EA015148B1 - СПОСОБЫ ОЧИСТКИ Aβ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ОБЛАСТЬ FC - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение предусматривает способы очистки Аβ-связывающих белков, имеющих область Fc, например антител к Аβ или слитых антител, адсорбцией Aβ-связывающего белка на Fc-связывающем агенте, например, таком как белок А или белок G, промыванием буфером соли двухвалентного катиона для удаления примесей с последующей регенерацией адсорбированного Аβ-связывающего белка. Настоящее изобретение также предусматривает способы элюции очищенного Аβ-связывающего белка, а также включение способов в схему (цепь) очистки. Также предусматриваются наборы, содержащие компоненты для осуществления способов и инструкции по применению.

Description

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Альцгеймера (ΑΌ) представляет собой нейродегенеративное нарушение, характеризующееся наличием амилоидных бляшек, нейрофибриллярных узлов и значительной утратой нейронов. β-амилоидный белок (также в данном описании называемый Ав-пептид), основной компонент сенильных бляшек, непосредственно связан с патогенезом болезни Альцгеймера (8е1кое (1989), Се11 58: 611612; Нагбу (1997), Ттепбв Ыеиго5С1. 20: 154-159). Показано, что β-амилоид обладает как прямой токсичностью в отношении культивируемых нейронов (Богепхо апб Уапкпег (1996), Апп. ΝΥ Асаб. 8с1. 777: 8995), так и косвенной токсичностью через различные медиаторы (Кой е! а1. (1990), Вташ Кевеагсй 533: 315-320; Майкоп е! а1. (1992), 1. №иго5С1епсе5 12: 376-389). Кроме того, в исследованиях на ш уйо моделях, включая мышиную ΡΌΑΡΡ и крысиную модель, связывают β-амилоид с изучением недостаточности, измененной когнитивной функции и ингибирования долговременного потенцирования в гиппокампе (Сйеп е! а1. (2000), №Ш1ге 408: 975-985; \Уа1к11 е! а1. (2002), №а!ше 416: 535-539). Поэтому большой интерес вызывают терапевтические средства, которые изменяют уровни β-амилоида, что, теоретически, снижает тяжесть заболевания или даже аннулирует саму болезнь.

Один метод лечения ΑΌ, разработанный недавно под влиянием успешных исследований на ΡΌΑΡΡ мышиной и крысиной экспериментальных моделях, представляет собой метод пассивной иммунизации индивидуума с целью предоставить иммуноглобулины, такие как антитела, специфические к β-амилоиду (см., например, Вагб е! а1. (2000), №11. Меб. 6: 916-919 и Вагб е! а1. (2003), ΡΐΌα №-И1. Αсаб. 8с1. υδΑ 100: 2023-2028). Недавно было также показано, что восстановление Α^^ (бета-амилоидного пептида) с помощью пассивной иммунизации защищает от прогрессирующей утраты за счет синаптической дегенерации у трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (Ви!йш е! а1. (2005), 1. №еиговс1. 25: 9096-101).

Последние достижения рекомбинантной технологии позволили получать антитела фактически против любой мишени, например раковых клеток, бактерий и вирусов. Как правило, антитело продуцируют, используя клеточную линию, которая создана для экспрессии высоких уровней антитела. Получаемую генной инженерией (методом рекомбинантной ДНК) линию клеток затем выращивают в культуре, которая содержит сложную смесь сахаров, аминокислот и факторов роста, а также различные белки, включая, например, сывороточные белки. Однако отделение полных антител от побочных клеточных продуктов и компонентов культур с целью достижения чистоты, достаточной для применения в исследовании или в качестве терапевтических средств, является трудной задачей. Очистка антител особенно важна, если антитела предназначены для применения в качестве лекарства, вводимого человеку.

Традиционные схемы (или технологические линии) очистки антител часто включают стадию хроматографии, которая основана на способности антитела предпочтительно связываться с, или удерживаться, твердой фазой (или функционализированной твердой фазой) в хроматографической колонке по сравнению со связыванием, или удерживанием, различных примесей. Предложена или осуществлена схема очистки антител, по которой белки, содержащие область СН2/СН3, сначала связывают с белком А, иммобилизованным на твердой фазе, а затем удаляют примеси, связанные с твердой фазой, гидрофобным электролитическим растворителем с последующим извлечением белков, содержащих область СН2/СН3, из твердой фазы. Однако ограниченность этих схем заключается в том, что условия, применяемые для предпочтительного связывания белков, содержащих область СН2/СН3, также способствуют связыванию примесей (например, антител с неполными СН2/СН3 областями). При разработке терапевтических средств для человека такие примеси крайне нежелательны.

Следовательно, существует необходимость усовершенствовать очистку белков или полипептидов, содержащих константные области, в частности белки, содержащие области Рс (например, антитела), продуцируемые в культуре клеток.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способы очистки Аβ-связывающих белков, в частности Аβ-связывающих антител. Способы по изобретению особенно применимы для очистки белков (например, антител), предназначенных для введения человеку. В частности, изобретение предусматривает очистку белков, имеющих константные области, в особенности белков, имеющих области Рс (например, антител), полученных в культуре клеток.

В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы выделения Аβсвязывающего белка, содержащего Рс-область, такого как антитела против Аβ, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей. В способе по изобретению Аβ-связывающий белок адсорбируется на Р-связывающем агенте, а затем Рс-связывающий агент промывают буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, удаляя одну или более примесей. Затем белок выделяют из Рс-связывающего агента раствором для элюции. Способы по изобретению особенно применимы для удаления примесей, таких как частицы вариантов, полученных при использовании интронов, содержащих открытую рамку считывания (1К.Т), частицы с недостающими дисульфидными связями (иЭВ) и/или варианты низкомолекулярных частиц (ЬМ^). Способы по изобретению также применимы для эффективного удаления таких примесей, как белки клеток-хозяев (НСР) и ДНК.

Способы по настоящему изобретению включают одну или более стадий хроматографического раз- 1 015148 деления и, кроме того, могут включать одну или более стадий фильтрации. Стадии хроматографического разделения могут быть непрерывными или периодическими (например, партиями) или их комбинацией.

В различных вариантах изобретения способы включают одну или более стадий фильтрации, например, для удаления вирусов, концентрации и забуферивания раствора, содержащего целевой белок, и для удаления микробных примесей.

