EA040607B1 - Молекула биспецифического антитела - Google Patents

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к молекуле биспецифического антитела, а также к способу ее продуцирования, применения и молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу биспецифического антитела. В частности, изобретение предусматривает получение молекулы антитела, способной к опосредованию ограниченной клеткой-мишенью активации иммунных клеток.

Уровень техники

Моноклональные антитела к комплексу антиген-специфического Т-клеточного рецептора (TCR) и CD3 способны эффективно активировать Т-клетки. Однако данная активация требует мультимеризации антитела через его Fc-фрагмент на поверхности клеток, экспрессирующих Fc-рецепторы, что часто также обеспечивает дополнительные сигналы активации Т-клеток (Davis, L., Vida, R. and Lipsky, P.E., Regulation of human T lymphocyte mitogenesis by antibodies to CD3, J. Immunol. (1986), 137:3758-3767).

Биспецифические антитела, которые распознают как антиген на клетках-мишенях (например, FLT3 или CD19 на лейкозных клетках, CSPG4-антиген на клетках меланомы или EGFR на клетках глиобластомы), так и комплекс антиген-специфического Т-клеточного рецептора и CD3 (TCR/CD3-комплекс), подобным образом способны активировать Т-клетки (Jung, G., Ledbetter, J.A., Muller-Eberhard, H.J., Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1987), 84:4611-4615; Jung, G., Eberhard, H.J., An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today (1988), 9:257-260; Jung, G., Brandl, M., Eisner, W., Fraunberger, P., Reifenberger, G., Schlegel, U., Wiestler, O.D., Reulen, H.J., Wilmanns, W. Local immunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibody fragments and resting autologous lymphocytes: evidence for in situ T-cell activation and therapeutic efficacy, Int. J Cancer. (2001), 91:225-30) и в дополнение к этому фокусировать активированные клетки на клетке-мишени (Staerz, U.D., Kanagawa, О., and Bevan, M.J., Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells, Nature (1985), 314:628-631; Perez, P., Hoffman, R.W., Shaw, S., Bluestone, J.A., and Segal, D.M. Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cell antibody, Nature (1985), 316:354-356; Jung, G., Honsik, C.J., Reisfeld, R.A. and Muller-Eberhard, H.J. Activation of human peripheral blood mononuclear cells by anti-T3: killing of tumor target cells coated with anti-target-anti-T3 conjugates, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:4479-4483, 1986). В результате происходит опосредованный Т-клеткой лизис опухолевых клеток. Антитела, агонистические к костимулирующей Т-клетку молекуле, такой как CD28, усиливают активацию Т-клетки, опосредованную анtu-CD3. Такие костимулирующие антитела особенно эффективны, если они также сформированы в биспецифическом формате (Grosse-Hovest, L., Hartlapp, I., Marwan, W., Brem, G., Rammensee, H.G., and Jung, G., A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing, Eur. J. Immunol. (2003), 33:1334-1340). В любом случае мы считаем безусловным требованием для терапевтического применения биспецифических антител, характеризующихся специфичностью в отношении CD3, чтобы связывание с Fc-рецепторами было исключено (Jung, G., Eberhard, H.J., An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today (1988), 9:257-260; Jung, G., Freimann, U., Von Marshall, Z., Reisfeld, R.A., Wilmanns, W., Target cell-induced T cell activation with bi- and trispecific antibody fragments, Eur. J. Immunol. (1991), 21:2431-2435). Такое связывание с Fcрецепторами привело бы к активизации Т-клеток in vivo, что случается независимо от связывания с антигеном-мишенью в любом месте, где могут находиться экспрессирующие Fc-рецептор клетки, например, внутри всей гематопоэтической, лимфатической и ретикулоэндотелиальной системы. Исходя из опыта подобная активация Т-клеток ведет к системной активации Т-клеток, сопровождаемой синдромом выброса цитокинов - весьма неблагоприятной побочной реакции при терапевтическом применении цитокинов или антител, активирующих Т-клетки (Rosenberg, S.A., Lotze, M.T., Yang, J.C., Aebersold, P.M., Linehan, W.M., Seipp, C.A., and White, D.E., Experience with the use of high-dose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients, Ann. Surg. (1989), 210:474-484; Tibben, J.G., Boerman, O.C., Massuger, L.F., Schijf, C.P., Claessens, R.A., and Corstens, F.H., Pharmacokinetics, biodistribution and biological effects of intravenously administered bispecific monoclonal antibody OC/TR F(ab')2 in ovarian carcinoma patients, Int. J. Cancer (1996), 66:477-483; Kroesen, B.J., Buter, J., Sleijfer, D.T., Janssen, R.A., van der Graaf, W.T., The, Т.Н., de, L.L., Mulder, N.H., Phase I study of intravenously applied bispecific antibody in renal cell cancer patients receiving subcutaneous interleukin 2, Br. J. Cancer (1994), 70:652-661). Таким образом, целью при форматировании биспецифических антител CD3 должно быть предотвращение Fc-опосредованной системной активации Т-клеток и обеспечение за счет этого возможности ограниченной активации клеток-мишеней, которая зависит исключительно от связывания части-мишени биспецифического антитела с соответствующим антигеном-мишенью (Jung, G., Eberhard, H.J., An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today (1988), 9:257-260; Jung, G., Freimann, U., Von Marshall, Z., Reisfeld, R.A., Wilmanns, W., Target cell-induced T cell activation with bi- and trispecific antibody fragments, Eur. J. Immunol. (1991), 21:2431-2435). Из сказанного выше следует, что при выборе антигена-мишени необходимо максимально возможно следить за экспрессией, ограниченной патогенными клетками. За счет этого активация непатогенными клетками с сопутствующим выбросом цитокинов удерживается на максимально возможном низком уровне.

Подобные соображения распространяются на случаи конструирования биспецифических антител,

- 1 040607 содержащих агонистические эффекторные антитела, связывающиеся с триггерными рецепторами на иммунных клетках, отличных от Т-клеток, такими как CD16, экспрессирующимися на NK-клетках. Так или иначе Fc-опосредованное связывание антител с Fc-рецепторами следует избегать, следуя доводам, приведенным выше относительно Т-клеток.

Биспецифическое антитело, клиническая разработка которого наиболее продвинулась сегодня, представляет собой Blinatumomab (Micromet, Inc., Роквил, Мэриленд, США) - биспецифическое одноцепочечное антитело с CD19χCD3-специфичностью, обладающее замечательной терапевтической активностью против клеток лимфомы и лейкемии (Bargou, R. et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science (2008), 321:974-977; Topp, M.S. et al., Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival, J. Clin. Oncol. (2011), 29:2493-2498).

Поскольку одноцепочечный формат не содержит какой-либо участок Fc-части, это антитело представляет собой клетку-мишень, ограниченную в истолкованном выше смысле, т.е. оно активирует Т-клетки лишь в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих CD19 (Brischwein, K. et al., Strictly target cell-dependent activation of T cells by bispecific single-chain antibody constructs of the BiTE class, J. Immunother. (2007), 30:798-807).

Однако CD19 также экспрессируется на нормальных В-клетках таким образом, что несмотря на ограниченность клетки-мишени после терапевтического применения происходит системный выброс цитокинов, вызывающий значительную цитотоксичность уже при суточных дозах около 100 мкг (Bargou, R., et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science (2008), 321:974-977; Topp, M.S. et al., Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival, J. Clin. Oncol. (2011), 29:2493-2498).

Более того, одноцепочечный формат имеет такие недостатки, как (i) молекулярная масса около 50 кДа относительно низка и связана с коротким периодом полураспада сыворотки;

(ii) антитела этого формата легко агрегируют; и (iii) их трудно получать обычной ферментацией (Grosse-Hovest, L., Hartlapp, I., Marwan, W., Brem, G., Rammensee, H.G., Jung, G., A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing, Eur. J. Immunol. (2003), 33:1334-1340; Grosse-Hovest, L. et al., Cloned transgenic farm animals produce a bispecific antibody for T cell-mediated tumor cell killing, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2004), 101:6858-6863).

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение молекулы биспецифического антитела, которая преодолевала бы по меньшей мере некоторые из вышеуказанных недостатков и которую можно было бы широко применять в терапии, помимо прочих, для строго ограничиваемой клеткоймишенью активации иммунных клеток, как было описано выше.

Краткое описание изобретения

Первым аспектом настоящего изобретения является рекомбинантная молекула биспецифического антитела. Рекомбинантная молекула биспецифического антитела состоит из Fab-фрагмента, одноцепочечного Fv-фрагмента и С_Н2-домена иммуноглобулина. Fab-фрагмент включает первый сайт связывания первого антигена. Одноцепочечный Fv-фрагмент включает второй сайт связывания второго антигена. Fab-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент сопряжены друг с другом через С_Н2-домен. В типовых вариантах реализации происходит замена остатков цистеина, образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями (С226 и С229 в иммуноглобулинах (IgG) человека).

Вторым аспектом настоящего изобретения является тетрамерная молекула антитела. Тетрамерная молекула антитела содержит димер молекулы антитела по первому аспекту. Димер в целом определяется связью между остатками цистеина двух молекул антитела по первому аспекту, а именно между цистеинами в шарнирной области. Такими остатками цистеина обычно являются сохранившиеся аминокислоты (С226 и С229 в иммуноглобулинах IgG человека).

Третьим аспектом настоящего изобретения является рекомбинантная молекула биспецифического антитела. Рекомбинантная молекула биспецифического антитела включает Fab-фрагмент, содержащий первый сайт связывания первого антигена, одноцепочечный Fv-фрагмент, содержащий второй сайт связывания второго антигена, С_Н2-домен иммуноглобулина и С_Н3-домен иммуноглобулина. Fab-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент связаны через С_Н2-домен/С_Н3-домен. По меньшей мере один аминокислотный остаток С_Н2-домена, способный опосредствовать связывание с Fc-рецепторами, отсутствует или мутирован. В типовых вариантах осуществления этого аспекта происходит замена по меньшей мере одного из остатков цистеина, формирующих межцепочечные дисульфидные связи (С226 и С229 в IgG-антителах человека). В некоторых вариантах реализации такие молекулы могут содержать дополнительные модификации в области С_Н3, которые предотвращают димеризацию с гомотипическими С_Н3-доменами.

Четвертым аспектом настоящего изобретения является тетрамерная молекула антитела. Тетрамер

- 2 040607 ная молекула антитела состоит из димера рекомбинантной молекулы биспецифического антитела по третьему аспекту. Димер, как правило, определяется связью между сохранившимися цистеинами в шарнирной области (С226 и С229 в IgG-антителах человека).

Пятым аспектом настоящего изобретения является еще одна рекомбинантная молекула биспецифического антитела. Эта молекула антитела включает Fab-фрагмент, содержащий первый сайт связывания первого антигена, одноцепочечный Fv-фрагмент, содержащий второй сайт связывания второго антигена, С_Н2-домен иммуноглобулина и С_Н3-домен иммуноглобулина. Fab-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент сопряжены друг с другом через С_Н2-домен и С_Н3-домен. По меньшей мере один остаток цистеина этой молекулы антитела, способный формировать дисульфидный мостик димеризации, отсутствует или мутирован.

Шестым аспектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует молекулу антитела по одному из первого, второго, третьего, четвертого или пятого аспектов.

Седьмым аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция включает молекулу антитела по одному из первого, второго, третьего, четвертого и пятого аспектов.

Восьмым аспектом настоящего изобретения является способ лечения болезни. Способ включает применение молекулы антитела по одному из первого, второго, третьего, четвертого и пятого аспектов. В целом молекулу антитела вводят пациенту, нуждающемуся в этом.

Девятым аспектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по шестому аспекту.

Десятым аспектом настоящего изобретения является способ продуцирования молекулы антитела по одному из первого, второго, третьего, четвертого или пятого аспектов. Способ включает экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу антитела, в условиях, допускающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты.

Эти аспекты изобретения будут более полно раскрыты с учетом представленного ниже описания, чертежей и неограничивающих примеров.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 схематично изображены варианты реализации молекул биспецифического антитела согласно изобретению.

На фиг. 1А изображена бивалентная молекула, включающая Fab-фрагмент, С_Н2-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Молекула антитела имеет главную цепь, в которой С_Н2-домен своим N-концом сопряжен с Chi- и VH-доменами тяжелой цепи Fab-фрагмента, а С-концом - с одноцепочечным Fv-фрагментом (формат bsFc-1/2).

На фиг. 1В изображена двухвалентная молекула антитела с главной цепью, в которой СН2-домен сопряжен с легкой цепью Fab-фрагмента, т.е. главная цепь которой содержит V_L- и CL-домен, шарнирную область, С_Н2-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент.

На фиг. 1С показана бивалентная молекула антитела, в которой главная цепь включает V_L- и С_н1-домен, шарнирную область, С_Н2-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Вторая цепь с более низкой массой включает V_H- и CL-домен. Таким образом, Fab-фрагмент молекулы антитела на фиг. 1С не является классическим (имеющим естественное происхождение), в котором вариабельная область легкой и тяжелой цепей сцеплена с соответствующей константной областью (соответственно C_l и С_н1), a представляет собой гибридный Fab-фрагмент, в котором вариабельная область сцеплена с константной областью противоположной цепи, т.е. V_н-домен сцеплен с CL-доменом, a VL-домен сцеплен с С_н1-доменом.

На фиг. 1D изображена бивалентная молекула антитела, в главной цепи которой С_Н2-домен связан с C_l- и V_н-доменом. Вторая цепь более низкой массы включает V_L- и С_н1-домен. Таким образом, молекула антитела на фиг. 1D содержит гибридный Fab-фрагмент (включающий первый сайт связывания), который также содержится в молекуле на фиг. 1С.

На фиг. 1E изображена бивалентная молекула антитела с конфигурацией как на фиг. 1А, в которой аминокислоты в С_Н2-домене и/или шарнирная область модифицированы (обозначено X, как показано на фиг. 1O, формат bsFc^ko-1/2). Подобным образом, такие модификации могут быть включены в молекулы, изображенные на фиг. 1B-1D. В молекулах, изображенных на фиг. Ία-IE, происходит замена остатков цистеина, формирующих межцепочечные дисульфидные связи (С226 и С229 в антителах IgG человека), для предотвращения образования димеров (·).

На фиг. 1F в качестве иллюстрации изображен вариант реализации с тетравалентной молекулой, которая является димером конфигурации, изображенной на фиг. 1А. Подобная молекула может быть также продуцирована в конфигурациях Fab, изображенных на фиг. 1B-1D с модификациями и без модификаций Fc, изображенных на фиг. 1E. Перечень этих модификаций приведен на фиг. 1P.

На фиг. 1G в качестве иллюстрации изображен вариант реализации с тетравалентной молекулой, которая является димером конфигурации, включающей Fab-фрагмент, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Аминокислоты в С_Н2-домене и в шарнирной области модифицированы (X), как резюмировано в таблице на фиг. 1P. Две главные цепи антитела включают V_H- и С_н1-домен, шарнирную

- 3 040607 область, СН2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент (формат bsFc^ko-1). Подобные молекулы также могут быть построены в конфигурациях Fab, изображенных на фиг. Ία-IE. Во всех этих молекулах димеры определяются остатками цистеина в шарнирной области (С226 и С229 в антителах IgG человека).

На фиг. 1H изображена тетравалентная молекула, являющаяся димером конфигурации, включающей Fab-фрагмент, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. В пределах Fab-фрагмента две главные цепи антитела включают VH- и CL-домен.

На фиг. 1I показано тетравалентное антитело с общей структурой, как на фиг. 1G. В отличие от варианта реализации по фиг. 1G, у этого антитела только одна из двух основных цепей содержит аминокислоты в С_Н2-домене и шарнирной области, которые были модифицированы (обозначено X).

На фиг. 1J изображена тетравалентная молекула, две основные цепи которой включают V_L- и CL-домен, шарнирную область, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент.

На фиг. 1K изображена тетравалентная молекула с двумя структурно отличающимися Fab-фрагментами. Первая главная цепь антитела включает V_L- и CL-домен, шарнирную область, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Вторая главная цепь антитела включает VH- и С_н1-домен, шарнирную область, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент.

На фиг. 1L изображена тетравалентная молекула, являющаяся димером конфигурации, включающей Fab-фрагмент, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. В структуре Fab-фрагмента две главные цепи антитела включают V_L- и С_н1-домен.

На фиг. 1М изображена еще одна тетравалентная молекула с двумя структурно отличающимися Fab-фрагментами. Первая главная цепь антитела включает V_L- и С_н1-домен, шарнирную область, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Вторая главная цепь антитела включает VH- и CL-домен, шарнирную область, С_Н2-домен, С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент.

На фиг. 1N в качестве иллюстрации изображен вариант реализации бивалентной молекулы, включающей Fab-фрагмент, С_Н2- и С_Н3-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. Молекула антитела имеет главную цепь, в которой С_Н2-домен своим N-концом сопряжен с С_н1- и VH-доменами тяжелой цепи Fab-фрагмента, а своим С-концом - с С_Н3-доменом, который своим С-концом сопряжен с одноцепочечным Fv-фрагментом. Такая молекула также может быть построена в Fab-конфигурациях, изображенных на фиг. 1A-1D, и может содержать модификации Fc в шарнирной области и С_Н2-области (X), как изображено на фиг. 1E и 1O. Дополнительно они могут содержать модификации в С_Н3-домене, которые предотвращают димеризацию этого домена и могут влиять на связывание с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Примеры остатков, которые участвуют в димеризации и, следовательно, могут быть модифицированы делецией или мутацией, включают Т366, L368, F405, Y407 и K409 (см. Dall'Aqua et al., Contribution of domain interface residues to the stability of antibody CH3 domain homodimers, Biochemistry (1998), vol. 37, issue 26, p. 9266-9273). Другие контактирующие остатки поверхности сопряжения С_Н3-домена, которые могут быть подвергнуты модификации, включают Q347, Y349, Т350, L351, L368, K370, K392, Т394, Р395, V397, L398, d399, F405, Y407 и K409 (см. S. Miller, Protein-Protein Recognition and the Association of Immunoglobulin Constant Domains, J. Mol. Biol. (1990), vol. 216, p. 965-973; и J. Deisenhofer Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment В of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution, Biochemistry (1981), vol. 20, p. 2361-2370); а также, поскольку речь идет о связывании неонатального Fc-рецептора, например, следующие остатки аминокислот С_Н2-домена: Т250, М252, S254, Т256, Т307 Н310; и С_Н3-домена: Е380 М428, Н433, N434, Н435 (см. обзор Roopenian & Akilesh; FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age, Nature Reviews Immunology (2007), vol. 7, p. 715-725). Во всех этих молекулах, относящихся к изобретению, происходит замена остатков цистеина, образующих межцепочечные дисульфидные связи (С226 и С229 в антителах IgG человека), для предотвращения формирования димеров (·).

Дополнительные иллюстративные варианты реализации, не изображенные на фиг. 1A-1N, включают молекулы, в которых, по сравнению с изображенными вариантами реализации, одноцепочечный Fv-фрагмент на С-конце, скорее, может иметь VL-VH-, нежели VH-VL-ориентацию, означая, что VL-домен сцеплен с соответствующей константной областью.

На фиг. 1O дан перечень иллюстративных модификаций, которые могут быть внесены в варианты бивалентного антитела, изображенные на фиг. 1A-1D и 1N, с получением Fc-дефицитных производных, как представлено в качестве примера на фиг. 1E. Модификации идентичны показанным на фиг. 1P, за исключением сохранившихся цистеинов (С226 и С229 в антителах IgG человека). Нумерация аминокислот соответствует нумерации Кабата (индекс ЕС), wt=последовательность дикого типа IgG1 человека; А1=нокаут; Glycan=Δ1-нокаут с делецией сахаридных фрагментов =297; Δ2-5 последующие варианты нокаута после Δ1; - = аминокислота была подвергнута делеции.

На фиг. 1P дан перечень возможных модификаций, используемых для продуцирования тетравалентной молекулы, изображенной на фиг. 1F-1M. Нумерация аминокислот соответствует нумерации Кабата (индекс ЕС), wt=последовательность дикого типа IgG1 человека; Δ1=нокаут; Glycan=Δ1-нокаут с делецией сахаридных фрагментов =297; Δ2-5 последующие варианты нокаута после Δ1; - = аминокислота

- 4 040607 была подвергнута делеции.

На фиг. 2А-2С схематически изображена процедура клонирования при генерации оптимизированной тяжелой (главной) цепи для антител, изображенных на фиг. 1, в виде бивалентных или тетравалентных биспецифических антител с модифицированными Fc-частями с ослабленной ADCC.

i) Изображен первоначальный вектор на каркасе плазмиды pcDNA3 (Invitrogen; промотор CMV и сигнал терминации бычьего гормона роста удалены). Эта плазмида содержит тяжелую цепь D1-изотипа Ig человека с регуляторными элементами локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

ii) Показана замена элемента VDJ (вариабельной области тяжелой цепи) или VJ (вариабельной области легкой цепи) через сайт рестрикционной эндонуклеазы AatII и ClaI.

iii) Показана простая замена (через сайты рестрикции MluI и SpeI) полной тяжелой цепи D1-изотипа Ig человека на кодирующую последовательность для scFv-фрагмента и на элемент ДНК с подвергнутым делеции С_Н3-доменом и модифицированными шарнирной областью и С_Н2-доменом с получением в результате тяжелой цепи бивалентного специфического антитела. Для некоторых вариантов антител, в частности, изображенных на фиг. 1D, C_H1-домен может быть заменен CL-доменом.

iv) Замена модифицированного фрагмента CH1-H-CH2 (через сайты рестрикции MluI и BspEI) на элемент CH1-H-CH2-CH3 с модифицированными шарнирной областью и С_Н2-доменом формирует в результате тяжелую цепь тетравалентного биспецифического антитела, как показано в секции v). В случае дополнительной или как таковой замены цистеинов в позиции С226 и С229 результатом станет образование молекул бивалентных специфических антител, как показано на фиг. 1N.

v) Замена фрагмента scFv (через сайты рестрикции BspEI и SpeI) на фрагмент scFv со специфичностью любого другого антигена или другой V_H- и VL-ориентацией.

Замены iv) и v) могут быть объединены.

На фиг. 2В и 2С подробно показаны области, смежные со вставленными VDJ-CH1 и scFv-элементами соответственно.

На фиг. 2D и 2F изображено схематическое представление процедуры клонирования для генерации легкой цепи моноспецифических антител человека.

i) Родительский вектор на каркасе плазмиды pCR-Script (Stratagene; промотор lacZ и сигнал терминации удалены) содержит VJ-область и С-область k-гена человека совместно с регуляторными элементами локуса легкой цепи иммуноглобулина.

ii) Замена элемента VJ (вариабельной области легкой цепи) или элемента VDJ (вариабельной области тяжелой цепи) через рестрикционные эндонуклеазы XhoI и SpeI.

iii) Замена элемента CL (константной легкой цепи) через рестрикционные эндонуклеазы PmlI и BsmBI.

На фиг. 2Е и 2F подробно показаны области, смежные со вставленными элементами VJ и CL.

На схемах прямоугольниками обозначены экзоны, кружками - энхансерные элементы, тонкими линиями - UT-области и последовательности интронов;

L1 и L2 - лидерные последовательности, кодируемые двумя различными экзонами (также показаны на фиг. 2В и 2Е);

V - вариабельные области;

D - область диверсификации;

J - области сопряжения;

C_H1, C_H2, С_Н3, CL - экзоны константных тяжелых и легких цепей;

Н - шарнирный участок;

sc Fv - одноцепочечный Fv-фрагмент;

X=модификации аминокислот.

NotI, AatII, ClaI, MluI, BspEI, SpeI, XhoI, KpnI, XhoI, SpeI, PmlI, BsmBI, SaiI - рестрикционные эндонуклеазы, используемые для клонирования;

AmpR и NeoR обозначают области кодирования устойчивости к ампициллину и неомицину соответственно.

Сайты расщепления для секреторных сигнальных пептидов обозначены как |; границы между экзонами и нитронами обозначены как [,].

На фиг. 3А изображена ограниченная клеткой-мишенью активация Т-клетки (включение ³Н-тимидина) двумя биспецифическими антителами разного формата, имеющими специфичность FLT3xCD3, в соответствии с настоящим изобретением. На клетках используются антитела, которые не включают (не закрашенные символы) и которые включают (закрашенные символы) ELT3/CD19-положительные REH-клетки.

о, ·: бивалентная молекула антитела, как изображено на фиг. 1А, включающая последовательность Glycan, как изображено на фиг. 1E и 1O (формат bsFc^ko-l/2), Fab-фрагмент с сайтом связывания FLT3, фрагмент scFv с сайтом связывания CD3.

□, : тетравалентная молекула антитела, как изображено на фиг. 1G, с последовательностью D1, как изображено на фиг. 1P (формат bsFc^ko-1).

Fab₂-фрагмент с сайтом связывания FLT3, scFv-фрагмент с сайтом связывания CD3.

*: интактное моноспецифическое анти-CD3 антитело без клеток-мишеней.

- 5 040607

В отсутствие клетки-мишени интактные моноспецифические CD3-антитела эффективно активируют Т-клетки в зависимости от Fc/FcR, тогда как биспецифические антитела неэффективны. Это показывает, что в биспецифическом формате изобретения связывание Fc/FcR фактически полностью отсутствует.

На фиг. 3В изображена ограниченная клеткой-мишенью активация Т-клетки (выброс TNF) различными бивалентными специфическими антителами согласно изобретению, используемыми на клетках, не включающих (не закрашенные символы) и включающих (закрашенные символы) FLT3/CD19-положительные REH-клетки.

о, ·: бивалентная молекула антитела, как изображено на фиг. 1А, включающая последовательность Glycan, как изображено на фиг. 1E и фиг. 1O, Fab-фрагмент с сайтом связывания FLT3, scFv-фрагмент с сайтом связывания CD3;

◊, ♦: бивалентная молекула антитела, как изображено на фиг. 1E, включающая последовательность Glycan, как изображено на фиг. 1O, Fab-фрагмент с сайтом связывания CD 19, scFv-фрагмент с сайтом связывания TCR;

V,V: бивалентная молекула антитела, как изображено на фиг. 1E, включающая последовательность Glycan, как изображено на фиг. 1O, Fab-фрагмент с сайтом связывания CSPG4, scFv-фрагмент с сайтом связывания CD3.

