EA045653B1

EA045653B1 - Новые биспецифические полипептидные комплексы

Info

Publication number: EA045653B1
Application number: EA202090812
Authority: EA
Inventors: Цзяньцин Сюй; Чжочжи ВАН; Цзин Ли
Original assignee: Уси Байолоджикс Аэлэнд Лимитед
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2023-12-13

Description

Область изобретения

В целом, настоящее изобретение относится к растворимым полипептидным комплексам, содержащим вариабельные области антитела, слитые с константными областями TCR, и содержащим их биспецифическим полипептидным комплексам.

Уровень техники

Биспецифические антитела становятся новой категорией терапевтических антител. Они могут связываться с двумя разными мишенями или двумя разными эпитопами на мишени, приводя к аддитивному или синергическому эффекту, превосходящему эффект отдельных антител. Предпринято множество попыток конструирования антител для дизайна новых биспецифических форматов, таких как DVD-Ig, CrossMab, BiTE и т.д. (Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp. 95-106 (2015)). Однако, эти форматы теоретически имеют различные ограничения, касающиеся стабильности, растворимости, небольшого времени полужизни и иммуногенности.

Среди этих форматов биспецифических антител, распространенным форматом является IgGподобное биспецифическое антитело: одно плечо связывается с мишенью А, а другое плечо связывается с мишенью В. Структурно оно получено из половины антитела А и половины антитела В и имеет размер и форму, схожие с природным IgG. Для облегчения последующей разработки желательно, чтобы такие биспецифические молекулы можно было легко получать, подобно нормальному IgG, из одной клеткихозяина с высоким уровнем экспрессии и в правильно собранной форме. К сожалению, спаривание когнатных легких и тяжелых цепей, а также сборку двух разных половин антитела невозможно контролировать автоматически. Все типы неправильного спаривания в случайном порядке могут приводить к значительной гетерогенности продукта.

Предпочтительной гетеродимерной сборки двух разных тяжелых цепей достигают посредством встраивания мутаций в Fc-область, таких как выступы-во-впадины (Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp. 617-21(1996); Merchant et al., Nature Biotechnology, 16(7), pp. 677-681(1998)), электростатическими способами (Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285(25), pp. 19637-19646 (2010)) или дизайна отрицательного состояния (Kreudenstein et al., mAbs, 5(5), pp. 646-654 (2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp. 641-651 (2016)). Однако, селективное спаривание легких и тяжелых цепей каждого отдельного антитела остается затруднительным. Область контакта между легкими и тяжелыми цепями включает вариабельный домен (VH-VL) и константный домен (CH1-CL). Для дизайна ортогональных областей контакта для облегчения когнатного спаривания используют несколько стратегий. Roche поменяли местами домены СН1 и CL и создали платформу CrossMab (Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), pp. 11187-11192 (2011)), Medlmmune включали альтернативную дисульфидную связь (Mazor et al., mAbs, 7(2), pp. 377-389 (2015)), Amgen дополнительно улучшали электростатику области CH1-CL (Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290(12), pp.7535-7562 (2015)), и Lilly (Lewis et al., Nature Biotechnology, 32(2), pp. 191-198 (2014)) и Genentech (Dillon et al., mAbs, 9(2), pp. 213-230 (2017)) включали мутации в вариабельные и константные домены.

Таким образом, в этой области существует потребность в дизайне биспецифических молекул с желаемым уровнем экспрессии и аффинностью к антигенам.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидному комплексу, содержащему первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Т-клеточного рецептора (TCR), и второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому полипептидному комплексу, содержащему первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, связанный со вторым антигенсвязывающим функциональным фрагментом, где первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Тклеточного рецептора (TCR), и второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и пер- 1 045653 вое антитело имеет первую антигенную специфичность, второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент имеет вторую антигенную специфичность, отличающуюся от первой антигенной специфичности, и первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент менее склонны к неправильному спариванию, чем если бы первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты являлись соответствующими частями природного Fab.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому полипептидному комплексу, содержащему первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, содержащий полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании и имеющий первую антигенную специфичность, связанный со вторым антигенсвязывающим функциональным фрагментом, имеющим вторую антигенную специфичность, отличающуюся от первой антигенной специфичности, и первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент менее склонны к неправильному спариванию, чем если бы первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты являлись соответствующими частями природного Fab.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому фрагменту биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, конъюгированный с функциональным фрагментом.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному вектору, содержащему полинуклеотид, представленный в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащему выделенный полинуклеотид, представленный в настоящем описании, или выделенный вектор, представленный в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу экспрессии полипептидного комплекса, представленный в настоящем описании, или биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина, представленной в настоящем описании, в условиях, в которых экспрессируется полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему а) встраивание в клетку-хозяина первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первым константным доменом (С1) TCR, и второго полинуклеотида, кодирующего второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со вторым константным доменом (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком содержащимся в С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер С1 и С2, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность; b) экспрессию полипептидного комплекса клеткой-хозяином.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему а) встраивание в клетку-хозяина первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к Сконцу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (C1) TCR, второй полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, третий полинуклеотид, кодирующий третий полипептид, содержащий VH второго антитела, и четвертый полинуклеотид, кодирующий четвертый полипептид, содержащий VL второго антитела, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность, и второе антитело имеет вторую антигенную специфичность; b) экспрессию биспецифического полипептидного комплекса клеткой-хозяином.

В некоторых вариантах осуществления способ получения биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, дополнительно включает выделение полипептидного комплекса.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержа- 2 045653 щей полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения состояния у нуждающегося в этом индивидуума, включающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, или биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления состояние можно облегчать, устранять, лечить или подвергать профилактике в случае модуляции первого антигена и второго антигена.

В некоторых вариантах осуществления ненативная межцепочечная связь образуется между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из первого и второго мутантных остатков является остатком цистеина.

В некоторых вариантах осуществления ненативная межцепочечная связь является дисульфидной связью.

В некоторых вариантах осуществления первый мутантный остаток содержится в области контакта С1, и/или второй мутантный остаток содержится в области контакта С2.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный остаток цистеина отсутствует или присутствует в С1 и/или С2. В некоторых вариантах осуществления нативный остаток цистеина в положении С74 сконструированного С-бета отсутствует или присутствует. В некоторых вариантах осуществления нативный С74 отсутствует в С-бета.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный участок Nгликозилирования отсутствует или присутствует в С1 и/или С2. В некоторых вариантах осуществления нативные участки N-гликозилирования отсутствуют в С1 и/или С2.

В некоторых вариантах осуществления димер содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более ненативных межцепочечных связей. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из ненативных межцепочечных связей является дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления димер содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более дисульфидных связей.

В некоторых вариантах осуществления а) С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-альфа; b) C1 содержит сконструированную С-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета; с) С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-преальфа; d) C1 содержит сконструированную С-пре-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета; е) С1 содержит сконструированную С-гамма, и С2 содержит сконструированную С-дельта; или f) С1 содержит сконструированную С-дельта, и С2 содержит сконструированную С-гамма.

В некоторых вариантах осуществления первый VH функционально связан с С1 в первом соединительном домене, и первый VL функционально связан с С2 во втором соединительном домене. В некоторых вариантах осуществления первый VH связан с С1 в первом соединительном домене через линкер, первый VL связан с С2 во втором соединительном домене через линкер.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй соединительный домен содержит фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) Сконцевого фрагмента соединительной области V/C антитела и фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) N-концевого фрагмента соединительной области V/C TCR.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 6-29, 37-67 и 86-95.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S56C, S16C, F13C, V12C, Е14С, L62C, D58C, S76C и R78C, и/или сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из Т49С, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, Т46С, L51C и S62C.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета и сконструированная С-альфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и Y11C в С-альфа, F13C в С-бета и L13C в С-альфа, S16C в С-бета и L13C в С-альфа, V12C в С-бета и S16C в С-альфа, Е14С в С-бета и S16C в С-альфа, F13C в С-бета и V23C в С-альфа, L62C в С-бета и Y44C в С-альфа, D58C в С-бета и Т46С в С-альфа, S76C в Сбета и Т46С в С-альфа, S56C в С-бета и Т49С в С-альфа, S56C в С-бета и L51C в С-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-альфа и R78C в С-бета и S62C в С-альфа, и где пара остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует или присутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-альфа.

В некоторых вариантах осуществления нативный участок гликозилирования в сконструированной

- 3 045653

С-бета представляет собой N69, и/или нативные участки гликозилирования в сконструированной Сальфа выбраны из N34, N68, N79 и любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета сохраняет или не сохраняет петлю FG, включающую аминокислотные остатки 101-117 нативной С-бета, и/или петлю DE, включающую аминокислотные остатки 66-71 нативной С-бета.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 43-48, и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 33-41 и 306.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-альфа; и где первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50, и/или второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 51 или 52.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета; и где первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 129 или 130, и/или второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 7-19, 26-34, 56-75 и 103-106.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S16C, А18С, Е19С, F13C, А11С, S56C и S76C, и/или сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S11C, А13С, I16C, S62C, Т65С и Y59C.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета и сконструированная С-преальфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и S11C в С-пре-альфа, А18С в С-бета и S11C в С-преальфа, Е19С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, F13C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, S16C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, А11С в С-бета и I16C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и Т65С в С-пре-альфа и S76C в С-бет, и Y59C в С-пре-альфа, и где пара мутантных остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-пре-альфа.

В некоторых вариантах осуществления отсутствующий или присутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-бета представляет собой N69, и/или отсутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-пре-альфа представляет собой N50.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета сохраняет или не сохраняет петлю FG, включающую аминокислотные остатки 101-107 нативной С-бета, и/или петлю DE в положении, включающем аминокислотные остатки 66-71 нативной С-бета.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-пре-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 82, 83 и 311-318; и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 84, 33-41 и 319324.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа; и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 49 или 50, и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 81 или 131.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-пре-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета; и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 132 или 133, и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 49 или 50.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 8-26, 43-64 и 84-88; и/или сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 11-35 и 55-76.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S17C, Е20С, F14C, Т12С, М62С, Q57C и А19С, и/или сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из F12C, М14С, N16C, D46C, V50C, F87C и E88C.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-гамма и сконструированная С-дельта содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S17C в С-гамма и F12C в С-дельта, Е20С в С-гамма и F12C в С-дельта, F14C в С-гамма и М14С в С-дельта, Т12С в С-гамма и N16C в С-дельта, М62С в С-гамма и D46C в Сдельта, Q57C в С-гамма и V50C в С-дельта, А19С в С-гамма и F87C в С-дельта и А19С в С-гамма и Е88С

- 4 045653 в С-дельта, и где встроенная пара остатков цистеина может образовывать межцепочечную дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует или присутствует в сконструированной С-гамма и/или сконструированной С-дельта.

В некоторых вариантах осуществления нативный участок гликозилирования в сконструированной С-гамма представляет собой N65, и/или нативные участки гликозилирования в сконструированной Сдельта представляют собой один или оба из N16 и N79.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-гамма содержит SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 или 340, и/или сконструированная С-дельта содержит SEQ ID NO: 115, 116, 310, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 или 332.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-гамма, и С2 содержит сконструированную С-дельта; и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 117 или 118, и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 119 или 120.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-дельта, и С2 содержит сконструированную С-гамма; и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 123 или 124, и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 125 или 126.

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид дополнительно содержит домен СН2 антитела и/или домен СН3 антитела.

В некоторых вариантах осуществления первая антигенная специфичность и вторая антигенная специфичность направлены против двух разных антигенов или направлены против двух разных эпитопов на одном антигене.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD3. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD3.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с PD-1. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с PD-1. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления связывание осуществляют посредством линкера, дисульфидной связи, водородной связи, электростатического взаимодействия, солевого мостика, гидрофобногидрофильного взаимодействия или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи второго антитела, имеющего вторую антигенную специфичность.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит Fab.

В некоторых вариантах осуществления одна из первой и второй антигенных специфичностей направлена против специфической для Т-клеток рецепторной молекулы и/или специфической для естественных киллеров (NK-клеток) рецепторной молекулы, а другая направлена против опухолеассоциированного антигена.

В некоторых вариантах осуществления одна из первой и второй антигенных специфичностей направлена против CD3, а другая направлена против опухолеассоциированного антигена.

В некоторых вариантах осуществления одна из первой и второй антигенных специфичностей направлена против CD3, а другая направлена против CD19.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент дополнительно содержит первый домен димеризации, и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент дополнительно содержит второй домен димеризации, где первый и второй домены димеризации связаны.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй домен димеризации содержит по меньшей мере часть шарнирной области антитела, необязательно, полученную из IgG1, IgG2 или IgG4.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй домен димеризации дополнительно содержит домен димеризации. В некоторых вариантах осуществления домен димеризации содержит по меньшей мере часть шарнирной области антитела, домен СН2 антитела и/или домен СН3 антитела.

- 5 045653

В некоторых вариантах осуществления первый домен димеризации функционально связан с первой константной областью (C1) TCR в третьем соединительном домене.

В некоторых вариантах осуществления а) С1 содержит сконструированную С-бета, и третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 53 или 54; b) C1 содержит сконструированную С-альфа, и третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 134, 135, 140 или 141; с) С1 содержит сконструированную С-пре-альфа, и третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 134, 135, 140 или 141; d) C1 содержит сконструированную С-гамма, и третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 121 или 122; или е) С1 содержит сконструированную С-дельта, и третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 127 или 128.

В некоторых вариантах осуществления второй домен димеризации функционально связан с вариабельным доменом тяжелой цепи второго антигенсвязывающего функционального фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации отличаются и связываются таким образом, что препятствуют гомодимеризации и/или способствуют гетеродимеризации.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации могут связываться с образованием гетеродимеров посредством выступов-во-впадины, гидрофобного взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофильного взаимодействия или повышенной гибкости.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит первый полипептид, содержащий VH, функционально связанный с химерной константной областью, и второй полипептид содержит VL, функционально связанный с С2, где химерная константная область и С2 содержат пару последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:

177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189,

192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209,

211/210, 213/212, 213/215, 213/151, 214/212, 214/151, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223,

226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 и 238/237.

В некоторых вариантах осуществления первая антигенная специфичность направлена против CD3, и первый полипептид и второй полипептид содержат пару последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/1, 3/4/, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92/, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 и 138/139.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержат комбинацию четырех последовательностей, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22/12/24/23, 25/12/26/23 и 25/12/27/23, где первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент может связываться с CD3, и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент может связываться с CD19.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно получать в виде Fab, (Fab)₂, битела, тритела, три-Fab, тандемно соединенных Fab, FabFv, тандемно соединенных V-доменов, тандемно соединенных scFv и других форматов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, для детекции, диагностики, прогнозирования или лечения заболевания или состояния.

Указанные выше и другие признаки и преимущества изобретения будут более очевидны из следующего подробного описания нескольких вариантов осуществления со ссылкой на сопутствующие чертежи.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана схема исследуемых форматов антител. Разрабатывали антитело против CD3 Т3 и антитело против CD19 U4. Константную область (CL и СН1) Т3 заменяли константными доменами TCR для создания уникальной области контакта легкой и тяжелой цепи, ортогональной обычному антителу. TCR-модифицированное Т3 и нативное U4 в комбинации с мутациями выступы-во-впадины в Fcдомене использовали для дизайна форматов биспецифических антител Е17 и F16.

На фиг. 2A-2D показаны наложенные изображения модели антитела Fv и структуры TCR, представляющие собой схему слияния антитела Fv и константной области TCR. На фиг. 2А показана модель структуры антитела Fv, построенная с учетом последовательности антитела против CD3 Т3 собственной разработки. На фиг. 2В показана структура TCR из PDB 4L4T. На фиг. 2С показана структурная модель антитела Fv, наложенная на вариабельную область TCR в разной ориентации. Предварительные химерные белки получали посредством удаления вариабельного домена TCR при наложении, как показано на фиг. 2D. С помощью перекрывающихся остатков в области соединения конструировали соединительную область. Цепь VL антитела и альфа-цепь TCR указаны белым цветом. Цепь VH и бета-цепь указаны черным цветом.

На фиг. 3А-3В показано сравнение константной области TCR и константной области Fab антитела. На фиг. 3А показана кристаллическая структура TCR из PDB 4L4T. На фиг. 3В показана структурная модель антитела Fab, образованного FV-доменом модели Т3 и константным доменом антитела из PDB 5DK3. Очевидные различия цепей FG и DE в константных доменах TCR и константных доменах антитела Fab отмечены посредством отображения всех боковых цепей остатков.

- 6 045653

На фиг. 4 показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS дегликозилированных мутантов химерных антител TCR-антитело с цепями С-альфа и С-бета. Образцы представляли собой все собранные супернатанты после экспрессии в Expi293. Дорожки 1, 3, 5, 7 и 9 соответствуют невосстановительным условиям для Дизайн_2-QQQQ, Дизайн_2-АААА, Дизайн_2-QSKE, Дизайн_2-ASKE и Дизайн_2-QQQQQ, соответственно. Дорожки 2, 4, 6, 8 и 10 соответствуют восстановительным условиям.

На фиг. 5 показано дозозависимое связывание при FACS всех дегликозилированных мутантов, связывающихся с CD3-экспрессирующими клетками Jurkat. Все образцы представляли собой собранные супернатанты Expi293, экспрессирующих дегликозилированных мутантов. В качестве положительного контроля использовали антитело против CD3 дикого типа (T3-IgG1).

На фиг. 6А-6В показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS для тестов неправильного спаривания цепей антител Т3 и U4 с изотипами IgG1 (фиг. 6А) и IgG4 (фиг. 6В). Дорожки 1-2 соответствуют парам Т3_легкая-U4_тяжелая и Т3_тяжелая-U4_легкая, соответственно. Дорожки 3-4 имеют тот же порядок пар, что и дорожки 1-2, но с Т3, модифицированным с использованием константной области TCR. Дорожки 1-4 на обеих фигурах соответствуют невосстановленным образцам, и дорожки 5-8 соответствуют восстановленным образцам.

На фиг. 7А-7В показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS очищенного биспецифического антитела E17-Дизайн_2-QQQQ с изотипом IgG1 (фиг. 7А) и IgG4 (фиг. 7В). Изотип IgG1 очищали трехступенчатым способом: хроматография с протеином А, ионообменная хроматография (IEC) и эксклюзионная хроматография (SEC). IgG4 получали посредством двухступенчатой очистки: хроматография с протеином А и SEC. На фиг. 7C-7D показаны данные SEC-ВЭЖХ для очищенных образцов IgG1 (фиг. 7С) и IgG4 (фиг. 7D) для определения чистоты образцов.

На фиг. 8 показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS Fab-фрагментов химерного Т3 с меткой 6xHis, очищенных посредством хроматографии с никель-сефарозой Ni Sepharose™ Excel. Дорожки 1 и 3 содержат полосы T3-Fab-Дизайн_2.his1, и дорожки 2 и 4 содержат полосы Т3-FabДизайн_2.his2.

На фиг. 9 показано дозозависимое связывание при FACS Fab-фрагмента TCR-модифицированного химерного Т3. В качестве положительного контроля использовали моновалентную форму антитела Т3 дикого типа (T3-Fab-IgG4). В качестве отрицательного контроля использовали обычное антитело IgG4 человека.

На фиг. 10А-10В показано дозозависимое связывание при FACS сконструированного биспецифического антитела E17-Дизайн_2-QQQQ с CD3+ клетками Jurkat. Антитела Т3 и U4 дикого типа, а также их моновалентные формы, использовали в качестве положительных контролей (фиг. 10А), а также использовали CD19+ клетки Ramos (фиг. 10В). Тестировали изотипы IgG1 и IgG4. В качестве отрицательного контроля использовали неродственное антитело IgG1 или IgG4 человека.

На фиг. 11А-11В показано сравнение связывания при FACS двух сконструированных биспецифических антител, E17-Дизайн_2-QQQQ и F16-Дизайн_2-QQQQ, с CD3 на клетках Jurkat (фиг. 11А) и CD19, экспрессирующимся на клетках Ramos (фиг. 11В). Тестировали биспецифические антитела изотипов IgG1 и IgG4. В качестве отрицательного контроля использовали обычные антитела IgG1 или IgG4 человека.

На фиг. 12 показан анализ цитотоксичности при направляемом Т-клетками цитолизе злокачественных В-клеток, опосредованном сконструированными биспецифическими антителами E17-Дизайн_2QQQQ изотипов IgG1 и IgG4. В качестве отрицательного контроля использовали родительское моноспецифическое антитело против CD3 (T3-IgG4) и антитело против CD19 (U4-IgG), а также неродственное антитело IgG1 человека.

На фиг. 13 показано сравнение активности двух сконструированных биспецифических антител, E17-Дизайн_2-QQQQ и F16-Дизайн_2-QQQQ, при опосредовании цитолиза Т-клетками злокачественных В-клеток. В качестве отрицательного контроля использовали неродственное антитело IgG человека.

На фиг. 14А-14В показаны подвергнутые деконволюции массовые спектры биспецифического антитела E17-Дизайн_2-QQQQ в невосстановительных (фиг. 14А) и восстановительных (фиг. 14В) условиях. Пик в 148180,53 на фиг. 14А соответствует правильной молекулярной массе интактного WuXiBody. Пик 22877 Да соответствует легкой цепи, обнаруживаемой на массовых спектрах восстановленных образцов на фиг. 14В. Предполагают, что небольшой пик 149128,45 Да на фиг. 14А соответствует Огликозилированию (на приблизительно 947,92 Да больше) легкой цепи, показанной на фиг. 14В.

На фиг. 15А-15В показана роль межцепочечной дисульфидной связи при экспрессии антитела с областью контакта альфа/бета, охарактеризованная посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. На фиг. 15А показано антитело, содержащее межцепочечную дисульфидную связь между С-альфа и С-бета; на фиг. 15В показано антитело без межцепочечной дисульфидной связи между С-альфа и Сбета; дорожки 1 и 3 соответствуют результатам электрофореза в ПААГ в невосстановительных условиях для Дизайн_2-QQQQ-IgG4 с встроенной дисульфидной связью и без нее, соответственно. Дорожки 2 и 4 соответствуют результатам электрофореза в ПААГ в восстановительных условиях для Дизайн_2-QQQQIgG4 с встроенной дисульфидной связью и без нее, соответственно.

На фиг. 16 показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS для сконструированной дисульфидной связи в области контакта пре-альфа/бета. Дорожки 1 и 2 соответствуют Ди- 7 045653 зайн_5_Пре_TCR_область соединения 1_Cys13 и Дизайн_6_Пре_TCR_область соединения'1_Cys14, соответственно, в невосстановительных условиях. Дорожки 4 и 5 соответствуют Дизайн_5_Пре_TCR_область соединения 1_Cys13 и Дизайн_6_Пре_TCR_область соединения'1_Cys14, соответственно, в восстановительных условиях.

На фиг. 17А-17В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS сконструированной дисульфидной связи в области контакта дельта/гамма. Дорожки 6 и 8 соответствуют Дизайн_2_Cys5_без_гликозилирования и Дизайн_2_hyp eCys2_без_гликозилирования, соответственно. На фиг. 17А показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS в невосстановительных условиях. На фиг. 17В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS в восстановительных условиях.

На фиг. 18А показана последовательность нативной альфа-цепи TCR и соответствующей ей последовательности с мутантными остатками цистеина. TRAC_человек представляет собой природную последовательность константной области альфа-цепи. 4L4Т_Альфа_Кристалл представляет собой последовательность для кристаллической структуры (код PDB 4L4T) с мутациями S55C, которая может образовывать межцепочечную дисульфидную связь. Серая область представляет собой константную область, используемую в настоящем изобретении в качестве остова химерного белка.

На фиг. 18В показана последовательность нативной бета-цепи TCR и соответствующая ей последовательность с мутантными остатками цистеина. TRBC1_человек и TRBC2_человек представляют собой последовательности константной области бета-цепи.

На фиг. 18С показаны последовательности нативной пре-альфа-цепи TCR. PTCRA_человек представляет собой природную последовательность константной области пре-альфа-цепи (пре-альфа-цепь не содержит только вариабельную область). 3OF6_Пре-альфа_Кристалл представляет собой последовательность для кристаллической структуры (код PDB 3OF6). Серая область представляет собой константную область, используемую выше для определения нумерации.

На фиг. 18D показаны последовательности нативной дельта-цепи TCR. TRA@_человек представляет собой природную последовательность константной области дельта-цепи. 4LFH_Дельта_Кристалл представляет собой константную область последовательности дельта-цепи для кристаллической структуры (код PDB 4LFH). Серая область представляет собой константную область, используемую выше для определения нумерации.

На фиг. 18Е показаны последовательности нативной гамма-цепи TCR. TRGC1_человек и TRGC2_человек представляют собой природные последовательности константной области гамма-цепи. 4LFH_Гамма_Кристалл представляет собой константную область последовательности гамма-цепи для кристаллической структуры (код PDB 4LFH). Серая область представляет собой константную область, используемую выше для определения нумерации.

На фиг. 19А-19Е показаны последовательности и нумерация константных областей TCR. На фиг. 19А показаны последовательности и нумерация константной области альфа-цепи TCR. На фиг. 19В показаны последовательности и нумерация константной области бета-цепи TCR. На фиг. 19С показаны последовательности и нумерация константной области пре-альфа-цепи TCR. На фиг. 19D показаны последовательности и нумерация константной области дельта-цепи TCR. На фиг. 19Е показаны последовательности и нумерация константной области гамма-цепи TCR.

На фиг. 20A-20D показаны последовательности и нумерация выступов-во-впадины в IgG1 и IgG4. На фиг. 20А показаны последовательности и нумерация мутаций-выступов IgG1. На фиг. 20В показаны последовательности и нумерация мутаций-выступов IgG4. На фиг. 20С показаны последовательности и нумерация мутаций-впадин IgG1. На фиг. 20D показаны последовательности и нумерация мутаций-впадин IgG4.

На фиг. 21А-21В показано связывание E17-Дизайн_2-QQQQ в форматах IgG4 (фиг. 21А) и дикого типа IgG1 (фиг. 21В) с C1Q человека по результатам ELISA. В качестве контроля использовали антитело IgG1 человека.

На фиг. 22 показана схема четырех симметричных форматов WuXiBody G19, G19R, G25 и G25R. В случае форматов G19 и G25 два TCR-содержащих химерных Fab-подобных домена пересаживали на Сконец и N-конец нормального антитела, соответственно. Прямоугольниками указаны константные домены TCR, и овалами указаны вариабельные и константные домены антитела. Различием между форматами G19 и G19R или G25 и G25R являются переставленные местами нормальный Fab и химерный Fab. Эти форматы могут включать разные вариабельные области из разных пар антител и, как правило, имеют молекулярную массу приблизительно 240-250 кДа.

На фиг. 23А-23В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 23А) и SEC-ВЭЖХ (фиг. 23В) двух очищенных биспецифических антител в формате G19. Номера дорожек на ПААГ соответствуют номерам на фигуре с SEC-ВЭЖХ. Дорожки 1 и 2 соответствуют паре антител T1U6 и U6T1, соответственно. В T1U6 Т1 (против CTLA-4) располагали на N-конце формата, в то же время в U6T1 U6 (против PD-1) располагали на N-конце формата. Обе биспецифические молекулы очищали посредством хроматографии с протеином А и достигали чистоты приблизительно 90%.

На фиг. 24А-24В показано дозозависимое связывание при FACS очищенных антител U6T1 и T1U6 в формате G19 со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 24А) и CTLA-4 человека (фиг. 24В). В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

- 8 045653

На фиг. 25А-25В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 25А) и SEC-ВЭЖХ (фиг. 25В) очищенных посредством хроматографии с протеином А, биспецифических антител в разных симметричных форматах. Дорожки 1-3 соответствуют паре антител U6T1 в форматах G19R, G25 и G25R, соответственно. PC является контрольным белком с известной молекулярной массой 250 кДа. Все три биспецифические молекулы имели чистоту более 90%. Номера дорожек на ПААГ соответствуют номерам на фигурах с SEC-ВЭЖХ.

На фиг. 26А-26В показано дозозависимое связывание при FACS очищенных биспецифических антител U6T1 в форматах G19R, G25 и G25R со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 26А) и CTLA-4 человека (фиг. 26В). В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4 и PD-1 (BMK1.IgG1) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 27А-27В показаны конкурентные анализы FACS сконструированных биспецифических антител в форматах G19R, G25 и G25R для блокирования связывания PD-L1 человека с PD-1 (фиг. 27А) и связывания CD80 с CTLA-4 (фиг. 27В), соответственно. В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4 и PD-1 (BMK1.IgG1) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 28А-28В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 28А) и SEC-ВЭЖХ. (фиг. 28В) очищенных посредством хроматографии с протеином А, биспецифических антител в разных симметричных форматах. Дорожки 1-4 соответствуют паре антител U6T5 в форматах G19, G19R, G25 и G25R, соответственно. PC является контрольным белком с молекулярной массой 250 кДа. Все три биспецифические молекулы имели чистоту более 90%. Номера дорожек на ПААГ соответствуют номерам на фигурах с SEC-ВЭЖХ.

На фиг. 29А-29В показано дозозависимое связывание при FACS очищенных биспецифических антител в форматах G19, G19R, G25 и G25R со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 29А) и CTLA-4 человека (фиг. 29В). В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4xPD-1 (BMKl.IgGl) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 30 показан анализ двойного связывания ELISA для двух молекул U6T5.G25 и U6T1.G25R. В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4xPD-1 (BMKl.IgGl) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 31А-31В показаны конкурентные анализы FACS сконструированных биспецифических антител U6T5.G25 и U6T1. G25R блокирует связывание PD-L1 человека PD-1 (фиг. 31А) и связывание CD80 с CTLA-4 (фиг. 31В), соответственно. В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4xPD-1 (BMK1.IgG1) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 32 показана схема трех симметричных форматов G26, G27 и G26R с переставленными местами химерными Fab-подобными доменами в легких и тяжелых цепях.

На фиг. 33А-33В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 33А) и SEC-ВЭЖХ (фиг. 33В) очищенных посредством хроматографии с протеином А, биспецифических антител в форматах G27 и G26R. Дорожки 1-2 соответствуют паре антител T4U6 в форматах G27 и G26R, соответственно. Только в случае формата G26R достигали чистоты 90% после очистки. Номера дорожек на ПААГ соответствуют номерам на фигурах с SEC-ВЭЖХ.

На фиг. 34А-34В показано дозозависимое связывание при FACS очищенной биспецифической пары антител T4U6 в формате G26R со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 34А) и CTLA-4 человека (фиг. 34В). В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4xPD-1 (BMK1.IgG1) и в качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 35А-35В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 35А) и SEC-ВЭЖХ (фиг. 35В) очищенной посредством хроматографии с протеином А, биспецифической пары антител U6T4 в формате G26. Достигали чистоты 90% после очистки.

На фиг. 36A-36D показано дозозависимое связывание при ELISA очищенной биспецифической пары антител U6T4 в формате G26 со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 36А) и CTLA-4 человека (фиг. 36В), а также дозозависимое связывание при FACS очищенной биспецифической пары антител U6T4 в формате G26 со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека (фиг. 36С) и CTLA-4 человека (фиг. 36D). В качестве контроля использовали демонстрационное биспецифическое антитело против CTAL-4xPD-1 (BMK1.IgG1) и в качестве отрицательного контроля использовали неродственное антитело IgG4.

На фиг. 37 показаны гистограммы проточной цитометрии линии клеток WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9, трансфицированной с использованием CD19 яванского макака, и родительской линии клеток СНО-К1.

На фиг. 38 показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP. М: белковый маркер; дорожка 1: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, невосстановительные условия; дорожка 3: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, восстановительные условия.

- 9 045653

На фиг. 39 показана SEC-ВЭЖХ W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.

На фиг. 40 показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP. М: белковый маркер; Lane1: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, невосстановительные условия; Lane2: W3438T3U4.E17-1.uIgG4.SP, восстановительные условия.

На фиг. 41 показана SEC-ВЭЖХ W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.

На фиг. 42А-42В показано связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с клетками Ramos (фиг. 42А) и клетками Jurkat (фиг. 42В) по результатам FACS.

На фиг. 43А-43В показано связывание W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP с клетками Ramos (фиг. 43А) и клетками Jurkat (фиг. 43В) по результатам FACS.

На фиг. 44 показано связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с клетками, экспрессирующим CD19 яванского макака, по результатам FACS.

На фиг. 45 показано связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD3 яванского макака по результатам ELISA.

На фиг. 46А-46В показана аффинность W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP к CD19 и CD3 человека, измеряемая по связыванию с клетками Ramos (фиг. 46А) и Jurkat (фиг. 46В).

На фиг. 47А-47В показано опосредованное W3438-T3U4.E17-LuIgG4.SP связывание CD3+ клеток с CD19+ клетками (фиг. 47А). В качестве отрицательного контроля использовали неродственный IgG (фиг. 47В).

На фиг. 48А-48В показана цитотоксическая активность опосредованного W3438-T3U4.E171.uIgG4.SP цитолиза клеток Raji Т-клетками (фиг. 48А) и цитотоксическая активность опосредованного W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP цитолиза клеток Raji Т-клетками (фиг. 48В).

На фиг. 49A-49D показана экспрессия CD69 и CD25 на Т-клетках в присутствии или отсутствие CD19+ клеток-мишеней. Процентная доля CD69+ Т-клеток в субпопуляции CD4+ Т-клеток (фиг. 49А); процентная доля CD69-экспрессирующих Т-клеток в субпопуляции CD8+ Т-клеток (фиг. 49В); процентная доля CD25-экспрессирующих Т-клеток в субпопуляции CD4+ Т-клеток (фиг. 49С); процентная доля CD25-экспрессирующих Т-клеток в субпопуляции CD8+ Т-клеток (фиг. 49D).

На фиг. 50A-50D показано высвобождение цитокинов ИФНу и ФНОа Т-клетками в присутствии или отсутствие CD19+ клеток-мишеней. Высвобождение ИФНу в субпопуляции CD4+ Т-клеток (фиг. 50А); высвобождение ФНОа в субпопуляции CD4+ Т-клеток (фиг. 50В); высвобождение ИФНу в субпопуляции CD8+ Т-клетка (фиг. 50С); высвобождение ФНОа в субпопуляции CD8+ Т-клетка (фиг. 50D).

На фиг. 51А-51В показана стабильность W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в сыворотке человека. Связывание образцов W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, инкубируемых в сыворотке, с клетками Ramos в указанные дни (фиг. 51А); связывание образцов W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, инкубируемых в сыворотке, с клетками Jurkat в указанные дни (фиг. 51В).

На фиг. 52 показано связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с C1Q по результатам ELISA. В качестве контроля использовали антитело IgG1.

На фиг. 53 показан объем опухоли после введения гуманизированным мышам, несущим ксенотрансплантаты опухолей Raji, W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в разных дозах с примешанными РВМС. Точки данных соответствуют среднему в группе, и планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего (SEM). В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 54 показана фармакокинетика W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP у яванского макака. Образцы сыворотки двух яванских макаков анализировали посредством ELISA.

На фиг. 55А-55В показано антитело против лекарственного средства (ADA, определяемое посредством ELISA) в образцах сыворотки обезьяны #1 (фиг. 55А) и обезьяны #2 (фиг. 55В), включая моменты до и после введения W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.

На фиг. 56А-56В показан электрофорез в ПААГ в присутствии SDS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP. М: белковый маркер. PC: биспецифическое антитело положительного контроля с массой приблизительно 250 кДа (фиг. 56А), и SEC-ВэЖх W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP (фиг. 56В).

На фиг. 57 показаны температуры плавления W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP, W3248-U6T5.G251.uIgG4.SP и демонстрационного биспецифического антитела против CTLA-4xPD-1 WBP324BMK1.uIgG1.KDL.

На фиг. 58 показано связывание при FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1 человека. WBP324BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4 и W324-BMK3.uIgG4 представляют собой разные версии демонстрационных биспецифических антител против CTLA-4 и PD-1. WBP305-BMK1.IgG4 является антителом против PD-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 59 показано связывание при FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP со сконструированными клетками, экспрессирующим PD-1 яванского макака. WBP3055_1.153.7.hAb и WBP305-BMK1.IgG4 являются антителами против PD-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

- 10 045653

На фиг. 60 показано связывание при FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP со сконструированными клетками, экспрессирующими CTLA-4 человека. WBP324BMK1.uIgG1.KDL, W324-BMK2.uIgG4 и W324-BMK3.uIgG4 являются разными демонстрационными биспецифическими антителами против CTLA-4xPD-1. WBP316-BMK1.IgG4 является антителом против

CTLA-4-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 61 показано связывание при FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP со сконструированными клетками, экспрессирующими CTLA-4 яванского макака. WBP324BMK1.uIgG1.KDL является демонстрационным биспецифическим антителом против CTLA-4 и PD-1. W3162_1.154.8-z35-IgG1K и WBP316-BMK1.IgG4 являются антителами против CTLA-4. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 62 показаны аффинности связывания W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP с CTLA-4 и PD-1, измеряемые посредством SPR. WBP316-BMK1.IgG4 является антителом против CTLA-4-1. В качестве контроля использовали родительское антитело против PD-1.

На фиг. 63 показаны FaCs конкурентные анализы W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248U6T1.G25R-1.uIgG4.SP для блокирования связывания белка PD-L1 человека со сконструированными клетками, экспрессирующими PD-1. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL является демонстрационным биспецифическим антителом против CTLA-4xPD-1. WBP3055_1.153.7.hAb и WBP305-BMK1.IgG4 являются антителами против PD-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 64 показаны конкурентные анализы FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248U6T1.G25R-1.uIgG4.SP для блокирования связывания белка CTLA-4 человека со сконструированными клетками, экспрессирующими CD80. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL является демонстрационным биспецифическим антителом против CTLA-4xPD-1. W3162_1.154.8-z35-IgG1K и WBP316-BMK1.IgG4 являются антителами против CTLA-4. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 65 показаны конкурентные анализы FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248U6T1.G25R-1.uIgG4.SP для блокирования связывания белка CTLA-4 яванского макака со сконструированными клетками, экспрессирующими CD80. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL является демонстрационным биспецифическим антителом против CTLA-4xPD-1. W3162_1.154.8-z35-IgG1K и WBP316-BMK1.IgG4 являются антителами против CTLA-4. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 66 показан анализ двойного связывания ELISA W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248U6T1.G25R-1.uIgG4.SP. WBP324-BMK1.uIgG1.KDL является демонстрационным биспецифическим антителом против CTLA-4xPD-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 67 показано двойное связывание при FACS W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP и W3248U6Tl.G25R-1.uIgG4.SP с CTLA-4 и PD-1. В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG4.

На фиг. 68А-68В показана стабильность W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP в сыворотке в течение 14 дней, измеряемая посредством анализа двойного связывания ELISA с CTLA-4 и PD-1 человека (фиг. 68А), и стабильность W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP в сыворотке в течение 14 дней, измеряемая посредством анализа двойного связывания ELISA с CTLA-4 и PD-1 человека (фиг. 68В).

Подробное описание изобретения

Следующее описание изобретения представлено исключительно для иллюстрирования различных вариантов его осуществления. В связи с этим, конкретные описываемые модификации не следует истолковывать как ограничение объема изобретения. Специалисту в этой области очевидно, что можно осуществлять различные эквиваленты, изменения и модификации без отклонения от объема изобретения, и следует понимать, что такие эквивалентные варианты осуществления следует включать в настоящее изобретение. Все цитируемые в настоящем описании ссылки, включая публикации, патенты и патентные заявки, включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Определения.

В настоящем описании термины в единственном числе используют для обозначения одного или более (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, термин полипептидный комплекс означает один полипептидный комплекс или более полипептидных комплексов.

В рамках изобретения термин приблизительно относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, процентной доле, размеру, массе или длине, отклоняющихся на вплоть до 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от референсного количества, уровня, значения, числа, частоты, процентной доли, размера, массы или длины. В конкретных вариантах осуществления термин приблизительно, предшествующий числовому значению, означает значение плюс или минус диапазон 15%, 10%, 5% или 1%.

На всем протяжении настоящего описания, если контекст не требует иного, термины содержат, содержит и содержащий следует понимать как означающие включение указанной стадии, или элементов, или группы стадий или элементов, но не исключение любой другой стадии, или элемента, или группы стадий или элементов. Термин состоящий из означает включающий все, что следует после фразы состоящий из, и ограниченный этим. Таким образом, фраза состоящий из указывает, что указанные элементы являются обязательными, и что другие элементы не могут присутствовать. Термин со- 11 045653 стоящий, по существу, из означает включающий любые элементы, указанные после фразы, и ограниченный другими элементами, не препятствующими активности или действию, приведенных в описании в отношении указанных элементов, или не вносящими вклад в активность или действие. Таким образом, фраза состоящий, по существу, из означает, что указанные элементы являются обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или отсутствовать в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие указанных элементов.

На всем протяжении настоящего описания ссылка на один из вариантов осуществления, вариант осуществления, конкретный вариант осуществления, родственный вариант осуществления, некоторый вариант осуществления или дополнительный вариант осуществления изобретения или их комбинации означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в отношении варианта осуществления, включены по меньшей мере в один из вариантов осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление указанных выше фраз в различных местах на всем протяжении настоящего описания не обязательно относится к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики можно комбинировать любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления.

В настоящем описании термины полипептид, пептид и белок используют взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков или совокупности множества полимеров аминокислотных остатков. Термины относятся к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков являются искусственным химическим миметиком соответствующей природной аминокислоты, а также к полимерам природных аминокислот и полимерам неприродных аминокислот. Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, функционирующим схожим образом с природными аминокислотами. Природные аминокислоты являются аминокислотами, кодируемыми генетическим кодом, а также аминокислотами, модифицированными впоследствии, например, гидроксипролином, гаммакарбоксиглутаматом и О-фосфосерином. Термин аналоги аминокислот относится к соединениям, имеющим ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е. альфа-атом углерода, связанный с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерину, норлейцину, сульфоксиду метионина, метилметионинсульфонию. Такие аналоги содержат модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота. Термин альфа-атом углерода относится к первому атому углерода, присоединенному к функциональной группе, такой как карбонил. Термин бета-атом углерода относится ко второму атому углерода, соединенному с альфа-атомом углерода, и нумерацию атомов углерода продолжают в алфавитном порядке с использованием букв греческого алфавита. Термин миметики аминокислот относится к химическим соединениям, имеющим структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но функционирующим схожим образом с природной аминокислотой. Термин белок, как правило, относится к крупным полипептидам. Термин пептид, как правило, относится к коротким полипептидам. Полипептидные последовательности, как правило, описывают таким образом, что левый конец полипептидной последовательности представляет собой амино-конец (N-конец), а правый конец полипептидной последовательности представляет собой карбокси-конец (С-конец). В рамках изобретения термин полипептидный комплекс относится к комплексу, содержащему один или более полипептидов, связанных для осуществления некоторых функций. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ассоциированы с иммунной системой.

В рамках изобретения термин антитело включает любой иммуноглобулин, моноклональное антитело, поликлональное антитело, полиспецифическое антитело или биспецифическое (бивалентное) антитело, связывающееся с конкретным антигеном. Нативное интактное антитело содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (HCVR) и первой, второй и третьей константной области (CH1, CH2 и СН3), в то время как каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (LCVR) и константной области (CL). Тяжелые цепи млекопитающих классифицируют как α, δ, ε, γ и μ, и легкие цепи млекопитающих классифицируют как λ или к. Антитело имеет Yобразную форму, при этом стебель Y состоит из второй и третьей константных областей двух тяжелых цепей, соединенных дисульфидной связью. Каждое плечо Y включает вариабельную область и первую константную область одной тяжелой цепи, соединенные с вариабельной и константной областями одной легкой цепи. Вариабельные области легких и тяжелых цепей отвечают за связывание антигена. Вариабельные области в обеих цепях, как правило, содержат три высоковариабельные петли, названные определяющими комплементарность областями (CDR) (CDR легкой цепи (L) включают LCDR1, LCDR2 и LCDR3, CDR тяжелой цепи (Н) включают HCDR1, HCDR2, HCDR3). Границы CDR антител можно определять или идентифицировать по Kabat, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani, В., Chothia, С., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, С. et al., J Mol. Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, С. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, С. et al., Nature. Dec 21-28; 342 (6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)). Три CDR распределены среди тяжей, известных как каркасные области (FR), являющихся более консервативными, чем CDR, и образующих каркас для поддержки гипервариабельных петель. Каждая HCVR и LCVR содержит четыре FR, и CDR и

- 12 045653

FR расположены от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Константные области тяжелых и легких цепей не участвуют в связывании антигена, но выполняют различные эффекторные функции. Антитела распределяют по классам с учетом аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Пятью основными классами или изотипами антител являются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, отличающиеся наличием тяжелых цепей α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Несколько основных классов антител разделяют на подклассы, такие как IgG1 (тяжелая цепь Yl), IgG2 (тяжелая цепь γ2), IgG3 (тяжелая цепь γ3), IgG4 (тяжелая цепь γ4), IgA1 (тяжелая цепь α1) или IgA2 (тяжелая цепь α2).

В рамках изобретения термин вариабельный домен в отношении антитела относится к вариабельной области антитела или ее фрагменту, содержащему одну или более CDR. Хотя вариабельный домен может содержать интактную вариабельную область (такую как HCVR или LCVR), она также может содержать вариабельную область меньше интактной, но при этом сохранять способность связываться с антигеном или образовывать антигенсвязывающий участок.

В рамках изобретения термин антигенсвязывающий функциональный фрагмент относится к фрагменту антитела, образованному частью антитела, содержащей одну или более CDR, или любому другому фрагменту антитела, связывающемуся с антигеном, но несодержащему интактную нативную структуру антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающего функционального фрагмента включают вариабельный домен, вариабельную область, диатело, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv-фрагмент, Fvфрагмент, стабилизированный дисульфидной связью (dsFv), (dsFv)₂, биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), стабилизированное дисульфидной связью диатело (ds-диатело), полиспецифическое антитело, камелизированное однодоменное антитело, нанотело, доменное антитело и бивалентное доменное антитело. Антигенсвязывающий функциональный фрагмент может связываться с тем же антигеном, с которым связывается родительское антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий функциональный фрагмент может содержать одну или более CDR из конкретного антитела человека, пересаженных на каркасную область одного или более разных антител человека. Более подробно форматы антигенсвязывающих функциональных фрагментов описаны в Spiess et al., 2015 (выше), и Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp. 182-212 (2017), включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Термин Fab в отношении антитела относится к части антитела, состоящей из одной легкой цепи (вариабельной и константной областей), соединенной с вариабельной областью и первой константной областью одной тяжелой цепи дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления константные области легкой цепи и тяжелой цепи заменяют константными областями TCR.

Термин Fab'относится к Fab-фрагменту, включающему часть шарнирной области.

Термин F(ab')₂относится к димеру Fab'.

Термин битело относится к слитому белку, образованному посредством слияния scFv с С-концом легкой цепи (Fab-L-scFv) или Fd (Fab-H-scFv).

Термин тритело относится к слитому белку, образованному посредством слияния scFv с легкой цепью и тяжелой цепью (Fab-(scFv)2).

WuXiBody является биспецифическим антителом, содержащим растворимый химерный белок с вариабельными доменами антитела и константными доменами TCR, где субъединицы (такие как альфаи бета-домены) константных доменов TCR соединяют посредством сконструированной дисульфидной связи.

Термин Fd-фрагмент в отношении антитела относится к амино-концевой половине фрагмента тяжелой цепи, который можно комбинировать с легкой цепью для получения Fab.

Термин Fc в отношении антитела относится к части антитела, состоящей из второй (СН2) и третьей (СН3) константных областей первой тяжелой цепи, связанным со второй и третей константными областями второй тяжелой цепи посредством дисульфидной связи. Fc-часть антитела отвечает за различные эффекторные функции, такие как ADCC и CDC, но не участвует в связывании антигена.

Термин шарнирная область в отношении антитела включает часть молекулы тяжелой цепи, соединяющую домен СН1 с доменом СН2. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 аминокислотных остатков и является гибкой, таким образом, позволяя двум N-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо.

В рамках изобретения термин домен СН2 относится к части молекулы тяжелой цепи, пролегающей, например, приблизительно от аминокислоты 244 до аминокислоты 360 антитела IgG при использовании общепринятых схем нумерации (аминокислоты 244-360 по системе нумерации Kabat и аминокислоты 231-340 по системе нумерации EU; см. Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)).

Домен СН3 пролегает от домена СН2 до С-конца молекулы IgG и содержит приблизительно 108 аминокислот. Некоторые классы иммуноглобулинов, например, IgM, дополнительно включают область СН4.

Термин Fv в отношении антитела относится к наименьшему фрагменту антитела, несущему полный антигенсвязывающий участок. Fv-фрагмент состоит из вариабельного домена одной легкой цепи,

- 13 045653 соединенного с вариабельным доменом одной тяжелой цепи. Разработан ряд форматов Fv, включая dsFv, в котором соединение между двумя доменами усилено встроенной дисульфидной связью; и scFv можно получать с использованием пептидного линкера для связывания двух доменов в виде единого полипептида. Также получают конструкции Fv, содержащие вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, соединенный с вариабельным и константным доменом соответствующей тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина. Fv также тримеризуют для получения диател и триател (Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000)).

Термин ScFab относится к слитому полипептиду с Fd, соединенным с легкой цепью через полипептидный линкер, что приводит к образованию одноцепочечного Fab-фрагмента (scFab).

Термин три-Fab относится к тривалентному, биспецифическому слитому белку, состоящему из трех единиц с Fab-функциональностью. Три-Fab несут два обычных Fab, слитых с асимметричным Fabподобным функциональным фрагментом.

Термин Fab-Fab относится к слитому белку, полученному посредством слияния Fd-цепи первого плеча Fab с N-концом Fd-цепи второго плеча Fab.

Термин Fab-Fv относится к слитому белку, полученному посредством слияния HCVR с С-концом Fd-цепи и LCVR с С-концом легкой цепи. Молекулу Fab-dsFv можно получать посредством встраивания междоменной дисульфидной связи между доменом HCVR и доменом LCVR.

Термин mAb-Fv или IgG-Fv относится к слитому белку, полученному посредством слияния домена HCVR с С-концом одной Fc-цепи и доменом LCVR, экспрессируемым раздельно или слитым с Сконцом другой Fc-цепи, что приводит к получению биспецифического, тривалентного слитого белка IgG-Fv (mAb-Fv), при этом Fv стабилизируют посредством междоменной дисульфидной связи.

Термины ScFab-Fc-scFv₂ и ScFab-Fc-scFv относятся к слитому белку, полученному посредством слияния одноцепочечного Fab с Fc и стабилизированными дисульфидной связью FV-доменами.

Термин добавленный IgG относится к слитому белку с плечом Fab, слитым с IgG для получения формата биспецифического (Fab)₂-Fc. Оно может образовывать IgG-Fab или Fab-IgG с Fab, слитым с С-концом или N-концом молекулы IgG с линкером или без него. В некоторых вариантах осуществления добавленный IgG можно дополнительно модифицировать в формат IgG-Fab₄ (см. Brinkman et al., 2017, выше).

Термин DVD-Ig относится к антителу с двойным вариабельным доменом, получаемому посредством слияния дополнительного домена HCVR и домена LCVR со второй специфичностью с тяжелой цепью и легкой цепью IgG. Термин CODV-Ig относится к родственному формату, в котором два домена HCVR и два домена LCVR таким образом, что происходит перекрестное спаривание вариабельных доменов HCVR-LCVR, расположенных (с N-конца к С-концу) в порядке HCVRA-HCVRB и LCVRBLCVRA или в порядке HCVRB-HCVRA и LCVRA-LCVRB.

Термин CrossMab относится к технологии спаривания немодифицированной легкой цепи с соответствующей немодифицированной тяжелой цепью и спаривания модифицированной легкой цепи с соответствующей модифицированной тяжелой цепью для получения антитела со сниженным неправильным спариванием в легкой цепи.

BiTE представляет собой привлекающий Т-клетки биспецифический активатор, содержащий первый scFv с первой антигенной специфичностью в ориентации LCVR-HCVR, соединенный со вторым scFv со второй специфичностью в ориентации HCVR-LCVR.

Термин процент (%) идентичности последовательности в отношении аминокислотной последовательности (или последовательности нуклеиновой кислоты) определяют как процент остатков аминокислот (или нуклеотидов) в последовательности-кандидате, являющихся идентичными остаткам аминокислот (или нуклеотидов) в референсной последовательности после выравнивания последовательностей и, при необходимости, включения пропусков для достижения максимального количества идентичных аминокислот (или нуклеотидов). Консервативную замену аминокислотных остатков можно считать или не считать идентичным остатком. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности (или последовательности нуклеиновой кислоты) можно осуществлять, например, с использованием общедоступных инструментов, таких как программное обеспечение BLASTN, BLASTp (доступные на веб-сайте U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI), также см. Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (доступное на веб-сайте European Bioinformatics Institute, также см. Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)) и ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в этой области могут использовать параметры по умолчанию такого инструмента или, при необходимости, могут подбирать параметры выравнивания, например, выбирая подходящий алгоритм.