В различных вариантах изобретения антитело против Άβ представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. В некоторых вариантах изобретения антитело против Άβ представляет собой антитело, которое специфически связывается эпитопом в остатках Άβ 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42. Типичные антитела против Άβ специфически связываются с эпитопом в остатках 1-10 Άβ, например в остатках Άβ 1-7, 1-5, 3-7 или 3-6. Другие типичные антитела к Άβ специфически связываются с эпитопом в остатках Άβ 13-28, например в остатках Άβ 16-21 или 19-22. Другие типичные антитела против Άβ специфически связываются с С-концевым эпитопом Άβ, таким как, например, 33-40 или 33-42 белка Άβ. В некоторых вариантах изобретения антитело против Άβ связывает прерывистый эпитоп, который включает остатки в пределах 1-7 и 13-28 белка Άβ. Другие варианты изобретения предусматривают РаЬ, Р(аЬ')₂ или Ρν фрагменты антител против Άβ. В некоторых вариантах изобретения антитело является биспецифическим антителом или антителом, полученным способом, описанным в опубликованной патентной заявке \¥О 03/070760.

В предпочтительном варианте изобретения антитело является гуманизированным антителом против Άβ, а в некоторых вариантах изобретения антитело к Άβ выбирают из группы, состоящей из 3Ό6, 10Ό5, 12В4, 12Ά11, 15С11 и 266. Изотип антитела может представлять собой 1дМ, 1дС1, 1дС₂, 1дС₃, 1дС₄ или любой другой фармацевтически приемлемый изотип. В предпочтительных вариантах изобретения изотип представляет собой человеческий 1дС| или человеческий 1дС₄.

В различных вариантах изобретения Άβ-связывающий белок получают методом рекомбинантной ДНК. В различных вариантах изобретения Άβ-связывающий белок получают методом рекомбинантной ДНК в клетках яичников китайского хомячка (СНО).

В различных вариантах изобретения одна или более примесей представляют собой один или более белок клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белок клеточной культуры, нежелательную частицу Άβсвязывающего белка и их смеси. Например, в различных вариантах изобретения нежелательная частица Άβ-связывающего белка представляет собой одну или более цепей антитела или их фрагментов, содержащих последовательность считывания интрона, одну или более цепей антитела или их фрагментов, содержащих некорректную дисульфидную связь, половина антитела или его фрагмент, димер легкой цепи или его фрагмент и димер тяжелой цепи или его фрагмент.

В одном аспекте способы по настоящему изобретению позволяют очищать Άβ-связывающий белок, предпочтительно антитело к Άβ, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, сначала адсорбируя белок на Рс-связывающем агенте (связывая белок с Рс-связывающим агентом), затем промывая Рс-связывающий агент буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, с удалением одной или более примесей, а потом выделяя (извлекая) белок из Рс-связывающего агента. В различных вариантах изобретения стадии адсорбции белка на Рс-связывающем агенте и промывание Рссвязывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, осуществляют при температуре в примерном интервале 2-24°С. В различных вариантах изобретения стадия извлечения белка из Рс-связывающего агента включает элюирование белка буфером для элюции, рН которого равен примерно 2.0-6.5.

В различных вариантах изобретения агент, связывающий область Рс, представляет собой один или более из белка Ά и белка С. В предпочтительном варианте Рс-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе. Эта твердая фаза может представлять собой, например, один или более следующих компонентов: гранулы, агарозную матрицу, диоксид кремния и их смеси.

Соль двухвалентного катиона в буфере, применяемом для промывания Рс-связывающего агента, может представлять собой, например, хаотропную соль. Соли двухвалентного катиона, подходящие для приготовления буферного раствора для промывки, включают, но без ограничения, хлорид магния, хлорид кальция, хлорид никеля и их смеси. В различных вариантах изобретения соли двухвалентных катионов, подходящие для приготовления буферного раствора для промывания, включают, но без ограничения, соли: тиоцианаты (8ΟΝ^-), перхлораты (С1О4^-), нитраты (ΝΟ3^-), хлориды и бромиды двухвалентных катионов II группы (например, магния, кальция, бария и т.д.), двухвалентных переходных металлов катионов (например, меди, никеля, марганца и т.д.) и комбинации этих катионов.

В различных вариантах изобретения рН буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, находится в примерном интервале 4-9, а в некоторых вариантах изобретения в примерном интервале 4-8, в примерном интервале 4.5-7.5 или в примерном интервале 6-8. Предполагается также, что значения и интервалы, входящие в набор интервалов и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, также входят в объем настоящего изобретения. Например, соль двухвалентного катиона имеет рН примерно 7.1-7.9, примерно 7.2-7.9, примерно 7.3-7.7, примерно 7.4-7.6, примерно 4-5, примерно 5-6, примерно 6-7 или примерно 8-9.

- 2 015148

Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, соль двухвалентного катиона имеет рН по меньшей мере около (или около) 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 или 8.

В различных вариантах настоящего изобретения концентрация соли двухвалентного катиона в буферном растворе равна примерно 0.1-5 М, а в некоторых вариантах изобретения примерно 0.5-3 М, примерно 1.0-3 М или примерно 0.6-2.5 М. Например, буферный раствор соли двухвалентного катиона может содержать около 0.6 М СаС1₂, или по меньшей мере около 2 М МдС1₂, или по меньшей мере около 2 М СаС1₂. Предполагается также, что величины и интервалы, входящие в интервалы и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация буферного раствора соли двухвалентного катиона составляет примерно 0.5-0.75 М, примерно 0.5-0.8 М, примерно 0.5-0.9 М, примерно 0.5-1.0 М, примерно 0.5-2.0 М, примерно 1.5-2.0 М, примерно 1.5-2.5 М, примерно 1.5-3.0 М или примерно 2.5-3.0 М.

Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего пределов, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли двухвалентного катиона в буферном растворе равна по меньшей мере примерно (или примерно) 0.6 М, 1 М, 1.5 М, 2 М, 2.5 М или 3 М. В различных вариантах изобретения температура буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, равна около 2-24°С.