Хондроитинсульфата протеогликан CSPG4 является антигеном-мишенью клеток меланомы и не экспрессируется на REH-клетках.

На фиг. 4A, 4B изображен специфический лизис REH-клеток, экспрессирующих FLT3/CD19 (А), и SKMel63-клеток, экспрессирующих CSPG (В), соответственно посредством биспецифических антител согласно изобретению и активированных CD8-положительных Т-клеток-киллеров в 4-часовом тестировании на выделение ⁵¹хрома.

• : FLT3xCD3, формат bsFc^ko-1/2, как изображено на фиг. 1E;

: FLT3xCD3, формат bsFc^ko-1, как изображено на фиг. 1G;

▼ : CSPG4xCD3, формат bsFc^ko-1/2, как изображено на фиг. 1E;

♦ : CD19xTCR, формат bsFc^ko-l/2, как изображено на фиг. 1E.

На фиг. 5A, 5B показано сравнение антител FLT3xCD3 одинаковой специфичности в трех разных форматах: биспецифическом одноцепочечном формате (bs-scFv), формате bsFc^ko-1/2, как изображено на фиг. 1E, и формате bsFc^ko-1, как изображено на фиг. 1G.

А: определение агрегации (в процентах) фильтрацией в геле. Агрегаты мигрируют близко к объему пустот и составляют 43, 0 и 2% соответственно для bs-scFv, bsFc^ko-1/2 и bsFc^ko-1. Сделано заключение, что образование агрегатов значительно более выражено, если антитело экспрессируется как bs-scFv, а не как bsFc^ko-1/2 или bsFc^ko-1.

В: скорость продуцирования после трансфекции генов антитела в продуцируемые клетки и очистки аффинной хроматографией. Как можно видеть, образование агрегатов значительно снижено для двух форматов Fc^ko согласно изобретению, а скорости продуцирования существенно выше, чем при биспецифическом одноцепочечном формате (bs-scFv).

На фиг. 6А изображены последовательности иллюстративных легких цепей, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Соответствующие пептидные цепи соответствуют зрелому белку без соответствующей лидерной пептидной последовательности. Последовательности имеют N-концевую вариабельную область, обозначенную жирным шрифтом, и С-концевую константную область, обозначенную курсивом. Определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области выделены подчеркиванием.

На фиг. 6В изображены последовательности иллюстративных главных цепей, которые в данном случае также могут быть названы тяжелыми цепями, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Данная главная цепь для формата bsFc-1/2 (фиг. 1E) включает VH-домен, С_н1-домен, шарнирную область, модифицированный С_Н2-домен, VL-домен и VH-домен фрагмента scFv. В примере последовательности 21) (SEQ ID NO: 26) главная цепь содержит С_Н3-домен, как изображено в примере на фиг. 1G-1M (формат bsFc^ko-1).

VH-домены обозначены жирным шрифтом, С_н1-домены - обычным, а шарнирная область, С_Н2- и С_Н3-домены - обычным шрифтом с подчеркиванием. Главная цепь также включает VL-домен, который обозначен жирным курсивом, и VH-домен (жирным шрифтом) scFv-фрагмента. VH- и VL-домены сопряжены друг с другом посредством линкера, который обозначен подчеркнутым курсивом. Определяющие комплементарность области (CDR) соответствующих VL- и VH-доменов подчеркнуты. С_Н2-домен и фрагмент scFv сопряжены друг с другом через малый линкер (GQPSG), обозначенный курсивом.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле биспецифического антитела. Эта молекула антитела сформирована из элементов, входящих в нативные, т.е. имеющие естественное происхождение, иммуноглобулины, а именно из доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина.

Термин антитело в целом относится к белковой молекуле связывания, выполняющей функции на

- 6 040607 подобие иммуноглобулинов. Типичными примерами антитела являются иммуноглобулины, а также их производные или функциональные фрагменты, сохраняющие специфичность связывания. Способы продуцирования антител известны на существующем уровне техники. Термин антитело включает также иммуноглобулины (Ig) различных классов (т.е. IgA, IgG, IgM, IgD и IgE) и подклассов (таких как IgG1, IgG2 и т.д.). Иллюстративными примерами антител являются Fab-фрагменты, F(ab')₂, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), димерные антитела или доменные антитела (Holt L.J. et al., Trends Biotechnol., 21(11), 2003, 484-490). Доменные антитела могут представлять собой однодоменные антитела, антитела с одиночным вариабельным доменом или одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий только один вариабельный домен, который может быть V_H или VL, специфически связывающий антиген или эпитоп независимо от других V-областей или доменов. Такой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина может включать не только выделенный полипептид одиночного вариабельного домена антитела, но и полипептид больших размеров, содержащий или состоящий из одного или более мономеров полипептидной последовательности одиночного вариабельного домена антитела. Таким образом, под определение термина антитело попадают такие формы, как химерные, одноцепочечные и гуманизированные антитела.

Молекула антитела согласно изобретению может нести один или более доменов, содержащих последовательность, которая по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% идентична последовательности с соответствующим имеющим естественное происхождение доменом иммуноглобулина М, иммуноглобулина G, иммуноглобулина А, иммуноглобулина D или иммуноглобулина Е. В этом отношении следует отметить, что термин примерно или приблизительно, используемые в данном тексте, обозначают отклонение от названных величин или диапазонов значений в пределах 20%, например в пределах 10% или в пределах 5%.

Следовательно, главная цепь (более длинная полипептидная цепь) молекулы антитела по изобретению может включать или состоять из доменов с указанной выше идентичностью последовательности с соответствующим доменом мю-тяжелой цепи иммуноглобулина, гамма-тяжелой цепи иммуноглобулина, альфа-тяжелой цепи иммуноглобулина, дельта-тяжелой цепи иммуноглобулина или эпсилон-тяжелой цепи иммуноглобулина. Кроме того, молекула антитела по изобретению может включать или состоять из доменов с вышеуказанной идентичностью последовательностей с соответствующим доменом лямбдалегкой цепи иммуноглобулина или каппа-легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации полные домены тяжелой цепи молекулы антитела по изобретению по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% идентичны последовательностям соответствующих областей мю-тяжелой цепи иммуноглобулина, гамма-тяжелой цепи иммуноглобулина (таких, как тяжелые цепи гамма-1, гамма-2, гамма-3 или гамма-4), альфа-тяжелой цепи иммуноглобулина (таких, как тяжелые цепи альфа-1 или альфа-2), дельта-тяжелой цепи иммуноглобулина или эпсилон-тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации все домены легкой цепи, присутствующие в молекуле антитела по изобретению, по меньшей мере примерно на 60 %, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% идентичны последовательностям соответствующих областей лямбда-легкой цепи иммуноглобулина (таких, как легкие цепи лямбда-1, лямбда-2, лямбда-3 или лямбда-4) или каппалегкой цепи иммуноглобулина.

Процент (%) идентичности последовательности в отношении аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, попарно идентичных аминокислотным остаткам в эталонной последовательности, т.е. молекулы антитела по настоящему изобретению, после выравнивания последовательностей и внесения при необходимости гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть выполнена различными известными из уровня техники способами, например, с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, такого как BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут задавать необходимые параметры для измерительного выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых последовательностей по всей длине сравниваемых последовательностей. Это же справедливо в отношении раскрытых в настоящем документе последовательностям нуклеотидов.

- 7 040607

Термин вариабельный относится к доменам иммуноглобулина, проявляющим вариабельность в своей структуре и участвующим в определении специфичности и аффинности конкретного антитела (т.е. к вариабельному(ым) домену(ам)). Вариабельность имеет неравномерное распределение в пределах вариабельных доменов антител; она концентрируется в субдоменах каждой вариабельной области тяжелых и легких цепей. Такие субдомены называют гипервариабельными участками, HVR или HV, или определяющими комплементарность областями (CDR). Более консервативные (т.е. негипервариабельные) части вариабельных доменов называют каркасными участками (FR). Каждый из вариабельных доменов тяжелых и легких цепей естественного происхождения включает четыре каркасных участка FR, как правило, β-образной слоистой конфигурации, которые присоединены тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть β-слоистой структуры. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости от участка FR и, вместе с гипервариабельными участками другой цепи вносят свой вклад в формирование сайта связывания антигена (см. Kabat и др. ниже). В основном иммуноглобулины естественного происхождения включают шесть CDR (см. ниже): три в V_H (H1, Н2, Н3) и три в V_L (L1, L2, L3). В иммуноглобулинах естественного происхождения Н3 и L3 проявляют наибольшую диверсификацию из шести CDR, а Н3, в частности, как полагают, играет уникальную роль в придании иммуноглобулинам узконаправленной специфичности. Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антигена, но проявляют разнообразные эффекторные функции, такие как, например, антителозависимая, клеточноопосредованная цитотоксичность и активация комплемента.

Соответствующие иммуноглобулиновые мю-тяжелая цепь, гамма-тяжелая цепь, альфа-тяжелая цепь, дельта-тяжелая цепь, эпсилон-тяжелая цепь, лямбда-легкая цепь или каппа-легкая цепь могут быть любого биологического вида, например, от млекопитающих, включая грызунов, до земноводных, например, подкласса Lissamphibia, куда входят лягушки, жабы, саламандры и тритоны, или беспозвоночных. Неограничительными примерами млекопитающих служат крыса, мышь, кролик, морская свинка, белка, хомяк, еж, утконос, американская пищуха, броненосец, собака, лемур, козел, свинья, корова, опоссум, лошадь, летучая мышь, сурок, орангутан, макак-резус, шерстистая обезьяна, макака, шимпанзе, тамарин (saguinus oedipus), мартышка или человек.

Термин иммуноглобулин относится к гликопротеину, который включает по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, или к его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область тяжелой цепи (аббревиатура V_H) и константную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации константная область тяжелой цепи включает три домена: C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь имеет вариабельную область легкой цепи (аббревиатура V_L) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен C_L. Области VH и V_L могут быть также разделены на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными участками, называемыми каркасными областями (FR). CDR содержат большинство остатков, ответственных за специфическое взаимодействие антитела с антигеном. Каждая VH и VL имеет три CDR и четыре FR, расположенные от амино-конца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с эпитопом антигена.

Каждая легкая цепь иммуноглобулина включает N-концевой вариабельный (V) домен (V_L) и константный (С) домен. Каждая тяжелая цепь включает N-концевой V-домен (V_H), три или четыре С-домена (СН) и шарнирную область. Подобным образом, молекула антитела согласно настоящему изобретению содержит эти домены и области (даже при том, что один сайт связывания молекулы биспецифического антитела образован только одноцепочечным Fv-фрагментом).

Используемый здесь иммуноглобулин обычно представляет собой тетрамерный гликозилированный белок, образованный из двух легких (L) цепей приблизительно по 25 кДа каждая и двух тяжелых (Н) цепей приблизительно по 50 кДа каждая. Иммуноглобулины могут содержать две разновидности легкой цепи, называемые лямбда и каппа. В зависимости от аминокислотной последовательности в константном домене тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к пяти основным классам: A, D, Е, G и М, некоторые из которых могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Иммуноглобулин IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц в сочетании с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и содержит 10 сайтов связывания антигенов, в то время как иммуноглобулины IgA содержат от 2 до 5 из базовых 4-цепочечных элементов, способных полимеризироваться с образованием многовалентных структур в сочетании с J-цепью. В случае IgG молекулярная масса 4-цепочечного элемента в целом составляет приблизительно 150000 дальтон. Термин аминокислота или аминокислотный остаток относится к α- или β-аминокарбоновой кислоте.

Термины аминокислота или аминокислотный остаток, применяемые в отношении белка или пептида, обычно относятся к α-аминокарбоновой кислоте, известной в области техники как аминокислота, выбранная из группы, состоящей из следующего: L-аланин (Ala или А); L-аргинин (Arg или R); L-аспарагин (Asn или N); L-аспарагиновая-кислота (Asp или D); L-цистеин (Cys или С); L-глутамин (Gln

- 8 040607 или Q); L-глутаминовая кислота (Glu или Е); L-глицин (Gly или G); L-гистидин (His или Н); L-изолейцин (ILE или I); L-лейцин (Leu или L); L-лизин (Lys или K); L-метионин (Met или М); L-фенилаланин (Phe или F); L-пролин (Pro или Р); L-серин (Ser или S); L-треонин (Thr или Т); L-триптофан (Trp или W); L-тирозин (Tyr или Y) и L-валин (Val или V), хотя при необходимости могут быть использованы модифицированные, синтетические или редкие аминокислоты, такие как, например, таурин, орнитин, селеноцистеин, гомоцистин, гидроксипролин, тиопролин, йодотирозин, 3-нитротирозин, цитруллин, канаванин, 5-гидрокситриптофан, карнозин, циклолейцин, 3,4-дигидроксифенилаланин, N-ацетилцистеин, пролинол, аллилглицин или ацетидин-2-карбоновая кислота. В целом аминокислоты могут быть сгруппированы по наличию неполярной боковой цепи (например, Ala, Cys, ELE, Leu, Met, Phe, Pro, Val); отрицательно заряженной боковой цепи (например, Asp, Glu); положительно заряженной боковой цепи (например, Arg, His, Lys); или незаряженной полярной боковой цепи (например, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp и Tyr).

Термин эпитоп, также известный как антигенная детерминанта, относится к части антигена, с которой специфично связывается антитело или Т-клеточный рецептор, образуя комплекс. Из этого следует, что термин эпитоп включает в себя любую молекулу или белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Сайт(ы) связывания (паратоп) описываемой здесь молекулы антитела может(могут) специфично связаться/взаимодействовать с конформационными или непрерывными эпитопами с уникальной мишенной структурой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или сахаридные боковые цепи, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. В некоторых вариантах реализации детерминанты эпитопов содержат химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, сахаридные боковые цепи, фосфорил или сульфонил, а в определенных вариантах реализации они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Что касается полипептидных антигенов, конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется наличием двух или больше дискретных аминокислотных остатков, выделенных из первичной последовательности, которые, однако, собираются в последовательную структуру на поверхности молекулы, когда полипептид складывается в нативный белок/антиген (Sela, M., Science (1969), 166, 1365-1374; Laver, W.G. et al., Cell (1990), 61, 553-556). Два или более дискретных аминокислотных остатков, входящих в эпитоп, могут располагаться на отдельных участках одной или более полипептидных цепей. Эти остатки объединяются на поверхности молекулы, когда полипептидная(ые) цепь(и) складывает(ют)ся в трехмерную структуру со сборкой эпитопа. Напротив, непрерывный или линейный эпитоп состоит из двух или более дискретных аминокислотных остатков, которые присутствуют на одиночном линейном сегменте полипептидной цепи. В качестве иллюстративного примера контекстно-зависимый CD3-эпитоп является примером конформации указанного эпитопа. Такой контекстнозависимый эпитоп, локализованный на эпсилон-цепи CD3, может правильно развить свою конформацию, только если он встроен в остальную часть эпсилон-цепи и удерживается в правильном положении путем гетеродимеризации эпсилон-цепи с гамма- или дельта-цепью CD3. В противоположность этому контекстно-независимый CD3-эпитоп может быть N-концевым полипептидом из 1-27 аминокислотных остатков или его функциональным фрагментом в эпсилон-цепи CD3.

В целом по своей природе эпитопы могут быть линейными или прерывистыми. Таким образом, используемый здесь термин конформационный эпитоп относится к прерывистому эпитопу, образовавшемуся за счет пространственной взаимосвязи аминокислот в антигене, отличному от неразрывного ряда аминокислот. Кроме того, термин эпитоп включает в себя антигенную детерминанту гаптена, которая известна как небольшая молекула, способная выступать в роли антигена, проявляя один или более иммунологически распознаваемых эпитопов после связывания с веществом большего размера, таким как молекула большего размера, например белком.

Считается, что антитело или молекула/фрагмент антитела специфично связывается с антигеном при распознавании своего антигена-мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул. Считается, что антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если антитела взаимно конкурируют за то, чтобы только одно антитело могло связаться с эпитопом в данный момент времени, т.е. одно антитело предотвращает связывание или модулирующее воздействие другого.

В данном контексте термин специфический или специфически распознающий, также используемый как направленный на, в соответствии с настоящим изобретением означает, что молекула антитела способна специфично взаимодействовать и/или связываться по меньшей мере с двумя, например по меньшей мере с тремя или по меньшей мере с четырьмя, аминокислотами эпитопа, но по существу не связывается с другим эпитопом или антигеном. Пример такого связывания может быть приведен в качестве специфичности согласно принципу замок-ключ. Считается, что специфичность связывания реализуется специфическими мотивами в аминокислотной последовательности области связывания антитела и антитело и эпитоп или антиген связываются друг с другом в результате их первичной, вторичной или третичной структуры, а также в результате вторичных модификаций указанной структуры. Специфическое взаимодействие специфического эпитопа/сайта взаимодействия антигена со своим специфическим

- 9 040607 эпитопом/антигеном может также дать в результате простое связывание указанного сайта с антигеном. Более того, в качестве альтернативы специфическое взаимодействие сайта взаимодействия антигена со своим специфическим эпитопом/антигеном может привести к инициированию сигнала, например, вследствие индуцирования изменения конформации антигена или олигомеризации антигена.

Как правило, связывание считают специфичным, когда аффинность связывания превышает 10^-6 М. В частности, связывание считают специфическим при аффинности связывания приблизительно от 10^-8 до 10^-11 М (KD), или приблизительно от 10^-9 до 10^-11 М, или еще выше. Таким образом, молекулы антитела с аффинностью первого сайта связывания и/или второго сайта связывания в пикомолярном диапазоне (при K_D 10^-12 М) также включены в настоящее изобретение. В случае необходимости неспецифическое связывание сайта связывания может быть ослаблено без оказания существенного воздействия на специфическое связывание изменением условий связывания.

В некоторых вариантах реализации антиген, с которым связывается антитело, согласно изобретению является антигеном, входящим в состав внеклеточного матрикса, или поверхностно-клеточным антигеном. В некоторых вариантах реализации антиген, с которым связывается антитело, согласно изобретению представляет собой опухоль-ассоциированный антиген. Следует понимать, что такой опухольассоциированный антиген может быть включен во внеклеточный матрикс или представлять собой поверхностно-клеточный антиген.

Термин внеклеточный матрикс относится к тканевой области многоклеточного животного, включая человека, которая находится в межклеточном пространстве, т.е. между клетками соответствующей ткани. Внеклеточный матрикс представляет собой большей частью сеть белков, таких как фибриллярные и нефибриллярные коллагены или эластин, гликопротеинов, таких как ламинин или фибронектин, протеогликанов, таких как хондроитин сульфат или кератан сульфат, и полисахаридов, таких как гиалуроновая кислота. Среди прочего, внеклеточный матрикс служит для разделения между собой различных тканей или для регулирования межклеточной связи. В некоторых вариантах реализации опухольассоциированный антиген может экспрессироваться частично или исключительно во внеклеточном матриксе опухоли.

Используемый здесь термин поверхностно-клеточный антиген относится к молекуле, которая проявляется на поверхности клетки. Обычно такая молекула расположена в или на плазматической мембране клетки таким образом, что по меньшей мере часть этой молекулы остается доступной из окружающей среды, т.е. снаружи клетки. Соответствующая молекула состоит из или включает в себя аминокислотные и/или сахаридные фрагменты. Примером, иллюстрирующим поверхностно-клеточную молекулу, расположенную в плазматической мембране, является трансмембранный белок, который в своей трехмерной конформации имеет области гидрофильности и гидрофобности. Одна или более гидрофобных областей обеспечивают поверхностно-клеточной молекуле возможность встраивания или инсерции в гидрофобную плазматическую мембрану клетки, в то время как гидрофильные области белка проходят по каждой стороне плазматической мембраны в цитоплазму и внеклеточное пространство соответственно. Примеры поверхностно-клеточной молекулы, расположенной на плазматической мембране, включают, но без ограничения, белок с посттрансляционно модифицированным остатком цистеина, несущим пальмитоильную группу, белок, модифицированный на С-концевом остатке цистеина, несущем фарнезильную группу, или белок, модифицированный на С-конце, несущем гликозилфосфатидилинозитоловый (GPI) якорь. Эти группы способствуют ковалентному присоединению белков к наружной поверхности плазматической мембраны, где они остаются доступными для распознавания внеклеточными молекулами, такими как антитела. Примеры поверхностно-клеточных антигенов включают в себя молекулу рецептора клеточной поверхности, такого как сопряженный с G-белком рецептор (например, адренергетический рецептор β), рецептор тирозинкиназы (такой как EGFR, EGFRvIII, Her2/neu, Her2/c-neu, PDGFRa, ILR-1, TNFR, CD30, CD33 или GMCSFR), мембранный рецептор с соответствующей активностью тирозинкиназы (такой, как IL6R или LEFR) или мембранный рецептор с активностью Ser/Thr-киназы (такой, как TGFbR), которые приведены лишь в качестве нескольких примеров.

Примеры опухоль-ассоциированного антигена, входящего в состав внеклеточного матрикса, включают, но без ограничения, протеогликан, такой как ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан (CSPG4) или CD44v6, включая муцин, такой как Muc-1, или мембраносвязанный фермент, такой как карбоангидраза IX (CAIX). Примерами таких антигенов являются тенасцин и фибробластактивирующий протеин (FAP).

Используемый здесь термин выделенная молекула антитела относится к молекуле антитела, которая была идентифицирована и выделена и/или восстановлена из компонента своей природной среды. Примесями ее естественной среды являются вещества, которые могут препятствовать применению антитела в диагностике или терапии и которые могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах реализации молекулу антитела очищают более чем до 95% по массе антитела, например более чем до 99%, что определяется методом Лоури. В некоторых вариантах реализации молекулу антитела очищают до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использо

- 10 040607 ванием секвенатора с вращающимся стаканом. В некоторых вариантах реализации антитело очищают до уровня гомогенности методом SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси синим или предпочтительно серебром. В некоторых вариантах реализации выделенная молекула антитела может находиться внутри рекомбинантных клеток при отсутствии одного или более компонентов естественной среды антитела. Обычно выделенное антитело получают по меньшей мере одной стадией очистки.

Используемые здесь термины V_H и VL относятся соответственно к вариабельному домену тяжелой цепи и вариабельному домену легкой цепи иммуноглобулина. Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из каркасной области, прерываемой тремя гипервариабельными участками. Таким образом, термин гипервариабельный участок относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки из определяющей комплементарность области или CDR. В вариабельную часть иммуноглобулина входят по три CDR (или CDR-области) тяжелой и легкой цепей. Таким образом, используемый здесь термин CDR относится ко всем трем CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3), или всем трем CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), или же при необходимости ко всем CDR как тяжелой, так и легкой цепей. Три CDR составляют характер связывания вариабельной области легкой цепи, а другие три составляют характер связывания вариабельной области тяжелой цепи. CDR определяют специфичность молекулы иммуноглобулина в отношении антигена и разделены аминокислотными последовательностями, которые включают несущие или каркасные области. Четкие границы и протяженность CDR определяются различными классификационными и номенклатурными системами. Структура и укладка белка антитела могут означать, что другие остатки рассматриваются как часть антигенсвязывающей области, что будет ясно специалисту в данной области техники. CDR формируют большинство контактных остатков для связывания иммуноглобулина с антигеном или эпитопом.

CDR3, как правило, представляет собой самый большой источник молекулярного разнообразия в пределах сайта связывания антитела. Н3, например, может быть коротким, как два аминокислотных остатка, или длиннее, чем 26 аминокислот. Структура субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов разных классов хорошо известны из уровня техники. Обзор структуры антитела см. в Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Специалисту в данной области техники будет ясно, что каждая структура субъединицы, например структура СН, V_H, C_L, V_L, CDR, FR, содержит активные фрагменты, например, часть субъединицы V_H, V_L или CDR связывается с антигеном, т.е. антигенсвязывающим фрагментом, или, например, часть субъединицы СН, которая связывается и/или активирует, например, Fc-рецептор и/или комплемент. Как правило, CDR относятся к нумерации CDR по Кабату, как представлено в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al. Другим стандартом характеризации сайта связывания антигена является характеризация через гипервариабельные петли, как описано Чотиа. См., например, Chothia et al. (1992, J. Mol. Biol., 227:799-817); и Tomlinson et al. (1995), EMBO, J. 14:4628-4638. Еще одним стандартом является определение по AbM, используемое в программном обеспечении по моделированию антител AbM Oxford Molecular. В целом см., например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, Antibody Engineering Lab Manual (ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., SpringerVerlag, Heidelberg). Варианты реализации, описанные с использованием классификации CDR Кабата, альтернативно могут быть осуществлены с использованием подобных взаимоотношений касательно гипервариабельных петель по Чотиа или определенных по AbM петель.

Остатки каркасной области или FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличного от гипервариабельного домена. Последовательности каркасных областей разных легких или тяжелых цепей являются относительно постоянными в пределах одного вида. Таким образом, каркасная область человека представляет собой каркасную область, которая по существу идентична (около 85% или более, как правило 90-95% или более) каркасной области иммуноглобулина человека естественного происхождения. Каркасная область антитела, т.е. комбинированные каркасные области составляющих легкой и тяжелой цепей, служит для позиционирования и выравнивания CDR. CDR изначально ответственны за связывание с эпитопом антигена.

Термины Fab и Fab-область, Fab-часть или Fab-фрагмент следует понимать, как определяющие полипептид, который включает домен V_H, C_H1, V_L и C_L иммуноглобулина. Fab может относиться к этой области отдельно или этой области в контексте молекулы антитела согласно изобретению, а также всей длине иммуноглобулина или фрагменту иммуноглобулина. Как правило, Fab-область содержит всю легкую цепь антитела. Fab-область может быть определена как плечо молекулы иммуноглобулина. Она содержит эпитопсвязывающую часть этого Ig. Fab-область иммуноглобулина естественного происхождения может быть получена в виде протеолитического фрагмента путем расщепления папаином. F(ab')₂-часть представляет собой протеолитический фрагмент расщепленного пепсином иммуноглобулина. Fab'-часть является продуктом восстановления дисульфидных связей F(ab')₂-части. Используемые здесь термины Fab, Fab-область, Fab-часть и Fab-фрагмент также могут включать шарнирную область, определяющую С-концевое плечо антитела (см. выше). Эта шарнирная область соответствует шарнирной области, находящейся на С-конце Абдомена по всей длине иммуноглобулина, в которой

- 11 040607 плечи молекулы антитела могут быть взяты для образования Y. Термин шарнирная участок используют в данной области техники, поскольку иммуноглобулин в этой области имеет некоторую гибкость.