В рамках изобретения термин антиген или Ag относится к соединению, композиции, пептиду, полипептиду, белку или веществу, которое может стимулировать продукцию антител или Т-клеточный ответ в культуре клеток или у животного, включая композиции (такие как композиция, включающая опухолеспецифический белок), добавляемые к культуре клеток (такой как гибридома), или инъецируемые животному, или абсорбируемые животным. Антиген реагирует с продуктами специфического гумо- 14 045653 рального или клеточного иммунитета (такими как антитело), включая продукты, индуцируемые гетерологичными антигенами.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к области антигена, с которым связывается связывающее средство (такое как антитело). Эпитопы могут образовываться из смежных аминокислот (линейный или последовательный эпитоп) или несмежных аминокислот, сближающихся при фолдинге третичной структуры белка (конфигурационный или конформационный эпитоп). Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, как правило, расположены линейно вдоль аминокислотных остатков первичной структуры белка, и небольшие сегменты смежных аминокислот могут расщепляться при связывании антигена с использованием молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) или сохраняться при воздействии денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные при фолдинге третичной структуры, как правило, утрачиваются после обработки денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, и, более типично, по меньшей мере 5, приблизительно 7 или приблизительно 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

В рамках изобретения термин специфическое связывание или специфически связывается относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, такими как, например, антитело и антиген. В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс, представленные в настоящем описании, специфически связываются с антигеном с аффинностью связывания (K_D) <10’⁶ М (например, <5x10’7 М, <2x10’7 М, <10’⁷ М, <5x10’8 М, <2x10’8 М, <10⁸ М, <5x10’9 М, <2x10’9 М, <10’⁹ М или <10’¹⁰ М). В рамках изобретения термин K_D относится к отношению скорости диссоциации и скорости ассоциации (ko_ff/ko_n), ее можно определять способами поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием такого устройства, как Biacore.

Термин функциональная связь или функционально связанный относится к сближению двух или более интересующих биологических последовательностей с использованием спейсера или линкера или без них таким образом, что они находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. При использовании в отношении полипептидов термин означает, что полипептидные последовательности соединяют таким образом, что соединенный продукт может иметь заданную биологическую функцию. Например, вариабельную область антитела можно функционально связывать с константной областью для получения стабильного продукта с антигенсвязывающей активностью. Термин также можно использовать в отношении полинуклеотидов. В качестве одного из примеров, если полинуклеотид, кодирующий полипептид, функционально связан с регуляторной последовательностью (например, промотором, энхансером, сайленсером и т.д.), термин означает, что полинуклеотидные последовательности соединяют таким образом, что возможна регулируемая экспрессия полипептида с полинуклеотида.

При использовании в отношении аминокислотных последовательностей (например, пептида, полипептида или белка) термин слияние или слитый относится к комбинированию двух или более аминокислотных последовательностей, например посредством химического связывания или рекомбинантными способами, в одну аминокислотную последовательность, несуществующую в природе. Слитую аминокислотную последовательность можно получать посредством генетической рекомбинации двух кодирующих полинуклеотидных последовательностей и экспрессировать ее посредством встраивания конструкции, содержащей рекомбинантные полинуклеотиды, в клетку-хозяина.

В рамках изобретения термин спейсер относится к искусственной аминокислотной последовательности, содержащей 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков или длиной от 5 до 15, 20, 30, 50 или более аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями и используемых для соединения одного или более полипептидов. Спейсер может иметь или не иметь вторичную структуру. В этой области известны последовательности спейсеров, см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al. Structure 2:1121-1123 (1994). Можно использовать любые подходящие спейсеры, известные в этой области. Например, спейсер, который можно использовать в настоящем изобретении, может быть богат остатками глицина и пролина. Примеры включают спейсеры, имеющие одну или повторяющиеся последовательности, состоящие из треонина/серина и глицина, такие как TGGGG (SEQ ID NO: 266), GGGGS (SEQ ID NO: 267) или SGGGG (SEQ ID NO: 268) или их тандемные повторы (например, 2, 3, 4 или более повторов). Альтернативно, спейсер может являться длинной пептидной цепью, содержащей один или более последовательных или тандемных повторов аминокислотной последовательности GAPGGGGGAAAAAGGGGG (SEQ ID NO: 269). В определенном варианте осуществления спейсер содержит 1, 2, 3, 4 или более последовательных или тандемных повторов SEQ ID NO: 269.

Термин антигенная специфичность относится к конкретному антигену или его эпитопу, селективно распознаваемому антигенсвязывающей молекулой.

В рамках изобретения термин замена в отношении аминокислотного остатка относится к природной или индуцированной замене одной или более аминокислот другой аминокислотой в пептиде, полипептиде или белке. Замена в полипептиде может приводить к снижению, повышению или устранению функции полипептида.

Замена также может являться консервативной заменой, что в отношении аминокислотной после- 15 045653 довательности относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со схожими физико-химическими свойствами, или замене аминокислот, не являющихся критичными для активности полипептида. Например, консервативные замены можно осуществлять среди аминокислотных остатков с неполярными боковыми цепями (например, Met, Ala, Val, Leu и Ile, Pro, Phe, Trp), остатков с незаряженными полярными боковыми цепями (например, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly и Gln), остатков с кислыми боковыми цепями (например, Asp, Glu), аминокислот с основными боковыми цепями (например, His, Lys и Arg), аминокислот с бета-разветвленными боковыми цепями (например, Thr, Val и Ile), аминокислот с серосодержащими боковыми цепями (например, Cys и Met) или остатков с ароматическими боковыми цепями (например, Trp, Tyr, His и Phe). В некоторых вариантах осуществления замены, делеции или добавления тоже можно считать консервативными заменами. Количество аминокислот, подвергаемых инсерции или делеции, может находиться в диапазоне приблизительно от 1 до 5. Как правило, консервативная замена не вызывает значительного изменения конформационной структуры белка, и, таким образом, белок может сохранять биологическую активность.

В рамках изобретения термин мутация или мутантный в отношении аминокислотного остатка относится к замене, инсерции или добавлению аминокислотного остатка.

В рамках изобретения термин гомологичная последовательность относится к полинуклеотидным последовательностям (или их комплементарным цепям) или аминокислотным последовательностям, имеющим идентичность последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) в отношении других последовательностей, необязательно, при выравнивании.

В рамках изобретения термин Т-клетка относится к типу лимфоцита, играющему ключевую роль в клеточном иммунитете, включая хелперные Т-клетки (например, CD4+ Т-клетки, Т-хелперы 1 типа, Тхелперы 2 типа, Т-хелперы 3 типа, Т-хелперы 17 типа), цитотоксические Т-клетки (например, CD8+ Тклетки), Т-клетки памяти (например, Т-клетки центральной памяти (ТСМ-клетки), Т-клетки эффекторной памяти (ТЕМ-клетки и TEMRA-клетки) и резидентные Т-клетки памяти (TRM), являющиеся CD8+ или CD4+), NKT-клетки и ингибиторные Т-клетки.

Нативный Т-клеточный рецептор или нативный TCR является гетеродимерным белком на поверхности Т-клетки, связывающимся с инвариантными цепями CD3 с образованием комплекса, способного опосредовать передачу сигнала. TCR принадлежит к супер семейству иммуноглобулинов и похож на половину антитела с одной тяжелой цепью и одной легкой цепью. Нативный TCR имеет внеклеточную часть, трансмембранную часть и внутриклеточную часть. Внеклеточный домен TCR содержит проксимальную к мембране константную область и дистальную к мембране вариабельную область.

В рамках изобретения термины индивидуум, или животное, или пациент относятся к человеку или не являющегося человеком животному, включая млекопитающего или примата, нуждающемуся в диагностике, прогнозировании, улучшении, профилактике и/или лечении заболевания или нарушения. Млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, и животных, содержащихся в зоопарках, спортивных животных или животных-питомцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, свиньи, коровы, медведи и т.д.

А. Полипептидный комплекс.

Настоящее изобретение относится к новым полипептидным комплексам, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи антитела, функционально связанный с первой константной областью Тклеточного рецептора (TCR), и вариабельный домен легкой цепи антитела, функционально связанный со второй константной областью TCR, где первая константная область TCR и вторая константная область TCR соединены по меньшей мере одной ненативной межцепочечной связью. Полипептидный комплекс содержит по меньшей мере две полипептидные цепи, каждая из которых содержит вариабельный домен, полученный из антитела, и константную область, полученную из TCR. Две полипептидные цепи полипептидных комплексов содержат пару из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, функционально связанную с парой константных областей TCR, соответственно. Примеры пар константных областей TCR включают, например, константные области TCR альфа/бета, преальфа/бета и гамма/дельта. Константные области TCR в полипептидных комплексах, представленных в настоящем описании, могут являться полноразмерными областями или фрагментами и могут быть сконструированы при условии, что пара константных областей TCR может связываться друг с другом с образованием димера.

Неожиданно обнаружили, что полипептидные комплексы, представленные в настоящем описании, по меньшей мере с одной ненативной межцепочечной связью (в частности, ненативной дисульфидной связью) могут рекомбинантно экспрессироваться и собираться в желаемой конформации, стабилизирующей димер константных областей TCR, обеспечивая хорошую антигенсвязывающую активность вариабельных областей антитела. Кроме того, обнаружили, что полипептидные комплексы хорошо переносят общепринятое конструирование антител, например, модификацию участков гликозилирования и удаление некоторых природных последовательностей. Кроме того, полипептидные комплексы, представленные в настоящем описании, можно включать в биспецифический формат, который легко может экспрессироваться и собираться с минимальным неправильным спариванием антигенсвязывающих после- 16 045653 довательностей или без него благодаря наличию в полипептидных комплексах константных областей

TCR. Дополнительные преимущества полипептидных комплексов и конструкций, представленных в настоящем описании, станут более очевидными из представленного ниже описания.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидным комплексам, содержащим первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Т-клеточного рецептора (TCR), и второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где: С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность.

i. Константная область TCR.

Полипептидные комплексы, представленные в настоящем описании, содержат константные области, полученные из TCR.

Нативный TCR состоит из двух полипептидных цепей и, в основном, имеет два типа: один состоит из альфа- и бета-цепей (т.е. TCR альфа/бета), а другой состоит из гамма- и дельта-цепей (т.е. TCR гамма/дельта). Эти два типа структурно схожи, но имеют разную локализацию и функции. Приблизительно 95% Т-клеток человека имеют TCR альфа/бета, в то время как остальные 5% имеют TCR гамма/дельта. Также обнаруживают предшественника альфа-цепи, и он назван пре-альфа-цепь. Каждая из двух полипептидных цепей TCR содержит иммуноглобулиновый домен и проксимальную к мембране область. Иммуноглобулиновая область содержит вариабельную область и константную область и отличается наличием укладки иммуноглобулинового типа. Каждая полипептидная цепь TCR содержит остаток цистеина (например, на С-конце константного домена или N-конце проксимальной к мембране области), который вместе с соответствующим остатком может образовывать дисульфидную связь, соединяющую две цепи TCR.

На фиг. 18А-18Е приведены аминокислотные последовательности нативных константных областей альфа-, пре-альфа-, бета-, гамма- и дельта-цепей TCR. Для ясности, каждый из аминокислотных остатков в этих последовательностях пронумерован на фиг. 19А-19Е, и такую нумерацию используют на всем протяжении настоящего описания для обозначения конкретного аминокислотного остатка в конкретной константной области TCR.

Константная область альфа-цепи TCR человека известна как TRAC с регистрационным номером NCBI P01848 или аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 254.

Константная область бета-цепи человека TCR имеет два разных варианта, известных как TRBC1 и TRBC2 (номенклатура IMGT), при этом соответствующие последовательности приведены как SEQ ID NO: 256 и SEQ ID NO: 257, соответственно (также см. Toyonaga В, et al., PNAs, Vol. 82, pp. 8624-8628, Immunology (1985)). Эти два константных домена бета-цепи отличаются 4-м, 5-м и 37-м аминокислотными остатками экзона 1. В частности, TRBC1 содержит 4N, 5K и 37F в экзоне 1, и TRBC2 содержит 4K, 5N и 37Y в экзоне 1.

В частности, нативная бета-цепь TCR содержит нативный остаток цистеина в положении 74 (см. фиг. 19В), являющийся неспаренным и, таким образом, необразующим дисульфидную связь в нативном TCR альфа/бета. В некоторых вариантах осуществления этот нативный остаток цистеина отсутствует в полипептидных комплексах, представленных в настоящем описании, или подвергнут мутации в другой остаток. Это может быть полезным во избежание неправильного внутрицепочечного или межцепочечного спаривания. В некоторых вариантах осуществления нативный остаток цистеина заменяют другим остатком, например, серином или аланином. В некоторых вариантах осуществления замена может улучать эффективность рефолдинга TCR in vitro.

Константные области гамма-цепи TCR человека имеют два варианта, известные как TRGC1 и TRGC2 (см. Lefranc et al., Eur. J. Immunol. 19:989-994 (1989)) с регистрационными номерами NCBI A26659 и Р03986, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 263 и SEQ ID NO: 265, соответственно.

Константная область дельта-цепи TCR человека известна как TRDC с регистрационным номером NCBI A35591 или аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 261.

Константную область TCR в полипептидных комплексах, представленных в настоящем описании, также можно получать из антигенного рецептора пре-Т-клеток (пре-TCR). Пре-TCR экспрессируется незрелыми тимоцитами, играющими ключевую роль в раннем развитии Т-клеток. Пре-TCR имеет обычную бета-цепь, но специальную пре-альфа-цепь только с константной областью, последовательность и структура которой отличаются от обычной альфа-цепи (см. Harald von Boehmer, Nat Rev Immunol, Jul; 5(7):571-7 (2005)). Последовательность константной области пре-альфа-цепи человека (PTCRA) имеет регистрационный номер NCBI AAF89556.1 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 259.

В рамках изобретения первая и вторая константные области TCR полипептидных комплексов, представленных в настоящем описании, могут образовывать димер между константными областями TCR, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь, которая может стабилизи- 17 045653 ровать димер.

В рамках изобретения термин димер относится к связанной структуре, образованной двумя молекулами, такими как полипептиды или белки, посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Гомодимер образован двумя идентичными молекулами, и гетеродимер образован двумя разными молекулами. Димер, образованный первой и второй константными областями TCR, является гетеродимером.

Межцепочечная связь образуется между одним аминокислотным остатком на одной константной области TCR и другим аминокислотным остатком на другой константной области TCR. В некоторых вариантах осуществления ненативная межцепочечная связь может являться любой цепью или взаимодействием, посредством которого можно соединять две константные области TCR в димер. Примеры подходящей ненативной межцепочечной связи включают дисульфидную связь, водородную связь, электростатическое взаимодействие, соляной мостик или гидрофобно-гидрофильное взаимодействие, выступы-во-впадины или их комбинацию.

Термин дисульфидная связь относится к ковалентной связи со структурой R-S-S-R'. Аминокислота цистеин содержит тиоловую группу, которая может образовывать дисульфидную связь со второй тиоловой группой, например другого остатка цистеина. Дисульфидная связь может образовываться между тиоловыми группами двух остатков цистеина, находящихся, соответственно, на двух полипептидных цепях, таким образом, образующих межцепочечный мостик или межцепочечную связь.

Электростатическое взаимодействие является нековалентным взаимодействием, важно для фолдинга, стабильности, гибкости и функции белка и включает ионные взаимодействия, водородную связь и галогенную связь. Электростатическое взаимодействие может происходить в полипептиде, например, между Lys и Asp, между Lys и Glu, между Glu и Arg или между Glu, Trp на первой цепи и Arg, Val или Thr на второй цепи.

Соляной мостик является электростатическим взаимодействием ближнего диапазона, в основном, возникающим между анионом карбоксилата Asp или Glu и катионом аммония Lys или гуанидиния Arg, являющихся пространственно проксимальными парами противоположно заряженных остатков в нативных белковых структурах. Заряженные и полярные остатки в, главным образом, гидрофобных областях контакта могут действовать в качестве горячих точек для связывания. Среди прочих, остатки с ионизируемыми боковыми цепями, такие как His, Tyr и Ser, HYPERLINK также могут участвовать в образовании солевого мостика.

Гидрофобное взаимодействие может происходить между одним или более из Val, Tyr и Ala на первой цепи и одним или более из Val, Leu и Trp на второй цепи или His и Ala на первой цепи и Thr и Phe на второй цепи (см. Brinkmann, et al., 2017, выше).

Водородная связь образуется посредством электростатического притяжения между двумя полярными группами, когда атом водорода ковалентно связан с высоко электроотрицательным атомом, таким как азот, кислород или фтор. Водородная связь может образовываться в полипептиде между атомами кислорода остова (например, халькогенными группами) и атомами водорода амида (азот-содержащей группы) двух остатков, соответственно, такими как азот-содержащая группа в Asn и кислородсодержащая группа в His, или кислород-содержащая группа в Asn и азот-содержащая группа в Lys. Водородная связь сильнее вандерваальсова взаимодействия, но слабее ковалентной или ионной связи и является ключевой для поддержания вторичной структуры и третичной структуры. Например, альфа-спираль образуется, когда аминокислотные остатки расположены равномерно между положениями i и i+4, и беталист является тяжем пептидной цепи длиной 3-10 аминокислот, образующимся, когда два пептида, соединенные по меньшей мере двумя или тремя водородными связями остова, образуют скрученный, складчатый лист.

В рамках изобретения термин выступы-во-впадины относится к взаимодействию между двумя полипептидами, где один полипептид имеет выпуклость (т.е. выступ) благодаря наличию аминокислотного остатка, имеющего объемную боковую цепь (например, тирозин или триптофан), а другой полипептид имеет полость (т.е. впадину), где находится аминокислотный остаток с небольшой боковой цепью (например, аланин или треонин), и выпуклость располагается в полости таким образом, что способствует взаимодействию двух полипептидов с образованием гетеродимера или комплекса. В этой области известны способы получения полипептидов с выступами-во-впадины, например, как описано в патенте США № 5731168.

В некоторых вариантах осуществления димер константных областей TCR содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ненативных межцепочечных связей. Необязательно, по меньшей мере одна из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ненативных межцепочечных связей является дисульфидной связью, водородной связью, электростатическим взаимодействием, соляным мостиком, гидрофобн-гидрофильным взаимодействием или любой их комбинацией.

В рамках изобретения термин ненативная межцепочечная связь относится к межцепочечной связи, необнаруживаемой при нативном соединении соответствующих нативных константных областей TCR. Например, ненативная межцепочечная связь может образовываться между мутантным аминокислотным остатком и нативным аминокислотным остатком, каждый из которых находится в соответст- 18 045653 вующей константной области TCR; или, альтернативно, между двумя мутантными аминокислотными остатками, находящимися в соответствующих константных областях TCR. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна ненативная межцепочечная связь образуется между первым мутантным остатком, содержащимся в первой константной области TCR, и вторым мутантным остатком, содержащимся во второй константной области TCR полипептидного комплекса.

Термин мутантный аминокислотный остаток относится к остатку, представляющему собой замену, инсерцию или добавление и отличающемуся от соответствующего нативного остатка в соответствующей нативной константной области TCR. Например, если аминокислотный остаток в конкретном положении константной области TCR дикого типа обозначают как нативный остаток, то соответствующий ему мутантный остаток является любым остатком, отличающимся от нативного остатка, но находящимся в том же положении константной области TCR. Мутантный остаток может являться иным остатком, которым заменяют нативный остаток в том же положении или который встраивают перед нативным остатком, и, таким образом, он занимает его исходное положение.

В некоторых вариантах осуществления мутантный остаток может являться природным аминокислотным остатком. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из первого и второго ненативных аминокислотных остатков является мутантным остатком цистеина. В некоторых вариантах осуществления одна или более из ненативных межцепочечных связей является дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления ненативная дисульфидная связь может образовываться между двумя мутантными остатками цистеина, содержащимися в первой и второй константных областях TCR, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из первого и второго мутантных остатков является неприродным аминокислотным остатком. Термин неприродный аминокислотный остаток относится к аминокислотному остатку, необнаруживаемому в природе в белках человека, но который может экспрессироваться с помощью кодона нуклеиновой кислоты, который можно встраивать в кодирующий полинуклеотид. Например, неприродная аминокислота, такая как L-3,4дигидроксифенилаланин (L-DOPA), может реагировать и перекрестно сшиваться с природными аминокислотами, такими как цистеин, гистидин и лизин, при периодат-индуцированном окислении. Показано, что при встраивании L-DOPA в антитело неприродная аминокислота могла эффективно перекрестно сшиваться с остатками на антигене, что приводит к образованию ковалентно связанного комплекса антитело-антиген (Xu, J. et al., 2014, Structure-based non-canonical amno acid design to covalently crosslink antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology, 185(2), pp. 215-222). В настоящем описании предусмотрено, что мутантный аминокислотный остаток в первой и/или второй константных областях TCR может содержать неприродный аминокислотный остаток, такой как L-DOPA, который может перекрестно сшиваться с природным аминокислотным остатком (или, альтернативно, неприродным аминокислотным остатком) с образованием ненативной межцепочечной ковалентной связи.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна ненативная дисульфидная связь образуется между мутантным остатком цистеина и нативным остатком цистеина. В некоторых вариантах осуществления ненативные дисульфидные связи образуются между двумя мутантными остатками цистеина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из остатков цистеина, образующих ненативную дисульфидную связь, является мутантным остатком цистеина. В некоторых вариантах осуществления оба остатка цистеина, образующих ненативную дисульфидную связь являются мутантными остатками цистеина на первой и второй константных областях TCR, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первую и/или вторую константные области TCR можно конструировать так, чтобы они содержали один или более мутантных аминокислотных остатков, отвечающих за образование ненативной межцепочечной связи. Для встраивания такого мутантного остатка в константную область TCR можно воздействовать на кодирующую последовательность области TCR, например, для замены кодона, кодирующего нативный остаток, кодоном, кодирующим мутантный остаток, или для инсерции кодона, кодирующего мутантный остаток, перед кодоном нативного остатка. В константную область TCR можно встраивать один или более желаемых мутантных аминокислотных остатков, например, один или более аминокислотных остатков (например, остатков цистеина), способных образовывать дисульфидную связь, которые могут приводить к электростатическим взаимодействиям между двумя константными областями TCR, которые могут повышать гибкость константных областей TCR, которые могут способствовать расположению по меньшей мере одной аминокислоты, образующей ковалентную связь, такую как водородная связь, вдали от константного домена TCR, которые могут участвовать в образовании солевого мостика; гидрофобных аминокислотных остатков, которые могут приводить к гидрофобным взаимодействиям; и гидрофильных аминокислотных остатков, которые могут приводить к гидрофильным взаимодействиям, и т.д.

В некоторых вариантах осуществления первую и/или вторую константные области TCR можно конструировать так, чтобы они содержали один или более мутантных остатков цистеина. Например, остаток не-цистеина можно заменять остатком цистеина, или остаток цистеина можно встраивать между двумя исходно смежными нативными остатками не-цистеина. Положения замены можно определять таким образом, что после замены остатками цистеина может образовываться ненативная межцепочечная

- 19 045653 дисульфидная связь между двумя константными областями TCR. В связи с этим, можно учитывать множество факторов, например, остатки цистеина, образующие дисульфидную связь, могут находиться достаточно близко друг к другу, могут иметь подходящую ориентацию связи альфа-бета, тиоловые группы остатков цистеина могут быть ориентированы друг к другу, остаток, подлежащий замене, может иметь боковую цепь с химическими свойствами, относительно схожими с боковой цепью остатка цистеина, и/или замена не будет значительно менять третичную структуру константной области TCR или самого полипептидного комплекса.

Специалист в этой области может определять расстояние и угол между двумя аминокислотными остатками, подлежащими замене, подходящими известными в этой области способами, в качестве неограничивающих примеров, расстояние определяют посредством фотодетектирования, компьютерного моделирования, ЯМР-спектроскопии или рентгеновской кристаллографии. В иллюстративном примере в случае интересующего полипептида (такого как константная область TCR) его белковую кристаллическую структуру можно получать в общедоступных базах данных, таких как база данных PDB, или, альтернативно, выявлять такими способами, как рентгеновская кристаллография. Для определения расстояний и углов между аминокислотными остатками с учетом данных о белковой кристаллической структуре можно использовать подходящее компьютерное программное обеспечение. В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, дисульфидная связь может образовываться между мутантными остатками цистеина, имеющими достаточно близко расположенные соответствующие бета-атому углерода, например, с расстоянием менее 8 ангстрем, 7 ангстрем, 6 ангстрем, 5 ангстрем, 4 ангстрем, 3 ангстрем, 2 ангстрем, 1 ангстрем или менее, если комплекс правильно свернут.

Дополнительные подходящие положения для конструирования в первой и/или второй константных областях TCR можно получать из данных о кристаллической структуры, опубликованных для комплекса между TCR альфа и бета (Boulter, J.M. et al., Protein engineering, 16(9), pp.707-711 (2003)) или гамма и дельта (Allison, T.J. et al., Nature, 411(6839), pp. 820-824 (2001); Uldrich, A.P. et al., Nature Immunology, 14(11), pp. 1137-1145 (2013)). После определения остатка, подлежащего замене, специалист легко может определять встроенный кодон, подлежащий мутации (например, посредством выравнивания последовательностей с использованием существующего программного обеспечения, такого как ClustalW (веб-сайт European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk/index.html)), а затем подвергать его мутагенезу в кодон для цистеина известными в этой области способами, такими как ПЦР-мутагенез.

Образование межцепочечной дисульфидной связи можно определять подходящими, известными в этой области способами. Например, экспрессируемый белковый продукт можно подвергать электрофорезу в ПААГ в присутствии SDS в восстановительных и невосстановительных условиях, соответственно, с последующим сравнением полученных полос для идентификации потенциальных различий, свидетельствующих о наличии межцепочечной дисульфидной связи.

Ненативная межцепочечная связь может стабилизировать полипептидный комплекс. Такие эффекты стабилизации можно воплощать различными способами. Например, наличие мутантного аминокислотного остатка или ненативная межцепочечная связь могут позволить полипептидному комплексу стабильно экспрессироваться, и/или экспрессироваться на высоком уровне, и/или соединяться в стабильный комплекс, имеющий желаемую биологическую активность (например, антигенсвязывающую активность), и/или экспрессироваться на высоком уровне и собираться в желаемый стабильный комплекс, имеющий желаемую биологическую активность. Способность межцепочечной связи стабилизировать первую и вторую константные области TCR можно оценивать подходящими, известными в этой области способами, например, по молекулярной массе, определяемой посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, или термостабильности, измеряемой посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) или дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). В иллюстративном примере образование стабильного полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, можно подтверждать посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, если продукт демонстрирует молекулярную массу, сравнимую с комбинированной молекулярной массой первого и второго полипептидов. В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, является стабильным в том смысле, что его термостабильность составляет не менее 50%, 60%, 70%, 80% или 90% термостабильности природного Fab. В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, является стабильным в том смысле, что его термостабильность сравнима с термостабильностью природного Fab.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что ненативная межцепочечная связь (такая как дисульфидная связь), образованная между первой и второй константными областями TCR в полипептидных комплексах, может стабилизировать гетеродимер константных областей TCR, таким образом, повышая уровень правильного фолдинга, структурную стабильность и/или уровень экспрессии гетеродимера и полипептидных комплексов. В отличие от нативного TCR, заякоренного в мембране поверхности Т-клетки, обнаружено, что гетеродимеры нативных внеклеточных доменов TCR являются гораздо менее стабильными, несмотря на их сходство с антителом Fab по трехмерной структуре. Фактически, нестабильность нативного TCR в растворимом состоянии являлась значительным препятствием для

- 20 045653 определения его кристаллической структуры (см. Wang, Protein Cell, 5(9), pp. 649-652(2014)). Встраивая пару цистеиновых (Cys) мутаций в константных областях TCR и, таким образом, делая возможным образование межцепочечной ненативной дисульфидной связи, можно стабильно экспрессировать полипептидные комплексы, в то же время сохраняя антигенсвязывающую способность вариабельной области антитела.

Константную область TCR, содержащую мутантный остаток, в настоящем описании также обозначают как сконструированную константную область TCR. В некоторых вариантах осуществления первая константная область TCR (C1) полипептидного комплекса содержит сконструированную альфа-цепь TCR (С-альфа), и вторая константная область TCR (C2) содержит сконструированную бета-цепь TCR (Cбета). В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-альфа. В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную пре-альфа-цепь TCR (С-пре-альфа), и С2 содержит сконструированную С-бета. В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-преальфа. В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную гамма-цепь TCR (Сгамма), и С2 содержит сконструированную дельта-цепь TCR (С-дельта). В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-дельта, и С2 содержит сконструированную С-гамма.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная константная область TCR содержит один или более мутантных остатков цистеина. В некоторых вариантах осуществления один или более мутантных остатков содержатся в области контакта первой и/или второй сконструированных константных областей TCR.

В рамках изобретения термин область контакта относится к конкретным областям на полипептидах, в которых полипептиды взаимодействуют/соединяются друг с другом. Область контакта содержит один или более аминокислотных остатков, способных взаимодействовать с соответствующими аминокислотными остатками, контактирующими или соединяющимися, когда происходит взаимодействие. Аминокислотные остатки в области контакта могут находиться или не находиться в непрерывной последовательности. Например, если область контакта является трехмерной, аминокислотные остатки в области контакта могут быть разделены по разным положениям в линейной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127. В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 6-29, 37-67 и 86-95. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков в константной области TCR по настоящему изобретению является такой, как представлено на фиг. 19А-19Е.

В некоторых вариантах осуществления одна или более дисульфидных связей могут образовываться между сконструированной С-альфа и сконструированной С-бета. Мутантный остаток цистеина в С-бета может представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из S56C, S16C, F13C, V12C, Е14С, F13C, L62C, D58C, S76C и R78C, и/или мутантные остатки цистеина в С-альфа могут представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из Т49С, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, т46С, L51C и S62C. В некоторых вариантах осуществления пара мутантных остатков цистеина может представлять собой пару замен, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и Y11C в С-альфа, F13C в С-бета и L13C в С-альфа, S16C в С-бета и L13C в С-альфа, V12C в С-бета и S16C в С-альфа, Е14С в С-бета и S16C в Сальфа, F13C в С-бета и V23C в С-альфа, L62C в С-бета и Y44C в С-альфа, D58C в С-бета и Т46С в Сальфа, S76C в С-бета и Т46С в С-альфа, S56C в С-бета и Т49С в С-альфа, S56C в С-бета и L51C в Сальфа, S56C в С-бета и S62C в С-альфа и R78C в С-бета и S62C в С-альфа, и где пара остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь.

В рамках изобретения на всем протяжении настоящей заявки термин XnY в отношении константной области TCR предназначен для обозначения того, что n-й аминокислотный остаток X в константной области TCR (с учетом нумерации на фиг. 19А-19Е, как представлено в настоящем описании) заменяют аминокислотным остатком Y, где X и Y, соответственно, представляют собой однобуквенное обозначение конкретного аминокислотного остатка. Следует отметить, что число п основано исключительно на нумерации, представленной на фиг. 19А-19Е, и оно может отличаться от его точного положения. В качестве иллюстративного примера используют последовательность С-бета (S56C) (N69Q), приведенную в SEQ ID NO: 34. Хотя замена S на С находится в 48-м остатке в SEQ ID NO: 34, сам остаток обозначают как 56-ой остаток с учетом системы нумерации на фиг. 19А-19Е, и, таким образом, замену S на С обозначают как S56C, а не S48C. Аналогично, замену N на Q также обозначают как N69Q с учетом системы нумерации на фиг. 19А-19Е. Если не указано иначе, это правило обозначения замен аминокислотных остатков используют по отношению ко всей константной области TCR в настоящем описании. Аналогично, термин XnY при использовании в отношении Fc-области предназначен для обозначения того, что n-й аминокислотный остаток X в константной области Fc (с учетом нумерации на фиг. 20A-20D, как представлено в настоящем описании) заменяют аминокислотным остатком Y.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 33-41, и сконструированная С-альфа содержит или представляет собой любую

- 21 045653 из SEQ ID NO: 43-48.

В некоторых вариантах осуществления одна или более ненативных дисульфидных связей могут образовываться в областях контакта между С-пре-альфа и С-бета. В некоторых вариантах осуществления область контакта на С-пре-альфа выбрана из замен в положении аминокислотных остатков 7-19, 26-34, 56-75 и 103-106. В некоторых вариантах осуществления область контакта на С-бета выбрана из замен в положении аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127.

В некоторых вариантах осуществления одна или более дисульфидных связей могут образовываться между сконструированной константной областью альфа-цепи пре-TCR (С-пре-альфа) и константной областью бета-цепи (С-бета). Мутантные остатки цистеина в С-бета могут представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из S16C, А18С, Е19С, F13C, А11С, S56C и S76C, и/или мутантные остатки цистеина в С-пре-альфа могут представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из S11C, А13С, I16C, S62C, Т65С и Y59. В некоторых вариантах осуществления пара мутантных остатков цистеина может представлять собой пару замен, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и S11C в Спре-альфа, А18С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, Е19С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, F13C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, S16C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, А11С в С-бета и I16C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и Т65С в С-пре-альфа и S76C в С-бета и Y59C в С-преальфа, и где пара мутантных остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 33-41, и сконструированная С-пре-альфа содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 82 и 83.

В некоторых вариантах осуществления одна или более ненативных дисульфидных связей могут образовываться в областях контакта между С-гамма и С-дельта. В некоторых вариантах осуществления область контакта на С-гамма выбрана из замен в положениях аминокислотных остатков 11-35 и 55-76. В некоторых вариантах осуществления область контакта на С-дельта выбрана из замен в положениях аминокислотных остатков 8-26, 43-64 и 84-88.

В некоторых вариантах осуществления одна или более дисульфидных связей могут образовываться между сконструированными С-гамма и С-дельта. Мутантный остаток цистеина в С-гамма может представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из S17C, Е20С, F14C, Т12С, М62С, Q57C и А19С, и/или мутантные остатки цистеина в С-дельта могут представлять собой замену, выбранную из группы, состоящей из F12C, М14С, N16C, D46C, V50C, F87C и Е88С. В некоторых вариантах осуществления пара мутантных остатков цистеина может представлять собой пару замен, выбранных из группы, состоящей из S17C в С-гамма и F12C в С-дельта, Е20С в С-гамма и F12C в С-дельта, F14C в С-гамма и М14С в С-дельта, Т12С в С-гамма и N16C в С-дельта, М62С в С-гамма и D46C в С-дельта, Q57C в Сгамма и V50C в С-дельта, А19С в С-гамма и F87C в С-дельта и А19С в С-гамма и Е88С в С-дельта, и где встроенная пара остатков цистеина может образовывать межцепочечную дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-гамма содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 113 и 114, и сконструированная С-дельта содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 115 и 116.

В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к ненативному аминокислотному остатку, сконструированная константная область TCR может дополнительно содержать дополнительную модификацию в одном или более нативных остатках в последовательности константной области TCR дикого типа. Примеры такой дополнительной модификации включают, например, модификацию нативного остатка цистеина, модификацию нативного участка гликозилирования и/или модификацию нативной петли.

Некоторые нативные константные области TCR (такие как С-бета) содержат нативный остаток цистеина, который в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно модифицировать (например, удалять) или, альтернативно, можно сохранять в некоторых других вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления нативная дисульфидная связь в гетеродимерном TCR альфа/бета между константными доменами TRAC и TRBC1 или TRBC2, т.е. между Cys4 экзона 2 TRAC и Cys2 экзона 2 TRBC1 или TRBC2 в соответствии с номенклатурой IMGT TCR, может присутствовать или отсутствовать.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нативный остаток цистеина отсутствует или присутствует в сконструированной С-бета. Например, нативный остаток цистеина в положении С74 С-бета может присутствовать или отсутствовать в сконструированной С-бета. В некоторых вариантах осуществления сконструированная С-бета, в которой отсутствует нативный остаток цистеина С74, содержит или представляет собой любую из SEQ ID NO: 32-41.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании является предпочтительным, т.к. он выдерживает и присутствие, и отсутствие нативного остатка цистеина в С-бета. Хотя предполагали (см., например, патент США № 7666604), что наличие нативных остатков цистеина в растворимых гетеродимерах TCR является неблагоприятным для способности TCR связывать лиганд, полипептидный комплекс, представленный в настоящем описа- 22 045653 нии, может выдерживать наличие этого нативного остатка цистеина без отрицательного влияния на его антигенсвязывающую активность. Кроме того, полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, в отсутствие нативного остатка цистеина экспрессировался на высоком уровне, несмотря на то, что в Wu et al. mAbs, 7(2), pp. 364-376 (2005) описано противоположное, а именно, что нативная дисульфидная связь в гетеродимере TCR подходит для стабилизации гетеродимера TCR.

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, можно модифицировать (например, удалять) или сохранять один или более нативных участков гликозилирования, присутствующих в нативных константных областях TCR. В рамках изобретения термин участок гликозилирования в отношении полипептидной последовательности относится к аминокислотному остатку с боковой цепью, к которой можно присоединять молекулу углевода (например, олигосахаридную структуру). Гликозилирование полипептидов, подобных антителам, как правило, является N-связанным или О-связанным. Термин N-связанный'' относится к присоединению молекулы углевода к боковой цепи остатка аспарагина, например, остатка аспарагина в трипептидной последовательности, такой как аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X является любой аминокислотой, за исключением пролина. Термин О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из Сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего, к серину или треонину. Удаление нативных участков гликозилирования можно осуществлять посредством изменения аминокислотной последовательности таким образом, что заменяют одну или более из описанных выше трипептидных последовательностей (в случае участков N-связанного гликозилирования) или одного или более остатков серина или треонина (в случае участков О-связанного гликозилирования).

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, в сконструированных константных областях TCR, например, в первой и/или второй константных областях TCR, отсутствует или присутствует по меньшей мере один нативный участок гликозилирования. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, может выдерживать удаление всех или части участков гликозилирования без влияния на экспрессию и стабильность белка, в отличие от существующего мнения о том, что наличие участков N-связанного гликозилирования в константной области TCR, такой как С-альфа (т.е. N34, N68 и N79) и С-бета (т.е. N69), необходимо для экспрессии и стабильности белка (см. Wu et al., Mabs, 7:2, 364-376, 2015).

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, в сконструированной С-альфа отсутствует или присутствует по меньшей мере один из участков N-гликозилирования, например, N34, N68, N79 и N61. В некоторых вариантах осуществления сконструированные последовательности С-альфа, в которых отсутствует участок гликозилирования, содержат или представляют собой любую из SEQ ID NO: 44-48. В некоторых вариантах осуществления в сконструированной С-бета отсутствует или присутствует по меньшей мере один из участков Nгликозилирования, например, N69. Сконструированные последовательности С-бета (TRBC1), в которых отсутствует участок гликозилирования, содержат или представляют собой любую из SEQ ID NO: 34-36. Сконструированные последовательности С-бета (TRBC2), в которых отсутствует участок гликозилирования, содержат или представляют собой любую из SEQ ID NO: 38-40.

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, в сконструированной С-пре-альфа отсутствует или присутствует по меньшей мере один из участков N-гликозилирования, например, N50. Сконструированная последовательность С-пре-альфа, в которой отсутствует участок гликозилирования, содержит или представляет собой SEQ ID NO: 83.

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании в сконструированной С-гамма отсутствует или присутствует по меньшей мере один из участков N-гликозилирования, например N65. В некоторых вариантах осуществления последовательность сконструированной С-гамма, в которой отсутствует участок гликозилирования, содержит или представляет собой SEQ ID NO: 114. В некоторых вариантах осуществления в сконструированной С-дельта отсутствует или присутствует по меньшей мере один из участков N-гликозилирования, например, N16 и N79. Последовательность сконструированной С-дельта, в которой отсутствует участок гликозилирования, содержит или представляет собой SEQ ID NO: 116.

В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, можно модифицировать (например, удалять) или сохранять одну или более нативных вторичных структур, присутствующих в нативных константных областях TCR. В некоторых вариантах осуществления в полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, модифицируют (например, удаляют) или сохраняют нативную петлю (такую как петля FG и/или DE петля нативной С-бета). Термин петля FG и петля DE означает структуры, в основном, обнаруживаемые в константном домене бета-цепи TCR. Петля FG включает аминокислотные остатки 101-117 нативной С-бета и является необычно удлиненным, гидрофильным структурным элементом, образующим один из компонентов полости TCR альфа/бета против CD3. Петля DE включает аминокислотные остатки 66-71 нативной С-бета. Выравнивание последовательности константной области бета-цепи TCR с последовательностью константной области СН1 иммуноглобулина показало, что петля FG константной области бета-цепи TCR

- 23 045653 является значительно более длинной. На фиг. 3 показаны различия константных областей между бетацепью Т-клеточного рецептора и тяжелой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления последовательность в петеле FG (YGLSENDEWTQDRAKPVT, SEQ ID NO: 79) отсутствует и/или заменена YPSN (SEQ ID NO: 80). В некоторых вариантах осуществления последовательность в нативной цепи DE (QPALNDSR, SEQ ID NO: 88) отсутствует и/или заменена QSGR (SEQ ID NO: 87). В некоторых вариантах осуществления последовательности С-бета, в которых отсутствует нативная петля FG, содержат или представляют собой любую из SEQ ID NO: 37-40. В некоторых вариантах осуществления последовательность С-бета, в которой отсутствуют и нативная петля FG, и нативная петля DE, содержит или представляет собой SEQ ID NO: 41.

В полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, константные области, полученные из TCR, функционально связаны с вариабельными областями, полученными из антитела. Вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела можно функционально связывать с константной областью TCR с использованием спейсера или без него.

В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен (VH) антитела подвергают слиянию с первой константной областью TCR (C1) в первом соединительном домене, первый вариабельный домен (VL) антитела подвергают слиянию со второй константной областью TCR (C2) во втором соединительном домене.

В рамках изобретения термин соединительный домен относится к пограничной области, где две аминокислотные последовательности подвергают слиянию или комбинируют. В некоторых вариантах осуществления соединительный домен содержит по меньшей мере часть С-концевого фрагмента из первого партнера по слиянию, слитый по меньшей мере с частью N-концевого фрагмента из второго партнера по слиянию с использованием спейсера между ними или без него. В таких вариантах осуществления соединительный домен содержит фрагменты обоих партнеров по слиянию, и точка слияния находится там, где два фрагмента соединены друг с другом, например, напрямую или через спейсер. В некоторых других вариантах осуществления соединительный домен состоит из фрагмента одного из партнеров по слиянию. В таких вариантах осуществления точка слияния может находиться на любом конце соединительного домена.

В некоторых вариантах осуществления первый соединительный домен содержит по меньшей мере часть С-концевого фрагмента область соединения V/C антитела и по меньшей мере часть N-концевого фрагмента область соединения V/C TCR.

В рамках изобретения термин область соединения V/C антитела относится к границе вариабельного домена и константного домена антитела, например, границе между вариабельным доменом тяжелой цепи и доменом СН1 или между вариабельным доменом легкой цепи и константным доменом легкой цепи. Аналогично, термин область соединения V/C TCR относится к границе вариабельного домена и константного домена TCR, например, границе между вариабельным доменом и константным доменом альфа-цепи TCR или между вариабельным доменом и константным доменом бета-цепи TCR.

Если область Fv иммуноглобулина выравнивают с иммуноглобулино-подобным доменом TCR, также будут выравнивать область соединения V/C антитела и область соединения V/C TCR. Пример приведен в табл. 1 ниже, где область соединения V/C тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 270) выравнивают с областью соединения V/C бета-цепи TCR (SEQ ID NO: 271) и область соединения V/C легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 272) выравнивают с областью соединения V/C бета-цепи TCR (SEQ ID NO: 273).

Первый и/или второй соединительные домены полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, можно выбирать таким образом, чтобы они содержали фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) С-концевого фрагмента области соединения V/C антитела и фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) N-концевого фрагмента области соединения V/C TCR. Например, как показано в табл. 1, соединительный домен можно выбирать так, чтобы он содержал всю последовательность области соединения V/C TCR (см., например, SEQ ID NO: 145), или большую часть последовательности (см., например, SEQ ID NO: 147), или некоторую часть последовательности (см., например, SEQ ID NO: 146) области соединения V/C TCR. В табл. 1 также показано, что соединительный домен может содержать больше остатков из области соединения V/C TCR, чем из области соединения V/C антитела (см., например, SEQ ID NO: 147), или наоборот (см., например, SEQ ID NO: 146).

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй соединительные домены полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, имеют общую длину, сравнимую с длиной области соединения V/C антитела или области соединения V/C TCR.

Соответствующий соединительный домен можно определять с учетом структуры. Например, можно накладывать трехмерные структуры антитела и TCR, определять перекрывание области соединения V/C антитела и области соединения V/C TCR и учитывать его при определении длины или доли последовательностей области соединения V/C антитела или TCR.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй соединительный домен содержит спейсер между фрагментами из области соединения V/C антитела и области соединения V/C TCR. Можно использовать любые подходящие последовательности или длину спейсера при условии, что они не

- 24 045653 влияют отрицательно на связывание антигена или стабильность полипептидного комплекса.

Примеры последовательностей границы вариабельного/константного домена антитела, границы вариабельного/константного домена TCR и вариабельного домена антитела/константной области TCR представлены ниже в табл. 1-6.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-альфа. В качестве иллюстративного примера, в табл. 1 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-бета TCR, или VL антитела, слитого с С-альфа TCR. Границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена/С-бета TCR, и границу VL антитела/константного домена выравнивают по границе вариабельного домена/С-альфа TCR. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 144, 145, 146 или 147), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 51 или 52.

Таблица 1

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-С-бета/VL-С-альфа

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабельн ый домен	Константа ый домен		Вариабельны й домен	Константный домен
VH антитела SEQ ID NO: 270	......LVTVS S	AS- TKGPS...	VL антитела SEQ ID NO: 272	......KVEIK	RTVAAPSVF
ТСК_бета SEQ ID NO: 271	......RLTV LE	DLKNVF РРЕ......	ТСК_альфа SEQ ID NO: 273	......KLIIK	PDIQNPDPA
Нобласть соединени_1 SEQ ID NO: 144	......LVTVS S	ASKNVF РРЕ......	L_ область соединения_ 1 SEQ ID NO: 146	......KVEIK	RTVAAPDP А......
H_ область соединения_ 2	......LVTV LE	DLKNVF РРЕ......	L_ область соединения2	......KVEIK	PDIQNPDPA
SEQ ID NO: 145			SEQ ID NO: 147

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета. В табл. 2 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-альфа TCR, или для VL антитела, слитого с С-бета TCR. Границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-альфа, и границу VL антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-бета. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 148, 149 или 150), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 129 или 130. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50.

- 25 045653

Таблица 2

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-C-альфа/VL-С-бета

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабе льный домен	Константны й домен		Вариабел ьный домен	Константный домен
Антитело_Н SEQ ID NO: 274	......LVT VSS	ASTKGPS...	Антитело_Е SEQ ID NO: 276	......KVEI К-	RT— VAAPSVF...
ТСй_альфа SEQ ID NO: 275	......KLI IK -	PDIQNPDP А......	ТСй_бета SEQ ID NO: 277	......RLT VLE	DLKNVFPPE
Нобласть соединенияЗ SEQ ID NO: 148	......LVT VSS	ASIQNPDP А......	L_ область соединенияЗ SEQ ID NO: 150	......KVEI KLE	DLKNVFPPE
H_ область соединения _4 SEQ ID NO: 149	......LVT VSS	PDIQNPDP А......	L_ область соединения_4 SEQ ID NO: 150	......KVEI KLE	DLKNVFPPE

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа. В табл. 3 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-бета TCR, или VL антитела, слитого с С-преальфа TCR. границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-бета, и границу VL антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-пре-альфа. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 170, 171, 169 или 156), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 81 или 131.

- 26 045653

Таблица 3

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-C-бета/VL-С-пре-альфа

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабе льный домен	Константа ый домен		Вариабельн ый домен	Константа ый домен
Антитело_Н SEQ ID NO: 283	......LVT VSS	AS- TKGPS......	Антитело_Е SEQ ID NO: 285	......KVEIK	RTVAAPSV F......
TCR_6eTa SEQ ID NO: 284	......RLT VLE	DLKNVFPP Е......	ТСК_альфа SEQ ID NO: 286	......KLIIK	PDIQNPDP А......
			ПреТСК_альфа SEQ ID NO: 287	......GCPAL	PTGVGGT PF......
Нобласть соединения_А SEQ ID NO: 170	......LVT VSS	ASKNVFPP Е......	L_ область соединения_А SEQ ID NO: 169	......KVEIK	RTVAAGT PF......
H_ область соединенияВ SEQ ID NO: 171	......LVT VLE	DLKNVFPP Е......	L_ область соединенияВ SEQ ID NO: 156	......KVEIK	PTGVGGT PF......

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-пре-альфа, и С2 содержит сконструированную С-бета. В табл. 4 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-пре-альфа TCR, или VL антитела, слитого с Сбета TCR. Границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-пре-альфа, и границу VL антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-бета. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 172, 173, 174 или 175), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 81, 131, 132 или 133. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 49 или 50.

- 27 045653

Таблица 4

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-C-пре-альфа/VL-С-бета

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабе льный домен	Константы ый домен		Вариабель ный домен	Константны й домен
Антитело_Н SEQ ГО NO: 288	......LVT VSS	ASTKGPS...	Антитело_Е SEQ ID NO: 291	......KVEI К-	RTVAAPSVF
TCR-альфа SEQ ГО NO: 289	......KLII К-	PDIQNPDP А......	ТСК_бета SEQ ID NO: 292	......RLTV LE	DLKNVFPP Е......
ПреТСК_альфа SEQ ГО NO: 290	......GCP AL -	PTGVGGT PF......
Нобласть соединенияС SEQ ГО NO: 172	......LVT VSS	ASGVGGT PF......	L_ область соединения_ С SEQ ID NO: 174	......KVEI KLE	DLKNVFPP Е......
Н_ область соединениЯ-D	......LVT VSS	PTGVGGT PF......	L_ область соединения_	......KVEI KLE	DLKNVFPP

SEQ ГО NO: 173

D SEQ ID NO: 175

E......

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-гамма, и С2 содержит сконструированную С-дельта. В табл. 5 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-гамма TCR, или для VL антитела, слитого с TCR Сдельта. границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-гамма, и границу VL антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-дельта. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 157, 158, 159 или 160), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 117 или 118. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 119 или 120.

- 28 045653

Таблица 5

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-C-raMMa/VL-C-дельта

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабе льный домен	Константный домен		Варна бельн ый домен	Константный домен
Антитело_Н SEQ ГО NO: 293	......LVT VSS	AS-TK- GPS......	Антитело_Е SEQ ID NO: 143	......KV EIK	RTVAAPSVF...
ТСК_гамма SEQ ГО NO: 142	......TLV VTD	KQLDADVS РК......	ТСй_дельта SEQ ID NO: 55	......RV TVE	PRSQPHTKPS VF......
Нобласть соединения_ 4 SEQ ГО NO: 157	......LVT VSS	ASLDADVSP К......	L_ область соединения_4 SEQ ID NO: 159	......KV EIK	PRSOPHTKPS
VF......
Нобласть соединения_	......LVT УТР	KQLDADVS РК......	Еобласть соединения_5	......KV EIE	PRSQPHTKPS VF......
5 SEQ ГО NO: 158			SEQ ID NO: 160

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-дельта, и С2 содержит сконструированную С-гамма. В табл. 6 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для VH антитела, слитого с С-дельта TCR, или для VL антитела, слитого с С-гамма TCR. Границу VH антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/Cдельта, и границу VL антитела/константного домена выравнивают с границей вариабельного домена TCR/C-гамма. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 161, 162, 163 или 164), при этом первый или второй соединительный домен подчеркнут. В таких вариантах осуществления первый соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 123 или 124. В таких вариантах осуществления второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 125 или 126.

- 29 045653

Таблица 6

Дизайн первого и второго соединительного домена VH-C-дeльтa/VL-C-гaммa

	Область соединения (тяжелая цепь)		Область соединения (легкая цепь)
	Вариабе льный домен	Константа ый домен		Вариабел ьный домен	Константный домен
Антитело_Н SEQ ID NO: 56	......LVT VSS	ASTKGPS...	Антитело_Е SEQ ID NO: 58	......KVEI К-	RTV— AAPSVF......
ТСК_дельта SEQ ID NO: 57	......RV TVEP	RSQPHTKP S......	ТСК_гамма SEQ ID NO: 59	......TLV VTD	KQLDADVSPK РТ......
Нобласть соединенияб SEQ ID NO: 161	......LVT VSS	RSQPHTKP S......	Еобласть соединения_ 6 SEQ ID NO: 163	......KVEI KD	KOLDADVSPK
РТ......
Нобласть соединения_7 SEQ ID NO:	......LVT VEP	RSQPHTKP s......	Еобласть соединения_ 7	......KVEI TD	KOLDADVSPK РТ......
162			SEQ ID NO: 164

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид содержит последовательность, содержащую домены, функционально связанные по формуле (I): VH-HCJ-C1, и второй полипептид содержит последовательность, содержащую домены, функционально связанные по формуле (II):

VL-LCJ-C2, где VH является вариабельным доменом тяжелой цепи антитела;

HCJ является первым соединительным доменом, как определено выше;

С1 является первым константным доменом TCR, как определено выше;

VL является вариабельным доменом легкой цепи антитела;

LCJ является вторым соединительным доменом, как определено выше;

С2 является вторым константным доменом TCR, как определено выше.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-альфа, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42-48, и С2 является сконструированной С-бета, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-41, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 и 50; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51 и 52.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-бета, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-41, и С2 является сконструированной С-альфа, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42-48, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 129 и 130; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 и 50.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-бета, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-41, 84, 319, 320, 321, 322, 323 и 324, и С2 является сконструированной С-пре-альфа, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 и 318, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 и 50; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 81 и 131.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-пре-альфа, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 и 318, и С2 является сконструированной С-бета, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-41, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 81,

- 30 045653

131, 132 и 133; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 и 50.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-гамма, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 и 340, и С2 является сконструированной С-дельта содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 и 332, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 117 и 118; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 119 и 120.