В различных вариантах изобретения стадия регенерации антитела из Рс-связывающего агента включает элюцию антитела с применением элюирующего буфера, имеющего рН в интервале около 2.06.5, предпочтительно в интервале около 2.0-4.0, более предпочтительно в интервале около 2.5-3.5. Предполагается, что величины и интервалы, входящие в интервалы и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, входят в объем настоящего изобретения. Например, элюирующий буфер (буфер для элюции) имеет рН около 2-3 или около 3-4.

Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего пределов, входят в объем настоящего изобретения. Например, элюирующий буфер имеет рН по меньшей мере около (или около) 2, 2.5, 3, 3.5 или 4.

В различных вариантах изобретения можно проводить дополнительную стадию очистки регенерированных белков либо до, либо после стадии хроматографии на Рс-связывающем агенте. Например, типичная дополнительная стадия очистки включает, но без ограничения, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла, хроматографию с гидрофобным взаимодействием (Н1С), хроматографию на гидроксиапатите, диализ, аффинную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию и гель-фильтрацию (гель-хроматографию). В различных вариантах изобретения за стадией хроматографии на Рс-связывающем агенте следует стадия анионообменной хроматографии и стадия Н1С. В различных вариантах изобретения после стадий хроматографии следует стадия фильтрации вирусов, стадия ультрафильтрации/диафильтрации и/или стадия фильтрации микробных примесей.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела против Άβ, от содержащего примеси раствора этого белка. В различных вариантах изобретения способы включают, во-первых, адсорбирование белка на Рс-связывающем агенте с последующим промыванием Рс-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующую регенерацию белка из Рс-связывающего агента для получения первого элюированного пула (собранных элюированных фракций).

В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжает ионообменная хроматография первого элюированного пула (пула элюента) при контактировании ионообменной смолы с первым полом элюента таким образом, что целевой белок не адсорбируется смолой, а регенерируется проходящий целевой белок, получают второй элюированный пул. В различных вариантах изобретения стадия ионообменной хроматографии дополнительно включает промывание ионообменной смолы буферным раствором для промывания с целью регенерировать по меньшей мере часть какого-либо адсорбированного целевого белка.

В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжают хроматография с гидрофобным взаимодействием второго пула элюента, адсорбируя целевой белок на смоле с гидрофобным взаимодействием (например, твердая фаза функционализована гидрофобными лигандами), промывание смолы с гидрофобным взаимодействием буферным промывающим раствором с ионной силой, которая позволяет практически не элюировать целевой белок, и регенерация очищенного целевого белка (обычно элюирующим буфером с ионной силой, достаточно низкой, чтобы десорбировать целевой белок со смолы с гидрофобным взаимодействием).

В предпочтительных вариантах различных аспектов изобретения Рс-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе, которую предпочтительно перед контактированием с исходной жидкостью уравновешивают подходящим буфером. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, содер

- 3 015148 жащую агарозу, иммобилизующую Ес-связывающий агент. В различных вариантах изобретения колонку покрывают реагентом, таким как глицерин, для уменьшения или предотвращения неспецифической адгезии к колонке.

В различных вариантах изобретения белки, очищенные методами по настоящему изобретению, можно приготовить в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем и использовать для диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких соединений.

В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела к Άβ, из раствора, содержащего белок и варианты (ΙΒΤ), полученные с использованием интрона с открытой рамкой считывания (считывание интрона). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более вариантов, полученных при считывании интронов, в белковом препарате, например в препарате антитела. В различных вариантах изобретения уровень вариантов белка, полученных при считывании интронов, в белке, регенерированном из Ес-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень вариантов считывания интронов в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения - по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень вариантов считывании интронов в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения варианты, полученные при считывании интронов, составляют менее примерно 1.0, 0.8, 0.5, 0.2 или 0.1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Ессвязывающего агента.

В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела к Άβ, из раствора, содержащего белок и его низкомолекулярные варианты (ΕΜν). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более низкомолекулярных вариантов в белковом препарате, таком как препарат антитела. В различных вариантах изобретения уровень низкомолекулярных вариантов белка в белке, регенерированном из Ес-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень низкомолекулярных вариантов белка в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень низкомолекулярных вариантов в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения низкомолекулярные варианты составляют менее примерно 1.0, 0.8, 0.5, 0.2 или 0.1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Ес-связывающего агента.

В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела к Άβ, из раствора, содержащего белок и его варианты с недостающей дисульфидной связью (υΌΒ). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более вариантов с недостающей дисульфидной связью в белковом препарате, таком как препарат антитела. В различных вариантах изобретения уровень вариантов белка с недостающей дисульфидной связью в белке, регенерированном из Ес-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень вариантов белка с недостающей дисульфидной связью в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения - по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень вариантов с недостающей дисульфидной связью в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения варианты с недостающей дисульфидной связью составляют менее примерно 20, 15, 5, 2 или 1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Ес-связывающего агента.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает Άβ-связывающий белок, предпочтительно антитело к Άβ, очищенное любым из способов, который включает, по меньшей мере, стадии, вопервых, адсорбции белка с Ес-связывающим агентом с последующим промыванием Ес-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей, а затем стадию регенерации белка из Ес-связывающего агента. В различных вариантах изобретения антитело к Άβ является гуманизированным антителом к Αβ, выбранным из группы, состоящей из 3Ό6, 10Ό5, 12В4, 12Ά11, 15С11 и 266. В различных вариантах изобретения антитело к Άβ является гуманизированным антителом к Άβ, выбранным из группы, состоящей из 3Ό6, 10Ό5, 12В4 и 12Ά11.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает систему, пригодную для осуществления любых способов, которые включают, по меньшей мере, во-первых, стадии адсорбции Άβ-связывающего белка, содержащего Ес-область, такого как антитело к Άβ, с Ес-связывающим агентом с последующим промыванием Ес-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей, а затем регенерацию белка из Ес-связывающего агента.

В других аспектах настоящее изобретение предусматривает линию (схему) очистки для осуществления любого из способов, которые включают, по меньшей мере, во-первых, стадии адсорбции Άβсвязывающего белка, такого как антитело к Άβ, с Ес-связывающим агентом с последующим промыванием Ес-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей, а затем регенерацию белка из Ес-связывающего агента.