Fv или Fv-фрагмент состоит только из V_L и VH доменов одиночного плеча иммуноглобулина. Таким образом, Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный сайт распознавания и связывания антигена. Двухцепочечный Fv-фрагмент состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой и одного вариабельного домена легкой цепей, находящихся в прочной нековалентной связи. Разновидность одноцепочечного Fv (scFv) включает VH- и VL-домен иммуноглобулина, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи, в которой они ковалентно связаны друг с другом с помощью гибкого пептидного линкера. Как правило, в scFv-фрагменте вариабельные домены легкой и тяжелой цепей связаны в димерную структуру, аналогичную таковой в разновидности двухцепочечного Fv-. В одноцепочечных scFv-фрагментах возможно, чтобы вариабельный домен легкой цепи находился на N-конце одиночной полипептидной цепи, после которого следует линкер и вариабельный домен тяжелой цепи, находящийся на С-конце полипептидной цепи, или наоборот, чтобы вариабельный домен тяжелой цепи находился на N-конце, а вариабельный домен легкой цепи - на С-конце, между которыми находился бы пептидный линкер. Пептидный линкер может представлять собой любой известный из области техники гибкий линкер, например, составленный из остатков глицина и серина. Кроме того, возможно дополнительно стабилизировать ассоциацию между доменами V_H и V_L путем введения дисульфидных связей в консервативные каркасные области (см. Reiter et al., Stabilization of the Fv fragments in recombinant immunotoxins by disulfide bonds engineered into conserved framework regions, Biochemistry, 1994, 33, 6551-5459). Такие scFv-фрагменты также известны как стабилизированные дисульфидными связями scFv-фрагменты (ds-scFv).

Используемый здесь термин Fc-область или Fc-фрагмент обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, включающую Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Fc-часть опосредует эффекторную функцию антител, например активацию системы комплемента и несущих Fc-рецептор иммунных эффекторных клеток, таких как NK-клетки. В молекулах IgG человека Fc-область генерируется расщеплением папаином на N-конце у Cys226. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно имеет протяжение от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до ее карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 447 по номенклатуре ЕС) Fc-области может быть удален, например, при продуцировании или очистке молекулы антитела или посредством рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь молекулы антитела. Следовательно, композиция интактных антител может включать популяции антител со всеми удаленными остатками K447, популяции антител без удаленных остатков K447 и популяции со смесью антител с и без остатков K447. Fc-области с нативной последовательностью, пригодные для антител в соответствии с изобретением, включают иммуноглобулины млекопитающих, например, человека или мыши, IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4. Fc-область содержит два или три константных домена в зависимости от класса антитела. В вариантах реализации, где иммуноглобулином является IgG, Fc-область включает домены C_H2 ^и CH3.

Молекула антитела по настоящему изобретению имеет две цепи: более короткую цепь, которая в некоторых вариантах реализации может быть легкой цепью, и главную цепь, которая в некоторых вариантах реализации также может быть названа тяжелой цепью. Молекула антитела обычно представляет собой димер из этих двух цепей. Основываясь на доменах, включенных в молекулу антитела, согласно изобретению может быть взята молекула антитела, которая имеет Fab-фрагмент, в целом включающий шарнирную области, C_H2-домен и одноцепочечный Fv-фрагмент. В некоторых вариантах реализации молекула антитела также включает С_Н3-домен, в целом расположенный на С-конце C_H2-домена. В некоторых вариантах реализации расположение доменов антитела согласно изобретению соответствует расположению доменов в иммуноглобулине. В качестве двух примеров более короткая цепь молекулы антитела по изобретению может иметь VL-домен на N-конце и CL-домен на С-конце более короткой цепи, а главная цепь может иметь VH-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. В некоторых вариантах реализации более короткая цепь может иметь VL-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. В некоторых вариантах реализации более короткая цепь может иметь VH-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце более короткой цепи. В некоторых вариантах реализации более короткая цепь может иметь VH-домен на N-конце и CL-домен на С-конце более короткой цепи. В некоторых вариантах реализации главная цепь может иметь VL-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. В некоторых вариантах реализации главная цепь может иметь VH-домен на N-конце и CL-домен на С-конце. В некоторых вариантах реализации главная цепь может иметь VL-домен на N-конце и CL-домен на С-конце.

Более короткая цепь антитела может быть связана с главной цепью антитела посредством одной, двух или трех дисульфидных связей. Соответствующая дисульфидная связь может образовывать мостик между С-концевым остатком цистеина меньшей цепи и остатком цистеина в пределах шарнирной области главной цепи антитела.

В молекуле антитела по изобретению С-концевая область главной цепи может быть определена одноцепочечным Fv-фрагментом. В некоторых вариантах реализации С-конец главной цепи может быть

- 12 040607 определен VH-доменом scFv-фрагмента. В некоторых вариантах реализации С-конец главной цепи может быть определен VL-доменом scFv-фрагмента. Соответственно в некоторых вариантах реализации scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н2-доменом или с С_Н3-доменом, если он присутствует, главной цепи через VH-домен, например N-конец VH-домена. В некоторых вариантах реализации scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н2-доменом или с С_Н3-доменом, если он присутствует, главной цепи через VL-домен, например через N-конец V_L-домена. В некоторых вариантах реализации С_Н2-домен молекулы антитела или С_Н3-домен, если он присутствует, связан с scFv-фрагментом через вариабельный домен легкой цепи (VL-домен) scFv-фрагмента. В некоторых вариантах реализации С_Н2-домен связан с scFv-фрагментом через вариабельный домен тяжелой цепи (VH-домен) scFv-фрагмента.

Fab-фрагмент молекулы антитела по изобретению в некоторых вариантах реализации связан с С_Н2-доменом через домен тяжелой цепи Fab-фрагмента. Соответственно главная цепь антитела может иметь домен тяжелой цепи, такой как C_H1-домен (см. выше), сопряженный с С_Н2-доменом. Как сказано выше, соответствующий C_H1-домен может быть сопряжен с С_Н2-доменом через шарнирную область. Соответствующий домен тяжелой цепи Fab-фрагмента в некоторых вариантах реализации может находиться на N-конце полипептидной цепи главной цепи антитела. В некоторых вариантах реализации Fab-фрагмент молекулы антитела по изобретению связан с С_Н2-доменом через домен легкой цепи Fab-фрагмента. Соответственно главная цепь молекулы антитела может иметь домен легкой цепи, такой как CL-домен, сопряженный с С_Н2-доменом. И вновь соответствующий CL-домен может быть сопряжен с С_Н2-доменом через шарнирную область. В некоторых вариантах реализации соответствующий домен легкой цепи Fab-фрагмента может находиться на N-конце полипептидной цепи главной цепи молекулы антитела. Для предотвращения димеризации молекул в бивалентных вариантах реализации (фиг. 1А-1Е и 1N) остатки цистеина в шарнирной области, обеспечивающие межцепочечные дисульфидные связи, могут быть заменены. В тетравалентных вариантах реализации (фиг. 1F-1M) эти остатки цистеина сохранены. В этих вариантах реализации молекула антитела, соответственно, может быть взята для определения димера бивалентной димерной молекулы антитела, как описано выше, и каждая главная цепь и каждая более короткая цепь могут быть выбраны индивидуально. Например, первая из более коротких цепей может иметь VH-домен на N-конце и CL-домен на С-конце. Первая главная цепь может иметь VL-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. Далее первая главная цепь может иметь С_Н2- и С_Н3-домен, а также С-концевой scFv-фрагмент. scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н3-доменом через VL-домен. Вторая из более коротких цепей может иметь VH-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. Вторая главная цепь может иметь VL-домен на N-конце и CL-домен на С-конце. Вторая главная цепь может также иметь С_Н2- и С_Н3-домен, а также С-концевой scFv-фрагмент. scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н3-доменом через VL-домен.

Соответствующая тетрамерная молекула антитела может быть образована из двух димерных молекул антитела, связанных между собой одной или более, например двумя, дисульфидными связями. Такая дисульфидная связь может сформировать мостик между остатком цистеина главной цепи первой димерной молекулы антитела и остатком цистеина главной цепи второй димерной молекулы антитела. Как правило, соответствующие остатки цистеина расположены в пределах шарнирной области соответствующей главной цепи каждой димерной молекулы антитела. В некоторых вариантах реализации одна или обе из двух главных цепей, т.е. главная цепь первой димерной молекулы и главная цепь второй димерной молекулы тетрамерной молекулы антитела, имеют остаток цистеина в позиции 226 последовательности и/или в позиции 229 последовательности одной из соответствующих шарнирных областей в соответствии с нумерацией Кабата (индекс ЕС). В одном варианте реализации дисульфидная связь между шарнирной областью первой главной цепи и шарнирной областью второй главной цепи определяется по меньшей мере одним остатком цистеина в позиции 226 последовательности и остатком цистеина в позиции 229 последовательности одной из шарнирных областей в соответствии с нумерацией Кабата (индекс ЕС). В некоторых вариантах реализации тетрамерная молекула антитела может иметь одну или более дисульфидных связей между шарнирными областями двух главных цепей димерных молекул антитела и одну дисульфидную связь между шарнирными областями двух главных цепей димерных молекул антитела. В некоторых вариантах реализации две димерные молекулы антитела тетрамерной молекулы антитела по изобретению могут быть связаны дисульфидной связью, определяемой остатком цистеина, входящим в С_Н2-домен главной цепи первой димерной молекулы антитела, и остатком цистеина, входящим в С_Н2-домен главной цепи второй димерной молекулы антитела.

В качестве еще одного примера первая из более коротких цепей может иметь VL-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. Первая главная цепь может иметь VH-домен на N-конце и CL-домен, связанный с ней на С-конце. Кроме того, первая главная цепь может иметь СН2- и СН3-домен, а также С-концевой scFv-фрагмент. scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н3-доменом через VH-домен. Вторая из более коротких цепей может иметь VL-домен на N-конце и CL-домен на С-конце. Вторая главная цепь может иметь VH-домен на N-конце и C_H1-домен на С-конце. Вторая главная цепь может иметь также С_Н2- и С_Н3-домены, а также С-терминальный scFv-фрагмент. scFv-фрагмент может быть сопряжен с С_Н3-доменом через VH-домен.

Биспецифическая или бифункциональная молекула антитела представляет собой молекулу ан

- 13 040607 титела, которая имеет два разных эпитоп/антигенсвязывающих сайта и, соответственно, обладает специфичностью связывания с двумя разными эпитопами-мишенями. Эти два эпитопа могут быть эпитопами одного и того же антигена или разных антигенов. В отличие от этого бивалентное антитело может иметь сайты связывания идентичной антигенной специфичности.

Биспецифическое антитело может представлять собой молекулу антитела, которая связывается с одним антигеном или эпитопом на одном из двух или более плеч связывания, определяемых первой парой тяжелой и легкой цепей или главной и более короткой/меньшей цепей (см. выше), и связывается с другим антигеном или эпитопом на втором плече, определяемом второй парой тяжелой и легкой или главной и меньшей цепей. Такой вариант реализации биспецифического антитела имеет два антигенсвязывающих плеча, отличающихся как специфичностью, так и последовательностями CDR. Как правило, биспецифическое антитело является моновалентным для каждого антигена, с которым оно связывается. Биспецифическое антитело представляет собой гибридную молекулу антитела, которая может иметь первую область связывания, определяемую первой вариабельной областью легкой цепи и первой вариабельной областью тяжелой цепи, и вторую область связывания, определяемую второй вариабельной областью легкой цепи и второй вариабельной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации одна из этих областей связывания может быть определена парой тяжелой/легкой цепей. Как разъяснено выше, в контексте настоящего изобретения молекула биспецифического антитела имеет первый сайт связывания, определяемый вариабельными областями главной цепи и меньшей цепи, и второй (другой) сайт связывания, определяемый вариабельной областью scFv-фрагмента, включенного в главную цепь молекулы антитела.

Способы получения молекулы биспецифического антитела известны из уровня техники; ими являются, например, химическая конъюгация двух различных моноклональных антител или также, например, химическая конъюгация двух фрагментов антитела, например двух Fab-фрагментов. В качестве альтернативы молекулы биспецифического антитела получают рекомбинантным способом. Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар Н-цепь-L-цепь иммуноглобулина, где две Н-цепи обладают различной специфичностью связывания. Вследствие случайного подбора Н- и L-цепей получают потенциальную смесь из десяти различных структур антитела, из которых только одно имеет желаемую специфичность связывания. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов, характеризующихся желаемой специфичностью связывания, с константной областью тяжелой цепи, включающей по меньшей мере часть шарнирной области, С_Н2- и С_Н3-области. В одном варианте реализации C_H1-область, содержащая сайт, требуемый для связывания легкой цепи, присутствует по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующую эти слияния, и при необходимости L-цепь подвергают инсерции в отдельные векторы экспрессии и затем котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. При этом существует возможность инсерции кодирующих последовательностей для двух или всех трех цепей в один вектор экспрессии.

Молекула биспецифического антитела согласно изобретению может действовать в отношении каждой мишени как моноклональное антитело (MAb). В некоторых вариантах реализации антитело может быть химерным, гуманизированным или полностью человеческим.

В целом антитело с двойной специфичностью, которое может быть, например, иммуноглобулином полной длины или конструктом со свойствами связывания наподобие иммуноглобулина, следует понимать, как такое, которое имеет два плеча связывания, в частности плечи, характеризуемые парой HC/LC, каждая из которых может связывать два разных антигена или эпитопа (см. публикацию РСТ WO 02/02773). Соответственно связывающий белок с двойной специфичностью имеет два идентичных антигенсвязывающих плеча с идентичной специфичностью и идентичными CDR-последовательностями, и является бивалентным для каждого антигена, с которым он связывается.

Т-клеточный рецептор (TCR) представляет собой конкретный рецептор на клеточной поверхности Т-клеток, т.е. Т-лимфоцитов. In vivo Т-клеточный рецептор существует в виде комплекса из нескольких белков. В целом Т-клеточный рецептор имеет две отдельные пептидные цепи, как правило альфа- и бета-цепи Т-клеточного рецептора (цепи TCRa и TCRe), у некоторых Т-клеток имеется Т-клеточный рецептор с гамма- и дельта-цепями (TCRy и TCRδ). Другими белками в комплексе являются белки CD3: гетеродимеры CD3εγ и CD3εδ и, самое главное, гомодимер CD3Z, который имеет в общей сложности шесть ITAM-мотивов. ITAM-мотивы на CD3Z могут быть фосфорилированы посредством Lck и, в свою очередь, привлечь ZAP-70. Lck и/или ZAP-70 также может фосфорилировать тирозины на многих других молекулах, особенно CD28, LAT и SLP-76, что обеспечивает агрегацию сигнальных комплексов вокруг этих белков.

Молекула антитела согласно изобретению включает легкую цепь с VL-доменом и CL-доменом. Кроме того, молекула антитела включает главную цепь, которая включает VH-домен, C_H1-домен и шарнирную область. VH-домен расположен на N-конце главной цепи, при этом VH-домен связан с CHi-доменом напрямую или через связывающий пептид, обычно состоящий из 20 или менее, в том числе 10 или менее, аминокислотных остатков. Шарнирная область связана с С-концом C_H1-домена. Таким образом, часть молекулы антитела, которая определена смежным расположением VL-, CL-, V_H- и C_H1-домена, а

- 14 040607 также шарнирной области, может быть взята для определения Fab-фрагмента и, следовательно, называется именно так. Как и в иммуноглобулине естественного происхождения, конъюгация VH- и VL-домена друг с другом определяет один антигенсвязывающий сайт. Следовательно, Fab-фрагмент антитела по изобретению содержит сайт связывания с первым антигеном. В соответствующей молекуле антитела легкая цепь связана с главной цепью дисульфидной связью. В некоторых вариантах реализации молекула антитела согласно изобретению представляет собой димер, который включает две главных цепи и две легких цепи, как описано выше (также см. ниже).

В некоторых вариантах реализации последовательность рекомбинантной молекулы биспецифического антитела, согласно изобретению, можно сопоставить с последовательностью IgG1, поскольку последовательность молекулы антитела по изобретению имеет определенную степень сходства с последовательностью IgG1, как дополнительно показано ниже. По сравнению с аминокислотной последовательностью IgG1 по Кабату и др. (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) главная цепь молекулы антитела по изобретению в некоторых вариантах реализации включает VH-домен в позициях аминокислоты 1-117, C_H1-домен в позициях 118-215, шарнирную область в позициях 216-230 и C_H2-домен в позициях 231-340.

В этих вариантах реализации в соответствии с аминокислотной последовательностью главной цепи антитела согласно изобретению Fab-фрагмент, состоящий из VH-домена, C_H1-домена и шарнирной области, обычно охватывает аминокислоты 1-230. В составе этого Fab-фрагмента VH-домен обычно определен аминокислотами 1-118, C_H1-домен определен аминокислотами 119-216, а шарнирная область определена аминокислотами 217-231 согласно нумерации Кабата. Цепь антитела с последовательностью SEQ ID NO: 6 может служить примером соответствующего варианта реализации. В некоторых вариантах реализации молекула антитела согласно изобретению в позициях 342 и далее главной цепи имеет химерную последовательность, составленную из VH-домена и VH-домена. В некоторых вариантах реализации VH-домен расположен так, что он определяет С-концевой домен этой химерной последовательности. В некоторых вариантах реализации антитело по изобретению, в отличие от аминокислотной последовательности IgG1 по Кабату и др., имеет С_Н3-домен в позициях 342-447, после которого следует химерная последовательность, составленная из VH-домена и С-концевого VH-домена. В таких вариантах реализации, где С_Н3-домен включен в состав антитела, согласно изобретению этот С_Н3-домен определен аминокислотами 342-448 в соответствии с аминокислотной последовательностью главной цепи молекулы антитела. Химерная последовательность, составленная из VH-домена и VL-домена, которые в этих вариантах реализации могут быть С-концевыми (см. выше), в этих реализациях находится в позициях 449 и далее аминокислотной последовательности главной цепи молекулы антитела.

Молекула биспецифического антитела по изобретению может иметь два сайта связывания любой желаемой специфичности. В некоторых вариантах реализации один из сайтов связывания способен к связыванию опухоль-ассоциированного антигена. В некоторых вариантах реализации сайт связывания, включенный в состав Fab-фрагмента, представляет собой сайт связывания, который специфичен в отношении поверхностного опухоль-ассоциированного антигена. В некоторых вариантах реализации сайт связывания, включенный в состав одноцепочечного Fv-фрагмента, представляет собой сайт связывания, который специфичен в отношении опухоль-ассоциированного антигена, такого как поверхностный опухоль-ассоциированный антиген.

Используемый здесь термин поверхностный опухоль-ассоциированный антиген относится к антигену, который присутствует или может присутствовать на поверхности, расположенной на или внутри опухолевых клеток. Эти антигены могут присутствовать на поверхности клетки с внеклеточной частью, которая зачастую скомбинирована с трансмембранной и цитоплазматической частью молекулы. Эти антигены в некоторых вариантах реализации могут быть презентированы только опухолевыми клетками, а не нормальными, т.е. неопухолевыми клетками. Опухолевые антигены могут экспрессироваться исключительно на опухолевых клетках или могут выражать опухоль-специфическую мутацию по сравнению с неопухолевыми клетками. В таком варианте реализации соответствующий антиген может называться опухоль-специфическим антигеном. Некоторые антигены презентируются как опухолевыми, так и неопухолевыми клетками, которые могут называться опухоль-ассоциированными антигенами. Эти опухоль-ассоциированные антигены могут сверхэкспрессироваться на опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми клетками или быть доступными для связывания антителом в опухолевых клетках в силу менее компактной структуры опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой тканью. В некоторых вариантах реализации поверхностный опухоль-ассоциированный антиген расположен на сосудистой сети опухоли.

Примерами, иллюстрирующими поверхностный опухоль-ассоциированный антиген, являются CD10, CD19, CD20, CD22, Cd33, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), хондроитинсульфатпротеогликан 4 (CSPG4, ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Her2/neu, Her3, IGFR, CD133, IL3R, фибробласт-активирующий белок (FAP), CDCP1, Derlinl, тенасцин, frizzled 1-10, сосудистые антигены VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b) эндоглин, CLEC14, Tem1-8 и Tie2. Еще одни примеры могут включать в себя А33, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген

- 15 040607 (СЕА), карбоангидраза IX (MN/CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, фолатсвязывающий протеин, G250, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2-рецептор, IL3R, MCSP (ассоциированный с меланомой поверхностно-клеточный хондроитинсульфатпротеогликан), Muc-1, простатаспецифический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовой клетки простаты (PSCA), простатаспецифический антиген (PSA) и TAG-72. Примерами антигенов, экспрессирующихся на внеклеточном матриксе опухолей, являются тенасцин и фибробласт-активирующий белок (FAP).

В некоторых вариантах реализации один из сайтов связывания молекулы антитела по изобретению способен к связыванию молекулы специфического Т-клеточного рецептора и/или молекулы специфического рецептора естественной клетки-киллера (NK-клетки). Специфический Т-клеточный рецептор представляет собой так называемый Т-клеточный рецептор (TCR), который обеспечивает Т-клетке возможность связывания с эпитопом/антигеном и, при наличии дополнительных сигналов, активации эпитопом/антигеном и отклика на эпитоп/антиген, при этом указанный эпитоп/антиген презентируется другой клеткой, называемой антиген-презентирующей клеткой или АРС. Известно, что Т-клеточный рецептор имеет сходство с Fab-фрагментом иммуноглобулина естественного происхождения. В целом он является моновалентным, охватывает α- и β-цепи, а в некоторых вариантах реализации он охватывает γ- и δ-цепи (см. выше). Соответственно в некоторых вариантах реализации TCR представляет собой TCR (альфа/бета), а в некоторых вариантах реализации он представляет собой TCR (гамма/дельта). Т-клеточный рецептор образует комплекс с Т-клеточным корецептором CD3. CD3 представляет собой комплекс белка, и он составлен из четырех различных цепей. У млекопитающих этот комплекс состоит из CD3γ-цепи, CD3δ-цепи и двух CD3ε-цепей. Эти цепи ассоциируются с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR) и ζ-цепью для генерирования сигнала активации в Т-лимфоцитах. Таким образом, в некоторых вариантах реализации специфический Т-клеточный рецептор представляет собой Т-клеточный корецептор CD3. В некоторых вариантах реализации специфическим Т-клеточным рецептором является CD28, белок, также экспрессирующийся на Т-клетках. CD28 может обеспечить костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-клеток. CD28 выполняет важные функции в пролиферации и выживании Т-клеток, выработке цитокинов и развитии Т-хелпера типа 2. Еще одним примером специфического Т-клеточного рецептора является CD134, называемый также Ох40. CD134/OX40 экспрессируется через 24-72 ч после активации и может быть взят для определения вторичной костимулирующей молекулы. Другим примером Т-клеточного рецептора является 4-1ВВ, способный связываться с 4-1ВВ-лигандом на антиген-презентирующих клетках (АРС), посредством чего генерируется костимулирующий сигнал для Т-клетки. Другим примером рецептора, присутствующего преимущественно на Т-клетках, является CD5, который также находится на В-клетках на низких уровнях. Еще одним примером рецептора, модифицирующего функции Т-клеток, является CD95, известный также как Fas-рецептор, который опосредует апоптотический сигналинг Fas-лигандом, экспрессирующимся на поверхности других клеток. Было сообщено, что CD95 модулирует TCR/CD3-активируемые пути сигналинга в покоящихся Т-лимфоцитах.

Примером молекулы специфического NK-клеточного рецептора является CD16, низкоаффинный Fc-рецептор и NKG2D. Примером молекулы рецептора, которая презентируется на поверхности как Т-клеток, так и естественных клеток-киллеров (NK-клеток), является CD2 и другие члены CD2-суперсемейства. CD2 может действовать как костимулирующая молекула на Т- и NK-клетках.

В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания молекулы антитела связывает поверхностный опухоль-ассоциированный антиген, а второй сайт связывания связывает молекулу специфического Т-клеточного рецептора и/или молекулу специфического рецептора естественной клетки-киллера (NK). В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания молекулы антитела связывает один из следующих: А33, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА), карбоангидраза IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, хондроитинсульфатпротеогликан 4 (CSPG4, ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан), CLEC14, Derlin1, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, эндоглин, ЕР-CAM, фибробласт-активирующий белок (FAP), фолатсвязывающий белок, G250, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, рецептор IL-2, IL3R, MCSP (ассоциированный с меланомой поверхностноклеточный хондроитинсульфатпротеогликан), Muc-1, простата-специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовой клетки простаты (PSCA), простата-специфический антиген (PSA), TAG-72, тенасцин, Tem1-8, Tie2 и VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b), a второй сайт связывания связывает молекулу специфического Т-клеточного рецептора и/или молекулу специфического рецептора естественной клетки-киллера (NK). В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания молекулы антитела связывает поверхностный опухоль-ассоциированный антиген, а второй сайт связывания связывает один из CD3, Т-клеточный рецептор (TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ох40, 4-1ВВ, CD2, CD5 и CD95.