В некоторых вариантах осуществления С1 является сконструированной С-дельта, содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 и 332, и С2 является сконструированной С-гамма содержащей или представляющей собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 и 340, HCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 123 и 124; LCJ содержит или представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 125 и 126.

В патенте США № 9683052 описано, что некоторые остатки из области контакта между константными областями TCR можно конструировать в Fc-области для облегчения гетеродимерного спаривания двух тяжелых цепей. Такие остатки и/или соответствующие остатки из области контакта между константными областями TCR, представленными в настоящем описании, также можно конструировать в Fab-области, например, доменах СН1 и CL, для облегчения спаривания между легкой цепью и тяжелой цепью.

ii. Вариабельная область антитела.

Полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, содержит первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела. В общепринятом нативном антителе вариабельная область содержит три области CDR, чередующихся с фланкирующими каркасными областями (FR), например, в соответствии со следующей формулой: FR1CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 с N-конца к С-концу. Полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, может содержать, в качестве неограничивающих примеров, такую общепринятую вариабельную область антитела. Например, вариабельный домен может содержать все три или менее трех CDR со всеми четырьмя или менее чем четырьмя из FR тяжелой или легкой цепи антитела при условии, что вариабельный домен может специфически связываться с антигеном.

Первое антитело имеет первую антигенную специфичность. Другими словами, VH и VL образуют антигенсвязывающий участок, который может специфически связываться с антигеном или эпитопом. Антигенная специфичность может быть направлена против любого подходящего антигена или эпитопа, например, являющегося экзогенным антигеном, эндогенным антигеном, аутоантигеном, неоантигеном, вирусным антигеном или опухолевым антигеном. Экзогенный антиген попадает в организм при вдыхании, проглатывании или инъекции и может быть презентирован антигенпрезентирующими клетками (АРС) посредством эндоцитоза или фагоцитоза и образования комплекса МНС II. Эндогенный антиген образуется в нормальных клетках в результате клеточного метаболизма, внутриклеточной вирусной или бактериальной инфекции и может образовывать комплекс с МНС I. Аутоантиген (например, пептид, ДНК или РНК и т.д.) распознается иммунной системой пациента, страдающего аутоиммунными заболеваниями, в то время как в нормальных условиях этот антиген не будет мишенью иммунной системы. Неоантиген полностью отсутствует в нормальном организме и образуется из-за конкретного заболевания, такого как опухоль или злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с конкретным заболеванием (например, опухолью или злокачественным новообразованием, аутоиммунными заболеваниями, инфекционными и паразитарными заболеваниями, сердечнососудистыми заболеваниями, невропатиями, психоневрологическими состояниями, травмами, воспалением, нарушением свертывания). В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с иммунной системой (например, иммунными клетками, такими как В-клетка, Т-клетка, NK-клетки, макрофаги и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления первая антигенная специфичность направлена против связанного с иммунной системой антигена или его эпитопа. Примеры связанного с иммунной системой антигена включают специфическую для Т-клеток рецепторную молекулу и/или специфическую для естественных киллеров (NK-клеток) рецепторную молекулу.

Специфичная для Т-клеток рецепторная молекула позволяет Т-клетке связываться и, при наличии дополнительных сигналов, активироваться и отвечать на эпитоп/антиген, презентируемый другой клеткой, названной антигенпрезентирующей клеткой или АРС. Специфичная для Т-клеток рецепторная молекула может являться TCR, CD3, CD28, CD134 (также названным ОХ40), 4-1 ВВ, CD5 и CD95 (также известным как Fas-рецептор).

Примеры специфической для NK-клеток рецепторной молекулы включают CD16, низкоаффинный Fc-рецептор, NKG2D и CD2.

- 31 045653

В некоторых вариантах осуществления первая антигенная специфичность направлена против опухолеассоциированного антигена или его эпитопа. Термин опухолеассоциированный антиген относится к антигену, присутствующему на поверхности опухолевой клетки, или который может быть презентирован на ней, и локализующийся на опухолевых клетках или в них. В некоторых вариантах осуществления опухолеассоциированные антигены могут быть презентированы только опухолевыми клетками, но не нормальными, т.е. неопухолевыми клетками. В некоторых других вариантах осуществления опухолеассоциированные антигены могут экспрессироваться исключительно на опухолевых клетках или могут представлять собой опухолеспецифическую мутацию по сравнению с неопухолевыми клетками. В некоторых других вариантах осуществления опухолеассоциированные антигены можно обнаружить в опухолевых клетках и неопухолевых клетках, но они гиперэкспрессированы на опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми клетками или доступны для связывания антителом в опухолевых клетках по причине менее компактной структуры опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой тканью. В некоторых вариантах осуществления опухолеассоциированный антиген локализован в сосудах опухоли.

Иллюстративными примерами опухолеассоциированного поверхностного антигена являются CD10, CD19, CD20, CD22, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT-3, CD135), протеогликан хондроитинсульфат 4 (CSPG4, меланомаассоциированный протеогликан хондроитинсульфат), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, IL3R, активирующий фибробласты белок (FAP), CDCP1, дерлин-1, тенасцин, frizzled 1-10, сосудистые антигены VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-альфа (CD140α), PDGFR-бета (CDHOb), эндоглин, CLEC14, Tem1-8 и Tie2. Дополнительные примеры могут включать А33, САМРАТН-1 (CDw52), карциноэмбриональный антиген (СЕА), карбоангидразу IX (MN/CA IX), de2-7 EGFR, EGFRvIII, ЕрСАМ, Ер-САМ, фолат-связывающий белок, G250,Fms-подобную тирозинкиназу 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, рецептор ИЛ-2, IL3R, MCSP (меланома-ассоциированный поверхностный протеогликан хондроитинсульфат), Muc-1, простатспецифический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), простатспецифический антиген (PSA) и TAG-72.

В некоторых вариантах осуществления первая антигенная специфичность направлена против антигена или его эпитопа, выбранного из группы, состоящей из CD3, 4.1ВВ (CD137), ОХ40 (CD134), CD16, CD47, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD123, CD133, СЕА, cdH3, ЕрСАМ, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), EGFRvIII (мутантной формы EGFR), HER2, HER3, dLL3, BCMA, сиалил-Lea, 5Т4, ROR1, меланома-ассоциированного протеогликана хондроитинсульфата, мезотелина, рецептора фолата 1, рецептора VEGF, ЕрСАМ, HER2/neu, HER3/neu, G250, СЕА, MAGE, протеогликанов, VEGF, FGFR, альфа-V-бета-3-интегрина, HLA, HLA-DR, ASC, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD21, CD23, CD24, CD28, CD30, CD37, CD40, CD41, CD44, CD52, CD64, c-erb-2, CALLA, МНСП, CD44v3, CD44v6, p97, ганглиозида GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4 Trp2, gp100, тирозиназы, Muc-1, теломеразы, сурвивина, G250, p53, CA125 MUC, антигена Wue, антигена Льюиса Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EpHA2 и антигенов поверхности клетки GC182, GT468 или GT512.

Вариабельные домены антитела можно получать из родительского антитела. Родительское антитело может являться антителом любого типа, включая, например, полностью человеческое антитело, гуманизированное антитело или антитело животного (например, мыши, крысы, кролика, овцы, коровы, собаки и т.д.), родительское антитело может являться моноклональным антителом или поликлональным антителом.

В некоторых вариантах осуществления родительское антитело является моноклональным антителом. Моноклональное антитело можно получать различными известными в этой области способами, например, посредством гибридомной технологии, рекомбинантного способа, фагового дисплея или любой их комбинации.

Гибридомная технология включает слияние антитело-экспрессирующих В-клеток с иммортализованной линией В-клеток для получения гибридом, далее подвергаемых скринингу на желаемые характеристики, такие как высокий уровень продукции антител, хороший рост гибридомных клеток и сильное связывание или хорошая биологическая активность антитела (см., например, Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.).

Рекомбинантный способ является другим способом получения родительского антитела. В кратком изложении, получают и идентифицируют клетки, такие как лимфоциты, секретирующие интересующие антитела, и выделяют отдельные клетки с последующей ПЦР с обратной транскрипцией для получения кДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепи. Эти последовательности кДНК вариабельных областей можно использовать для конструирования кодирующей последовательности полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, а затем экспрессии в подходящей клетке-хозяине (обзор см., например, в патенте США № 5627052; публикации РСТ № WO 92/02551; и Babcock et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848).

Библиотеки антител являются другой альтернативой для получения родительского антитела. В кратком изложении, можно осуществлять скрининг библиотеки антител для идентификации антитела,

- 32 045653 имеющего желаемую специфичность связывания. Способы такого скрининга рекомбинантных библиотек антител хорошо известны в этой области и включают способы, описанные, например, в патенте США № 5223409; публикациях РСТ №№ WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 и WO 97/29131; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137; и Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; и публикации патентной заявки № 20030186374.

Другим иллюстративным способом получения родительского антитела является фаговый дисплей (см., например, Brinkman et al., (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., (1997) Gene 187 9-18 и патенты США №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108). Полинуклеотидные последовательности, кодирующие домены антитела, встраивают в фаговые частицы для получения библиотеки фаговых частиц, экспонирующих различные функциональные домены антител. Fd и М13 являются часто используемыми нитевидными фагами, и функциональные домены антитела, экспонируемые на фаговых частицах, могут являться, например, Fab, Fv или стабилизируемым дисульфидной связью Fv, рекомбинантно слитыми с фаговым белком, кодируемым геном III или геном VIII. Фаговую библиотеку можно подвергать скринингу с использованием интересующего антигена, например, необязательно, меченого или связанного или фиксированного на твердой подложке (например, частице). В случае выбранного фага его полинуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные домены антитела, получают и используют в конструировании полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании. Аналогично, можно получать дрожжевую библиотеку, экспонирующую вариабельные домены антитела, связывая домены антитела со стенкой дрожжевой клетки (см., например, патент США № 6699658), а затем осуществлять скрининг с использованием связанного антигена для получения родительского антитела, которое можно использовать для конструирования полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании.

Кроме того, родительское антитело также можно получать посредством инъецирования интересующего антигена трансгенному, не являющемуся человеком животному, содержащему некоторую часть или весь иммуноглобулиновый локус человека, например, OmniRat, OmniMouse (см., например, Osborn M. et al., Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90; Ma B. et al., Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86; Geurts A. et al., Science, 2009, 325:433; патент США № 8907157; патент № ЕР 2152880 В1; патент № ЕР 2336329 В1), мыши HuMab (подробности см. в Lonberg, N. et al., Nature 368(6474): 856 859 (1994)), Xeno-Mouse (Mendez et al., Nat Genet., 1997, 15:146-156), мышь TransChromo (Ishida et al., Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102) и мышь Veloclmmune (Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:51535158), Kymouse (Lee et al., Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363) и трансгенный кролик (Flisikowska et al., PLoS One, 2011, 6:e21045).

Родительские антитела, представленные в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать, например, для пересадки последовательностей CDR на другой каркас, для замены одного или более аминокислотных остатков в одной или более каркасных областях, для замены одного или более остатков в одной или более областях CDR для созревания аффинности и т.д. Это может осуществлять специалист в этой области общепринятыми способами.

Родительское антитело также может являться терапевтическим антителом, известным в этой области, например антителом, одобренным FDA для терапевтического или диагностического использования, или антителом, находящимся на стадии клинического испытания для лечения заболевания, или антителом, находящимся на стадии исследования и разработки. Полинуклеотидные последовательности и белковые последовательности вариабельных областей известных антител можно найти в общедоступных базах данных, таких как, например, например, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html.

Неограничивающие примеры терапевтических антител включают ритуксимаб (ритуксан, IDEC/Genentech/Roche) (см. например, патент США № 5736137), химерное антитело против CD20, одобренное для лечения неходжкинской лимфомы; HuMax-CD20, антитело против CD20, в настоящее время разрабатываемое Genmab, антитело против CD20, описанное в патенте США № 5500362, АМЕ-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) и PRO70769 (заявка PCT № PCT/US2003/040426), трастузумаб (герцептин, Genentech) (см., например, патент США № 5677171), гуманизированное антитело против Her2/neu, одобренное для лечения рака молочной железы; пертузумаб (rhuMab-2C4, Omnitarg), в настоящее время разрабатываемый Genentech; антитело против Her2, описанное в патенте США № 4753894; цетуксимаб (эрбитукс, Imclone) (патент США № 4943533; публикация РСТ № WO 96/40210), химерное антитело против EGFR, находящееся на стадии клинических испытаний для различных злокачественных новообразований; ABX-EGF (патент США № 6235883), в настоя

- 33 045653 щее время разрабатываемое Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (патент США № 7247301), в настоящее время разрабатываемое Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 и EMD72000 (Merck KGaA) (патент США № 5558864; Murthy et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., (1987) J. Cell. Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., (1991) Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (публикация PCT № WO 95/20045; Modjtahedi et al., (1993) J. Cell Biophys. 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., (1993) Br. J. Cancer 67(2):247-53; Modjtahedi et al., (1996) Br. J. Cancer 73(2):228-35; Modjtahedi et al., (2003) Int. J. Cancer 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada и Centra de ImmunologiaMolecular, Cuba (патент США № 5891996; патент США № 6506883; Mateo et al., (1997) Immunotechnol. 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (публикация PCT № WO 0162931); и SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); алемтузумаб (кэмпас, Millenium), гуманизированное mAb, в настоящее время одобренное для лечения хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза; муромонаб-CD3 (Orthoclone OKT3), антитело против CD3, разработанное Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ибритумомаб тиуксетан (зевалин), антитело против CD20, разработанное IDEC/Schering AG, гемтузумабозогамицин (милотарг), антитело против CD33 (белка р67), разработанное Celltech/Wyeth, алефацепт (амевив), слитый белок против LFA-3 Fc, разработанный Biogen), абциксимаб (ReoPro), разработанный Centocor/Lilly, базиликсимаб (симулект), разработанный Novartis, паливизумаб (синагис), разработанный Medimmune, инфликсимаб (ремикейд), антитело против ФНО альфа, разработанное Centocor, адалимумаб (хумира), антитело против ФНО альфа, разработанное Abbott, хумикейд, антитело против ФНО альфа, разработанное Celltech, голимумаб (CNTO-148), полностью человеческое антитело против ФНО, разработанное Centocor, этанерцепт (энбрел), слитый белок рецептора ФНО р75 и Fc, разработанный Immunex/Amgen, ленерцепт, слитый белок рецептора ФНО р55 и Fc, разработанный Roche, ABX-CBL, антитело против CD147, разработанное Abgenix, ABX-IL8, антитело против ИЛ-8, разработанное Abgenix, АВХ-МА1, антитело против MUC18, разработанное Abgenix, пемтумомаб (R1549, 90Y-muHMFG1), антитело против MUC1, разрабатываемое Antisoma, Therex (R1550), антитело против MUC1, разработанное Antisoma, AngioMab (AS 1405), разработанное Antisoma, HuBC-1, разработанное Antisoma, тиоплатин (AS 1407), разработанный Antisoma, антегрен (натализумаб), антитело против альфа-4-бета-1 (VLA-4) и альфа-4-бета-7, разработанное Biogen, VLA-1 mAb, антитело против интегрина VLA-1, разработанное Biogen, mAb LTBR, антитело против рецептора лимфотоксина бета (LTBR), разработанное Biogen, CAT-152, антитело против TGF-бета 2, разработанное Cambridge Antibody Technology, АВТ 874 (J695), антитело против ИЛ-12 р40, разработанное Abbott, CAT-192, антитело против TGF-бета 1, разработанное Cambridge Antibody Technology и Genzyme, CAT-213, антитело против эотаксина 1, разработанное Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B, антитело против Blys, разработанное Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, антитело против TRAIL-R1, разработанное Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences, Inc., авастин бевацизумаб, rhuMAb-VEGF), антитело против VEGF, разработанное Genentech, антитело против семейства рецепторов HER, разработанное Genentech, антитело против тканевого фактора (ATF), разработанное Genentech, Xolair (Omalizumab), антитело против IgE, разработанное Genentech, раптива (эфализумаб), антитело против CD11a, разработанное Genentech и Хота, антитело MLN-02 (ранее известное как LDP-02), разработанное Genentech и Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, антитело против CD4, разработанное Genmab, HuMax-IL15, антитело против IL15, разработанное Genmab и Amgen, HuMax-Inflam, разработанное Genmab и Medarex, HuMax-Cancer, антитело против гепараназы I, разработанное Genmab, Medarex и Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, разработанное Genmab и Amgen, HuMax-TAC, разработанное Genmab, IDEC-131, антитело против CD40L, разработанное IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (кленоликсимаб), антитело против CD4, разработанное IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, антитело против CD80, разработанное IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, антитело против CD23, разработанное IDEC Pharmaceuticals, антитела против фактора, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), разработанные IDEC Pharmaceuticals, BEC2, антиидиотипическое антитело, разработанное Imclone, IMC1C11, антитело против KDR, разработанное Imclone, DC101, антитело против flk-1, разработанное Imclone, антитела против кадгерина VE, разработанные Imclone, CEA-Cide (лабетузумаб), антитело против карциноэмбрионального антигена (СЕА), разработанное Immunomedics, LymphoCide (эпратузумаб), антитело против CD22, разработанное Immunomedics, AFP-Cide, разработанное Immunomedics, MyelomaCide, разработанное Immunomedics, LkoCide, разработанное Immunomedics, ProstaCide, разработанное Immunomedics, MDX-010, антитело против CTLA4, разработанное Medarex, MDX-060, антитело против CD30, разработанное Medarex, MDX-070, разработанное Medarex, MDX-018, разработаннон Medarex, Osidem (IDM-1), антитело против Her2, разработанное Medarex и Immuno-Designed Molecules, HuMaxCD4, антитело против CD4, разработанное Medarex и Genmab, HuMax-IL15, антитело против ИЛ-15, разработанное Medarex и Genmab, CNTO 148, антитело против ФНО альфа, разработанное Medarex и Centocor/J&J, CNTO 1275, антитело против цитокинов, разработанное Centocor/J&J, MOR101 и MOR102, антитела против внутриклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1) (CD54), разработанные MorphoSys, MOR201, антитело против рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), разработанное MorphoSys, Nuvion (висилизумаб), антитело против CD3, разработанное Protein Design Labs, HuZAF, антитело про

- 34 045653 тив интерферона гамма, разработанное Protein Design Labs, антитело против интегрина альфа-5-бета-1, разработанное Protein Design Labs, антитело против ИЛ-12, разработанное Protein Design Labs, ING-1, антитело против Ер-САМ, разработанное Xoma, Xolair (омализумаб), гуманизированное антитело против IgE, разработанное Genentech и Novartis, и MLN01, антитело против интегрина бета-2, разработанное Xoma. В другом варианте осуществления терапевтические средства включают KRN330 (Kirin); антитело huA33 (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 (против интегринов альфа V, Centocor); MEDI-522 (против интегрина альфа-V-бета-3, Medimmune); волоциксимаб (против интегрина альфа-Vбета-1, Biogen/PDL); mAb 216 человека (против В-клеточного гликозилированного эпитопа, NCI); BiTE MT103 (биспецифический, CD19xCD3, Medimmune); 4G7xH22 (биспецифический, В-kлеткиχFc-гамма R1, Medarex/Merck KGa); rM28 (биспецифический CD28xMAPG, патент ЕР № ЕР1444268); MDX447 (EMD 82633) (биспецифический, CD64xEGFR, Medarex); катумаксомаб (ремоваб) (биспецифический, EpCAMxCD3, Trion/Fres); эртумаксомаб (биспецифический, HER2/CD3, Fresenius Biotech); ореговомаб (OvaRex) (CA-125, ViRexx); ренкарекс (WX G250) (против карбоангидразы IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (против CD105 (эндоглина), Tracon); BMS-663513 (агонист CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); сиплизумаб (MEDI-507) (CD2, Medimmune); офатумумаб (HumaxCD20) (CD20, Genmab); ритуксимаб (ритуксан) (против CD20, Genentech); велтузумаб (hA20) (против CD20, Immunomedics); эпратузумаб (против CD22, Amgen); люмиликсимаб (IDEC 152) (против CD23, Biogen); муромонаб-CD3 (против CD3, Ortho); HuM291 (несвязывающееся с Fc-рецептором антитело против CD3, PDL Biopharma); HeFi-1 (против CD30, NCI); MDX-060 (против CD30, Medarex); MDX-1401 (против CD30, Medarex); SGN-30 (против CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (линтузумаб) (против CD33, Seattle Genentics); занолимумаб (HuMax-CD4) (против CD4, Genmab); HCD122 (против CD40, Novartis); SGN-40 (против CD40, Seattle Genentics); кэмпас-1h (алемтузумаб) (против CD52, Genzyme); MDX-1411 (против CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (против CD74.38, Immunomedics); галиксимаб (IDEC-144) (против CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (против расщепленного коллагена, Tracon); HuLuc63 (против CS1, PDL Pharma); ипилимумаб (MDX-010) (против CTLA4, Brystol Myers Squibb); тремелимумаб (тицилимумаб, СР-675.2) (против CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (мапатумумаб) (агонист DR4 TRAIL-R1, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (против DR5, Amgen); апомаб (против DR5, Genentech); CS1008 (против DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (лексатумумаб) (агонист DR5 TRAIL-R2, HGS); цетуксимаб (эрбитукс) (против EGFR, Imclone); IMC-11F8 (против EGFR, Imclone); нимотузумаб (против EGFR, YM Bio); панитумумаб (вектабикс) (против EGFR, Amgen); залутумумаб (HuMaxEGFr) (против EGFR, Genmab); CDX-110 (против EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); адекатумумаб (МТ201) (против Epcam, Merck); эдреколомаб (Panorex, 17-1A) (против Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (против рецептора фолата a, Morphotech); KW-2871 (против ганглиозида GD3, Kyowa); MORAb-009 (против GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (против hCGb, Celldex); трастузумаб (герцептин) (против HER2, Celldex); пертузумаб (rhuMAb 2C4) (против HER2 (DI), Genentech); аполизумаб (против бета-цепи HLADR, PDL Pharma); AMG-479 (против IGF-1R, Amgen); антитело против IGF-1R R1507 (против IGF1-R, Roche); CP 751871 (против IGF-R, Pfizer); IMC-A12 (против IGF1-R, Imclone); BIIB022 (против IGF-1R, Biogen); Mik-бета-1 (против IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (против ИЛ-6, Centocor); антитело против KIR (1-7F9) (против Ig-подобного рецептора естественных киллеров (KIR), Novo); Hu3S193 (против антигена Льюиса (у), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (против LTBR, Biogen); HuHMFGl (против MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (против N-связанного углеводного эпитопа, Raven); CAL (против родственного паратиреоидному гормону белка (PTH-rP), University of California); СТ-011 (против PD1, CureTech); MDX-1106 (опо-4538) (против PD1, Medarex/Ono); MAb СТ-011 (против PD1, Curetech); IMC-3G3 (против PDGFRa, Imclone); бавитуксимаб (против фосфатидилсерина, Peregrine); huJ591 (против PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (против PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 ((пан)ингибитор TGFb (IgG4), Genzyme); инфликсимаб (ремикейд) (против ФНО альфа, Centocor); А27,15 (против рецептора трансферрина, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2,3 (против рецептора трансферрина, Salk Institute); бевацизумаб (авастин) (против VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab, публикация PCT № WO 2000/034337, University of Texas); EVIC-18F1 (против VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (против VEGFR2, Imclone).

а) Связывающий функциональный фрагмент против CD3.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент является связывающим функциональным фрагментом против CD3, полученным из антитела против CD3, содержащего 1, 2 или 3 последовательности CDR тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 342-344, и/или 1, 2 или 3 последовательности CDR легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 345-347.

Эти последовательности CDR получают из антитела против CD3, представленного в табл. А ниже. Ниже приведены последовательности CDR антитела WBP3311_2.306.4.

- 35 045653

Таблица А

ID антитела:		CDR1	CDR2	CDR3
WBP3311 2.306.4	VH	SEQ ID NO: 342	SEQ ID NO: 343	SEQ ID NO: 344
GFAFTDYYIH	WISPGNVNTKYNE NFKG	DGYSLYYF DY
WBP3311 2.306.4	VL	SEQ ID NO: 345	SEQ ID NO: 346	SEQ ID NO: 347
KSSQSLLNSRTRK NYLA	WASTRQS	TQSHTLRT

Ниже приведены последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи каппа антитела WBP33112.306.4. WBP3311_2.306.4-VH.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 348):

QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPG NVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQG TTLTVSS

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 349):

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCG TGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGG TGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAAT GTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCT ATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGT CTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGG CACCACTCTCACAGTCTCCTCA

WBP3311_2.306.4-VL.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 350):

DIVMSOSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSOSLLNSRTRKNYLAWYOQKPGOSPKLLIY WASTROSGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVOAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 351):

GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGA AGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAG AACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTAC TGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGG ACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTC TGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA A

Известно, что CDR отвечают за связывание антигена, однако, обнаружено, что не все из 6 CDR являются необходимыми или неизменными. Другими словами, можно заменять, или изменять, или модифицировать одну или более CDR в связывающем функциональном фрагменте против CD3, полученном из WBP3311_2.306.4, при этом, по существу, сохраняя специфическую аффинность связывания с CD3.

В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD3, представленный в настоящем описании, содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи антитела против CD3 WBP33112.306.4. В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD3, представленный в настоящем описании, содержит CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 344. Область CDR3 тяжелой цепи локализована в центре антигенсвязывающего участка, и, таким образом, считают, что она больше остальных контактирует с антигеном и обеспечивает большую часть свободной энергии в отношении аффинности антитела к антигену. Также считают, что CDR3 тяжелой цепи, несомненно, является наиболее разнообразной CDR антигенсвязывающего участка в терминах длины, композиции аминокислоты и конформации благодаря множеству механизмов диверсификации (Tonegawa S., Nature. 302:575-81 (1983)). Разнообразия CDR3 тяжелой цепи достаточно для достижения большинства специфичностей антител (Xu JL, Davis MM., Immunity. 13:37-45 (2000)), а также желаемой аффинности связывания с антигеном (Schier R, et al., J Mol Biol. 263:551-67 (1996)).

В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD3, представленный в настоящем описании, содержит подходящие последовательности каркасной области (FR) при условии, что связывающий функциональный фрагмент против CD3 может специфически связываться с CD3. Последовательности CDR, приведенные в табл. А, получают из антител мыши, но их можно пересаживать на любые подходящие последовательности FR любого подходящего биологического вида, такого как, помимо прочего, мышь, человек, крыса, кролик, подходящими известными в этой области способами, такими как рекомбинантные способы.

В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD3, представленный в настоящем описании, является гуманизированным.

- 36 045653

В некоторых вариантах осуществления гуманизированный антигенсвязывающий функциональный фрагмент, представленный в настоящем описании, состоит, по существу, из полностью человеческих последовательностей, за исключением последовательностей CDR, не принадлежащих человеку. В некоторых вариантах осуществления FR вариабельной области и константные области, если они есть, получают полностью или в значительной степени из последовательностей иммуноглобулина человека. Последовательности FR человека и последовательности константной области человека можно получать из разных генов иммуноглобулинов человека, например, последовательности FR получают из одного антитела человека, а константную область - из другого антитела человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит FR1-4 человека.

Ниже приведены последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела против CD3 WBP33112.306.4-zl.

WBP3311_2.306.4-zl-VH.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 352):

OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGOGLEWMGWIS PGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWG QGTLVTVSS

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 353):

CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTG TCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGG TGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAAT GTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAA GAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCG TCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGG GCACACTGGTGACAGTGAGCTCC

WBP3311_2.306.4-zl-VL.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 354):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY WASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 355):

GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAA

GAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAG AATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTAC TGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGG GACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTA CTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTA AG

b) Антитело против CD19.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент является связывающим функциональным фрагментом против CD19, полученным из антитела против CD19, содержащего 1, 2 или 3 последовательности CDR тяжелой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 356-359, и/или 1, 2 или 3 последовательности CDR легкой цепи каппа, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 360-362.

Эти последовательности CDR, полученные из антитела, приведены в табл. В ниже. Ниже приведены последовательности CDR этих антител против CD19.

Таблица В

		CDR1	CDR2	CDR3
WBP7011 _4.155.8	VH	SEQ ID NO: 356	SEQ ID NO: 357	SEQ ID NO: 358
GYAFTSYNMY	YIDPYNGDTTYNQ KFKG	TAYAMDY
W7011- 4.155.8- Z1-P15	VH	SEQ ID NO: 356	SEQ ID NO: 359	SEQ ID NO: 358
GYAFTSYNMY	YIDPYNADTTYNQ KFKG	TAYAMDY
WBP7011 -4.155.8	VL	SEQ Ш NO: 360	SEQ Ш NO: 361	SEQ ID NO: 362
SASSTVNYMH	STSNLAS	HQWSSYPYT
W7011- 4.155.8- Z1-P15	VL	SEQ Ш NO: 360	SEQ ID NO: 361	SEQ ID NO: 362
SASSTVNYMH	STSNLAS	HQWSSYPYT

Ниже приведены последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи каппа антитела WBP70114.155.8. WBP7011-4.155.8-VH.

- 37 045653

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 363):

EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPY NGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMDYWGOGTS VTVSS

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 364):

GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAG

TGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGG TGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAAT GGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAA GTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGT CTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA

WBP7011-4.155.8-VL.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 365):

QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASG

VPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHOWSSYPYTFGGGTKLEIK

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 366):

CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGA

GATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCA GAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGG AGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGA AGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCG TACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD19, представленный в настоящем описании содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи антитела против CD19 WBP70114.155.8 или W7011-4.155.8-z1-P15. В некоторых вариантах осуществления связывающий функциональный фрагмент против CD19, представленный в настоящем описании, содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 358. Область CDR3 тяжелой цепи локализована в центре антигенсвязывающего участка, и, таким образом, считают, что она больше остальных контактирует с антигеном и обеспечивает большую часть свободной энергии в отношении аффинности антитела к антигену. Также считают, что CDR3 тяжелой цепи, несомненно, является наиболее разнообразной CDR антигенсвязывающего участка в терминах длины, композиции аминокислоты и конформации благодаря множеству механизмов диверсификации (Tonegawa S., Nature. 302:575-81 (1983)). Разнообразия CDR3 тяжелой цепи достаточно для достижения большинства специфичностей антител (Xu JL, Davis MM., Immunity. 13:37-45 (2000)), а также желаемой аффинности связывания с антигеном (Schier R., et al., J Mol Biol. 263:551-67 (1996)).

В некоторых вариантах осуществления антитела против CD19, представленные в настоящем описании, являются гуманизированными. Ниже приведены последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела против CD19 W7011-4.155.8-z1-P15.

W7011-4.155.8-Z1-P15-VH.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 367):

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDP

YNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGOGT

LVTVSS

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 368):

CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCG

TCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGG TGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAAC GCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATAT GTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCG TGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTG TGACTGTGAGCAGT

W7011-4.155.8-Z1-P15-VL.

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 369):

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATYYCHQWSSYPYTFGOGTKLEIK

Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 370):

GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAG

GGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCA GAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTG GAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTA GCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACC CCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG

Биспецифические полипептидные комплексы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому полипептидному комплексу. В рамках изобретения термин биспецифический означает, что есть два антигенсвязывающих

- 38 045653 функциональных фрагмента, каждый из которых может специфически связываться с иным антигеном или иным эпитопом на том же антигене. Биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, содержит первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, содержащий первый вариабельный домен тяжелой цепи, функционально связанный с первой константной областью (C1) TCR, и первый вариабельный домен легкой цепи, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную и стабилизирующую межцепочечную связь между С1 и С2. Биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, дополнительно содержит второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент, содержащий второй антигенсвязывающий участок, но не содержит последовательность, полученную из константной области TCR.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому полипептидному комплексу, содержащему первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, связанный со вторым антигенсвязывающим функциональным фрагментом, где первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Т-клеточного рецептора (TCR), и второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где:

С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность, второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент имеет вторую антигенную специфичность отличающуюся от первой антигенной специфичности, и первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент менее склонны к неправильному спариванию, чем если бы первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты являлись соответствующими частями природного Fab.

Биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, значительно менее склонен к неправильному спариванию вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что стабилизированные константные области TCR в первом антигенсвязывающем функциональном фрагменте могут специфически связываться друг с другом и, таким образом, участвовать в высокоспецифическом спаривании заданных VH1 и VL1, в то же время препятствуя нежелательному неправильному спариванию VH1 или VL1 с другими вариабельными областями, не образующими заданные антигенсвязывающие участки.

Биспецифические полипептидные комплексы в форматах WuXiBody имеют большее время полужизни in vivo, и их относительно проще производить по сравнению с биспецифическими полипептидными комплексами в других форматах.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH2) и второй вариабельный домен легкой цепи (VL2) второго антитела. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из VH2 и VL2 функционально связан с константной областью антитело, или оба из VH2 и VL2 функционально связаны с константными областями тяжелой цепи и легкой цепи антитела, соответственно. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент дополнительно содержит константный домен СН1 антитела, функционально связанный с VH2, и константный домен легкой цепи антитела, функционально связанный с VL2. Например, второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит Fab.

Если первый, второй, третий и четвертый вариабельные домены (например, VH1, VH2, VL1 и VL2) экспрессируются в одной клетке, крайне желательно, чтобы VH1 специфически спаривался с VL1, и VH2 специфически спаривался с VL2, таким образом, что получаемый биспецифический белковый продукт будет иметь правильные специфичности связывания антигена. Однако, при использовании существующих технологий, таких как гибридная гибридома (или квадрома), происходит случайное спаривание VH1, VH2, VL1 и VL2, что, таким образом, приводит к образованию до десяти разных видов продукта, из которых только один является функциональной биспецифической антигенсвязывающей молекулой. Это не только снижает выход при получении, но также затрудняет очистку целевого продукта.

Биспецифические полипептидные комплексы по настоящему изобретению являются исключительными в том, что вариабельные домены менее склонны к неправильному спариванию, чем если бы первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты являлись соответствующими частями природного Fab. В иллюстративном примере первый антигенсвязывающий домен содержит VH1-C1, спаренный с VL1-C2, и второй антигенсвязывающий домен содержит VH2-CH1, спаренный с VL2-CL. Неожиданно обнаружено, что С1 и С2 преимущественно связываются друг с другом и менее склонны к

- 39 045653 связыванию с CL или СН1, таким образом, препятствуют образованию нежелательных пар, таких как C1CH, C1-CL, C2-CH и C2-CL, и значительно снижают его. В результате специфического связывания С1С2 VH1 специфически спаривается с VL1 и, таким образом, образует первый антигенсвязывающий участок, и СН1 специфически спаривается с CL и, таким образом, делает возможным специфическое спаривание VH2-VL2, образующих второй антигенсвязывающий участок. Таким образом, первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент менее склонны к неправильному связыванию, и неправильное спаривание, например, VH1-VL2, VH2-VL1, VH1-VH2, VL1-VL2, будет значительно снижено по сравнению с тем, что бы было, если бы первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты являлись соответствующими частями природных Fab, например, в форме VH1-CH1, VL1-CL, VH2-CH1 и VL2-CL.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, при экспрессии в клетке будет иметь значительно меньше продуктов неправильного спаривания (например, меньше по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5 или более продуктов неправильного спаривания) и/или значимо более высокий выход при получении (например, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или более высокий выход), чем референсная молекула, экспрессируемая в сравнимых условиях, где референсная молекула в остальном является идентичной биспецифическому полипептидному комплексу, за исключением того, что она содержит нативный СН1 вместо С1 и нативный CL вместо С2.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент является мультивалентным, например, бивалентным, тривалентным, тетравалентным. В рамках изобретения термин валентный относится к наличию определенного количества антигенсвязывающих участков в указанной молекуле. В связи с этим, термины бивалентный, тетравалентный и гексавалентный означают наличие двух, четырех и шести участков связывания, соответственно, в антигенсвязывающей молекуле. Бивалентная молекула может являться моноспецифической, если два участка связывания предназначены для специфического связывания одного и того же антигена или эпитопа. Аналогично, тривалентная молекула может являться биспецифической, например, если два участка связывания являются моноспецифическими для первого антигена (или эпитопа), а третий участок связывания является специфическим для второго антигена (или эпитопа). В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент в биспецифическом полипептидном комплексе, представленном в настоящем описании, может являться бивалентным, тривалентным или тетравалентным, при этом по меньшей мере два участка связывания являются специфическими для одного и того же антигена или эпитопа. В некоторых вариантах осуществления это обеспечивает более сильное связывание с антигеном или эпитопом, чем в случае моновалентного антитела. В некоторых вариантах осуществления в бивалентном антигенсвязывающем функциональном фрагменте первый валентный участок связывания и второй валентный участок связывания являются структурно идентичными (т.е. имеющими одни и те же последовательности) или структурно разными (т.е. имеющими разные последовательности, несмотря на одинаковую специфичность).

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент является мультивалентным и содержит два или более антигенсвязывающих участка, функционально связанных друг с другом с использованием спейсера или без него.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит один или более фрагментов Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fd, Fv и scFv и других фрагментов, описанных в Spiess et al., 2015 выше и Brinkmann et al., 2017 выше, или их комбинацию, соединенных с использованием спейсера в тяжелой цепи и/или легкой цепи или без него и образующих по меньшей мере одно антитело, способное связываться со вторым антителом.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент содержит два или более Fab второго антитела. Два Fab можно функционально связывать друг с другом, например, первый Fab можно ковалентно соединять со вторым Fab через тяжелую цепь с использованием спейсера или без него между ними.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент дополнительно содержит первый домен димеризации, и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент дополнительно содержит второй домен димеризации. В рамках изобретения термин домен димеризации относится к пептидным доменам, способным связываться друг с другом для образования димера или, в некоторых примерах, делающим возможным спонтанную димеризацию двух пептидов.

В некоторых вариантах осуществления первый домен димеризации можно связывать со вторым доменом димеризации. Связывание можно осуществлять посредством любого подходящего взаимодействия или связывания, например, посредством линкера, дисульфидной связи, водородной связи, электростатического взаимодействия, солевого мостика, гидрофобно-гидрофильного взаимодействия или их комбинации. Неограничивающие примеры доменов димеризации включают шарнирную область антитела, домен СН2 антитела, домен СН3 антитела и другие подходящие мономеры белков, способные димеризоваться и связываться друг с другом. Шарнирную область, домен СН2 и/или СН3 можно получать из любых изотипов антитела, таких как IgG1, IgG2 и IgG4.

- 40 045653

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй домен димеризации содержит по меньшей мере часть шарнирной области антитела. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй домен димеризации может дополнительно содержать домен СН2 антитела и/или домен СН3 антитела. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй домен димеризации содержит по меньшей мере часть области шарнир-Fc, т.е. домен шарнирная область-СН2-СН3. В некоторых вариантах осуществления первый домен димеризации можно функционально связывать с С-концом первой константной области TCR. В некоторых вариантах осуществления второй домен димеризации можно функционально связывать с С-концом константной области СН1 второго антигенсвязывающего функционального фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления первый домен димеризации функционально связан (с использованием спейсера или без него) с первой константной областью TCR (C1) в третьем соединительном домене.

Если область Fv иммуноглобулина выравнивают с иммуноглобулин-подобным доменом TCR, Nконец шарнирной области антитела и N-конец шарнирной области TCR также будут выравнивать. Пример приведен в табл. 7 ниже, где N-конец шарнирной области антитела (SEQ ID NO: 278 или 279) выравнивают N-концом шарнирной области бета-цепи TCR (SEQ ID NO: 280).

Третий соединительный домен биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, можно выбирать так, чтобы он содержал фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) N-конца шарнирной области антитела и фрагмент подходящей длины (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков) N-конца шарнирной области TCR. В рамках изобретения термин N-конец шарнирной области относится к наиболее N-концевому фрагменту шарнирной области. Например, соединительный домен можно выбирать так, чтобы он содержал все, или большую часть, или некоторые последовательности N-конца шарнирной области антитела или N-конца шарнирной области TCR, или он может содержать больше остатков из Nконца шарнирной области антитела, чем из N-конца шарнирной области TCR, или наоборот.

В некоторых вариантах осуществления третьи соединительные домены полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, имеют общую длину, сравнимую с длиной N-конца шарнирной области антитела или длиной N-конца шарнирной области TCR.

Аналогично, правильный третий соединительный домен можно определять с учетом структуры. Например, можно накладывать трехмерные структуры антитела и TCR, и можно определять перекрывание N-конца шарнирной области антитела и N-конца шарнирной области TCR на наложенной структуре и учитывать его при определении длины или доли последовательностей из N-конца шарнирной области антитела или TCR.

В некоторых вариантах осуществления третий соединительный домен содержит спейсер между фрагментами N-конца шарнирной области антитела и N-конца шарнирной области TCR. Можно использовать любые подходящие последовательности или длину спейсерных последовательностей при условии, что они не влияют отрицательно на связывание антигена или стабильность полипептидного комплекса.

Примеры последовательностей N-конца шарнирной области антитела, N-конца шарнирной области TCR и третьих соединительных доменов приведены ниже в табл. 7, 8, 9 и 10.

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-бета, и первый домен димеризации содержит шарнирную область и Fc IgG1 или IgG4. В табл. 7 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для С-бета TCR, слитой с шарнирной областью антитела. N-конец шарнирной области антитела выравнивают с N-концом шарнирной области бета-цепи TCR. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 152 или 153). В таких вариантах осуществления третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 53 или 54 (включающих третий соединительный домен и С-конец шарнирной области).

Таблица 7

Дизайн третьего соединительного домена VH-C-бета-шарнирная область

	Шарнирная область	SEQ ГО NO
IgG 1 Антител о_Н	EPKS-CDKTHTC......	278
1дО4_Антитело_Н	ESK—-YGPPC......	279
ТСИбета	WGRADCGFTSVS......	280
Область соединения’1 (IgGl)	WGRA-SDKTHTC......	152
Область соединения’1 (IgG4)	WGR----YGPPC......	153

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-альфа или С-пре-альфа, и первый домен димеризации содержит шарнирную область и Fc IgG1 или IgG4. В табл. 8 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для TCR С-альфа или С-преальфа, слитых с шарнирной области антитела. N-конец шарнирной области антитела выравнивают с Nконцом шарнирной области С-альфа или С-пре-альфа TCR. В таких вариантах осуществления третий

- 41 045653 соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 134, 135, 140 или 141 (включающих третий соединительный домен и С-конец шарнирной области).

Таблица 8

Дизайн третьего соединительного домена VH-C-альфа-шарнирная область

	Шарнирная область	SEQ ID NO
IgG 1 _Антител о_Н	EPKSCDKTHTC......	?81
1иО4_Антитело_Н	ESK —YGPPC......	282
ТСКальфа или TCRnpe-альфа	—
Область соединения’_2 (IgGl) Область соединения’-? (IgG4)	—-SDKTHTC...... -------YGPPC......	154 155

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-гамма, и первый домен димеризации содержит шарнирную область и Fc IgG1 или IgG4. В табл. 9 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для С-гамма TCR, слитой с шарнирной областью антитела. N-конец шарнирной области антитела выравнивают с N-концом шарнирной области гаммацепи TCR. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания (см., например, SEQ ID NO: 165 или 166). В таких вариантах осуществления третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 121 или 122 (включающих третий соединительный домен и С-конец шарнирной области).

Таблица 9

Дизайн третьего соединительного домена VH-C-гамма-шарнирная область

	Шарнирная область	SEQ ГО NO
IgG 1 Антител о_Н	EPKSCDKTHTC......	60
1§О4_Антитело_Н	ES К—YGPPC......	61
TCRraMMa	PPIKTDVITMD......	62
Область соединения’_3 (IgGl)	PPIKSDKTHTC......	165
Область соединения’_3 (IgG4)	PPI -YGPPC......	166

В некоторых вариантах осуществления С1 содержит сконструированную С-дельта, и первый домен димеризации содержит шарнирную область и Fc IgG1 или IgG4. В табл. 10 приведены примеры дизайна соединительных доменов, которые можно использовать для С-дельта TCR, слитой с шарнирной областью антитела. N-конец шарнирной области антитела выравнивают с N-концом шарнирной области дельта-цепи TCR. Примеры дизайна соединительных доменов также приведены в форме выравнивания. В таких вариантах осуществления третий соединительный домен содержится в SEQ ID NO: 127 или 128 (включающих третий соединительный домен и С-конец шарнирной области).

Таблица 10

Дизайн третьего соединительного домена VH-C-дельта-шарнирная область-Fc

	Шарнирная область и Fc	SEQ ID NO
IgG 1 Антител о_Н	EPKSCDKTHTC......	63
1§О4_Антитело_Н	ESK—YGPPC......	103
TCR-Дельта	FEVKTDSTDHV......	104
Область соединения’_4 (IgGl)	EPKSSDKTHTC......	167
Область соединения’_4 (IgG4)	ESK—YGPPC......	168

В некоторых вариантах осуществления первый домен димеризации функционально связан с Сконцом сконструированной константной области TCR, и вместе они образуют химерную константную область. Другими словами, химерная константная область содержит первый домен димеризации, функционально связанный со сконструированной константной областью TCR.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область содержит сконструированную С-бета, соединенную с первой областью шарнир-Fc, полученной из IgG1, IgG2 или IgG4. Примеры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 11, 12, 13 и 14.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область содержит сконструированную С-альфа, соединенную с первой шарнирной областью, полученной из IgG1, IgG2 или IgG4. Примеры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 11, 12 и 13.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область содержит сконструированную С-пре-альфа, соединенную с первой шарнирной областью, полученной из IgG1, IgG2 или IgG4, в третьем соединительном домене, содержащем или представляющим собой SEQ ID NO: 134, 135, 140 или 141. Примеры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 15 и 16.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область содержит сконструированную С-гамма, соединенную с первой шарнирной областью, полученной из IgG1, IgG2 или IgG4. Приме- 42 045653 ры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 17 и 18.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область содержит сконструированную С-дельта, соединенную с первой шарнирной областью, полученной из IgG1, IgG2 или IgG4. Примеры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 17 и 18.

В некоторых вариантах осуществления химерная константная область дополнительно содержит первый домен СН2 антитела и/или первый домен СН3 антитела.

Например, химерная константная область дополнительно содержит первый домен СН2-СН3 антитела, соединенный с С-концом третьего соединительного домена. Примеры последовательностей такой химерной константной области приведены в табл. 19.

В некоторых вариантах осуществления первая химерная константная область и второй константный домен TCR содержат пару последовательностей, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 177/176, 179/178, 184/183, 185/183, 180/176, 181/178, 182/178, 184/186, 185/186, 188/187, 196/187, 190/189, 192/191, 192/193, 195/194, 198/197, 200/199, 202/201, 203/201, 203/204, 205/204, 206/204, 208/207, 208/209, 211/210, 213/212, 213/151, 214/212, 214/151, 234/233, 232/231, 216/215, 218/217, 220/219, 222/221, 224/223, 226/225, 227/223, 229/228, 229/230, 236/235 и 238/237, как представлено в табл. 19.

Эти пары химерных константных областей и вторых константных доменов TCR полезны тем, что на них можно воздействовать для слияния с желаемой вариабельной областью антитела для получения полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании. Например, вариабельную область тяжелой цепи антитела можно подвергать слиянию с химерной константной областью (содержащей С1), таким образом, получая первую полипептидную цепь полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании; и аналогично, вариабельную область легкой цепи антитела можно подвергать слиянию со вторым константным доменом TCR (содержащим С2), таким образом, получая вторую полипептидную цепь полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании.

Эти пары химерных константных областей и вторых константных доменов TCR можно использовать в качестве платформы для получения первого антигенсвязывающего функционального фрагмента биспецифических полипептидных комплексов, представленных в настоящем описании. Например, вариабельные области первого антитела можно подвергать слиянию на N-конце последовательностей платформы (например, слиянию VH с химерным константным доменом и VL с константным доменом TCR, соответственно). Для получения биспецифического полипептидного комплекса можно конструировать и получать второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент, соединяя его в биспецифический полипептидным комплекс, представленный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления второй домен димеризации содержит шарнирную область. Шарнирную область можно получать из антитела, такого как IgG1, IgG2 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления второй домен димеризации, необязательно, может дополнительно содержать домен СН2 антитела и/или домен СН3 антитела, например, такой как область шарнир-Fc. Шарнирную область можно соединять с тяжелой цепью второго антигенсвязывающего участка (например, Fab).

В биспецифическом полипептидном комплексе первый и второй домен димеризации могут связываться в димер. В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации отличаются и связываются так, что препятствуют гомодимеризации и/или способствуют гетеродимеризации. Например, первый и второй домены димеризации можно выбирать так, чтобы они не были идентичными и преимущественно образовывали гетеродимеры друг с другом, а не гомодимеры сами с собой. В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации могут связываться с образованием гетеродимеров посредством выступа-во-впадину, гидрофобного взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофильного взаимодействия или повышенной гибкости.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации содержат домены СН2 и/или СН3, соответственно, подвергнутые мутации для образования выступов-во-впадины. Выступ можно получать посредством замены небольшого аминокислотного остатка более крупным остатком в первом полипептиде СН2/СН3, а впадину можно получать посредством замены крупного остатка меньшим остатком. Подробное описание участков мутаций выступы-во-впадину см. в Ridgway et al., 1996, выше, Spiess et al., 2015, выше и Brinkmann et al., 2017, выше.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации содержат первый домен СН3 изотипа IgG1, содержащий замены S139C и T151W (SEQ ID NO: 295, выступ), и второй домен СН3 изотипа IgG1, содержащий замены Y134C, T151S, L153A и Y192V (SEQ ID nO: 296, впадина). В других вариантах осуществления первый и второй домены димеризации содержат первый домен СН3 изотипа IgG4, содержащий замены S136C и T148W (SEQ ID NO: 298, выступ), и второй домен СН3 изотипа IgG4, содержащий замены Y131C, T148S, L150A и Y189V (SEQ ID NO: 299, впадина). Последовательности и нумерация Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 294) и Fc IgG4 дикого типа (SEQ ID NO: 297) приведены на фиг. 20A-20D. Как указано выше, обозначение XnY относится к Fc-области (например, домену СН3 Fc-области), нумерация аминокислотных остатков основана на нумерации, приведенной на фиг. 20A-20D.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй домены димеризации дополнительно содержат первую шарнирную область и вторую шарнирную область. Например, для стимуляции гетероди- 43 045653 меризации в шарнирную область IgG1 и IgG2 можно встраивать замены парами заряженных остатков.

Подробности см. в Brinkmann et al., 2017, выше.

Биспецифический формат.

Биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, может иметь любой подходящий биспецифический формат, известный в этой области. В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс основан на референсном формате биспецифического антитела. В рамках изобретения термин основан на в отношении биспецифического формата означает, что биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, имеет тот же биспецифический формат референсного биспецифического антитела, за исключением того, что формат антигенсвязывающего функционального фрагмента модифицирован так, что он содержит VH, функционально связанный с С1, и VL, функционально связанный с С2, где С1 и С2 соединяют посредством по меньшей мере одной ненативной межцепочечной связи, как определено выше. Неограничивающие примеры референсных форматов биспецифических антител, известных в этой области, включают (i) биспецифическое антитело с симметричным Fc, (ii) биспецифическое антитело с ассиметричным Fc, (iii) обычное антитело, соединенное с дополнительным антигенсвязывающим функциональным фрагментом, (iv) фрагмент биспецифического антитела, (v) фрагмент обычного антитела, соединенный с дополнительным антигенсвязывающим функциональным фрагментом, (vi) биспецифическое антитело, соединенное с альбумином человека или пептидом, связывающим альбумин человека.

BsIgG является моновалентным для каждого антигена, и его можно получать посредством коэкспрессии двух легких и двух тяжелых цепей в одной клетке-хозяине. Присоединяемый IgG конструируют так, чтобы он образовывал биспецифический IgG, посредством соединения амино- или карбокси-конца легких или тяжелых цепей с дополнительными антигенсвязывающими единицами. Дополнительные антигенсвязывающие единицы могут являться однодоменными антителами (неспаренными VL или VH), такими как DVD-Ig, спаренными вариабельными доменами антитела (например, Fv или scFv) или сконструированными белковыми каркасами. Любые из антигенсвязывающих единиц в BsIgG, в частности, спаренные VH-CH1/VL-CL, можно модифицировать для замены СН1 на С1 и CL на С2, как представлено в настоящем описании, для получения биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании.