Также настоящее изобретение предусматривает в различных аспектах наборы для применения при осуществлении одного или более способов по настоящему изобретению. В различных вариантах изобретения набор содержит по меньшей мере один реагент и инструкции по применению набора. Например, набор может содержать один или более реагентов, таких как Ес-связывающий агент, соль двухвалентно- 4 015148 го катиона и реагенты для приготовления буферного промывающего раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, наряду с инструкциями по применению набора, например, для очистки Άβсвязывающего белка, например антитела к Άβ.

Краткое описание чертежа

На фигуре показаны полные аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела к Άβ 3Ό6 версия 2 (1ιι.ι3Ο6.ν2). 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 соответственно. Гипервариабельные области (СЭК) легкой цепи, т.е. СОК1, СЭК2 и СОК3, расположены соответственно в остатках в положениях 24-39, 55-61 и 94-102 (верхняя панель). Гипервариабельные области (СОЯ) тяжелой цепи, т.е. СЭК.1, СЭК2 и СЭК3, расположены соответственно в остатках в положениях 40-44, 50-65 и 99-108 (нижняя панель). Ожидаемые внутримолекулярные дисульфидные связи показаны в виде связей имеющихся дисульфидных остатков. Цистеиновые остатки, предположительно, образующие внутримолекулярные дисульфидные связи, подчеркнуты и связи показаны. Типичный сайт Ν-гликозилирования тяжелой цепи антитела показан курсивом в положениях остатков 299-301 (нижняя панель). Предсказанный С-концевой лизин тяжелой цепи показан в скобках.

Подробное описание изобретения

Для лучшего понимания данного изобретения прежде, чем описывать его подробно, целесообразно дать определения некоторых терминов, используемых в данном описании. Определения, представленные в данном описании, сгруппированы лишь для того, чтобы проще было ссылаться, но не для ограничения.

Определения, относящиеся к белкам.

Настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающих белков, в частности Άβ-связывающих антител. В частности, данное изобретение включает очистку белков, содержащих константные области, в частности белки, имеющие Ге-области (например, антитела), продуцированные в культуре клеток. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβсвязывающего белка, который содержит Гс-область, такого как антитело к Άβ, из раствора, содержащего белок и один или более его вариантов, образующихся при считывании (трансляции), например, вариантов трансляции гена с интронами. В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней частиц одного или более вариантов, полученных трансляцией генов с интронами (ΙΚΤ), в белковом препарате, например в препарате антитела. Выражения вариант, полученный считыванием интрона (вариант со считыванием интрона) и частицы вариантов, полученных считыванием интрона используются взаимозаменяемо в данном описании и относятся к продукту процесса, в котором при синтезе Άβ-связывающего белка элонгация полипептидной цепи заканчивается ранее транскрипции кодирующей области с помощью стоп-кодона в интроне, предшествующем кодирующей области. В результате получают представляющий интерес вариант белка (т.е. вариант со считыванием интрона), в котором имеется один или более неполных доменов или отсутствующие домены. Такие интроны могут содержать более одного стоп-кодона, что приводит к продуцированию нескольких различных вариантов считывания интрона.

Выражение вариант с недостающими дисульфидными связями (вариант с недостающей дисульфидной связью или υΌΒ) относится к любому белку, в котором отсутствует (пропущена, утрачена) по меньшей мере одна дисульфидная связь. Отсутствующая дисульфидная связь может быть либо межцепной дисульфидной связью, либо внутрицепной дисульфидной связью, либо их комбинацией.

Выражение низкомолекулярные частицы, или ЬМ^ частицы, относится к вариантам Άβсвязывающего белка, например антитела к Άβ, включая белок, который состоит из свободной тяжелой цепи, свободной легкой цепи, ΙΚΤ частиц, полумолекулярных и три-четвертимолекулярных частиц или их смесей.

Белок Ά представляет собой белок клеточной стенки протяженностью около 42 кДа, находящийся в большинстве штаммов §1арйу1ососси8 аитеак, который связывается с высокой аффинностью (около 10^-8 М с человеческим 1дС) с Гс-областью антител. Применяемый в данном описании термин белок Ά охватывает белок Ά, регенерированный (извлеченный) из его нативного источника, белок Ά, полученный синтетическими методами (например, пептидным синтезом, методом рекомбинантной ДНК и т.д.), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, содержащие область СН2/СН3.

Белок С представляет собой белок клеточной стенки группы С 81тер1ососсЕ Белок С представляет собой Гс-рецептор типа ΙΙΙ, который с высокой аффинностью связывается с Гс-областью антител, в частности 1дС антител. Термин белок С по данному описанию охватывает белок С, регенерированный (извлеченный) из его нативного источника, белок С, полученный синтетическими методами (например, пептидным синтезом, методом рекомбинантной ДНК и т.д.), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, содержащие область Гс.

Термины β-амилоидный белок, β-амилоидный пептид, β-амилоид, Άβ и Άβ-пептид применяются в данном описании равнозначно (взаимозаменяемо).

Предполагается, что термин Άβ-связывающий белок по данному описанию относится к белку, способному специфически связываться с Άβ-пептидом (пептидами) или эпитопом (эпитопами) внутри указанного (указанных) Άβ-пептида (пептидов) или обладающему заметной аффинностью связывания с

- 5 015148

Αβ. В типичных вариантах изобретения Αβ-связывающий белок содержит область Рс, так что она может связываться с Рс-связывающим агентом в соответствии со способами по изобретению.

Термин антитело, или иммуноглобулин (применяемые в данном описании равнозначно, взаимозаменяемо), относится к антигенсвязывающему белку, имеющему основную структуру из четырех полипептидных цепей, состоящую из двух тяжелых и двух легких цепей, причем указанные цепи стабилизированы, например, межцепными дисульфидными связями, которые обладают способностью специфически связывать антиген. Как тяжелая, так и легкая цепи скручиваются в домены. Термин антитело, или иммуноглобулин, включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные (полной длины) моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, СЭЯ-привитые антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела и одноцепочечные антитела (зсРуз).