В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания молекулы антитела связывает молекулу специфического Т-клеточного рецептора и/или молекулу специфического рецептора естественной

- 16 040607 клетки-киллера (NK), а второй сайт связывания связывает поверхностный опухоль-ассоциированный антиген. В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания антитела связывает молекулу специфического Т-клеточного рецептора и/или молекулу специфического рецептора естественной клеткикиллера (NK), а второй сайт связывания связывает один из следующих: А33, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА), карбоангидраза IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, Cd37, CD44v6, CD45, CD133, CdCPI, Her3, хондроитинсульфатпротеогликан 4 (CSPG4, ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан), CLEC14, Derlinl, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, эндоглин, ЕР-CAM, фибробластактивирующий белок (FAP), фолатсвязывающий белок, G250, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, рецептор IL-2, IL3R, MCSP (ассоциированный с меланомой поверхностно-клеточный хондроитинсульфатпротеогликан), Muc-1, простата-специфический мембранный антиген (PSMA), простата-специфический антиген (PSA), TAG-72, тенасцин, Tem1-8, Tie2 и VEGFR. В некоторых вариантах реализации первый сайт связывания антитела связывает один из следующих: CD3, Т-клеточный рецептор (TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ох40, 4-1ВВ, CD2, CD5 и CD95, а второй сайт связывания связывает поверхностный опухоль-ассоциированный антиген.

Термин гликозилирование означает присоединение олигосахаридов (углеводов, содержащих два или больше простых сахаров, связанных вместе, например от двух до двенадцати простых сахаров, связанных вместе) к гликопротеину. Боковые цепи олигосахаридов обычно связаны с каркасом гликопротеина посредством N- или О-связей. Олигосахариды антител, раскрытых здесь, в целом присоединены к С_Н2-домену Fc-области в виде N-сцепленные олигосахаридов. N-сцепленное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к аспарагиновому остатку в гликопротеиновой цепи. Специалисту в данной области техники будет ясно, что, например, СН2-домены каждого из мышиных IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 и человеческих IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgD имеют один сайт для N-сцепленного гликозилирования в остатке 297.

Последовательности доменов или областей, включенных в молекулу антитела, согласно изобретению могут представлять собой последовательности любых разновидностей. Тем не менее в зависимости от последующего применения молекулы антитела, в некоторых вариантах реализации может быть желательно внесение изменений, предотвращающих нежелательные побочные эффекты, вызываемые антителом. Применение интактных нечеловеческих антител в лечении болезней или расстройств у человека несет с собой потенциальную иммуногенность со всеми хорошо известными последствиями, что означает, что иммунная система пациента может распознать нечеловеческое интактное антитело как чужеродное и выработать нейтрализирующую реакцию. Это особенно очевидно при многократном введении нечеловеческого антитела пациенту-человеку. В течение многих лет для решения этих задач были разработаны различные методики, которые в целом включают снижение содержания нечеловеческих аминокислотных последовательностей в интактном антителе, сохраняя при этом относительную простоту получения нечеловеческих антител от иммунизированных животных, например мыши, крысы или кролика. Для достижения этих целей было выработано два общих подхода. Первый - это химерные антитела, которые в целом имеют нечеловеческий (а, например, относящийся к грызуну, такому как мышь) вариабельный домен, сцепленный с константной областью человека. В силу того что антигенсвязывающий сайт антитела определяется остатками внутри вариабельных доменов, химерное антитело сохраняет свою аффинность к антигену, но приобретает эффекторные функции константной области человека и, следовательно, способно выполнять эффекторные функции, как описано выше. Химерные антитела обычно получают, используя методы рекомбинантных ДНК. ДНК, кодирующую антитела (например, кДНК), выделяют и секвенируют с использованием стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими Н- и L-цепи антитела по изобретению). Гибридомные клетки служат типичным источником такой ДНК. После выделения ДНК помещают в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как Е.coli, COS-клетки, СНО-клетки или клетки миеломы, которые без этого не продуцируют белок иммуноглобулина для синтеза антитела. ДНК может быть модифицирована путем замены кодирующей последовательности для L- и Н-цепей человека соответствующими нечеловеческими Н- и L-константными областями, например мышиными (см., например, Morrison, PNAS (1984), 81, 6851).

Второй подход включает генерирование гуманизированных антител, при которой не принадлежащее человеку содержимое антитела уменьшают за счет гуманизации вариабельных доменов. Распространение получили две методики гуманизации. Первая заключается в гуманизации путем трансплантации CDR. CDR определяют петли (см. выше), при этом антигенсвязывающая специфичность антитела главным образом определяется топографией и химическими характеристиками поверхности его CDR. Эти особенности, в свою очередь, определяются конформацией индивидуальных CDR, относительным расположением CDR, а также природой и расположением боковых цепей остатков, содержащих CDR. Значительное снижение иммуногенности может быть достигнуто за счет трансплантации CDR только нечеловеческих, например мышиных (донорских) антител на человеческий каркас (акцепторный каркас) и константные области (см. Jones et al. (1986), Nature, 321, 522-525; Verhoeyen M. et al. (1988), Science, 239, 1534-1536). Однако сама по себе трансплантация CDR может не обеспечить полное сохранение антиген

- 17 040607 связывающих свойств и часто оказывается, что некоторые каркасные остатки (иногда называемые обратными мутациями) донорского антитела должны быть сохранены в гуманизированной молекуле, если необходимо восстановить значительный уровень антиген-связывающей аффинности (см. Queen С. et al. (1989), PNAS, 86, 10,029-10,033; Со, М. et al. (1991), Nature, 351, 501-502). В этом случае из базы данных выбирают человеческие вариабельные домены, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательностей относительно нечеловеческого донорского антитела, для формирования человеческого каркаса (FR). FR человека выбирают как из общетипичных, так и из индивидуальных человеческих антител. Где это необходимо, ключевые остатки из донорского антитела заменяют в человеческом акцепторном каркасе, чтобы сохранить CDR-конформации, при этом для помощи при идентификации таких структурно важных остатков может быть применено компьютерное моделирование антитела. См., например, WO 99/48523.

В качестве альтернативы гуманизация может быть достигнута способом маскировки. Статистический анализ уникальных человеческих и мышиных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина показал, что точные шаблоны подвергнутых воздействию остатков отличаются у человеческих и мышиных антител и наиболее индивидуальные позиции на поверхности являются более предпочтительными по сравнению с малым числом разных остатков (см. Padlan E.A. et al. (1991), Mol. Immunol., 28, 489-498; и Pedersen J.T. et al. (1994), J. Mol. Biol., 235; 959-973). Следовательно, можно снизить иммуногенность нечеловеческого Fv путем замены подвергнутых воздействию остатков в его каркасных областях, отличающиеся от тех, которые обычно находятся в антителах человека. Поскольку антигенность белка может быть связана с поверхностной доступностью, замены поверхностных остатков может быть достаточно, чтобы сделать вариабельный домен грызуна невидимым для иммунной системы человека (см. также Mark G.E. et al. (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, p. 105-134). Эту процедуру гуманизации называют маскировкой, поскольку при ней изменяют только поверхность антитела, а опорные остатки остаются нетронутыми.

Молекула антитела по изобретению может быть получена с использованием любой известной и широко применяемой системы экспрессии и рекомбинантной технологии культивирования клеток, например экспрессии в бактериях-хозяевах (прокариотических системах) или эукариотических системах, таких как дрожжи, грибы, клетки насекомых или клетки млекопитающих. Молекула антитела по настоящему изобретению может быть получена в трансгенных организмах, таких как коза, растение или трансгенная мышь XENOMOUSE, сконструированных путем инжиниринга породы мыши, которая имеет крупные фрагменты локусов иммуноглобулина человека и является дефицитной в отношении продуцирования антитела мыши. Антитело также может быть получено путем химического синтеза.

Как правило, для рекомбинантного получения молекулы антитела по изобретению полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и подвергают инсерции в реплицирующийся вектор, такой как плазмида, для последующего клонирования (амплификации) или экспрессии. Примером, иллюстрирующим подходящую систему экспрессии, является система глутаматсинтетазы (например, продаваемая Lonza Biologies), при этом клетка-хозяин представляет собой, например, СНО или NS0. Полинуклеотид, кодирующий антитело, легко выделяют и секвенируют с использованием традиционных процедур. Векторы, которые могут быть использованы, включают в себя плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, среди которых типичным вариантом реализации являются плазмиды. В целом такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательности терминации транскрипции, функционально сцепленные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепей, способствуя экспрессии. Полинуклеотиды, кодирующие легкую и тяжелую цепи, могут быть подвергнуты инсерции в отдельные векторы и трансфицированы в одну и ту же клетку-хозяина, или при необходимости тяжелая цепь и легкая цепь могут быть подвергнуты инсерции в один и тот же вектор для трансфекции в клетку-хозяин. Обе цепи, например, могут быть скомпонованы под контролем бицистронного оперона и экспрессироваться, чтобы дать в результате функциональную и корректно сложенную молекулу антитела, как описано в Skerra, A. (1994) Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli, Gene, 151, 131-135; или Skerra, A. (1994), A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments, Gene, 141, 79-8. Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения представлен способ конструирования вектора, кодирующего легкую и/или тяжелую цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, причем способ включает инсерцию в вектор полинуклеотида, кодирующего легкую цепь и/или тяжелую цепь молекулы антитела по изобретению.

При использовании рекомбинантных методик молекула антитела может быть получена внутриклеточно в периплазматическом пространстве или секретирована непосредственно в среду (см. также Skerra, 1994, выше). Если антитело получено внутриклеточно, на первом этапе дебрис в виде частиц, или клетки-хозяева, или лизированные фрагменты удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. В публикации Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) описана процедура выделения антител, секретированных в периплазматическое пространство Е.coli. Антитело также может быть получено в

- 18 040607 любой окислительной среде. Такая окислительная среда может быть получена периплазмой грамотрицательных бактерий, таких как Е.coli, во внеклеточной среде грамположительных бактерий, или в полости эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток (включая клетки животных, такие как клетки насекомых или млекопитающих), и обычно способствует образованию структурных дисульфидных связей. Однако также возможно получение молекулы антитела по изобретению в цитозоли клетки-хозяина, такой как Е.coli. В таком случае полипептид может быть получен или напрямую в растворимом и сложенном состоянии или восстановлен в форме телец включения с последующей ренатурацией in vitro. Еще одним вариантом является использование специфических штаммов-хозяев, имеющих окислительную внутриклеточную среду, которая, таким образом, может способствовать формированию дисульфидных связей в цитозоли (Venturi M., Seifert С., Hunte С. (2002), High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm, J. Mol. Biol., 315, 1-8).

Молекула антитела, продуцированная клетками, может быть очищена любым традиционным способом очистки, например гидроксилапатитовой хроматографией, гель-электрофорезом, диализом и аффинной хроматографией, которая является одной предпочтительной методикой очистки. Молекулы антител могут быть очищены аффинной очисткой белками/лигандами, специфично и обратимо связывающими константные домены, такие как C_H1 или C_L. Примерами таких белков являются иммуноглобулинсвязывающие бактериальные белки, такие как белок А, белок G, Белок A/G или белок L, причем связывание белка L ограничено молекулами антител, которые содержат легкие каппа-цепи. Альтернативным способом очистки антител с легкими k-цепями является использование нагруженных гранулами антител к каппа (KappaSelect). Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от разновидности и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в антителе. Белок А может использоваться для очистки антител (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для γ3 человека (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). Выбор способа очистки, используемого для конкретной молекулы антитела согласно изобретению, находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Также можно снабдить одну из цепей молекулы антитела по изобретению аффинным маркером. Такие аффинные маркеры, как Strep-tag® или Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996), J. Mol. Biol., 255, 753-766), myc-tag, FLAG™-tag, His6-tag или HA-tag, обеспечивают легкое распознавание, а также простую очистку рекомбинантной молекулы антитела.

Термины мутировавший/мутированный, мутант/мутантный и мутация/мутирование, используемые в отношении нуклеиновой кислоты или полипептида, обозначают замену, делецию или инсерцию одного или более нуклеотидов или аминокислот соответственно по сравнению с нуклеиновой кислотой или полипептидом естественного происхождения, т.е. эталонной последовательностью, которая может быть взята для определения дикого типа.

В этом отношении следует понимать, что термин позиция, используемый в контексте данного изобретения, подразумевает позицию аминокислоты в представленной здесь аминокислотной последовательности. Такая позиция может быть обозначена относительно сходной нативной последовательности, например последовательности домена или цепи IgG естественного происхождения. Используемый здесь термин соответствующий также включает то, что такая позиция не обязательна или определяется не только количеством предшествующих нуклеотидов/аминокислот. Таким образом, позиция заданной аминокислоты согласно настоящему изобретению, которая может быть заменена, может меняться вследствие делеции или добавления аминокислот в любом месте в цепи антитела.

Следовательно, в контексте изобретения под соответствующей позицией следует понимать то, что аминокислоты могут отличаться по обозначенному номеру, однако, все еще имея подобные соседние аминокислоты. Указанные аминокислоты, которые могут быть заменены, удалены или добавлены, также охвачены термином соответствующая позиция. Чтобы определить, соответствует ли аминокислотный остаток в заданной аминокислотной последовательности определенной позиции в аминокислотной последовательности домена или цепи иммуноглобулина естественного происхождения, специалист может использовать средства и способы, которые широко известны в данной области техники, например выравнивание вручную или с использованием таких компьютерных программ, как BLAST2.0, что расшифровывается, как средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любой другой программы, которая пригодна для генерирования выравниваний последовательностей.

В некоторых вариантах реализации под заменой (или замещением) подразумевается консервативная замена. В целом консервативными заменами являются следующие замены, перечисленные в соответствии с аминокислотами, подлежащими мутации, за каждым из которых следует одна или более замен, которые можно принять за консервативные: Ala^Gly, Ser, Val; Arg^Lys; Asn^Gln, His; Asp^Glu; Cys^Ser; Gln^Asn; Glu^Asp; Gly^Ala; His^Arg, Asn, Gln; Ile^Leu, Val; Leu^Ile, Val; Lys^Arg, Gln, Glu; Met^Leu, Tyr, Ile; Phe^Met, Leu, Tyr; Ser^Thr; Thr^Ser; Trp^Tyr; Tyr^Trp, Phe; Val^Ile, Leu. Другие замены также допустимы и могут быть определены эмпирически или по известным консервативным или неконсервативным заменам. В качестве еще одной ориентировки приведены следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые, как правило, могут быть взяты для опреде

- 19 040607 ления консервативных замен между собой:

1) аланин (Ala), глицин (Gly);

2) аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu);

3) аспарагин (Asn), глютамин (Gln);

4) аргинин (Arg), лизин (Lys);

5) изолейцин (Ile), лейцин (Leu), метионин (Met), валин (Val);

6) фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), триптофан (Trp);

7) серии (Ser), треонин (Thr); и

8) цистеин (Cys), метионин (Met).

Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть внесены более существенные изменения, такие как перечисленные ниже или дополнительно описанные ниже в отношении классов аминокислот, после чего продукты скринируют на желаемую характеристику. Примерами таких более существенных изменений являются Ala^Leu, Ile; Arg^Gln; Asn^Asp, Lys, Arg, His; Asp^Asn; Cys^Ala; Gln^Glu; Glu^Gln; His^Lys; Ile^Met, Ala, Phe; Leu^Ala, Met, норлейцин; Lys^Asn; Met^Phe; Phe^Val, Ile, Ala; Trp^Phe; Tyr^Thr, Ser; Val^Met, Phe, Ala.

В некоторых вариантах реализации молекула антитела согласно изобретению включает один или более аминокислотных остатков, в том числе два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать или восемнадцать аминокислотных остатков, которые мутированы для предотвращения димеризации через остатки цистеина или для модуляции Fc-функции. В некоторых из этих вариантов реализации мутированными являются один или более аминокислотных остатков С_Н2-домена и/или шарнирной области, способных опосредствовать связывание с Fc-рецепторами. При наличии один или более аминокислотных остатков, способных опосредствовать связывание с Fc-рецепторами, могут представлять собой аминокислотный остаток, способный активировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплемент-опосредованную цитотоксичность (CDC). В некоторых вариантах реализации соответствующий аминокислотный остаток, способный к опосредованию связывания с Fc-рецепторами, заменен другой аминокислотой в целом при сравнении данной последовательности с последовательностью соответствующего домена иммуноглобулина естественного происхождения, такого как IgG. В некоторых вариантах реализации такой аминокислотный остаток, способный опосредовать связывания с Fc-рецепторами, подвергают делеции в целом относительно последовательности соответствующего домена естественного происхождения в иммуноглобулине, таком как IgG. Однако в других вариантах реализации изобретения, когда молекула биспецифического антитела состоит из Fab-фрагмента, одноцепочечного Fv-фрагмента и С_Н2-домена иммуноглобулина, в объем изобретения входит введение мутаций в С_Н2-домен человеческого γ1, что оптимизирует антителозависимую цитотоксичность (ADCC).

Такие мутации описаны, например, в международных патентных заявках WO 2011/076922 и WO 2011/089211.

В некоторых вариантах реализации один или более мутировавших, например замещенных или подвергнутых делеции, аминокислотных остатков представляют собой аминокислоту, расположенную в одной из позиций 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 и 330. Здесь также нумерация используемых аминокислот соответствует позициям в последовательности согласно нумерации Кабата (индекс ЕС). Соответствующая делеция аминокислоты может представлять собой, например, делецию аминокислоты 228, в целом пролина в IgG, делецию аминокислоты 229, в целом цистеина в IgG, делецию аминокислоты 230, в целом пролина в IgG, делецию аминокислоты 231, в целом аланина в IgG, делецию аминокислоты 232, в целом пролина в IgG, делецию аминокислоты 233, в целом глутаминовой кислоты в IgG, делецию аминокислоты 234, в целом лейцина в IgG, делецию аминокислоты 235, в целом лейцина в IgG, делецию аминокислоты 236, в целом глицина в IgG, делецию аминокислоты 237, в целом глицина в IgG, делецию аминокислоты 238, в целом пролина в IgG, и делецию аминокислоты 265, в целом аспарагиновой кислоты в IgG. Соответствующая замена аминокислоты может представлять собой, например, замену аминокислоты 226, в целом цистенина в IgG, замену аминокислоты 228, в целом пролина в IgG, замену аминокислоты 229, в целом цистеина в IgG, замену аминокислоты 230, в целом пролина в IgG, замену аминокислоты 231, в целом аланина в IgG, замену аминокислоты 232, в целом пролина в IgG, замену аминокислоты 233, в целом глутаминовой кислоты в IgG, замену аминокислоты 234, в целом лейцина в IgG, замену аминокислоты 235, в целом лейцина в IgG, замену аминокислоты 265, в целом аспарагиновой кислоты в IgG, замену аминокислоты 297, в целом аспарагина в IgG, замену аминокислоты 327, в целом аланина в IgG, и замену аминокислоты 330, в целом аланина в IgG. Соответствующей заменой может быть одна из следующих замен: Cys226®Ser, Cys229®Ser, Glu233®Pro, Leu234®Val, Leu235®Ala, Asp265®Gly, Asn297®Gln, Ala327®Gln, Ala327®Gly и Ala330®Ser. Как можно понять из приведенного выше, в некоторых вариантах реализации один или два остатка цистеина в позициях 226 и 229 в шарнирной области заменяются на другую аминокислоту, например, остатком серина. Таким образом, может быть предотвращено образование дисульфидной связи с другой главной цепью. Кроме того, а также, как описано ниже, делеция и/или замена (мутация) выбранных аминокис

- 20 040607 лотных остатков в С_Н2-домене, который способен опосредовать связывание с Fc-рецепторами, могут обусловить снижение или потерю молекулой антитела по изобретению активности в части антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности и фиксации комплемента.

Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет исходный профиль гликозилирования (при наличии такового) молекулы антитела. Под изменением понимается делеция из антитела одного или более присутствующих в нем углеводных фрагментов и/или добавление к нему одного или более сайтов гликозилирования, отсутствующих в антителе. Гликозилирование антител обычно осуществляется N- или О-сцеплением. N-сцепление относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X - любая аминокислота, кроме пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного прикрепления углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде формирует потенциальный сайт гликозилирования. О-сцепленное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиламинокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также может быть использован 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление сайтов гликозилирования к антителу легко осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из описанных выше трипептидных последовательностей (для N-сцепленных сайтов гликозилирования). Это изменение также может быть осуществлено путем добавления одного или более остатков серина или треонина к последовательности исходного антитела или путем замены ими (для О-сцепленных сайтов гликозилирования).

В контексте данного изобретения в некоторых вариантах реализации часть главной цепи молекулы антитела по изобретению, представляющая Fc-область иммуноглобулина, обычно инертна или оказывает по меньшей мере по существу низкое воздействие в отношении связывания с Fc-рецепторами. Как уже сказано, это достигается путем делеции и/или замены (мутации) по меньшей мере одного из выбранных аминокислотных остатков в С_Н2-домене, способных опосредовать связывание с Fc-рецептором. Здесь такие молекулы антител также называются Fc-аттенуированными или Fc^ko-молекулами антитела. Таким образом, часть цепи антитела по изобретению, которое может быть взято для представления части Fc-фрагмента, т.е. С_Н2-домен и при наличии С_Н3-домен, может составлять каркас без обеспечения конкретной биологической функции, например эффекторной функции. Однако в настоящем изобретении было выявлено, что этот каркас способен обеспечивать значительные преимущества в части очистки, эффективности продуцирования и/или стабильности молекул антитела по изобретению по сравнению с известными молекулами антител (см. примеры).

В некоторых вариантах реализации распознавание и, соответственно, связывание этой части, соответствующей Fc-фрагменту, с конкретным Fc-рецептором приблизительно в 2 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 12 раз, приблизительно в 15 раз, приблизительно в 20 раз или более ниже, чем у Fc-области иммуноглобулина естественного происхождения. В некоторых вариантах реализации эта часть, соответствующая Fc-фрагменту, полностью лишена способности связывания с Fc-рецепторами. Связывание антитела с Fc-рецепторами, включая определение константы диссоциации, может быть легко определено специалистом с применением стандартных методик, таких как поверхностный плазмонный резонанс, с использованием, например, измерений с помощью Biacore™. Подобным образом, может быть использован любой другой способ измерения биомолекулярного связывания, который может быть основан, например, на средствах спектроскопии, фотохимии, фотометрии или радиологии. Примерами соответствующих способов обнаружения являются флуоресцентная корреляционная спектроскопия, фотохимическое поперечное сшивание и применение, соответственно, фотоактивных или радиоактивных меток. Некоторые из этих способов могут включать методики дополнительного разделения, такие как электрофорез или ВЭЖХ.

При необходимости для этой цели может быть осуществлена замена или делеция аминокислотных остатков, как объяснено выше. Подходящие мутации могут быть взяты, например, из Armour et al. (Eur. J. Immunol. (1999), 29, 2613-2624). Другие подходящие позиции для мутаций до последовательности цепи антитела могут быть взяты из данных кристаллической структуры, опубликованных в отношении комплекса между FcyRIII и Fc-фрагментом IgG1 человека (Sondermann et al., Nature (2000), 406, 267-273). В дополнение к описанному выше измерению аффинности для оценки уровня Fc-аттенуации или потери аффинности также возможна функциональная оценка способности (ее отсутствия) опосредствовать связывание с Fc-рецептором. В случае молекул антитела, которые связывают CD3 в качестве одной мишени, можно, например, оценить связывание через митогенность молекул таких CD3-связывающих антител на клетках. Митогенность опосредуется связыванием антител CD3 с Fc-рецепторами на А-клетках, таких как моноциты. Если молекула антитела по изобретению, которая имеет один сайт связывания для CD3, не проявляет никакого митогенного эффекта, в то время как родительское моноклональное анти-CD3 антитело, которое имеет функциональную Fc-часть, индуцирует интенсивный митоз в Т-клетках, становится ясно, что в силу отсутствия митоза молекула антитела по изобретению не обладает способностью к Fc-связыванию и, следовательно, может рассматриваться как молекула Fc-нокаута. Примеры, иллюст

- 21 040607 рирующие способ оценки анти-CD3-опосредованной митогенности, описаны в Davis, Vida & Lipsky (J. Immunol. (1986), 137, 3758); и Ceuppens, J.L., van Vaeck, F. (см. J. Immunol. (1987), 139, 4067 или Cell. Immunol. (1989), 118, 136). Другие иллюстрирующие примеры оценки митогенности антитела были описаны в Rosenthal-Allieri et al. (Rosenthal-Allieri M.A., Ticcioni M., Deckert M., Breittmeyer J.P., Rochet N., Rouleaux M., Senik A., Bemerd A., Cell Immunol., 1995, 163(1):88-95); и Grosse-Hovest et al. (Grosse-Hovest L., Hartlapp I., Marwan W., Brem G., Rammensee H-G, and Jung G., Eur. J. Immunol. (2003), may, 33(5):1334-1340). В дополнение к этому отсутствие Fc-связывания может быть оценено по способности молекулы антитела согласно изобретению опосредовать одну или более известных эффекторных функций Fc-части.

Как отмечено выше, замены или делеции остатков цистеина могут быть выполнены для введения или удаления одной или более дисульфидных связей, в том числе для введения или удаления потенциальной или ранее существовавшей дисульфидной связи. За счет этого можно управлять связью между главной цепью и более легкой/более короткой цепью молекулы антитела по изобретению, в том числе устанавливать, усиливать или удалять эту связь. Путем введения или удаления одного или более остатков цистеина может быть введен или удален дисульфидный мостик. В качестве иллюстративного примера, тетрамерная молекула антитела по настоящему изобретению имеет одну или более дисульфидных связей, соединяющих две димерные молекулы антитела. Одна такая дисульфидная связь обычно образована цистеином в главной цепи первой димерной молекулы антитела и цистеином в шарнирной области второй димерной молекулы антитела. В этом отношении в некоторых вариантах реализации антитело по изобретению может включать аминокислотную замену нативного остатка цистеина в позициях 226 и/или 229 относительно последовательности IgG человека в соответствии с нумерацией Кабата (индекс Е) другим аминокислотным остатком.

Замены или делеции таких аминокислотных остатков, как остатки аргинина, аспарагина, серина, треонина или тирозина, также могут выполняться для модификации профиля гликолизирования антитела. В качестве иллюстративного примера молекула IgG имеет одиночный N-сцепленный биантенарный углевод в Asn297 С_Н2-домена. Для IgG как сывороточного, так и полученного ex vivo в гибридомах или сконструированных путем инжиниринга клетках, IgG являются гетерогенными относительно присоединенного к Asn-297 углевода. В случае с IgG человека, основной олигосахарид обычно состоит из GlcNAc₂Man₃GlcNAc при отличающихся номерах внешних остатков.