Фрагменты биспецифических антител являются антигенсвязывающими фрагментами, полученными из антитела, но в которых отсутствует некоторые или все из константных доменов антитела. Примеры такого фрагмента биспецифического антитела включают, например, однодоменное антитело, Fv, Fab и диатело и т.д. Для получения биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, антигенсвязывающий участок (например, конкретные спаренные VH-CH1/VL-CL) в фрагменте биспецифического антитела, можно модифицировать так, чтобы он включал полипептидный комплекс, как представлено в настоящем описании (например, VH-C1/CL-C2).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на формате полного антитела, такого как полный IgG или IgGподобные молекулы, и небольшие рекомбинантные форматы, такие как молекулы тандемного одноцепочечного вариабельного фрагмента (taFv), диатела (Db), одноцепочечные диатела (scDb) и различные другие их производные (ср. форматы биспецифических антител, как описано в Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632. Примеры биспецифического антитела основаны на формате, включающем, в качестве неограничивающих примеров, квадрому, химически соединенные Fab (антигенсвязывающие фрагменты) и BiTE (привлекающий Т-клетки биспецифический активатор).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на биспецифическом формате, выбранном из Triomab; гибридной гибридоме (квадроме); мультиспецифической антикалиновой платформы (Pieris); диател; одноцепочечных диател; тандемных одноцепочечных Fv-фрагментов; TandAb, триспецифических Ab (Affimed); DART (переориентирующегося антитела с двойной аффинностью; Macrogenics); биспецифических Xmab (Xencor); привлекающих Т-клетки биспецифических активаторов (BiTE; Amgen; 55 кДа); Triplebody; многофункциональных рекомбинантных производных антител, слитого белка тритела (Fab-scFv) (CreativeBiolabs); платформы Duobody (Genmab); платформы Dock and lock; платформы выступ-во-впадину (KIH); гуманизированного биспецифического антитела IgG (REGN1979) (Regeneron); биспецифических антител Mab₂ (F-Star); DVD-Ig (иммуноглобулина с двойным вариабельным доменом) (Abbvie); каппалямбда-тел; TBTI (тетравалентного биспецифического тандемного Ig) и CrossMab.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на биспецифическом формате, выбранном из биспецифических IgGподобных антител (BsIgG), включающих CrossMab; DAF (два-в-одном); DAF (четыре-в-одном); DutaMab; DT-IgG; общей LC с выступами-во-впадину; сборки с выступами-во-впадину; пары заряженных остатков; обмена Fab-фрагментами; SEEDbody; Triomab; LUZ-Y; Fcab; каппа-лямбда-тела и ортогонального Fab. Подробное описание форматов биспецифических антител см. Spiess С., Zhai Q. and Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

- 44 045653

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на биспецифическом формате, выбранном из антител с добавленным IgG с дополнительным антигенсвязывающим функциональным фрагментом, включающих DVDIgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L, H)-Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zybody и DVI-IgG (четыре-в-одном) (см. там же).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на формате, выбранном из фрагментов биспецифических антител, включающих нанотело; нанотело-HAS; BiTE; диатело; DART; TandAb; sc-диатело; sc-диатело-СН3; диатело-СН3; TripleBody; миниантитело; минитело; TriBiminibody; scFv-СНЗ KIH; Fab-scFv; scFv-CH-CLscFv; F(ab')2; F(ab')2-scFv2; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; тетравалентное HCAb; sc-диатело-Fc; диатело-Fc; тандемное scFv-Fc и интратело (см. там же).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на биспецифическом формате, таком как Dock and Lock; ImmTAC; HSA-тело; sc-диатело-HAS и тандемное scFv-токсин (см. там же).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, основан на формате, выбранном из конъюгатов биспецифического антитела, включающих IgG-IgG; Cov-X-Body и scFv1-PEG-scFv2 (см. там же).

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй связывающий функциональный фрагмент можно соединять в Ig-подобную структуру. Igподобная структура подобна природному антителу, имеющему Y-образную конструкцию с двумя плечами для связывания антигена и одним стеблем для соединения и стабилизации. Сходство с природным антителом может обеспечивать различные преимущества, такие как хорошая фармакокинетика in vivo, желаемый иммунный ответ, стабильность и т.д. Обнаружено, что Ig-подобная структура, содержащая первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, представленный в настоящем описании и соединенный с вторым антигенсвязывающим функциональным фрагментом, представленным в настоящем описании, имеет термостабильность, сравнимую с термостабильностью Ig (например, IgG). В некоторых вариантах осуществления Ig-подобная структура, представленная в настоящем описании, имеет по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 100% термостабильности природного IgG.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс содержит четыре полипептидные цепи: i) VH1-С1-шарнирнαя область-СН2-СН3; ii) VL1-C2; iii) VH2-CH1шарнирная область-СН2-СН3 и iv) VL2-CL, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь, и две шарнирные области и/или два домена СН3 могут образовывать одну или более межцепочечных связей, способствующих димеризации.

Антигенные специфичности биспецифического комплекса.

Биспецифический комплекс, представленный в настоящем описании, имеет две антигенные специфичности. Первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты имеют первую и вторую антигенные специфичности, соответственно.

Первая и вторая антигенные специфичности могут быть идентичными, другими словами, первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты связываются с одной и той же молекулой антигена или с одним и тем же эпитопом одной молекулы антигена.

Альтернативно, первая и вторая антигенные специфичности могут отличаться. Например, первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты могут связываться с разными антигенами. Такой биспецифический полипептидный комплекс можно использовать, например, в сближении двух разных антигенов и, таким образом, стимуляции их взаимодействий (например, сближении иммунных клеток с опухолевым антигеном или антигеном патогена и, таким образом, стимуляции распознавания или элиминации такого антигена иммунной системой). В качестве другого примера, первый и второй антигенсвязывающие функциональные фрагменты могут связываться с разными (и, необязательно, неперекрывающимися) эпитопами одного антигена. Это может быть полезным в усилении распознавания или связывания с антигеном-мишенью, в частности, антигена, склонного к мутациям (например, вирусного антигена).

В некоторых вариантах осуществления одна из антигенных специфичностей биспецифического комплекса, представленного в настоящем описании, направлена против специфической для Т-клеток рецепторной молекулы и/или специфической для естественных киллеров (NK-клеток) рецепторной молекулы. В некоторых вариантах осуществления один из первого и второго антигенсвязывающих функциональных фрагментов может специфически связываться с CD3, TCR, CD28, CD16, NKG2D, Ох40, 4-1BB, CD2, CD5 или CD95, а другой может специфически связываться с опухолеассоциированным антигеном.

В некоторых вариантах осуществления одна из антигенных специфичностей биспецифического комплекса, представленного в настоящем описании, направлена против CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент биспецифического комплекса может специфически связываться с CD3. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент биспецифического комплекса может специфически связываться с CD3.

- 45 045653

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий функциональный фрагмент биспецифического комплекса содержит VH1 и VL1, полученные из антитела против CD3. В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, где первый полипептид и второй полипептид содержат пару последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/1, 3/4/, 5/1, 6/3, 7/3, 9/8, 10/8, 9/11, 10/11, 13/12, 15/14, 17/16, 17/18, 20/19, 21/12, 28/3, 29/3, 30/12, 31/12, 65/64, 67/66, 69/68, 70/68, 70/71, 72/71, 73/71, 75/74, 75/76, 78/77, 86/85, 90/89, 91/92/, 94/93, 96/95, 98/97, 99/95, 101/100, 101/102, 106/105, 108/107, 110/109, 112/111, 137/136, 138/136, 137/139 и 138/139, где вариабельные области антитела против CD3 (Т3) слиты с константной областью TCR, как показано в табл. 20.

В некоторых вариантах осуществления одна из антигенных специфичностей биспецифического комплекса, представленного в настоящем описании, направлена против специфической для Т-клеток рецепторной молекулы и/или специфической для естественных киллеров (NK-клеток) рецепторной молекулы, а другая антигенная специфичность направлена против опухолеассоциированного поверхностного антигена. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент биспецифического комплекса может специфически связываться со специфической для Т-клеток рецепторной молекулой и/или специфической для естественных киллеров (NK-клеток) рецепторной молекулой (такой как CD3), и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент может специфически связываться с опухолеассоциированным антигеном (таким как CD19), или наоборот.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс содержит комбинацию четырех последовательностей, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22/12/24/23 (Е17, IgG1), 25/12/26/23 (Е17, IgG4) и 25/12/27/23 (F16), как показано в примере 8 и 20, где первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD3, и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент связывается с CD19. Дизайн Е17 представляет собой биспецифическое, бивалентное антитело, и дизайн F16 представляет собой биспецифический и тривалентный антигенсвязывающий комплекс с двумя повторами Fab антитела против CD19.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс содержит первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент, связывающийся с CTLA-4, и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент, связывающийся с PD-1, или наоборот.

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс содержит четыре полипептидные цепи, содержащие: i) VH1, функционально связанный с первой химерной константной областью; ii) VL1, функционально связанный со второй химерной константной областью; iii) VH2, функционально связанный с общепринятой константной областью тяжелой цепи антитела, и iv) VL2, функционально связанный с общепринятой константной областью легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления первая химерная константная область может содержать С1-шарнирная область-СН2-СН3, каждый из которых определен выше. В некоторых вариантах осуществления вторая химерная константная область может содержать С2, как определено выше. В некоторых вариантах осуществления общепринятая константная область тяжелой цепи антитела может содержать СН1-шарнирная область-СН2-СН3, каждый из которых определен выше. В некоторых вариантах осуществления общепринятая константная область легкой цепи антитела может содержать CL, как определено выше.

В настоящем описании следующие названия конструкций используют взаимозаменяемо: E17Дизайн_2-QQQQ и W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP; Е16-Дизайн_2-QQQQ и W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP; U6T5.G25.IgG4 и W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP; и U6T1.G25R.IgG4 и W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP.

Способ получения.

Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам или полинуклеотидам, кодирующим полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании.

В рамках изобретения термин нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин включает полинуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, имеющие связывающие свойства, схожие с референсной нуклеиновой кислотой, и метаболизируемые аналогично природным нуклеотидам. Если не указано иначе, конкретная полинуклеотидная последовательность также безусловно включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также конкретно указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов можно осуществлять посредством получения последовательностей, в которых третье положение одного или более из выбранных (или всех) кодонов заменяют смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (см. Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды, кодирующие полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно конструировать рекомбинантными способами. В связи с этим, ДНК, кодирующую антигенсвязывающий функциональный фрагмент родительского антитела (такой как CDR или вариабельная область), можно выделять и секве

- 46 045653 нировать общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые могут специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Аналогично, также можно получать ДНК, кодирующую константную область TCR. Например, полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный домен (VH), и полинуклеотидную последовательность, кодирующую первую константную область TCR (C1), получают и функционально связывают, чтобы сделать возможной транскрипцию и экспрессию в клетке-хозяине для получения первого полипептида. Аналогично, полинуклеотидную последовательность, кодирующую VL, функционально связывают с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей С1, чтобы сделать возможной экспрессию второго полипептида в клетке-хозяине. При необходимости, кодирующие полинуклеотидные последовательности одного или более спейсеров также функционально связывают с другими кодирующими последовательностями, чтобы сделать возможной экспрессию желаемого продукта.

Кодирующие полинуклеотидные последовательности можно дополнительно функционально связывать с одной или более регуляторными последовательностями, необязательно, в экспрессирующем векторе, таким образом, что экспрессия или продукция первого и второго полипептидов является осуществимой и находится под правильным контролем.

Кодирующие полинуклеотидные последовательности можно встраивать в вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии рекомбинантными способами, известными в этой области. В другом варианте осуществления полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно получать посредством гомологичной рекомбинации, известной в этой области. Доступно множество векторов. Компоненты вектора, как правило, включают, в качестве неограничивающих примеров, одно или более из следующего: сигнальной последовательности, участка начала репликации, одного или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор (например, SV40, CMV, EF-1a) и последовательность терминации транскрипции.

В рамках изобретения термин вектор относится к носителю, в который можно функционально встраивать полинуклеотид, кодирующий белок, для достижения экспрессии этого белка. Как правило, конструкция также включает подходящие регуляторные последовательности. Например, молекула полинуклеотида может включать регуляторные последовательности, локализованные в 5'-фланкирующей области нуклеотидной последовательности, кодирующей гидовую РНК, и/или нуклеотидной последовательности, кодирующей сайт-специфический модифицирующий полипептид, функционально связанные с кодирующими последовательностями так, чтобы сделать возможной экспрессию желаемого транскрипта/гена в клетке-хозяине. Вектор можно использовать для трансформации, трансдукции или трансфекции клетки-хозяина для достижения экспрессии генетического элемента, который он несет внутри клеткихозяина. Примеры векторов включают плазмиды, фагмиды, космиды, искусственные хромосомы, такие как искусственная дрожжевая хромосома (YAC), искусственная бактериальная хромосома (ВАС) или полученная из Р1 искусственная хромосома (РАС), бактериофаги, такие как фаг лямбда или фаг М13, и вирусы животных. Категории вирусов животных, используемых в качестве векторов, включают ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (например, SV40). Вектор может содержать различные элементы для контроля экспрессии, включая промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности, подвергаемые селекции элементы и репортерные гены. Кроме того, вектор может содержать участок начала репликации. Вектор также могут включать средства для его проникновения в клетку, включая, в качестве неограничивающих примеров, вирусную частицу, липосому или белковое покрытие.

В некоторых вариантах осуществления векторная система включает системы млекопитающих, бактерий, дрожжей и т.д. и содержит плазмиды, в качестве неограничивающих примеров, такие как, pALTER, pBAD, pcDNA, pCa1, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 и т.д., и другие лабораторные и коммерчески доступные векторы. Подходящие векторы могут включать плазмиды или вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы).

Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, можно встраивать в клетку-хозяина для клонирования или экспрессии генов. В рамках изобретения фраза клетка-хозяин относится к клетке, в которую встроен экзогенный полинуклеотид и/или вектор.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по настоящему изобретению являются клетками прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанными выше. Подходящие для этой цели прокариоты включают эубактерий, таких как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis, Pseudomonas, такие как Р. aeruginosa, и Streptomyces.

В дополнение к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитевидные грибы или

- 47 045653 дрожжи, являются подходящими организмами-хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако, доступен ряд других родов, видов и штаммов, и их можно использовать в настоящем изобретении, такие как Schizosaccharomyces pombe; организмы-хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans и K. marxianus; Yarrowia (ЕР 402.226); Pichia pastoris (ЕР 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитевидные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A nidulans и A niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного полипептидного комплекса, биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем изобретении, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Определено множество штаммов и вариантов бакуловирусов и соответствующих пермиссивных клетокхозяев насекомых, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Общедоступны различные штаммы вирусов для трансфекции, например, вариант L-1 NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori, и такие вирусы можно использовать в качестве вируса по настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Также в качестве клеток-хозяев можно использовать культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томата и табака.

Однако, наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало общепринятым способом. Примерами линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно использовать, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), такие как Expi293; клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомяка/-DHFR (СНО, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой макаки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы Buffalo (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).

Клетки-хозяева трансформируют с использованием описанных выше экспрессирующих или клонирующих векторов, их можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных, при необходимости, для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации клонирующих векторов.

Для получения полипептидного комплекса и биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, клетки-хозяева, трансформированные с использованием экспрессирующего вектора, можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма F10 (Sigma), минимальная питательная среда (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) (Sigma). Кроме того, в качестве среды для культивирования клеток-хозяев можно использовать любые из сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США №№ 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США № Re. 30,985. При необходимости, любые из этих сред можно дополнять гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальциевые, магниевые и фосфатные соли), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как лекарственное средство GENTAMYCIN™), микроэлементами (определенными как неорганические соединения, как правило, присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Также можно включать любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, которые будут известны специалистам в этой области. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и будут очевидны специалистам в этой области.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу экспрессии полипептидного комплекса и биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина, представленной в настоящем описании, в условиях, в которых экспрессируется полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему а) встраивание в клет

- 48 045653 ку-хозяина первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к Сконцу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (Cl) TCR, и второй полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где: С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер С1 и С2, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность; b) экспрессию полипептидного комплекса клеткой-хозяином.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, включающему а) встраивание в клетку-хозяина первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (C1) TCR, второй полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, и один или более дополнительных полинуклеотидов, кодирующих второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент, где: С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер С1 и С2, первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент и второй антигенсвязывающий функциональный фрагмент имеют неправильное спаривание, сниженное по сравнению с тем, которое было бы, если бы первый антигенсвязывающий функциональный фрагмент был соответствующей частью природного Fab, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность, и второе антитело имеет вторую антигенную специфичность, b) экспрессию биспецифического полипептидного комплекса клеткой-хозяином.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение полипептидного комплекса.

При использовании рекомбинантных способов полипептидный комплекс, биспецифический полипептидным комплекс, представленный в настоящем описании, может продуцироваться внутриклеточно в периплазматическом пространстве или напрямую секретироваться в среду. Если продукт продуцируется внутриклеточно, в качестве первой стадии удаляют дебрис из макрочастиц, клетки-хозяева или лизированные фрагменты, например, посредством центрифугирования или ультрафильтрации. В Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описывают способ выделения антител, секретируемых в периплазматическом пространстве Е. coli. В кратком изложении, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), ЭДТА и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение приблизительно 30 мин. Клеточный дебрис можно удалять посредством центрифугирования. Если продукт секретируется в среду, супернатанты таких систем экспрессии, как правило, сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационного блока Amicon или Millipore Pellicon. В любую из указанных выше стадий можно включать ингибитор протеазы, такой как PMSF, для ингибирования протеолиза и антибиотики для предотвращения роста незапланированных контаминантов.

Полипептидный комплекс и биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании и полученный из клеток, можно очищать с использованием, например, хроматографии на гидроксиапатите, электрофореза в геле, диализа, ионообменной хроматографии на DEAEцеллюлозе, осаждения сульфатом аммония, высаливания и аффинной хроматографии, при этом аффинная хроматография является предпочтительным способом очистки.

Если полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, содержит Fc-домен иммуноглобулина, в качестве аффинного лиганда можно использовать протеин А в зависимости от биологического вида и изотипа Fc-домена, присутствующего в полипептидном комплексе. Для очистки полипептидных комплексов на основе тяжелых цепей γ1, γ2 или γ4 человека можно использовать протеин A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Протеин G рекомендуют для всех изотипов мыши и γ3 человека (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). Матрицей, к которой присоединяют аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но доступны другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или полистиролдивинилбензол, делают возможными более высокие скорости потока и меньшее время обработки, чем в случае агарозы.

Если полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, содержит домен СН3, для очистки можно использовать смолу Bakerbond ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Доступны другие способы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарин-сефарозе, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, в колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в

- 49 045653

ПААГ в присутствии SDS и осаждение сульфатом аммония, в зависимости от выделяемого антитела.

После любых стадий предварительной очистки смесь, содержащую интересующий полипептидный комплекс и контаминантов, можно подвергать хроматографии гидрофобных взаимодействий при низком рН с использованием элюирующего буфера с рН приблизительно от 2,5-4,5, предпочтительно, осуществляемой при низких концентрациях соли (например, приблизительно от 0-0,25 М).

В некоторых вариантах осуществления биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, легко можно очищать общепринятыми способами с высоким выходом. Одним из преимуществ биспецифического полипептидного комплекса является значительно сниженное неправильное спаривание между последовательностями вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи. Это снижает продукцию нежелательных побочных продуктов и позволяет получать продукт с высокой чистотой и высоким выходом при использовании относительно простых способов очистки.

Производные.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс можно использовать в качестве основы для конъюгации с желаемыми конъюгатами.

Предполагают, что с полипептидным комплексом или биспецифическим полипептидным комплексом, представленным в настоящем описании, можно связывать различные конъюгаты (см., например, Conjugate Vaccines, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse и R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)). Эти конъюгаты можно связывать с полипептидным комплексом или биспецифическим полипептидным комплексом посредством, помимо других способов, ковалентного связывания, аффинного связывания, интеркаляции, координационного связывания, комплексирования, соединения, смешивания или добавления.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно конструировать так, чтобы он содержал специфические участки вне эпитоп-связывающей части, которые можно использовать для связывания с одним или более конъюгатами. Например, такой участок может включать один или более реакционноспособных аминокислотных остатков, таких как, например, остатки цистеина или гистидина, для облегчения ковалентного связывания с конъюгатом.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс можно связывать с конъюгатом косвенно или косвенно, например, с помощью другого конъюгата или линкера.

Например, полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, содержащий реакционноспособный остаток, такой как цистеин, можно связывать с средством, реагирующим с тиолом, в котором реакционная группа является, например, малеимидом, йодацетамидом, пиридилдисульфидом или другим реагирующим с тиолом партнером по конъюгации (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).

В качестве другого примера, полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс можно конъюгировать с биотином, затем косвенно конъюгировать со вторым конъюгатом, конъюгированным с авидином. В качестве еще одного примера, полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс можно связывать с линкером, связанным с конъюгатом. Примеры линкером включают бифункциональные связывающие средства, такие как N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидные соединения (такие как бис(р-азидобензоил)гександиамин), производные бидиазония (такие как бис-(р-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6диизоцианат) и цис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифторо-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительные связывающие средства включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) для получения дисульфидной связи.

Конъюгат может представлять собой детектируемую метку, модифицирующий фармакокинетику функциональный фрагмент, функциональный фрагмент для очистки или цитотоксический функциональный фрагмент. Примеры детектируемой метки могут включать флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, родамин, данзил, фикоэритрин или Texas Red), фермент-субстратные метки (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, люциферазы, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы или β-Dгалактозидазу), радиоактивные изотопы (например, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H, ⁿ¹In, ¹¹²In, ¹⁴C, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸y, ⁹0у, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi и ³²P, другие лантаноиды, люминесцентные метки), хромофорный функциональный фрагмент, дигоксигенин, биотин/авидин, молекулу ДНК или золото для детекции. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может представлять собой модифицирующий фармакокинетику функциональный фрагмент, такой как PEG, с помощью которого повышают время по- 50 045653 лужизни антитела. Другие подходящие полимеры включают карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоль и т.п. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может представлять собой функциональный фрагмент для очистки, такой как магнитные частицы. Цитотоксический функциональный фрагмент может являться любым средством, вредным для клеток, или средством, которое может повреждать или уничтожать клетки. Неограничивающие примеры цитотоксического функционального фрагмента включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и его аналоги, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие средства (например, мехлоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее известный как дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее известный как актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).

Способы конъюгации конъюгатов с белками, такими как антитела, иммуноглобулины или их фрагменты, можно найти, например, в патенте США № 5208020; патенте США № 6441163; WO2005037992; WO2005081711 и WO2006/034488, включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Фармацевтическая композиция.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Термин фармацевтически приемлемый означает, что указанные носитель, дилюент, эксципиенты и/или соль, как правило, химически и/или физически совместимы с другими ингредиентами, содержащимися в составе, и физиологически совместимы с реципиентом.

Термин фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, иному, чем активный ингредиент, и являющемуся приемлемым для биологической активности и нетоксичным для индивидуума. Фармацевтические приемлемые носители для использования в фармацевтических композициях, представленных в настоящем описании, могут включать, например, фармацевтически приемлемую жидкость, гель или твердые носители, водные носители, неводные носители, противомикробные средства, изотонические средства, буферы, антиоксиданты, анестетики, суспендирующие/диспергирующие средства, комплексообразующие или хелатирующие средства, дилюенты, адъюванты, эксципиенты или нетоксичные вспомогательные средства, другие компоненты, известные в этой области, или различные их комбинации.

Подходящие компоненты могут включать, например, антиоксиданты, наполнители, связывающие средства, разрыхлители, буферы, консерванты, смазочные средства, вкусовые добавки, загустители, красители, эмульгаторы или стабилизаторы, такие как сахара и циклодекстрины. Подходящие антиоксиданты могут включать, например, метионин, аскорбиновую кислоту, ЭДТА, тиосульфат натрия, платину, каталазу, лимонную кислоту, цистеин, тиоглицерин, тиогликолевую кислоту, тиосорбит, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол и/или пропилгаллат. Как представлено в настоящем описании, включение в фармацевтическую композицию, представленную в настоящем описании, одного или более антиоксидантов, таких как метионин, снижает окисление полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса. Это снижение окисления предотвращает или снижает потерю аффинности связывания, таким образом, улучшая стабильность белка и максимизируя срок годности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, и один или более антиоксидантов, таких как метионин.

В качестве иллюстративного примера, фармацевтические приемлемые носители могут включать водные носители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильную воду для инъекций или декстрозу и лактат Рингера для инъекций, неводные носители, такие как жирные масла растительного происхождения, хлопковое масло, кукурузное масло, сезамовое масло или арахисовое масло, противомикробные средства в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, изотонические средства, такие как хлорид натрия или декстроза, буферы, такие как фосфатный или цитратный буферы, антиоксиданты, такие как бисульфат натрия, местные анестетики, такие как прокаин гидрохлорид, суспендирующие и диспергирующие средства, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливинилпирролидон, эмульгаторы, такие как полисорбат 80 (TWEEN-80), комплексообразующие или хелатирующие средства, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), этиловый спирт, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, гидроксид натрия, соляная кислота, лимонная кислота или молочная кислота. Противомикробные средства, используемые в качестве носите

- 51 045653 лей, можно добавлять в фармацевтические композиции в многодозовых контейнерах, включая фенолы или крезолы, ртутные препараты, бензиловый спирт, хлорбутанол, метиловый и пропиловый сложные эфиры р-гидроксибензойной кислоты, тиомерсал, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Подходящие эксципиенты могут включать, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или этанол. Подходящие нетоксичные вспомогательные средства могут включать, например, увлажнители или эмульгаторы, рН-буферные средства, стабилизаторы, усилители растворимости или средства, такие как ацетат натрия, сорбитанмонолаурат, триэтаноламинолеат или циклодекстрин.

Фармацевтические композиции могут представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, пилюлю, капсулу, таблетку, состав с замедленным высвобождением или порошок. Пероральные составы могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливинилпирролидон, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической категории и т.д.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции составляют в инъецируемой композиции. Инъецируемые фармацевтические композиции можно получать в любой общепринятой форме, такой как например жидкий раствор, суспензия, эмульсия или твердые формы, подходящие для получения жидкого раствора, суспензии или эмульсии. Препараты для инъекции могут включать готовые стерильные и/или непирогенные растворы для инъекций, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые для комбинирования с растворителем непосредственно перед использованием, включая подкожные таблетки, готовые стерильные суспензии для инъекций, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые для комбинирования с носителем непосредственно перед использованием, и стерильные и/или непирогенные эмульсии. Растворы могут быть водными или неводными.

В некоторых вариантах осуществления парентеральные препараты в однократной дозе упаковывают в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными и непирогенными, как известно в этой области.

В некоторых вариантах осуществления стерильный лиофилизированный порошок получают посредством растворения полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, в подходящем растворителе. Растворитель может содержать эксципиент, улучшающий стабильность, или другие фармакологические компоненты порошка или восстановленного раствора, полученные из порошка. Эксципиенты, которые можно использовать, включают, в качестве неограничивающих примеров, воду, декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу или другое подходящее средство. Растворитель может содержать буфер, такой как цитрат, фосфат натрия или калия или другой такой буфер, известный специалистам в этой области, в одном из вариантов осуществления с приблизительно нейтральным рН. При последующей стерильной фильтрации раствора с последующей лиофилизацией в стандартных условиях, известных специалистам в этой области, получают желаемый состав. В одном из вариантов осуществления получаемый раствор будут распределять по флаконам для лиофилизации. Каждый флакон может содержать однократную дозу или многократные дозы полипептидного комплекса, биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, или их композиции. Наполнение флаконов количеством, немного превышающим количество, необходимое для дозы или набора доз (например, приблизительно 10%), является приемлемым для облегчения точного забора доз. Лиофилизированный порошок можно хранить в соответствующих условиях, например, при от приблизительно 4°С до комнатной температуры.

Посредством восстановления лиофилизированного порошка водой для инъекций получают состав для использования в парентеральном введении. В одном из вариантов осуществления для восстановления в лиофилизированный порошок добавляют стерильную и/или непирогенную воду или другой подходящий жидкий носитель. Точное количество зависит от выбранной терапии, и его можно определять эмпирически.

Способ лечения.

Настоящее изобретение также относится к терапевтическим способам, включающим: введение терапевтически эффективного количества полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, нуждающемуся в этом индивидууму и, таким образом, лечение или профилактику состояния или нарушения. В некоторых вариантах осуществления индивидуума определяют как имеющего нарушение или состояние, которое, вероятно, ответит на полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании.

В рамках изобретения термин лечение состояния включает профилактику или облегчение состояния, замедление дебюта или скорости развития состояния, снижение риска развития состояния, профилактику или задержку развития симптомов, ассоциированных с состоянием, снижение или устранение симптомов, ассоциированных с состоянием, достижение полной или частичной регрессии состояния, излечение состояния или некоторую их комбинацию.

Терапевтически эффективное количество полипептидного комплекса и биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, будет зависеть от различных факторов, из

- 52 045653 вестных в этой области, таких как, например, масса тела, возраст, медицинский анамнез, используемые в настоящее время лекарственные средства, состояние здоровья индивидуума и потенциальные перекрестные реакции, аллергия, чувствительность и неблагоприятные побочные эффекты, а также способ введения и степень развития заболевания. Специалист в этой области (например, лечащий врач или ветеринар) может пропорционально снижать или повышать дозы с учетом этих и других обстоятельств или требований.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно вводить в терапевтически эффективной дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг (например, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 55 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 75 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно мг/кг, приблизительно 90 мг/кг, приблизительно 95 мг/кг или приблизительно 100 мг/кг). В некоторых из этих вариантов осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, вводят в дозе приблизительно 50 мг/кг или менее, и в некоторых из этих вариантов осуществления доза составляет 10 мг/кг или менее, 5 мг/кг или менее, 1 мг/кг или менее, 0,5 мг/кг или менее или 0,1 мг/кг или менее. В некоторых вариантах осуществления вводимую дозу можно изменять в течение лечения. Например, в некоторых вариантах осуществления начальная вводимая доза может быть выше, чем последующие вводимые дозы. В некоторых вариантах осуществления вводимую дозу можно варьировать в течение лечения в зависимости от реакции индивидуума.

Режимы дозирования можно корректировать для достижения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить однократную дозу или можно вводить несколько дробных доз с течением времени.

Полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно вводить любым путем, известным в этой области, например, парентеральным (например, подкожным, интраперитонеальным, внутривенным, включая внутривенную инфузию, внутримышечным или внутрикожным путем посредством инъекции) или непарентеральным (например, пероральным, интраназальным, внутриглазным, сублингвальным, ректальным или местным) путями.

В некоторых вариантах осуществления состояние или нарушение, которое лечат полипептидным комплексом или биспецифическим полипептидным комплексом, представленным в настоящем описании, представляет собой злокачественное новообразование, аутоиммунные заболевания, инфекционные и паразитарные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, нейропатии, психоневрологические состояния, травмы, воспаление или нарушение свертывания.

В рамках изобретения термин злокачественное новообразование относится к любому заболеванию, опосредованному ростом, пролиферацией или метастазированием неопластических или злокачественных клеток, и включает солидные злокачественные новообразования и несолидные злокачественные новообразования, такие как лейкоз. В рамках изобретения термин опухоль относится к солидной массе неопластических и/или злокачественных клеток.

В отношении злокачественного новообразования термин лечение может относиться к ингибированию или замедлению роста, пролиферации или метастазирования неопластических или злокачественных клеток, профилактике или замедлению развития роста, пролиферации или метастазирования неопластических или злокачественных клеток или некоторым их комбинациям. В отношении опухоли термин лечение включает эрадикацию всей или части опухоли, ингибирование или замедление роста опухоли и метастазирования, профилактику или замедление развития опухоли или некоторые их комбинации.

Например, в отношении использования полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании, для лечения злокачественного новообразования, терапевтически эффективное количество представляет собой дозу или концентрацию полипептидного комплекса, с помощью которой можно устранить всю опухоль или ее часть, ингибировать или замедлить рост опухоли, ингибировать рост или пролиферацию клеток, опосредующих злокачественное новообразование, ингибировать метастазирование опухолевых клеток, улучшить какой-либо симптом или маркер, ассоциированный с опухолью или злокачественным новообразованием, предотвратить или замедлить развитие опухоли или злокачественного новообразования, или возможны некоторые комбинации.

В некоторых вариантах осуществления состояния и нарушения включают опухоли и злокачественные новообразования, например, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, почечноклеточный рак, колоректальный рак, рак яичников, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, карциному желудка, рак мочевого пузыря, рак пищевода, мезотелиому, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, карциному тимуса, лейкоз, лимфомы, миеломы, фунгоидный микоз, рак из клеток Меркеля и другие гемобластозы, такие как классическая лимфома Ходжкина (CHL), первичную медиастинальную крупноклеточную В

- 53 045653 клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами В-клеточную лимфому, EBV-положительный и -отрицательный PTLD и EBV-ассоциированную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), плазмобластную лимфому, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому, назофарингеальную карциному и HHV8-ассоциированную первичную выпотную лимфому, лимфому Ходжкина, неоплазию центральной нервной системы (ЦНС), такую как первичная лимфома ЦНС, опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга.

В некоторых вариантах осуществления состояния и нарушения включают CD19-ассоциированное заболевание или состояние, такое как В-клеточная лимфома, необязательно, лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома, где неходжкинская лимфома включает: диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, В-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (MZL), лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (хронический лимфоцитарный лейкоз, CLL) или лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или макроглобулинемию Вальденстрема (WM).

В некоторых вариантах осуществления состояния и нарушения включают гиперпролиферативные состояния или инфекционные заболевания, которые можно лечить посредством регуляции иммунных ответов с помощью CTLA-4 и/или PD-1. Неограничивающих примеры гиперпролиферативных состояний включают солидные опухоли, гемобластозы, опухоли мягких тканей и метастатические очаги.

Полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс можно вводить в отдельности или в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими способами или средствами.

В некоторых вариантах осуществления при использовании для лечения злокачественного новообразования, или опухоли, или пролиферативного заболевания полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, можно вводить в комбинации с химиотерапией, лучевой терапией, хирургическим вмешательством для лечения злокачественного новообразования (например, туморэктомией), одним или более антиэметиками или другими лекарственными средствами против осложнений химиотерапии или любым другим терапевтическим средством для использования в лечении злокачественного новообразования или любого родственного заболевания. В рамках изобретения термин вводимый в комбинации включает одновременное введение в виде части одной и той же фармацевтической композиции, одновременное введение в виде отдельных композиций или введение в разные моменты времени в виде отдельных композиций. Композицию, вводимую до или после другого средства, считают вводимой в комбинации с тем средством, как эту фразу используют в настоящем описании, даже если композицию и второе средство вводят разными путями. По возможности, дополнительные терапевтические средства, вводимые в комбинации с полипептидным комплексом или биспецифическим полипептидным комплексом, представленным в настоящем описании, вводят по схеме, указанной в информационном листке дополнительного терапевтического средства, или в соответствии с Physicians' Desk Reference (Physicians' Desk Reference, 70th Ed (2016)) или протоколами, хорошо известными в этой области.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства могут индуцировать или усиливать иммунный ответ против злокачественного новообразования. Например, для индукции иммунного ответа на некоторые опухоли или злокачественные новообразования можно использовать противоопухолевую вакцину. Для усиления презентации опухолевого антигена иммунной системе также можно использовать цитокиновую терапию. Неограничивающие примеры цитокиновой терапии включают интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ, колониестимулирующие факторы, такие как макрофагальный КСФ, гранулоцитарно-макрофагальный КСФ и гранулоцитарный КСФ, интерлейкины, такие как ИЛ-1, ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11 и ИЛ-12, факторы некроза опухоли, такие как ФНОа и ФНОв. Также можно использовать средства, инактивирующие иммуносупрессорные мишени, например, ингибиторы TGF-бета, ингибиторы ИЛ-10 и ингибиторы Fas-лиганда. Другая группа средств включает средства, активирующие иммунологическую реактивность в отношении опухолевых или злокачественных клеток, например, средства, повышающие активацию Т-клеток (например, агонист Т-клеточных костимуляторных молекул, таких как CTLA-4, ICOS и ОХ-40), и средства, повышающие функцию дендритных клеток и презентацию антигена.

Наборы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к наборам, содержащим полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления наборы можно использовать для детекции наличия или уровня, или захвата или обогащения одной или более интересующих мишеней в биологическом образце. Биологический образец может содержать клетку или ткань.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, конъюгированный с детектируемой меткой. В некоторых других вариантах осуществления набор содержит немеченый полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании,

- 54 045653 и дополнительно содержит вторичное меченое антитело, которое может связываться с немеченым полипептидным комплексом или биспецифическим полипептидным комплексом, представленным в настоящем описании. Набор может дополнительно содержать инструкции по использованию и упаковку, с помощью которой отделяют каждый из компонентов в наборе.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный комплекс или биспецифический полипептидный комплекс, представленный в настоящем описании, связан с субстратом или устройством. Субстрат или устройство, которые можно использовать, могут представлять собой, например, магнитные частицы, планшет для микротитрования или тест-полоску. Их можно использовать для анализа связывания (такого как ELISA), иммунографического анализа, захвата или обогащения молекулы-мишени в биологическом образце.

Следующие примеры представлены для лучшего иллюстрирования описываемого в заявке изобретения, и их не следует истолковывать как ограничение объема изобретения. Все конкретные композиции, материалы и способы, описанные ниже, полностью или частично попадают в объем настоящего изобретения. Эти конкретные композиции, материалы и способы предназначены не для ограничения изобретения, а для иллюстрирования конкретных вариантов осуществления, попадающих в объем изобретения. Специалист в этой области может разрабатывать эквивалентные композиции, материалы и способы без осуществления изобретательского потенциала и без отклонения от объема изобретения. Следует понимать, что в способах, представленных в настоящем описании, можно осуществлять множество изменений, оставаясь в рамках настоящего изобретения. Авторами настоящего изобретения предусмотрено включение таких изменений в объем изобретения.

Таблица 11

Дизайн и обозначения химерных константных областей (С-бета/С-альфа)

Домены и SEQ ID NO химерных константных областей (С-бета/С-альфа)

Название химерной константной области и SEQ Ш NO цепи:	Домены с N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Первый или второй соединительн ый домен (CJ)	Константный домен TCR (С1 или С2)	Третий соединительны й домен+шарнир ная область (СГ)	Домен димеризации (D)
НС Дизайн !	нсл	С-бета (S56C)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 177	SEQ ГО NO: 49	SEQ ГО NO: 33	SEQ ГО NO: 53	SEQ ГО NO: 302
LC Дизайн !	LCJ1	С-альфа (Т49С)
SEQ ГО NO: 176	SEQ ГО NO: 51	SEQ ГО NO: 43
НС Дизайн !	HCJ2	С-бета (S56C)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 179	SEQ ГО NO:	SEQ ГО NO: 33	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO:

- 55 045653

	50			302
LC Дизайн !	LCJ2	С-альфа (T49C)
SEQ ID NO: 178	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 43
НС ДизайнЗ	HCJ3	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ID NO: 184	SEQ ID NO: 129	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн З	LCJ3	С-бета (S56C)
SEQ ID NO: 183	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 33+NO: 306
НС Дизайн_4	HCJ4	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ID NO: 185	SEQ ID NO: 130	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_4	LCJ3	С-бета (S56C)
SEQ ID NO: 183	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 33+NO: 306
НС Дизайн_5	HCJ1	С-бета (S56C) (FG-)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 180	SEQ ID NO: 49	SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_5	LCJ1	С-альфа (T49C)
SEQ ID NO: 176	SEQ ID NO: 51	SEQ ID NO: 43
НС Дизайнб	HCJ1	С-бета (S56C)(FG- )	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 181	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн б	LCJ2	С-альфа (T49C)
SEQ ID NO: 178	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 43
НС Дизайнба	HCJ2	С-бета (S56C)(DE- FG-)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 182	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 41	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн ба	LCJ2	С-альфа (T49C)
SEQ ID NO: 178	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 43
НС Дизайн ?	HCJ3	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ГО NO: 184	SEQ ID NO: 129	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн ?	LCJ3	С-бета (S56C)(FG- )
SEQ ID NO: 186	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 37+NO: 306
НС Дизайн_8	HCJ4	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ID NO: 185	SEQ ID NO: 130	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_8	LCJ3	С-бета (S56C)(FG- )
SEQ ID NO: 186	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 37+NO: 306

- 56 045653

Таблица 13

Дизайн и обозначения Дизайн_2 (С-бета/С-альфа) без участков гликозилирования

Образец	SEQ ID NO: (НС-С-бета/ЬС-С-альфа) HC/LC
Дизaйн_2-QQQQ	188/187 (IgGl) 196/187 (IgG4)
Дизайн_2-АААА	190/189 (IgGl)
Дизaйн_2-QSKE	192/191 (IgGl)
Дизайн_2-А8КЕ	192/193 (IgGl)
Дизaйн_2-QQQQQ	195/194 (IgGl)

Таблица 14

Домены и SEQ ID NO Дизайн_2 (С-бета/С-альфа) без участков гликозилирования

Название комплекса и SEQ ID NO цепи	Домены c N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Первый или второй соединительный	Константный домен TCR (С1 или С2)	Третий соединительны й	Домен димеризаци h(D)
	домен (CJ)		домен+шарнир ная область (СТ)
НС Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 188	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ГО NO: 53	SEQ ГО NO: 302
LC Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	LCJ2	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68Q + N79Q)
SEQ ID NO: 187	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 44
НС Дизайн_2- QQQQ (lgG4)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ1G4	FcG4
SEQ ID NO: 196	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ГО NO: 54	SEQ ID NO: 303
LC Дизайн_2- QQQQ (lgG4)	LCJ2	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68Q + N79Q)
SEQ ID NO: 187	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 44
НС Дизайн_2- AAAA (IgGl)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69A)	CJ1G1	FcGl
SEQ ID NO: 190	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 35	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2- AAAA (IgGl)	LCJ2	С-альфа (Т49С) (N34A+N68A + N79A)

- 57 045653

SEQ ГО NO: 189	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 45
НС Дизайн_2QSKE (IgGl)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69E)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 192	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 36	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2QSKE (IgGl)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34Q+N68S + N79K)
SEQ ID NO: 191	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 46
НС Дизайн_2- ASKE (IgGl)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69E)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 192	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 36	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2ASKE (IgGl)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34A+N68S + N79K)
SEQ ID NO: 191	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 47
НС Дизайн_2- QQQQQ (IgGl)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 195	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2- QQQQQ (IgGl)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34Q+N68Q + N79Q+N61Q)
SEQ ID NO: 194	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 48

- 58 045653

Таблица 15

Дизайн и обозначение химерных константных областей (С-бета/С-пре-альфа)

Матрицы на основе таблицы 16 (IgGl)	Последовательность	SEQ ID NO:
Пре- ТСЯ^ДизайнВ	Дизайн_1_Пре_ТСЯ_область соединения’ 1 Дизайн_2_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су810 ДизайнЗПреТСЯобласть соединения’_1_Су811 Дизайн_4_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су812 Дизайн_5_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су813 ДизайнбПреТ СЯобласть соединения’_1_Су814 Дизайн_7_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су815 Дизайн_8_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су81_4Ь4Т_1 Дизайн_9_Пре_Т СЯобласть соединения’_1_Су82_4Ь4Т_2 Дизайн! ОПреТСЯобласть соединения’_1_Су84	198/197 200/199 202/201 203/201 203/204 205/204 206/204 208/207 208/209 211/210
Пре- ТСКДизайнС	Пре-ТСЛ_Дизайн_5_перекрестный_1 Пре-ТСЯ^Дизайн_6_перекрестный_1	213/212 213/215
Пре- ТСИЛизайнИ	Пре-ТСЯ^Дизайн_5_перекрестный_2 Пре-ТСИ_Дизайн_6_перекрестный_2	214/212 214/215

- 59 045653

Таблица 16

Домены и SEQ ID NO химерных константных областей (С-бета/С-пре-альфа)

Название комплекса и SEQ ГО NO цепи	Домены с N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Первый или второй	Константны й домен	Третий соединительный	Домен димеризаци
	Соединитель ный домен (CJ)	TCR (Cl или C2)	домен+шарнирн ая область (СТ)	h(D)
НС Дизайн_1_Пре_ТСК_о бласть соединения’1	HCJB	С-бета (N69Q)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 198	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 84	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_1_Пре_ТСК_о бласть соединения’1	LCJB	C-npeальфа (N50Q)
SEQ ГО NO: 197	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 83
НС Дизайн_2_Пре_ТСК_о бласть соединения’_1_Су810	HCJB	С-бета (S76C)(N69 Q)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 200	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 319	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2_Пре_ТСК_о бласть соединения’_1_Су810	LCJB	C-npeальфа (Y59C)(N50 Q)
SEQ ГО NO: 199	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 311
НС Дизайн_3_Пре_ТСК_о бласть соединения’_1_Су811	HCJB	С-бета (F13C)(N69 Q)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 202	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 320	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC ДизайнЗПреТСКо бласть	LCJB	C-npeальфа (A13C)(N50

- 60 045653

соединения’_1_Су811		Q)
SEQ ГО NO: 201	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 312
НС Дизайн_4_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су812	HCJB	С-бета (S16C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 203	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 321	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_4_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су812	LCJB	С-преальфа (A13C)(N50 Q)
SEQ ГО NO: 201	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 312
НС Дизайн_5_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су813	HCJB	С-бета (S16C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 203	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 321	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_5_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су813	LCJB	С-преальфа (S11C)(N5O Q)
SEQ ГО NO: 204	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_6_Пре_ТСИ_о бласть соединения’_1_Су814	HCJB	С-бета (A18C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 205	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 322	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC	LCJB	C-npe-

- 61 045653

Дизайн_6_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су814		альфа (S11C)(N5O Q)
SEQ ГО NO: 204	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_7_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су815	HCJB	С-бета (E19C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 206	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 323	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_7_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су815	LCJB	C-npeальфа (S11C)(N5O Q)
SEQ ГО NO: 204	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_8_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су814 L4T_1	HCJB	С-бета (S56C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 208	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_8_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су814 L4T_1	LCJB	C-npeальфа (S62C)(N50 Q)
SEQ ГО NO: 207	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 314
НС Дизайн_9_Пре_TCR_o бласть	HCJB	С-бета (S56C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcGl

- 62 045653

соединения’_1_Су82_4 L4T_2
SEQ ГО NO: 207	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_9_Пре_TCR_o бласть соединения’_1_Су82_4 L4T_2	LCJB	C-npeальфа (T65C)(N50 Q)
SEQ ID NO: 209	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 315
HC Дизайн! OIIpeTCR область соединения’_1_Су84	HCJB	С-бета (A11C)(N69 Q)	CJ'lGl	FcG!
SEQ ID NO: 211	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 324	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн! OIIpeTCR область соединения’_1_Су84	LCJB	C-npeальфа (I16C)(N50 Q)
SEQ ID NO: 210	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 316
HC Hpe- ТСКЛизайн_5_перек рестный!
SEQ ID NO: 213	HCJC	C-npeальфа (S11C)(N5O Q)	CJ'2G1	FcGl
LC Hpe- ТСКЛизайн_5_перек рестный!	SEQ ID NO: 132	SEQ ID NO: 313	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
SEQ ID NO: 212	LCJC	С-бета

- 63 045653

		(N69Q, S16C)
НС Пре- ГСВДизайнбперек· рестный!	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 321+306
SEQ ГО NO: 213
LC Пре- ГСВДизайнбперек· рестный!	HCJC	C-npeальфа (S11C)(N5O Q)	CJ'2G4	FcG4
SEQ ID NO: 215	SEQ ID NO: 132	SEQ ID NO: 313	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 303
НС ПреТСВДизайнЗперек· рестный!	LCJC	С-бета (N69Q, A18C)
SEQ ГО NO: 214	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 322+ 306
LC Пре- Г(КДизанн5перек· рестный!
SEQ ГО NO: 212	HCJD	C-npeальфа (S11C)(N5O Q)	CJ'2G1	FcGl
НС Пре- ТСНЛизайнбперек рестный!	SEQ ID NO: 133	SEQ ID NO: 313	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
SEQ ГО NO: 214	LCJC	С-бета (N69Q, S16C)
LC Пре- ГСКДизайнбперек· рестный!	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: NO:321+ 306
SEQ ID NO: 215	HCJD	C-npe-	CJ'2G1	FcGl
		альфа (S11C)(N5O Q)

Таблица 17

Дизайн и обозначения химерных константных областей (С-гамма/С-дельта)

Матрицы на основе таблицы 13 (IgGl)	Конструкция	SEQ ID NO в HC/LC
dg Дизайн 1	dg^H3adH_l	234/233
dgJlH3aflH_!	dgJI,H3adH_2 dgJI,H3adH_2_6e3_niHKO3HnHpoBaHHa dg^n3adH_2_hypeCys 1 _без_гликозилирования dg^n3adH_2_hypeCys2_6e3_niHKO3HnHpoBaHHa dg^n3adH_2_hypeCys3_6e3_niHKO3HnHpoBaHHa 4ё_Дизайн_2_Су52_без_гликозилирования dg^n3adH_2_Cysl_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH dgJI,H3adH_2_Cys3_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa dg^n3adH_2_Cys4_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH dgJI,H3adH_2_Cys5_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa	232/231 216/215 218/217 220/219 222/221 224/223 226/225 227/223 229/228 229/230
dgJ)H3afiH_3	dg_nepeKpecTHbidJI,H3adH_l	236/235
dg Дизайн 4	dg_nepeKpecTHbidJI,H3adH_2	238/237

- 64 045653

Таблица 18

Домены и SEQ ID NO химерных константных областей (С-гамма/С-дельта)

Название комплекса и SEQ Ш NO цепи	Домены c N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Первый или второй соединительный домен (CJ)	Константный домен TCR (Cl или C2)	Третий соединительный домен+шарнирн ая область (СТ)	Домен димериза ции (D)
НС dgHmainil	HCJ4	С-гамма	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 234	SEQIDNO: 117	SEQ ID NO: 113	SEQIDNO: 121	SEQ ID NO: 302
LC й«Дизайн1	LCJ4	С-дельта
SEQ ГО NO: 233	SEQIDNO: 119	SEQ ID NO: 310
НС dgHii3aini2	HCJ5	С-гамма	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 232	SEQIDNO: 118	SEQ ID NO: 113	SEQIDNO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJlH3a0H_2	LCJ5	С-дельта
SEQ ГО NO: 231	SEQ ГО NO: 120	SEQ ID NO: 115
HC dg,lii3aini2 6e3in икозилирования	HCJ5	С-гамма (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 216	SEQIDNO: 118	SEQ ID NO: 114	SEQIDNO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg_Hii3aini_2_6e3_rn икозилирования	LCJ5	С-дельта (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 215	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 116
HC dgJiH3a0H_2_hypeC увХбезгликозилир ования	HCJ5	С-гамма (T12C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 218	SEQIDNO: 118	SEQ ID NO: 333	SEQIDNO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg Дизайн 2 hypeC увХбезгликозилир ования	LCJ5	С-дельта (N16C) (N79Q)
SEQ ID NO: 217	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 325
HC dgJlH3afi^H_2_hypeC у82_без_гликозилир ования	HCJ5	С-гамма (Q57C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 220	SEQIDNO: 118	SEQ ID NO: 334	SEQIDNO: 121	SEQ ID NO: 302

- 65 045653

LC dg Дизайн 2 hypeC у82_без_гликозилир ования	LCJ5	С-дельта (V50C) (N16Q+N79Q )
SEQ ГО NO: 219	SEQ ГО NO: 120	SEQ ID NO: 326
НС dg Дизайн 2 hypeC увЗбезгликозилир ования	HCJ5	С-гамма (M62C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 222	SEQID NO: 118	SEQ ID NO: 335	SEQ ID NO: 121	SEQID NO: 302
LC dg,lii3aini2hypeC увЗбезгликозилир ования	LCJ5	С-дельта (D46C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 221	SEQ ГО NO: 120	SEQ ID NO: 327
НС dglii3aini2(ys2 безгликозилирован ИЯ	HCJ5	С-гамма (S17C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 224	SEQ ГО NO: 118	SEQ ID NO: 336	SEQ ID NO: 121	SEQID NO: 302
LC dglii3aini2(ys2 безгликозилирован ня	LCJ5	С-дельта (F12C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 223	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 328
НС dgЛ изайн_2_Су81_ безгликозилирован ня	HCJ5	С-гамма (F14C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl

- 66 045653

SEQ ГО NO: 226	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 337	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg Дизайн 2 Cys 1 безгликозилирован ИЯ	LCJ5	С-дельта (M14C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 225	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 329
HC dgJ(H3afiH_2_Cys3_ безгликозилирован ИЯ	HCJ5	С-гамма (E20C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 227	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 338	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJ(H3afiH_2_Cys3_ безгликозилирован ИЯ	LCJ5	С-дельта (F12C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 223	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 328
HC dg Дизайн 2 Cys4 безгликозилирован ИЯ	HCJ5	С-гамма (A19C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 229	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 339	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJ(H3afiH_2_Cys4_ безгликозилирован ИЯ	LCJ5	С-дельта (F87C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 228	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 330
HC dg Дизайн 2 Cys5	HCJ5	С-гамма (A19C)	CJ'3G1	FcGl