Термин моноклональное антитело, или композиция моноклонального антитела, по данному описанию относится к популяции антител, которые содержат только один тип антигенсвязывающего сайта, способного распознавать конкретный эпитоп целевого антигена и связываться с ним, например эпитоп(ы) Ав. Таким образом, композиции моноклонального антитела обычно проявляют единственную специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного антигена, с которым у него осуществляется иммунная реакция. Антитела нечеловеческого происхождения можно гуманизировать методами, описанными, например, в патенте США 5225539. В одном методе СЭЯ нечеловеческого происхожения встраивают в рамку считывания последовательности антитела человека или консенсусной последовательности антитела человека. Затем можно ввести дополнительные изменения в рамку считывания последовательности антитела с целью модулировать аффинность или иммуногенность.

Предполагается, что термин антитело к Ав относится к антителу, обладающему специфичностью связывания с Ав-пептидом человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР). В уровне техники Ав-пептид известен также как бета-амилоидный пептид. Ав-пептид представляет собой внутренний фрагмент размером 4 кДа из 39-43 аминокислот АРР (Ав₃₉, Ав₄₀, Ав₄₁, Ав₄₂ и Ав₄₃ соответственно). Предполагается, что антитело к Ав охватывает антитела, обладающие специфичностью связывания к любой из этих форм Ав-пептида. Представляющие интерес специфические антитела к Ав включают, но без ограничения, 3Ό6, 10Ό5, 12В4, 12А11, 15С11 и 266 и их гуманизированные варианты. Типичные антитела к Ав описаны в патентной заявке США регистрационный № 10/010942, поданной 6 декабря 2001 г. (опубликованная патентная заявка США № 20030165496 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 2002/46237 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/388389, поданной 12 марта 2003 г. (опубликованная патентная заявка США № 20040087777 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 2004/080419 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/388214, поданной 12 марта 2003 г. (опубликованная патентная заявка США № 20040082762 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 2003/077858 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/858855, поданной 1 июня 2004 г. (опубликованная патентная заявка США № 20050118651 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 2004/108895 А2); в патентной заявке США регистрационный № 11/304986, поданной 15 декабря 2005 г.; см. также РСТ/И805/45515; полное содержание всех этих заявок вводится в данное описание в качестве ссылки.

Другие типичные антитела к Ав описаны в патентной заявке США регистрационный № 10/226435, поданной 26 февраля 2001 г. (опубликованная патентная заявка США № 20040043418 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 01/062801 А2), в патентной заявке США регистрационный № 10/487322, поданной 14 августа 2002 г. (опубликованная патентная заявка США № 20040192898 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 03/016466 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/476265, поданной 26 апреля 2002 г. (опубликованная патентная заявка США № 20050090648 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 02/088306 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/497475, поданной 26 апреля 2002 г. (опубликованная патентная заявка США № 20050142131 А1; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 02/088307 А2); в патентной заявке США регистрационный № 10/505313, поданной 20 февраля 2003 г. (опубликованная патентная заявка США № 20050169925; см. также опубликованную патентную заявку РСТ № νθ 03/070760 А2).

Термин фрагмент антитела относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащего меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Фрагменты можно получать также методами рекомбинантной ДНК. Типичные фрагменты включают фрагменты Рай, Рай', Р(ай')₂, Райс и/или Ρν. Методы конструирования Рай фрагментов описаны, например, в Низе, с1 а1. (1989), 8с1еисе 246: 1275-1281). Другие фрагменты антитела можно получать методами, известными в уровне техники, включая, но без ограничения:

(ί) фрагмент Р(ай')₂, получающийся расщеплением (гидролизом) молекулы антитела пепсином; (ίί) фрагмент Рай, образующийся восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента Р(ай')₂;

(ίίί) фрагмент Рай', образующийся при обработке антитела папаином и восстановителем;

(ίν) Ρν фрагменты.

- 6 015148

Термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который(ое) связывает антиген или конкурирует с интактным антителом, из которого они образованы, за специфическое связывание с антигеном.

Термин домен относится к глобулярной области полипептида тяжелой или легкой цепи, содержащей пептидные петли (например, содержащей 3-4 пептидные петли), стабилизированные, например, β-складкой и/или внутрицепной дисульфидной связью. Кроме того, в данном описании домены называют константными или вариабельными на основании относительного отсутствия изменений последовательности внутри доменов различных представителей класса в случае константного домена или значительного изменения внутри доменов членов различных представителей класса в случае вариабельного домена. Константные домены на легкой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют константными областями легкой цепи, константными доменами легкой цепи, СЬ областями или СЬ доменами. Константные домены тяжелой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют константными областями тяжелой цепи, константными доменами тяжелой цепи, СН областями или СН доменами. Вариабельные домены на легкой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют вариабельными областями легкой цепи, вариабельными доменами легкой цепи, УЪ областями или УЪ доменами. Вариабельные домены на тяжелой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют вариабельными областями тяжелой цепи, вариабельными доменами тяжелой цепи, УН областями или УН доменами.

Термин область может также относиться к части (сегменту) или участку цепи антитела или домена цепи антитела (например, к части или участку тяжелой или легкой цепи или к части или участку константного или вариабельного домена по данному описанию), а также к более дискретным частям (сегментам) или участкам указанных цепей или доменов. Например, легкие и тяжелые цепи или вариабельные домены легкой или тяжелой цепи включают гипервариабельные области, или СЭК., рассеянные среди каркасных областей, или РК, по данному описанию.

Термин конформация относится к третичной структуре белка или полипептида, такой, например, как антитело, цепь антитела, его домен или область. Например, выражение конформация легкой (или тяжелой) цепи относится к третичной структуре вариабельной области легкой (или тяжелой) цепи, а выражение конформация антитела или конформация фрагмента антитела относится к третичной структуре антитела или его фрагмента.

