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EP0641213A1 - Utilisation de glycosaminoglycanes exogenes ou derives dans le traitement des thrombopenies - Google Patents

Utilisation de glycosaminoglycanes exogenes ou derives dans le traitement des thrombopenies

Info

Publication number
EP0641213A1
EP0641213A1 EP93910111A EP93910111A EP0641213A1 EP 0641213 A1 EP0641213 A1 EP 0641213A1 EP 93910111 A EP93910111 A EP 93910111A EP 93910111 A EP93910111 A EP 93910111A EP 0641213 A1 EP0641213 A1 EP 0641213A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
derivatives
fractions
fragments
exogenous
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP93910111A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Zhong Chao Han
Jacques Caen
Jean-Claude Lormeau
Maurice Petitou
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Original Assignee
IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IVS Institut des Vaisseaux et du Sang filed Critical IVS Institut des Vaisseaux et du Sang
Publication of EP0641213A1 publication Critical patent/EP0641213A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/795—Polymers containing sulfur
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • the invention relates to the use of exogenous glycosaminoglycans, their analogs, as well as their fractions, fragments and derivatives, for the preparation of medicaments intended for the treatment of thrombocytopenia.
  • Glycosaminoglycans are polysaccharides formed essentially by the regular repetition of the disaccharide sequence [uronic acid (D-glucuronic or L-iduronic) - » hexosamine (glucosamine or galactosamine)]. These products exist in several forms: heparin and heparan sulfate, chondroitin sulfate (4- S and 6-S), dermatan sulfate and hyaiuronic acid. The first three are variously substituted by sulfate groups; hyaiuronic acid does not contain a sulfate group.
  • glycosidic bonds between the different osidic motifs vary according to the forms and are of types 1-4 or 1-3 (Casu B. in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Académie press Inc. 1985, 43, pp 51-133; Ruoslahti & Yamaguchi, Cell, 1991, 64 pp 867-869).
  • Glycosaminoglycans are components of cells and the extracellular matrix. They carry significant negative charges giving them an ability to fix a certain number of substances of cationic nature. As a result, they have multiple biological activities.
  • glycosaminoglycans products such as: dextran sulfate, pentosan polysulfate, sulfated alginic acid, sulfated lactobionic acid, polyvinyl sulfate and sucralfate. These products also often have interesting pharmacological properties.
  • glycosaminoglycans have been the subject of numerous studies, which have made it possible to highlight several biological activities. These activities are: anticoagulant activity, the ability to complex various proteins, activity in the complement system, activity as regulators and modulators of the development of certain types of cells, vascular or non-vascular and activity on angiogenesis.
  • glycosaminoglycans Several pharmaceutical specialties contain as active ingredient glycosaminoglycans, their fragments or derivatives.
  • Magnesium heparinate for example, is the active ingredient in a specialty marketed in France under the name Cutheparin®. It is an anticoagulant acting on several coagulation factors and used in the prevention and treatment of thromboembolic disease and thrombogenic states.
  • Heparin fragments also known as low molecular weight heparins, are also active ingredients in drugs such as, for example, nadroparin, or dalteparin, enoxaparin, parnaparin or tinzaparin.
  • Patent application EP-A-0 037 319 describes such products and their preparation process.
  • Patent application EP-A-0 199 033 also describes the use of dermatan sulfate and that of heparan sulfate, alone or in combination, for the prevention or treatment of venous thrombosis or manifestations of arteriosclerosis.
  • Dextran sulfate is also used as an anticoagulant (JEF Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1564).
  • patent application EP-A-0 270 317 describes low molecular weight dextran sulfate derivatives which exert an inhibitory activity on cell fusion and on viral adsorption, and disclose the advantage of using these products in the treatment and prophylaxis of diseases due to viral infections.
  • Sodium hyaluronate is used as an adjunct in anterior chamber eye surgery. This product provides mechanical protection of the cornea and reduces the risk of synechiae formation ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris). This same product is also used in the treatment of arthritis (J.E.F. Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1617).
  • the pentosan polysulfate active ingredient of a specialty marketed in France under the name of Hemoclar®, has anticoagulant, fibrinolytic properties and exerts an activity on the release of lipoprotein lipase ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris and 'The
  • Chondroitin sulfate a physiological constituent of the cornea, is used in the symptomatic treatment of hypolacrymia.
  • the mucin structure of this naturally occurring mucopolysaccharide achieves prolonged adhesion to hydrophobic cells of the eyeball and thus maintains effective protection ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris).
  • Chondroitin sulfate also finds its application in the treatment of cardiac ischemia and osteoporosis (J.E.F. Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1556).
  • this product has antihyperlipoproteinemic activity ('The Merck Index ", 1989, Merck and Co INC, Rahway N.J, USA, p 344 No. 2217).
  • Patent application EP-A-0 287 477 describes heparins of low molecular weight which can be used for the regulation of certain physiological systems such as the inhibition of angiogenesis, the inhibition on the proliferation of smooth muscle cells or having activity anti-complement.
  • Oligosaccharides containing at least 5 monosaccharide units consistent with those present in natural heparin and having a specific affinity for cationic or anionic cell growth factors recognizing heparin, are described in patent application EP-A-0244298. These fragments are described as having regulatory activities on cell division and differentiation and find their applications in stimulating the repair of muscle tissue, heart tissue or skin tissue, accelerating the healing of injuries of traumatic origin. , and alone or in combination with steroids, in the inhibition of processes where neoangiogenesis is pathological.
  • Megacaryocytopoiesis concerns the engagement of hematopoietic stem cells towards the megakaryocytic line, the proliferation of megakaryocytic progenitors and the maturation of megakaryocytes to give rise to platelets (Mazur EM., Megakaryocytopoiesis and platelet production: A review Exp Hematol., 1987, ⁇ 5, pp 340-350; Hoffman R., Regulation of megakaryocytopoiesis, Blood, 1989, 74, pp 1196-1212). Platelets play a very important role in certain physiological processes, notably blood coagulation (Caen J.P., Cronberg S. and Kubisz P., Platelet physiology and pathology, New-York, Stratton International, 1977).
  • megakaryocytopoiesis is directly regulated by a number of hematopoietic growth factors such as "megakaryocyte colony-stimulating factor” (MK-CSF), interleukin-3 (IL3), interleukin-6 (IL6 ), the “granulocyte-macrophage colony-stimulating factor” (GM-CSF) and erythropoietin (Epo). It is also indirectly controlled by interleukin-1 and interleukin-11 (Mazur EM., Exp. HematoL, 1987, 15, pp 340-350; Hoffman R., Blood, 1989, 75, pp 1196- 1212).
  • IL3, Epo, and GM-CSF have been used in vivo in normal subjects and patients.
  • Their stimulating effects of megakaryocytopoiesis are limited, in particular in aplastic anemias and in secondary hematopoietic insufficiencies (Peters WP. The myeloid colony-stimulating factors, Introduction and overview, Seminars in Hematology, 1991, 28, pp 1-5; Ganser A. et al. , Blood, 1990, 76, pp 1287-1292; Ganser A. et al, Z6, pp 666-676).
  • the hematopoietic cord is a complex system made up of cells of different types and functions. Its organization can be conceived in five cell compartments: stem cells of the entire hematopoietic line, hematopoietic progenitor cells, mature hematopoietic cells, the micro-environment and accessory cells. Stem cells by a series of differentiations and maturations give rise to progenitor cells which include megakaryocyte progenitors, the latter in turn giving rise to platelets as indicated above.