- 67 045653

безгликозилирован ИЯ		(N65Q)
SEQ ГО NO: 229	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 339	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg Дизайн 2 Cys5 безгликозилирован ИЯ	LCJ5	С-дельта (E88C) (N16Q+N79Q )
SEQ ГО NO: 230	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 331
НС dg_^neP^eKP^eCTHbI®JI изайн!	HCJ6	С-дельта	CJ'4G1	FcGl
SEQ ГО NO: 236	SEQ ID NO: 123	SEQ ID NO: 332	SEQ ID NO: 127	SEQ ID NO: 302
LC dg_^neP^eKP^eCTHbI®JI изайн!	LCJ6	С-гамма
SEQ ID NO: 235	SEQ ID NO: 125	SEQ ID NO: 340
HC dg_^neP^eKP^eCTHbI®JI изайн_2	HCJ7	С-дельта	CJ'4G1	FcGl
SEQ ID NO: 238	SEQ ID NO: 124	SEQ ID NO: 332	SEQ ID NO: 127	SEQ ID NO: 302
LC dg_^neP^eKP^eCTHbI®JI изайн_2	LCJ7	С-гамма
SEQ ID NO: 237	SEQ ID NO: 126	SEQ ID NO: 340

- 68 045653

Таблица 19

Последовательности примеров химерных константных областей

Дизайн матриц ы
Сальфа/С -бета	Тип цепи	SEQ ID NO		Последовательности
Дизайн_ 1 (IgGl) нормаль ный	LC	176	LCJ1-Cальфа (Т49С)	KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESS
НС	177	нсл-сбета (S56C)- CJ’lGlFc(Gl)	SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2 (IgGl) нормаль ный	LC	178	LCJ2-Cальфа (T49C)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESS
НС	179	HCJ2-Cбета (S56C)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK

- 69 045653

				SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 5 (IgGl) нормаль ный	LC	176	LCJ1-Cальфа (Т49С)	KRTVAAPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESS
НС	180	нсл-сбета (S56C)(F G-DE+)CJ’lGlFc(Gl)	SSASKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 6 (IgGl) нормаль ный	LC	178	LCJ2-Cальфа (Т49С)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESS
НС	181	HCJ2-Cбета (S56C)(F G-DE+)CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 70 045653

Дизайн_ 6а (IgGl) нормаль ный	LC	178	LCJ2-Cальфа (Т49С)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESS
НС	182	HCJ2-Cбета (S56C)(F G-DE+)CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQSGRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 3 (IgGl) перекре стный	LC	183	LCJ3-Cбета (S56C)	KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVC TDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRA
НС	184	HCJ2-Cбета (S56C)(F G-DE-)CJ’lGlFc(Gl)	SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 4 (IgGl) перекре	LC	183	LCJ4-Cбета (S56C)	KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVC TDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFW

- 71 045653

стный				QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRA
НС	185	HCJ4-Cальфа (Т49С)CJ’2G1Fc(Gl)	SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 7 (IgGl) перекре стный	LC	186	LCJ3-Cбета (S56C)(F G-DE+)	KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVC TDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
НС	184	HCJ3-Cальфа (Т49С)CJ’2G1- Fc(Gl)	SSASIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 8 (IgGl) перекре стный	LC	186	LCJ4-Cбета (S56C)(F G-DE+)	KLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELS WW VNGKEVHS GVC TDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYPSNQIVSAEAWGRA
НС	185	HCJ4-Cальфа (Т49С)-	SSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTF

- 72 045653

			CJ’2G1- Fc(Gl)	FPSPESSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Дизайн_ 2-QQQQ (IgGl)	LC	187	LCJ2-Cальфа (T49C) (N34Q+ N68Q+ N79Q)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTF FPSPESS
HC	188	HCJ2-Cбета (S56C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2-AAAA (IgGl)	LC	189	LCJ2-Cальфа (T49C) (N34A+ N68A+N 79A)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSAKSDFACANAFANSIIPEDTF FPSPESS
HC	190	HCJ2-C- бета	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT

- 73 045653

			(S56C) (N69A)- CJ’lGlFc(Gl)	DPQPLKEQPALADSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2-QSKE (IgGl)	LC	191	LCJ2-Cальфа (T49C) ( N34Q+N 68S+N79 К)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFF PSPESS
HC	192	HCI2-Cбета (S56C) (N69E)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2-ASKE (IgGl)	LC	193	LCJ2-Cальфа (T49C) (N34A+ N68S+N	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTAVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSSKSDFACANAFKNSIIPEDTFF PSPESS

- 74 045653

			79K)
НС	192	HCJ2-Cбета (S56C)(N 69Е)CJ’lGl- Fc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALEDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2- QQQQQ (IgGl)	LC	194	LCJ2-Cальфа (T49C) (N34Q+ N68Q+N 79Q+ N61Q)	KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSQSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTF FPSPESS
НС	195	HCJ2-Cбета (S56C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

- 75 045653

Дизайн_ 2-QQQQ (IgG4)	LC	187		KPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTF FPSPESS
НС	196	HCJ2-Cбета (S56C) (N69Q)CJ’1G4Fc(G4)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Дизайн Преальфа- Бета	Название цепи	SEQ ID NO		Последовательности
Дизайн_ 1_Пре_Т СИобл асть соедине ния’1	LC	197	LCJB-C- преальфа (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	198	HCJB-Cбета (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK

- 76 045653

				SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 2 Пре_Т СИобл асть соедине ния’1_С yslO	LC	199	LCJB-Cпреальфа (Y59C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT CGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	200	HCJB-Cбета (S76C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALQDSRYALCSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Дизайн_ ЗПреТ СИобл асть соедине ния’1_С ysll	LC	201	VL(CD3) -LCJB- С-преальфа (А13С) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	202	HCJB-Cбета (F13C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVCEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVS TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS

- 77 045653

				REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Дизайн_ 4_Пре_Т СИобл асть соедине ния’1_С ysl2	LC	201	VL(CD3) -LCJBС-преальфа (А13С) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLCPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	203	HCJB-Cбета (S16C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVS TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Дизайн_ 5 Пре_Т СИобл асть соедине ния’1_С ysl3	LC	204	VL(CD3) -LCJBС-преальфа (S11C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	203	HCJB-Cбета (S16C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVS TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS

- 78 045653

				HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Дизайн_ 6_Пре_Т СИобл асть соедине нияЧС ysl4	LC	204	VL(CD3) -LCJB- С-преальфа (S11C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	205	HCJB-Cбета (А18С) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 7\|\|реГ СИобл асть соедине ния’1_С ysl5	LC	204	VL(CD3) -LCJBС-преальфа (S11C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	206	HCJB-Cбета (E19C)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEACISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ

- 79 045653

			(N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 8_Пре_Т СИобл асть соедине ния’1_С ysl_4L4 Т_1	LC	207	VL(CD3) -LCJBС-преальфа (S62C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPCPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	208	HCJB-Cбета (S56C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELS WW VNGKEVHS GVCT DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 9_Пре_Т СИобл асть соедине нияЧС	LC	209	VL(CD3) -LCJBC-npeальфа (T65C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPACDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART

- 80 045653

ys2_4L4 T_2	НС	208	HCJB-Cбета (S56C) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCT DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Дизайн_ 10_Пре_ TCR_o6 ласть соедине ния’1_С ys4	LC	210	VL(CD3) -LCJBС-преальфа (I16C) (N50Q)	KPTGVGGTPFPSLAPPCMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART
НС	211	HCJB-Cбета (Al IC) (N69Q)- CJ’lGlFc(Gl)	LEDLKNVFPPEVCVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQ NPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
ПреКИДи зайн_5_	Легкая	212	VL(CD3) -HCJB- С-бета	KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV STDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATF

- 81 045653

перекре стный!			(N69Q, S16C)CJ’IG	WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRA KPVTQIVSAEAWGRA
Тяжелая (область соединени я в большей степени принадле жит антителу)	213	HCJC-Cпреальфа (S11C, N50Q)CJ’2G1Fc	SSASGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMV VVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAF TYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEP LVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTART SDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ПреТСИ_Ди зайн_5_ перекре стный_2	Легкая	212	VL(CD3) -HCJB- С-бета (N69Q, S16C)- CJ’IG	KLEDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV STDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATF WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRA KPVTQIVSAEAWGRA
Тяжелая (область соединени я в большей степени принадле жит преTCR)	214	HCJD-C- npeальфа (Sil) - CJ’2G1- Fc	SSPTGVGGTPFPCLAPPIMLLVDGKQQMVV VCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGQGSALDAFT YGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPL VCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Пре- ТСИ_Ди	Легкая	215	VL(CD3) -LCJC-	KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVS

- 82 045653

зайн_6_ перекре стный!			С-бета (А18С, N69Q)	TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRA
Тяжелая (область соединени я в большей степени принадле жит антителу)	213
ПреКИДи зайн_6_ перекре стный_2	Легкая	215		KLEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVS TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP VTQIVSAEAWGRA
Тяжелая (область соединени я в большей степени принадле жит TCR)	214
Дизайн ДельтаГамма	Название цепи	SEQ ID NO		Последовательности
dgjinsa йн_2_бе згликоз илирова НИЯ	LC	215	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
НС	216	HCJ5-C- гамма-	TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN

- 83 045653

			CJ’3G1- Fc(Gl) (N65Q)	TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
склиза йн_2_Ьу peCysl_ безгли козилир ования	LC	217	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (N16C) (N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVMKCGTNVACLVKEFYP KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVK LGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
НС	218	HCJ5-Cгамма (Т12С) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPCIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgjinsa йн_2_Ьу peCys2_ безгли козилир ования	LC	219	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (V50C) (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
НС	220	HCJ5-C- гамма	TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSCEGN

- 84 045653

			(Q57C) (N65Q)CJ’3G1Fc(Gl)	TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgHma йн_2_Ьу peCys3_ безгли козилир ования	LC	221	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (D46C) (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFCPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
НС	222	HCJ5-Cгамма (М62С) (N65Q)CJ’3G1Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TCKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVR HENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgJInsa йн 2 Су s2_6e3_r ликозил ировани я	LC	223	VL(CD3) -LCJ5-C- дельта (F12C) (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE

- 85 045653

	НС	224	HCJ5-Cгамма (S17C) (N65Q)- CJ’3G1Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPCIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGS QEG NTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
dgjma йн 2 Су sl_6e3_r ликозил ировани я	LC	225	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (М14С) (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVCKQGTNVACLVKEFYP KDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVK LGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE
НС	226	HCJ5-Cгамма (F14C) (N65Q)CF3G1- Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTICLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGS QEG NTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI VRHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
dgJ)H3a йн 2 Су вЗбезг ликозил ировани	LC	223	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (F12C) (N16Q+	EPRSQPHTKPSVCVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFE

- 86 045653

я			N79Q)
НС	227	HCJ5-Cгамма (Е20С) (N65Q)- CJ’3G1Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPSIACTKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgjma йн 2 Су s4_6e3_r ликозил ировани я	LC	228	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта (F87C) (N16Q+ N79Q)	EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDCE
НС	229	HCJ5-Cгамма (А19С) (N65Q)CJ’3G1Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgJlH3a йн 2 Су s5_6e3_r	LC	230	VL(CD3) -LCJ5-Cдельта	EPRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDQKTVHSTDFC

- 87 045653

ликозил ировани я			(Е88С) (N16Q+ N79Q)
НС	229	HCJ5-Cгамма (А19С) (N65Q)- CJ’3G1Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPSICETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgjiua йн_2	LC	231	VL(CD3) -LCJ5-C- дельта	EPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
НС	232	HCJ5-CгаммаCF3G1- Fc(Gl)	TDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN TMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgJ(H3a йн_1	LC	233	VL(CD3) -LCJ4-C- дельта	KPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFE
НС	234	HCJ4-C- гамма-	SSASLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGN

- 88 045653

			CJ’3G1- Fc(Gl)	TMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIV RHENNKNGVDQEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
dgnepe крестны пДизап н_1	LC	235	VL(CD3) -LCJ6-Cгамма	KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGS CEG NTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI VRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
НС	236	HCJ6-Cдельта- CJ’4G1- Fc(Gl)	SSRSQPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVOHDQKTVHSTDEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
dgnepe крестны йДизай н 2	LC	237	VL(CD3) -LCJ7-Cгамма	KDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGS CEG NTMKTQDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCI VRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMD
НС	238	HCJ7-Cдельта- CJ’4G1- Fc(Gl)	EPRSOPHTKPSVFVMKQGTNVACLVKEFY PKDIRINLVSSKKITEFDPAICISPSGKYNAV KLGKYEDSNSVTCSVOHDQKTVHSTDEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT
				VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 89 045653

Таблица 20

Последовательности примеров полипептидных комплексов

Дизайн АльфаБета	Название цепи	SEQ ID NO		Последовательности
ТЗДизайн! (IgGl) нормальн ЫН	LC	1	VL(CD3)- LCJl-Cальфа (T49C)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKR TVAAPDPAVYQLRDSKSS DKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFAC ANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	2	VH(CD3)HC Л-С-бета (S56C)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTnA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSASKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP

- 90 045653

				KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тзДизайн_2 (IgGl) нормальн ый	LC	3	VL(CD3)- LCJ2-Cальфа (Т49С)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	4	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF

- 91 045653

				YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тзДизайн_5 (IgGl) нормальн ый	LC	1	VL(CD3)- LCJ1-Cальфа (Т49С)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKR TVAAPDPAVYQLRDSKSS DKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFAC ANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	5	VH(CD3)НС Л-С-бета (S56C)(FGDE+)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTETA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSASKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW

- 92 045653

				WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YPSNQIVSAEAWGRASDK THTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLS PGK
тзДизайнб (IgGl) нормальн ый	LC	3	VL(CD3)- LCJ2-Cальфа (Т49С)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPA VYQLRDS KS SD KSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	6	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C)(FGDE+)CJ4G1Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP

- 93 045653

				PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YPSNQIVSAEAWGRASDK THTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLS PGK
тзДизайнба (IgGl) нормальн ый	LC	3	VL(CD3)- LCJ2-Cальфа (Т49С)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	7	VH(CD3)НСП-С-бета (S56C)(FG- DE-)CJ’lGl-	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT

- 94 045653

			Fc(Gl)	AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQ-SGRYALSSRLRVSATFWQNP RNHFRCQVQFYPSNQIVSA EAWGRASDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
тзДизайнЗ (IgGl) перекрести ый	LC	8	VL(CD3)LCJ3-C-6e_Ta (S56C)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDV AVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL EDLKNVFPPEVAVFEPSEA EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VCTDPQPLKEQPALNDSR YALSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYGLSENDEW TQDRAKPVTQIVSAEAWG RA

- 95 045653

	НС	9	VH(CD3)HCJ3-Cальфа (Т49С)CJ’2G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTFTA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSASIQNPDP AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSSDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тзДизайн_4 (IgGl) перекрести ый	LC	8	VL(CD3)LCJ4-C-6era (S56C)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL EDLKNVFPPEVAVFEPSEA EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VCTDPQPLKEQPALNDSR

- 96 045653

				YALSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYGLSENDEW TQDRAKPVTQIVSAEAWG RA
НС	10	VH(CD3)HCJ4-Cальфа (Т49С)CJ’2G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSPDIQNPDP AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSSDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тзДизайн_7 (IgGl) перекрести ый	LC	11	VL(CD3)LCJS-C-бета (S56C)(FGDE+)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL

- 97 045653

				EDLKNVFPPEVAVFEPSEA EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VCTDPQPLKEQPALNDSR YALSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYPSNQIVSAE AWGRA
НС	9	VH(CD3)HCJ3-Cальфа (Т49С)CJ’2G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSASIQNPDP AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSSDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_8 (IgGl)	LC	11	VL(CD3)LCJ4-C-6eTa (S56C)(FG-	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW

- 98 045653

перекрести ый			DE+)	ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL EDLKNVFPPEVAVFEPSEA EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VCTDPQPLKEQPALNDSR YALSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYPSNQIVSAE AWGRA
НС	10	VH(CD3)HCJ4-Cальфа (Т49С)- CJ’2G1Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSPDIQNPDP AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSSDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK

- 99 045653

тз- Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	LC	12	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34Q+N68Q + N79Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
НС	13	VH(CD3)НС32-С-бета (S56C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK

- 100 045653

				LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_2АААА (IgGl)	LC	14	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34A+N68A + N79A)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTAVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSAKSDFACA NAFANSIIPEDTFFPSPESS
НС	15	VH(CD3)- HCJ2-C-6era (S56C) (N69A)- CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALADSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS

- 101 045653

				REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_2- QSKE (IgGl)	LC	16	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34Q+N68S + N79K)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSSKSDFACA NAFKNSIIPEDTFFPSPESS
НС	17	VH(CD3)НС32-С-бета (S56C) (N69E)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALEDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST

- 102 045653

				YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_2ASKE (IgGl)	LC	18	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34A+N68S +N79K)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTAVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSSKSDFACA NAFKNSIIPEDTFFPSPESS
НС	17	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C)(N69E )-CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW W VNGKE VHS G VCTDPQPL KEQPALEDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRASDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPP

- 103 045653

				KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_2- QQQQQ (IgGl)	LC	19	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34Q+N68Q +N79Q+ N61Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSQSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
НС	20	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	Q VQLVQS G AE VKKPGS S V KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ

- 104 045653

				FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
тз- Дизайн_2- QQQQ (IgG4)	LC	12		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
НС	21	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C) (N69Q)CJ’1G4Fc(G4)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW

- 105 045653

				WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRYGPPCPPC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK
E17- Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	T3-LC	12	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (T49C) (N34Q+N68Q + N79Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
ТЗ-НС	22	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl) (выступ)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP

- 106 045653

				PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPC REEMTKNQVSLWCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
U4-LC	23	VL(CD19)- CL	DIQLTQSPSFLSASVGDRV TITCSASSTVNYMHWYQQ KPGKAPKLLIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCHQWSSYP YTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
U4-HC	24	VH(CD19)- CHl-Fc(Gl) (впадина)	QMQLVQSGPEVKKPGTSV KVSCKASGYAFTSYNMY WVRQARGQRLEWIGYIDP

- 107 045653

				YNGDTTYNQKFKGRVTIT RDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKRVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTIS KAKGQPREPQ VCTL PPSREEMTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
E17- Дизайн_2- QQQQ (IgG4)	T3-LC	12	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (T49C) (N34Q+N68Q +N79Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
ТЗ-НС	25	VH(CD3)- HCJ2-C-6era	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW

- 108 045653

			(S56C) (N69Q)- CJ’1G4- Fc(G4) (выступ)	VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRYGPPCPPC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVS NKGLPS SIEKTIS KAK GQPREPQVYTLPPCQEEM TKNQVSLWCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC	23	VL(CD19)- CL	DIQLTQSPSFLSASVGDRV TITCSASSTVNYMHWYQQ KPGKAPKLLIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCHQWSSYP YTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVT

- 109 045653

				KSFNRGEC
U4-HC	26	VH(CD19)CHl-Fc(G4) (впадина)	QMQLVQSGPEVKKPGTSV KVSCKASGYAFTSYNMY WVRQARGQRLEWIGYIDP YNGDTTYNQKFKGRVTIT RDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYG PPCPPCPAPEFLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVCTLPP SQEEMTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLVSR LTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSL GK
F16- Дизайн_2- QQQQ (IgG4)	T3-LC	12		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD

- 110 045653

				FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
тз-нс	25		QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRYGPPCPPC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCQEEM TKNQVSLWCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC	23	VL(CD19)- CL	DIQLTQSPSFLSASVGDRV TITCSASSTVNYMHWYQQ KPGKAPKLLIYSTSNLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCHQWSSYP YTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVV

- 111 045653

				CLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
U4-HC	27	VH(CD19)CH1спейсерVH(CD19)CHl-Fc(G4) (впадина)	QMQLVQSGPEVKKPGTSV KVSCKASGYAFTSYNMY WVRQARGQRLEWIGYIDP YNGDTTYNQKFKGRVTIT RDMSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCLTTAYAMDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLV KD YFPEPVT VS WNS GALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVGGGGS GGGGSQMQLVQSGPEVKK PGTSVKVSCKASGYAFTSY NMYWVRQARGQRLEWIG YIDPYNGDTTYNQKFKGR VTITRDMSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCLTTAYAMD YWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYT CNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSI

- 112 045653

				EKTIS KAKGQPREPQ VCTL PPSQEEMTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLV SRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK
Fc-IgGl (выступ)		304		SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCREEMTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
Fc-IgG4 (выступ)		305		SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCQEEMTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK
T3-Fab- Дизайн_2.Ь isl	LC	3	VL(CD3)- LCJ2-Cальфа (T49C)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT

- 113 045653

				DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	28	VH(CD3)НС32-С-бета (856С)област соединения’	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTTTA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGR
ТЗ-Fab- Дизайн_2.Ь is2	LC	3		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESS
НС	29	VH(CD3)НС32-С-бета (856С)област	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG

- 114 045653

			соединения’	NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYALSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRAD
ТЗ-Fab- Дизайн_2- QQQQ.hisl	LC	12	VL(CD3)LCJ2-Cальфа (Т49С) (N34Q+N68Q +N79Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
НС	30	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C) (N69Q)-Hisl	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV

- 115 045653

				TQIVSAEAWGR
T3-Fab- Дизайн_2- QQQQ.his2	LC	12		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSD KSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMD FKSNSAVAWSQKSDFACA NAFQNSIIPEDTFFPSPESS
НС	31	VH(CD3)НС12-С-бета (S56C) (N69Q)-His2	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRAD
С-бета	C-6eTa_l_noCys	32	С-бета (C74A)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALNDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
С-бета_1	33	С-бета (S56C)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW

- 116 045653

			(С74А)	VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALNDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
C-6eTa_l-Q	34	С-бета (S56C) (N69Q) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
С-бета_1-А	35	С-бета (S56C) (N69A) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALADSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
С-бета_1-Е	36	С-бета (S56C) (N69E) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALEDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
С-бета_2	37	С-бета (S56C)(FG-) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALNDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY PSN--------------QIVSAEA
C-6e_Ta_2-Q	38	С-бета (S56C) (N69Q) (FG-)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK

- 117 045653

			(С74А)	EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY PSN--------------QIVSAEA
С-бета_2-А	39	С-бета (S56C) (N69A) (FG-) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALADSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY PSN--------------QIVSAEA
С-бета_2-Е	40	С-бета (S56C) (N69E) (FG-) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALEDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY PSN--------------QIVSAEA
С-бета_3	41	С-бета (S56C)(FG- DE-) (С74А)	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVCTDPQPLK EQ—S- GRYALSSRLRVSATFWQN PRNHFRCQVQFYPSN------- -------QIVSAEA
С-альфа	С-альфа_1 noCys	42	С-альфа	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAV AWSNKSDFACANAFNNSII PEDTFFPSPESS
С-альфа_1	43	С-альфа (Т49С)	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESS
С-альфа-1-QQQ	44	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68Q	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTQVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA

- 118 045653

			+ N79Q)	VAWSQKSDFACANAFQNS IIPEDTFFPSPESS
С-альфа_1-ААА	45	С-альфа (Т49С) (N34A+N68A + N79A)	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTAVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSAKSDFACANAFANS IIPEDTFFPSPESS
C-aльφa_l-QSK	46	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68S + N79K)	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTQVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSSKSDFACANAFKNS IIPEDTFFPSPESS
С-альфа_1-А8К	47	С-альфа (Т49С) (N34A+N68S + N79K)	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTAVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSSKSDFACANAFKNS IIPEDTFFPSPESS
С-альфа_1- QQQQ	48	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68Q + N79Q+N61Q)	AVYQLRDSKSSDKSVCLFT DFDSQTQVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSQSA VAWSQKSDFACANAFQNS IIPEDTFFPSPESS
Область соединения X	Нобласть соединения!	49	VH-C- бетаС J1	SSASKNVFPP
Нобласть соединения_2	50	VH-C- бетаО2	LEDLKNVFPP
Область соединения Z	Ьобласть соединения!	51	VL-CальфаС J1	KRTVAAPDP
Еобласть соединения_2	52	VL-CальфаС12	KPDIQNPDP
Область соединения Ύ	область соединения’IgG 1	53	С-бетаобласть соединения’( IgGl)CJl	WGRASDKTHTCPPCPAPE AAGGP

- 119 045653

	область соединения’1 rG4	54	С-бетаобласть соединения’( IgG4)CJl	WGR— YGPPCPPCPAPEFLGGP
		307		FE
		308	VH-C- бетаСТ2	KLEDLKNVFPP
		309	VL-C-npeальфа-CJB	KPTGVGGTP
		306	С-конец (перекрестны й С-конец легкой цепи)	WGRA
Дизайн Преальфа- Бета	Название цепи	SEQID NO		Последовательности
Дизайн_1_ Hpe_TCR_ область соединения Ί	LC	64	VL(CD3)LCJB-C-npeальфа (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	65	VH(CD3)HCJB-C-бета (N69Q)CJ’lGl-	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA

- 120 045653

			Fc(Gl)	DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_2_ Hpe_TCR_ область соединения ’ICyslO	LC	66	VL(CD3)LCJB-C-npeальфа (Y59C) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTCGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE

- 121 045653

				ASTART
НС	67	VH(CD3)HCJB-C-бета (S76C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALCSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_3_ Пре_TCR_ область соединения ’ICysll	LC	68	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (A13C) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLCPPIMLLV

- 122 045653

				DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	69	VH(CD3)HCJB-C-бета (F13C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVCEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_4_ IIpe_TCR_	LC	68	VL(CD3)- LCJB-C-npe-	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY

- 123 045653

область соединения ’l_Cys 12			альфа (А13С) (N50Q)	LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLCPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	70	VH(CD3)HCJB-C-бета (S16C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPCEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK

- 124 045653

				LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_5_ IIpe_TCR_ область соединения Ί Cys 13	LC	71	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (SIIC) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPCLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	70	VH(CD3)HCJB-C-бета (S16C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPCEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG

- 125 045653

				KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_6_ IIpe_TCR_ область соединения ’l_Cysl4	LC	71	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (SIIC) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPCLAPPIMLLV
DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	72	VH(CD3)HCJB-C-бета (A18C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSECEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT

- 126 045653

				CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_7_ IIpe_TCR_ область соединения Ί Cysl5	LC	71	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (SIIC) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPCLAPPIMLLV
DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	73	VH(CD3)HCJB-C-бета (E19C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEACISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW

- 127 045653

				WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_8_ IIpe_TCR_ область соединения Ί Cysl_4L 4Т_1	LC	74	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (S62C) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPCPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	75	VH(CD3)HCJB-C-бета (S56C) (N69Q)-	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA

- 128 045653

			CJ’lGl- Fc(Gl)	DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_9_ IIpe_TCR_ область соединения Ч Cys2 4L 4Т_2	LC	76	VL(CD3)LCJB-C-преальфа (Т65С) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPACDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE

- 129 045653

				ASTART
НС	75	VH(CD3)HCJB-C-бета (S56C) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_10 IIpeTCR область соединения ’l_Cys4	LC	77	VL(CD3)LCJB-C-npeальфа (116C) (N50Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPCMLLV

- 130 045653

				DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTART
НС	78	VH(CD3)HCJB-C-бета (Al IC) (N69Q)CJ’lGlFc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVCVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRASDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн! 1 IIpeTCR	LC	58		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY

- 131 045653

область соединения ’2_С-конец				LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTARTCPQEPLRGTPGG
НС	79		QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRADCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK

- 132 045653

				LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Дизайн_12 IIpeTCR область соединения ’3 С	LC	63		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP TGVGGTPFPSLAPPIMLLV DGKQQMVVVCLVLDVAP PGLDSPIWFSAGQGSALDA FTYGPSPATDGTWTNLAH LSLPSEELASWEPLVCHTG PGAEGHSRSTQPMHLSGE ASTARTC
НС	80		QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFP PEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRADCGFTS VCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLN

- 133 045653

				GKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Область соединения W	Ьобласть соединенияЗ	81	VL-C-npeальфа-CJB	PTGVGGTP
С-преальфа	С-пре-альфа	82		FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGNGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я (Дизайн 1)	83	(N50Q)	FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 2)	311	(N50Q, Y59C)	FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTCGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 3)	312	(N50Q, А13С)	FPSLCPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART

- 134 045653

	С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 4)	312	(N50Q, А13С)
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 5)	313	(N50Q, S11C)	FPCLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 6)	313	(N50Q, S11C)
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 7)	313	(N50Q, S11C)
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 8)	314	(N50Q, S62C)	FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPC PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн 9)	315	(N50Q, Т65С)	FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PACDGTWTNLAHLSLPSE ELASWEPLVCHTGPGAEG HSRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без гликозилировани я-Cys (Дизайн Ю)	316	(N50Q, I16C)	FPSLAPPCMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTART
С-пре-альфа-без	317	(N50Q,	FPSLAPPIMLLVDGKQQM

- 135 045653

	гликозилировани я (Дизайн 11)		концевые остатки)	VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTARTC PQEPLRGTPGG
С-пре-альфа-без гликозилировани я (Дизайн 12)	318	(N50Q, только Сконец)	FPSLAPPIMLLVDGKQQM VVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTARTC
с- бетаГогС -пре-альфа	С-бета_1ог_Преальфа	84	N69Q	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
Дизайн!	84	N69Q
Дизайн_2	319	N69Q, S76C	EVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALCSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEA
ДизайнЗ	320	N69Q, F13C	EVAVCEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA

- 136 045653

	Дизайн_4	321	N69Q, S16C	EVAVFEPCEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
Дизайн_5	321	N69Q, S16C
Дизайнб	322	N69Q, А18С	EVAVFEPSECEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
Дизайн?	323	N69Q, Е19С	EVAVFEPSEACISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
Дизайн_8	34	N69Q, S56C
Дизайн_9	34	N69Q, S56C
Дизайн_10	324	N69Q, АИС	EVCVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLK EQPALQDSRYALSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQ IVSAEA
Дизайн! 1	84	N69Q
Дизайн_12	84	N69Q

- 137 045653

Дизайн ДельтаГамма	Название цепи	SEQID NO		Последовательности
dg-Лизайн 2безгли козилиров ания	LC	85	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	86	VH(CD3)HCJ5-C- гамма- CJ’3G1- Fc(Gl) (N65Q)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA

- 138 045653

				VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
dg-Лизайн _2_hypeCys 1_без_глик озилирова НИЯ	LC	89	VL(CD3)LCJ5-Cдельта (N16C) (N79Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKCGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	90	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (Т12С) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPCIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT

- 139 045653

				KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
dgjiinaiin _2_hypeCys 2_без_глик озилирова ния	LC	91	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (V50C) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAICISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	92	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (Q57C) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSCEGNTMKT QDTYMKFSWLTVPEESLD KEHRCIVRHENNKNGVDQ EIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKG

- 140 045653

				QPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
dgJiHsaiin _2_hypeCys 3_без_глик озилирова ния	LC	93	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (D46C) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFCPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	94	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (М62С) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	Q VQLVQS G AE VKKPGS S V KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTCKT QDTYMKFSWLTVPEESLD KEHRCIVRHENNKNGVDQ EIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCK

- 141 045653

				VSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
dgJtH3aiiH _2_Cys2_6e ЗГЛИКОЗИЛ ирования	LC	95	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (F12C) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVCVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	96	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (S17C) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT A VYYC ARDGYS LYYFD Y WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPCIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS

- 142 045653

				VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
((«Дизайн 2Cysloe згликозил ирования	LC	97	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (М14С) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVCKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	98	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (F14C) (N65Q)CF3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTICLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN

- 143 045653

				AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
dg-Лизайн _2_Cys3_6e 3 гликозил ирования	LC	95	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (F12C) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVCVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFE
НС	99	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (Е20С) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSIACTKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE

- 144 045653

				DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
^§_Лизайн _2_Cys4_6e ЗГЛИКОЗИЛ ирования	LC	100	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (F87C) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDCE
НС	101	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (А19С) (N65Q)CF3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSICETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT

- 145 045653

				LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
й§_Дизайн _2_Cys5_6e ЗГЛИКОЗИЛ ирования	LC	102	VL(CD3)LCJ5-C- дельта (Е88С) (N16Q+N79Q )	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKQGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDQKTVHSTDFC
НС	101	VH(CD3)HCJ5-Cгамма (А19С) (N65Q)CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSICETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TQDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA

- 146 045653

				PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
С^Л^изаЙН _2	LC	105	VL(CD3)- LCJ5-C- дельта	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIEP RSQPHTKPSVFVMKNGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKITEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDNKTVHSTDFE
НС	106	VH(CD3)HCJ5-Cгамма- CJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVTDKQLDAD VSPKPTIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHW QEKKSNTILGSQEGNTMK TNDTYMKFSWLTVPEESL DKEHRCIVRHENNKNGVD

- 147 045653

				QEIIFPPIKSDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
dgJ)H3aiiH _1	LC	107	VL(CD3)- LCJ4-C- дельта	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKP RSQPHTKPSVFVMKNGTN VACLVKEFYPKDIRINLVS SKKHEFDPAIVISPSGKYN AVKLGKYEDSNSVTCSVQ HDNKTVHSTDFE
HC	108	VH(CD3)HCJ4-CгаммаCJ’3G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT A VYYC ARDGYS LYYFD Y WGQGTLVTVSSASLDADV SPKPTIFLPSIAETKLQKAG TYLCLLEKFFPDVIKIHWQ EKKSNTILGSQEGNTMKT NDTYMKFSWLTVPEESLD

- 148 045653

				KEHRCIVRHENNKNGVDQ EIIFPPIKSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
dgnepeKpe стныйДиз айн_1	LC	109	VL(CD3)LCJ6-Cгамма	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKD KQLDADVSPKPTIFLPSIAE TKLQKAGTYLCLLEKFFPD VIKIHWQEKKSNTILGSCE GNTMKTQDTYMKFSWLT VPEESLDKEHRCIVRHENN KNGVDQEIIFPPIKTDVITM D
НС	ПО	VH(CD3)HCJ6-Cдельта- CJ’4G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSRSQPHTK PSVFVMKQGTNVACLVKE

- 149 045653

				FYPKDIRINLVSSKKITEFD PAICISPSGKYNAVKLGKY EDSNSVTCSVQHDQKTVH STDEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
dgnepeKpe стныйДиз айн_2	LC	111	VL(CD3)LCJ7-Cгамма	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKD KQLDADVS PKPTIFLPSIAE TKLQKAGTYLCLLEKFFPD VIKIHWQEKKSNTILGSCE GNTMKTQDTYMKFSWLT VPEESLDKEHRCIVRHENN KNGVDQEIIFPPIKTDVITM D
НС	112	VH(CD3)HCJ7-Cдельта- CJ’4G1- Fc(Gl)	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY

- 150 045653

				WGQGTLVTVEPRSQPHTK PSVFVMKQGTNVACLVKE FYPKDIRINLVSSKKITEFD PAICISPSGKYNAVKLGKY EDSNSVTCSVQHDQKTVH STDEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
С-гамма	С-гамма_1	113	С-гамма	KPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTMKTND TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F
С- гамма_1_без_гли козилирования	114	С-гамма (N65Q)	KPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F
0§_Лизайн_1	113	Без мутаций
(1«Дизайи2	113	Без мутаций
(1«Дизайи2бе згликозилиров ания	114	N65Q

- 151 045653

	й«Дизайн2 11у peCys 1_без_гл ик озилирования	333	N65Q, Т12С	KPCIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F
й«Дизайн2 11у реСу82_без_глик озилирования	334	N65Q, Q57C	KPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSCEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F
dg Дизайн 2 hy реСувЗбезглик озилирования	335	N65Q, М62С	KPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTCKTQDT YMKFSWLTVPEESLDKEH RCIVRHENNKNGVDQEIIF
dg Дизайн 2 Су 82_без_гликозил ирования	336	N65Q, S17C	KPTIFLPCIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQE KKSNTILGSQEGNTMKTQ DTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGVDQ EIIF
dg Дизайн 2 Су 81_без_гликозил ирования	337	N65Q, F14C	KPTICLPSIAETKLQKAGT YLCLLEKFFPDVIKIHWQE KKSNTILGSQEGNTMKTQ DTYMKFSWLTVPEESLDK EHRCIVRHENNKNGVDQEI IF
dg Дизайн 2 Су вЗбезгликозил ирования	338	N65Q, Е20С	KPTIFLPSIACTKLQK AGT Y LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F

- 152 045653

	dg Дизайн 2 Су 84_без_гликозил ирования	339	N65Q, А19С	KPTIFLPSICETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSQEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII F
dg Дизайн 2 Су s5 без гликозил	339	N65Q, А19С
ирования
dgnepeKpecTHbi йДизайн!	340		KPTIFLPSIAETKLQKAGTY LCLLEKFFPDVIKIHWQEK KSNTILGSCEGNTMKTQD TYMKFSWLTVPEESLDKE HRCIVRHENNKNGVDQEII FPPIKTDVITMD
dgnepeKpecTHbi й^Дизайн_2	340
С-дельта	С-дельта_1	115	С-дельта	SVFVMKNGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDNKTVHS TDFE
С- дельта_ 1 _без_гл и козилирования	116	С-дельта (N16Q+N79Q )	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFE
	310	С-дельта	KSVFVMKNGTNVACLVK EFYPKDIRINLVSSKKITEF DPAIVISPSGKYNAVKLGK YEDSNSVTCSVQHDNKTV HSTDFE
dg Дизайн 1	115	Без мутаций
dg Дизайн 2	115	Без мутаций

- 153 045653

	dg Дизайн 2 бе згликозилиров ания	116	N16Q, N79Q
dg Дизайн 2 hy peCys 1_без_гл ик озилирования	325	N16C, N79Q	SVFVMKCGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFE
dg_JlH3afiH_2_hy реСу82_без_глик озилирования	326	N16Q, N79Q, V50C	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AICISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFE
dgHii3aiiii2hy реСувЗбезглик озилирования	327	N16Q, N79Q, D46C	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFCP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFE
dg Дизайн 2 Су 82_без_гликозил ирования	328	N16Q, N79Q, F12C	SVCVMKQGTNVACLVKE FYPKDIRINLVSSKKITEFD PAIVISPSGKYNAVKLGKY EDSNSVTCSVQHDQKTVH STDFE
dgHii3aiin2Cy 81_без_гликозил ирования	329	N16Q, N79Q, М14С	SVFVCKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFE
dg Дизайн 2 Су вЗбезгликозил ирования	328	N16Q, N79Q, F12C
dgHii3aiin2Cy 84_без_гликозил ирования	330	N16Q, N79Q, F87C	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE

- 154 045653

				DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDCE
dg Дизайн 2 Су s5 без гликозил ирования	331	N16Q, N79Q, Е88С	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AIVISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TDFC
dgnepeKpecTHbi иДизаин! (дельта в качестве тяжелой цепи)	332	N16Q, N79Q, V50C	SVFVMKQGTNVACLVKEF YPKDIRINLVSSKKITEFDP AICISPSGKYNAVKLGKYE DSNSVTCSVQHDQKTVHS TD-
dgnepeKpecTHbi й_Дизайн_2 (дельта в качестве тяжелой цепи)	332
Область соединения R	Нобласть соединения_4	117	HCJ4	SSASLDADVSP
Нобласть соединения_5	118	HCJ5	TDKQLDADVSP
Область соединения Т	Еобласть соединения_4	119	LCJ4	PRSQPHTKP
Еобласть соединения_5	120	LCJ5	EPRSQPHTKP
Область соединения ’S	область соединения’3_Ig G1	121	CJ’3G1	PPIKSDKTHTCPPCPAPEAA GGP
область соединения’3_1 rG4	122	CJ’3G4	PPI— YGPPCPPCPAPEFLGGP
Область соединения Н	Нобласть соединения_6	123	HCJ6	SSRSQPHTKP
Нобласть	124	HCJ7	EPRSQPHTKP

- 155 045653

	соединения_7
Область соединения J	Ьобласть соединения_6	125	LCJ6	KDKLDADVSP
Ьобласть соединения_7	126	LCJ7	TDKLDADVSP
Область соединения Ί	область соединения ’ 4_Ig G1	127	CJ’4G1	EPKSSDKTHTCPPCPAPEA AGGP
область соединения’4_1 rG4	128	CJ’4G4	ESK— YGPPCPPCPAPEFLGGP
Область соединения (АльфаБета, перекрести ый, в большей степени принадлеж ИТ антителу)	Нобласть соединенияЗ	129	HCJ3	SSASIQNPDP
Ьобласть соединенияЗ	50	LCJ3
Область соединения (АльфаБета, перекрести ый, в большей степени принадлеж нт TCR)	Нобласть соединения_4	130	HCJ4	SSPDIQNPDP
Ьобласть соединения_3	50	LCJ3
Область соединения	Область соединения	131	LCJA	RTVAAGTP

- 156 045653

(ПреальфаБета, нормальн ый, в большей степени принадлеж ИТ антителу)	легкой цепи
Область соединения (ПреальфаБета, перекрести ый, в большей степени принадлеж ИТ антителу)	Область соединения легкой цепи	50	LCJC
Область соединения тяжелой цепи	132	HCJC	SSASGVGGTP
Область соединения (ПреальфаБета, перекрести ый, в большей степени принадлеж нт TCR)	Область соединения легкой цепи	50	LCJD
Область соединения тяжелой цепи	133	HCJD	SSPTGVGGTP
Область соединения	Область соединения’	134	CJ’2G1	SDKTHTCPPCPAPEAAGGP

- 157 045653

’ (АльфаБета, ПреальфаБета, crossed)	Область соединения’	135	CJ’2G4	—YGPPCPPCPAPEFLGGP
ПреТСИ_Диза йн_5_пере крестный_ 1	Легкая	136	VL(CD3)HCJB-C-бета (N69Q, S16C)-CJ’1G	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL EDLKNVFPPEVAVFEPCEA EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VSTDPQPLKEQPALQDSRY ALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGR A
Тяжелая (область соединения в большей степени принадлежит антителу)	137	VH(CD3)HCJC-C-преальфа (SIIC, N50Q) CJ’2G1-Fc	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSASGVGGT PFPCLAPPIMLLVDGKQQ MVVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTARTS DKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNW

- 158 045653

				YVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTIS KAKGQPREPQ VYTL PPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
ПреКИДиза йн_5_пере крестный_ 2	Легкая	136	VL(CD3)HCJB-C-бета (N69Q, S16C)-CJ’1G
Тяжелая (область соединения в большей степени принадлежит npe-TCR)	138	VH(CD3)HCJD-C-преальфа (SI 1)CJ’2G1область соединения Fc	QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTVSSPTGVGGT PFPCLAPPIMLLVDGKQQ MVVVCLVLDVAPPGLDSPI WFSAGQGSALDAFTYGPS PATDGTWTNLAHLSLPSEE LASWEPLVCHTGPGAEGH SRSTQPMHLSGEASTARTS DKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTIS KAKGQPREPQ VYTL PPSREEMTKNQVSLTCLV

- 159 045653

				KGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Пре- ТСИ_Диза йн_6_пере крестный_ 1	Легкая	139	VL(CD3)LCJC-C-бета (А18С, N69Q)	DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEIKL EDLKNVFPPEVAVFEPSEC EISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSG VSTDPQPLKEQPALQDSRY ALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGR A
Тяжелая (область соединения в большей степени принадлежит антителу)	137
ПреТСИ_Диза йн_6_пере крестный_ 2	Легкая	139
Тяжелая (область соединения в большей степени принадлежит TCR)	138
Область соединения ’ (альфабета,	IgGl	140	CJ’2G1	SDKTHTCPPCPAPEAAGGP

- 160 045653

перекрести ый, IgGl)
Область соединения ’ (альфабета, перекрести ый, IgG4)	IgG4	141	CJ’2G4	YGPPCPPCPAPEFLGGP
Антитело против CD3 VH		300		QVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGFAFTDYYIHW VRQAPGQGLEWMGWISPG NVNTKYNENFKGRVTHA DKSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDGYSLYYFDY WGQGTLVTV
Антитело против CD3 VL		301		DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSLLNSRTRKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRQSGVPDRFSGSGSGT DFTLTISSLQAEDVAVYYC TQSHTLRTFGGGTKVEI
Fc(Gl)		302		SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK
Fc(G4)		303		SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFN

WYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK

Примеры

Пример 1. Дизайн и конструирование химерных белков антитела и TCR.

Последовательности TCR.

TCR являются гетеродимерными белками, состоящими из двух цепей. Приблизительно 95% Тклеток человека имеют TCR, состоящие из альфа- и бета-цепей, в то время как остальные 5% имеют TCR, состоящие из гамма- и дельта-цепей. Константная область альфа-цепи человека имеет только один ген TRAC. Константная область бета-цепи человека имеет два подкласса: гены TRBC1 и TRBC2. В Protein Data Bank (PDB) количество кристаллических структур TRBC1 относительно больше количества структур TRBC2, таким образом, последовательности TRBC1 выбирали в качестве основного остова для дизайна полипептидного комплекса, представленного в настоящем описании (WuXiBody). Типичную аминокислотную последовательность TRBC1 можно найти в структуре PDB 4L4T.

- 161 045653

Межцепочечная дисульфидная связь в TCR.

Кристаллическую структуру TCR использовали в качестве основы при дизайне WuXiBody. В отличие от нативного TCR, заякоренного в мембране на поверхности Т-клетки, растворимые молекулы TCR являются менее стабильными, хотя его трехмерная структура очень похожа на антитело Fab. Фактически, нестабильность TCR в растворимом состоянии являлась значительном препятствием для выявления его кристаллической структуры (Wang 2014, выше). Авторы настоящего изобретения использовали стратегию встраивания пары цистеиновых мутаций в константную область TCR и обнаруживали, что они могут значительно улучшать сборку цепей и повышать экспрессию.

Эффекты межцепочечной дисульфидной связи в отношении экспрессии антител.

Для определения того, играют ли дисульфидные связи роль в поддержании структур WuXiBody, экспрессировали конструкции с дисульфидными связями в константной области TCR в химерных антителах и/или без них. Результаты электрофореза экспрессируемого WuXiBody в ПААГ в присутствии SDS показаны на фиг. 15-17. Все экспрессируемое WuXiBody являлось полностью IgG-подобной конструкцией с двумя идентичными плечами. Тестировали экспрессию конструкций с цистеиновыми мутациями и без них между S56 в С-бета и Т49 в С-альфа, экспрессию конструкций с цистеиновыми мутациями между S16 или А18 в С-бета и S11 в С-пре-альфа, между Q57 в С-гамма и V50 в С-дельта и между А19 в Сгамма и Е88 в С-дельта.

Результаты экспрессии конструкций с дисульфидной связью, отсутствующей в С-бета/С-альфа (SEQ ID NO: 32/42), свидетельствуют о том, что конструкции, в которых отсутствуют дисульфидные связи, не могли поддерживать структуру антитела (см. фиг. 15В). Также тестировали экспрессию конструкций с дисульфидной связью, отсутствующей в С-бета/С-пре-альфа и С-гамма/С-дельта, и получали схожие результаты. В отличие от этого, конструкции, содержащие мутантные остатки цистеина, могли образовывать межцепочечные дисульфидные связи, которые могли поддерживать Ig-подобные структуры (см. фиг. 15А).

Дизайн химерных доменов WuXibody.

Парные цистеиновые мутации (нумерация в соответствии с последовательностями на фиг. 19А-19Е) в константных областях TCR встраивали в разные конструкции химерных антител с TCR, приведенных в табл. 21.

Таблица 21

Парные цистеиновые мутации для встраивания межцепочечной дисульфидной связи

АльфаБета	Пре-альфа-Бета	Дельта-Гамма
Цистеинов ые парные мутации	Цистеинов ые парные мутации	Название соответствующего белка SEQ ID NO в HC/LC	Цистеин овые парные мутации	Название соответствующего белка SEQ ID NO в HC/LC
Y11-S16	S11-S16	Дизайн 5 Пре TCR об ласть соединения’1 Cysl3 SEQ ID NO: 70/71	F12-S17	Дизайн_2_Суз2_без_ гликозилирования SEQ ГО NO: 96/95
L13-F13	S11-A18	Дизайн 6 Пре TCR об ласть соединения’1 Cysl4 SEQ ID NO: 72/71	F12-E20	Дизайн_2_СузЗ_без_ гликозилирования SEQ ГО NO: 99/95
L13-S16	S11-E19	Дизайн_7_Пре_Т C Roon асть	M14-F14	Д изай н_2_Суз 1 _без_ гликозилирования

- 162 045653

		соединения’ l_Cysl5 SEQ ID NO: 73/71		SEQ ID NO: 98/97
S16-V12	A13-F13	ДизайнЗПреТСКобл асть соединения’ l_Cysl 1 SEQ ID NO: 69/68	N16-T12	Дизайн_2_йуреСу s 1 _без_гликозилирова НИЯ SEQ ГО NO: 90/89
S16-E14	A13-S16	Дизайн_4_Пре_ТС К обл асть соединения’ l_Cysl2 SEQ ID NO: 70/68	D46-M62	Дизайн_2_йуреСу83 _без_гликозилирова НИЯ SEQ ГО NO: 94/93
V23-F13	I16-A11	Дизайн! 0_npe_TCR_o6 ласть соединения’ l_Cys4 SEQ ID NO: 78/77	V50-Q57	Дизайн 2 hypeCys2 без гликозилиров ания SEQID NO: 92/91
Y44-L62	S62-S56	Дизайн_8_Пре_Т CR_oбл асть соединения’ l_Cysl_4L4 T_1 SEQ ID NO: 75/74	F87-A19	Дизайн_2_Суз4_без_ гликозилирования SEQ ГО NOs: 101/100
T46-D58	T65-S56	Дизайн_9_Пре_Т CR_oбл асть соединения’ l_Cys2_4L4 T_2 SEQ ID NO: 75/76	E88-A19	Дизайн 2 Cys5 без гликозилирования SEQ ГО NO: 101/102
T46-S76	Y59-S76	Дизайн_2_Пре_ТС К обл асть соединения’ l_CyslO SEQ ID NO: 67/66
T49-S56
L51-S56
S62-S56
S62-R78

В случае парных цистеиновых мутаций в константных областях TCR альфа-бета дисульфидную связь T49C-S56C использовали для всех конструкций.

Для получения стабильного и функционального WuXiBody тщательно настраивали области соединения, соединяющие вариабельные домены антитела и константные домены TCR, их относительную ориентацию при слиянии, а также Fc-соединяющие области соединения. Т.к. структура TCR очень похожа на антитело Fab, авторы настоящего изобретения накладывали гомологичную модель антитела Fv на вариабельную область TCR (PDB 4L4T, фиг. 2В). Наложение структур показало, что антитело Fv структурно совместимо с константным доменом TCR. Учитывая это структурное выравнивание и соответствующие последовательности, определяли все необходимые параметры конструирования, как показано ниже.

Ориентация доменов.

Т.к. ориентация VH-С-бета/VL-С-альфа и перекрестного VH-С-альфа/VL-С-бетα при слиянии может приводить к правильной сборке химерного белка, авторы настоящего изобретения конструировали и тестировали обе ориентации. Гомология последовательностей VH-VL является более близкой к TCR Vбета-У-альфа. Авторы настоящего изобретения обозначали формулы VH-С-бета/VL-С-альфа как нормальную ориентацию, и VH-С-альфа/VL-С-бетα как перекрестную ориентацию.

Первый и второй соединительные домены.

Авторы настоящего изобретения выравнивали последовательности антитела и TCR с учетом структурного выравнивания и обнаружили, что области соединения, определенные в последовательности зародышевой линии, не всегда соответствуют тому, что отражено в структуре. Например, учитывая определение последовательностей, области соединения, соединяющие VH и СН1, должны начинать непосредственно после последних двух остатков SS в области VH. Однако, структурно эти два остатка уже являются частью области соединения. Авторы настоящего изобретения определяли области соединения с учетом структуры, а не последовательности.

В табл. 1 и 2 в настоящем описании приведено основанное на структуре выравнивание последовательностей для двух исследуемых ориентации. Т.к. было затруднительным предсказать, какой домен будет совместим с каким соединительным доменом, авторы настоящего изобретения проверяли, как области соединения антитела и TCR перекрываются на наложенных структурах, и оценивали возможную за- 163 045653 мену с использованием наложения друг на друга. Дизайн соединительных доменов представлен в табл. 1 и 2.

Третьи соединительные домены.

Стратегию, схожую с описанной выше использовали для выравнивания шарнирной области IgG1 и IgG4 человека с проксимальной к мембране областью TCR (т.е. шарнирной областью TCR), а также проверяли их перекрывание на структурном уровне. В табл. 7 и 8 в настоящем описании представлен дизайн третьих соединительных доменов.

Петля FG и петля DE.

Выравнивание структур константной области TCR со структурами антител показало, что петли FG и DE бета-цепи TCR являются более длинными, чем соответствующая область CH1 антитела. На фиг. 3А-3В показаны различия константных областей между бета-цепью Т-клеточного рецептора и тяжелой цепью антитела. Для тестирования того, как эти две петли могут нарушать структуру, если СН1 заменяют бета-цепью TCR, получали конструкции с этими двумя петлями и без них.