Выражение специфическое связывание антитела означает, что антитело проявляет значительную аффинность к конкретному антигену или эпитопу и, как правило, не проявляет заметной кроссреактивности. В типичных примерах антитело не проявляет кросс-реактивности (например, не реагирует перекрестно с не-Ав-пептидами или с отдаленными или дальними эпитопами на Άβ). Значительное (заметное, ощутимое) или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 или 10^-10 М. Более предпочтительна аффинность выше 10^-7 М, предпочтительно выше 10^-8 М. Предполагается, что промежуточные значения в представленной группе также входят в объем настоящего изобретения, а предпочтительная аффинность связывания может быть указана в виде интервала аффинностей, например 10^-6-10^-10 М, предпочтительно 10^-7-10^-10 М, более предпочтительно 10⁸-10^-10 М. Антитело, которое не проявляет заметной кросс-реактивности, представляет собой антитело, которое не связывается в значительной степени с нежелательной частицей (например, нежелательным белком, полипептидом или пептидом). Например, антитело, которое специфически связывается с Άβ, в заметной степени связывает Άβ, но заметно не реагирует с не-Ав-белками или пептидами (например, неΆβ-белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Антитело, специфическое к конкретному эпитопу, не будет в значительной степени перекрестно реагировать с удаленными или отличными эпитопами на том же белке или пептиде. Специфическое связывание можно определить любым принятым в уровне техники методом определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют методом Скетчарда и/или анализами конкурентного связывания.

Под иммуноглобулином или антителом, отличным от биспецифических или бифункциональных иммуноглобулинов или антител, понимают иммуноглобулин или антитело, имеющие идентичные сайты связывания. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелая/легкая цепь и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание РаЬ' фрагментов, см., например, 3οη§5ίνί1αί апб Ьасйтапп, С1т. Ехр. 1ттипо1. 19: 315-321 (1990); Ко81е1пу е! а1., 1. 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992).

Антиген представляет собой соединение (например, белок, полипептид, пептид, углевод или низкомолекулярное соединение (малая молекула)), содержащее антигенную детерминанту, с которой специфически связывается антитело.

Термин эпитоп, или антигенная детерминанта, относится к сайту на антигене, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут быть образованы из соседних аминокислот и несоседних аминокислот, сближающихся за счет фолдинга белка с образованием третичной структуры. Эпитопы, образованные из соседних аминокислот,

- 7 015148 обычно сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, получающиеся при фолдинге белка с образованием третичной структуры, обычно утрачиваются при обработке денатурирующим растворителем. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурный анализ и двумерный ядерный магнитный резонанс, см., например, Ерйоре Марршд Рго1оео18 в Ме11юб8 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 66, С.Е. Моглк, Еб. (1996).

Помимо описанных выше антител к Άβ, другие Άβ-связывающие белки включают слитые белки, содержащие антитело. Выражения слитые белки, включающие антитело и слияние антитела относятся к слитому белку, включающему целое антитело или часть антитела, слитое (слитую) по меньшей мере с частью отличного от антитела белка или с отличным от антитела полипептидом. Слияние обычно осуществляют методами генной инженерии (методами рекомбинантной ДНК). Дополнительные типичные слитые белки, содержащие антитело, включают участок связывания антитела (включая область Ес) с клеточным рецептором, слитый с целым другим растворимым или клеточным биологическим белком или его участком, например с рецептором (клеточным или растворимым) или его участком, цитокином или его частью, ферментом или его участком и т. д. В частности, слитый белок, содержащий антитело, по изобретению может содержать область Ес антитела, слитую с отличным от антитела участком белка или полипептидом, способным связываться с Άβ.

Термин Ес-связывающий агент относится к соединению, способному связываться с областью Ес антитела (например, 1дС антитела), включая, но без ограничения, белок комплемента, Ес-рецептор или бактериальный белок, такой как белок Ά или белок С, обладающий высокой аффинностью к области Ес антитела.

Термин область Ес относится к С-концевой области антитела 1дС, в частности к С-концевой области тяжелой (тяжелых) цепи (цепей) указанного 1дС антитела. Хотя границы области Ес тяжелой цепи могут немного меняться, область Ес обычно определяют как область тяжелой цепи (тяжелых цепей) 1дС от аминокислотного остатка Суз226 до карбоксильного конца.

Определения, относящиеся к хроматографии.

Выражение исходная жидкость по данному описанию относится к жидкости, содержащей по меньшей мере одно целевое вещество, которое хотят очистить от других имеющихся веществ. Исходные жидкости могут быть, например, водными растворами, системами органических растворителей или смеси или растворы водных/органических растворителей. Исходные жидкости часто являются сложными смесями или растворами, содержащими многие биологические соединения (такие как белки, антитела, гормоны и вирусы), малые молекулы (такие как соли, сахара, липиды и т.д.) и даже частицы твердого вещества. Хотя типичная исходная жидкость биологического происхождения может вначале быть в виде водного раствора или суспензии, она может также содержать органические растворители, использовавшиеся на предыдущих стадиях разделения, таких как осаждение растворителем, экстракция и т.д.. Примеры исходных жидкостей, которые могут содержать ценные биологические вещества, подлежащие очистке в различных вариантах настоящего изобретения, но без ограничения, культуральный супернатант, гомогенизированную клеточную суспензию, плазму, фракции плазмы и молоко.

Выражение целевое вещество, или целевой белок, или целевое антитело, в данном описании относится к одному или более заданных Άβ-связывающих белков, например антител к Άβ, которые следует очистить из исходной жидкости. Целевое вещество может находиться в исходной жидкости в виде суспензии или раствора.

Термин примеси относится к материалам в исходной жидкости, отличным от целевого (целевых) вещества (веществ) и, желательно, исключенным из конечного целевого продукта (конечных целевых продуктов). Типичные примеси включают нуклеиновые кислоты, белки (включая продукты считывания интрона, низкомолекулярные частицы и частицы с недостающими дисульфидными связями), пептиды, эндотоксины, вирусы и малые молекулы.

Термин побочный продукт включает нежелательные продукты, которые снижают или уменьшают долю терапевтического белка по изобретению.

Выражение высокомолекулярные продукты относится к комплексам белков, молекулярная масса которых выше, чем у заданного белка по изобретению. В случае антитела, например 1дС антитела, такие агрегаты по размеру больше примерно 150 кДа.

Выражение низкомолекулярные продукты относится к белкам, например продуктам разложения, молекулярная масса которых меньше молекулярной массы заданного белка по изобретению. В случае антитела, например 1дС антитела, такие агрегаты по размеру меньше примерно 150 кДа.