  • Thrombocytopenia is a well-known condition, especially during cancer chemotherapy. At present, there is no effective and economical treatment to remedy it. It was therefore of prime interest to find a specific and economical way to combat this pathological situation.
  • the invention therefore relates to the use, as specific inducers of megakaryocytopoiesis of exogenous glycosaminoglycans, of their analogs, as well as of their fractions, fragments and derivatives, for obtaining medicaments intended for the treatment of thrombocytopenia.
  • heparins of porcine or bovine origin extracted from the lungs, from the intestinal mucosa or from any other organ, can be used as unfractionated heparins.
  • low molecular weight heparins can be used, nadroparin calcic (DCI) and CY 222 (Laboratoires CHOAY, France; patents FR-2,440,376 and EP-0,037,319), PK 10169 known as also enoxaparin (DCI) (PHARMUKA Laboratories, France; patent application EP-0040 144), dalteparin (DCI) or KABI 2165 (KABI VITRUM, Sweden; Thrombosis Res.
  • DCI nadroparin calcic
  • CY 222 Laboratoires CHOAY, France
  • PK 10169 known as also enoxaparin (DCI) (PHARMUKA Laboratories, France; patent application EP-0040 144), dalteparin (DCI) or KABI 2165 (KABI VITRUM, Sweden; Thrombosis Res.
  • caicic nadroparin is the active ingredient in the specialty Fraxiparine®
  • dalteparin is the active ingredient in the specialty Fragmine®
  • enoxaparin is the active ingredient in the specialties Lovenox® and Clexan®
  • tinzaparin is the active ingredient Logiparin ® and Innohep ® specialties
  • pamaparin is the active ingredient in Fluxam® and Minidalton ® specialties.
  • O-acylated heparins are described in patent application EP-0 356275.
  • Other fragments of heparins are described in patent application EP-0244298.
  • Chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaiuronic acid and heparan sulfate are commercially available products.
  • the glycosaminoglycans used are, chondroitins sulfate 4-S and 6-S, dermatan sulfate as well as their fractions, fragments and derivatives.
  • the glycosaminoglycans used are hyaiuronic acid, its fractions, fragments and derivatives.
  • the glycosaminoglycans used are heparin and heparan sulfate, as well as their fractions, fragments and derivatives.
  • the glycosaminoglycans used are heparin, as well as its fractions, fragments and derivatives.
  • analogs of glycosaminoglycans are used, such as the following products: dextran sulfate, pentosan polysulfate, alginic acid sulfate, lactobionic acid sulfate, polyvinyl sulfate and sucralfate.
  • dextran sulfate and pentosan polysulfate are used.
  • low molecular weight heparins such as caicic nadroparin, are used as exogenous glycosaminoglycans.
  • glycosaminoglycans exogenous, their analogs as well as their fractions, fragments and derivatives are positive regulators of megakaryocytopoiesis. Given their stimulatory or modulatory effects on megakaryocytopoiesis, and their mechanism of action, these products can therefore be used for the therapeutic treatment of different types of thrombocytopenia, such as:
  • peripheral thrombocytopenia of various mechanisms idiopathic thrombocytopenic purpuras and other immune thrombocytopenia.
  • the dosage used depends on the patient's age, weight, route and frequency of administration, severity of thrombocytopenia and associated treatments. It varies from 40 ⁇ g to 1 mg per kg of body and per dose, when glycosaminoglycans, their analogs, their fragments, fractions or derivatives, are administered by intravenous, intramuscular or subcutaneous route. When administered orally, doses of 40 ⁇ g to 10 mg per kg of body weight and per dose are required.
  • the daily doses by parenteral can vary from 40 ⁇ g to 2 mg per kg of body weight, and by oral route, from 40 ⁇ g to 20 mg per kg of body weight.
  • the invention also extends to pharmaceutical compositions which can be used in the treatment of thrombocytopenia, containing as active principle an exogenous glycosaminoglycan, one of its analogs, of its fragments, fractions or derivatives, in combination with one or more inert and suitable excipients, or in combination with other compounds used for the treatment of thrombocytopenia.
  • Various pharmaceutical forms can be envisaged, such as injectable solutions, tablets, dragees, capsules, glossettes or other galenical preparations suitable for sublingual administration, nanoparticles, microcapsules and solutions for endonasal spraying.
  • gastro-resistant formulations are used for oral administration.
  • Cutheparin ® Unfractionated heparin sold under the name Cutheparin ® , supplied by Biosedra, Paris.
  • Product A Heparin fragment practically devoid of anticoagulant activity. To obtain this product, the heparin was subjected to a gentle oxidation using periodic acid, then to a depolymerization by addition of a strong base and finally, the products resulting from the polymerization were subjected to a reduction according to the process described in patent application EP-0 287 477 (Example 1).
  • Product A has an average molecular weight of 6500 Da and a degree of sulfation of 2.3.
  • Product A was supplied by Elf Sanofi, Paris;
  • Product B It is a hexasaccharide prepared from heparin, according to the process described in patent application EP-0 244 298. This compound is explicitly described in the same application, and it was supplied by Elf Sanofi , Paris.
  • the murine mononuclear cells of the femoral marrow are taken from Balb / c mice (IFFA CREDO). 2.10 5 murine mononuclear cells are added, at least in triplicate, in a volume of 1 ml of a base medium (alpha medium) containing: 10% bovine plasma citrate, 1% bovine serum albumin, 10% mercaptoethanoi (final concentration of 1 (HM), 0.34 mg ml of calcium chloride with or without 10% aplasia serum.
  • the different quantities of test products are diluted in a volume of 0.2 ml of alpha medium , and the solutions thus obtained, having different concentrations, are added to the plasma clots formed after coagulation of the plasma.
  • the pig aplasia serum is used for these murine marrow cultures.
  • the megakaryocytes and their murine colonies are identified by ia acetylcholinesterase staining (Jackson CW. t Blood, 1973, 42, pp 413-421). 1- Results obtained with heparin, heparan sulfate and Fraxiparine®
  • test products including a standard unfractionated heparin, Fraxiparin ® and heparan sulfate were used in different doses, given in Table I.
  • the results represent the mean ⁇ SEM for the number of colonies 2.10 5 cells from 3 separate experiments, done in triplicate. Statistical significance (*) was established according to Student's t test for p ⁇ 0.05.
  • CFU-MK megakaryocytic
  • CFU-GM granulocyte-macrophagic
  • Standard heparin, Fraxiparine® and heparan sulfate are capable of promoting maturation and increasing the size of megakaryocytes and their colonies.
  • Product A heparin depolymerized with periodic acid and having a very reduced anticoagulant activity
  • Product B regular hexasaccharide of heparin and CY 222
  • Table III represent the mean ⁇ SEM of the number of colonies for 2.10 5 cells, from 3 separate experiments carried out in triplicate; statistical significance HP ⁇ 0.05.
  • Chondroitin sulfate, dermatan sulfate, its fragments and hyaiuronic acid added to murine marrow cultures in the presence of aplastic serum at concentrations of 10-100 ⁇ g / ml, are capable of significantly stimulating the formation of megakaryocytic colonies.