Учитывая изложенное выше, всего получали девять конструкций, комбинируя эти параметры, как показано в табл. 22 и 23.

Таблица 22

Дизайн химерных белков WuXiBody (С-бета/С-альфа)

SEQ ГО NO (Тяжелая цепь (НС)/Легкая цепь (LC))-IgGl	Ориентац ня	Область соединения	Область соединения’	Петля FG	Петля DE
Дизайн! SEQ ГО NO: 2/1	Нормальна я	Область соединения_ 1	Область соединения’(IgGl, IgG4)	_1	Нативна я	Нативна я
Дизайн! SEQ ГО NO: 4/3	Нормальна я	Область соединения_ 2	Область соединения’(IgGl, IgG4)	1	Нативна я	Нативна я
ДизайнЗ SEQ ГО NO: 9/8	Перекрест ная	Область соединения- 3	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	_2	Нативна я	Нативна я
Дизайн_4 SEQ ГО NO: 10/8	Перекрест ная	Область соединения- 4	Область соединения’(IgGl, IgG4)	_2	Нативна я	Нативна я
Дизайн_5 SEQ ГО NO: 5/1	Нормальна я	Область соединения- 1	Область соединения’(IgGl, IgG4)	1	Заменен ная	Нативна я
Дизайнб SEQ ГО NO: 6/3	Нормальна я	Область соединения- 2	Область соединения’(IgGl, IgG4)	1	Заменен ная	Нативна я
Дизайн_6а SEQ ГО NO: 7/3	Нормальн ый	Область соединения- 2	Область соединения’(IgGl, IgG4)	1	Заменен ная	Заменен ная
Дизайн_7 SEQIDNO: 9/11	Перекрест ная	Область соединения- 3	Область соединения’(IgGl, IgG4)	_2	Заменен ная	Нативна я
Дизайн_8 SEQIDNO: 10/11	Перекрест ная	Область соединения- 4	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	_2	Заменен ная	Нативна я

- 164 045653

Таблица 23

Компоненты и последовательности химерных белков WuXiBody (С-бета/С-альфа)

Название комплекса и SEQ ID NO цепи	Домены с N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Вариабель ный домен тяжелой цепи антитела (VH или VL)	Первый или второй соединительн ый домен (CJ)	Константы ый домен TCR (С1 или С2)	Третий соединительн ый домен+шарни рная область (СТ)	Домен димеризации (D)
НС Дизайн!	VH(CD3)	нсл	С-бета (S56C)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 2	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 49	SEQID NO: 33	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн!	VL(CD3)	LCJ1	С-альфа (Т49С)
SEQID NO: 1	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 51	SEQID NO: 43
НС Дизайн!	VH(CD3)	HCJ!	С-бета (S56C)	CJ'lGl	FcGl
SEQID NO: 4	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQID NO: 33	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн!	VL(CD3)	LCJ!	С-альфа (T49C)
SEQID NO: 3	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQID NO: 43
НС ДизайнЗ	VH(CD3)	HCJ3	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQID NO: 9	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 129	SEQID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC ДизайнЗ	VL(CD3)	LCJ3	С-бета (S56C)

- 165 045653

SEQ ГО NO: 8	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 33+NO: 306
НС Дизайн_4	VH(CD3)	HCJ4	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ГО NO: 10	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 130	SEQ ID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_4	VL(CD3)	LCJ3	С-бета (S56C)
SEQ ГО NO: 8	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 308	SEQ ID NO: 33+NO: 306
НС Дизайн_5	VH(CD3)	HCJ1	С-бета (S56C) (FG-)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 5	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 49	SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_5	VL(CD3)	LCJ1	С-альфа (T49C)
SEQ ГО NO: 1	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 51	SEQ ID NO: 43
НС Дизайнб	VH(CD3)	HCJ1	С-бета (S56C)(FG -)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 6	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайнб	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C)
SEQ ГО NO: 3	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 43
НС Дизайнба	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C)(DE	CJ'lGl	FcGl

- 166 045653

			-FG-)
SEQ ГО NO: 7	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQID NO: 41	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайнба	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C)
SEQID NO: 3	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQID NO: 43
НС Дизайн?	VH(CD3)	HCJ3	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQID NO: 9	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 129	SEQID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн?	VL(CD3)	LCJ3	С-бета (S56C)(FG -)
SEQID NO: 11	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 308	SEQID NO: 37+NO: 306
НС Дизайн_8	VH(CD3)	HCJ4	С-альфа (T49C)	CJ'2G1	FcGl
SEQID NO: 10	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 130	SEQID NO: 43	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_8	VL(CD3)	LCJ3	С-бета (S56C)(FG -)
SEQID NO: 11	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 308	SEQID NO: 37+NO: 306

Пример 2. Получение и характеризация моноспецифических химерных белков TCR/антитело.

Перед слиянием константных доменов TCR в конструкции биспецифического антитела, сначала оценивали осуществимость их встраивания в обычный моноспецифический IgG. Для осуществления этого исследования для подтверждения концепции выбирали разработанное для собственного использования антитело против CD3, названное Т3. Константные домены СН1 и CL Т3 IgG заменяли соответствующей константной областью TCR (С-альфа и С-бета). Использовали все девять разных стратегий, приведенных в табл. 22 (см. выше) и все конструкции экспрессировали в системе Expi293.

В табл. 24 приведен уровень экспрессии сконструированных белков в собранных супернатантах, количественно анализируемый посредством Q-ELISA. В основном, большинство из конструкций с нормальной ориентацией имело лучшую экспрессию, чем форматы с перекрестной ориентацией, и большинство из соединительных областей TCR были лучше соединительных областей антитела. Две конструкции с нормальной ориентацией, Дизайн_5 и Дизайн_6, имели экспрессию, сравнимую с экспрессией Дизайн_2. В случае двух конструкций с перекрестной ориентацией, Дизайн_7, 8 имели лучшую экспрессию, чем Дизайн_3, 4. Наблюдали низкую экспрессию экстрадлинной петли FG в С-бета TCR, что позволяет предполагать, что эта петля FG может вызывать значительные стерические столкновения со слитым доменом VL антитела.

- 167 045653

Таблица 24

Уровни экспрессии и связывание с CD3 всех конструкций в супернатанте

Образцы (IgGl)	Уровень экспрессии в супернатанте (мкг/мл)	Концентрация (нМ) при FACS
5,0	Μ	0,032
MFI
ТЗ	N/A	5101	2937	408
Дизайн!	72,04	5441	2190	292
Дизайн!	204,42	5833	2616	380
ДизайнЗ	15,35	5089	982	137
Дизайн_4	26,11	5438	1213	168
Дизайн_5	113,68	5388	1865	249
Дизайнб	178,56	5789	3914	613
Дизайнба	173,60	5794	2822	405
Дизайн?	75,69	6322	1929	259
Дизайн_8	98,63	6412	1831	243

Эти результаты полностью отличаются от описанного Wu et al. в отношении их дизайна схожих химерных белков антитело-TCR (Wu et al. 2015, выше): их конструкции с перекрестной ориентацией имели низкую экспрессию. Их конструкции с нормальной ориентацией даже не экспрессировались.

Для подтверждения того, подвергаются ли экспрессируемые белки правильному фолдингу и сохраняют ли исходную функцию, авторы настоящего изобретения тестировали их связывание с CD3положительными клетками Jurkat. Для анализа связывания всех образцов посредством FACS использовали три разные концентрации: 5,0, 0,4 и 0,032 нм. В качестве положительного контроля использовали исходное антитело Т3 дикого типа. Данные о дозозависимом связывании CD3 приведены в колонках 3-5 табл. 24. Дизайн_2, Дизайн_6 и Дизайн_6а демонстрировали лучшую связывающую способность, сравнимую с нативным антителом Т3. Примечательно, что все эти три конструкции оказались лучшими тремя экспрессируемыми форматами в клетках млекопитающего. Эта сильная корреляция позволяет предполагать, что уровень экспрессии или связывания может являться результатом одного молекулярного происхождения, т.е. совместимости вариабельного домена антитела и константных доменов TCR, для которых необходимо тщательное конструирование компонентов, таких как соединительные домены и межцепочечная дисульфидная связь и т.д.

Учитывая уровень экспрессии и активность связывания, в качестве конечного формата для дальнейшей разработки выбирали Дизайн_2.

Пример 3. Дегликозилирование.

Посттрансляционные модификации (РТМ), подобные участкам N-гликозилирования, в антителе могут вызывать гетерогенность белков, что затрудняет разработку. Таким образом, предпринимали попытку удалить участки N-гликозилирования в константной области TCR. В константной области TCR обнаружено всего четыре участка N-гликозилирования. Один из них находится в С-бета (N69, см. SEQ ID NO: 244), и а другие три - в С-альфа (N34, N68 и N79, см. SEQ ID NO: 241). Данные об экспрессии, представленные в настоящем описании, позволяют предполагать, что эти участки, особенно участки в Сальфа, фактически, сильно гликозилированы, когда молекулу экспрессируют в клетке млекопитающего.

Все участки гликозилирования в Дизайн_2 удаляли посредством замены четырех остатков Asn на Gln или Ala (обозначены как Дизайн_2-QQQQ или -АААА, см. табл. 25). Хотя эта стратегия распространена в белковой инженерии, показано, что мутации Gln/Ala могут влиять на уровень экспрессии химерных белков TCR/антитело (Wu et al., 2015, выше). Для снижения риска этого также использовали остатки из пре-TCR (N68S в С-альфа) и TCR макаки (N79 в С-альфа, N69E в С-бета) в соответствующих положениях (обозначены как Дизайн_2-QSKE и -ASKE) (см. табл. 25). Кроме того, показано, что в С-альфа может существовать атипичный участок гликозилирования (N61) (Wollscheid et al., Nature Biotechnology, 27(4), pp. 378-386 (2009) Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Wollscheid В., Bausch-Fluck D., Henderson C., O'Brien R., Bibel M., Schiess R., Aebersold R., Watts J.D., Nat. Biotechnol. 27:378-386(2009) [PubMed] [Europe PMC]). Таким образом, этот остаток также подвергают мутации в Gln (обозначен как Дизайн_2-QQQQQ, см. табл. 25). Всех мутантов экспрессировали в Expi293 для дальнейшего тестирования.

- 168 045653

Таблица 25

Уровни экспрессии всех дегликозилированных конструкций в супернатанте

Образец	Уровень экспрессии в супернатанте (мкг/мл)	SEQ ID NO (НС-Сбета/ЕС-С-альфа)
Дизaйн_2-QQQQ	334,39	13/12 (IgGl) 21/12 (IgG4)
Дизайн_2-АААА	414,58	15/14 (IgGl)
Дизaйн_2-QSKE	311,48	17/16 (IgGl)
Дизайн_2-А8КЕ	107,89	17/18 (IgGl)
Дизaйн_2-QQQQQ	213,31	20/19 (IgGl)

Таблица 26

Компоненты дегликозилированных конструкций

Название комплекса и SEQ ГО NO цепи	Домены c N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Вариабельн ый домен тяжелой цепи антитела (VH или VL)	Первый или второй соединител ьный домен (CJ)	Константа ый домен TCR (С1 или С2)	Третий соединительны й домен+шарнирн ая область (СТ)	Домен димеризаци и (D)
НС Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ1G1	FcGl
SEQ ГО NO: 13	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2- QQQQ (IgGl)	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (Т49С) (N34Q+N68 Q+N79Q)
SEQ ID NO: 12	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 44
HC Дизайн_2- QQQQ (IgG4)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ1G4	FcG4
SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 54	SEQ ID NO: 303
LC	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа

- 169 045653

Дизайн_2- QQQQ (IgG4)			(T49C) (N34Q+N68 Q+N79Q)
SEQ ГО NO: 12	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 44
НС Дизайн_2АААА (IgGl)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69A)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 15	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 35	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2АААА (IgGl)	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34A+N68 A+N79A)
SEQ ГО NO: 14	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 45
НС Дизайн_2- QSKE (IgGl)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69E)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 17	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 36	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2- QSKE (IgGl)	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34Q+N68 S+N79K)
SEQ ID NO: 16	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 46
HC Дизайн_2ASKE (IgGl)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69E)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO:

17	300	50	36		302
LC Дизайн_2ASKE (IgGl)	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34A+N68 S+N79K)
SEQ ID NO: 18	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 47
HC Дизайн_2- QQQQQ (IgGl)	VH(CD3)	HCJ2	С-бета (S56C) (N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 20	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2- QQQQQ (IgGl)	VL(CD3)	LCJ2	С-альфа (T49C) (N34Q+N68 Q+N79Q+N 61Q)
SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 52	SEQ ID NO: 48

Уровни экспрессии в супернатантах оценивали посредством Q-ELISA, как показано в табл. 25. Примечательно, что только одна из дегликозилированных конструкций имела немного сниженный уро

- 170 045653 вень экспрессии. Простые мутации в Gln или Ala не имели каких-либо отрицательных эффектов, как показал электрофорез в невосстановительных условиях (фиг. 4), и определяли полосу 150 кДа. В геле для электрофореза в восстановительных условиях (фиг. 4) определяли полосу 25 кДа. И то, и другое свидетельствует об успешном устранении гликозилирования легкой цепи и тяжелой цепи. Мутеины с удаленными N-гликанами в константной области TCR тестировали на связывание с CD3. На фиг. 5 показано связывание разных мутеинов на CD3+ клетках Jurkat. Кривые мутеинов лишь немного сдвинуты вправо по сравнению с кривыми антитела Т3 дикого типа, что может являться результатом того, что детекторное антитело является более чувствительным к IgG человека, чем к химерному белку. Максимальное связывание не изменилось. В целом, большинство дегликозилированных конструкций не проявляли какихлибо очевидных различий в экспрессии или связывании. В качестве конструкции для дальнейшего исследования выбирали Дизайн_2-QQQQ.

В схоже исследовании, проведенном Wu et al. (Wu et al. 2015, выше), получали мутации дегликозилирования в форматах с перекрестной ориентацией, т.к. их форматы с нормальной ориентация не экспрессировались.

Пример 4. Дизайн WuXiBody на основе TCR пре-альфа/бета.

Антигенный рецептор пре-Т-клеток (пре-TCR), экспрессируемый незрелыми тимоцитами, играет ключевую роль в раннем развитии Т-клеток. Пре-TCR имеет обычную бета-цепь, но особую пре-альфацепь только с константной областью, ее последовательность и структура в достаточной степени отличаются от альфа-цепи. Т.к. константная область обычного TCR совместима с вариабельной областью антитела, ожидали, что пре-TCR (см. PDB 3OF6, SEQ ID NO: 246) также можно использовать в дизайне химерного белка. Конструкции антител приведены в табл. 27.

Таблица 27

Дизайн химерных белков для WuXiBody на основе TCR пре-альфа/бета

	Ориентац ИЯ	Область соединения	Область соединения’	Петля FG	Петля DE
ПреТСЯ^Дизайн _А	Нормальн ая	Область соединения	А	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	1	Нативная	Нативная
ПреТСЯ^Дизайн _В	Нормальн ая	Область соединения	В	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	1	Нативная	Нативная
ПреТСКДизайн _С	Перекрест ная	Область соединения	С	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	2	Нативная	Нативная
Пре- ТСЯ^Дизайн _D	Перекрест ная	Область соединения	D	Область соединения’ (IgGl, IgG4)	2	Нативная	Нативная

Комбинируя эти параметры получали всего десять химерных конструкций, как указано в табл. 28.

Таблица 28

Соответствие дизайна химерного белка пре-TCR-αнтитело в форме IgG1

Конструкции в таблице 27	Последовательность	SEQ ID NO (HC/LC)
Пре-	Дизайн_1_Пре_ТСЯ_область соединения’ 1	65/64
ТСКЛизайнВ	Дизайн_2_Пре_ТСЯ_область соединения’_1_Су810	67/66
	ДизайнЗПреТСЯобласть соединения’_1_Су811	69/68
	Дизайн_4_Пре_ТСЯ_область соединения’_1_Су812	70/68
	Дизайн_5_Пре_ТСЯ_область соединения’_1_Су813	70/71
	Дизайн_6_Пре_ТСЯ_область соединения’_1_Су814	72/71
	Дизайн_7_Пре_ТСЯ_область соединения’_1_Су815	73/71
	Дизайн_8_Пре_ТС К обл асть	75/74
	соединения’_1_Су81_4Е4Т_1	75/76
	Дизайн_9_Пре_Т СЯобласть	78/77
	соединения ’ _ 1 _Су s2_4L4T_2
	Дизайн ! О Пре ТСЯ область соединения’_1_Су84
Пре-	Пре-ТСЯЛизайн_5_перекрестный_1	137/136
ТСЯ^ДизайнС	Пре-ТСЯЩизайнбперекрестный!	137/139
Пре-	Пре-ТСЯЛизайн_5_перекрестный_2	138/136
ТСЯ^ДизайнП	Пре-ТСЯЛизайн_6_перекрестный_2	138/139

- 171 045653

Таблица 29

Компоненты конструкции химерного белка npe-TCR-антитело в форме IgG 1

Название комплекса и SEQ ID NO цепи	Домены с N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Вариабель ный домен тяжелой цепи антитела (VH или VL)	Первый или второй соединител ьный домен (CJ)	Константный домен TCR (С 1 или C2)	Третий соедините льный домен+ша рнирная область (СТ)	Домен димериза ции (D)
НС Дизайн_1_Пре ТС Нобласть соединения’1	VH(CD3)	HCJB	С-бета (N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 65	SEQ ГО NO: 300	SEQ ГО NO: 50	SEQ ID NO: 84	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_1_Пре_ТС Нобласть соединения’!	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (N50Q)
SEQ ГО NO: 64	SEQ ГО NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 83
НС Дизайн_2_Пре_ТС Нобласть соединения’_1_Су S10	VH(CD3)	HCJB	С-бета (S76C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 67	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 319	SEQ ГО NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_2_Пре_ТС Нобласть соединения’_1_Су slO	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (Y59C)(N50Q)
SEQ ГО NO: 66	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 311
НС ДизайнЗПреТС Нобласть соединения’_1_Су sll	VH(CD3)	HCJB	С-бета (F13C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 69	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 320	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC ДизайнЗПреТС Нобласть соединения’_1_Су sll	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (A13C)(N50Q)
SEQ ГО NO: 68	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 312
НС Дизайн_4_Пре_ТС Нобласть соединения’_1_Су S12	VH(CD3)	HCJB	С-бета (S16C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 70	SEQ ID	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	SEQ ID	SEQ ID

- 172 045653

	NO: 300	50	321	NO: 53	NO: 302
LC Дизайн_4_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су S12	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (A13C)(N50Q)
SEQ ГО NO: 68	SEQ ГО NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 312
НС Дизайн_5_Пре_ТС Вобласть соединения’_1_Су S13	VH(CD3)	HCJB	С-бета (S16C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 70	SEQ ГО NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 321	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_5_Пре_ТС Иобласть соединения’_1_Су S13	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)
SEQIDNO: 71	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_6_Пре_ТС Иобласть соединения’_1_Су S14	VH(CD3)	HCJB	С-бета (A18C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 72	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 322	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_6_Пре_ТС Иобласть соединения’_1_Су S14	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)

- 173 045653

SEQ ГО NO: 71	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_7_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су S15	VH(CD3)	HCJB	С-бета (E19C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 73	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 323	SEQID NO: 53	SEQID NO: 302
LC Дизайн_7_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су S15	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)
SEQID NO: 71	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 313
НС Дизайн_8_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су sl_4L4T_l	VH(CD3)	HCJB	С-бета (S56C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ГО NO: 75	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQID NO: 53	SEQID NO: 302
LC Дизайн_8_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су sl_4L4T_l	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (S62C)(N50Q)
SEQ ГО NO: 74	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 314
НС Дизайн_9_Пре_ТС Кобласть соединения’_1_Су	VH(CD3)	HCJB	С-бета (S56C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl

- 174 045653

s2_4L4T_2
SEQ ГО NO: 75	SEQ ГО NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн_9_Пре_ТС Нобласть соединения’_1_Су s2_4L4T_2	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (T65C)(N50Q)
SEQ ID NO: 76	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 315
HC Дизайн! ОПреТ СИобласть соединения’_1_Су s4	VH(CD3)	HCJB	С-бета (A11C)(N69Q)	CJ'lGl	FcGl
SEQ ID NO: 78	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 324	SEQ ID NO: 53	SEQ ID NO: 302
LC Дизайн! ОПреТ СИобласть соединения’_1_Су s4	VL(CD3)	LCJB	С-пре-альфа (I16C)(N50Q)
SEQ ГО NO: 77	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 309	SEQ ID NO: 316
НС Пре- ТСН_^Дизайн_5_пе рекрестный!	VH(CD3)	HCJC	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)	CJ'2G1	FcGl
SEQ ГО NO: 137	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 132	SEQ ID NO: 313	SEQ ID NO: 134	SEQ ID NO: 302
LC Пре- ТСН^Дизайн_5_пе рекрестный!	VL(CD3)	LCJC	С-бета (N69Q, S16C)
SEQ ГО NO: 136	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 321+306

- 175 045653

НС Пре- ТСК^Дизайнбпе рекрестный!	VH(CD3)	HCJC	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)	CJ'2G4	FcG4
SEQ ГО NO: 137	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 132	SEQ ID NO: 313	SEQID NO: 134	SEQID NO: 303
LC Пре- ТСК^Дизайнбпе рекрестный!	VL(CD3)	LCJC	С-бета (N69Q, A18C)
SEQ ГО NO: 139	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 322+ 306
НС Пре- TCR_Лизайн_5_пе рекрестный_2	VH(CD3)	HCJD	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)	CJ'2G1	FcGl
SEQID NO: 138	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 133	SEQ ID NO: 313	SEQID NO: 134	SEQID NO: 302
LC Пре- TCRJI,H3afiH_5_ne рекрестный_2	VL(CD3)	LCJC	С-бета (N69Q, S16C)
SEQ ГО NO: 136	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: NO:321+306
НС Пре- TCRJI,H3afiH_6_ne рекрестный_2	VH(CD3)	HCJD	С-пре-альфа (S11C)(N5OQ)	CJ'2G1	FcGl
SEQID NO: 138	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 133	SEQ ID NO: 313	SEQID NO: 134	SEQID NO: 302
LC Пре- TCRДизайнбпе рекрестный_2	VL(CD3)	LCJC	С-бета (N69Q, A18C)
SEQ ГО NO: 139	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 322+306

Описанное в примерах 1-3 позволяет предполагать, что нормальная ориентация и соединительный домен, который в большей степени принадлежит остаткам TCR, больше подходят для получения подходящих химерных белков. Таким образом, использовали ту же стратегию и конструировали соединительные домены легкой цепи и тяжелой цепи, как показано в табл. 3 и 4. В отличие от обычной альфацепи, в этом случае есть только один участок гликозилирования (N50) в пре-альфа-цепи TCR, подвергнутый мутации в остаток Gln (см. SEQ ID NO: 247). Вся тяжелая цепь с константной областью бета-цепи была той же, что и в Дизайн_2 в табл. 22, при этом участок N-гликозилирования (N69) заменяли остатком Gln (см. SEQ ID NO: 244).

Третьи соединительные домены в нормальной ориентации конструировали идентичными доменам, приведенным в табл. 7, и третьи соединительные домены в перекрестной ориентации конструировали идентичными доменам, приведенным в табл. 8 (химерные антитела на основе TCR альфа/бета).

Пре-TCR не содержит нативную межцепочечную дисульфидную связь выше третьего соединительного домена. Аналогично конструированию, которому подвергали обычный TCR, авторы настоящего изобретения встраивали дисульфидную связь в область контакта бета-цепи и пре-альфа-цепи в константной области для улучшения стабильности химерного белка (см. табл. 11). Исследовали все остатки в области контакта в кристаллической структуре пре-TCR (PDB 3OF6) и получали список межцепочечных пар, в которых атомы углерода С-альфа и С-бета находились на расстоянии в пределах 7 А и 5 А, соответственно (см. табл. 11). Затем каждую идентифицированную пару заменяли остатками Cys и экспрессировали мутеин в клетках Expi293.

Пример 5. Дизайн химерных антител на основе TCR гамма/дельта.

TCR, состоящие из гамма- и дельта-цепи, являются менее распространенными, но гетеродимерная природа белка также может быть полезной в дизайне нового химерного формата. Следуя стратегии и способам, валидированным в примере 1, авторы настоящего изобретения получали новые химерные конструкции, в которых использовали константную область TCR дельта-гамма для замены соответствующей области антитела. Структуру TCR дельта-гамма (PDB 4LFH, см. SEQ ID NO: 249 и 252) использовали для облегчения основанного на структуре выравнивания последовательностей антитела и TCR.

В табл. 5 и 6 приведены сконструированные соединительные домены для нормальной ориентации и перекрестной ориентации, соответственно. В табл. 9 и 10 приведены соответствующие соединитель- 176 045653 ные домены IgGl и IgG4 разных ориентации. Структура TCR дельта-гамма больше похожа на антитело, чем TCR альфа-бета. Не осуществляли дизайн дополнительных петель FG и DE. Все участки Nгликозилирования (N65 в гамма-цепи и N16 и N79 в дельта-цепи, см. SEQ ID NO: 250) удаляли посредством замены Gln (Q). Дисульфидную связь в области контакта конструировали посредством той же стратегии, что и в примере 4.

Таблица 30

Дизайн химерного белка TCR/антитело

	Ориентация	Первый и второй соединительны	Третий соединител ьный	Петля FG	Петля DE
		й домен	домен
0§_Лизайн_ 1	Нормальная	Область соединения_4	область соединения’ _3 (IgGl, IgG4)	Нативная	Нативная
0§Лизайн_ 2	Нормальная	Область соединения_5	область соединения’ _3 (IgGl, IgG4)	Нативная	Нативная
3	Перекрестная	Область соединения_6	область соединения’ _4 (IgGl, IgG4)	Нативная	Нативная
dg_JlH3afiH_ 4	Перекрестная	Область соединения_7	область соединения’ _4 (IgGl, IgG4)	Нативная	Нативная

Комбинируя эти параметры, получали всего тринадцать химерных конструкций, как указано в табл. 31.

Таблица 31

Соответствие дизайна химерного TCR/антитело в случае С-гамма/С-дельта

Конструкции IgGl в таблице 30	Конструкции	SEQ ID NO в HC/LC
dg_JlH3afiH_l	dg^H3ailH_l	108/107
dg Дизайн 2	4§^Дизайн_2	106/105
	dgJI,H3adH_2_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa	86/85
	dgJI,H3adH_2_hypeCysl_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa	90/89
	dgJI,H3adH_2_hypeCys2_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa	92/91
	dgJI,H3adH_2_hypeCys3_6e3_raHKO3HnHpoBaHHa	94/93
	dg^H3ailH_2_Cys2_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH	96/95
	dgJI,H3adH_2_Cysl_6e3_rnHKO3HnHpoBaHHa	98/97
	dg^H3ailH_2_Cys3_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH	99/95
	dg^H3ailH_2_Cys4_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH	101/100
	dg^H3ailH_2_Cys5_6e3_niHKO3HnHpoBaHHH	101/102
dg Дизайн 3	dg_nepeKpecTHbidJI,H3aflH_l	110/109
dg Дизайн 4	dg_nepeKpecTHbidJI,H3aflH_2	112/111

- 177 045653

Таблица 32

Компоненты конструкции химерного белка TCR/антитело в случае С-гамма/С-дельта

Название комплекса и SEQ ГО NO цепи	Домены с N-конца к С-концу и их SEQ ГО NO
Вариабельн ый домен тяжелой цепи антитела (VH или VL)	Первый или второй соединитель ный домен (CJ)	Константный домен TCR (С1 или С2)	Третий соединитель ный домен+шар нирная область (СГ)	Домен димеризаци и (D)
НС 0§_Лизайн_1	VH(CD3)	HCJ4	С-гамма	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 108	SEQ ID NO: 300	SEQ ГО NO: 117	SEQ ID NO: 113	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC й§_Лизайн_1	VL(CD3)	LCJ4	С-дельта
SEQ ГО NO: 107	SEQ ID NO: 301	SEQ ГО NO: 119	SEQ ID NO: 310
НС dg Дизайн 2	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 106	SEQ ID NO: 300	SEQ ГО NO: 118	SEQ ID NO: 113	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg Дизайн 2	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта
SEQ ГО NO: 105	SEQ ID NO: 301	SEQ ГО NO: 120	SEQ ID NO: 115
НС dg Дизайн 2 безгликоз илирования	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 86	SEQ ID NO: 300	SEQ ГО NO: 118	SEQ ID NO: 114	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта

- 178 045653

dgJlH3aii^H_2 безгликоз илирования			(N16Q+N79Q )
SEQ ГО NO: 85	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 116
НС dgJlH3aiiH_2 _hypeCysl_6 езгликозил ирования	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (T12C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 90	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 333	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJI,H3aiiH_2 _hypeCysl_6 езгликозил ирования	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (N16C) (N79Q)
SEQ ID NO: 89	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 325
HC dgJlH3aiiH_2 _hypeCys2_6 езгликозил ирования	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (Q57C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 92	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 334	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJI,H3aiiH_2 _hypeCys2_6 езгликозил ирования	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (V50C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 91	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 326
HC	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма	CJ'3G1	FcGl

- 179 045653

dgJ)H3aii^H_2 _hypeCys3_6 езгликозил ирования			(M62C) (N65Q)
SEQ ГО NO: 94	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 335	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJ)H3aiiH_2 _hypeCys3_6 езгликозил ирования	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (D46C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 93	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 327
HC й«Дизайн2 _Cys2_6e3_r ликозилиров ания	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (S17C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 96	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 336	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJ)H3aiiH_2 _Cys2_6e3_r ликозилиров ания	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (F12C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 95	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 328
HC dg Дизайн 2 _Cysl_6e3_r ликозилиров ания	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (F14C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 98	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 337	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302

- 180 045653

LC dglii³aini2 _Cysl_6e3_r ликозилиров ания	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (M14C) (N16Q+N79Q )
SEQ ГО NO: 97	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 329
НС dg^^H3aHH_2 СувЗбезг ликозилиров ания	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (E20C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 99	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 338	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dg^^H3aHH_2 СувЗбезг ликозилиров ания	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (F12C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO: 95	SEQID NO: 301	SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 328
HC dg^^H3aHH_2 _Cys4_6e3_r ликозилиров ания	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (A19C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ID NO: 101	SEQID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 339	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC й§_Л^изайн_2 _Сув4_без_г ликозилиров ания	VL(CD3)	LCJ5	С-дельта (F87C) (N16Q+N79Q )
SEQ ID NO:	SEQID	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:

- 181 045653

100	NO: 301	120	330
НС й§_Лизайн_2 _Cys5_6e3_r ликозилиров ания	VH(CD3)	HCJ5	С-гамма (A19C) (N65Q)	CJ'3G1	FcGl
SEQ ГО NO: 101	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 118	SEQ ID NO: 339	SEQ ID NO: 121	SEQ ID NO: 302
LC dgJJ,H3afi^H_2 _Cys5_6e3_r ликозилиров ания		LCJ5	С-дельта (E88C) (N16Q+N79Q )
SEQ ГО NO: 102		SEQ ID NO: 120	SEQ ID NO: 331
НС dgnepeKpec гнынДизан н_1	VH(CD3)	HCJ6	С-дельта	CJ'4G1	FcGl
SEQ ГО NO: ПО	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 123	SEQ ID NO: 332	SEQ ID NO: 127	SEQ ID NO: 302
LC dgnepeKpec гнынДизан н_1	VL(CD3)	LCJ6	С-гамма
SEQ ГО NO: 109	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 125	SEQ ID NO: 340
НС dgnepeKpec гнынДизан н 2	VH(CD3)	HCJ7	С-дельта	CJ'4G1	FcGl
SEQ ГО NO: 112	SEQ ID NO: 300	SEQ ID NO: 124	SEQ ID NO: 332	SEQ ID NO: 127	SEQ ID NO: 302
LC	VL(CD3)	LCJ7	С-гамма
dgnepeKpec гнынДизан н 2
SEQ ГО NO: 111	SEQ ID NO: 301	SEQ ID NO: 126	SEQ ID NO: 340

Пример 6. Тестирование неправильного спаривания тяжелых и легких цепей антитела.

Одной из проблем при получении биспецифического антитела в IgG-подобном формате является неконтролируемое неправильное спаривание легких и тяжелых цепей. Авторы настоящего изобретения оценивали то, могут ли замененный TCR бета и альфа домен СН1 и CL собираться с нормальной тяжелой цепью и легкой цепью IgG, когда они коэкспрессируются в одной клетке-хозяине.

Помимо антитела против CD3 Т3, авторы настоящего изобретения также разрабатывали моноклональное антитело U4 против В-лимфоцитарного антигена CD19. Для проверки того, насколько вероятно то, что легкие цепи и тяжелые цепи двух нативных антител будут неправильно спариваться, пары легких и тяжелых цепей Т3 и U4 специально меняли местами (Т3_легкая-U4_тяжелая, Т3_тяжелая-U4_легкая) и коэкспрессировали в клетках Expi293. Для наглядного сравнения осуществляли такое же исследование с использованием TCRмодифицированного ТЗ. На фиг. 6А-6В показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS для белков в IgG1 и IgG4. В случае переставленных пар с использованием нативных антител при наличии полосы 150 кДа в ПААГ в невосстановительных условиях и полос 50 кДа и 23 кДа в ПААГ в восстановительных условиях четко подтверждали сборку неправильно спаренного белка IgG. Однако после встраивания TCRмодифицированного Т3 полосы 150 кДа в геле больше не обнаруживали, что свидетельствует о том, что ни одна из некогнатных пар не могла собраться в антитело-подобную молекулу. Эти данные подтверждают, что сконструированный авторами настоящего изобретения TCR-модифицированный Fab может эффективно предотвращать неправильное спаривание некогнатных цепей.

- 182 045653

Пример 7. Получение и характеризация химерных белков Fab-TCR.

Чтобы убедиться, что TCR-модифицированное антитело Fab можно использовать для конструирования биспецифического антитела, конструировали Fab-фрагменты, укороченные в двух положениях. На фиг. 8 показано, что Fab TCR-модифицированного Т3 с удаленным N-гликаном успешно экспрессировали и очищали (T3-Fab-Дизайн_2.his1 (SEQ ID NO: 30/12) и T3-Fab-Дизайн_2.his2 (SEQ ID NO: 31/12)). Их способность к связыванию с CD3 также оценивали с помощью CD3+ клеток Jurkat и сравнивали с моновалентной формой Т3 дикого типа. На фиг. 9 показано, что химерный Fab и моновалентное Т3 имели качественно схожие связывающие свойства. Отклонения могут являться результатом различий способов детекции белков с метками His и Fc.

Пример 8. Получение и характеризация биспецифического антитела на основе TCR с выступамиво-впадины.

После успешного слияния константного домена TCR с моноспецифическим антителом Т3 и подтверждения того, что с помощью нового формата можно эффективно предотвращать неправильное спаривание цепей с антителом U4, авторы настоящего изобретения конструировали биспецифические форматы.

TCR-модифицированное Т3 и U4 дикого типа с мутациями выступы-во-впадины, используемыми в домене СН3 Fc, коэкспрессировали в клетках Expi293. Получали мутации выступы-во-впадины S139C и T151W в домене СН3 (SEQ ID NO: 295, выступ) Т3 и Y134C, T151S, L153A и Y192V в домене СН3 (SEQ ID NO: 296, впадина) U4 изотипа IgG1. Альтернативно, получали мутации выступы-вовпадины S136C и T148W в домене СН3 (SEQ ID NO: 298, выступ) Т3 и Y131C, T148S, L150A и Y189V в домене СН3 (SEQ ID NO: 299, впадина) U4 изотипа IgG4. На фиг. 7А-7В показаны результаты электрофореза в ПААГ в присутствии SDS полученных белков в форме IgG1 и IgG4 после очистки. Выход после первой стадии очистки с протеином А достигал 125 мг/л и 173,7 мг/л для IgG1 и IgG4, соответственно. Четко наблюдали правильную молекулярную массу, т.е. полосы приблизительно 150 кДа в геле в невосстановительных условиях, а также полосы приблизительно 50 и 25 кДа в геле в восстановительных условиях. Очищенные образцы дополнительно исследовали с помощью SEC-ВЭЖХ. Чистота IgG1 и IgG4 достигала 98,63% и 100%. Данные свидетельствуют о том, что IgG-подобные молекулы в форме IgG1 и IgG4 хорошо экспрессировались и собирались. Эти включающие TCR, новые биспецифические форматы обозначали как E17-Дизайн_2-QQQQ(SEQ ID NO: 22/12/24/23 для IgG1 и SEQ ID NO: 25/12/26/23 для IgG4).

Хотя в случае сконструированного биспецифического антитела наблюдали ожидаемую молекулярную массу, было необходимым определить, сохраняет ли каждое плечо свою исходную способность к связыванию с их индивидуальным когнатным антигеном. Т.к. для каждой мишени Е17-Дизайн_2 являлось моновалентным связывающим средством, авторы настоящего изобретения также конструировали моновалентную версию нативного Т3 и нативного U4 для наглядного сравнения. На фиг. 10А и фиг. 10В показаны результаты связывания при FACS сконструированного биспецифического антитела с CD3+ клетками Jurkat и CD19+ клетками Ramos, соответственно. Плечо TCR-модифицированного Т3 проявляло умеренную потерю связывания по сравнению с Т3 дикого типа, но IgG4 превосходило IgG1 и было близким к нативному белку. Связывание плеча U4 не снижалось под действием соседнего сконструированного плеча Т3. Оно имело связывание, схожее с исходным антителом U4 в моновалентной форме. Примечательно, в этот раз IgG1 превосходило IgG4. Неясно, почему изотип играет роль в поддержании моновалентного связывания. В наблюдаемое явление могут носить свой вклад факторы, подобные стабильности константной области TCR, выбора дизайна третьего соединительного домена или взаимодействиям между двумя плечами Fab.

Моновалентное связывание TCR-модифицированного биспецифического формата с CD3 и CD19 снижалось по сравнению с бивалентными родительскими антителами. Известно, что активация Т-клеток посредством связывания с CD3 является достаточно чувствительной. Сильная стимуляция Т-клеток может иметь побочные эффекты. Таким образом, относительно слабое связывание с CD3, вероятно, являлось приемлемым и даже желательным по причинам, связанным с безопасностью. Однако слабое связывание с CD19 может напрямую влиять на его способность к направляемому биспецифическим антителом цитолизу В-клеток и, таким образом, снижает эффективность лекарственного средства. Для подтверждения важности связывания с CD19 и для тестирования универсальности химерных конструкций, полученных авторами настоящего изобретения, они получали другие биспецифические конструкции, названные F16-Дизайн_2-QQQQ в IgG4, в которых сконструированное плечо Т3 все равно будет моновалентным, но плечо U4 будет бивалентным.

Новую конструкцию экспрессировали, очищали и подвергали эксперименту по связыванию. На фиг. 11А11В показаны результаты анализа связывания FACS по сравнению со сконструированным ранее Е17 и двумя родительскими антителами Т3 и U4. Примечательно, что F16-Дuзайн_2-QQQQ имело улучшенное связывание с CD3 и CD19 (SEQ ID NO: 25/12/27/23 в порядке HC/LC (антитело против CD3)/HC/LC (антитело против CD19)). Его связывание с CD19 (SEQ ID NO: 27/23) было сравнимым со связыванием антитела U4 дикого типа. Данные подтверждали, что дизайн химерной конструкции с Т3, полученной авторами настоящего изобретения, можно использовать в отношении разных биспецифических форматов.

- 183 045653

Пример 9. Анализ in vitro направляемого биспецифическим антителом цитолиза опухолевых клеток.

Функциональный анализ in vitro осуществляли для проверки активности сконструированного биспецифического формата в Т-клеточном цитолизе злокачественных В-клеток. Сначала тестировали конструкцию Е17. В качестве отрицательных контролей использовали родительские моноспецифические антитела Т3 и U4. На фиг. 12 показана дозозависимая цитолитическая функция этого биспецифического формата Е17. E17-IgG4 (EC₅₀=57 пМ) было более активным, чем Е17-IgG1 (EC₅₀=624 пМ). Для улучшения активности цитолиза формат F16, имеющий два участка связывания CD19, также сравнивали с Е17. Как показано на фигуре 13, по сравнению с Е17 (EC₅₀=17,7 пМ) активность F16 (EC₅₀=5,5 пМ) была в 3 раза выше. Данные подтверждали эффект влияния связывания с CD19 в отношении цитолиза. В качестве отрицательного контроля использовали неродственное антитело IgG4 человека.

Пример 10. Характеризация посредством масс-спектрометрии.

Для подтверждения того, что полученное биспецифическое антитело собирается правильно, авторы настоящего изобретения охарактеризовывали молекулу E17-Дизайн_2-QQQQ посредством массспектрометрии. Различия теоретической молекулярной массы между двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями составляли приблизительно 4000 Да и 500 Да, соответственно. На фиг. 14А показаны спектры белка в невосстановительных условиях. Пик 148180 Да соответствовал ожидаемой массе молекулы правильно собранного биспецифического антитела. Отсутствие других пиков свидетельствует о том, что мутации выступы-во-впадины в Fc-области, а также замененные TCR области CH1/CL правильно функционировали при спаривании четырех желаемых цепей. Примечательно, что с помощью массовых спектров в невосстановительных условиях нельзя отличить правильно собранное биспецифическое антитело от IgG, в котором обе легкие цепи неправильно спарены. Однако в примере 4 указано, что неправильно спаренные тяжелые и легкие цепи не будут экспрессироваться или собираться, что устраняет возможность неправильного спаривания обеих пар тяжелых и легких цепей.

В невосстановительных условиях (см. фиг. 14А) наблюдали пик 149128 Да, приблизительно на 947 Да превышающий вычисленную массу молекулы. Масс-спектрометрический анализ также осуществляли с использованием белка в восстановительных условиях. На фиг. 14В показано, что фактически пик был на расстоянии 948 Да от химерной легкой цепи VL-C-альфа, что свидетельствует о О-гликановых модификациях (GlcNAc+Hex+2-NeuAc) в легкой цепи.

Пример 11. Тестирование термостабильности.

Авторы настоящего изобретения дополнительно тестировали и сравнивали термостабильность сконструированных биспецифических антител в форме IgG1 и IgG4 посредством измерения температуры плавления белка Tm с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). В качестве контролей использовали нативное моноспецифическое Т3 и TCR-модифицированное Т3 (Дизайн_2 и Дизайн_2-QQQQ).

В табл. 33 приведены измеренные значения T_on, Tm новых конструкций. В целом, все молекулы демонстрировали приемлемую термостабильность. IgG1-подобные молекулы были более стабильными, чем IgG4-подобные молекулы. Значение Tm нативного антитела Т3 составляло 74°С. Химерные белки TCR-антитело имели относительно более низкую Tm приблизительно 60°С, что позволяет предполагать, что С-бета-С-альфа TCR может быть менее устойчивым к повышенным температурам по сравнению с CH1-CL нормального антитела. Это соответствует описанному Wu (Wu et al. 2015, выше), и предполагали, что домен С-альфа был менее стабильным, чем С-бета (Toughiri et al. mAbs, 862(July), рр. 12761285(2016)).

Мутации, приводящие к устранению N-гликозилирования в константной области TCR, не влияли на термостабильность химерного белка. Полученное авторами настоящего изобретения биспецифическое антитело E17-Дизайн_2-QQQQ имело T_m, схожую с Дизайн_2-QQQQ, и более низкую T_m, чем нативное Т3.

- 184 045653

Таблица 33 Термостабильность сконструированного химерного и биспецифического антитела, измеряемая посредством дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF)

Название белка HC/LC (антитело против CD3)/HC/LC (антитело против CD19)	Изоти π	Концентрац ия (мг/мл)	Ton (°C)	T_hl (Tm) (°Q	T_h 2 (°C)	pi	Чистот a
ТЗ	IgGl	2,7	57	74,2	He onpe деле HO	8,31	99,41%
Дизайн_2 ( SEQ Ш NO: 4/3/4/3)	IgGl	1,6	46	59,3	He onpe деле HO	6,07	93,09%
Дизaйн_2-QQQQ (SEQ ID NO: 13/12/13/12)	IgGl	1,1	45	59,1	He onpe деле HO	6,07	99,03%
Е17-Дизайн_2- QQQQ (SEQ ID NO: 22/12/24/23)	IgGl	0,3	49	61,9	76,2	7,29	98,63%
ТЗ	IgG4	1,4	53	65	73,2	8,24	96,06%
Дизaйн_2-QQQQ (SEQ ID NO: 21/12/21/12)	IgG4	0,9	45	58,4	He onpe деле HO	5,7	96,05%
Е17-Дизайн_2- QQQQ (SEQ ID NO: 25/12/26/23)	IgG4	0,8	47	60,2	72,7	6,4	100%

Пример 12. Материалы и способы.

Гомологичное моделирование Fv антитела Т3.

Структурную модель антитела Fv строили с учетом аминокислотных последовательностей Fv с использованием программного обеспечения Discovery Studio (BIOVIA). Сначала последовательности легкой и тяжелой цепи аннотировали в соответствии с нумерацией по Kabat для идентификации трех CDR, а также каркаса каждой цепи. Затем каждый сегмент (CDR или каркас) подвергали поиску BLAST в базах данных антител с использованием последовательностей всех структур антител в PDB. Для построения гомологичной модели использовали структуру наиболее совпадающей последовательности, если она имеет высокое разрешение и низкий В-фактор. Затем все смоделированные сегменты собирали для конструирования структурной модели легкой и тяжелой цепи. Относительную ориентацию двух смоделированных цепей прогнозировали, используя угол структуры антитела, имеющей наиболее схожую общую последовательность. Всю молекулярную визуализацию и аналитическую работу осуществляли с использованием программного обеспечения PyMOL (Schrodinger).

Векторные конструкции.

Гены VL, VH, Ck, CH1 амплифицировали посредством ПЦР с использованием существующих матриц ДНК собственной разработки. Гены С-альфа и С-бета синтезировали в Genewiz Inc. Гены нативной или химерной легкой цепи встраивали в линеаризованный вектор, содержащий промотор CMV и сигнальный пептид каппа-цепи. Фрагменты ДНК VH-CH1 или VH-C-бета встраивали в линеаризованный вектор, содержащий константную область СН2-СН3 IgG4/IgG1 человека. Вектор содержит промотор CMV и сигнальный пептид тяжелой цепи антитела человека. Лигирование плазмид, трансформацию, получение ДНК осуществляли стандартными способами молекулярной биологии. Сайт-специфический мутагенез осуществляли посредством ПЦР-амплификации с использованием мутагенных праймеров с последующим расщеплением ДНК-матрицы с помощью DpnI.

Экспрессия белка.

С помощью сконструированных векторов для тяжелой цепи и легкой цепи котрансфицировали клетки Expi293 (Thermofisher Scientific). Соотношение разных векторов для котрансфекции корректировали в соответствии с ожидаемой структурой антител и результатом исходной экспрессии, определенном посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. В кратком изложении, 40 мкг плазмиды и

- 185 045653

108 мкл ExpiFectamine использовали для трансфекции 40 мл 1,2x108 клеток. Через 20 ч после трансфекции добавляли Enhancer 1 и Enhancer 2. Трансфицированные клетки культивировали при 37°С с 8% СО₂ на орбитальном шейкере при 120 об/мин. Через пять дней после трансфекции супернатанты собирали посредством центрифугирования и удаляли фрагменты клеток с помощью фильтра 0,22 мкм.

Детекция экспрессии посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS.

Супернатант, собранный в 5-й день, смешивали с буфером для образцов NuPAGE LDS (4-кратным), восстановителем для образцов NuPAGE (10-кратным) и Н₂О. Восстановленные образцы нагревали при 75°С перед нанесением на гель. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В в течение 35 мин. Затем гели окрашивали SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, LC6065) и помещали в микроволновую печь на 5 мин. Обесцвечивание осуществляли посредством инкубации с водой и обработки в микроволновой печи в течение 7 мин. Изображения гелей получали с использованием Universal Hood III (BioRad).

Очистка.

Очистка посредством хроматографии с протеином А.

Смолы с протеином A MabSelect™ SuRe™ (MSS) получали от GE Healthcare и упаковывали в стеклянные колонки (BioRad). Очистку посредством хроматографии с протеином А осуществляли при комнатной температуре с использованием перистальтического насоса при скорости потока 0,2 мл/мин. После введения образцов для элюции использовали 10 объемов колонки 100 мМ глицина, рН 3,5, и собирали разные фракции. Концентрацию белка в разных фракциях измеряли с использованием NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific). Чистоту белка определяли посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC-ВЭЖХ.

Ионообменная хроматография (ТЕС).

Эксперименты с IEC осуществляли с использованием колонки HiTrap SP HP 1 мл от GE Healthcare Life Sciences и системы AKTA Pure (GE Healthcare). Программируемые параметры способа являлись следующими: промывка колонки 10 CV промывочного буфера А (10 мМ NaH₂PO₄, рН 6,0); введение образца с использованием впускного отверстия для образцов; уравновешивание колонки 10 CV промывочного буфера А (10 мМ NaH₂PO₄, рН 6,0); элюция колонки промывочным буфером А и промывочным буфером В (10 мМ NaH₂PO₄, 1 M NaCl, рН 6,0). Условия элюции в градиенте использовали в виде линейной стадии с 50 CV с использованием 30% промывочного буфера В, линейной стадии с 5 CV с использованием 100% промывочного буфера В и стадии с наполнением 10 CV с использованием 100% промывочного буфера В. Фракции собирали в виде 0,5 мл на пробирку в соответствии со значением поглощения УФ (пороговое значение при сборе устанавливали на 5 мЕА).

Эксклюзионная хроматография (SEC).

Хроматографические эксперименты осуществляли с использованием колонки Superdex™ 200 Increase 10/300 GL и системы AKTA от GE Healthcare Life Sciences. Эксперимент проводили с использованием PBS (137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 1,76 мМ KH2PO4, 10 мМ Na₂HPO₄, рН 7,0) при 0,5 мл/мин. Фракции собирали с использованием автоматизированной программы для сбора (значение поглощения УФ для сбора устанавливали на 5 мЕА) при объеме каждой фракции 0,5 мл.

Очистка посредством хроматографии с Ni Sepharose™ Excel.

Очистку меченого 6xHis белка осуществляли с использованием хроматографических смол Ni Sepharose™, приобретенных в GE Healthcare. Смолу упаковывали в стеклянные колонки (BioRad). После промывки колонки 10 объемами колонки (CV) ddH₂O для удаления буфера для консервации смолы, ее использовали для очистки меченых 6xHis белков. В кратком изложении, очистку с помощью колонки с Niсефарозой осуществляли при комнатной температуре с использованием перистальтического насоса при скорости потока 0,2 мл/мин. После введения образца для промывки использовали 10 CV PBS (50 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, pH 7,0), затем 5 CV элюирующего буфера 1 (50 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,0) для удаления слабо связанного белка. Для элюции связанного белка использовали 10 CV элюирующего буфера 2 (50 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, рН 7,0). После элюции собранный белок измеряли с использованием NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific). Чистоту элюированного белка определяли посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC-ВЭЖХ. Колонку регенерировали с использованием 10 CV ddH2O, 10 CV буфера для стрипирования (50 мМ Трис, 500 мМ NaCl, 50 мМ ЭДТА, рН 7,4) для санации, 10 CV 6 М гидрохлорида гуанидина, рН 7,4, и 10 CV 0,1 М сульфата никеля. Регенерированную колонку наполняли 20% этанолом и хранили при 4°С.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (SEC-ВЭЖХ).

Чистоту образцов анализировали с использованием колонки TSK-GEL G3000SWXL (7,8 мм x 300 мм) от Tosoh Bioscience и системы для ВЭЖХ Agilent 1200 (Agilent Technologies). Колонку уравновешивали фосфатным буфером (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,0) при скорости потока 1,0 мл/мин. После фильтрации и впрыскивания образца белка объемом 50 мкл осуществляли мониторинг поглощения УФ при 280 нм. Чистоту оценивали посредством интегрирования хроматограммы.

Измерение концентрации антител посредством ELISA.

Планшеты для ELISA покрывали 200 нг/мл (Fab)₂-формы антитела козы против Fc IgG человека в

- 186 045653 покрывающем буфере (200 мМ Na₂CO₃/NaHCO₃, рН 9,2). После инкубации в течение ночи при 4°С планшеты однократно промывали буфером PBS с использованием устройства Deep-Well Washer (Biotek ELx405). Затем планшеты блокировали 2% BSA в буфере PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты 3 раза промывали промывочным буфером и добавляли антитело положительного контроля и разбавленные образцы. После 2-часовой инкубации планшеты промывали 6 раз 300 мкл промывочного буфера и добавляли биотинилированное антитело козы против Fc Ig человека (Bethyl, 100 мкл/лунку, разведение 1:5000 в 2% BSA) в качестве детекторного антитела. После стадий инкубации и промывки добавляли SA-HRP (Invitrogen, разведение 1:8000 в 2% BSA). Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре еще в течение 1 ч. Планшеты промывали 6 раз с помощью 300 мкл/лунку промывочного буфера. Добавляли субстрат ТМВ и проявляли в течение 10 мин. Добавляли стоп-раствор (2 М HCl, 100 мкл/лунку) для прекращения дальнейшего проявления окрашивания и измеряли поглощение при 450 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов (Molecular Device SpectraMax® M5e).