Применяемый в данном описании термин твердая фаза относится к неводной матрице, с которой целевое вещество взаимодействует в процессе очистки или к (с) которой может присоединяться (связываться) Ес-связывающий агент. Подходящие твердофазные материалы включают, но без ограничения, стекло, диоксид кремния (например, силикагель), полисахариды (например, полисахаридная матрица), такие как агароза и целлюлоза, органические полимеры, такие как полиакриламид, метилметакрилат и

- 8 015148 сополимеры полистирол-дивинилбензол, например, такие как смола АтЬегШе™ (выпускаемая фирмой Войт аиб Наак СНет1са1 Со., РЫ1айе1рЫа, Ра.). Твердую фазу можно выбирать из любой группы смол, обычно описываемых как аффинные, ионообменные и захватывающие ионы смолы; твердая фаза, например колонка для очистки, дисперсная фаза из дискретных частиц или их комбинация. Твердая фаза может быть пористой или непористой и может быть прессованной или непрессованной. В различных вариантах изобретения твердая фаза представляет собой полимерную матрицу или агарозные частицы или бусы (гранулы). В различных вариантах изобретения твердая фаза может быть покрыта реагентом (таким как глицерин), например, для предупреждения неспецифической адгезии примесей к твердой фазе. Необходимо, чтобы Рс-связывающая твердая фаза имела химические группы или ассоциированный лиганд, которые позволяли бы Рс-связывающему агенту связываться с поверхностью твердой фазы. Предпочтительные твердофазные материалы должны быть физически и химически устойчивы к условиям процесса очистки, включая вакуумирование и фильтрацию в поперечном потоке, и температурам, рН и другим характеристикам используемых жидкостей.

Аффинный лиганд относится к частице, которая связывается селективно или предпочтительно с компонентом исходной жидкости за счет специфического взаимодействия с сайтом связывания компонента. В данном изобретении аффинный лиганд (например, Рс-связывающий агент) обычно иммобилизован на твердой фазе, такой как смола. Примеры аффинных лигандов, которые могут связываться с полимерной подложкой с образованием хроматографических смол, применимых в способе по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, белок А, белок П и их аналоги, которые селективно связываются с областью Рс белка. Методы связывания аффинных лигандов с материалами твердой подложки хорошо известны в области очистки, см., например, ΑΓΓίπίΙν Зерагайопк: А Ргасйса1 АрргоасН (Ргасйса1 АрргоасН Зейек), Раи1 МаЮрксНнк (Еййог), 1г1 Рг: 1997; ΑΓΓίπίΙν СкготаЮргарку. НегЬеП ЗсНо!!, Магсе1 Оеккег, Ыете Уогк: 1997.

Смола для аффинной хроматографии, или аффинная смола, относится к хроматографической смоле, которая представляет собой твердую фазу или субстрат (подложку, носитель), с поверхностью которых связаны аффинные лиганды.

Смола для ионообменной хроматографии, или ионообменная смола, относится к твердому носителю (подложке), с которым ковалентной связью связаны лиганды, несущие положительный или отрицательный заряд, и, следовательно, содержащему свободные противоионы, способные обмениваться с ионами в растворе, с которым контактирует ионообменная смола.

Термин катионообменные смолы относится к ионообменной смоле с ковалентно связанными отрицательно заряженными лигандами и, следовательно, содержащей свободные катионы в растворе, с которым контактирует смола. В уровне техники известен большой ряд катионообменных смол, например, таких, в которых связанные ковалентной связью группы представляют собой карбоксилат или сульфонат. Выпускаемые промышленно катионообменные смолы включают СМС-целлюлозу, ЗРЗерйайех™ (Сефадекс) и Рак! Р1о\\- З-ЗерНагоке™ (Сефарозу) (последние две выпускаются фирмой РНагтас1а).

Термин анионообменные смолы относится к ионообменной смоле с ковалентно связанными положительно заряженными группами, такими как четвертичные аминогруппы. Продажные анионообменные смолы включают ΌΕΑΕ целлюлозу, ТМАЕ, САЕ ЗерНабех™ и Рак! Р1о\у С-ЗерНагоке™ (последние две выпускаются фирмой РНагтааа).

Применяемое в данном описании выражение хаотропная соль относится к соли, которая содержит один или более ионных компонентов, расположенных внизу лиотропного ряда, которые способны проникать через гидратирующую оболочку белка и связываться непосредственно с их поверхностью. Это разрушает ассоциацию за счет согидратации, способствуя солюбилизации белка. Примеры хаотропных солей включают, но без ограничения, галоидные соли элементов II группы (например, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид бария, бромид кальция, бромид магния, бромид бария, йодид кальция, йодид магния, йодид бария).

Примеры подходящих солей двухвалентных катионов включают, но без ограничения, соли Мп²⁺, Νί²⁺ или Си²⁺, Мд²⁺, Са²⁺ и Ва²⁺ с тиоцианатом (ЗСЫ^-), перхлоратом (С1О4^-), нитратом (ΝΟ3^-), хлоридом (С1^-) и бромидом (Вг^-) в качестве анионов и их комбинации.

В некоторых вариантах изобретения соли двухвалентных катионов содержат двухвалентный катион (например, Мп²⁺, Са²⁺, Νί²⁺ или Ва²⁺). Предпочтительными хаотропными солями в указанных процессах являются МдС1₂, Νίί,'Η и СаС1₂. После стадии солью двухвалентного катиона целевой белок элюируют с аффинной хроматографической матрицы.

Буфер представляет собой вещество, которое, присутствуя в растворе, повышает количество кислоты или щелочи, которое следует добавить для того, чтобы вызвать изменение единиц рН. Буферный раствор устойчив к изменениям рН, действуя как сопряженная система кислота-основание. Буферные растворы для применения с биологическими реагентами обычно способны поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода, так что величина рН раствора находится в биологическом интервале.

Термин физиологический (физиологическое значение) рН относится к рН крови млекопитающих

- 9 015148 (т.е. 7.38 или около 7.4). Таким образом, интервал физиологического рН составляет примерно 7.2-7.6. Традиционные компоненты буфера включают, но без ограничения, органические и неорганические соли, кислоты и основания. Типичные буферы, применяемые для очистки биологических молекул (например, белковых молекул), включают цвиттерионные буферы или буферы Гуда, см., например, Соой с1 а1. (1966), Вюс11сш151гу 5: 467 и Соой аий Ιζα\να (1972), Мс11юЙ5 Епхуто1. 24: 62. Примеры буферов включают, но без ограничения, ТЕБ, МЕБ, Р1РЕ8, НЕРЕ8, МОР8, МОР8О, ΤΚΙΟΝΕ и ΒΙΕΊΝΕ.