Известно, что, кроме связывания антигенов/эпитопов, иммуноглобулин имеет другие эффекторные функции, биологические активности, связанные к Fc-областью (Fc-областью с нативной последовательностью или вариантной Fc-областью с аминокислотной последовательностью) иммуноглобулина, и изменяется в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Примерами эффекторных функций антитела являются Clq-связывание и комплементзависимая цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даун-регуляция поверхностно-клеточных рецепторов (например, В-клеточных рецепторов) и активация В-клеток. Осуществление антителом эффекторных функций в целом включает задействование эффекторных клеток. Некоторые эффекторные функции иммуноглобулина опосредствуются Fc-рецепторами (FcR), которые связывают Fc-область антитела. FcR определяются их специфичностью к изотипам иммуноглобулина; Fc-рецепторы для антител IgG называются FcyR, для IgE - FcεR, для IgA - FcaR и т.д. Любая из этих эффекторных функций (или потеря этих эффекторных функций), таких как CDC или ADCC, может быть использована для оценки того, отсутствует ли у молекулы антитела по изобретению способность Fc-связывания.

В данном контексте следует отметить, что термин Fc-рецептор или FcR обозначает рецептор, в целом белок, способный связываться с Fc-областью антитела. Fc-рецепторы расположены на поверхности определенных клеток иммунной системы организма, например естественных клеток-киллеров, макрофагов, нейтрофилов и тучных клеток. In vivo Fc-рецепторы связываются с иммуноглобулинами, иммобилизованными на инфицированных клетках или присутствующими на инвазивных патогенах. Их активность стимулирует фагоцитарные или цитотоксические клетки для уничтожение микробов или инфицированных клеток за счет антитело-опосредованного фагоцитоза или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности. Некоторые вирусы, такие как флавивирусы, используют Fc-рецепторы при инфицировании клеток за счет механизма, известного как антителозависимое усиление инфекции. Обзор рецепторов FcR был сделан в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995).

Комплементзависимая цитотоксичность или CDC относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация пути классического комплемента инициируется путем связывания первого компонента (Clq) системы комплемента с антителами (соответствующего подкласса), связанными со своим распознанным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен CDC-анализ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1997).

Термин система комплемента используется в данной области техники для обозначения ряда мелких белков, называемых факторами комплемента, присутствующих в крови, которые в целом циркулируют в виде неактивных предшественников (пробелков). Термин относится к способности этой неизменной и неадаптивной системы комплементировать способность антител и фагоцитов для очистки орга

- 22 040607 низма от патогенов, таких как бактерии, а также от комплексов антиген-антитело. Примером факторов комплемента является комплекс С1, включающий C1q и две сериновые протеазы - C1r и C1s. Комплекс С1 представляет собой компонент пути CDC. C1q представляет собой шестивалентную молекулу с молекулярной массой примерно 460000 и структурой, похожей на букет тюльпанов, в котором шесть коллагеновых стеблей соединены с шестью сферическими областями, представляющими собой головку. Для активации каскада комплемента необходимо, чтобы C1q связывался по меньшей мере с двумя молекулами из IgG1, IgG2 или IgG3.

Термин антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность или ADCC относится к форме цитотоксичности, при которой секретированные Ig, связанные с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках, таких как естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги, обеспечивают специфическое связывание этих цитотоксических эффекторных клеток с антиген-несущей клеткой-мишенью для последующего киллинга этой клетки-мишени цитотоксинами. Антитела заряжают цитотоксические клетки и требуются для киллинга клетки-мишени посредством этого механизма. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в табл. 3 на странице 464 в публикации Ravetch, Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC интересующей молекулы может быть проведен анализ ADCC in vitro, как описано в патентах US 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для таких анализов, включают, но без ограничения, периферические мононуклеарные клетки крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В некоторых вариантах реализации ADCC-активность интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, как описано в Clynes et al., PNAS, USA, 95:652-656 (1998).

Некоторые эффекторные функции антитела опосредуются Fc-рецепторами (FcR), которые связывают Fc-область антитела. FcR определяются специфичностью к изотипам иммуноглобулина; Fc-рецепторы для антител IgG называются FcyR, для IgE - FcεR, для IgA - FcaR и т.д. Было выделено три подкласса FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16).

Переходя далее к нуклеиновым кислотам, согласно изобретению молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одну или более цепей антитела, согласно изобретению может представлять собой любую нуклеиновую кислоту в любой возможной конфигурации, например однонитевой, двунитевой или их комбинацию. В нуклеиновые кислоты входят, например, молекулы ДНК, молекулы РНК, аналоги ДНК или РНК, генерируемые с использованием аналогов нуклеотидов или с использованием химии нуклеиновых кислот, молекулы закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК) и молекулы белковых нуклеиновых кислот (БНК). ДНК или РНК могут иметь геномное или синтетическое происхождение и могут быть одноили двунитевыми. Такая нуклеиновая кислота может представлять собой, например, мРНК, кРНК, синтетическую РНК, геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК, сополимер ДНК и РНК, олигонуклеотиды и т.д. Соответствующая нуклеиновая кислота, кроме того, может содержать ненатуральные аналоги нуклеотидов и/или быть связана с аффинным маркером или меткой.

В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую цепь, такую как главную цепь и/или меньшую цепь, антитела по изобретению, включают в вектор, например плазмиду. Когда необходима замена или делеция в цепи антитела, по сравнению с доменом или областью антитела естественного происхождения, в качестве исходной точки мутагенеза может быть использована кодирующая последовательность соответствующего нативного/ой домена/области, например, входящего/ей в последовательность иммуноглобулина. Для осуществления мутагенеза выбранных аминокислотных позиций в распоряжении специалиста имеются различные стандартные методики сайтнаправленного мутагенеза. Общеупотребимой методикой является включение мутаций посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием смесей синтетических олигонуклеотидов, несущих дегенеративный состав оснований, в заданные позиции последовательности. Например, использование кодона NNK или NNS (где N=аденин, гуанин, цитозин или тимин; K=гуанин или тимин; S=аденин или цитозин) обеспечивает возможность включения всех 20 аминокислот плюс амбер стоп-кодон во время мутагенеза, тогда как кодон VVS ограничивает количество возможных включаемых аминокислот до 12, поскольку он предотвращает включение аминокислот Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val в выбранную позицию последовательности полипептида; использование кодона NMS (где М=аденин или цитозин), например, ограничивает количество возможных аминокислот до 11 в выбранной позиции в последовательности, поскольку он предотвращает включение аминокислот Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val в выбранную позицию последовательности. В этой связи следует отметить, что кодоны для других аминокислот, отличных от обычных 20 аминокислот естественного происхождения, такие как селеноцистеин или пирролизин, также могут быть включены в нуклеиновую кислоту молекулы антитела. Как описано в Wang, L. et al. (2001), Science, 292, 498-500; или Wang, L. and Schultz, P.G. (2002), Chem. Comm., 1, 1-11 также представляется возможным использование искусственных кодонов, таких как UAG, обычно распознаваемых в качестве стоп-кодонов, для инсерции других нестандартных аминокислот, например о-метил-Ь-тирозина или р-аминофенилаланина.

- 23 040607

Другим вариантом включения мутаций в выбранный сегмент последовательности является применение нуклеотидных структурных блоков с пониженной специфичностью пар оснований, например инозина, 8-окса-2'-дезоксигуанозина или 6-(2-деокси-в-О-рибофуранозил)-3,4-дигидро-8Н-пиримин-до-1,2оксазин-7-она (Zaccolo et al. (1996), J. Mol. Biol., 255, 589-603). Еще одним возможным вариантом является так называемый триплет-мутагенез. В этом способе для включения в кодирующую последовательность используют смеси различных нуклеотидных триплетов, каждый из которых кодирует одну аминокислоту (Virnekas В., et al., 1994, Nucleic. Acids. Res., 22, 5600-5607).

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь, такую как главная цепь и/или меньшая цепь, антитела по изобретению, может экспрессироваться с использованием любой подходящей системы экспрессии, например, в соответствующей клетке-хозяине или в бесклеточной системе. Полученная молекула антитела обогащается за счет отбора и/или выделения.

Как было разъяснено выше, молекула антитела согласно изобретению может быть нацелена на любые необходимые эпитопы/антигены-мишени. В зависимости от выбранных эпитопов/антигенов антитело может быть пригодным в лечении или профилактике заболевания. Следовательно, в некоторых вариантах реализации антитело по изобретению может быть применено в способах лечения и/или профилактики медицинского состояния, такого как расстройство или заболевание. В вариантах реализации, в которых одно из антител, включенных в биспецифичную молекулу, способно активировать иммунные клетки FcR-зависимым образом, может быть особенно полезно выбрать молекулу антитела, имеющую Fc-соответствующую часть, демонстрирующую пониженное связывание с Fc-рецепторами. За счет этого может быть предупреждена нежелательная иммунная активация, опосредованная FcR-связыванием. В некоторых вариантах реализации заболевание, подлежащее лечению или профилактике, может представлять собой пролиферативное заболевание. Примеры пролиферативного заболевания включают, но без ограничения, злокачественные поражения гемопоэтической системы, такие как острый и хронический миеломный и лимфатический лейкозы, а также лимфомы или солидные опухоли. Примеры солидных опухолей включают, но без ограничения, опухоли желудочно-кишечного тракта, костей, легких, почек, простаты, молочной железы, головного мозга, яичника, матки, яичка, мезенхимальных тканей и кожи, например меланома.

В изобретении также представлена фармацевтическая композиция, включающая молекулу антитела согласно изобретению и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Молекула антитела согласно изобретению может быть введена любым парентеральным или непарентеральным (энтеральным) путем, который является терапевтически эффективным в отношении белковых лекарственных средств. Способы парентерального применения включают, например, внутрикожные, подкожные, внутримышечные, интратрахеальные, интраназальные, интравитреальные или внутривенные инъекции и инфузии, например, в форме растворов для инъекции, растворов для инфузии или тинктур, а также введение и ингаляции аэрозолей, например, в форме аэрозольных смесей, распыляемых растворов или порошков. Обзор способов доставки лекарственного средства в легкие, т.е. путем ингаляции аэрозоля (который также может быть применен при интраназальном введении) или интратрахеального введения, представлен, например, в J.S. Patton et al., The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery, Proc. Amer. Thoracic Soc., 2004, vol. 1, p. 338-344. К непарентеральным способам доставки относятся, например, пероральное применение, например, в форме пилюль, таблеток, капсул, растворов или суспензий или ректальное применение, например, в форме суппозиториев. Введение молекул антитела по изобретению может осуществляться системно или местно в составах, содержащих любые общепринятые нетоксичные фармакологически приемлемые вспомогательные вещества или носители, добавки и наполнители по мере необходимости.

В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят парентерально млекопитающему и, в частности, человеку. Соответствующие способы введения включают, но без ограничения, например, внутрикожные, подкожные, внутримышечные, интратрахеальные или внутривенные инъекции и инфузии, например, в форме растворов для инъекции, растворов для инфузии или тинктур, а также введение и ингаляции аэрозолей, например, в форме аэрозольных смесей, распыляемых растворов или порошков. В случаях соединений с относительно коротким временем полужизни в сыворотке наиболее удобной может быть комбинация внутривенной и подкожной инфузии и/или инъекции. Фармацевтическая композиция может представлять собой водный раствор, эмульсию типа масло в воде или эмульсию типа вода в масле.

В этом отношении следует отметить, что для трансдермальной доставки молекулы антитела, описанного здесь, также могут быть применены способы трансдермальной доставки, например ионтофорез, сонофорез или доставка с микроигольным усилением, как описано в Meidan V.M., Michniak B.B., 2004, Am. J. Ther., 11(4):312-316. Непарентеральные способы доставки представляют собой, например, пероральное применение, например, в форме пилюль, таблеток, капсул, растворов или суспензий или ректальное применение, например, в форме суппозиториев. Введение молекул антитела по изобретению может осуществляться системно или местно в составах, содержащих разнообразные традиционные нетоксичные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества или носители, добавки и наполнители по мере необходимости.

- 24 040607

Дозировка применяемой молекулы антитела может варьироваться в широких пределах в зависимости для достижения желаемого профилактического или терапевтического ответа. Это будет зависеть, например, от аффинности молекулы антитела к выбранной мишени, а также от периода полужизни комплекса между молекулой антитела и лигандом in vivo. Кроме того, оптимальная дозировка будет зависеть от биораспределения молекулы антитела или ее конъюгата, способа введения, тяжести заболевания/расстройства, подвергаемого лечению, а также медицинского состояния пациента. Например, при местном нанесении в форме мази может быть использована высокая концентрация молекулы антитела. Однако при необходимости молекула антитела также может быть представлена в составе с замедленным высвобождением, например липосомных дисперсиях или полимерных микросферах на основе гидрогеля, например PolyActive™ или OctoDEX™ (см. Bos et al., Business Briefing: Pharmatech, 2003, 1-6). Другими доступными составами с замедленным высвобождением являются, например, полимеры на основе PLGA (PR pharmaceuticals), гидрогели на основе PLA-PEG (Medincell) и полимеры на основе PEA (Medivas).

Таким образом, молекулы антител по настоящему изобретению могут быть включены в композиции с использованием фармацевтически приемлемых ингредиентов и известных способов приготовления (Gennaro, A.L., Gennaro, A.R. (2000), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Для приготовления фармацевтических композиций могут быть применены фармацевтически инертные неорганические или органические вспомогательные вещества. Для приготовления, например, пилюль, порошков, желатиновых капсул или суппозиториев может быть использована лактоза, тальк, стеариновая кислота и ее соли, жиры, воски, твердые или жидкие полиолы, натуральные и гидрогенизированные масла.

Подходящими вспомогательными веществами для получения растворов, суспензий, эмульсий, аэрозольных смесей или порошков для разведения в растворах или аэрозольных смесях перед применением являются вода, спирты, глицерин, полиолы и подходящие их смеси, а также растительные масла.

Фармацевтическая композиция может также включать такие добавки, как, например, наполнители, связующие, увлажнители, глиданты, стабилизаторы, консерванты, эмульгаторы и, кроме того, растворители, или солюбилизаторы, или агенты для достижения депонирующего эффекта. Последние предназначены для того, чтобы белки слияния могли быть включены в системы медленного или замедленного высвобождения или системы направленной доставки, такие как липосомы и микрокапсулы.

Составы могут быть подвергнуты стерилизации многочисленными способами, включая фильтрацию через удерживающий бактерии фильтр, или путем включения стерилизирующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерилизованной воде или другой стерилизованной среде непосредственно перед применением.

В медицине существует множество возможных вариантов применения молекулы антитела в соответствии с настоящим изобретением. В дополнение к ее применению в диагностике in vitro или доставке лекарственного средства может быть получена молекула антитела по изобретению, которая связывает, например, ткань- или опухоль-специфические клеточно-поверхностные молекулы.

Далее приведены неограничительные примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1.

Генерировали биспецифичную бивалентную Fc-аттенуированную молекулу, также обозначаемую, как молекула формата bsFc^ko-1/2, с опухолевой X CD3 специфичностью, как схематично изображено на фиг. 1E. Вносили модификации аминокислот шарнирной области и Сн2-домена, как показано на фиг. 1О. Генерировали биспецифические Fc-аттенуированные тетравалентные молекулы, также обозначаемые, как молекулы формата bsFc^ko-1, с опухолевой X CD3 специфичностью, как схематично изображено на фиг. 1G. Вносили модификации аминокислот шарнирной области и Сн2-домена, как показано на фиг. 1P.

Клонирование и амплификацию плазмид осуществляли, используя Escherichia coli DH5a (Invitrogen, Карлсруэ, Германия). Построение соответствующих векторов отображено на фиг. 2.

Котрансфекцию векторов экспрессии, кодирующих главную и меньшую цепи, которые также могут называться тяжелой и легкой цепями, с обозначенной специфичностью выполняли в клетках плазмоцитомы Sp2/0, полученных от American Type Culture Collection (ATCC, Манассас, штат Виргиния). Структура соответствующих векторов изображена на фиг. 2 (см. также пример 2 ниже). Клетки культивировали в средах EMDM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (PAN-Biotech, Айденбах, Германия), 1% пенициллина и стрептомицина (Lonza, Базель, Швейцария). Стабильные трансфектанты отбирали путем добавления 1 мг/мл G418 (Invitrogen, Карлсруэ, Германия).

Биспецифические антитела очищали от супернатантов культур стабильно трансфицированных клеток путем аффинной хроматографии, используя белок А для формата Fc^ko-1 и KappaSelect для формата bsFc^ko-1/2 (обе среды для хроматографии были получены от GE Healthcare, Мюнхен, Германия).

Пример 2.

В векторе экспрессии V-области иммуноглобулина объединяли с желаемыми константными С-областями. Указанная здесь процедура клонирования обеспечивает возможность включения полных V-областей Ig и их экспрессии в лимфоидных клетках без каких-либо изменений их аминокислотной последовательности. С этой целью нуклеотидную последовательность VDJ- и VJ-фрагмента моноспеци

- 25 040607 фического антитела использовали для конструирования пар праймеров (С-С, D-D'; табл. 1). Реамплифицированные фрагменты ДНК V-сегментов расщепляли (VJ - напрямую, a VDJ - после реамплификации с парой праймеров Е-Е', табл. 1) с помощью соответствующих нуклеаз рестрикции (резюмировано в табл. 1), а затем лигировали в векторы экспрессии. В качестве альтернативы V-домены синтезировали как фрагменты ДНК в GeneArt, Регенсбург, Германия. Этот способ использовали для кодирования генов для V-областей антитела, направленного на EGFR (клон K225). Векторы (фиг. 2) содержат гены тяжелой и легкой константной области человека. Таким образом, инсерция амплифицированных и расщепленных V-сегментов восстанавливает исходную геномную организацию генов Ig в векторах без изменения какой-либо аминокислоты в V-областях.

Исходный вектор для тяжелой цепи содержит тяжелую цепь изотипа γ1 человеческого Ig (фиг. 2А). Сайты рестрикции вводили в требуемых позициях в интронах для замещения AatII-ClaI-фрагмента на VDJ-фрагмент тяжелой цепи моноклональных антител 4G8 (анти-FLT3), BV10 (анти-FLT3), 4G7 (анти-CD19), С225 (анти-EGFR) и 9.2.27 (анти-CSPG4) или любого другого моноклонального антитела. Область, релевантная для клонирования VDJ-фрагмента, показана увеличенной на фиг. 2В. Фрагмент, подлежащий замещению, содержит части первого интрона с сайтом рестрикции AatII, второй экзон лидерной последовательности, VDJ-область и часть интрона тяжелой цепи с сайтом рестрикции ClaI. Для замены всех экзонов константной области тяжелой цепи человеческого γ1 сайты рестрикции вводили в заданные позиции в интроне тяжелой цепи (MluI) и в поли А-области тяжелой цепи 5'-UTR (рА-область; SpeI), как показано на фиг. 2А и 2С.

Кроме того, после конструирования векторов экспрессии возможно замещение всей константной области изотипа γ1 человеческого Ig (фрагмент MluI-SpeI; см фиг. 2А) или на константные области всех других изотипов антитела или на Fc-части с оптимизированной или пониженной эффекторной функцией. В случае антител, оптимизированных для запуска ADCC, аминокислотные замены вводили в С_Н2-домен константной области человеческого γ1, как показано в международных патентных заявках WO 2011/076922 и WO 2011/089211. Для получения биспецифических антител, показанных на фиг. 1A-1N, можно выполнить инсерцию MluI- и SpeI-фланкированных фрагментов ДНК, содержащих экзоны, кодирующие дикий тип, или модифицированные константные области тяжелой цепи Ig. Подлежащий замещению фрагмент MluI-SpeI показан увеличенным на фиг. 2С. Чтобы дополнить биспецифическое антитело специфичностью ко второму антигену, можно включить scFv-фрагменты с ориентацией V_H-V_L или V_l-V_h через сайты ферментов рестрикции BspEI и SpeI, что также показано на фиг. 2А. Область, релевантная для клонирования scFv-фрагмента в ориентации VL-VH, показана увеличенной на фиг. 2С. ScFv-фрагменты со специфичностью к CD3 (гуманизированный клон UCHT1; ориентация V_l-V_h), CD28 (клон 9.3; ориентация V_l-V_h), TCRa/β (клон ВМА031; ориентация V_h-V_l) получали путем ПЦР с олигонуклеотидами F и F', перечисленными в табл. 2. В качестве альтернативы их синтезировали как фрагменты ДНК в Gene Art, Регенсбург, Германии. Этот способ применяли для генов, кодирующих антитела, направленные на CD16 (клон 3G8; ориентация V_l-V_h). Фрагмент ДНК scFv-фрагментов в ориентации V_h-V_l и V_l-V_h соответственно расщепляли подходящими рестрикционными нуклеазами (резюмированы в табл. 2) и затем лигировали в вектор экспрессии.

Исходный вектор для легкой цепи содержит VJ-область легкой цепи и С-область κ-гена человека (фиг. 2D). В требуемые места (XhoI и SpeI) вводили сайты рестрикции для замены фрагмента XhoI-SpeI легкой цепи на соответствующий VJ-фрагмент легкой цепи моноклональных антител 4G8 (анти-FLT3), BV10 (анти-FLT3), 4G7 (анти-CD19), K225 (анти-EGFR) или 9.2.27 (анти-CSPG4) или любого другого моноклонального антитела. Область, смежная с фрагментом, подлежащим замещению, показана на фиг. 2Е. Эта область содержит части второго экзона лидерной последовательности, сайт рестрикции (XhoI), подходящий для слияния с сохранением рамки считывания, VJ-область и части интрона каппацепи с сайтом рестрикции SpeI. Для замены константной области легкой цепи (CL) сайты рестрикции вводили в требуемые места (PmlI и BsmBI). Область, смежная с фрагментом, подлежащим замещению, показана увеличенной на фиг. 2F. Эта область содержит части интрона каппа-цепи, подходящий сайт рестрикции (PmII), CL-область и части полиА-области (пА-области) каппа-цепи области 3'-UTR с сайтом рестрикции (BsmBI).

- 26 040607

Таблица 1

Олигонуклеотиды, используемые для амплификации VDJ- и VJ-сегментов для инсерции в векторы экспрессии

Олигонуклеотиды, используемые для VDJ-сегмента тяжёлой цепи
С	4G7-H-for	5’-etc ttc аса ggt gtc etc tet gag gtc cag etg cag cag tet gga cct g-3’ (SEQ ID NO: 27)
С’	4G7-H-rev	5’-ggg aga agg tag gac tea cct gag gag act gtg aga gtg gtg cct tgg ccc cag tag tc-3’ (SEQ ID NO: 28)
С	9.2.27-H-for	5’-tet tea cag gtg tcc tet ccc agg tga age tgc age aat etg gac etg agc-3’ (SEQ ID NO: 29)
С’	9.2.27-H-rev	5’-aat ggg aga agg tag gac tea cct gag gag acg gtg acc gtg gtc cct tgg-3’ (SEQ ID NO: 30)
с	4G8-H-for	5’-tet ett cac agg tgt cct etc tea ggt cca act gca gca gcc tgg ggc tga gc-3’ (SEQ ID NO: 31)
С’	4G8-H-rev	5’-gag aag gta gga etc acc tga gga gac tgt gag agt ggt gcc ttg gcc cca g-3’ (SEQ ID NO: 32)
с	BVlO-H-for	5’-aga cgt cca etc tgt ett tet ett cac agg tgt cct etc cca ggt gca get gaa gca gtc-3’(SEQID NO: 33)
С’	BVlO-H-rev	5’-gag aag gta gga etc acc tga gga gac ggt gac tga ggt tec ttg acc c-3’ (SEQ ID NO: 34)
Е	universal for (Aatll)	5’-aga cgt cca etc tgt ett tet ett cac agg tgt cct etc c-3’ (SEQ ID NO: 35)

E’	universal rev (Clal)	5’-tat ega ttt aga atg gga gaa ggt agg act cac-3’ (SEQ ID NO: 36)
Олигонуклеотиды, используемые для VJ-сегмента лёгкой цепи
D	4G7-L-for (Xhol)	5’-act ega gga gat att gtg atg act cag get gca ccc tet ata c-3’ (SEQ ID NO: 37)
D	4G7-L-rev (Spel)	5’-aac tag tac tta cgt ttc age tec age ttg gtc cca gca ccg aac gtg-3’ (SEQ ID NO: 38)
D	9.2.27-L-for (Xhol)	5’-tet ega gga gac ate gag etc act cag tet cca get tet ttg-3’ (SEQ ID NO: 39)
D	9.2.27-L-rev (Spel)	5’-aac tag tac tta cgt ttg ate tec age ttg gtg ccc cct cca aag g-3’ (SEQ ID NO: 40)
D	4G8-L-for (Xhol)	5’-act ega gga gat att gtg eta act cag tet cca gcc acc ctg-3’ (SEQ ID NO: 41)
D 9	4G8-L-rev (Spel)	5’-tac tag tac tta cgt ttt att tec age ttg gtc ccc cct cc-3’ (SEQ ID NO: 42)
D	BVlO-L-for (Xhol)	5’-act ega gga gac att gtg atg аса cag tet cca tec tec c-3’ (SEQ ID NO: 43)
D 9	BVlO-L-rev (Spel)	5’-act agt act tac gtt tea get cca get tgg tec cag cac ega acg tg-3’ (SEQ ID NO: 44)

Сайты рестрикции выделены жирным шрифтом и обозначены буквами в круглых скобках.

- 27 040607

Таблица 2

Олигонуклеотиды, используемые для амплификации scFv-сегментов для инсерции в векторы экспрессии

Олигонуклеотиды, используемые для scFv-сегмента
F	UCHTl-for (BspEI)	5’- ate egg aga tat cca gat gac cca gtc ccc gag etc cct g-3’ (SEQ ID NO: 45)
F’	UCHTl-rev (Spel)	5’- tac tag tta tea ega gga gac ggt gac cag ggt tcc ttg acc cca-3’ (SEQ ID NO: 46)

F	BMA031-for (BspEI)	5’- ate egg aga agt gca get gca gca gtc egg ccc tga gct-3’ (SEQ ID NO: 47)
F’	BMA031-rev (Spel)	5’- tac tag tta tea ett cag ttc cag ett ggt gee age gee gaa ggt-3’ (SEQ ID NO: 48)
F	9.3-for (BspEI)	5’-ate egg aga cat tgt get gac cca gtc ccc tgc etc cct gg-3’ (SEQ ID NO: 49)
F’	9.3-rev (Spel)	5’- tac tag tta tea aga get cac agt cac tgt ggt gee etg gee cca -3’ (SEQ ID NO: 50)

Сайты рестрикции выделены жирным шрифтом и обозначены буквами в круглых скобках.