Анализы связывания мишени.

Связывающую способность сконструированных молекул оценивали с использованием CD3+ клеток Jurkat и CD19+ клеток Ramos, соответственно. Обе линии клеток получали в American Type Culture Collection (ATCC) и поддерживали в среде RPMI 1640 (Invitrogen, кат. № 22400105), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, Corning, кат. № 35-076-CV).

Аликвоты по 105 клеток на лунку собирали и промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA, BovoGen-BSAS) с последующей инкубацией с серийно разведенными исследуемыми антителами в 96-луночном круглодонном планшете (Corning, кат. № 3799) при 4°С в течение 1 ч. После двукратной промывки 1% BSA планшеты дополнительно инкубировали с РЕ-конъюгированным антителом козы против Fc IgG человека (Jackson Immuno Research Laboratories, кат. № 109-115-098) при 4°С в течение 30 мин. После того как планшеты снова дважды промывали, клетки анализировали посредством проточной цитометрии с использованием цитометра FACSCanto II (BD Biosciences) и соответствующую интенсивность флуоресценции количественно анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Для получения значений ЕС₅₀ использовали четырех-параметрический нелинейный регрессионный анализ в программном обеспечении GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

Направляемый биспецифическими антителами цитолиз опухолевых клеток.

Для получения Т-клеток человека мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здоровых доноров выделяли из гепаринизированной венозной крови посредством центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03). После культивирования в среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS, 1% раствором пенициллина/стрептомицина (ScienCell, кат. № 0503), 50 ед. на мл белка-лиганда ИЛ-2 человека и 10 нг/мл антитела OKT3 (EBioscience, кат. № 16-0037-85), в течение 6 дней РВМС пропускали через колонки EasySep (Stemcell, кат. № 19053) для обогащения CD8+ Т-клеток. CD8+ Т-клетки из колонок для отрицательной селекции использовали в качестве эффекторных клеток.

В анализе цитотоксичности CD19+ клетки Raji в качестве клеток-мишеней предварительно метили с использованием 20 нМ CellTrace Far Red (Invitrogen, кат. № C34564) при 37°С в течение 30 мин. Затем клеточные осадки дважды промывали средой RPMI 1640 без фенола (Invitrogen, кат. № 11835030), дополненной 10% FBS. Окрашенные Far Red-stained В-клетки Raji (20000 клеток/лунку) инкубировали в 96-луночном круглодонном планшете (Corning, кат. № 3799) с выделенными CD8+ Т-клетками (соотношение мишень/эффекторная клетка 1:5) и серийно разведенными биспецифическими антителами при 37°С в течение 4 ч. После инкубации добавляли 3 мкМ йодида пропидия (PI, Invitrogen, кат. № Р3566) и тщательно смешивали для идентификации погибших клеток. Через 15 мин клетки анализировали посредством проточной цитометрии с использованием цитометра FACSCanto II. Опосредованную биспецифическим антителом цитотоксичность можно определять как процентную долю PIположительных клеток-мишеней среди Far Red-положительных клеток-мишеней. EC₅₀ цитотоксичности Т-клеток определяли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

Характеризация посредством масс-спектрометрии.

Белок разводили до 0,4 мг/мл и дегликозилировали посредством инкубации с 1 мкл ПНГазы F (Glyko, GKE-5006D) (соотношение белка и фермента 40:1) в 100 мкл 20 мМ буфера Трис (рН 8,0) при 37°С в течение по меньшей мере 4 ч. Аликвоту дегликозилированных биспецифических антител частично восстанавливали посредством добавления 2 мкл 1М DTT до конечной концентрации 20 мМ при комнатной температуре в течение 15 мин. Каждый образец в количестве 2 мкг впрыскивали в колонку Acquity UPLC BEH300 С4 (2,1x100 мм, 1,7 мкм) при 0,4 мл/мин. Подвижная фаза А представляла собой 0,1% муравьиной кислоты (FA) в воде категории ВЭЖХ. Подвижная фаза В представляла собой 0,1% FA в ацетонитриле. В случае невосстановительных и восстановительных условий использовали эффективный градиент элюции от 24% В до 34% В в течение от 3,0 до 15,0 мин. После разделения с помощью RP UPLC массу биспецифического белка в невосстановительных и восстановительных условиях определяли

- 187 045653 с помощью Waters Xevo G2 Q-TOF. Сигналы MS подвергали деконволюции с использованием программного обеспечения BiophamaLynx 1.3. Теоретические усредненные по массе молекулярные массы компонентов легкой цепи и тяжелой цепи определяли с использованием программного обеспечения

GPMaw (v. 6.00).

Тестирование термостабильности посредством DSF.

Анализ DSF осуществляли с использованием системы для ПЦР в реальном времени 7500 Fast RealTime PCR (Applied Biosystems). В кратком изложении 19 мкл раствора антитела смешивали с 1 мкл 62,5кратного раствора SYPRO Orange (Invitrogen) и наносили на 96-луночный планшет (Biosystems). Планшет нагревали с 26°С до 95°С со скоростью 2°С/мин и собирали получаемые данные о флуоресценции. Вычисляли отрицательные производные изменений флуоресценции в отношении разных температур и максимальное значение определяли как температуру плавления T_h. Если белок имеет множество конформационных переходов с разворачиванием, регистрировали первые две T_h и обозначали их как T_h1 и T_h2-T_h1 всегда интерпретируют как формальную температуру плавления T_m для облегчения сравнения разных белков. Сбор данных и вычисление Th осуществляли автоматически с помощью программного обеспечения. После построения графика отрицательных производных разных температур с помощью программного обеспечения, точку на графике, в которой кривая начинает снижаться относительно базового уровня до перехода, можно приблизительно принимать за температуру начала перехода T_on.

Пример 13. Идентификация О-гликанов.

При предшествующей масс-спектрометрии в легкой цепи TCR-модифицированного Т3 обнаруживали О-гликаны. В отличие от участков N-гликозилирования, которые можно локализовать с учетом паттернов аминокислотной последовательности, участки О-гликозилирования трудно прогнозировать с учетом последовательности. Эта TCR-химерная легкая цепь Т3 состояла из V-области родительского антитела Т3, а также константной области альфа-цепи TCR. Обе области потенциально могут иметь Участки О-гликозилирования. Снова осуществляли масс-спектрометрический анализ исходного моноклонального антитела Т3 и обнаруживали, что это родительское антитело не содержало О-гликаны, что свидетельствует о том, что О-гликаны локализовались с константной области альфа-цепи TCR.

Известно, что О-гликозилирование, главным образом, происходит на остатках Ser или Thr, и в последовательности константной области альфа-цепи TCR есть 21 остаток Ser/Thr (показаны полужирным шрифтом в последовательности ниже). Для определения точного положения участков Огликозилирования осуществляли аланиновое сканирование Ala для замены каждого отдельного Ser/Thr на Ala, и конструировали 21 TCR-модифицированную моноспецифическую молекулу Т3. Потенциальные О-гликаны на каждом мутанте высвобождали из белка, метили 2-аминобензойной кислотой и количественно анализировали посредством ВЭЖХ с использованием датчика флуоресценции. Потеря сигнала О-гликанов может служить в качестве средства определения локализации участка О-гликозилирования.

1121 3141

PDIQNPDPAV YQLRDSKSSD KSVCLFTDFD SQTQVSQSKD SDVYITDKCV 5161718191

LDMRSMDFKS NSAVAWSQKS DFACANAFQN SIIPEDTFFP SPESS (SEQ ID NO:411)

Для идентификации и анализа количества О-гликанов разрабатывали способ кислотного гидролиза и способ ВЭЖХ. Образец гидролизовали с помощью 2 М TFA (трифторуксусной кислоты) и высвобождали моносахарид О-гликана. Высвобожденный GalN (галактозамин) из GalNAc (N-ацетил-Dгалактозамина) О-гликана и Gal (галактозу) метили 2-аминобензойной кислотой, анализировали посредством ВЭЖХ с использованием FLD (датчика флуоресценции) и количественно анализировали с помощью внешней калибровочной кривой. Содержание высвобожденного GalN напрямую коррелировало с количеством О-гликана, т.к. он является моносахаридом, специфическим для О-гликанов. Результаты приведены в виде количества моль GalN на моль белка, что соответствует тому, что один моль белка содержит количество моль О-гликанов.

В табл. 34 приведены уровни О-гликанов на всех мутантах. В качестве контрольного белка использовали биспецифическую молекулу E17-Дизайн_2-QQQQ. Данные свидетельствовали о том, что было 0,24 моль доступных О-гликанов на каждый моль белка E17-Дизайн_2-QQQQ. Т.к. это биспецифическое антитело содержит только TCR-модифицированную легкую цепь Т3, общий уровень О-гликанов двух цепей необходимо удваивать, т.е. он составляет приблизительно 0,48 моль/моль. Среди всех 21 мутанта большинство сохраняло ожидаемое количество О-гликанов. Образцы #3, #8, #10 и #20 демонстрировали небольшое снижение сигнала. Образец #19 демонстрировал очевидную утрату О-гликанов. Сигнал был даже ниже сигнала контрольного белка. Таким образом, положение S91 идентифицировали как основной участок О-гликозилирования. S19, S36, S41 и S94 идентифицировали как возможные участки Огликозилирования.

- 188 045653

Таблица 34 Количественно проанализированные О-гликаны на различных мутантах с единичными Ala (нумерация остатков приведена на фиг. 19А)

№ проекта	WBP3438	Аналитически й№	AS1803474
Исследуемый образец	Анализ моносахаридов	№ SOP	PD-PAS-LAB- 090-02
№ образца	ID образца	Результаты теста (моль/моль белка)
Галактозамин
196388	Е17-Дизайн_2-ОООО	0,24 (х2)
1	T3.uIgG4.SP(S16A)	0,41
2	T3.uIgG4.SP(S18A)	0,43
3	T3.uIgG4.SP(S19A)	0,38
4	T3.uIgG4.SP(S22A)	0,45
5	T3.uIgG4.SP(T27A)	0,57
6	T3.uIgG4.SP(S31A)	0,44
7	T3.uIgG4.SP(T33A)	0,42
8	T3.uIgG4.SP(S36A)	0,36
9	T3.uIgG4.SP(S38A)	0,47
10	T3.uIgG4.SP(S41A)	0,37
11	T3.uIgG4.SP(T46A)	0,50
12	T3.uIgG4.SP(S55A)	0,43
13	T3.uIgG4.SP(S60A)	0,53
14	T3.uIgG4.SP(S62A)	0,56
15	T3.uIgG4.SP(S67A)	0,57
16	T3.uIgG4.SP(S70A)	0,52
17	T3.uIgG4.SP(S81A)	0,53
18	T3.uIgG4.SP(T87A)	0,55
19	T3.uIgG4.SP(S91A)	0,12
20	T3.uIgG4.SP(S94A)	0,32
21	T3.uIgG4.SP(S95A)	0,61

Пример 14. Связывание с рецептором Fcy, C1q и FcRn.

Способы.

Аффинность связывания с рецептором Fcy по результатам SPR.

Аффинность связывания антитела с FcyR определяли с использованием Biacore T200 (или Biacore 8K). Каждый рецептор фиксировали на сенсорном чипе СМ5 с иммобилизованным антителом против His (GE). Антитела в разных концентрациях впрыскивали на сенсорный чип при скорости потока 30 мкл/мин в течение фазы ассоциации 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с. Затем чип регенерировали с помощью 10 мМ глицина (рН 1,5) после каждого цикла связывания.

Из тестовых сенсограмм вычитали сенсограммы для контрольной поверхности и канала буфера. Данные эксперимента аппроксимировали с помощью модели 1:1 с использованием анализа по Ленгмюру (в случае FcyRI) или равновесной модели (в случае других рецепторов). Для вычисления молярной концентрации антител использовали молекулярную массу 150 кДа.

Связывание с C1q по результатам ELISA.

Планшеты для ELISA (Nunc) покрывали образцами антител в концентрации 3 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После блокирования и промывки C1q серийно разводили, начиная с 600 мкг/мл, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты промывали и инкубировали с HRPконъюгированным антителом овцы против C1q человека в течение 1 ч. После промывки добавляли субстрат ТМВ и останавливали реакцию добавлением 2 М HCl. Поглощение при 450 нм регистрировали с использованием спектрофотометр для чтения микропланшетов (Molecular Device).

Аффинность связывания с FcRn по результатам SPR.

Аффинность связывания антитела с FcRn определяли с использованием Biacore T200 (или Biacore 8K). Каждое антитело иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 (GE). FcRn в разных концентрациях в подвижном буфере (50 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 150 мМ NaCl, 0,05% Tween20, pH 6,0) впрыскивали на сенсорный чип при скорости потока 30 мкл/мин в фазу ассоциации в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с. Затем чип регенерировали с помощью 1-кратного PBS (рН 7,4) после каждого цикла связывания.

- 189 045653

Из тестовых сенсограмм вычитали сенсограммы контрольной поверхности и канала буфера. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью равновесной модели. Молекулярную массу 45 КДа использовали для вычисления молярной концентрации FcRn.

Результаты.

Т.к. все упомянутые выше IgG1 являлись IgG1 с мутацией LALA, активность связывания E17Дизайн_2-QQQQ в форме IgG4 и IgG1 дикого типа (T3U4.E17-2.(2).uIgG1 (IgG1 дикого типа с выступами-во-впадины)) с FcyRI, FcYRIIa (H167), FcYRIIa(R167), FcYRIIb, FcYRIIIa (F176), FcYRIIIa (V176) и FcYRIIIb исследовали посредством SPR.

Соответствующие последовательности конструкции T3U4.E17-2.(2).uIgG1 приведены ниже.

T3U4.E17- 2.(2).uIgGl	U4-LC (SEQ ID NO: 371)	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKP GKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC (SEQ ID NO: 372)	QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWV RQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMST STAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCT LPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
T3-LC (SEQ ID NO: 373)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTL TISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPD PAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYIT DKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPE DTFFPSPESS
T3-HC (SEQ ID NO: 374)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVR QAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTL VTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF YPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRY ALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQD RAKPVTQIVSAEAWGRASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
		EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREE MTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK

Аффинности приведены в табл. 35 (IgG4) и 36 (IgG1 дикого типа). Обе молекулы демонстрировали типичную аффинность связывания IgG4 и IgG1 дикого типа человека со всеми рецепторами Fcy.

- 190 045653

Таблица 35

Аффинность IgG4 к Fc-рецептору по результатам SPR

Fc-рецептор	K_D (M)
FcyRI	9,79E-09
FcyRIIa (Hl67)	2,05E-05
FcyRIIa (RI 67)	l,58E-05
Fc/RHb	2Д1Е-05
FcyRnia (Fl76)	2,93E-05
FcyRnia (VI76)	1Д0Е-05
FcyRHIb	>4,10E-05
	Таблица 36
Аффинность IgG1 дикого типа к Fc-рецептору по результатам SPR
Fc-рецептор	K_D (M)
Fey RI	1Д0Е-09
FcyRIIa (Hl67)	3,58E-06
FcyRIIa (RI 67)	4,83E-06
FcyRIIb	8,07E-06
FcyRHIa (Fl76)	2,08E-06
FcyRHIa (VI76)	6,44E-07
FcyRHIb	5,16E-06

Активность связывания антител с C1Q тестировали посредством ELISA (фиг. 21А-21В). E17Дизайн_2-QQQQ в форме IgG4 не проявлял сигнал связывания при ELISA (фиг. 21А), в то время как E17-Дизайн_2-QQQQ в форме IgG1 дикого типа и контрольное антитело IgG1 человека демонстрировали нормальный сигнал связывания (фиг. 21В).

Пример 15. Симметричные форматы G19, G19R, G25, G25R.

В случае мишеней терапевтических средств на основе антител, подобных CD3xCD19, биспецифическое антитело с моновалентным связыванием CD3 будет благоприятным по причинам, связанным с безопасностью. Учитывая это, конструировали и успешно получали асимметричные биспецифические форматы Е17 и F16 посредством встраивания Fab WuXiBody, а также способов с использованием выступов-во-впадины. Однако, в случае некоторых мишеней биспецифических антител, подобных CTLA4xPD-1, благоприятным для достижения желаемых синергических эффектов будет симметричный формат, в котором могут собираться два разных антитела при сохранении их исходных валентностей (т.е. в целом, тетравалентный). Коровая единица WuXiBody представляет собой химерный Fab, который легко можно включать в ассиметричные и симметричные форматы для обеспечения правильного спаривания когнатных легких и тяжелых цепей. Конструировали четыре симметричных формата на основе WuXiBody, названные G19, G19R, G25 и G25R.

На фиг. 22 показана схема четырех симметричных форматов. В G19 и G25 два химерных Fab WuXiBody пересаживали на С-конец и N-конец нормального антитела, соответственно. Различием между G19 и G19R или между G25 и G25R является обратная локализация нормального и химерного Fab в каждом отдельном формате. Тяжелые части двух Fab, а также Fc IgG встраивали в одну цепь, в то время как легкие цепи могли свободно сворачиваться и независимо собираться. Когда с помощью трех векторов котрансфицировали клетки-хозяева, ожидали, что при экспрессии будет происходить связывание между тяжелыми цепями, подобно нормальным антителам, в то время как каждая легкая цепь будет самостоятельно собираться с собственным когнатным партнером на тяжелой цепи.

Конструировали биспецифические антитела против CTLA-4xPD-1 в симметричном формате WuXiBody. Для включения в новые форматы использовали новое антитело против PD-1 W30551.153.7 (названное U6) и коммерческое антитело против CTLA-4 ипилимумаб (названное Т1). Для обеспечения устранения эффекта ADCC и CDC в отношении молекулы выбирали изотип IgG4. Т.к. U6 и Т1 можно располагать в верхней или нижней части формата (обозначены как U6T1 и T1U6, соответственно), для исследования обоих вариантов сначала использовали единый формат G19.

Соответствующие последовательности тестируемого WuXiBody приведены ниже.

- 191 045653

Образцы	SEQ ID NO плазмид Ы	Последовательности
T1U6.G19.I gG4	Tl-LC (SEQ ID NO: 375)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
	T1-U6- HC (SEQ ID NO: 376)	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQA PGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVC LATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQD SRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQ DRAKPVTQIVSAEAWGR
U6-LC (SEQ ID NO: 377)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6T1.G19.I gG4	U6-LC (SEQ ID NO: 378)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS
U6-T1- HC (SEQ ID NO: 379)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK

- 192 045653

		DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG FTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVC LATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQD SRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQ DRAKPVTQIVSAEAWGR
Tl-LC (SEQ ID NO: 380)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKS SDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6T1.G19 R.IgG4	U6-LC (SEQ ID NO: 381)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-T1- HC (SEQ ID NO: 382)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWV

- 193 045653

		RQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRV
Tl-LC (SEQ ID NO: 383)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
U6T1.G25.I gG4	U6-LC (SEQ ID NO: 384)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-T1- HC (SEQ ID NO: 385)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF TFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK

- 194 045653

	Tl-LC (SEQ ID NO: 386)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
U6T1.G25 R.IgG4	U6-LC (SEQ ID NO: 387)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS
U6-T1- HC (SEQ ID NO: 388)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSL RLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART GWLGPFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISH TQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK
Tl-LC (SEQ ID NO: 389)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKS SDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS

- 195 045653

U6T4.G26.I gG4	U6-LC (SEQ ID NO: 390)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-HC- T4-LC (SEQ ID NO: 391)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRGGGGS GGGGSDIVMTQTPLS LS VTPGQPASISCRS S QSL LNSDGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLGSGVPNRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHDPWTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
T4-HC (SEQ ID NO: 392)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPP GKGMEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLS SVTAADTAVYYCASMMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U6T5.G19.I gG4	U6-LC (SEQ ID NO: 393)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS

- 196 045653

	U6-T5нс (SEQ ID NO: 394)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG YTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKF KKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNY GFAYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP ALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSEND EWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
T5-LC (SEQ ID NO: 395)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQ SPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAA TYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6T5.G19 R.IgG4	U6-LC (SEQ ID NO: 396)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-T5- HC (SEQ ID NO: 397)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

- 197 045653

		CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNW VRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRV
T5-LC (SEQ ID NO: 398)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQ SPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAA TYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
U6T5.G25.I gG4	U6-LC (SEQ ID NO: 399)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-T5- HC (SEQ ID NO: 400)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG YTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKF KKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAMDNY GFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED

- 198 045653

		PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK
T5-LC (SEQ ID NO: 401)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQ SPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAA TYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
U6T5.G25 R.IgG4	U6-LC (SEQ ID NO: 402)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQQKPG QAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTISRAQAGDE ADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEE LQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKT VAPTECS
U6-T5- HC (SEQ ID NO: 403)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGR ADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RAMDNYGFAYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAE ISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDP QPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEF LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK

- 199 045653

	T5-LC (SEQ ID NO: 404)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQ SPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAA TYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDF KSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T4U6.G27.I gG4	T4-HC- U6-LC (SEQ ID NO: 405)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPP GKGMEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLS SVTAADTAVYYCASMMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSSYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNI GNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGN TATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQ NPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYI TDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPE DTFFPSPESS
U6-HC (SEQ ID NO: 406)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGR
T4-LC (SEQ ID NO: 407)	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLNSDGNTYLYWYL QKPGQSPQLLIYLVSKLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCVQGTHDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC

- 200 045653

T4U6.G26 R.IgG4	Т4-НС- U6-LC (SEQ ID NO: 408)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPP GKGMEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLS SVTAADTAVYYCASMMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSSYELTQPLSVSVALGQTARI TCGGDNIGNKDVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGF SGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTK LTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQS KDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANA FQNSIIPEDTFFPSPESS
U6-HC (SEQ ID NO: 409)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDYWGQGTLVTVLEDL KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSW WVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
T4-LC (SEQ ID NO: 410)	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLNSDGNTYLYWYL QKPGQSPQLLIYLVSKLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCVQGTHDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC

Обе конструкции, U6T1 и T1U6, нормально экспрессировались в системе Expi293, и экспрессируемый белок достигал чистоты приблизительно 90% после одностадийной очистки посредством хроматографии с протеином А. На фиг. 23А-23В показана характеризация очищенных белков посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC-ВЭЖХ. Затем, для исследования их связывающей способности, осуществляли клеточные анализы связывания с мишенями PD-1 и CTLA-4. На фиг. 24А-24В показано, что U6 и Т1 проявляли сниженное связывание, если они находились в нижней части формата. Учитывая, что функция PD-1 имеет относительно большую важность, чем CTLA-4 (известно, что антитела против CTLA-4 имеют более тяжелые побочные эффекты), PD-1-связывающую часть располагают наверху для максимизации связывания U6 (т.е. в виде U6T1, а не T1U6) и для тестирования того, как оптимизировать связывание CTLA-4, связывающая часть для которого расположена внизу.

Дополнительно исследовали другие три формата WuXiBody G19R, G25 и G25R (показаны на фигуре 22). Кроме того, получали демонстрационное антитело AK-104 (Akeso Biopharma, Inc), являющееся биспецифическим антителом против PD-1/CTLA-4, используемым в клиническом испытании, и использовали его в качестве контроля для прямого сравнения.

Из-за важности функции PD-1, U6 оставляли в верхней части всех форматов для максимизации связывания PD-1, в то время как Т1 оставляли в нижней части для реализации приемлемого связывания CTLA-4. Все сконструированные молекулы хорошо экспрессировались в Expi293 и легко достигали чистоты >90% после одностадийной очистки посредством хроматографии с протеином А. На фиг. 25А-25В показано, что очищенные белки охарактеризовывали посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, а также SEC-ВЭЖХ.

Затем осуществляли клеточные анализы связывания с PD-1 и CTLA-4 для проверки связывающей способности всех новых сконструированных молекул. На фиг. 26А-26В показано сравнение кривых связывания полученных конструкций и демонстрационного антитела. Данные свидетельствуют о том, что все белки имели связывание с PD-1, схожее с демонстрационным антителом. Кроме того, связывание CTLA-4 значительно улучшалось в случае форматов G25 и G25R и достигало уровня, сравнимого с демонстрационным антителом (<2 раза). Однако формат G19R все равно плохо работал. Вероятно, G19 и G19R имеют общий недостаток, состоящий в том, что они предотвращают эффективное связывание Т1.

Функции молекул дополнительно охарактеризовывали, исследуя их конкурентные свойства в отношении каждого лиганда двух мишеней, PD-L1 и CD80. На фиг. 27А-27В показано, что эти молекулы имеют свойства, сравнимые с демонстрационным антителом, в отношении конкуренции с PD-L1. Что

- 201 045653 касается CTLA-4-связывающей части, формат G25R проявлял свойства, схожие с демонстрационным антителом, в отношении конкуренции с CD80. Другие два формата имели относительно более низкие результаты. Различие между G25 и G25R состоит в локализации константной области TCR. Повидимому, преобразование Т1 в формат WuXiBody способствует активности Т1, хотя Т1 все еще располагали ниже U6. Это является хорошим примером того, что функциональные части можно подвергать эффективному скринингу посредством сканирования ограниченного количества форматов, полученных из WuXiBody.

Таким образом, получали функциональное биспецифическое антитело против PD-1/CTLA-4, схожее с демонстрационным антителом. Форматы WuXiBody являются универсальными, т.е. в эти форматы можно адаптировать любые новые антитела, и они будут выполнять свои функции. Если доступно хорошее родительское антитело, его можно использовать для получения молекулы, превосходящей демонстрационное антитело.

Для подтверждения этой концепции, разрабатывали другое антитело против CTLA-4 W3162_1.154.8-z35 (названное Т5), имеющее гораздо более высокую аффинность, чем ипилимумаб, и воплощали его во всех четырех форматах G19, G19R, G25 и G25R, приведенных на фиг. 22. И снова, все новые конструкции хорошо экспрессировались в клетках Expi293, и их легко очищали посредством одностадийной хроматографии с протеином А. Чистота белков показана на фиг. 28А-28В.

Определяли и сравнивали связывание всех молекул U6T5, идентифицированной ранее молекулы U6T1.G25R, а также демонстрационного антитела. Результаты показаны на фиг. 29А-29В. PD-1связывающая часть сохраняла исходные связывающие свойства, наблюдаемые ранее, т.к. никакие из антител против PD-1 не заменяли в каком-либо из форматов. Однако, что касается CTLA-4-связывающей части, все конструкции U6T5 (даже форматы G19 и G19R) демонстрировали связывание, очевидно превосходящее U6T1.G25R, а также демонстрационную молекулу. U6T5.G25 являлось наиболее активным среди всех новых белков, имеющим улучшенную в 1,6 раза ЕС₅₀ и в >3 раз улучшенные значения для верхней части по сравнению с демонстрационным антителом. Эту молекулу дополнительно охарактеризовывали посредством анализа двойного связывания ELISA и конкурентных анализов FACS. На фиг. 30 показано эффективное двойное связывание молекул с двумя мишенями одновременно. Данные, приведенные на фиг. 31А-31В, подтверждают, что U6T5.G25 имело значимо улучшенную способность к конкуренции с CD80 за CTLA-4. Это доказывает, что форматы WuXiBody являются в достаточной степени гибкими для включения разных родительских антител. Верхняя часть родительского антитела может быть достаточно консервативной и продуманной, когда молекулу включают в форматы WuXiBody.

Охарактеризовывали термостабильность молекул, охватывающих все четыре симметричных формата. Большинство молекул демонстрировали температуру плавления приблизительно 60°С (как показано в табл. 37), что соответствует асимметричному формату, описанному выше.

Таблица 37

Температуры плавления соответствующих антител в форматах WuXiBodv

Название белка	Изотип	pi	Буфе Р	Концен трация (мг/мл)	T_hi (°C )	T_h2 (°C )
TlU6.G19.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,92	PBS	1,3	60,8	69,9
U6Tl.G19.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,92	PBS	0,9	59,1	72,8
U6Tl.G25R.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	6,06	PBS	1,385	60,8	73,9
U6T5.G19.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,93	PBS	0,6	56,2	74,1
U6T5.G19R.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,87	PBS	1,2	63,4	-
U6T5.G25.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,93	PBS	0,7	63,4	-
U6T5.G25R.uIgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,99	PBS	0,5	57,2	74,1

Пример 16. Химерный Fab с переставленными легкими и тяжелыми цепями.

Успешно конструировали всего 111 потенциальных форматов на основе WuXiBody. Помимо Е17, F16, G19, G19R, G25 и G25R, описанных выше, также конструировали несколько форматов TCRхимерного Fab с переставленными легкими и тяжелыми цепями. Их обозначали как G26, G26R и G27, как показано на фиг. 32. В этом случае использовали пару антител U6 и Т4, где Т4 представляло собой антитело против CTLA-4 WBP3162-1.146.19-z12. Пару T4U6 разрабатывали в формате G27 и G26R. На фиг. 33А-33В показан очищенный белок, охарактеризованный посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC-ВЭЖХ. Хотя экспрессировали оба белка, T4U6.G27.IgG4 имел низкую чистоту, а T4U6.G26R.IgG4 имел правильную молекулярную массу и высокую чистоту. Связывающую способность последней из молекул охарактеризовывали посредством FACS. На фиг. 34А-34В показано, что это влияло на связывание PD-1, т.к. за него отвечает нижняя часть, в то время как CTLA-связывающая часть демонстрировала полное восстановление, т.к. она расположена наверху формата.

Пару U6T4 исследовали в формате G26. Успешно осуществляли стадии экспрессии и очистки, как

- 202 045653 показано на фиг. 35А-35В. Осуществляли анализы связывания посредством ELISA и FACS, данные которых приведены на фиг. 36A-36D. Эти данные подтверждают, что химерный Fab с переставленными легкими и тяжелыми цепями все равно хорошо работает. Температура плавления этой молекулы составляет приблизительно 63,4, как показано в табл. 38.

Таблица 38

Температура плавления U6T4.G26.IgG4

Название белка	Изотип	pl	Буфер	Концентраци я (мг/мл)	T_hl (°C)	T_h2 (°C)
U6T4.G26.IgG4	IgG4, каппа, лямбда	5,93	PBS	0,8	63,4	-

Пример 17. Биспецифическое WuXiBody против CD13xCD19. Предпосылки. Биология мишени.

CD19 человека представляет собой трансмембранный белок типа I, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов (Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 2004, 7:4-32). Он экспрессируется на большинстве В-клеток, но его не определяют на плазматических клетках, стволовых клетках или нормальных клетках миелоидного ростка (Tedder, Nat Rev Rheumatol, 2009, 5(10):572-577). CD19 участвует в установлении пороговых значений характерной передачи сигнала В-клеток посредством модуляции зависящей и независящей от В-клеточного рецептора (BCR) передачи сигнала (Wang et al., Experimental Hematology & Oncology, 2012, 1:36). CD19 экспрессируется более обширно, чем CD20. Профиль экспрессии CD19 сохраняется в В-клеточных злокачественных новообразованиях, охватывая все подтипы В-клеточной лимфомы от вялотекущих до агрессивных форм, а также хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз и острый не-Т-клеточный лимфобластный лейкоз, и делая возможным таргетинг опухолей ранних Вклеток, таких как острый лимфобластный лейкоз (ALL), на которые нельзя воздействовать ритуксимабом. Исследовано несколько моноклональных антител против CD19 для терапии лимфомы (публикация патентной заявки США № 20140072587 А1, патент США № 8242252В2 и патент США № 8097703В2).

Т-клеточный корецептор CD3 представляет собой белковый комплекс, состоящий из четырех отдельных цепей, гамма-цепи CD3, дельта-цепи CD3 и двух эпсилон-цепей CD3. Четыре цепи связываются с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR), и дзета-цепью для генерирования сигнала активации в Т-лимфоцитах. TCR, дзета-цепь и молекулы CD3 составляют комплекс TCR, в котором TCR как субъединица распознает антиген и связывается с ним, и CD3 как субъединица передает сигнал антигенной стимуляции в путь передачи сигнала и, в конечном итоге, регулирует активность Т-клетки. Белок CD3 присутствует, по существу, во всех Т-клетках. Комплекс CD3-TCR модулирует функции Т-клеток во врожденном и адоптивном иммунном ответе, а также клеточные и гуморальные иммунные функции. Они включают элиминацию патогенных организмов и контроль роста опухоли с помощью широкого диапазона цитотоксических эффектов. Моноклональные антитела мыши против CD3 человека, такие как OKT3 (Kung et al., Science, 1979, 206: 347-9), представляли собой антитела против CD3 первого поколения, разработанные для лечения. Хотя OKT3 имеет сильную иммуносупрессорную активность, его клиническому использованию препятствуют серьезные побочные эффекты, связанные с иммуногенными и митогенными потенциалами (Chatenoud, Nature Reviews, 2003, 3:123-132). OKT3 индуцировало антиглобулиновый ответ, способствуя своему собственному клиренсу и нейтрализации (Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 1982, 137:830-8). Кроме того, OKT3 индуцировало пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов in vitro и приводило к крупномасштабному высвобождению цитокинов in vivo (Hirsch et al., J. Immunol, 1989, 142: 737-43). Такие серьезные побочные эффекты ограничивали более широкое использование OKT3 при трансплантации, а также расширение его использования в других клинических областях, например, в отношении аутоиммунности (см. там же).

Биспецифическое антитело против CD3 и CD19 может одновременно связываться с Т-клетками и В-клетками. После связывания биспецифического антитела с CD3-положительной Т-клеткой и CD19положительной В-клеткой образуется цитолитический синапс. Затем цитотоксичность индуцируется посредством высвобождения перфорина и гранзимов из гранул в цитотоксической Т-клетке, что индуцирует апоптоз и лизис злокачественной В-клетки.

Подтверждено, что активность блинатумомаба не зависит от презентации антигена МНС класса I и распознавания TCR. Таким образом, он может преодолевать различные опухолевые механизмы ускользания от иммунного надзора, такие как нарушение механизма презентации антигена и активация отрицательных костимуляторных сигналов в микроокружении опухоли.

Нереализованные медицинские потребности.

Лечение острого лимф областного лейкоза (ALL) у взрослых остается затруднительным, и необходимы новые способы терапии. В случае существующих способов терапии частота ответа находится в диапазоне от 30 до 50% в зависимости от длительности исходной ремиссии, возраста и цитогенетики. Общая частота ответа в случае подгруппы неходжкинской лимфомы (NHL) в настоящее время составляет более 90% при схемах лечения, в которых используют первое поколение антител против CD20. Однако некоторые подтипы NHL не отвечают на эти способы терапии, и у большей части пациентов с отве- 203 045653 чающей NHL в конечном итоге развивается рецидив после стандартной комбинированной схемы лечения с использованием иммунотерапии/химиотерапии. Таким образом, для этих неудовлетворенных потребностей необходимы новые способы терапии первой линии и новые схемы терапии спасения.

Материалы и способы.

Получение CD19-экспрессирующей линии клеток яванского макака.

Ген полноразмерного CD19 человека или яванского макака клонировали в вектор pcDNA3.3. Затем с помощью каждого экспрессирующего вектора трансфицировали клетки СНО-Ki соответствующим образом с использованием Lipofectamine 2000. Клетки культивировали в F12-K с 10% FBS. Через 24-48 ч после трансфекции добавляли бластицидин. После 2-3 пассажей для селекции клетки обогащали с помощью РЕ-конъюгированного антитела против CD19 и микрочастиц против РЕ (Miltenyi-013-048-801). Стабильные клоны отдельных клеток выделяли способом предельных разведений и подвергали скринингу посредством FACS с использованием антитела против CD19.

Экспрессирующие мишень линии опухолевых клеток.

Клетки Raji и Jurkat получали из АТСС. Клетки Ramos получали из ЕСАСС. Все опухолевые клетки культивировали в RPMI 1640/10% FBS.

Конструирование WuXiBodyW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP и W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP.

Гены VL, VH, Ck, CH1 амплифицировали посредством ПЦР с использованием матриц ДНК собственного производства. Гены С-альфа и С-бета синтезировали в Genewiz Inc. Гены нативной легкой цепи против CD19 или химерной легкой цепи против CD3 встраивали в линеаризованный вектор, содержащий промотор CMV и сигнальный пептид каппа. Фрагменты ДНК VH-C-бета против CD3 встраивали в линеаризованный вектор, содержащий константную область СН2-СН3 IgG4 человека S228P с мутацией выступа. Фрагменты ДНК VH-CH1 против CD19 встраивали в линеаризованный вектор, содержащий константную область СН2-СН3 IgG4 человека S228P с мутацией впадины. Вектор содержит промотор CMV и сигнальный пептид тяжелой цепи антитела человека.

Экспрессия и очистка W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP и W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP.

С помощью экспрессирующих плазмид для тяжелой цепи и легкой цепи котрансфицировали клетки Expi293 с использованием набора экспрессионной системы Expi293 (Thermo Fisher-A14635) по инструкциям производителя. Через пять дней после трансфекции собирали супернатанты и очищали белок с использованием колонки с протеином A (GE Healthcare-17543802) и дополнительной эксклюзионной колонки (GE Healthcare-17104301). Концентрацию антитела измеряли с помощью Nano Drop. Чистоту белков оценивали посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и ВЭЖХ-SEC.

Связывание мишени по результатам FACS.

Связывание биспецифических антител с CD3- и CD19-экспрессирующими клетками оценивали с использованием клеток Jurkat и Ramos, соответственно. В качестве изотипического контроля использовали неродственное антитело. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (Corning-3799) при плотности 105 клеток/лунку и промывали PBS/1% BSA. Антитела серийно разводили и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 ч. Для детекции использовали РЕ-конъюгированное антитело козы против Fc IgG человека (Jackson-109-115-098). После промывки и ресуспендирования клетки анализировали посредством проточной цитометрии (Canto II, BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Для вычисления значений ЕС₅₀ использовали четырех-параметрический нелинейный регрессионный анализ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Связывание с CD3 яванского макака.

Связывание биспецифического антитела против CD3xCD19 с CD3 яванского макака тестировали посредством анализа связывания белков ELISA. 96-луночные белок-связывающие планшеты для ELISA (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher, Thermo-442404) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл белка эпсилон-цепи CD3 яванского макака (Acro, #CDE-C5226) в карбонат-бикарбонатном буфере (20 мМ Na₂CO₃, 180 мМ NaHCO3, рН 9,2) в течение ночи при 4°С. Все лунки однократно промывали 300 мкл PBS/0,5% Tween20(o6./o6.) на лунку. Затем лунки блокировали 200 мкл PBS/2% BSA (BOVOGEN, #BSAS) на лунку в течение одного часа при комнатной температуре и три раза промывали 300 мкл PBS/0,5% Tween20(o6./o6.) на лунку. Для связывания первичного антитела в соответствующие лунки добавляли биспецифическое антитело против CD3xCD19, серийно разведенное в PBS/2% BSA, и инкубировали при комнатной температуре в течение двух часов. Планшеты три раза промывали, как описано выше, перед добавлением 100 мкл 100 нг/мл вторичного HRP-конъюгированного антитела козы против Fc IgG человека (Bethyl, #А80-304Р). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, затем шесть раз промывали, как описано выше. Для детекции связывания во все лунки добавляли 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) (Sigma-860336) на 10 мин при комнатной температуре в темноте перед остановкой реакции с помощью 100 мкл 2 М HCl. Степень связывания биспецифического антитела с CD3 яванского макака определяли посредством измерения поглощения OD450 с использованием спектрофотометра для чтения микропланшетов SpectraMax® M5e. В соответствующих случаях значения ЕС₅₀ связывания получали с помощью четырех-параметрического нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.

- 204 045653

Связывание с CD19 яванского макака.

Связывание биспецифического антитела против CD3xCD19 с CD19 яванского макака, белком-мишенью, экспрессирующимся на клетках CHOK1, определяли посредством проточной цитометрии. В кратком изложении, гиперэкспрессирующую CD19 яванского макака, стабильную линию клеток (WBP701.CHOK1.cPro1.C9, WuXi Biologics) собирали с помощью трипсина и разводили до 1х10⁶ клеток/мл в 1% BSA/1-кратном PBS. В каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном (Corning, #3799) добавляли 1х10⁵ клеток/лунку (100 мкл) и центрифугировали при 1500 o6./мин.(Eppendorf, #5810R) в течение 5 мин перед удалением супернатанта. Антитела, серийно разведенные в 1% BSA/1-кратном PBS, добавляли в количестве 100 мкл/лунку к осажденным клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. В качестве изотипического контроля использовали неродственное антитело hIgG4. Клетки два раза промывали 180 мкл/лунку 1% BSA/1-кратного PBS посредством центрифугирования при 1500 об./мин.в течение 5 мин при 4°С. Осажденные клетки ресуспендировали в 100 мкл/лунку флуоресцентно меченого антитела против Fc IgG человека (Jackson, #109-115-098), разведенного в соотношении 1:150 в 1% BSA/1-кратного PBS, в течение 30 мин при 4°С в темноте. Затем клетки два раза промывали, как описано выше. После последней промывки клетки ресуспендировали в 80 мкл 1% BSA/1-кратного PBS и измеряли значения флуоресценции с помощью цитометра FACS Canto II (BD Biosciences). Поверхность клетки, связанную с биспецифическим антителом против CD19 и CD3, оценивали посредством измерения средней флуоресценции (MFI). Необработанные данные FACS анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo, для определения фоновой флуоресценции использовали лунки, несодержащие антитело или содержащие только вторичное антитело. Значения ЕС₅₀ связывания получали с помощью четырех-параметрического нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.

Аффинность по результатам FACS.

Аффинность связывания с CD3 и CD19 определяли посредством проточной цитометрии с использованием клеток Jurkat и Ramos, соответственно. Клетки переносили в 96-луночные планшеты с Uобразным дном (BD) при плотности 5х10⁴ клеток/лунку.

Антитела, подлежащие тестированию, серийно разводили в соотношении 1:2 в 1-кратном PBS/1% BSA и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 ч. Затем планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 мин и выбрасывали супернатант. К ресуспендированным клеткам добавляли вторичное антитело, А1еха647-конъюгированное антитело козы против Fc IgG человека (Jackson, кат. № 109-605-098) или FITC-конъюгированное антитело козы против His (Bethyl, кат. № A190-113F), и инкубировали при 4°С в темноте в течение 30 мин. Клетки однократно промывали и ресуспендировали в 100 мкл 1-кратного PBS/1% BSA. Интенсивность флуоресценции измеряли посредством проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo. Интенсивность флуоресценции преобразовывали в связанные молекулы/клетку с использованием частиц для количественного анализа (наборы Quantum™ MESF, Bangs Laboratories). K_D вычисляли с помощью GraphPad Prism 5.

Двойное связывание на клетках-мишенях.

Способность биспецифических антител служить мостиком между CD3+ Т-клетками и CD19+ Вклетками тестировали посредством FACS. Клетки Jurkat и клетки Raji предварительно раздельно метили 20 нМ CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564) и 50 нМ кальцеина-АМ (Invitrogen-C3099) при 37°С в течение 30 мин при плотности 1х10⁶ клеток/мл. Осадки предварительно меченых клеток два раза промывали PBS/1% BSA, затем смешивали в соотношении 1:1 при конечной плотности 1х10⁶ клеток/мл. Смесь клеток центрифугировали и ресуспендировали с 10 нМ антитела, а затем инкубировали в течение 1 ч. Смесь клеток анализировали посредством проточной цитометрии непосредственно после инкубации. Процент образования мостика вычисляли как процент одновременного мечения Far-Red и кальцеином.

Анализ цитотоксичности.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из гепаринизированной венозной крови посредством центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-171440-03). Затем полученные РВМС пропускали через колонки EasySep (Stemcell-19053) для обогащения CD8+ Т-клеток, используемых в качестве эффекторных клеток. Эффективность антител в опосредовании лизиса опухолевых клеток CD8+ Т-клетками определяли посредством проточной цитометрии. В анализе цитотоксичности CD19+ В-клетки Raji в качестве клеток-мишеней предварительно метили 20 нМ CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564) при 37°С в течение 30 мин, а затем клеточные осадки два раза промывали несодержащей фенол RPMI 1640 (Invitrogen-11835030), дополненной 1% FBS. Окрашенные Far Red клетки Raji (20000 клеток на лунку) инкубировали в 96-луночном круглодонном планшете (Corning3799) с выделенными CD8+ Т-клетками (соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени 5:1) и серийно разведенными антителами при 37°С в течение 4 ч. После инкубации тщательно примешивали 3 мкМ йодида пропидия (PL Invitrogen-P3566) для идентификации погибших клеток. Через 15 мин клетки анализировали посредством проточной цитометрии с использованием цитометра FACSCanto II. Abопосредованную цитотоксичность можно определять как процент PI-положительных клеток-мишеней среди Far Red-положительных клеток-мишеней. ЕС5₀ в анализе цитотоксичности определяли с использованием GraphPad Prism.

- 205 045653

Анализ активации Т-клеток.

Секретируемые цитокины ФНОа и ИФНу.

Активацию Т-клетки отражает количество ФНОа и ИФНу, секретируемых в супернатант. Способ выделения CD4- и CD8-положительных Т-клеток описан в разделе Активация Т-клеток (окрашивание внутриклеточных цитокинов ФНОа и ИФНу). Смесь В-клеток человека Raji (2х10⁴ клеток/лунку), CD4+ или CD8+ Т-клеток (1 х 10⁵ клеток/лунку) и антител инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Собирали супернатант, затем центрифугировали реакционную смесь при 1500 об/мин в течение 5 мин. Количество ФНОа и ИФНу в супернатанте определяли с помощью набора для ELISA ФНО человека (R&D-DY210) и набора для ELISA ИФНу человека (захватывающее Ab: Thermo Fisher-M700A, детекторное Ab: Thermo Fisher-M701B, вещество-стандарт: PEROTECH-300-02), соответственно.

Способ ELISA сэндвич-формата представлял собой следующее. 96-луночные белок-связывающие планшеты для ELISA (ThermoFisher-442404) покрывали 50 мкл/лунку захватывающего антитела в карбонат-бикарбонатном буфере (20 мМ Na₂CO₃, 180 мМ NaHCO₃, pH 9,2) по инструкциям производителя в течение ночи при 4°С или комнатной температуре. Все лунки три раза промывали 300 мкл PBS/0,5% Tween-20 (об./об.) на лунку и все последующие стадии промывки в ходе анализа осуществляли тем же образом. Затем лунки блокировали в течение одного часа с использованием PBS/2% BSA (BovoGen Biologicals-BSAS) в случае ФНОа и 100% казеина (Pierce-37528) в случае ИФНу, затем промывали три раза с последующим связыванием собранного супернатант, описанного выше, или вещества-стандарта (50 мкл/лунку) в течение 1 ч при комнатной температуре и тремя промывками. Что касается связывания детекторного антитела, соответствующие антитела, разведенные в PBS/2% BSA в случае ФНОа и 50% казеине в случае ИФНу, добавляли в соответствующие лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение двух часов. Планшеты промывали три раза перед добавлением 50 мкл HRPконъюгированного вторичного антитела SA. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, а затем промывали шесть раз, как описано выше. Для детекции связывания во все лунки добавляли 50 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) (Sigma-860336) на 10 мин перед остановкой реакции с помощью 50 мкл 2 М HCl. Количество ФНОа и ИФНу определяли посредством измерения поглощения OD450 с использованием спектрофотометра для чтения микропланшетов SpectraMax® M5e.

Анализ активации Т-клеток - экспрессия поверхностных маркеров CD25 и CD69.

Активацию Т-клеток отражают сигналы окрашивания на поверхностные рецепторы CD25 и CD69. Способ выделения CD4- и CD8-положительных Т-клеток описан в разделе Активация Т-клеток (окрашивание внутриклеточных цитокинов ФНОа и ИФНу). Смесь В-клеток человека Raji (2х10⁴ клеток/лунку), CD4+ или CD8+ Т-клеток (1х10⁵ клеток/лунку) и антитела инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После однократной промывки 1% BSA клеточные осадки ресуспендировали с буфером для окрашивания, содержащим FITC-конъюгированное антитело мыши против CD4 человека (BD-550628) или PerCpCy5.5-конъюгированное антитело мыши против CD8 человека (BD-560662), РЕ-конъюгированное антитело мыши против CD69 человека (BD-560968) и АРС-конъюгированное антитело мыши против CD25 человека (BD-555434), с последующей инкубацией в течение 30 мин при 4°С. После двукратной промывки клеток процент РЕ- и АРС-положительных клеток среди FITC- или PerCpCy5.5положительных клеток определяли посредством проточной цитометрии.

Термостабильность (DSF).

Температуру плавления (T_m) антител исследовали с использованием системы для ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 7 Flex (Applied Biosystems). 19 мкл раствора антитела смешивали с 1 мкл 62,5-кратного раствора SYPRO Orange (Invitrogen) и переносили в 96-луночный планшет (Biosystems). Планшет нагревали с 26°С до 95°С со скоростью 0,9°С/мин и собирали получаемые данные о флуоресценции. Вычисляли отрицательные производные изменений флуоресценции в отношении разных температур и определяли максимальное значение как температуру плавления Tm. Если белок имеет множество конформационных переходов с разворачиванием, регистрировали первые две Tm, обозначаемые как Tm1 и Tm2. Сбор данных и вычисление Tm осуществляли автоматически с помощью операционного программного обеспечения.

Стабильность в сыворотке.

Кровь человека получали из выбранных доноров и собирали в полистироловые пробирки без антикоагулянта. После отстаивания в течение 30 мин при комнатной температуре кровь человека центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин для сбора слоя сыворотки. Стадию центрифугирования повторяли до достижения прозрачности сыворотки. Антитела смешивали с собранной сывороткой в соотношении 1:9, и отбирали аликвоты при 37°С в указанные моменты времени: 0 дней, 1 день, 4 дня, 7 дней и 14 дней. Образцы быстро замораживали в разные моменты времени в жидком азоте и хранили при 80°С до использования. Образцы анализировали посредством FACS для оценки связывающей способности в отношении CD3+ Т-клеток Jurkat и CD19+ В-клеток Ramos посредством сравнения со связывающей способностью соответствующих антител без обработки сывороткой.

- 206 045653

Аффинность связывания антитела с FcyR определяли с использованием Biacore T200 (или Biacore 8K). Каждый рецептор захватывали с помощью антитела против His, иммобилизованного на сенсорном чипе СМ5 (GE). Антитела в разных концентрациях впрыскивали на сенсорный чип при скорости потока 30 мкл/мин в фазу ассоциации в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с. Затем чип регенерировали с помощью 10 мМ глицина (рН 1,5) после каждого цикла связывания.

Из тестовых сенсограмм вычитали сенсограммы контрольной поверхности и канала буфера. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью модели 1:1 с использованием анализа по Ленгмюру (в случае FcyRI) или равновесной модели (в случае других рецепторов). Молекулярную массу 150 кДа использовали для вычисления молярной концентрации антител.

Связывание C1q по результатам ELISA.

Планшеты для ELISA (Nunc) покрывали образцами антител в количестве 3 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После блокирования и промывки C1q серийно разводили, начиная с 600 мкг/мл, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты промывали и инкубировали с HRPконъюгированным Ab овцы против C1q человека в течение 1 ч. После промывки добавляли субстрат ТМВ и взаимодействие останавливали с помощью 2 М HCl. Поглощение при 450 нм определяли с использованием спектрофотометра для чтения микропланшетов (Molecular Device).

Антитело аффинность связывания с FcRn определяли с использованием Biacore T200 (или Biacore 8K). Каждое антитело иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 (GE). FcRn в разных концентрациях в подвижном буфере (50 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 150 мМ NaCl, 0,05% Tween20, pH 6,0) впрыскивали на сенсорный чип при скорости потока 30 мкл/мин в фазу ассоциации в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с. Затем чип регенерировали с помощью 1-кратного PBS (рН 7,4) после каждого цикла связывания.

Исследование эффективности в модели Raji/PBMC мыши.

Опухолевые клетки Raji (ATCC® CCL-86™) поддерживали in vitro в виде монослойной культуры в среде RPMI-1640, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в воздухе. Опухолевые клетки субкультивировали общепринятым образом дважды в неделю. Собирали клетки в фазе экспоненциального роста и подсчитывали для инокуляции опухоли.

РВМС человека выделяли из гепаринизированной цельной крови с использованием Ficoll-Paque Plus по инструкциям производителя.

Каждой мыши подкожно в правый бок совместно инокулировали опухолевые клетки Raji, смешанные с Matrigel, и свежие РВМС в 0,2 мл PBS в день 0. Антитела инъецировали со дня 3 (i.v. BIW х 4 раза).

Тестируемые препараты

Соединения	Упаков ка	Препарат	Концентр ация мг/мл
Изотипический контроль	9,38 мг/мл	0,031 мл раствора+1,908 мл PBS	1,5
W3438-T3U4.E17-l.uIgG4.SP	2,6 мг/мл	В: 0,138 мл раствора+2,254 мл PBS	1,5
W3438-T3U4.E17-l.uIgG4.SP	В1: 0,450 мл В+1,800 мл PBS	0,3
W3438-T3U4.E17-l.uIgG4.SP	В2: 0,450 мл В 1+1,800 мл PBS	0,06

Измерения опухоли и конечные точки.

Основной конечной точкой являлась проверка того, можно ли замедлить рост опухоли или можно ли вылечить мышей. Размер опухоли измеряли дважды в неделю в двух измерениях с использованием калипера и выражали объем в мм по формуле: V=0,5axb², где а и b представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Значение Т/С (в процентах) является показателем противоопухолевой эффективности.