  • the megakaryocytic progenitor culture system used is that described by Han ZC. et al, Exp. Hematol, 1989, 1 £ pp 46-52.
  • Human spinal cord mononuclear cells are taken from healthy individuals (the various samples were taken with the consent of healthy volunteers). 2.10 5 spinal mononuclear cells are added, at least in triplicate, in a volume of 1 ml of a basic medium containing: 10% bovine citrate plasma, 1% bovine serum albumin, 10% mercaptoethanol (final concentration of 10 -4 M), 0.34 mg / ml of calcium chloride with or without 10% aplasia serum. Human aplasia serum is used for human marrow cultures. Heparin and heparan are added in a volume of 0.2 ml of alpha medium (cf. Example 1), on the plasma clots formed after coagulation of the plasma. Human megakaryocyte colonies are identified by immunoperoxidase staining using a monoclonal antibody directed against platelet glycoprotein llb / IIIa (Han ZC. Et al., Exp Hemato., 1989, 7, 46-52).
  • the products tested are unfractionated heparin and heparan sulfate.
  • the doses used were from 1 to 5 IU / ml for heparin and from 10 to 50 ⁇ g / ml for heparan sulfate.
  • the method used for this study is that of the plasma clot.
  • the results reported in Table VI represent the mean ⁇ SEM of the number of MK colonies from two experiments. It is found that heparin and heparan sulfate stimulate the formation of megakaryocytic colonies in normal marrow cultures in the presence of human aplastic serum.
  • Standard heparin and Fraxiparine® increase the activity potential of aplastic serum (rich in MK-CSF).
  • aplastic serum rich in MK-CSF.
  • IL3 Genzyme, USA
  • IL6 Gene, USA
  • GM-CSF Gene, USA
  • Epo Amersham, France
  • mice Balb / c bi-daily for 4 days at concentrations of 0, 4, 20, 40, 5200 and 1000 IU / kg.
  • the "control" mice only received phosphate buffer (PBS Eurobio).
  • the animals were killed by cervical dislocation 2 days after the last injection.
  • the spinal cells were obtained from the femurs and the blood was obtained by cardiac puncture. Medullary cells at a concentration of 2.10 5 mononuclear cells per ml were re-cultured in five copies in the presence of megakaryocytic progenitors or CFU-MK and granulomonocytic progenitors or CFU-GM.
  • MK megakaryocytes
  • Tables VIII and IX represent the mean ⁇ SEM. Each group contains 5 or more mice. Statistical significance ( * ) p ⁇ 0.05.
  • Fraxiparine ® was injected at an optimal dose of 40 IU / kg subcutaneously, into Balb / c mice bi-daily for 4 days.
  • the marrow and blood samples were taken on days 2, 5, and 8, after the last injection, according to the protocol indicated above.
  • the results in Table X represent the mean ⁇ SEM. Each group contains 5 or more mice.
  • Fraxiparine ® specifically increases ia producing megakaryocytes and platelets.
  • mice (5-10 mice per group) were initially injected with 150 mg kg of 5-fluorouracyia. Two days later, Fraxiparine ® (40 IU / kg) or Product B (40 IU / kg), were injected subcutaneously (one injection per day for 4 days). For the "control" mice, phosphate buffer (PBS-Eurobio) was used. The animals were killed by cervical dislocation. The spinal cells were obtained from the femurs and the blood was obtained by cardiac puncture. The spinal cells at a concentration of 5.10 4 per ml, were re-cultured in five copies in the presence of aplastic pig serum for one week, to test the number of CFU-MK.
  • PBS-Eurobio phosphate buffer
  • MK megakaryocytes
  • Dextran sulfate (5000 Da) and Product B were injected in the same way as Fraxiparine ® , at a dose of 10 ⁇ g / injection in mice treated with 5-fluorouracyl.
  • the administration of these two products also accelerates the recovery of platelets on day 2 after the last injection.
  • protamine sulfate Choay Laboratories, Paris
  • the main heparin neutralizing agent was tested in murine marrow cultures according to the protocol described in Example 1.
  • the protamine in the concentrations of 50-100 ⁇ g / ml, completely neutralizes the activity of Fraxiparine®.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, ainsi que de leurs fractions, fragments et dérivés, pour la préparation des médicaments destinés au traitement des thrombopénies.

Description

UTILISATION DE GLYCXβAMDKX__LYO\ ES EXOGENE OU DERIVES DANS LE TRAITEMENT DES THROMBOPENIES
L'invention concerne l'utilisation, de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, ainsi que de leurs fractions, fragments et dérivés, pour la préparation des médicaments destinés au traitement des thrombopénies.
Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polysaccharides constitués essentiellement par la répétition régulière de ia séquence disaccharidique [acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) — » hexosamine (glucosamine ou galactosamine)]. Ces produits existent sous plusieurs formes : l'héparine et l'héparane sulfate, les chondroïtines sulfate (4- S et 6-S), le dermatane sulfate et l'acide hyaiuronique. Les trois premiers sont diversement substitués par des groupes sulfate ; l'acide hyaiuronique ne contient pas de groupe sulfate. Les liaisons glycosidiques entre les différents motifs osidiques varient selon les formes et sont de types 1-4 ou 1-3 (Casu B. in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Académie press Inc. 1985, 43, pp 51-133 ; Ruoslahti & Yamaguchi, Cell, 1991, 64 pp 867-869).
Les glycosaminoglycanes sont des composants des cellules et de ia matrice extracellulaire. Ils portent des charges négatives importantes leur conférant une capacité à fixer un certain nombre de substances à caractère cationique. En conséquence, ils possèdent des activités biologiques multiples.
On entend par analogues des glycosaminoglycanes, des produits tels que : le dextrane sulfate, le pentosane polysulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate et le sucralfate. Ces produits aussi, possèdent souvent des propriétés pharmacologiques intéressantes.
Des fractions, fragments et dérivés des glycosaminoglycanes, et plus particulièrement de l'héparine et de l'héparane sulfate qu'ils aient ou non une activité anticoagulante, sont aussi connus.
En effet, les glycosaminoglycanes, leurs analogues, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés, et en particulier l'héparine, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, ont fait l'objet de nombreuses études, qui ont permis de mettre en évidence plusieurs activités biologiques. Ces activités sont : l'activité anticoagulante, la faculté de complexer diverses protéines, l'activité dans le système du complément, l'activité comme régulateurs et modulateurs du développement de certains types de cellules, vasculaires ou non vasculaires et l'activité sur l'angiogenèse.
(Casu B., in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Académie press Inc. 1985, 43, pp 51-133 ; Seminar in Thrombosis and Haemostasis, 1991, 17, supl. 1 & 2, pp 1-246. Development of non-heparin glycosaminoglycans as therapeutic agents, J. M. Walenga, J. Fareed, guest editors, Thieme médical Publishers, Inc. New-York ; Ruoslahti E. & Yamaguchi Y., Cell, 1991, 64, pp 867-869 ; Lindahl U., TP Int. Rev. ScL Org. Chem. Ser. Two, Carbohydrate, 1976, 7, pp 283-312).