Таким образом, были получены молекулы биспецифического антитела с FLT3xCD3 (4G8xUCHT1, BV10xUCHT1), FLT3xTCRa/e (4G8xBMA031, BV10xBMA031), FLT3xCD28 (4G8x9.3, BV10x9.3), FLT3xCD16 (4G8x3G8, BV10x3G8), CD19xCD3 (4G7xUCHT1), CD19xTCRa/e (4G7xBMA031), CD19xCD28 (4G7x9.3), CD19xCD16 (4G7x3G8), CSPG4xCD3 (9.2.27xUCHT1), CSPG4xTCRD/D (9.2.27xBMA031), CSPG4xCD28 (9.2.27x9.3), CSPG4xCD16 (9.2.27x3G8), EGFRxCD3 (C225xUCHT1), EGFRxTCRa/β (C225xBMA031), EGFRxCD28 (C225x9.3), EGFRxCD16 (C225x3G8) в качестве тетравалентного bsFc-^KO-1 и бивалентного bsFc-^KO-1/2. Последовательности соответствующих цепей изображены как SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 26 и представлены на фиг. 6.

Котрансфекция векторов экспрессии, кодирующих химерные тяжелую и легкую цепи (IgG1/k) или модифицированные тяжелые цепи в не-Ig-продуцирующую линию миеломной клетки Sp2/0 давала устойчивые трансфектомы, секретирующие биспецифические моноклональные антитела, способные специфично связываться с целевым антигеном. Функциональные характеристики этих молекул антител проиллюстрированы в следующих экспериментах с использованием молекул биспецифических антител FLT3xCD3, CD19xTCRa/e и CSPGxCD3.

Пример 3.

Определяли активацию Т-клеток двумя форматами антител из примера 1, форматом bsFc^ko-1/2 и bsFc^ko-1, с и без позитивных REH-клеток FLT3/CD19. Данные приведены на фиг. 3. Используемые молекулы биспецифического антитела имели сайт связывания FLT3 (первый сайт связывания) клона 4G8 и сайт связывания CD3 (второй сайт связывания) клона UCHT1. Молекула bsFc^ko-1/2-формата была составлена из цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 6, а молекула bsFc^ko-1-формата состояла из цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 26. Молекула биспецифического антитела, связывающая CSPG4 и CD3, имела bsFc^ko-1/2-формат и состояла из цепей SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 18. Дополнительно использовали молекулу биспецифического антитела в формате bsFc^ko-1/2, связывающую CD19 и TCRa/β, которая состояла из цепей SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 15.

A) Из периферической крови здоровых доноров получали мононуклеарные клетки человека (РВМС) и отделяли с использованием центрифугирования в градиенте плотности. РВМС переносили в 96-луночные планшеты (100000 на лунку). Далее добавляли облученные FLT3/CD19-позитивные REH-клетки (50000 на лунку) или среду, в завершение чего добавляли антитела в показанных концентрациях (фиг. 3А). Через 24 ч клетки инкубировали с использованием ³Н тимидина (0,5 μCi/лунка). Еще через 24 ч клетки наносили на стекловолоконные фильтры, используя коллектор клеток. Далее с помощью сцинтилляционного счетчика определяли радиоактивность.

B) Гепаринизированную цельную кровь (50 мкл/лунка) инкубировали в 96-луночных планшетах с и без FLT3/CD19-позитивных REH-клеток (50000/лунку) и с антителами в концентрациях, указанных на фиг. 3В. Через 24 ч концентрацию TNF в супернатанте определяли посредством ELISA.

REH-клетки (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Брауншвейг, Германия) и РВМС-клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыво

- 28 040607 ротки (PAN-Biotech, Айденбах, Германия), 1% пенициллина и стрептомицина (Lonza, Базель, Швейцария).

Пример 4.

Определяли лизис REH-клеток, экспрессирующих FLT3/CD19 (фиг. 4А), и SKMe163-клеток, экспрессирующих CSPG (фиг. 4В), биспецифическими антителами и активированными клетками-киллерами CD8+T.

Мононуклеарные клетки человека (РВМС) в течение трех дней стимулировали посредством моноспецифического CD3-антитела UCHT1 (10 нг/мл). Затем активированные клетки CD8+T отделяли позитивной селекцией, используя магнитную сортировку клеток. Эти клетки добавляли к FLT3/CD19-позитивным REH-клеткам, маркированным ⁵¹Cr (фиг. 4А), или к CSPG4-позитивным клеткам SKMe163 (фиг. 4В) и инкубировали с антителами в указанных концентрациях. Через 4 ч клеточные супернатанты собирали на планшетах сцинтилляции и определяли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике.

Специфический лизис в процентах при заданных экспериментальных условиях оценивали следующим образом: cpm(exp)-cpm(bg)/cpm(100)-cpm(bg), где cpm(bg) соответствует выходу хрома без антитела и эффекторных клеток, а cpm(100) соответствует выходу хрома после инкубации клеток-мишеней с детергентом.

Клетки SKMe163 были получены от Dr. В. Guckel, Klinik fur Gynakologie, University of Tubingen, Германия.

Пример 5.

Скорость агрегации и продуцирования антител FLT3xCD3 (сайт связывания FLT: клон 4G8, сайт связывания CD3: клон UCHT1) идентичной специфичности сравнивали между тремя разными форматами: биспецифичного одноцепочечного формата (bs-scFv), bsFc^ko-1/2-формата и bsFc^ko-1-формата. Молекула антитела bsFc^ko-1/2-формата состояла из цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 6, а молекула антитела bsFcko-1-формата состояла из цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 26.

Биспецифические одноцепочечные молекулы очищали афинной хроматографией, используя белок L.

Выполняли фильтрацию в геле, используя колонку Superdex 200 РС3.2/30 и SMARTSystem (GEHealthcare, Мюнхен, Германия). Стандартными белками были каталаза (232 кДа, из бычьей печени), альдолаза (158 кДа, из мышц кролика), альбумин (67 кДа, из бычьей сыворотки) и рибонуклеаза А (13,7 кДа, из бычьей поджелудочной железы). Результаты представлены на фиг. 5А. Из данных на фиг. 5А следует, что образование агрегатов значительно более выражено, если антитело экспрессируется, как bs-scFv (скорость агрегации 43%), а не как bsFcko-1/2 (агрегация не обнаружена) или bsFcko-1 (скорость агрегации 2%), т.е. молекулы биспецифического антитела по настоящему изобретению остаются мономерными молекулами и по существу не стремятся к агрегации.

Для сравнения скоростей продуцирования в клетки Sp2/0 вводили гены, кодирующие биспецифические молекулы со специфичностью к 4G8 (анти-FLT3) и UCHT1 (анти-CD3) в указанных форматах, и антитела очищали, используя аффинную хроматографию. Количество антитела, очищенного от супернатантов клонов, выбранное для максимального продуцирования, изображено на фиг. 5В. Концентрации антител определяли оптической спектроскопией, принимая оптическую плотность в 1,4 при 280 нм за концентрацию антитела 1 мг/мл. Скорости продуцирования для молекул антитела bsFcko-1/2 и bsFcko-1 по изобретению были значительно выше соответствующих значений для соответствующей молекулы bs-scFv.

Специалист в данной области техники легко поймет, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для решения задач и достижения указанных конечных целей и преимуществ, указанных в настоящем документе. Кроме того, специалисту в данной области техники будет понятно, что в раскрытое здесь изобретение могут быть внесены различные замены и модификации без отступления от объема и сущности изобретения. Композиции, способы, процедуры, способы лечения, молекулы и специфические соединения, описанные здесь, представляют собой некоторые варианты реализации, приведены в качестве примера и не ограничивают объем правовой охраны изобретения. Изменения и другие варианты применения будут ясны специалисту в данной области техники, и они входят в рамки сущности изобретения и определены формулой изобретения. Перечень или ссылки на опубликованные ранее документы, сделанные в настоящем описании, не являются подтверждением того, что этот документ является частью уровня техники или обычными общеизвестными знаниями.

Изобретение, иллюстративно описанное здесь, подходящим образом может быть осуществлено на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, не раскрытых здесь конкретно. Соответственно, например, термины содержащий, включающий, содержащий в себе и т.д. имеют расширительный и неограничительный смысл. Кроме того, использованные здесь термины и выражения применены как описательные, но не ограничительные, и не должны толковаться как исключающие возможность эквивалентов представленных и описанных признаков, при этом различные модификации допустимы в объеме формулы заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то что настоящее изобретение информационно раскрыто на основе конкретных вариантов реализации и необязательных признаков, специалистам в данной области техники может быть понятна модификация и вариация реализованных в нем изобретений и такие модификации и вариации

- 29 040607 входят в объем данного изобретения.

Здесь дано широкое и общее описание изобретения. Любая более узкая производная и соподчиненная составляющая общего раскрытия также является частью изобретения. Это относится и к общему описанию изобретения при некотором условии или отрицательном признаке, исключающем какой-либо объект изобретения из общего вне зависимости от присутствия такого исключения в описании.

Другие варианты реализации входят в рамки представленной ниже формулы изобретения. В дополнение к этому там, где описанные признаки или аспекты изобретения относятся к группе Маркуша, специалистам в данной области будет понятно, что данное изобретение также имеет отношение к какомулибо отдельному компоненту или подгруппе компонентов группы Маркуша.

Перечень последовательностей <110> Synimmune GbmH <120> МОЛЕКУЛА БИСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА <130> SYN14309PCT <150> US 61/577,327 <151> 2011-12-19 <160> 50 <170> Patentin, версия 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность легкой цепи, анти-ПТЗ химерная легкая цепь (клон

4G8) < 400> 1

Asp lie Val 1	Leu Thr 5	Gin	Ser Pro Ala Thr Leu 10	Ser	Val	Thr	Pro 15
Gly Asp Ser	Val Ser	Leu	Ser Cys Arg Ala Ser	Gin	Ser	lie	Ser
	20		25				30
Asn Asn Leu	His Trp	Tyr	Gin Gin Lys Ser His	Glu	Ser	Pro	Arg
	35		40				45
Leu Leu lie	Lys Tyr	Ala	Ser Gin Ser lie Ser	Gly	lie	Pro	Ser
	50		55				60
Arg Phe Ser	Gly Ser	Gly	Ser Gly Thr Asp Phe	Thr	Leu	Ser	lie
	65		70				75
Asn Ser Val	Glu Thr	Glu	Asp Phe Gly Val Tyr	Phe	Cys	Gin	Gin
	80		85				90
Ser Asn Thr	Trp Pro	Tyr	Thr Phe Gly Gly Gly	Thr	Lys	Leu	Glu
	95		100				105
lie Lys Arg	Thr Val	Ala	Ala Pro Ser Val Phe	lie	Phe	Pro	Pro
	110		115				120
Ser Asp Glu	Gin Leu	Lys	Ser Gly Thr Ala Ser	Val	Val	cys	Leu
	125		130				135
Leu Asn Asn	Phe Tyr	Pro	Arg Glu Ala Lys Val	Gin	Trp	Lys	Val
	140		145				150
Asp Asn Ala	Leu Gin	Ser	Gly Asn Ser Gin Glu	Ser	Val	Thr	Glu
	155		160				165
Gin Asp Ser	Lys Asp	Ser	Thr Tyr Ser Leu Ser	Ser	Thr	Leu	Thr
	170		175				180
Leu Ser Lys	Ala Asp	Tyr	Glu Lys His Lys Val	Tyr	Ala	Cys	Glu
	185		190				195
Val Thr His	Gin Gly	Leu	Ser Ser Pro Val Thr	Lys	Ser	Phe	Asn
	200		205				210

- 30 040607

Arg Gly Glu Cys < 210> 2 < 211> 220 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность легкой цепи, анти-РИЗ химерная легкая цепь (клон BV10) < 400> 2

Asp lie Vai Met Thr	Gin Ser	Pro	Ser Ser 10	Leu Ser	Vai Ser Ala 15
1	5
Gly Glu	Lys Vai Thr	Met Ser	Cys	Lys Ser	Ser Gin	Ser Leu Leu
	20			25		30
Asn Ser	Gly Asn Gin	Lys Asn	Tyr	Met Ala	Trp Tyr	Gin Gin Lys
	35			40		45
Pro Gly	Gin Pro Pro	Lys Leu	Leu	He Tyr	Gly Ala	Ser Thr Arg
	50			55		60
Glu Ser	Gly Vai Pro	Asp Arg	Phe	Thr Gly	Ser Gly	Ser Gly Thr
	65			70		75
Asp Phe	Thr Leu Thr	He Ser	Ser	Vai Gin	Ala Glu	Asp Leu Ala
	80			85		90
Vai Tyr	Tyr Cys Gin	Asn Asp	His	Ser Tyr	Pro Leu	Thr Phe Gly
	95			100		105
Ala Gly	Thr Lys Leu	Glu Leu	Lys	Arg Thr	Vai Ala	Ala Pro Ser
	110			115		120
Vai Phe	He Phe Pro	Pro Ser	Asp	Glu Gin	Leu Lys	Ser Gly Thr
	125			130		135
Ala Ser	Vai Vai Cys	Leu Leu	Asn	Asn Phe	Tyr Pro	Arg Glu Ala
	140			145		150
Lys Vai	Gin Trp Lys	Vai Asp	Asn	Ala Leu	Gin Ser	Gly Asn Ser
	155			160		165
Gin Glu	Ser Vai Thr	Glu Gin	Asp	Ser Lys	Asp Ser	Thr Tyr Ser
	170			175		180
Leu Ser	Ser Thr Leu	Thr Leu	Ser	Lys Ala	Asp Tyr	Glu Lys His
	185			190		195
Lys Vai	Tyr Ala Cys	Glu Vai	Thr	His Gin	Gly Leu	Ser Ser Pro

- 31 040607

200 205 210

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 220 <210> 3 <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> последовательность легкой цепи, aHTM-CSPG4 химерная легкая цепь (клон 9.2.27) <400> 3

Asp

He

Glu

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

1

5

10

15

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

He

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Ser

Val

Asp

20

25

30

Ser

Tyr

Gly

Asn

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Gln

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

He

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Arg

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

He

Asp

Pro

Val

Glu

Ala

Asp

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gln

Gln

Asn

Asn

Glu

Asp

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Leu

Glu

He

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

He

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

<210> 4 <211> 219 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность легкой цепи, анти-С019 химерная легкая цепь (клон

- 32 040607

4G7) <400> 4

Asp lie Vai Met Thr 1 5

Glu Ser Vai Ser lie 20

Asn Gly Asn Thr Tyr 35

Pro Gin Leu Leu Ile 50

Asp Arg Phe Ser Gly 65

Ser Arg Vai Glu Ala 85

Leu Glu Tyr Pro Phe 100

Arg Thr Vai Ala Ala 115

Gin Leu Lys Ser Gly 130

Tyr Pro Arg Glu Ala 145

Ser Gly Asn Ser Gin 165

Thr Tyr Ser Leu Ser 180

Lys His Lys Vai Tyr 195

Pro Vai Thr Lys Ser 210

Gin Ala Ala Pro Ser lie 10

Ser Cys Arg Ser Ser Lys 25

Leu Tyr Trp Phe Leu Gin 40

Tyr Arg Met Ser Asn Leu 55

Ser Gly Ser Gly Thr Ala 70 75

Glu Asp Vai Gly Vai Tyr 90

Thr Phe Gly Ala Gly Thr 105

Pro Ser Vai Phe lie Phe 120

Thr Ala Ser Vai Vai Cys 135

Lys Vai Gin Trp Lys Vai 150 155

Glu Ser Vai Thr Glu Gin 170

Ser Thr Leu Thr Leu Ser 185

Ala Cys Glu Vai Thr His 200

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215

Pro Vai Thr Pro Gly 15

Ser Leu Leu Asn Ser 30

Arg Pro Gly Gin Ser 45

Ala Ser Gly Vai Pro 60

Phe Thr Leu Arg lie 80

Tyr Cys Met Gin His 95

Lys Leu Glu Leu Lys 110

Pro Pro Ser Asp Glu 125

Leu Leu Asn Asn Phe 140

Asp Asn Ala Leu Gin 160

Asp Ser Lys Asp Ser 175

Lys Ala Asp Tyr Glu 190

Gin Gly Leu Ser Ser 205 < 210> 5 < 211> 214 < 212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность легкой цепи, анти-EGFR химерная легкая цепь

- 33 040607

(клон C225)

<400> 5

Asp

He

Leu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Vai

He

Leu

Ser

Vai

Ser

Pro

1

5

10

15

Gly

Glu

Arg

Vai

Ser

Phe

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

He

Gly

20

25

30

Thr

Asn

He

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Thr

Asn

Gly

Ser

Pro

Arg

35

40

45

Leu

Leu

He

Lys

Tyr

Ala

Ser

Glu

Ser

He

Ser

Gly

He

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Ser

He

65

70

75

Asn

Ser

Vai

Glu

Ser

Glu

Asp

He

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

80

85

90

Asn

Asn

Asn

Trp

Pro

Thr

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

95

100

105

Leu

Lys

Arg

Thr

Vai

Ala

Ala

Pro

Ser

Vai

Phe

He

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Vai

Vai

Cys

Leu

125

130

135

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Vai

Gin

Trp

Lys

Vai

140

145

150

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Vai

Thr

Glu

155

160

165

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

170

175

180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Vai

Tyr

Ala

cys

Glu

185

190

195

Vai

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Vai

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

200

205

210

Arg Gly

Glu

Cys <210> 6 <211> 589 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 34 040607 <220>

<223> последовательность тяжелой цепи/главной цепи, FLT3 х CD3; bsFcko-1/2 [N концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон 4G8) и Сконцевая CD3 одноцепочечная (клон UCHT1, VL-VH)] цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> б

Gin	Vai	Gin Leu Gin Gin	Pro Gly Ala	Glu Leu	Vai	Lys	Pro Gly
1		5		10			15
Ala	Ser	Leu Lys Leu Ser 20	Cys Lys Ser	Ser Gly 25	Tyr	Thr	Phe Thr 30
Ser	Tyr	Trp Met His Trp 35	Vai Arg Gin	Arg Pro 40	Gly	His	Gly Leu 45
Glu	Trp	He Gly Glu He 50	Asp Pro Ser	Asp Ser 55	Tyr	Lys	Asp Tyr 60
Asn	Gin	Lys Phe Lys Asp 65	Lys Ala Thr	Leu Thr 70	Vai	Asp	Arg Ser 75
Ser	Asn	Thr Ala Tyr Met 80	His Leu Ser	Ser Leu 85	Thr	Ser	Asp Asp 90
Ser	Ala	Vai Tyr Tyr Cys 95	Ala Arg Ala	He Thr 100	Thr	Thr	Pro Phe 105
Asp	Phe	Trp Gly Gin Gly 110	Thr Thr Leu	Thr Vai 115	Ser	Ser	Ala Ser 120
Thr	Lys	Gly Pro Ser Vai 125	Phe Pro Leu	Ala Pro 130	Ser	Ser	Lys Ser 135
Thr	Ser	Gly Gly Thr Ala 140	Ala Leu Gly	Cys Leu 145	Vai	Lys	Asp Tyr 150
Phe	Pro	Glu Pro Vai Thr 155	Vai Ser Trp	Asn Ser 160	Gly	Ala	Leu Thr 165
Ser	Gly	Vai His Thr Phe 170	Pro Ala Vai	Leu Gin 175	Ser	Ser	Gly Leu 180
Tyr	Ser	Leu Ser Ser Vai 185	Vai Thr Vai	Pro Ser 190	Ser	Ser	Leu Gly 195
Thr	Gin	Thr Tyr lie Cys 200	Asn Vai Asn	His Lys 205	Pro	Ser	Asn Thr 210
Lys	Vai	Asp Lys Lys Vai 215	Glu Pro Lys	Ser Cys 220	Asp	Lys	Thr His 225
Thr	Ser	Pro Pro Ser Pro 230	Ala Pro Pro	Vai Ala 235	Gly	Pro	Ser Vai 240
Phe	Leu	Phe Pro Pro Lys 245	Pro Lys Asp	Thr Leu 250	Met	He	Ser Arg 255
Thr	Pro	Glu Vai Thr Cys 260	Vai Vai Vai	Gly Vai 265	Ser	His	Glu Asp 270
Pro	Glu	Vai Lys Phe Asn 275	Trp Tyr Vai	Asp Gly 280	Vai	Glu	Vai His 285
Asn	Ala	Lys Thr Lys Pro 290	Arg Glu Glu	Gin Tyr 295	Gin	Ser	Thr Tyr 300
Arg	Vai	Vai Ser Vai Leu 305	Thr Vai Leu	His Gin 310	Asp	Trp	Leu Asn 315
Gly	Lys	Glu Tyr Lys Cys 320	Lys Vai Ser	Asn Lys 325	Gin	Leu	Pro Ser 330
Pro	He.	Glu Lys Thr He 335	Ser Lys Ala	Lys Gly 340	Gin	Pro	Ser Gly 345

- 35 040607

Asp He	Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser	Leu Ser	Ala	Ser	Vai 360
350	355
Gly Asp	Arg Vai Thr He 365	Thr Cys Arg Ala 370	Ser Gin	Asp	lie	Arg 375
Asn Tyr	Leu Asn Trp Tyr 380	Gin Gin Lys Pro 385	Gly Lys	Ala	Pro	Lys 390
Leu Leu	lie Tyr Tyr Thr 395	Ser Arg Leu Glu 400	Ser Gly	Vai	Pro	Ser 405
Arg Phe	Ser Gly Ser Gly 410	Ser Gly Thr Asp 415	Tyr Thr	Leu	Thr	He 420
Ser Ser	Leu Gin Pro Glu 425	Asp Phe Ala Thr 430	Tyr Tyr	Cys	Gin	Gin 435
Gly Asn	Thr Leu Pro Trp 440	Thr Phe Gly Gin 445	Gly Thr	Lys	Vai	Glu 450
He Lys	Gly Gly Gly Gly 455	Ser Gly Gly Gly 460	Gly Ser	Gly Gly	Gly 465
Gly Ser	Glu Vai Gin Leu 470	Vai Glu Ser Gly 475	Gly Gly	Leu	Vai	Gin 480
Pro Gly	Gly Ser Leu Arg 485	Leu Ser Cys Ala 490	Ala Ser	Gly	Tyr	Ser 495
Phe Thr	Gly Tyr Thr Met 500	Asn Trp Vai Arg 505	Gin Ala	Pro	Gly	Lys 510
Gly Leu	Glu Trp Vai Ala 515	Leu He Asn Pro 520	Tyr Lys	Gly	Vai	Ser 525
Thr Tyr	Asn Gin Lys Phe 530	Lys Asp Arg Phe 535	Thr He	Ser	Vai	Asp 540
Lys Ser	Lys Asn Thr Ala 545	Tyr Leu Gin Met 550	Asn Ser	Leu	Arg	Ala 555
Glu Asp	Thr Ala Vai Tyr 560	Tyr Cys Ala Arg 565	Ser Gly	Tyr	Tyr	Gly 570
Asp Ser Thr Vai	Asp Trp Tyr Phe 575 Ser Ser	Asp Vai Trp Gly 580	Gin Gly	Thr	Leu	Vai 585

<210> 7 <211> 594 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <22Θ>

< 223> FLT3 x CD3; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон BV10) и С-концевая CD3 одноцепочечная (клон UCHT1, VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы < 400> 7

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin

10 15

Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30

- 36 040607

Gly Leu His Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045

Gly Vai lie Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe lie 50 5560

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 65 70 7580

Lys Met Asn Ser Leu Gin Ala Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 9095

Arg Lys Gly Gly lie Tyr Tyr Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105110

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120125

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai

145 150 155160

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe

165 170175

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai

180 185190

Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai

195 200205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys

210 215220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai 225 230 235240

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250255

- 37 040607

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser

260 265270

His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu

275 280285

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr

290 295300

Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn

305 310 315320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro

325 330335

He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp lie

340 345350

Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg

355 360365

Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Arg Asn Tyr Leu Asn

370 375380

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr

385 390 395400

Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 405 410415

Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp

420 425430

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe

435 440445

Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu He Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

450 455460

- 38 040607

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly

465 470 475480

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

485 490495

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala

500 505510

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Leu lie Asn Pro Tyr Lys Gly

515 520525

Vai Ser Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Vai

530 535540

Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala

545 550 555560

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp

565 570575

Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai

580 585590

Ser Ser <210> 8 <211> 585 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> FLT3 x TCR альфа/бета; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон 4G8) и С-концевая TCR альфа/бета одноцепочечная (клон ВМА031; VH-VL)], цепь гликан-ковариант-полумолекулы <400> 8

Gin Vai 1	Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala
5	10	15
Ser Leu	Lys Leu Ser Cys	Lys Ser Ser Gly Tyr Thr	Phe Thr Ser Tyr
	20	25	30

- 39 040607

Trp

Met

His

Trp

Vai

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

His

Gly

Leu

Glu

Trp

lie

35

40

45

Gly

Glu

lie

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Lys

Asp

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Asp

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Vai

Asp

Arg

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

His

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Asp

Asp

Ser

Ala

Vai

Tyr

Tyr

cys

85

90

95

Ala

Arg

Ala

lie

Thr

Thr

Thr

Pro

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr

Leu

Thr

Vai

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Vai

Phe

Pro

115

120

125

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

130

135

140

cys

Leu

Vai

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Vai

Thr

Vai

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Vai

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Vai

Leu

Gin

165

170

175

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Vai

Vai

Thr

Vai

Pro

Ser

Ser

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

Vai

Asn

His

Lys

Pro

Ser

195

200

205

Asn

Thr

Lys

Vai

Asp

Lys

Lys

Vai

Glu

Pro

Lys

Ser

cys

Asp

Lys

Thr

210

215

220

His

Thr

Ser

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Vai

Ala

Gly

Pro

Ser

Vai

225

230

235

240

- 40 040607

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

250 255

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai

260

Gly Vai Ser His Glu Asp Pro Glu

265 270

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp

275 280

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys

285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr

290 295

Gin Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser 300

Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 305 310

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

315 320

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu

325

Pro Ser Pro lie Glu Lys Thr lie

330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser 340

Gly Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser

345 350

Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly

355 360

Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys 365

Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser

370 375

Tyr Vai Met His Trp Vai Lys Gin 380

Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 385 390 lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn

395 400

Asp Vai Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 405

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr

410 415

Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 420

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr

425 430

Ser Glu Asp Ser Ala Vai His Tyr

435 440

Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp 445

Tyr Asp Gly Phe Vai Tyr Gly Gin

450 455

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

460

- 41 040607

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin

465 470 475480

He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu 485 490495

Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Vai Ser Tyr Met His

500 505510

Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp

515 520525

Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

530 535540

Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp

545 550 555560

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe

565 570575

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

580585 <210> 9 <211> 590 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> FLT3 x TCR альфа/бета; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTM-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон BV10) и С-концевая TCR альфа/бета одноцепочечная (клон ВМА031; VH-VL)], цепь гликан-ковариант-полумолекулы

<400> 9
Gin Vai 1	Gin	Leu	Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu 5 10	Vai	Gin	Pro Ser Gin 15
Ser Leu	Ser	He 20	Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe 25	Ser	Leu	Thr Asn Tyr 30

- 42 040607

Gly Leu	His 35	Trp	Vai Arg Gin	Ser Pro Gly 40	Lys Gly	Leu Glu 45	Trp	Leu
Gly Vai 50	He	Trp	Ser Gly Gly 55	Ser Thr Asp	Tyr Asn 60	Ala Ala Phe	He
Ser Arg 65	Leu	Ser	He Ser Lys 70	Asp Asn Ser	Lys Ser 75	Gin Vai	Phe	Phe 80
Lys Met	Asn	Ser	Leu Gin Ala 85	Asp Asp Thr 90	Ala He	Tyr Tyr	Cys 95	Ala
Arg Lys	Gly	Gly 100	He Tyr Tyr	Ala Asn His 105	Tyr Tyr	Ala Met 110	Asp	Tyr
Trp Gly	Gin 115	Gly	Thr Ser Vai	Thr Vai Ser 120	Ser Ala	Ser Thr 125	Lys	Gly
Pro Ser 130	Vai	Phe	Pro Leu Ala 135	Pro Ser Ser	Lys Ser 140	Thr Ser	Gly	Gly
Thr Ala 145	Ala	Leu	Gly Cys Leu 150	Vai Lys Asp	Tyr Phe 155	Pro Glu	Pro	Vai 160
Thr Vai	Ser	Trp	Asn Ser Gly 165	Ala Leu Thr 170	Ser Gly	Vai His	Thr 175	Phe
Pro Ala	Vai	Leu 180	Gin Ser Ser	Gly Leu Tyr 185	Ser Leu	Ser Ser 190	Vai	Vai
Thr Vai	Pro 195	Ser	Ser Ser Leu	Gly Thr Gin 200	Thr Tyr	He Cys 205	Asn	Vai
Asn His 210	Lys	Pro	Ser Asn Thr 215	Lys Vai Asp	Lys Lys 220	Vai Glu	Pro	Lys
Ser Cys 225	Asp	Lys	Thr His Thr 230	Ser Pro Pro	Ser Pro 235	Ala Pro	Pro	Vai 240

- 43 040607

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val

260

Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser

265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

290 295

Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr

300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn

315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325

Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro

330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 340

Lys Gly Gin Pro Ser Gly Glu Val

345 350

Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu

355 360

Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

365

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly

370 375

Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr Val Met 380

His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly

385 390

Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr

395 400 lie Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr 405

Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

410 415

Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys 420

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu

425 430

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

435 440

Ser Ala Val His Tyr Cys Ala Arg 445

Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly

450 455

Phe Val Tyr Gly Gin Gly Thr Leu 460

- 44 040607

Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

465 470 475480

Gly Gly Gly Ser Gin Ue Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ue Met Ser

485 490495

Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser

500 505510

Vai Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys

515 520525

Arg Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg

530 535540

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser

545 550 555560

Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser

565 570575

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

580 585590 <210> 10 <211> 592 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> FLT3 x CD28; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTM-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон 4G8) и С-концевая CD28 одноцепочечная (клон 9.3;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 10

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala

10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

- 45 040607

Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly	His Gly	Leu 45	Glu Trp	He
	35	40
Gly	Glu He 50	Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys 55	Asp Tyr 60	Asn	Gln Lys	Phe
Lys 65	Asp Lys	Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg 70	Ser Ser 75	Asn	Thr Ala	Tyr 80
Met	His Leu	Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp 85 90	Ser Ala	Val	Tyr Tyr 95	Cys
Ala	Arg Ala	He Thr Thr Thr Pro Phe Asp 100 105	Phe Trp	Gly	Gln Gly 110	Thr
Thr	Leu Thr 115	Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 120	Gly Pro	Ser 125	Val Phe	Pro
Leu	Ala Pro 130	Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 135	Gly Thr 140	Ala	Ala Leu	Gly
Cys 145	Leu Val	Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 150	Val Thr 155	Val	Ser Trp	Asn 160
Ser	Gly Ala	Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170	Phe Pro	Ala	Val Leu 175	Gln
Ser	Ser Gly	Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185	Val Thr	Val	Pro Ser 190	Ser
Ser	Leu Gly 195	Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn 200	Val Asn	His 205	Lys Pro	Ser
Asn	Thr Lys 210	Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 215	Lys Ser 220	Cys	Asp Lys	Thr
His 225	Thr Ser	Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro 230	Val Ala 235	Gly	Pro Ser	Val 240
Phe	Leu Phe	Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250	Leu Met	He	Ser Arg 255	Thr

- 46 040607

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265270

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys

275 280285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser

290 295300

Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315320

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro lie Glu Lys Thr lie

325 330335

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser

340 345350

Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys

355 360365

Arg Ala Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin Trp

370 375380

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Phe Ala Ala

385 390 395400

Ser Asn Vai Glu Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

405 410415

Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn He His Pro Vai Asp Glu Asp Asp Vai

420 425430

Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Tyr Thr Phe Gly

435 440445

Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

450 455460

- 47 040607

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly

465 470 475480

Pro Gly Leu Vai Thr Pro Ser Gin Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Vai

485 490495

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Vai His Trp Vai Arg Gin Ser

500 505510

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai He Trp Ala Gly Gly Gly

515 520525

Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Lys Ser He Ser Lys Asp

530 535540

Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gin Ala Asp

545 550 555560

Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr

565 570575

Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 580 585590 <210> 11 <211> 597 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> FLT3 x CD28; bsFcko-1/2 [N-концевая 3hth-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон BV10) и С-концевая CD28 одноцепочечная (клон 9.3,

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 11

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin 15 1015

Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 2530

Gly Leu His Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045

- 48 040607

Gly Vai He Trp Ser Gly Gly Ser Thr

55

Asp Tyr Asn Ala Ala Phe He 60

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn 65 70

Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe

80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Ala Asp Asp 85

Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Arg Lys Gly Gly He Tyr Tyr Ala Asn

100 105

His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

110

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai

115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 125

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys 145 150

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai

155 160

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165

Thr Ser Gly Vai His Thr Phe

170 175

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu

180 185

Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai 190

Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

195 200

Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai

210 215

Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro 225 230

Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai

235 240

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 245

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

250 255

Met He Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr

Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser

- 49 040607

260

265 270

His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe

275 280

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu

285

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

290 295

Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr

300

Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 305 310

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn

315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai

325

Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro

330 335

He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 340

Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp He 345 350

Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser

355 360

Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg

365

Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser

370 375

Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr 380

Ser Leu Met Gin Trp Tyr Gin Gin

385 390

Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu

395 400

Leu He Phe Ala Ala Ser Asn Vai 405

Glu Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe

410 415

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn

420

Phe Ser Leu Asn He His Pro Vai

425 430

Asp Glu Asp Asp Vai Ala Met Tyr

435 440

Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai 445

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

450 455

Lys Leu Glu He Lys Arg Gly Gly 460

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470

Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Lys

475 480

- 50 040607

Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Thr Pro Ser Gin Ser Leu Ser 485 490495

He Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Vai His

500 505510

Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai He 515 520525

Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Lys

530 535540

Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn

545 550 555560

Ser Leu Gin Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys

565 570575

Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr

580 585590

Vai Thr Vai Ser Ser 595 <210> 12 <211> 589 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> FLT3 x CD16; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон 4G8) и С-концевая CD16 одноцепочечная (клон 3G8;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 12

Gin Vai Gin Leu 1	Gin Gin 5	Pro Gly Ala	Glu Leu 10	Vai	Lys	Pro	Gly 15	Ala
Ser Leu Lys Leu	Ser Cys	Lys Ser Ser	Gly Tyr	Thr	Phe	Thr	Ser	Tyr
20		25				30
Trp Met His Trp	Vai Arg	Gin Arg Pro	Gly His	Gly	Leu	Glu	Trp	He

- 51 040607

4045

Gly Glu He Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gin Lys Phe 50 5560

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Ala lie Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr

100 105110

Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135140

Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn

145 150 155160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin

165 170175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser

180 185190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser

195 200205

Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215220

His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai

225 230 235240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr

245 250255

- 52 040607

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai	Ser His	Glu	Asp 270	Pro	Glu
	260	265
Vai Lys	Phe Asn Trp 275	Tyr Vai Asp Gly Vai 280	Glu Vai	His 285	Asn	Ala	Lys
Thr Lys 290	Pro Arg Glu	Glu Gin Tyr Gin Ser 295	Thr Tyr Arg 300	Vai	Vai	Ser
Vai Leu 305	Thr Vai Leu	His Gin Asp Trp Leu 310	Asn Gly 315	Lys	Glu	Tyr	Lys 320
Cys Lys	Vai Ser Asn 325	Lys Gin Leu Pro Ser 330	Pro lie	Glu	Lys	Thr 335	He
Ser Lys	Ala Lys Gly 340	Gin Pro Ser Gly Asp 345	He Vai	Leu	Thr 350	Gin	Ser
Pro Ala	Ser Leu Ala 355	Vai Ser Leu Gly Gin 360	Arg Ala	Thr 365	He	Ser	Cys
Lys Ala 370	Ser Gin Ser	Vai Asp Phe Asp Gly 375	Asp Ser 380	Phe	Met	Asn	Trp
Tyr Gin 385	Gin Lys Pro	Gly Gin Pro Pro Lys 390	Leu Leu 395	He	Tyr	Thr	Thr 400
Ser Asn	Leu Glu Ser 405	Gly He Pro Ala Arg 410	Phe Ser	Ala	Ser	Gly 415	Ser
Gly Thr	Asp Phe Thr 420	Leu Asn He His Pro 425	Vai Glu	Glu	Glu 430	Asp	Thr
Ala Thr	Tyr Tyr Cys 435	Gin Gin Ser Asn Glu 440	Asp Pro	Tyr 445	Thr	Phe	Gly
Gly Gly 450	Thr Lys Leu	Glu lie Lys Gly Gly 455	Gly Gly 460	Ser	Gly	Gly Gly
Gly Ser	Gly Gly Gly	Gly Ser Gin Vai Thr	Leu Lys	Glu	Ser	Gly Pro

- 53 040607

465 470 475480

Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser

485 490495

Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp lie Arg Gin

500 505510

Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp

515 520525

Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys

530 535540

Asp Thr Ser Ser Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Ala Ser Val Asp Thr

545 550 555560

Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin lie Asn Pro Ala Trp Phe 565 570575

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 580585 <210> 13 <211> 594 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> FLT3 x CD16; bsFcko-1/2 [N-концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь (клон BV10) и С-концевая CD16 одноцепочечная (клон 3G8;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы < 400> 13

Gin 1

Val

Gin

Leu

Lys 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Ser 15

Gin

Ser

Leu

Ser

lie 20

Thr

cys

Thr

Val

Ser 25

Gly

Phe

Ser

Leu

Thr 30

Asn

Tyr

Gly

Leu

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ser 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Leu

Gly

Val

lie

Trp

Ser

Gly Gly

Ser

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ala

Ala

Phe

lie

- 54 040607

55

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys 65 70

Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Ala 85

Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Arg Lys Gly Gly lie Tyr Tyr 100

Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai 115

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 120 125

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala

130 135

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145 150

Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai

155 160

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly

165

Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe

170 175

Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser

180

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai

185 190

Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu

195

Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

210 215

Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

225 230

Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai

235 240

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu

245

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260

Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser

265 270

- 55 040607

His	Glu Asp 275	Pro	Glu	Vai	Lys	Phe Asn Trp Tyr 280	Vai	Asp Gly 285	Vai	Glu
Vai	His Asn 290	Ala	Lys	Thr	Lys 295	Pro Arg Glu Glu	Gin 300	Tyr Gin	Ser	Thr
Tyr 305	Arg Vai	Vai	Ser	Vai 310	Leu	Thr Vai Leu His 315	Gin	Asp Trp	Leu	Asn 320
Gly	Lys Glu	Tyr	Lys 325	Cys	Lys	Vai Ser Asn Lys 330	Gin	Leu Pro	Ser 335	Pro
Ue	Glu Lys	Thr 340	Ue	Ser	Lys	Ala Lys Gly Gin 345	Pro	Ser Gly 350	Asp	Ue
Vai	Leu Thr 355	Gin	Ser	Pro	Ala	Ser Leu Ala Vai 360	Ser	Leu Gly 365	Gin	Arg
Ala	Thr lie 370	Ser	cys	Lys	Ala 375	Ser Gin Ser Vai	Asp 380	Phe Asp	Gly	Asp
Ser 385	Phe Met	Asn	Trp	Tyr 390	Gin	Gin Lys Pro Gly 395	Gin	Pro Pro	Lys	Leu 400
Leu	lie Tyr	Thr	Thr 405	Ser	Asn	Leu Glu Ser Gly 410	Ue	Pro Ala	Arg 415	Phe
Ser	Ala Ser	Gly 420	Ser	Gly	Thr	Asp Phe Thr Leu 425	Asn	lie His 430	Pro	Vai
Glu	Glu Glu 435	Asp	Thr	Ala	Thr	Tyr Tyr Cys Gin 440	Gin	Ser Asn 445	Glu	Asp
Pro	Tyr Thr 450	Phe	Gly	Gly	Gly 455	Thr Lys Leu Glu	Ue 460	Lys Gly	Gly	Gly
Gly 465	Ser Gly	Gly	Gly	Gly 470	Ser	Gly Gly Gly Gly 475	Ser	Gin Vai	Thr	Leu 480
Lys	Glu Ser	Gly	Pro Gly	Ue	Leu Gin Pro Ser	Gin	Thr Leu	Ser	Leu

- 56 040607

485 490495

Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Vai 500 505510

Gly Trp He Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His

515 520525

He Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg

530 535540

Leu Thr He Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Vai Phe Leu Lys lie

545 550 555560

Ala Ser Vai Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin lie

565 570575

Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai

580 585590

Ser Ser <210> 14 <211> 592 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> CD19 x CD3, bsFcko-1/2 [N-концевая анти-С019 химерная тяжелая цепь (клон 4G7) и С-концевая анти-СОЗ одноцепочечная (клон

UCHT1; VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 14

Glu Vai Gin 1

Leu

Gin 5

Gin Ser Gly

Pro Glu 10

Leu

He Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Vai

Lys

Met

Ser

cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Vai

Met

His

Trp

Vai

Lys

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

He

35

40

45

- 57 040607

Gly Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105110

Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai

145 150 155160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala

165 170175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai

180 185190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His

195 200205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys

210 215220

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly

225 230 235240

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie

245 250255

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser His Glu

260 265270

- 58 040607

Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His

275 280285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg

290 295300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu

325 330335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp He Gin Met

340 345350

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr

355 360365

He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr

370 375380

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Tyr Thr Ser

385 390 395400

Arg Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 405 410415

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 420 425430

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin

435 440445

Gly Thr Lys Vai Glu He Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly

465 470 475480

- 59 040607

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 485 490495

Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

500 505510

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu He Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser

515 520525

Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys

530 535540

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

545 550 555560

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp 565 570575

Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585590 <210> 15 <211> 588 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> CD19 x TCR альфа/бета, bsFcko-1/2 [N-концевая анти-С019 химерная тяжелая цепь (клон 4G7) и С-концевая анти-TCR альфа/бета одноцепочечная (клон гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys 3540

Gly Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp

5055

BMA031; VH-VL)]: цепь

Pro Glu Leu He Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 45

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

- 60 040607

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Ser

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Vai

Tyr

Tyr 95 cys

Ala

Arg

Gly

Thr 100

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Ser

105

Arg

Vai

Phe

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Leu

Thr

Vai

Ser

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

125

Gly

Pro

Ser

Vai

Phe

130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Vai 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

155

Glu

Pro

Vai

Thr

Vai 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Vai

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Vai

Leu

Gin

Ser

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

185

Leu

Ser

Ser

Vai

Vai 190

Thr

Vai

Pro

Ser

Ser

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

200

Thr

Tyr

He cys

Asn

205

Vai

Asn

His

Lys

Pro

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Vai 215

Asp

Lys

Lys

Vai

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Ser

230

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

235

Pro

Pro

Vai

Ala

Gly 240

Pro

Ser

Vai

Phe

Leu

245

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

250

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

255

He

Ser

Arg

Thr

Pro

260

Glu

Vai

Thr cys

Vai

265

Vai

Vai

Gly

Vai

Ser

270

His

Glu

- 61 040607

Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp

275 280

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His

285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295

Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg 300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu

305 310

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn

325

Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu

330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 340

Gin Pro Ser Gly Glu Vai Gin Leu 345 350

Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai

355 360

Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met

365

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys

370 375

Phe Thr Ser Tyr Vai Met His Trp 380

Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly

385 390

Leu Glu Trp He Gly Tyr lie Asn

395 400

Pro Tyr Asn Asp Vai Thr Lys Tyr 405

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala

410 415

Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 420

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser 425 430

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

435 440

Vai His Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 445

Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Vai

450 455

Tyr Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr

460

Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

465 470

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

475 480

Gly Ser Gin He Vai Leu Thr Gin

485

Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser

490 495

- 62 040607

Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Vai Ser

500 505510

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp

515 520525

He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser

530 535540

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Ser Met Glu

545 550 555560

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro

565 570575

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 580585 <210> 16 <211> 595 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> CD19 x CD28; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-С019 химерная тяжелая цепь (клон 4G7) и С-концевая CD28 одноцепочечная (клон 9.3;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы < 400> 16

Glu 1

Vai

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

He

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Vai

Lys

Met 20

Ser

cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Vai

Met

His 35

Trp

Vai

Lys

Gin

Lys 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

He

Gly

Tyr 50

He

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

Asp

Gly

Thr

Lys

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Phe

- 63 040607

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105110

Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai

145 150 155160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala

165 170175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai

180 185190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His

195 200205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys

210 215220

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly

225 230 235240

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie

245 250255

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser His Glu

260 265270

Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His

275 280285

- 64 040607

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg

290 295300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu

325 330335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp He Glu Leu

340 345350

Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr

355 360365

He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu

370 375380

Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He

385 390 395400

Phe Ala Ala Ser Asn Vai Glu Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly 405 410415

Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn lie His Pro Vai Asp Glu 420 425430

Asp Asp Vai Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Tyr

435 440445

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Gly Gly Gly Gly

450 455460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Lys Leu Gin

465 470 475480

Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Thr Pro Ser Gin Ser Leu Ser He Thr

485 490495

- 65 040607

Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Vai His Trp Vai

500 505510

Arg Gin Ser Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai He Trp Ala

515 520525

Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Lys Ser lie

530 535540

Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu

545 550 555560

Gin Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Gly Tyr

565 570575

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr

580 585590

Vai Ser Ser

595 <210> 17 <211> 592 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> CD19 x CD16; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-С019 химерная тяжелая цепь (клон 4G7) и С-концевая CD16 одноцепочечная (клон 3G8;

VL-VH)], цепи гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 17

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu lie Lys Pro Gly Ala

1015

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530

Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 4045

Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 5560

- 66 040607

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Ser

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Vai

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

100

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Ser 105

Arg

Vai

Phe

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

115

Thr

Leu

Thr

Vai

Ser

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Vai

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Vai

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

155

Glu

Pro

Vai

Thr

Vai 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Vai

His

Thr

Phe

Pro

175

Ala

Vai

Leu

Gin

Ser

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

185

Leu

Ser

Ser

Vai

Vai 190

Thr

Vai

Pro

Ser

Ser

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

200

Thr

Tyr

He cys

Asn 205

Vai

Asn

His

Lys

Pro

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Vai 215

Asp

Lys

Lys

Vai

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Ser

230

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

235

Pro

Pro

Vai

Ala

Gly 240

Pro

Ser

Vai

Phe

Leu 245

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro 250

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

255

He

Ser

Arg

Thr

Pro 260

Glu

Vai

Thr

Cys

Vai

265

Vai

Vai

Gly

Vai

Ser

270

His

Glu

- 67 040607

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg

290 295300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro lie Glu

325 330335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp lie Val Leu

340 345350

Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr

355 360365 lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe

370 375380

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 385 390 395400

Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Ala 405 410415

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu 420 425430

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Tyr 435 440445

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser

450 455460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu

465 470 475480

Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys 485 490495

- 68 040607

Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Vai Gly Trp

500 505510

He Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His He Trp

515 520525

Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr

530 535540

He Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Vai Phe Leu Lys He Ala Ser

545 550 555560

Vai Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin He Asn Pro

565 570575

Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 580 585590 <210> 18 <211> 592 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> CSPG4 x CD3, bsFcko-1/2 [N-концевая aHTM-CSPG4 химерная тяжелая цепь (клон 9.2.27) и С-концевая анти-СОЗ одноцепочечная (клон UCHT1; VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант полумолекулы <400> 18

Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly

5

Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg 35 40

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 45

Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly

55

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 60

- 69 040607

Lys Gly Lys Ala Thr Leu	Thr Ala	Asp Lys Ser 75	Ser	Ser	Thr	Ala	Tyr 80
65	70
Met Gln	Val Ser Ser Leu 85	Thr Ser	Val Asp Ser 90	Ala	Val	Tyr	Phe 95	Cys
Ala Arg	Gly Asn Thr Val 100	Val Val	Pro Tyr Thr 105	Met	Asp	Tyr 110	Trp	Gly
Gln Gly	Thr Thr Val Thr 115	Val Ser 120	Ser Ala Ser	Thr	Lys 125	Gly	Pro	Ser
Val Phe 130	Pro Leu Ala Pro	Ser Ser 135	Lys Ser Thr	Ser 140	Gly	Gly	Thr	Ala
Ala Leu 145	Gly Cys Leu Val 150	Lys Asp	Tyr Phe Pro 155	Glu	Pro	Val	Thr	Val 160
Ser Trp	Asn Ser Gly Ala 165	Leu Thr	Ser Gly Val 170	His	Thr	Phe	Pro 175	Ala
Val Leu	Gln Ser Ser Gly 180	Leu Tyr	Ser Leu Ser 185	Ser	Val	Val 190	Thr	Val
Pro Ser	Ser Ser Leu Gly 195	Thr Gln 200	Thr Tyr He	Cys	Asn 205	Val	Asn	His
Lys Pro 210	Ser Asn Thr Lys	Val Asp 215	Lys Lys Val	Glu 220	Pro	Lys	Ser	cys
Asp Lys 225	Thr His Thr Ser 230	Pro Pro	Ser Pro Ala 235	Pro	Pro	Val	Ala	Gly 240
Pro Ser	Val Phe Leu Phe 245	Pro Pro	Lys Pro Lys 250	Asp	Thr	Leu	Met 255	He
Ser Arg	Thr Pro Glu Val 260	Thr Cys	Val Val Val 265	Gly	Val	Ser 270	His	Glu
Asp Pro	Glu Val Lys Phe 275	Asn Trp 280	Tyr Val Asp	Gly	Val 285	Glu	Val	His

- 70 040607

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg

290 295300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro Ue Glu

325 330335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp Ue Gin Met

340 345350

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr

355 360365 lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr

370 375380

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser

385 390 395400

Arg Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

405 410415

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala

420 425430

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin

435 440445

Gly Thr Lys Vai Glu Ue Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly

465 470 475480

Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 485 490495

- 71 040607

Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met 500

Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly 505 510

Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Leu

515 520

He Asn Pro Tyr Lys Gly Vai Ser

525

Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp

530 535

Arg Phe Thr He Ser Vai Asp Lys 540

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 545 550

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

555 560

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 565

Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp

570 575

Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 580

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 585 590 <210> 19 <211> 588 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> CSPG4 x TCR альфа/бета, bsFcko-1/2 [N-концевая aHTH-CSPG4 химерная тяжелая цепь (клон 9.2 альфа/бета одноцепочечная (клон гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 19

Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly 1 5

27) и С-концевая анти-TCR BMA031; VH-VL)], цепи

Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Vai Lys He Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg 35 40

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 45

Gly Arg He Tyr Pro Gly Asp Gly

55

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 65 70

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80

- 72 040607

Met Gin Vai Ser Ser Leu Thr Ser Vai Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 9095

Ala Arg Gly Asn Thr Vai Vai Vai Pro Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai

145 150 155160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala

165 170175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai

180 185190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Vai Asn His 195 200205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys

210 215220

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly

225 230 235240

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He

245 250255

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser His Glu

260 265270

Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His 275 280285

- 73 040607

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295

Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg 300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu

305 310

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn

325

Lys Gin Leu Pro Ser Pro lie Glu

330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 340

Gin Pro Ser Gly Glu Vai Gin Leu

345 350

Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai

355 360

Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met

365

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys

370 375

Phe Thr Ser Tyr Vai Met His Trp 380

Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly 385 390

Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn

395 400

Pro Tyr Asn Asp Vai Thr Lys Tyr 405

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala

410 415

Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 420

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser 425 430

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

435 440

Vai His Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 445

Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Vai

450 455

Tyr Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 460

Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

465 470

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

475 480

Gly Ser Gin He Vai Leu Thr Gin

485

Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser

490 495

Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr 500

Cys Ser Ala Thr Ser Ser Vai Ser 505 510

- 74 040607

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp 515 520525 lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser

530 535540

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu

545 550 555560

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro 565 570575

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 580585 <210> 20 <211> 595 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> CSPG4 x CD28; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-СБРС4 химерная тяжелая цепь (клон 9.2.27) и С-концевая CD28 одноцепочечная (клон 9.3; VL-VH)], цепь гликан-ко-вариантполумолекулы <400> 20

Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 1015

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser 20 2530

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 4045

Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

- 75 040607

Met	Gin Vai Ser Ser 85	Leu	Thr	Ser	Vai Asp Ser Ala 90	Vai	Tyr	Phe 95	cys
Ala	Arg Gly Asn Thr 100	Vai	Vai	Vai	Pro Tyr Thr Met 105	Asp	Tyr 110	Trp	Gly
Gin	Gly Thr Thr Vai 115	Thr	Vai	Ser 120	Ser Ala Ser Thr	Lys 125	Gly	Pro	Ser
Vai	Phe Pro Leu Ala 130	Pro	Ser 135	Ser	Lys Ser Thr Ser 140	Gly	Gly	Thr	Ala
Ala 145	Leu Gly Cys Leu	Vai 150	Lys	Asp	Tyr Phe Pro Glu 155	Pro	Vai	Thr	Vai 160
Ser	Trp Asn Ser Gly 165	Ala	Leu	Thr	Ser Gly Vai His 170	Thr	Phe	Pro 175	Ala
Vai	Leu Gin Ser Ser 180	Gly	Leu	Tyr	Ser Leu Ser Ser 185	Vai	Vai 190	Thr	Vai
Pro	Ser Ser Ser Leu 195	Gly	Thr	Gin 200	Thr Tyr He Cys	Asn 205	Vai	Asn	His
Lys	Pro Ser Asn Thr 210	Lys	Vai 215	Asp	Lys Lys Vai Glu 220	Pro	Lys	Ser	cys
Asp 225	Lys Thr His Thr	Ser 230	Pro	Pro	Ser Pro Ala Pro 235	Pro	Vai	Ala	Gly 240
Pro	Ser Vai Phe Leu 245	Phe	Pro	Pro	Lys Pro Lys Asp 250	Thr	Leu	Met 255	He
Ser	Arg Thr Pro Glu 260	Vai	Thr	cys	Vai Vai Vai Gly 265	Vai	Ser 270	His	Glu
Asp	Pro Glu Vai Lys 275	Phe	Asn	Trp 280	Tyr Vai Asp Gly	Vai 285	Glu	Vai	His
Asn	Ala Lys Thr Lys	Pro	Arg	Glu	Glu Gin Tyr Gin	Ser	Thr	Tyr	Arg

- 76 040607

290 295300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro Ile Glu

325 330335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp lie Glu Leu 340 345350

Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr

355 360365 lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu

370 375380

Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie

385 390 395400

Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 405 410415

Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn lie His Pro Val Asp Glu 420 425430

Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Val Pro Tyr

435 440445

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Gly Gly Gly Gly

450 455460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val Lys Leu Gin

465 470 475480

Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr 485 490495

Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Val His Trp Val 500 505510

- 77 040607

Arg Gin Ser Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai lie Trp Ala

515 520525

Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Lys Ser lie

530 535540

Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu

545 550 555560

Gin Ala Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Gly Tyr

565 570575

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr

580 585590

Vai Ser Ser

595 <210> 21 <211> 592 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> CSPG4 x CD16; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-С5Р64 химерная тяжелая цепь (клон 9.2.27) и С-концевая CD16 одноцепочечная (клон 3G8; VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 21

Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 1015

Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser 20 2530

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ue 35 4045

Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

- 78 040607

Met

Gin

Vai

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Vai

Asp 90

Ser

Ala

Vai

Tyr

Phe 95

Cys

Ala

Arg

Gly

Asn 100

Thr

Vai

Vai

Vai

Pro

105

Tyr

Thr

Met

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Vai

Thr

Vai

Ser

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Vai

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

140

Gly Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Vai

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

155

Glu

Pro

Vai

Thr

Vai 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Vai

His

Thr

Phe

Pro

175

Ala

Vai

Leu

Gin

Ser

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

185

Leu

Ser

Ser

Vai

Vai 190

Thr

Vai

Pro

Ser

Ser

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

He

Cys

Asn 205

Vai

Asn

His

Lys

Pro 210

Ser

Asn

Thr

Lys

Vai 215

Asp

Lys

Lys

Vai

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

225

Lys

Thr

His

Thr

Ser

230

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

235

Pro

Pro

Vai

Ala

Gly 240

Pro

Ser

Vai

Phe

Leu 245

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro 250

Lys

Asp

Thr

Leu

Met 255

He

Ser

Arg

Thr

Pro

260

Glu

Vai

Thr

Cys

Vai

265

Vai

Vai

Gly

Vai

Ser

270

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

Vai

Lys

Phe

Asn

Trp 280

Tyr

Vai

Asp

Gly

Vai 285

Glu

Vai

His

- 79 040607

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295

Glu Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg 300

Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu

305 310

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys

315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 325

Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu

330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly

340

Gin Pro Ser Gly Asp He Vai Leu 345 350

Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala

355 360

Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr

365

He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser

370 375

Vai Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe 380

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro

385 390

Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie

395 400

Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser 405

Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Ala

410 415

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 420

Leu Asn lie His Pro Vai Glu Glu

425 430

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

435 440

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Tyr 445

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

450 455

Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 465 470

Gly Ser Gin Vai Thr Leu Lys Glu

475 480

Ser Gly Pro Gly He Leu Gin Pro

485

Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys

490 495

Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg

Thr Ser Gly Met Gly Vai Gly Trp

- 80 040607

500 505510

He Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His He Trp

515 520525

Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr

530 535540

He Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Vai Phe Leu Lys He Ala Ser

545 550 555560

Vai Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin He Asn Pro

565 570575

Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

580 585590 <210> 22 <211> 590 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> EGFR x CD3; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-EGFR химерная тяжелая цепь (клон С225) и С-концевая CD3 одноцепочечная (клон UCHT1;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы < 400> 22

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin 15 1015

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 2530

Gly Vai His Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045

Gly Vai lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

5560

Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 65 70 7580

- 81 040607

Lys

Met

Asn

Ser

Leu 85

Gln

Ser

Asn

Asp

Thr 90

Ala

He

Tyr

Tyr

Cys 95

Ala

Arg

Ala

Leu

Thr

100

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Glu

105

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly 110

Gln

Gly

Thr

Leu

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

Ala 120

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

125

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

130

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys 135

Ser

Thr

Ser

Gly Gly

140

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 145

Cys

Leu

Val

Lys

Asp 150

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

155

Val

Thr

Val

Ser

Trp 160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu 165

Thr

Ser

Gly

Val

His

170

Thr

Phe

Pro

Ala

Val 175

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly 180

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

185

Ser

Val

Val

Thr

Val 190

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu 195

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr 200

He cys

Asn

Val

Asn 205

His

Lys

Pro

Ser

Asn 210

Thr

Lys

Val

Asp

Lys 215

Lys

Val

Glu

Pro

Lys 220

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

225

His

Thr

Ser

Pro

Pro

230

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

235

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

240

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

245

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

250

Thr

Leu

Met

He

Ser

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 260

Thr

Cys

Val

Val

Val

265

Gly

Val

Ser

His

Glu 270

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 275

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 280

Asp

Gly

Val

Glu

Val 285

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Gln

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

- 82 040607

290 295300

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315320

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu Lys Thr

325 330335

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp He Gin Met Thr Gin

340 345350

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr

355 360365

Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin

370 375380

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu

385 390 395400

Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 405 410415

Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 420 425430

Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr

435 440445

Lys Vai Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455460

Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai

465 470 475480

Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser 485 490495

Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly

500 505510

- 83 040607

Leu Glu	Trp 515	Vai	Ala Leu	lie Asn 520	Pro Tyr Lys	Gly	Vai Ser Thr Tyr 525
Asn Gin	Lys	Phe	Lys Asp	Arg Phe	Thr He Ser	Vai	Asp Lys Ser Lys
530				535		540
Asn Thr	Ala	Tyr	Leu Gin	Met Asn	Ser Leu Arg	Ala	Glu Asp Thr Ala
545			550		555		560
Vai Tyr	Tyr	Cys	Ala Arg	Ser Gly	Tyr Tyr Gly	Asp	Ser Asp Trp Tyr
			565		570		575
Phe Asp	Vai	Trp	Gly Gin	Gly Thr	Leu Vai Thr	Vai	Ser Ser
		580			585		590

<210> 23 <211> 586 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> EGFR x TCR альфа/бета; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-EGFR химерная тяжелая цепь (клон С225) и С-концевая TCR альфа/бета одноцепочечная (клон ВМА031; VH-VL)], цепь гликан-ковариант-полумолекулы <400> 23

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin 15 1015

Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 2530

Gly Vai His Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045

Gly Vai lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 5560

Ser Arg Leu Ser He Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 65 70 7580

- 84 040607

Lys

Met

Asn

Ser

Leu 85

Gin

Ser

Asn

Asp

Thr 90

Ala

He

Tyr

Tyr cys 95

Ala

Arg

Ala

Leu

Thr

100

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Glu 105

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr

Leu

Vai 115

Thr

Vai

Ser

Ser

Ala 120

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

125

Ser

Vai

Phe

Pro

Leu

130

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys 135

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly 140

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly 145

Cys

Leu

Vai

Lys

Asp 150

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

155

Vai

Thr

Vai

Ser

Trp 160

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

165

Thr

Ser

Gly

Vai

His 170

Thr

Phe

Pro

Ala

Vai 175

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly 180

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

185

Ser

Vai

Vai

Thr

Vai 190

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

195

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr 200

He

Cys

Asn

Vai

Asn

205

His

Lys

Pro

Ser

Asn 210

Thr

Lys

Vai

Asp

Lys 215

Lys

Vai

Glu

Pro

Lys 220

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr 225

His

Thr

Ser

Pro

Pro 230

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

235

Vai

Ala

Gly

Pro

Ser

240

Vai

Phe

Leu

Phe

Pro

245

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 250

Thr

Leu

Met

He

Ser

255

Arg

Thr

Pro

Glu

Vai 260

Thr

Cys

Vai

Vai

Vai 265

Gly

Vai

Ser

His

Glu

270

Asp

Pro

Glu

Vai

Lys 275

Phe

Asn

Trp

Tyr

Vai 280

Asp

Gly

Vai

Glu

Vai

285

His

Asn

Ala

- 85 040607

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

290 295

Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Val Val 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

305 310

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gin

325

Leu Pro Ser Pro lie Glu Lys Thr

330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340

Ser Gly Glu Val Gin Leu Gin Gin 345 350

Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

355 360

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys 365

Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr

370 375

Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys 380

Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu 385 390

Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr

395 400

Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu 405

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

410 415

Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr

420

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 425 430

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His

435 440

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr 445

Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Gly

450 455

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

475 480

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 485

Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly

490 495

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser

500

Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 505 510

- 86 040607

His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr

515 520525

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

530 535540

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu

545 550 555560

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 565 570575

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

580585 <210> 24 <211> 593 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> EGFR x CD28; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-EGFR химерная тяжелая цепь (клон С225) и С-концевая CD28 одноцепочечная (клон 9.3;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы < 400> 24

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin

1015

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 2530

Gly Vai His Trp Vai Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 4045

Gly Vai lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

5560

Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 65 70 7580

- 87 040607

Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn 85

Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr 100

Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala

115 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 . 135

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 140

Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe 145 150

Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp

155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165

Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu

170 175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180

Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser

185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr

195 200 lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 205

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys

210 215

Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 220

Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro

225 230

Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser

235 240

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245

Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg

250 255

Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai

260

Vai Gly Vai Ser His Glu Asp Pro

265 270

Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai

275 280

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

290 295

Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Vai Vai 300

- 88 040607

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315320

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin Leu Pro Ser Pro He Glu Lys Thr

325 330335

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Ser Gly Asp He Glu Leu Thr Gin

340 345350

Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser

355 360365

Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin

370 375380

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Phe Ala

385 390 395400

Ala Ser Asn Vai Glu Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

405 410415

Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn lie His Pro Vai Asp Glu Asp Asp 420 425430

Vai Ala Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Tyr Thr Phe

435 440445

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455460

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser

465 470 475480

Gly Pro Gly Leu Vai Thr Pro Ser Gin Ser Leu Ser He Thr Cys Thr

485 490495

Vai Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Vai His Trp Vai Arg Gin

500 505510

- 89 040607

Ser Pro	Gly 515	Gin	Gly Leu	Glu Trp Leu Gly Vai He Trp Ala Gly Gly
520	525
Gly Thr 530	Asn	Tyr	Asn Ser	Ala Leu Met Ser Arg 535	Lys Ser He Ser Lys 540
Asp Asn 545	Ser	Lys	Ser Gin 550	Vai Phe Leu Lys Met 555	Asn Ser Leu Gin Ala 560
Asp Asp	Thr	Ala	Vai Tyr 565	Tyr Cys Ala Arg Asp 570	Lys Gly Tyr Ser Tyr 575
Tyr Tyr	Ser	Met 580	Asp Tyr	Trp Gly Gin Gly Thr 585	Thr Vai Thr Vai Ser 590

Ser <210> 25 <211> 590 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> EGFR x CD16; bsFcko-1/2 [N-концевая анти-EGFR химерная тяжелая цепь (клон С225) и С-концевая CD16 одноцепочечная (клон 3G8;

VL-VH)], цепь гликан-ко-вариант-полумолекулы <400> 25

Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser Gly 1 5

Pro Gly Leu Vai Gin Pro Ser Gin

15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai 20

Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30

Gly Vai His Trp Vai Arg Gin Ser

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45

Gly Vai He Trp Ser Gly Gly Asn

55

Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 60

Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp 65 70

Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Phe 75 80

- 90 040607

Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala Ue Tyr Tyr Cys Ala 85 9095

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe

115 120125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135140

Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp

145 150 155160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu 165 170175

Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser

180 185190

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro

195 200205

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215220

Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser

225 230 235240

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg

245 250255

Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Gly Vai Ser His Glu Asp Pro

260 265270

Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala

275 280285

- 91 040607

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

290 295

Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg Vai Vai 300

Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin

305 310

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

315 320

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gin

325

Leu Pro Ser Pro lie Glu Lys Thr

330 335

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro

340

Ser Gly Asp He Vai Leu Thr Gin

345 350

Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser

355 360

Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser

365

Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp

370 375

Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn 380

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 385 390

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr

395 400

Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly He 405

Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Gly

410 415

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn 420 lie His Pro Vai Glu Glu Glu Asp 425 430

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin

435 440

Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe 445

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He

450 455

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 460

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

465 470

Gin Vai Thr Leu Lys Glu Ser Gly

475 480

Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin 485

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe

490 495

Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

500

Gly Met Gly Vai Gly Trp He Arg 505 510

- 92 040607

Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp

515 520525

Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser

530 535540

Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Ala Ser Val Asp

545 550 555560

Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin lie Asn Pro Ala Trp

565 570575

Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585590 <210> 26 <211> 693 < 212> БЕЛОК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> последовательность тяжелой цепи/главной цепи, FLT3 х CD3; bsFcko-1 [N концевая aHTH-FLT3 химерная тяжелая цепь и С-концевая СОЗ одноцепочечная (клон UCHT1; VL-VH)]: цепь ко-вариант(полной) молекулы, которая включает СНЗ-домен, не гликомутант < 400> 26

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Pro

Gly

Ala

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Leu

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Lys

Ser

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Arg 40

Pro

Gly

His

Gly

Leu 45

Glu

Trp

lie

Gly

Glu 50

lie

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Lys

Asp

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Asp

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Arg

Ser 75

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr 80

Met

His

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Asp

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ala

lie

Thr

Thr

Thr

Pro

Phe

- 93 040607

100 105

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin 110

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr 115

Vai

Ser

Ser

Ala

Ser 120

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser 125

Vai

Phe

Pro

Leu

Ala 130

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser 135

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr 140

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys 145

Leu

Vai

Lys

Asp

Tyr 150

Phe

Pro

Glu

Pro

Vai 155

Thr

Vai

Ser

Trp

Asn 160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr 165

Ser

Gly

Vai

His

Thr 170

Phe

Pro

Ala

Vai

Leu 175

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu 180

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser 185

Vai

Vai

Thr

Vai

Pro 190

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly 195

Thr

Gin

Thr

Tyr

lie 200

cys

Asn

Vai

Asn

His 205

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr 210

Lys

Vai

Asp

Lys

Lys 215

Vai

Glu

Pro

Lys

Ser 220

Cys

Asp

Lys

Thr

His 225

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys 230

Pro

Ala

Pro

Pro

Vai 235

Ala

Gly

Pro

Ser

Vai 240

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 245

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 250

Leu

Met

lie

Ser

Arg 255

Thr

Pro

Glu

Vai

Thr 260

cys

Vai

Vai

Vai

Gly 265

Vai

Ser

His

Glu

Asp 270

Pro

Glu

Vai

Lys

Phe 275

Asn

Trp

Tyr

Vai

Asp Gly 280

Vai

Glu

Vai

His 285

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 290

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 295

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 300

Arg

Vai

Vai

Ser

Vai 305

Leu

Thr

Vai

Leu

His 310

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 315

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 320

cys

Lys

Vai

Ser

Asn 325

Lys

Gin

Leu

Pro

Ser 330

Pro

lie

Glu

Lys

Thr 335

lie

Ser

Lys

Ala

Lys 340

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 345

Pro

Gin

Vai

Tyr

Thr 350

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg Asp 355

Glu

Leu

Thr

Lys 360

Asn

Gin

Vai

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Vai

Lys Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

- 94 040607

365 370 375

Asp

He

Ala

Vai

Glu 380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 385

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 390

Туг

Lys

Thr

Thr

Pro 395

Pro

Vai

Leu

Asp

Ser 400

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 405

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 410

Thr

Vai

Asp

Lys

Ser 415

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly 420

Asn

Vai

Phe

Ser

Cys 425

Ser

Vai

Met

His

Glu 430

Ala

Leu

His

Asn

His 435

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser 440

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 445

Gly

Lys

Ser

Gly

Asp 450

He

Gin

Met

Thr

Gin 455

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu 460

Ser

Ala

Ser

Vai

Gly 465

Asp

Arg

Vai

Thr

He 470

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser 475

Gin

Asp

He

Arg

Asn 480

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr 485

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 490

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu 495

Leu

He

Tyr

Tyr

Thr 500

Ser

Arg

Leu

Glu

Ser 505

Gly

Vai

Pro

Ser

Arg 510

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 515

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr 520

Thr

Leu

Thr

He

Ser 525

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu 530

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr 535

Tyr

Cys

Gin

Gin

Gly 540

Asn

Thr

Leu

Pro

Trp 545

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 550

Thr

Lys

Vai

Glu

He 555

Lys

Gly

Gly

Gly

Gly 560

Ser

Gly Gly Gly Gly 565

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly 570

Ser

Glu

Vai

Gin

Leu 575

Vai

Glu

Ser

Gly

Gly 580

Gly

Leu

Vai

Gin

Pro 585

Gly Gly

Ser

Leu

Arg 590

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala 595

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe 600

Thr

Gly

Tyr

Thr

Met 605

Asn

Trp

Vai

Arg

Gin 610

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 615

Leu

Glu

Trp

Vai

Ala 620

Leu

He

Asn

Pro

Tyr 625

Lys

Gly

Vai

Ser

Thr 630

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Asp Arg

Phe

Thr

He

Ser

Vai

Asp

Lys

- 95 040607

635 640645

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

650 655660

Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp

665 670675

Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr

680 685690

Vai Ser Ser <210> 27 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для VDJ-сегмента тц <400> 27 ctcttcacag gtgtcctctc tgaggtccag ctgcagcagt ctggacctg 49 <210> 28 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для УОЗ-сегмента тц <400> 28 gggagaaggt aggactcacc tgaggagact gtgagagtgg tgccttggcc ccagtagtc 59 <210> 29 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для УОЗ-сегмента тц <400> 29 tcttcacagg tgtcctctcc caggtgaagc tgcagcaatc tggacctgag c 51 <210> 30 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 96 040607 <220>

<223> олигонуклеотид для VDD-сегмента тц <400> 30 aatgggagaa ggtaggactc acctgaggag acggtgaccg tggtcccttg g < 210> 31 < 211> 53 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VD3-сегмента тц < 400> 31 tctcttcaca ggtgtcctct ctcaggtcca actgcagcag cctggggctg age 53 < 210> 32 < 211> 52 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VD3-сегмента тц < 400> 32 gagaaggtag gactcacctg aggagaetgt gagagtggtg ccttggcccc ag 52 < 210> 33 < 211> 60 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VD3-сегмента тц < 400> 33 agacgtccac tctgtctttc tcttcacagg tgtcctctcc caggtgcagc tgaagcagtc 60 < 210> 34 < 211> 49 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VDJ-сегмента тц < 400> 34

- 97 040607 gagaaggtag gactcacctg aggagacggt gactgaggtt ccttgaccc < 210> 35 < 211> 40 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> олигонуклеотид для VD3-сегмента тц < 400> 35 agacgtccac tctgtctttc tcttcacagg tgtcctctcc 40 < 210> 36 < 211> 40 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VD3-cerMeHTa тц < 400> 36 agacgtccac tctgtctttc tcttcacagg tgtcctctcc 40 < 210> 37 < 211> 43 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VD-сегмента лц < 400> 37 actcgaggag atattgtgat gactcaggct gcaccctcta tac 43 < 210> 38 < 211> 48 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для V3-сегмента лц < 400> 38 aactagtact tacgtttcag ctccagcttg gtcccagcac cgaacgtg 48 <210> 39 <211> 42 <212> ДНК

- 98 040607 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для VJ-сегмента лц <400> 39 tctcgaggag acatcgagct cactcagtct ccagcttctt tg < 210> 40 < 211> 46 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> олигонуклеотид для VD-сегмента лц < 400> 40 aactagtact tacgtttgat ctccagcttg gtgccccctc caaagg 46 < 210> 41 < 211> 42 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VJ-сегмента лц < 400> 41 actcgaggag atattgtgct aactcagtct ccagccaccc tg 42 < 210> 42 < 211> 41 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> олигонуклеотид для VJ-сегмента лц < 400> 42 tactagtact tacgttttat ttccagcttg gtcccccctc c 41 < 210> 43 < 211> 40 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> олигонуклеотид для VJ-сегмента лц < 400> 43

- 99 040607 actcgaggag acattgtgat gacacagtct ccatcctccc 40 <210> 44 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для VJ-сегмента лц <400> 44 actagtactt acgtttcagc tccagcttgg tcccagcacc gaacgtg 47 <210> 45 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для scFv-сегмента <400> 45 atccggagat atccagatga cccagtcccc gagctccctg 40 <210> 46 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для scFv-сегмента <400> 46 tactagttat cacgaggaga cggtgaccag ggttccttga cccca 45 <210> 47 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> олигонуклеотид для scFv-сегмента <400> 47 atccggagaa gtgcagctgc agcagtccgg ccctgagct 39 <210> 48 <211> 45 <212> ДНК

- 100 -

Claims (3)

1. < 213> Искусственная последовательность <220>

   < 223> олигонуклеотид для scFv-сегмента < 400> 48 tactagttat cacttcagtt ccagcttggt gccagcgccg aaggt 45 < 210> 49 < 211> 41 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

   < 223> олигонуклеотид для scFv-сегмента < 400> 49 atccggagac attgtgctga cccagtcccc tgcctccctg g 41 < 210> 50 < 211> 45 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

   < 223> олигонуклеотид для scFv-сегмента < 400> 50 tactagttat caagagctca cagtcactgt ggtgccctgg cccca 45

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантная молекула биспецифического антитела, характеризующаяся тем, что включает Fab-фрагмент, содержащий первый сайт связывания первого антигена, одноцепочечный Fv-фрагмент, содержащий второй сайт связывания для второго антигена, и С_Н2-домен иммуноглобулина IgG1, при этом Fab-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент связаны через С_Н2-домен, причем по меньшей мере три аминокислотных остатка С_Н2-домена, обладающие способностью обеспечивать связывание с Fc-рецепторами, удалены или мутированы путем замены на другую аминокислоту, тем самым ослабляя связывание С_Н2-домена к Fc-рецепторам, причем по меньшей мере три аминокислотных остатка С_Н2-домена состоят из положения последовательности 233 и по меньшей мере двух аминокислот, выбранных из группы, состоящей из положения последовательности 228, 230, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 и 330 (нумерация положений последовательностей в соответствии с номенклатурой ЕС), где, кроме того, аминокислотные остатки в положениях 226 и 229 удалены или мутированы посредством замены на другую аминокислоту, где либо первый сайт связывания, либо второй сайт связывания связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью, и где первый сайт связывания или второй сайт связывания связывается с молекулой специфического рецептора Т-клетки или NK-клетки.
2. 2. Молекула антитела по п.1, характеризующаяся тем, что ассоциированный с опухолью антиген выбран из группы, включающей CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CDw52, Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (протеин-рецепторной тирозинкиназы, продукт гена KIT) (CD117), CSF1R (CD115), CD133, PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b), хондроитинсульфат протеогликана 4 (CSPG4, меланома-ассоциированный хондроитинсульфат протеогликана), Muc-1, EGFR, de2-7-EGFR, EGFRvIII, фолатсвязывающий белок, Her2/neu, Her3, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, HLA-DR, IGFR, CD133, IL3R, белок, активирующий фибробласты (FAP), карбоангидраза IX (MN/CA IX), карциноэмбриональный антиген (СЕА), ЕрСАМ, CDCP1, Derlin1, тенасцин, Frizzled 1-10, сосудистые антигены VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), эндоглин, CLEC14, Tem1-8 и Tie2; и/или либо первый сайт связывания, либо второй сайт связывания связывает молекулу специфического рецептора Т-клеток или NK-клеток, которая является одной из нижеуказанных: CD3, TCR (рецептор Т-клеток), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 и CD95, при этом TCR представляет собой TCR (альфа/бета) или TCR (гамма/дельта).
3. 3. Молекула антитела по п.1 или 2, в которой Fab-фрагмент связан с С_Н2-доменом через C_H1- и V_H-домены тяжелой цепи Fab-фрагмента или через C_L- и VL-домены легкой цепи Fab-фрагмента,

   - 101 -