TGI для каждой группы вычисляли по формуле: TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100; Ti представляет собой средний объем опухоли в группе лечения в указанный день, Т0 представляет собой средний объем опухоли в группе лечения в день начала лечения, Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе, которой вводили носитель, в тот же день, что и Ti, и V0 представляет собой средний объем опухоли в группе, которой вводили носитель, в день начала лечения.

- 207 045653

PK, токсичность и иммуногенность у яванского макака.

Одному самцу и одной самке яванского макака вводили WBP3438 в количестве 1 мг/кг однократно посредством внутривенного болюсного введения. Составы составляли в 20 мМ NaAc-HAc, 7,0% (мас./мас.) сахарозы, 0,02% (мас./об.) PS80, рН 5,0. Образцы крови для анализа PK собирали перед введением дозы (день -1), через 0,25 ч, 0,5 ч, 1 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч, в день 3, день 7, день 14, день 21 и день 28. Образцы для анализа антитела против лекарственного средства (ADA) собирали через 3 дня, 14 дней (312 ч) и 28 дней (480 ч).

Концентрации WBP3438 и ADA в образцах сыворотки определяли посредством ELISA. Концентрацию WBP3438 в сыворотке обезьян подвергали некомпартментному фармакокинетическому анализе с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin (версии 6.3, Pharsight, Mountain View, CA). При получении параметров PK использовали линейное/логарифмическое правило трапеций.

Осуществляли наблюдения у клетки в отношении общего здоровья и внешнего вида, в особенности, раздражения кожи. Анализ образцов цельной крови на гематологические параметры (СВС) и биохимический анализ сыворотки осуществляли с помощью гематологического анализатора (ADVIA2120) и химического анализатора (HITACHI 7180), соответственно.

Результаты.

Получение линии клеток, экспрессирующей CD19 яванского макака.

Экспрессию в линии клеток, экспрессирующей CD19 яванского макака, WBP701.CHOK1.cpro1.FL.C9 определяли с использованием антитела против CD19 посредством проточной цитометрии. WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 демонстрировала высокую экспрессию CD19 яванского макака (фиг. 37).

Получение и оптимизация WuXiBody.

На фиг. 1 показана схема исследуемых антител и форматов. Разрабатывали антитело против CD3 Т3 и антитело против CD19 U4. Константную область (CL и СН1) Т3 заменяли константным доменом TCR для конструирования уникальной области контакта легких и тяжелых цепей, являющейся ортогональной относительно обычного антитела. TCR-модифицированное Т3 и нативное U4 в комбинации с мутациями выступы-во-впадины в домене Fc использовали для конструирования формата биспецифического антитела Е17 и F16.

Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи связывающих функциональных фрагментов против CD3 и против CD19 из W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP и W3438-T3U4.F161.uIgG4.SP приведены ниже.

W3438- T3U4.E17- l.uIgG4.SP HW3438- T3U4.F16- EuIgG4.SP	VH антитела против CD3	Последовательн ость ДНК (SEQ ID NO: 353)	CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCA GAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTC AAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTC GCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGG TGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGG AGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAA TGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTT CAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGA CAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGA GCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACAC TGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGG TACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGG CCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTC С
Аминокислотна я последовательн ость (SEQ Ш	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFA FTDYYIHWVROAPGOGLEWMGWISPGN VNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMEL S SLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQ

- 208 045653

		NO: 352)	GTLVTVSS
VL антитела против CD3	Последовательн ость ДНК (SEQ IDNO: 355)	GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACT CCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAG CAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAA GCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGA ATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCC CGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTAC TGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTG CCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCG GGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTC ACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTA CTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGC ACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAG ATTAAG
Аминокислотна я последовательн ость (SEQ Ш NO: 354)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSL LNSRTRKNYLAWYOQKPGOPPKLLIYWA STRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE DVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
VH антитела против CD19	Последовательн ость ДНК (SEQ IDNO: 368)	CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCT GAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTC AAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTAC GCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGG TGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGG AGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAA CGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTT AAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGAT ATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGC TGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACA GCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCT ATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCAC ACTTGTGACTGTGAGCAGT
Аминокислотна я последовательн	QMQLVQSGPEVI<I<PGTSVI<VSCI<ASGYA FTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYN ADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMEL
		ость (SEQ Ш NO: 367)	S SLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGOGTL VTVSS
VL антитела против CD19	Последовательн ость ДНК (SEQ Ш NO: 370)	GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTT TCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGT GACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACC GTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGA AGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGA TCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGG AGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGG CTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATT AGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCC ACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCT ACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAA AGCTGGAGATTAAG
Аминокислотна я последовательн ость (SEQ Ш NO: 369)	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVN YMHWYOQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVP SRF SGSGSGTEFTLTIS SLQPEDFAT YYCH QWSSYPYTFGOGTKLEIK

- 209 045653

Последовательности полноразмерных W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP и W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP приведены ниже.

Антитело	Цепь	Последовательности
W3438- T3U4.E17- LuIgG4.SP	T3-LC (SEQ ID NO: 12)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAW YQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVY QLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVL DMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSP ESS
тз-нс (SEQ ID NO: 25)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQ APGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTST AYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELS WWVNGKEVHS GVCTDPQPLKEQPALQD SRYALS SR LRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM
		ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC (SEQ ID NO: 23)	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPG KAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFA TYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
U4-HC (SEQ ID NO: 26)	QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVR QARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTST AYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQ S SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKT YTC NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK
Антитело	Цепь	Последовательности
W3438- T3U4.F16- LuIgG4.SP	T3-LC (SEQ ID NO: 12)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAW YQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVY QLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVL DMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSP ESS
T3-HC (SEQ ID NO: 25)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQ APGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTST AYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELS WWVNGKEVHS GVCTDPQPLKEQPALQD SRYALS SR

- 210 045653

		LRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC (SEQ ID NO: 23)	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPG KAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFA TYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
U4-HC (SEQ ID NO: 27)	QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVR QARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTST AYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQ S SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKT YTC NVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKK PGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYID PYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCLTTAYAMD YWGQGTLVT VS S ASTKGP S VFPL APC SR STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Получение W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP.

Титр экспрессирующегося антитела W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP составляет более 90 мг/л при транзиторной экспрессии. После двухстадийной очистки чистота W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP достигает 97,5% (SEC-ВЭЖХ, фиг. 39). W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP мигрирует с кажущейся молекулярной массой 75 кДа, 55кДа и 25 кДа при электрофорезе в ПААГ в присутствии SDS в восстановительных условиях, что соответствует двум тяжелым цепям и двум легким цепям. Две легкие цепи могут перекрываться из-за схожих молекулярных масс. Антитело мигрирует с кажущейся молекулярной массой 200 кДа в невосстановительных условиях, что соответствует интактной биспецифической молекуле (фиг. 38).

Получение W3438-T3U4.E 17-1 .uIgG4.SP.

Титр экспрессирующегося антитела W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP составляет более 100 мг/л при транзиторной экспрессии. После двухстадийной очистки чистота W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP достигает 95% (SEC-ВЭЖХ, фиг. 41). W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP мигрирует с кажущейся молекулярной массой 54 кДа, 56 кДа и 25 кДа при электрофорезе в ПААГ в присутствии SDS в восстановительных условиях, что соответствует двум тяжелым цепям и двум легким цепям. Две легкие цепи могут перекрываться из-за схожих молекулярных масс. Антитело мигрирует с кажущейся молекулярной массой 150 кДа в невосстановительных условиях, что соответствует интактной биспецифической молекуле (фиг. 40).

Связывание мишени.

Связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD19 и CD3 тестировали на клетках Ramos и Jurkat посредством проточной цитометрии (фиг. 42А-42В). Антитело W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP демонстрировало высокую активность связывания с Ramos и Jurkat клетки со значениями ЕС₅₀ 15,6 нМ и 47 нМ, соответственно.

Связывание W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP с CD19 и CD3 тестировали на клетках Ramos и Jurkat посредством проточной цитометрии (фиг. 43А-43В). Антитело W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP демонстрировало высокую активность связывания с клетками Ramos и Jurkat со значениями ЕС₅₀ 1,8 нМ и 19,3 нМ, соответственно.

Межвидовое связывание.

Связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD19 яванского макака тестировали на клетках WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 (CD19-экспрессирующих клетках) посредством проточной цитометрии (фиг. 44). ЕС₅₀ связывания составляла 26 нМ. Связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD3 яванского

- 211 045653 макака тестировали с использованием W331-cynoPro1.ECD.His (белка эпсилон-цепи CD3 яванского макака) посредством ELISA (фиг. 45). ЕС50 связывания составляла 0,04 нМ.

Аффинность к клеткам-мишеням.

Аффинность связывания W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD19 и CD3 человека тестировали на клетках Ramos и Jurkat посредством проточной цитометрии. Графики связанного IgG/свободного IgG относительно связанного IgG показаны 46А и 46В. Аппроксимированные значения K_D связывания с CD19 и CD3 составляли 23 нМ и 9,0 нМ, соответственно.

Двойное связывание на клетках-мишенях.

Активность W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в качестве мостика между CD3+ Т-клетками и CD19+ Вклетками тестировали с использованием предварительно меченых клеток Jurkat и Raji посредством проточной цитометрии (фиг. 47А-47В). Q2 соответствует популяции соединенных мостиком клеток Jurkat и Raji. По сравнению с отрицательным контролем, приблизительно 18% клеток были соединены мостиком посредством биспецифического антитела W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP.

Анализ цитотоксичности.

Цитотоксическую активность W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP оценивали с использованием CD8+ Тклеток и клеток Raji. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP индуцировало быстрый и эффективный лизис клеток после инкубации в течение 4 ч (фиг. 48А) со значением ЕС₅₀ 15 нМ. Максимальный процент лизиса клеток составлял 90%.

Цитотоксическую активность W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP оценивали с использованием CD8+ Тклеток и клеток Raji. W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP индуцировало быстрый и эффективный лизис клеток после инкубации в течение 4 ч (фиг. 48В) со значением ЕС₅₀ 3,2 нМ. Максимальный процент лизиса клеток составлял 90%.

Мишене-специфическая активация Т-клеток.

W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP исследовали с помощью анализов, в которых активацию Т-клеток определяли с помощью маркеров активации CD69 и CD25 в присутствии или отсутствие CD19+ клетокмишеней. Результаты свидетельствуют о том, что W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP индуцирует экспрессию маркеров активации Т-клеток CD25 и CD69 дозозависимым образом только в присутствии CD19+ клетокмишеней (фиг. 49A-49D). В отсутствие В-клеток не наблюдали экспрессию CD25 и CD69 в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-клеток.

W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP также исследовали с помощью анализов активации Т-клеток в отношении высвобождения цитокинов в присутствии или отсутствие CD19+ клеток-мишеней. Результаты свидетельствуют о том, что W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP индуцирует высвобождение ИФНу и ФНОа дозозависимым образом только в присутствии CD19+ клеток-мишеней (фиг. 50A-50D). В отсутствие Вклеток не определяли ИФНу и ФНОа в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-клеток.

Термостабильность.

Термостабильность W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP исследовали с использованием ПЦР в реальном времени. T_m1 и T_m2 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP составляют 60,2°С и 72,7°С.

Стабильность в сыворотке.

W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP инкубировали в сыворотке при 37°С в течение 14 дней. Связывающую активность антитела, инкубируемого в течение 0, 1, 4, 7 и 14 дней, определяли посредством проточной цитометрии. Результаты свидетельствуют о том, что активность связывания W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с CD3+ и CD19+ клетками была неизменной после инкубации в сыворотке человека в течение 14 дней (фиг. 51А-51В).

Связывание рецептора Fcy.

Активность связывания W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с FcyRI, FcyRIIa (H167), FcyRIIa (R167), FcyRIIb, FcyRIIIa (F176), FcyRIIIa (V176) и FcyRIIIb исследовали посредством SPR. Аффинности приведены в табл. 39. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP демонстрировало типичную аффинность связывания IgG4 человека со всеми рецепторами Fcy.

Таблица 39

Аффинность W343 8-T3U4.E 17-1 .uIgG4.SP к Fc-рецептору по результатам SPR

Fc-рецептор	K_D (M)
FcyRI	9,79E-09
FcyRIIa (Hl67)	2Д5Е-05
FcyRIIa (RI 67)	l,58E-05
FcyRIIb	2Д1Е-05
FcyRIIIa (Fl76)	2,93E-05
FcyRIIIa (VI76)	1Д0Е-05
FcyRIIIb	>4,10E-05

Активность связывания антитела с C1Q тестировали посредством ELISA. W3438-T3U4.E17- 212 045653

1.uIgG4.SP не демонстрировало связывание в ELISA (фиг. 52), а контрольное антитело IgG1 человека демонстрировало нормальный сигнал связывания.

Связывание FcRn.

Связывание W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP с FcRn тестировали посредством SPR при рН 6,0. Аффинность аппроксимировали как 2,58 мкМ, что является типичной аффинностью IgG4 человека к FcRn.

Исследование эффективности в модели ксенотрансплантата PBMC/Raji.

В этом исследовании определяли противоопухолевую эффективность ofW3438-T3U4.E171.uIgG4.SP в гуманизированной модели смешанных РВМС с клетками Raji на мышах NOG. Кривая роста опухоли показана на фиг. 53.

В день 14 средний размер опухоли в группе лечения, которой вводили изотипический контроль, достигал 342 мм³. Введение 1,5 мг/кг и 0,5 мг/кг W3438-T3U4.E17-1.uIG4.SP приводило к значительной противоопухолевой активности. Средний размер опухоли составлял 78 мм³(Т/С=23,0%, TGI=93,9%, p=0,016) и 75 мм³(Т/С=22,0%, TGI=95,3%, p=0,014), соответственно, и опухоль у одного животного в группе с высоким уровнем дозы подвергалась эрадикации. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в очень низкой дозе (0,06 мг/кг) не демонстрировало какую-либо противоопухолевую активность.

Фармакокинетика WuXiBody у яванского макака.

Концентрацию W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в сыворотке яванского макака тестировали посредством ELISA (фиг. 54). Вычисленные параметры PK приведены в табл. 40. Время полужизни W3438T3U4.E17-1.uIgG4.SP в случае однократной инъекции IV в дозе 1 мг/кг составляло 152 ч. W3438T3U4.E17-1.uIgG4.SP демонстрировало гораздо большее время полужизни, чем блинатумомаб, имеющий очень небольшое время полужизни (1,5-2,6 ч) у шимпанзе (экспертный отчет Европейского агентства лекарственных средств ЕМА/СНМР/469312/2015).

Таблица 40

PKW3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP у яванского макака

Параметр РК	W3438-T3U4.E17-l.uIgG4.SP
Со (мкг/мл)	60,4
Т1/2 (Ч.)	152
Vd_ss (л/кг)	0,0513
С1 (мл/мин/кг)	0,00462
AUCo-last (ч.*мкг/мл)	3552
AUCo-inf (ч.* мкг/мл)	3708
MRTo-last (ч.)	157
MRTo-inf(4.)	187

Токсичность.

Все обезьяны хорошо переносили лекарственное средство в течение всего исследования. Не наблюдали неблагоприятные эффекты во время прижизненной фазы исследования. Не наблюдали очевидных изменений в потреблении пищи и массе тела. Параметры общего и биохимического анализов крови, включая ACT, АЛТ, лейкоциты, гемоглобин и гематокрит, как правило, находились в пределах референсного диапазона.

Иммуногенность.

Результаты тестирования иммуногенности W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP показаны на фиг. 55А-55В. Титры антитела против лекарственного средства (ADA) против W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP в сыворотке обезьян через 3, 14 и 28 дней после введения дозы не имели значимых различий по сравнению с уровнем перед введением дозы. Таким образом, по-видимому, однократная инъекция IV W3438-T3U4.E171.uIgG4.SP в дозе 1 мг/кг не являлась иммуногенной для обезьян.

Пример 18. Биспецифическое WuXiBody против CTLA-4xPD-1.

Предпосылки.

Иммунотерапия является актуальной темой исследований лечения злокачественных новообразований. Антиген цитотоксических Т-лимфоцитов 4 (CTLA-4) является одной из валидированных мишеней иммунных контрольных точек. После активации Т-клеток CTLA-4 быстро экспрессируется на этих Тклетках, как правило, в течение одного часа после связывания антигена с TCR. CTLA-4 может ингибировать передачу сигнала Т-клеток посредством конкуренции с CD28, опосредующим хорошо описанный костимуляторный сигнал Т-клеток. Связывание CD28 с его лигандами CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2) на антигенпрезентирующих клетках приводит к пролиферации Т-клеток посредством индуцирования продукции интерлейкина-2 и антиапоптотических факторов. Из-за гораздо более высокой аффинности связывания CTLA-4 с CD80 и CD86, чем CD28, CTLA-4 может конкурентно вытеснять CD28 в отношении связывания с CD80 и CD86, что приводит к супрессии активации Т-клеток. В дополнение к индуцируемой экспрессии на активированных Т-клетках, CTLA-4 конститутивно экспрессируется на поверхности регуляторных Т-клеток (Treg), что позволяет предполагать, что CTLA-4 может быть необходимым для контактно-опосредуемой супрессии и ассоциированным с продукцией Treg иммуносупрессорных цитоки

- 213 045653 нов, таких как трансформирующий фактор роста бета и интерлейкин-10.

Блокада CTLA-4 может индуцировать регрессирование опухоли, что показано в ряде доклинических и клинических исследований. Два антитела против CTLA-4 находятся на стадии клинической разработки. Ипилимумаб (MDX-010, BMS-734016), полностью человеческое моноклональное антитело против CTLA-4 изотипа IgG1-каппа, является иммуномодулирующим средством, одобренным в качестве монотерапии для лечения меланомы на поздней стадии. Предполагаемый механизм действия ипилимумаба представляет собой противодействие взаимодействию CTLA-4, экспрессирующегося на субпопуляции активированных Т-клеток, с молекулами CD80/CD86 на профессиональных антигенпрезентирующих клетках. Это приводит к потенцированию Т-клеток по причине блокады ингибиторной модуляции активации Т-клеток, стимулируемой взаимодействием CTLA-4 и CD80/CD86. Возникающая активация Т-клеток, пролиферация и лимфоцитарная инфильтрация опухолей приводят к гибели опухолевых клеток. Коммерческая лекарственная форма представляет собой 5 мг/мл концентрата раствора для инфузии. Ипилимумаб также находится на стадии клинических исследований для других типов опухолей, включая рак предстательной железы и рак легких. Второе антитело против CTLA-4, находящееся на стадии клинической разработки, тремелимумаб, исследовали в качестве монотерапии меланомы и злокачественной мезотелиомы.

Белок программируемой гибели-1 (PD-1, CD279) является членом семейства CD28, экспрессирующимся на активированных Т-клетках и других иммунных клетках. Связывание PD-1 ингибирует функционирование этих иммунных клеток. PD-1 имеет два известных лиганда, PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PDL2 (B7-DC, CD273), оба из которых принадлежат к семейству В7. Экспрессия PD-L1 является индуцибельной в различных типах клеток лимфоидных и периферических тканей, в то время PD-L2 больше ограничен миелоидными клетками, включая дендритные клетки. Основной ролью пути PD-1 является снижение воспалительного иммунного ответа в тканях и органах.

Иммунотерапия с использованием комбинации моноклональных антител (mAb), блокирующих CTLA-4 (ипилимумаба) и PD-1 (ниволумаба), демонстрировала клиническую пользу, превосходящую таковую при использовании любого из mAb в отдельности. Биспецифическое WuXiBody против CTLA4xPD-1 разрабатывали для индуцирования противоопухолевого иммунитета посредством одновременной блокады обеих молекулы иммунных контрольных точек.

- 214 045653

Материалы и способы.

Общие материалы.

Общие исследовательские материалы и их источники приведены в таблице ниже.

Материалы	Поставщик	Кат. №
Клетки Expi293F™	Thermo Fisher	Кат. № А14527
Набор для трансфекции ExpiFectamine293	Thermo Fisher	Кат. № А14524
Среда для экспрессии Expi293F™	Thermo Fisher	Кат. № А1435101
Реагент для трансфекции Lipofectamine™ 2000	Thermo Fisher	Кат. № 11668019
Клетки FreeStyle™ 293-F	Thermo Fisher	Кат. № R79007
Среда для экспрессии FreeStyle™ 293	Thermo Fisher	Кат. № 12338002
Клетки CHO-S	Thermo Fisher	Кат. № А1155701
Среда для экспрессии FreeStyle™ CHO	GIBCO	Кат. № 12651014
Эмбриональная телячья сыворотка (FBS)	Coming	Кат. № 35-076-CV
Opti-MEM	Thermo Fisher	Кат. №31985070
Колонка с Ni-сефарозой	GE healthcare	Кат. № 17-5247-01
Колонка с протеином А	GE healthcare	Кат. № 17-5438-02
Superdex200 препаративной категории	GE Healthcare	Кат. № 17-1043-01
ВЭЖХ-SEC	TOSOH	Кат. № 0008541
Бис-Трис гель NuPAGE4%-12%	Thermo Fisher	Кат. № NP0322BOX
CTLA-4 человека: W316-hProl.ECD.His	Sino Biological	Кат. № 11159-Н08Н
CTLA-4 яванского макака: W316cprol.ECD.his	Sino Biological	Кат. № 90213-С08Н
PD-1 человека: W305-hProl.ECD.His	Собственное производство
PD-1 яванского макака: W305cynoProl.ECD.His	R&D	Кат. №R&D-8509- PD-050
Покрытые 96-луночные планшеты для ELISA	Nunc MaxiS orp, Thermo Fisher
96-луночные планшеты с U-образным дном для FACS	Coming-COSTAR	3799
Положительная по PD-1 человека линия клеток: W305-CHO-S.hProl.C6	Собственное производство
Положительные по PD-1 яванского макака	Собственное

- 215 045653

клетки: W305-293F.cProl.FL.Pool	производство
Положительная по CTLA-4 человека линия клеток: W316-293F.hProl.FL	Собственное производство
Положительная по CTLA-4 яванского макака линия клеток W316- 293F.cProl.FL.Pool	Собственное производство
Положительная по CD80 человека линия клеток: W316-CHO-Kl.hProlLl.B9B 11	Собственное производство
Положительная по CD86 человека линия клеток W316-CHO-Kl.hProlL2.A4A7	Собственное производство
PD-1 человека: W305-hProl.ECD.mFc	Собственное производство
PD-1 человека: W305-hProl.ECD.hFc	Собственное производство
PD-1 человека: W305-hProl.ECD.His	Собственное производство
PD-1 яванского макака: W305- cProl.ECD.His	Собственное производство
Белок CynoPD-1 .hFc	SinoBiological	90311С02Н
CTLA-4 человека: W316-hProl.ECD.mFc	Собственное производство
CTLA-4 человека: W316-hProl.ECD.hFc	Собственное производство
CTLA-4 человека: W316-hProl.ECD.His	Собственное производство
CTLA-4 яванского макака: W316- cProl.ECD.His	Собственное производство
PDL1 человека: W315-hProl.ECD.mFc	Собственное производство
CynoPD-Ll .hFc-биотин	Собственное производство
Меченое биотином W316.hProl.ECD.hFc	Собственное производство
CD80 человека: W316-hProlLl.ECD.His	Собственное

- 216 045653

	производство
WBP316-BMK1 (ипилимумаб)	Собственное производство
WBP305 ВМК1 (ниволумаб)	Собственное производство
WBP324-BMKl.IgGl.KDL	Собственное производство
Изотипический контроль: WBP332- 1.80.12.xAb.hIgG4	Собственное производство
HRP-меченое антитело козы против Fc IgG человека	Bethyl Laboratories	A80-304P
HRP-меченое мышь против Fc IgG человека (СН2)	Thermo	MA5-16859
HRP-меченое антитело козы против мышь IgGFc	Bethyl Laboratories	A90-231P
HRP-меченый стрептавидин	Life Technologies	SNN1004
Меченое биотином mAb против His	GenScript	A00613
FITC-меченое антитело козы против IgG человека	Jackson	109-095-008
PE-меченое антитело козы против IgG человека	Jackson	109-115-098
FITC-меченое антитело козы против IgG мыши	Abeam	98716
PE-меченый стрептавидин	BD	554061
Ficoll-Paque человека	Stemcell	07861
Набор для обогащения моноцитов	Miltenyi	Biotec-130-050-201
Набор для обогащения CD4⁺ Т-клеток	Stemcell	19052
Набор для обогащения CD4⁺CD25⁺ Тклеток	Miltenyi	130-093-631
Рекомбинантный ГМ-КСФ человека	R&D	215-GM
Рекомбинантный ИЛ-2 человека	SL PHARM
Рекомбинантный ИЛ-4 человека; АЬ против ИЛ-2	R&D	AG1815401; MAB602
Стандарт рекомбинантного ΗΦΗγ человека	Peprotech	300-02
Антитела против ΗΦΗγ	Life technology	M700A;M7001B
НЗ-тимидин и MicroScint	Perkin Elmer	NET027001MC
Эмбриональная телячья сыворотка (FBS)	GIBCO	10100147
Среда RPMI1640	GIBCO	22400089
DPBS	Coming	21-031-CVR
Реагенты для анализа цитотоксичности DELFIA® EuTDA	PerkinElmer	AD0116
Набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo	Promega	G7573
Кальцеин-АМ	Coming-354216	354216
Far red	Invitrogen	C34572

Получение растворимых антигенов.

Последовательности ДНК, кодирующие последовательность внеклеточного домена PD-1 человека (регистрационный номер Uniport Q15116), синтезировали в Sangon Biotech (Shanghai, China), а затем субклонировали в модифицированные экспрессирующие векторы pcDNA3.3 с меткой 6xHis на С-конце. Белки CTLA-4 человека, яванского макака и мыши и PD-1 мыши и яванского макака приобретали в Sino Biological.

Клетки Expi293 (Invitrogen-A14527) трансфицировали с использованием очищенного экспрессирующего вектора pcDNA3.3. Клетки культивировали в течение 5 дней и собирали супернатант для очистки белка с использованием колонки Ni-NTA (GE Healthcare, 175248). Полученный PD-1 человека подвергали контролю качества посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC, а затем хранили при -80°С.

- 217 045653

Получение референсных антител.

Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела против CTLA-4 (WBP316BMK1), антитела против PD-1 (WBP305-BMK1) синтезировали в Sangon Biothech (Shanghai, China), а затем субклонировали в модифицированные экспрессирующие векторы pcDNA3.4 с константной областью IgG1 человека или IgG4 человека (S228P). Антитела против PD-1 WBP3055-1.153.7.uIgG4k и WBP3055-1,103,11.uIgG4k получали после иммунизации крыс PD-1 человека и PD-1 мыши и преобразовывали в формат IgG4 (S228P). Синтезировали последовательность ДНК, кодирующую демонстрационное биспецифическое антитело против CTLA-4xPD-1 (WBP324-BMK1.IgG1.KDL).

С помощью плазмид, содержащих гены VH и VL, котрансфицировали клетки Expi293. Клетки культивировали в течение 5 дней и собирали супернатант для очистки белка с использованием колонки с протеином A (GE Healthcare, 175438) или колонки с протеином G (GE Healthcare, 170618). Полученные антитела тестировали посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и SEC, а затем хранили при -80°С.

Получение экспрессирующих мишень линий клеток.

С помощью Lipofectamine 2000 клетки CHO-S или 293F трансфицировали с использованием экспрессирующих векторов, содержащих гены, кодирующие полноразмерный PD-1 человека или PD-1 мыши. Клетки культивировали в среде, содержащей соответствующие селективные маркеры. Стабильную линию клеток с высокой экспрессией PD-1 человека (WBP305.CHO-S.hPro1.C6) и стабильную линию клеток с высокой экспрессией PD-1 мыши (WBP305.293F.mPro1.B4) получали способом предельных разведений.

Получение биспецифических антител против CTLA-4/PD-1.

Конструирование W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP: Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против PD-1, константную область 1, вариабельную область тяжелой цепи антитела против CTLA-4, константную область бета-цепи TCR, и константную область 2 и 3 IgG4 (S228P), соединенные с 5'-конца к 3'-концу, клонировали в модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против CTLA-4 на 5'-конце константной области альфа-цепи TCR, клонировали в другой модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3. Легкую цепь антитела против PD-1 клонировали в третий модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3.

Конструирование W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP: Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против PD-1, константную область бета-цепи TCR, вариабельную область тяжелой цепи антитела против CTLA-4 и константную область IgG4 (S228P), соединенные с 5'-конца к 3'-концу, клонировали в модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против PD-1 на 5'-конце константной области альфа-цепи TCR, клонировали в другой модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3. Легкую цепь антитела против CTLA-4 клонировали в третий модифицированный экспрессирующий вектор pcDNA3.3.

Соответствующие последовательности W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP приведены ниже.

LC1	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO:412)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQ QKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTI SRAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLGQP KAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE QWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
LC2	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO: 413)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWY QQKPGQ APRLLIYGAF SRATGIPDRF SGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKPDI

- 218 045653

		QNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSK DSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFAC ANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
нс	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO: 414)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW VRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLS S WT VPS S SLGTKT YTCNVDHKP SNTK VDKRV GGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYC ARTGWLGPFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVF EPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGK EVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATF WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIV SAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG

Соответствующие последовательности W3248-U6T5.G25-1.uIgG4.SP приведены ниже.

LC1	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO: 415)	SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGDNIGNKDVHWYQ QKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPEGFSGSNSGNTATLTIS RAQAGDEADYYCQVWDSIWVFGGGTKLTVLPDIQN PDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSD VYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAF QNSIIPEDTFFPSPESS
LC2	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO: 416)	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQ KPDQSPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTI NSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ

- 219 045653

		WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC
нс	Аминокислотная последовательность (SEQIDNO: 417)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW VRQAPGKGLEWVSTITGGGGSIYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRAGEGYFDY WGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP LKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRGGGGS GGGGSQ VQLVQ SGAEVKKPGS S VKVSCKASGYTFT NYFMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAEKF KKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAM DNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLG

В случае обоих биспецифических антител с помощью одного экспрессирующего вектора для тяжелой цепи и двух экспрессирующих векторов для легкой цепи котрансфицировали клетки Expi293 (Thermo Fisher-A14527) по инструкциям производителя. Через пять дней после трансфекции собирали супернатанты и очищали их с использованием колонки с протеином A (GE Healthcare-17543802) и дальнейшей эксклюзионной хроматографии (GE Healthcare-17104301). Концентрацию антитела измеряли с помощью Nano Drop. Низкий уровень эндотоксина подтверждали с использованием набора для детекции эндотоксина (GenScript-L00350), и уровень эндотоксина для двух биспецифических антител составлял менее 10 МЕ/мг. Чистоту белков оценивали посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS и ВЭЖХSEC.

Характеризация in vitro.

Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF).

Анализ DSF осуществляли с использованием системы для ПЦР в реальном времени 7500 Fast (Applied Biosystems). В кратком изложении, 19 мкл раствора биспецифического антитела смешивали с 1 мкл 62,5-кратного раствора SYPRO Orange (TheromFisher-S6650) и добавляли в 96-луночный планшет. Планшет нагревали с 26°С до 95 °С со скоростью 2°С/мин и собирали получаемые данные о флуоресценции. Данные анализировали автоматически с помощью операционного программного обеспечения и вычисляли T_h, используя максимальное значение отрицательной производной получаемых данных о флуоресценции относительно температуры. Ton можно приблизительно определять как температуру на графике отрицательной производной, начинающуюся снижаться относительно исходного уровня до перехода.

Связывание PD-1 человека по результатам FACS

Сконструированные экспрессирующие PD-1 человека клетки W305-CHO-S.hPro1.C6 высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799). К клеткам добавляли титрованные в 3,16 раз антитела в 1% BSA/DPBS от 200 нМ до 0,002 нМ. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного 1:125 РЕ-меченого антитела козы против антитела человека (Jackson 109-115-098) и инкубировали планшеты при 4°С в течение 1 ч. Связывание антител на клетках тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FlowJo.

Связывание PD-1 яванского макака по результатам FACS.

Сконструированные экспрессирующие PD-1 яванского макака клетки W305-293F.cynoPro1.FL.pool высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799). К клеткам добавляли титрованные в 4,0 раз Ab в 1% BSA/DPBS от 40 мкг/мл до 0,0001526 мкг/мл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного 1:150 РЕ-меченого антитела козы против антитела человека (Jackson 109-115-098) и инкубировали планшеты при 4°С в течение 1 ч. Связывание антител на клетках тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FlowJo.

- 220 045653

Связывание CTLA-4 человека по результатам FACS.

Сконструированные экспрессирующие CTLA-4 человек клетки W316-293F.hPro1.FL высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799). К клеткам добавляли титрованные в 3,16 раз Ab в 1% BSA/DPBS от 200 нМ до 0,002 нМ. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного 1:150 РЕмеченого антитела козы против антитела человека (Jackson 109-115-098) и инкубировали планшеты при 4°С в течение 1 ч. Связывание антител на клетках тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FlowJo.

Связывание CTLA-4 яванского макака по результатам FACS.

Сконструированные экспрессирующие CTLA-4 человека клетки W316-293F.cynoPro1.F1.pool высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799). К клеткам добавляли титрованные в 4 раза Ab в 1% BSA/DPBS от 40 мкг/мл до 0,00004 мкг/мл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного 1:150 РЕ-меченого антитела козы против антитела человека (Jackson 109-115-098) и инкубировали планшеты при 4°С в течение 1 ч. Связывание антител на клетках тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FlowJo.

Двойное связывание hPD-1 и hCTLA-4 по результатам ELISA Для тестирования того, могут ли биспецифические антитела связываться и с hPD-1, и с hCTLA-4, осуществляли анализ ELISA, как описано ниже. 96-луночный планшет для ELISA (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher) покрывали 0,5 мкг/мл антигена-1 (hPD-1-ECD, W305-hPro1.ECD.mFc) в карбонат-бикарбонатном буфере в течение ночи при 4°С. После 1часовой стадии блокирования 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (Pierce), растворенного в PBS, серийные разведения разных биспецифических антител против PD-1xCTLA-4 в PBS, содержащем 2% BSA, инкубировали на планшетах в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации планшеты три раза промывали 300 мкл PBS, содержащего 0,5% (об./об.) Tween 20, на лунку. В планшеты добавляли 0,5 мкг/мл антигена-2 (hCTLA-4-ECD, W316-hPro1.ECD.hFc.биотин) и инкубировали смесь в течение 1 ч. После трехкратной промывки планшетов добавляли стрептавидин-HRP (Life Technologies, #SNN1004) (разведенный 1:20000) и инкубировали на планшетах в течение 1 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки 300 мкл PBS, содержащего 0,5% (об./об.) Tween 20, на лунку, для детекции добавляли 100 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) на лунку. Реакцию останавливали через приблизительно 5 мин посредством добавления 100 мкл 2 М HCl на лунку. Поглощение в лунках измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра для чтения многолуночных планшетов (SpectraMax® M5e).

Двойное связывание hPD-1 и hCTLA-4 по результатам FACS Для тестирования того, могут ли биспецифические антитела связываться и с hPD-1, и с hCTLA-4, осуществляли анализ FACS, как описано ниже. Сконструированные экспрессирующие PD-1 и CTLA-4 человека клетки W305-CHO-S.hPro1.C6 и W316-293F.hPro1.F1 окрашивали кальцеином-АМ (Corning-354216) в количестве 50 нМ и Far red (Invitrogen-C34572) в количестве 20 нМ, соответственно, в течение 20 мин при 37°С. После двукратной промывки 1% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином (Pierce) в PBS смешанные клетки с hPD-1 (5E4) и hCTLA-4 (5E4) высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799). После удаления супернатанта к клеткам добавляли антитела, серийно разведенные в 3 раза 1% BSA/DPBS от 7,5 нМ до 0,83 нМ. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1,5 ч.

Клетки тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали процент двойных положительных клеток с помощью FlowJo.

Конкурентный анализ PD-1 человека посредством FACS.

Для тестирования того, могут ли биспецифические антитела блокировать связывание hPD-L1 с белком hPD-1, осуществляли конкурентный анализ FACS. В кратком изложении, сконструированные экспрессирующие PD-1 человека клетки W305-CHO-S.hPro1.C6 (собственное производство) высевали в количестве 1х10⁵ клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (COSTAR 3799), к клеткам добавляли от 200 нМ до 0,002 нМ PD-L1 человека вместе с 5 мкг/мл белка PD-L1 человека W315hPro1.ECD.mFc. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч. После промывки определяли связывание W315-hPro1.ECD.mFc с клетками, экспрессирующими PD-1 человека, с помощью FITC-меченого антитела козы против антитела мыши (Abcam 98716 1:125). Конкурентное связывание антитела с клетками тестировали посредством проточной цитометрии и анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FlowJo.

Блокада связывания CTLA-4 человека/яванского макака с CD80 человека.

Для тестирования того, могут ли биспецифические антитела блокировать связывание hCTLA-4 с белком hCD80, использовали ELISA. В кратком изложении, плоскодонные 96-луночные планшеты (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher) предварительно покрывали 0,5 мкг/мл W316-hPro1.ECD.hFc в течение ночи при 4°С. После блокирования с помощью 2% BSA в каждую лунку пипеткой добавляли 100 мкл титрованных в 3,16 раза Ab в количестве от 400 нМ до 0,04 нМ вместе с 0,5 мкг/мл белка CD80 человека W316-hPro1L1.ECD.His и инкубировали в течение 1 ч при температуре окружающей среды. После инкубации планшеты промывали 3 раза 300 мкл PBS, содержащего

- 221 045653

0,5% (об./об.) Tween 20, на лунку. На планшет добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл меченого биотином mAb против His (GenScript-A00613) на лунку и инкубировали в течение 1 ч. После шестикратной промывки связывание W315hPro1L1.ECD.His с WBP316-hPro1.ECD.hFc определяли с помощью стрептавидина-HRP (Life Technologies, #SNN1004) (разведенного 1:20000). Окраску проявляли, добавляя 100 мкл субстрата ТМВ, а затем останавливая реакцию с помощью 100 мкл 2 Н HCl. Поглощение определяли при 450 нм с использованием спектрофотометра для чтения микропланшетов (SpectraMax® M5e).

Конкурентный анализ FACS использовали для тестирования того, могут ли антитела блокировать связывание CTLA-4 человека или яванского макака с hCD80 на поверхности клеток. В кратком изложении, экспрессирующие CD80 человека клетки Сно-Κι добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета (COSTAR. 3799) в количестве 1x105 на лунку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С перед удалением супернатанта. Серийные разведения тестируемых антител, положительные и отрицательные контроли смешивали с биотинилированным CTLA-4.ECD.hFc человека. Из-за разной плотности лигандов на поверхности клеток, в случае клеток, экспрессирующих CD80 человека, использовали 0,066-0,037 мкг/мл hCTLA-4.ECD.hFc-биотин. Затем смеси антитела и CTLA-4 добавляли к клеткам и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Клетки два раза промывали 200 мкл промывочного буфера для FACS (DPBS, содержащего 1% BSA). К клеткам добавляли стрептавидин-РЕ (BD Pharmingen554061), разведенный 1:600 в буфере для FACS, и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Дополнительные стадии промывки осуществляли два раза с использованием 200 мкл промывочного буфера для FACS с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С. И наконец, клетки ресуспендировали в 100 мкл промывочного буфера для FACS, измеряли значения флуоресценции посредством проточной цитометрии и анализировали их с помощью FlowJo.

Аффинность к CTLA-4 и PD-1.

Для измерения константы скорости прямой реакции (ka) и константы скорости обратной реакции (kd) связывания антител с ECD CTLA-4 или PD-1 использовали технологию SPR. Таким образом, определяли константу аффинности (KD).

Устройство Biacore T200, сенсорный чип СМ5 серии S, набор для соединения по аминогруппе и 10-кратный HBS-EP приобретали в GE Healthcare. Антитело козы против Fc IgG человека приобретали в Jackson ImmunoResearch Lab (кат. № 109-005-098). На стадии иммобилизации получали активационный буфер посредством смешивания 400 мМ EDC и 100 мМ NHS непосредственно перед впрыскиванием. Сенсорный чип СМ5 активировали в течение 420 с с помощью активационного буфера. Затем в каналы Fc1-Fc4 впрыскивали 30 мкг/мл антитела козы против Fcy человека в 10 мМ NaAc (pH 4,5) в течение 200 с при скорости потока 5 мкл/мин. Чип дезактивировали 1 М этаноламином-HCl (GE). Затем антитела захватывали на чипе. В кратком изложении, 4 мкг/мл антител в подвижном буфере (HBS-EP+) впрыскивали отдельно в канал Fc3 в течение 30 с при скорости потока 10 мкл/мин. Восемь разных концентраций (20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 и 0,15625 нМ) аналита ECD CTLA-4 или PD-1 и пустой подвижный буфер впрыскивали по порядку в каналы Fc1-Fc4 при скорости потока 30 мкл/мин в фазу ассоциации в течение 120 с с последующей фазой диссоциацией в течение 2400 с. Буфер для регенерации (10 мМ глицина, рН 1,5) впрыскивали со скоростью 10 мкл/ мин в течение 30 с после каждой фазы диссоциации.

Стабильность в сыворотке человека.

Антитела инкубировали в свежевыделенной сыворотке человека при 37°С. В указанные моменты времени аликвоты обработанного сывороткой образца удаляли из инкубатора и быстро замораживали в жидком азоте, а затем хранили при -80°С до анализа двойного связывания посредством ELISA. Замороженные образцы быстро размораживали непосредственно перед анализом стабильности. В кратком изложении, планшеты предварительно покрывали 0,5 мкг/мл hCTLA4.ECD.hFc (собственное производство) при 4°С в течение ночи. После блокирования в течение 1 ч тестируемые антитела добавляли в планшеты в различных концентрациях. Планшеты инкубировали при температуре окружающей среды в течение 1 ч. После инкубации планшеты три раза промывали 300 мкл PBS, содержащего 0,5% (об./об.) Tween. 20, на лунку. Затем в планшеты добавляли 0,1 мкг/мл hPD-1-ECD.биотин и инкубировали смесь в течение 1 ч. После трехкратной промывки планшетов добавляли стрептавидин-HRP (Life Technologies, #SNN1004) (разведенный 1:20000) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки 300 мкл PBS, содержащего 0,5% (об./об.) Tween 20, на лунку, для детекции добавляли 100 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) на лунку. Реакцию останавливали через приблизительно 5 мин посредством добавления 100 мкл 2 М HCl на лунку. Поглощение в лунках измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра для чтения многолуночных планшетов (SpectraMax® M5e).

Результаты.

Экспрессия и очистка биспецифических антител.

Чистота биспецифических антител, анализируемая посредством электрофореза в ПААГ в присутствии SDS (фиг. 56А) и SEC-ВЭЖХ (фиг. 56В), составляла более 90%.

DSF WuXiBody.

DSF использовали для измерения T_m WuXiBody. Как показано на фиг. 57, W3248-U6T1.G25R1.uIgG4.SP и WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4. SP имеют T_h1 60,8 и 63,4°С, соответственно.

Связывание PD-1 человека и яванского макака.

Биспецифические антитела могут связываться с PD-1 человека (фиг. 58) и PD-1 яванского макака (фиг. 59). По результатам FACS активность связывания W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP с PD-1 человека

- 222 045653 была немного лучше, чем WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248U6T5.G25-1-uIgG4.SP имели аффинность к PD-1 человека 1,24 нМ и 1,32 нМ, соответственно (фиг. 62).

Связывание с CTLA-4 человека и яванского макака.

Очищенные биспецифические антитела связывались с CTLA-4 человека, что тестировали посредством FACS (фиг. 60). Два биспецифических антитела также связывались с CTLA-4 яванского макака (фиг. 61). W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP имели аффинность к CTLA-4 человека 0,0356 нМ и 0,357 нМ, соответственно (фиг. 62).

Одновременное связывание с CTLA-4 и PD-1.

Для тестирования того, могут ли биспецифические антитела связываться с обеими мишенями, использовали ELISA и FACS. При ELISA планшет покрывали PD-1 человека. После добавления биспецифических антител биотинилированный CTLA-4 использовали для детекции связанных биспецифических антител. Как показано на фиг. 66, W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP могут связываться и с PD-1, и с CTLA-4 с EC₅₀ от 0,1072 до 0,0710 нМ, что сравнимо с референсным биспецифическим антителом WBP324 BMK1 (ЕС₅₀=0,05 99 нМ). При FACS и W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP, и WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP могли одновременно связываться с PD-1+ и CTLA-4+ клетками (фиг. 67).

Блокирование связывания CTLA-4 человека или яванского макака с CD80.

Конкурентный анализ FACS использовали для тестирования блокирования связывания CTLA-4 с его лигандом CD80 с помощью биспецифических антител. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248U6T5.G25-1-uIgG4.SP блокировали связывание CTLA-4 с CD80 с IC₅₀ 4,3 00 и 0,7581 нМ (фиг. 64). Аналогично, биспецифические антитела также могли блокировать связывание CTLA-4 яванского макака с клетками, положительными по CD80 человека (фиг. 65).

Блокирование связывания PD-1 с его лигандами.

Конкурентный анализ FACS использовали для тестирования блокирования связывания PD-1 с его лигандом PD-L1 с помощью биспецифических антител. W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248U6T5.G25-1-uIgG4.SP блокировали связывание PD-1 с PD-L1 с IC₅₀ 1,670 нМ и 1,917 нМ (фиг. 63).

Стабильность в сыворотке.

Два биспецифические антитела инкубировали при 37°С в сыворотке человека в течение 14 дней и измеряли их двойное связывание с CTLA-4 и PD-1 человека посредством ELISA. Как показано на фиг. 68А и 68В, двойное связывание W3248-U6T1.G25R-1.uIgG4.SP и WBP3248-U6T5.G25-1-uIgG4.SP с мишенями не изменялось с течением времени, что свидетельствует о том, что эти два биспецифических антитела являлись стабильными в сыворотке человека при 37°С в течение по меньшей мере 14 дней.

Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, специалисту в этой области следует понимать, что можно осуществлять различные изменения формы и деталей настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, как представлено в настоящем описании.

Claims

1. Полипептидный комплекс, содержащий первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Т-клеточного рецептора (TCR), и второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, где первый VH функционально связан с С1 в первом соединительном домене и первый VL функционально связан с С2 во втором соединительном домене, где С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-альфа;

С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа; или

С1 содержит сконструированную С-гамма и С2 содержит сконструированную С-дельта; или

С1 содержит сконструированную С-дельта и С2 содержит сконструированную С-гамма; и где первое антитело имеет первую антигенную специфичность.

2. Полипептидный комплекс по п.1, где ненативная межцепочечная связь образуется между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2, необязательно где по меньшей мере один из первого и второго мутантных остатков является остатком цистеина.

3. Полипептидный комплекс по п.1 или 2, где по меньшей мере один нативный остаток цистеина отсутствует в С1 и/или С2 и/или где по меньшей мере один нативный участок N-гликозилирования отсутствует в С1 и/или С2.

4. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-3, где димер содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ненативных межцепочечных связей, необязательно где по меньшей мере одна из ненативных межцепочечных связей является дисульфидной связью.

- 223 045653

5. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-4, где сконструированная С-бета не сохраняет петлю FG, охватывающую аминокислотные остатки 101-107 нативной С-бета, и/или петлю DE, охватывающую аминокислотные остатки 66-71 нативной С-бета.

6. Полипептидный комплекс по п.5, где:

(а) сконструированная С-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 43-48 и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 33-41, (b) сконструированная С-пре-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 82-83, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 или 318 и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 84, 33-41, 319, 320, 321, 322, 323 или 324, или (c) сконструированная С-гамма содержит любую из SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334 или 335, 336, 337, 338, 339 или 340 и/или сконструированная С-дельта содержит любую из SEQ ID NO: 115, 116, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 или 332.

7. Полипептидный комплекс по п.5 или 6, где:

(а) С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-альфа и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 49, 50, 129 или 130 и/или второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 51 или 52, (b) С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 49, 50, 132 или 133 и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 81 или 131, (с) С1 содержит сконструированную С-гамма и С2 содержит сконструированную С-дельта и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 117 или 118 и/или второй соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 119 или 120, или (d) С1 содержит сконструированную С-дельта и С2 содержит сконструированную С-гамма и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 123 или 124 и/или второй соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 125 или 126.

8. Конъюгат, содержащий полипептидный комплекс по любому из пп.1-7, конъюгированный с фрагментом, где указанный фрагмент представляет собой детектируемую метку, модифицирующий фармакокинетику фрагмент, фрагмент для очистки, цитотоксический фрагмент, антитело или фрагмент антитела.

9. Способ получения полипептидного комплекса по любому из пп.1-7, включающий:

а) введение в клетку-хозяина первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первую вариабельную область тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанную с первой константной областью (C1) TCR, и второго полинуклеотида, кодирующего второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR, где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и первое антитело имеет первую антигенную специфичность, и

b) экспрессию полипептидного комплекса в клетке-хозяине;

где указанный способ включает:

c) введение в клетку-хозяина одного или более дополнительных полинуклеотидов, кодирующих второй антигенсвязывающий фрагмент, где второй антигенсвязывающий фрагмент имеет вторую антигенную специфичность, отличающуюся от первой антигенной специфичности, и

d) экспрессию биспецифического полипептидного комплекса клеткой-хозяином;

где указанный способ дополнительно включает выделение полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса.

10. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:

(a) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 6-29, 37-67 и 86-95;

(b) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 7-19, 26-34, 56-75 и 103-106; или (c) сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 8-26, 43-64 и 84-88; и/или сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 11-35 и 55-76.

11. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:

(а) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S56C, S16C, F13C, V12C, Е14С, F13C, L62C, D58C, S76C

- 224 045653 и R78C, и/или сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из Т49С, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, Т46С, L51C и S62C, необязательно где сконструированная С-бета и сконструированная С-альфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S56C в С-бета и Т49С в С-альфа, S16C в С-бета и Y11C в С-альфа, F13C в С-бета и L13C в

С-альфа, S16C в С-бета и L13C в С-альфа, V12C в С-бета и S16C в С-альфа, Е14С в С-бета и S16Cв

С-альфа, F13C в С-бета и V23C в С-альфа, L62C в С-бета и Y44C в С-альфа, D58C в С-бета и Т46Св

С-альфа, S76C в С-бета и Т46С в С-альфа, S56C в С-бета и L51C в С-альфа, S56C в С-бета и S62Cв

С-альфа и R78C в С-бета и S62C в С-альфа, и где указанная пара остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь, дополнительно необязательно где отсутствует нативный остаток цистеина в положении С74 сконструированной С-бета;

(b) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S16C, А18С, Е19С, F13C, А11С, S56C и S76C, и/или сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S11C, А13С, I16C, S62C, Т65С и Y59, необязательно где сконструированная С-бета и сконструированная С-пре-альфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и S11C в С-пре-альфа, А18С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, Е19С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, F13C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, S16C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, А11С в С-бета и I16C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и Т65С в С-пре-альфа и S76C в С-бета и Y59C в С-пре-альфа, и где указанная пара мутантных остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь; или (c) сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S17C, Е20С, F14C, Т12С, М62С, Q57C и А19С, и/или сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из F12C, М14С, N16C, D46C, V50C, F87C и Е88С, необязательно где сконструированная С-гамма и сконструированная С-дельта содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Q57C в С-гамма и V50C в С-дельта, А19С в С-гамма и Е88С в С-дельта, S17C в С-гамма и F12C в С-дельта, Е20С в С-гамма и F12C в С-дельта, F14C в С-гамма и М14С в С-дельта, Т12С в С-гамма и N16C в С-дельта, М62С в С-гамма и D46C в С-дельта и А19С в С-гамма и F87C в С-дельта, и где указанная пара мутантных остатков цистеина может образовывать межцепочечную дисульфидную связь.

12. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:

(a) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-альфа, необязательно где нативный участок гликозилирования в сконструированной С-бета представляет собой N69, и/или нативный участок (нативные участки) гликозилирования в сконструированной С-альфа выбран(ы) из N34, N68, N79 и любой их комбинации;

(b) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-пре-альфа, необязательно где отсутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-бета представляет собой N69, и/или отсутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-пре- альфа представляет собой N50; или (с) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-гамма и/или сконструированной С-дельта, необязательно где нативный участок гликозилирования в сконструированной С-гамма представляет собой N65, и/или нативный участок (нативные участки) гликозилирования в сконструированной С-дельта представляет (представляют) собой один или оба из N16 и N79.

13. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептидный комплекс по любому из пп.1-7.

14. Выделенной вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по п.13.

15. Клетка-хозяин, содержащая выделенный полинуклеотид по п.13 или выделенный вектор по п.14.

16. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептидный комплекс по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Применение полипептидного комплекса по любому из пп.1-7 для производства лекарственного средства для лечения состояния у нуждающегося в этом индивидуума, где указанное лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве.

18. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-7, где С1 или С2 содержит сконструированную С-альфа и по меньшей мере один нативный остаток Ser в сконструированной С-альфа подвергают мутации для снижения О-гликозилирования, необязательно где мутантный аминокислотный остаток выбран из S19, S36, S41, S91 и S94.