Plusieurs spécialités pharmaceutiques contiennent comme principe actif des glycosaminoglycanes, leurs fragments ou dérivés. L'héparinate de magnésium, est par exemple le principe actif d'une spécialité commercialisée en France sous le nom Cuthéparine®. Il s'agit d'un anticoagulant agissant sur plusieurs facteurs de coagulation et utilisé dans la prévention et le traitement de la maladie thromboembolique et des états thrombogènes. Des fragments d'héparine, connus aussi sous le nom d'héparines de bas poids moléculaires, sont aussi des principes actifs de médicaments comme par exemple la nadroparine ou encore, la daltéparine, l'énoxaparine, la parnaparine ou la tinzaparine.
Ces principes actifs possèdent un effet antithrombotique notoire, notamment un effet anti-facteur X activé puissant, et un effet anticoagulant réduit ("Dictionnaire Vidal" 1992, Edition du Vidal, Paris).
La demande de brevet EP-A-0 037 319 décrit de tels produits et leur procédé de préparation.
Par ailleurs, l'activation du cofacteur II de l'héparine par l'héparine et le dermatane sulfate a été étudiée par D.M. Tolfesen (Nouv. Rev. Fr. HématoL, 1984, 26, N°4r PP 233-237). Cet auteur décrit les effets de l'héparine et du dermatane sulfate sur les facteurs de la coagulation, et suggère l'utilisation de ces deux produits dans ce même domaine.
La demande de brevet EP-A-0 199 033 décrit aussi l'utilisation du dermatane sulfate et celle de l'héparane sulfate, seuls ou en association, pour la prévention ou le traitement de la thrombose veineuse ou des manifestations d'artériosclérose.
Le dextrane sulfate est aussi utilisé comme anticoagulant (J.E.F. Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1564). Par ailleurs, la demande de brevet EP-A-0 270 317 décrit des dérivés de dextrane sulfate de bas poids moléculaires qui exercent une activité inhibitrice sur la fusion cellulaire et sur l'adsorption virale, et divulgue l'intérêt de l'utilisation de ces produits dans le traitement et la prophylaxie des maladies dues aux infections virales.
L'hyaluronate de sodium est utilisé comme adjuvant en chirurgie oculaire de la chambre antérieure. Ce produit assure une protection mécanique de la cornée et diminue le risque de formation de synéchies ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris). Ce même produit est aussi utilisé dans le traitement de l'arthrite (J.E.F. Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1617).
Le pentosane polysulfate, principe actif d'une spécialité commercialisée en France sous le nom d'Hémoclar®, possède des propriétés anticoagulantes, fibrinolytiques et exerce une activité sur la libération de lipoprotéine lipase ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris et 'The
Merck Index", 1989, Merck and Co INC, Rahway N.J, USA, p 1131 Nβ7090).
Le chondroïtine sulfate, constituant physiologique de la cornée, est utilisé dans le traitement symptomatique de l'hypolacrymie. La structure mucinique de ce mucopolysaccharide d'origine naturelle, réalise une adhérence prolongée aux cellules hydrophobes du globe oculaire et maintient ainsi une protection efficace ("Dictionnaire Vidal", 1992, Edition du Vidal, Paris). Le chondroïtine sulfate trouve aussi son application dans le traitement des ischémies cardiaques et de l'ostéoporose (J.E.F. Reynolds "Martindale, The extra Pharmacopeia", 1989, The Pharmaceutical Press, p 1556). Par ailleurs, dans la littérature, il est aussi décrit que ce produit possède une activité antihyperlipoprotéinémique ('The Merck Index", 1989, Merck and Co INC, Rahway N.J, USA, p 344 N°2217).
La demande de brevet EP-A-0 287 477 décrit des héparines de bas poids moléculaires utilisables pour la régularisation de certains systèmes physiologiques tels que l'inhibition de l'angiogénèse, l'inhibition sur la prolifération des cellules musculaires lisses ou ayant une activité anti- complément.
Des oligosaccharides contenant au moins 5 unités monosaccharidiques (dérivés de glucosamine et d'acides uroniques) conformes à ceux présents dans l'héparine naturelle et ayant une affinité spécifique pour les facteurs de croissance cellulaire cationiques ou anioniques reconnaissant l'héparine, sont décrits dans la demande de brevet EP-A-0244298. Ces fragments sont décrits comme possédant des activités régulatrices sur la division et la différenciation cellulaire et trouvent leurs applications dans la stimulation de la réparation des tissus musculaires, du tissu cardiaque ou des tissus cutanés, l'accélération de la cicatrisation des lésions d'origine traumatique, et seuls ou en association avec des stéroïdes, dans l'inhibition des processus où la néoangiogénèse est pathologique.
Le brevet US-3 466 365 décrit des sels sodiques ou potassiques des dérivés du polyvinyle sulfate doués d'activités antivirales.
Des dérivés d'acide lactobionique poly(H-sulfate) ainsi que leurs sels, présentant une activité inhibitrice du complément, sont décrits dans le brevet US- 4258 034.
La mégacaryocytopoïèse concerne l'engagement des cellules- souches hématopoïètiques vers la lignée mégacaryocytaire, ia prolifération des progéniteurs mégacaryocytaires et la maturation des megacaryocytes pour donner naissance aux plaquettes (Mazur EM., Megakaryocytopoiesis and platelet production : A review Exp Hematol., 1987, ^5, pp 340-350 ; Hoffman R., Régulation of megakaryocytopoiesis, Blood, 1989, 74, pp 1196-1212). Les plaquettes jouent un rôle très important dans certains processus physiologiques notamment la coagulation sanguine (Caen J.P., Cronberg S. et Kubisz P., Platelet physiology and pathology, New-York, Stratton International, 1977).
Il a été montré que la mégacaryocytopoïèse est directement régulée par un certain nombre de facteurs de croissance hématopoïétique tels le "megakaryocyte colony-stimulating factor" (MK-CSF), l'interleukine-3 (IL3), l'interleukine-6 (IL6), le "granulocyte-macrophage colony-stimulating factor" (GM-CSF) et l'érythropoïétine (Epo). Elle est aussi contrôlée de façon indirecte par l'interleukine-1 et l'interleukine-11 (Mazur EM., Exp. HematoL, 1987, 15, pp 340-350 ; Hoffman R. , Blood, 1989, 75, pp 1196-1212).
Parmi ces facteurs, l'IL3, l'Epo, et le GM-CSF ont été utilisés in vivo chez des sujets normaux et des malades. Leurs effets stimulateurs de la mégacaryocytopoïèse sont limités, en particulier dans les anémies aplasiques et dans les insuffisances hématopoïètiques secondaires (Peters WP. The myeloïd colony-stimulating factors, Introduction and overview, Seminars in Hematology, 1991 , 28, pp 1-5 ; Ganser A. et al., Blood, 1990, 76, pp 1287- 1292 ; Ganser A. et al, Z6, pp 666-676). Ceci montre l'existence d'un autre mécanisme contrôlant la mégacaryocytopoïèse. A noter que les facteurs de croissance possèdent des activités multiples. Ainsi leur administration excessive ne peut être envisagée puisqu'elle pourrait provoquer des effets secondaires inattendus et défavorables (Metcalf D., The conséquences of excess ievels of Haematopoietic growth factors. Br. J. Hematol., 1990, 75, pp 1-3).
La moelle hématopoïétique est un système complexe formé de cellules de nature et de fonctions différentes. Son organisation peut se concevoir en cinq compartiments cellules : les cellules-souches de toute la lignée hématopoïétique, les cellules progénitrices hématopoïètiques, les cellules hématopoïètiques matures, le micro-environnement et les cellules accessoires. Les cellules souches par une série de différenciations et de maturations, donnent naissance aux cellules progénitrices dont font partie les progéniteurs mégacaryocytaires, ces derniers donnant naissance à leur tour aux plaquettes comme cela a été indiqué plus haut. On sait seulement qu'il existe des protéoglycanes endogènes qui jouent un rôle sur la granulopoïèse par un mécanisme compartimentai fermé, ciblé sur le facteur de croissance GM-CSF (Gordon M. Y. et al., "Compartmentalization of a haematopoietic growth factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow micoenvironment", Nature, 1987, 326. pp 403-405 ; Roberts R. et al., Heparan sulfate bound growth factors, A mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis, Nature, 1988, 332. pp 376-378). Aucune information n'existe cependant sur l'action des glycosaminoglycanes exogènes dans le système de la mégacaryocytopoïèse.
Il a été maintenant mis en évidence, que de façon inattendue, des glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés, s'ils sont administrés chez l'animal ou l'homme, peuvent agir dans un système cellulaire tout à fait différent des systèmes étudiés à ce jour, à savoir le système médullaire hématopoïétique, et plus particulièrement, comme inducteurs ou modulateurs spécifiques de la régulation de la mégacaryocytopoïèse humaine ou murïπe, et peuvent être utilisés en thérapeutique pour traiter les thrombopénies.
Les thrombopénies sont des états bien connus, notamment au cours des chimiothérapies anticancéreuses. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement efficace et économique pour y remédier. Il était donc de tout premier intérêt de trouver un moyen spécifique et économique pour lutter contre cette situation pathologique.
L'invention concerne donc l'utilisation, en tant qu'inducteurs spécifiques de la mégacaryocytopoïèse de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, ainsi que de leurs fractions, fragments et dérivés, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des thrombopénies.
Pour la préparation de ces médicaments on peut utiliser comme héparines non fractionnées, les héparines d'origine porcine ou bovine, extraites des poumons, de la muqueuse intestinale ou de tout autre organe.
A titre d'exemple, on peut utiliser comme héparines de faibles masses moléculaires, ia nadroparine calcîque (DCI) et le CY 222 (Laboratoires CHOAY, France ; brevets FR-2 440 376 et EP-0 037 319), le PK 10169 dénommé aussi énoxaparine (DCI) (Laboratoires PHARMUKA, France ; demande de brevet EP-0040 144), la daltéparine (DCI) ou le KABI 2165 (KABI VITRUM, Suède ; Thrombosis Res. (1986) 42, p 435-447), la pamaparine ou le OP 2123 (OPOCRIN, Italie ; demandes de brevet EP-0 121 067 et WO 86/06729), le RD 11885 (HEPAR INDUSTRIES, Ohio USA ; demande de brevet et brevets EP-0244235, GB-2002406 et GB-2 068011 ), la tinzaparine (DCI) ou le LHN-1 (NOVO INDUSTRIES, Danemark ; demandes de brevet EP-0 244 234 et EP-0244 235). Tous ces produits sont déjà décrits dans la littérature (Haemostasis 1988, 18 sup 3, pp 3-15), et la majorité d'entre eux sont des principes actifs des spécialités déjà mises à la disposition du corps médical. Ainsi par exemple, la nadroparine caicique est le principe actif de la spécialité Fraxiparine®, la daltéparine est le principe actif de la spécialité Fragmine®, l'énoxaparine est le principe actif des spécialités Lovenox® et Clexan®, la tinzaparine est le principe actif des spécialités Logiparin® et Innohep®, et la pamaparine est le principe actif des spécialités Fluxam® et Minidalton®. Des fragments d'héparines non-anticoagulants et les dérivés d'héparines hypersulfatés, qui peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments selon l'invention, sont décrits respectivement dans les demandes de brevet EP-0287477 et EP-0 214 879. Des dérivés d'héparines O-acylés sont décrits dans la demande de brevet EP-0 356275. D'autres fragments d'héparines (hexasaccharides, octasaccharides etc..) sont décrits dans la demande de brevet EP-0244298.
Les chondroïtines sulfate, le dermatane sulfate, l'acide hyaiuronique et l'héparane sulfate sont des produits disponibles dans le commerce.
Dans un mode particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont, les chondroïtines sulfate 4-S et 6-S, le dermatane sulfate ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés.
Dans un autre mode particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont l'acide hyaiuronique, ses fractions, fragments et dérivés.
Dans un autre mode encore particulier de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont l'héparine et l'héparane sulfate, ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés. Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, les glycosaminoglycanes utilisés sont l'héparine, ainsi que ses fractions, fragments et dérivés.
Dans un autre mode avantageux de l'invention, sont utilisés des analogues des glycosaminoglycanes, tels que les produits suivants : le dextrane sulfate, le pentosane polysulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate et le sucralfate. On utilise de manière préférentielle, le dextrane sulfate et le pentosane polysulfate.
De manière avantageuse, selon la présente invention, on utilise pour la préparation des médicaments, des glycosaminoglycanes, leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés dépourvus d'activité anticoagulante.
De manière très préférentielle, on utilise comme glycosaminoglycanes exogènes, les héparines de faible masse moléculaire, telles que la nadroparine caicique.
Les essais in vitro chez l'homme et chez la souris, et les essais jn vivo chez la souris normale et chez des souris rendues aplasiques par traitement chimiothérapique, ont démontré que les glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés sont des régulateurs positifs de la mégacaryocytopoïèse. Compte-tenu de leurs effets stimulateurs ou modulateurs sur la mégacaryocytopoïèse, et de leur mécanisme d'action, ces produits peuvent donc être utilisés pour le traitement thérapeutique de différents types de thrombopénies, comme :
- des thrombopénies périphériques de divers mécanismes (les purpuras thrombopéniques îdiopathiques et les autres thrombopénies immunitaires).
- des thrombopénies centrales acquises, en particulier celles en récupération d'une chimiothérapie (cancers, leucémies, sida...) et d'une greffe de moelle. L'évolution sur la récupération médullaire en particulier mégacaryocytaire et plaquettaire serait importante. Il a été montré que chez des patients qui subissent une chimiothérapie ou une greffe de moelle, l'activité MK-CSF plasmatique est très élevée (Mazur EM. et al. Blood, 1990, 76, pp 290-297 ; Fauser et al., Transplantation, 1988, 46, pp 543-547 ; Hoffman R., Blood, 1989, 74, pp 1196-1212).
- d'autres types de thrombopénies telles que le syndrome plaquettaire du "Gray platelet syndrome".
La posologie utilisée dépend de l'âge du patient, de son poids, de la voie et la fréquence d'administration, de la gravité des thrombopénies et des traitements associés. Elle varie de 40 μg à 1 mg par kg corporel et par prise, lorsque les glycosaminoglycanes, leurs analogues, leurs fragments, fractions ou dérivés, sont administrés par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous- cutanée. Lors de l'administration par voie orale, des doses de 40 μg à 10 mg par kg de poids corporel et par prise sont nécessaires. Les doses journalières par voie parentérale peuvent varier de 40 μg à 2 mg par kg de poids corporel, et par voie orale, de 40 μg à 20 mg par kg de poids corporel.
L'invention s'étend aussi aux compositions pharmaceutiques utilisables dans le traitement des thrombopénies, renfermant comme principe actif, un glycosaminoglycane exogène, un de ses analogues, de ses fragments, fractions ou dérivés, en association avec un ou plusieurs excipients inertes et appropriés, ou encore en association avec d'autres composés utilisés pour le traitement des thrombopénies.
Diverses formes pharmaceutiques peuvent être envisagées, telles que solutés injectables, comprimés, dragées, gélules, glossettes ou autres préparations galéniques appropriées à une administration sublinguale, nanoparticuies, microcapsules et solutions pour pulvérisation endonasale. De manière préférentielle, on utilise, pour l'administration orale, des formulations gastro-résistantes.
Les formes pharmaceutiques indiquées ci-dessus sont données à titre d'exemples et ne sont pas limitatives. D'autres formes pharmaceutiques et d'autres voies d'administration peuvent être envisagées.
L'invention sera illustrée à l'aide des exemples ci-après, qui contiennent des résultats expérimentaux, obtenus lors des différents essais pharmacologiques.
Produits testés
- Chondroïtine sulfate (6-S), dermatane sulfate, héparane sulfate, acide hyaiuronique, (Sigma Chemical, USA).
- Héparine non fractionnée vendue sous le nom de Cuthéparine®, fournie par Biosedra, Paris.
- Fragments d'héparine :
* Nadroparine calcique, principe actif de la spécialité Fraxiparine®, fournie par les Laboratoires Choay, Paris ;
* CY 222 : Produit décrit dans le brevet EP-0 037 319 (Exemple 1), fourni par Elf Sanofi ;
• Produit A : Fragment d'héparine pratiquement dépourvu d'activité anticoagulante. Pour obtenir ce produit, l'héparine a été soumise à une oxydation ménagée à l'aide de l'acide périodique, puis à une dépolymérisation par addition d'une base forte et enfin, les produits issus de la polymérisation ont été soumis à une réduction selon le procédé décrit dans la demande de brevet EP-0 287 477 (Exemple 1 ). Le Produit A, a une masse moléculaire moyenne de 6500 Da, et un degré de sulfatation de 2,3. Le Produit A a été fourni par Elf Sanofi, Paris ;
* Produit B : C'est un hexasaccharide préparé à partir de l'héparine, selon le procédé décrit dans la demande de brevet EP-0 244 298. Ce composé est explicitement décrit dans la même demande, et il a été fourni par Elf Sanofi, Paris.
Fragments de dermatane sulfate :
Ces produits ont été obtenus par dépolymérisation du dermatane sulfate à l'aide de l'acide périodique (Tollefsen D.M., Nouv. Rev. Fr., Hematol. 1984, 26, N°4, pp 233-237). lis sont composés par un nombre d'unités monosaccharidiques (dérivés d'acide L-iduronique et D-galactosamine) bien déterminé, donné ci-après :
* Produit C : constitué de 3 unités monosaccharidiques * Produit D : constitué de 5 unités monosaccharidiques
* Produit E : constitué de 7 unités monosaccharidiques
* Produit F : constitué de 9 unités monosaccharidiques
* Produit G : constitué de 11 unités monosaccharidiques
* Produit H : constitué de 13 unités monosaccharidiques Tous ces produits ont été fournis par Elf Sanofi, Paris.
- Analogues de glycosaminoglycanes :
* Dextrane sulfate fourni par Sigma Chemical, USA
* Pentosane polysulfate, fourni par Elf Sanofi, Paris.
EXEMPLE 1
Effets sur la stimulation de la mégacaryocytopoïèse in vitro : essais sur un système de cultures cellulaires moπonuclées murines de moelle de fémurs de la souris
Des effets de glycosaminoglycanes, de leurs analogues ainsi que leurs fractions, fragments et dérivés sur la mégacaryocytopoïèse in vitro ont été examinés en utilisant un système de culture de progéniteurs mégacaryocytaires (Han ZC. et al. ; C.R. Acad. Sci., Paris, 1991, t 313, Série III, pp 553-558).
Dans ce système de culture, les cellules mononuclées murines de moelle de fémurs, sont prélevées chez des souris Balb/c (IFFA CREDO). 2.105 cellules mononuclées murines sont ajoutées, au moins en triplicate, dans un volume de 1 ml d'un milieu de base (milieu alpha) contenant : 10 % de plasma bovin citrate, 1 % d'albumine de sérum bovin, 10 % de mercaptoéthanoi (concentration finale de 1(H M), 0,34 mg ml de chlorure de calcium avec ou sans 10 % de sérum d'aplasie. Les différentes quantités de produits à tester sont diluées dans un volume de 0,2 ml du milieu alpha, et les solutions ainsi obtenues, ayant des concentrations différentes, sont ajoutées sur les caillots plasmatiques formés après coagulation du plasma. Le sérum d'aplasie de porc est utilisé pour ces cultures de moelle murine. Les megacaryocytes et leurs colonies murines sont identifiés par ia coloration d'acétylcholinestérase (Jackson CW.t Blood, 1973, 42, pp 413-421). 1- Résultats obtenus avec l'héparine, l'héparane sulfate et la Fraxiparine®
- Effets sur la formation de colonies mégacaryocytaires :
Les produits à tester et notamment, une héparine standard non fractionnée, la Fraxiparine® et l'héparane sulfate, ont été utilisés à différentes doses, indiquées dans le Tableau I. Les résultats représentent la moyenne ± SEM du nombre de colonies pour 2.105 cellules à partir de 3 expériences séparées, faites en triplicate. La signification statistique (*) a été établie selon le test t de Student pour p < 0,05.
TABLEAU I
Effets de l'héparine et de l'héparane sulfate sur la formation de colonies mégacaryocytaires (CFU-MK) et granulocyte-macrophagiques (CFU-GM) in vitro
Les résultats indiqués dans le Tableau I démontrent que l'héparine standard, la Fraxiparine® et l'héparane sulfate sont capables d'augmenter de manière significative la formation de colonies mégacaryocytaires sur le système de culture en caillot piasmatique, en particulier en présence de sérum de porc aplasique, obtenu de porcs irradiés, qui est riche en une activité dite MK-CSF. En revanche, ils ne stimulent pas de façon significative la formation de colonies CFU-GM, que ce soit en la présence ou en l'absence de sérum aplasique. - Effet sur la maturation et la taille des megacaryocytes et leurs colonies :
Plus de 500 colonies et 100 megacaryocytes individuels ont été analysés. Signification statistique (*) p < 0,05. Les résultats de cet essai sont donnés dans le Tableau II.
TABLEAU II
L'héparine standard, la Fraxiparine® et l'héparane sulfate, sont capables de promouvoir la maturation et d'augmenter la taille des megacaryocytes et de leurs colonies.
2- Résultats obtenus avec le Produit A, le Produit B et le CY 222
Le Produit A, héparine dépolymérisée à l'acide périodique et ayant une activité anticoagulante très réduite, le Produit B, hexasaccharide régulier de l'héparine et le CY 222, sont également capables de stimuler de façon significative la formation de colonies mégacaryocytaires sur la système de caillot plasmatique. Lors de ces essais, les cellules ont été cultivées en présence de sérum aplasique de porc. Les résultats rapportés dans le Tableau III, représentent la moyenne ± SEM du nombre de colonies pour 2.105 cellules, à partir de 3 expériences séparées faites en triplicate ; signification statistique H P < 0,05.
TABLEAU III
3- Résultats obtenus avec le chondroïtine sulfate, l'acide hyaiuronique, le dermatane sulfate et ses fragments
Les produits ont été testés à des doses variant de 0 à 100 μg/ml. Les résultats de cette étude sont indiqués dans le Tableau IV.
TABLEAU IV
H P < 0,05
Le chondroïtine sulfate, le dermatane sulfate, ses fragments et l'acide hyaiuronique, ajoutés aux cultures de moelle murine en présence de sérum aplasique aux concentrations de 10-100 μg/ml, sont capables de stimuler de façon significative la formation de colonies mégacaryocytaires.
4- Résultats obtenus avec des analogues de glycosaminoglycanes
Les produits examinés sont indiqués dans le Tableau V.
TABLEAU V
H P < 0,05 Les résultats du Tableau V démontrent que les produits examinés stimulent de manière dose-dépendante et significative, la formation des colonies mégacaryocytaires dans les cultures contenant du sérum aplasique.
EXEMPLE 2
Effets sur la stimulation de la mégacaryocytopoïèse in vitro, essais sur un système de culture de cellules mononuclées médullaires humaines
Le système de culture de progéniteurs mégacaryocytaires utilisé, est celui décrit par Han ZC. et al, Exp. Hematol, 1989, 1£ pp 46-52.
Les cellules mononuclées médullaires humaines sont prélevées chez des individus sains (les différents prélèvements ont été effectués avec le consentement de volontaires sains). 2.105 cellules mononuclées médullaires sont ajoutées, au moins en triplicate, dans un volume de 1 ml d'un milieu de base contenant : 10 % de plasma bovin citrate, 1 % d'albumine de sérum bovin, 10 % de mercaptoéthanol (concentration finale de 10-4 M), 0,34 mg/ml de chlorure de calcium avec ou sans 10 % de sérum d'aplasie. Le sérum d'aplasie humain est utilisé pour les cultures de moelle humaine. L'héparine et l'héparane sont ajoutés dans un volume de 0,2 ml de milieu alpha (cf. Exemple 1), sur les caillots plasmatiques formés après coagulation du plasma. Les colonies mégacaryocytaires humaines sont identifiées par la coloration d'immunoperoxidase en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre la glycoprotéïne llb/llla plaquettaire (Han ZC. et al., Exp Hemato., 1989, 7, 46- 52).
Les produits testés sont l'héparine non fractionnée et l'héparane sulfate.
Les doses utilisées ont été de 1 à 5 Ul/ml pour l'héparine et de 10 à 50 μg/ml pour l'héparane sulfate. La méthode utilisée pour cette étude, est celle du caillot plasmatique. Les résultats rapportés dans le Tableau VI, représentent la moyenne ± SEM du nombre de colonies MK à partir de deux expériences. On constate que l'héparine et l'héparane sulfate stimulent la formation des colonies mégacaryocytaires dans les cultures de moelle normale en présence de sérum aplasique humain.
Ces résultats indiquent que l'héparine et l'héparane sulfate, respectivement à des doses de 5 Ul/ml et 50 μg/ml, sont capables d'induire la croissance de megacaryocytes humains. TABLEAU VI
H P < 0,05
EXEMPLE 3
Etude de l'interaction de l'héparine standard et de la Fraxiparine® avec les facteurs de croissance agissant sur la mégacaryocytopoïèse
Les effets de l'héparine standard et de la Fraxiparine® ont été étudiés en présence de divers facteurs de croissance sur la formation de colonies mégacaryocytaires murines. Les résultats indiqués à la figure 1 , représentent la moyenne ± SEM du nombre de colonies MK à partir d'au moins
3 expériences séparées. Signification statistique (*) p < 0,05.
L'héparine standard et la Fraxiparine®, augmentent le potentiel d'activité du sérum aplasique (riche en MK-CSF). Lorsque le sérum d'aplasie est remplacé par un autre facteur de croissance, l'effet de l'héparine sur la mégacaryocytopoïèse n'est pas visible. C'est le cas par exemple, lorsqu'on ajoute l'IL3 (Genzyme, USA), l'IL6 (Genzyme, USA), le GM-CSF (Genzyme, USA) ou l'Epo (Amersham, France).
Les effets d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'IL3 ou PIL6 murins sur la formation de colonies mégacaryocytaires (MK) murines induites par l'IL3 OU l'IL6, par le sérum d'aplasie et la Fraxiparine®, et par le sérum d'aplasie et l'héparine, ont aussi été étudiés. Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans l'Exemple 1. Les résultats indiqués dans le Tableau VII ci- après, représentent la moyenne ± SEM de deux ou trois expériences.
On constate que l'addition d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'IL3 OU l'IL6 munn, neutralise l'action de l'IL3 ou de NL6 ajouté, mais ne supprime pas l'activité de la Fraxiparine® et de l'héparine standard. Cela suggère un effet de l'héparine, indépendant de NL3 et de l'IL6. TABLEAU VII
5
EXEMPLE 4
Essais in vivo chez la souris normale
0 1- Effets in vivo de la Fraxiparine® sur l'hématopoïèse et sur la taille des megacaryocytes et leurs colonies
La Fraxiparine® a été injectée par voie sous-cutanée à des souris
Balb/c bi-quotidiennement pendant 4 jours à des concentrations de 0, 4, 20, 40, 5 200 et 1000 Ul/kg. Les souris "témoins" ont seulement reçu du tampon phosphate (PBS Eurobio). Les animaux ont été tués par dislocation cervicale 2 jours après la dernière injection.
Le nombre de CFU-MK, de CFU-GM, de megacaryocytes et les formules sanguines ont été examinés en utilisant les méthodes décrites par Han Z.C. et al ; .C.R. Acad. Sci. Paris, 1991, 313, pp 553-558.
Les cellules médullaires ont été obtenues à partir des fémurs et le sang a été obtenu par ponction cardiaque. Les cellules médullaires à la concentration de 2.105 cellules mononuclées par ml ont été remises en culture en cinq exemplaires en présence de progéniteurs mégacaryocytaires ou CFU- MK et de progéniteurs granulomonocytaires ou CFU-GM.
Le nombre des megacaryocytes (MK) a été évalué sur des cellules médullaires non cultivées mais ensemencées dans des boîtes de culture après obtention à partir de fémurs. Le nombre de plaquettes, de globules blancs et le taux d'hémoglobine ont été mesurés en utilisant un compteur hématopoïétique automatique.
Les résultats indiqués dans les Tableaux VIII et IX, représentent la moyenne ± SEM. Chaque groupe contient 5 souris ou plus. Signification statistique (*) p < 0,05.
TABLEAU VIII
EFFET IN VIVO DE LA FRAXIPARINE® SUR L'HEMATOPOIESE
TABLEAU IX
EFFET DE L'ADMINISTRATION DE LA FRAXIPARINE® SUR LA TAILLE
DES MEGACARYOCYTES (MK)) ET LEURS COLONIES
On voit que le nombre de CFU-MK médullaires, de megacaryocytes isolés et de plaquettes, comme aussi la taille de megacaryocytes et de leurs colonies, augmentent de manière significative 24 heures après la dernière injection de Fraxiparine® aux doses de 20 à 200 Ul/kg. Pour autant, le nombre de CFU-GM, de globules blancs et le taux d'hémoglobine ne sont pas affectés. 2- Etude de la durée d'action de la Fraxiparine® sur la production de megacaryocytes et de plaquettes
La Fraxiparine® a été injectée à une dose optimale de 40 Ul/kg par voie sous cutanée, à des souris Balb/c bi-quotidiennement pendant 4 jours. Les échantillons de moelle et de sang ont été prélevés aux jours 2, 5, et 8, après la dernière injection, selon le protocole indiqué ci-dessus. Les résultats du Tableau X, représentent ia moyenne ± SEM. Chaque groupe contient 5 souris ou plus. Signification statistique (*) p < 0,05.
TABLEAU X
Comme on peut le voir, l'effet stimulateur de Fraxiparine® sur la production des plaquettes dure au moins 5 jours après la dernière injection. Ces résultats indiquent ou'in vivo, la Fraxiparine® augmente spécifiquement ia production de megacaryocytes et de plaquettes.
3- Résultats obtenus avec d'autres glycosaminoglycanes ou leurs . analogues, fragments ou fractions sur l'hématopoïèse
Le dermatane sulfate, le dextrane sulfate (5000 Da), l'héparine, le Produit A et le Produit B ont été injectés de la même façon que la Fraxiparine®, à une concentration de 10 μg/injection et par souris. Les échantillons de moelle et de sang ont été prélevés au jour 2, après la dernière injection. Les résultats de cette étude sont donnés dans le Tableau XI. TABLEAU XI
(*) p < 0,05
On constate, comme pour la Fraxiparine®, que les produits testés sont capables de promouvoir la production des megacaryocytes et des plaquettes (Produit A).
EXEMPLE 5
Effets de la Fraxiparine®. du dextrane sulfate et du Produit B sur l'insuffisance médullaire entraînée par l'iniection de 5-fluorouracyle
Des souris Balb/c (5-10 souris par groupe), ont subi initialement une injection de 150 mg kg de 5-fluorouracyie. Deux jours après, la Fraxiparine® (40 Ul/kg)) ou le Produit B (40 Ul/kg), ont été injectés par voie sous-cutanée (une injection par jour pendant 4 jours). Pour les souris "témoin" on a utilisé du tampon phosphate (PBS-Eurobio). Les animaux ont été tués par dislocation cervicale. Les cellules médullaires ont été obtenues à partir des fémurs et le sang a été obtenu par ponction cardiaque. Les cellules médullaires à la concentration de 5.104 par ml, ont été remises en culture en cinq exemplaires en présence de sérum aplasique de porc pendant une semaine, pour tester le nombre de CFU-MK. Le nombre de megacaryocytes (MK) a été évalué sur les cellules médullaires non cultivées mais ensemencées dans des boîtes de culture après leur obtention à partir de fémurs (Han Z.C. et al ; CR Acad. Sci. Paris, 1991, 3 3, pp 553-558). Le nombre de plaquettes, de globules blancs et le taux d'hémoglobine ont été mesurés en utilisant un compteur hématopoïétique automatique.
Les résultats indiqués dans le Tableau XII représentent la moyenne ± SEM. Signification statistique (*) p < 0,05. TABLEAU XII
(*) : PBS = Témoin
Les résultats obtenus montrent que l'administration de Fraxiparine® aux souris traitées par le 5-fluorouracyle accélère la récupération mégacaryocytaire. Ainsi aux jours 2 et 3, après l'injection de Fraxiparine®, le nombre de CFU-MK et de megacaryocytes isolés, augmente sensiblement dans la moelle ainsi que le nombre de plaquettes.
Le dextrane sulfate (5000 Da) et le Produit B ont été injectés de la même façon que la Fraxiparine®, à une dose de 10 μg/injection aux souris traitées par le 5-fluorouracyle. L'administration de ces deux produits accélère également la récupération des plaquettes au jour 2 après la dernière injection.
EXEMPLE 6
Expérimentations complémentaires visant à démontrer la spécificité de l'action des αlvcosaminoαlvcanes
L'effet de la protamine sulfate (Laboratoires Choay, Paris), le principal agent neutralisant de l'héparine a été testé dans les cultures de moelle murine selon le protocole décrit dans l'Exemple 1. La protamine, aux concentrations de 50-100 μg/ml, neutralise complètement l'activité de la Fraxiparine®.
L'héparinase (Sigma USA) et la chondroïtinase ABC (Sigma, USA), lorsqu'elles sont ajoutées aux concentrations de 0,1-1 μg/ml, inhibent de manière significative la formation de colonies mégacaryocytaires. Ces résultats montrent bien que les glycosaminoglycanes sont responsables de l'activité constatée sur la mégacaryocytopoïèse.
Les résultats de ces études sont respectivement regroupés dans les Tableaux XIII et XIV. Ils représentent la moyenne de 3 expériences ± SEM. Signification statistique (*) p < 0,05.
TABLEAU XIII Effets de la protamine sulfate sur l'action de la Fraxiparine® dans les cultures de moelle murine
TABLEAU XIV
Effets de l'héparinase et de la chondroïtinase ABC sur la formation de colonies MK in vitro (2.105 cellules)

Claims

REVENDICATIONS
1- Utilisation de glycosaminoglycanes exogènes, de leurs analogues, de leurs fractions, fragments ou dérivés, pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des thrombopénies.
2- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est l'héparine, l'héparane sulfate, leurs analogues, ainsi que leurs fractions fragments et dérivés.
3- Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène, est une héparine de bas poids moléculaire.
4- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est le chondroïtine sulfate 4-S, le chondroïtine sulfate 6-S, le dermatane sulfate, leurs fractions, fragments ou leurs dérivés.
5- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane exogène est l'acide hyaiuronique, ses fractions fragments ou ses dérivés.
6- Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les analogues des glycosaminoglycanes sont choisis parmi le dextrane sulfate, le pentosane polysulfate, l'acide alginique sulfaté, l'acide lactobionique sulfaté, le polyvinyl sulfate ou le sucralfate.
7- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments, ou dérivés sont dépourvus d'action anticoagulante.
8- Composition pharmaceutique pour le traitement des thrombopénies renfermant comme principe actif, des glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments ou dérivés. 9 - Composition pharmaceutique pour le traitement des thrombopénies, renfermant comme principe actif, des glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments ou dérivés en association avec un autre composé utilisable dans le traitement des thrombo¬ pénies.
10 - Procédé pour le traitement des thrombopénies, qui comprend l'administration, à un être humain qui en a besoin, d'une quantité efficace d'un composé choisi parmi les glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments et dérivés-
11 - Procédé selon la revendication 10, qui comprend 1'administration du composé par voie parentérale à une dose journalière de 40 μg à 2 mg par kg de poids corpo- rel.
12 - Procédé selon la revendication 10, qui comprend 1'administration du composé par voie orale à une dose journalière de 40 μg à 20 mg par kg de poids corporel.
13 - Procédé pour le traitement des thrombopénies, qui comprend l'administration, à un être humain qui en a besoin, d'une quantité efficace d'un composé choisi parmi les glycosaminoglycanes exogènes, leurs analogues, leurs fractions, fragments et dérivés, en association avec une quantité efficace d'un autre composé pour le traitement des thrombopénies.
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