Уравновешивающий буфер по данному описанию представляет собой буфер, используемый для подготовки Рс-связывающего реагента, твердой фазы, или того и другого к нанесению (нагрузке) исходной жидкости, содержащей целевой белок. Уравновешивающий буфер предпочтительно является изотоническим и обычно имеет рН в примерном интервале 6-8. Буфер для загрузки (буфер для нанесения образца, лодинг-буфер) представляет собой буфер, который используют для нанесения исходной жидкости, содержащей Άβ-связывающий белок, например антитело к Άβ, и примеси, на твердую фазу, на которой иммобилизован Рс-связывающий агент. Часто уравновешивающий и лодинг-буфер представляют собой один и тот же буфер. Буфер для элюции используют для элюции Άβ-связывающего белка с иммобилизованного Рс-связывающего агента. Предпочтительно буфер для элюции имеет низкий рН и поэтому нарушает взаимодействие между Рс-связывающим агентом и интересующим белком. Предпочтительно буфер для элюции с низким рН имеет рН в примерном интервале 2-5, наиболее предпочтительно в примерном интервале 3-4. Примеры буферов, которые регулируют рН в этом интервале, включают глициновый, фосфатный, ацетатный, нитратный и аммонийный буферы, а также их комбинации. Предпочтительными такими буферами являются цитратный и ацетатный буферы, наиболее предпочтительно натрий-цитратный или натрий-ацетатный буферы. Рассматриваются другие буферы для элюции, включая буферы с высоким рН (например, буферы с рН 9 или выше) и буферы, содержащие соединение или состав, такие как МдС1₂ (2 мМ), для элюции представляющего интерес белка.

Жидкость для промывания (промывающая жидкость), или буфер для промывания, по данному описанию относится к жидкости, используемой для вымывания примесей с хроматографической смолы, с которой связано целевое вещество. Можно последовательно использовать более одной жидкости для промывания, например последовательно промывать жидкостями с изменяющимися свойствами, такими как рН, проводимость, концентрация растворителя и т.д., предназначенными для отделения (диссоциации) и удаления различных типов примесей, которые неспецифически ассоциированы с хроматографической смолой.

Жидкость для элюции (элюирующая жидкость), или буфер для элюции (элюирующий буфер), по данному описанию относится к жидкости, которую используют для отделения целевого вещества от хроматографической смолы после того, как оно было промыто одной или более жидкостью для промывания. Элюирующая жидкость отделяет (выделяет) целевое вещество, но не вызывает необратимой денатурации. Типичные элюирующие жидкости хорошо известны в хроматографии и могут содержать повышенные концентрации солей, свободных аффинных лигандов или аналогов или других веществ, которые стимулируют выделение целевого вещества из хроматографической смолы.

Выражение условия элюции относится к условиям процесса, соблюдаемым на связанной с целевым веществом хроматографической смоле, которые способствуют выделению целевого вещества из хроматографической смолы, таким как контактирование связанной с целевым веществом хроматографической смолы элюирующей жидкостью или элюирующим буфером, вызывая такое выделение (разделение, отделение).

Термин очищающая (смывающая) жидкость (жидкость для очистки), или очищающий (смывающий) буфер (буфер для очистки), по данному описанию относится к жидкости, которую используют для промывания хроматографической смолы после завершения процесса очистки. Смывающая жидкость может содержать детергент, агент, инактивирующий вирусы и относительно высокие концентрации солей и может иметь рН выше или ниже, чем жидкости, используемые в процессе очистки. Они предназначены для очистки хроматографической резины от примесей, чтобы сделать ее пригодной для повторного применения. Типичные смывающие (очищающие) жидкости хорошо известны в хроматографии.

Жидкость для хранения, или буфер для хранения, по данному описанию относится к жидкости, в которой хроматографическая смола хранится в суспендированном виде между применениями. Жидкости для хранения, помимо ионов буфера, могут содержать бактерицидные вещества или другие консерванты. Такие жидкости для хранения хорошо известны в хроматографии.

В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела к Άβ, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, с помощью адсорбции белка на Рс-связывающем агенте с последующим промыванием Рссвязывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей и регенерацией (выделением) белка из Рс-связывающего агента. Подходящие Рс-связывающие агенты включают, но без ограничения, белок Ά и белок С.

Настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβ-связывающих белков, в частности

- 10 015148 антител к Αβ. Типичные процессы очистки включают стадию аффинной хроматографии. Процесс на стадии аффинной хроматографии может быть непрерывным, дискретным или их комбинацией. Например, стадию аффинной хроматографии можно осуществлять в виде дискретного процесса, такого, например, как периодический процесс. Аффинная хроматография представляет собой процесс биоселективной адсорбции и последующей регенерации целевого соединения с иммобилизованного лиганда. Этот процесс способствует высокоспецифической и высокоэффективной очистке целевого соединения. Процесс требует применения подходящего селективного лиганда (например, Рс-связывающего агента), который связывается с целевым соединением (например, антителом к Ав) с константой диссоциации, как правило, в интервале 10^-4-10^-8 и в то же время позволяет проводить регенерацию в мягких условиях. Лиганд обычно иммобилизуется на гранулированной и пористой матрице, которая может быть в виде упаковки (насадки) колонки или среды для периодической адсорбции.

Предпочтительным связывающим агентом является белок А. Белок А связывается с Рс-областью иммуноглобулинов. Белок А состоит из шести областей, пять из которых связывают 1дО. Он связывается с высокой аффинностью с человеческим 1дО_ь 1дС₂ и 1дО₄, а также мышиным 1дО_2а, 1дО_2Ь и 1дО₃. Белок А связывается с умеренной аффинностью с человеческим Ι§ϋ, 1дМ, 1дА и 1дЕ, а также с мышиным 1дО₁. В качестве аффинного лиганда белок А иммобилизуется на матрице таким образом, что эти области остаются свободными для связывания. Одна молекула иммобилизованного белка А может связывать по меньшей мере две молекулы 1дО. Нативный и рекомбинантный варианты белка А проявляют сходную специфичность к Рс-области 1дО. Можно создать рекомбинантный белок А (г-протеин А, г-белок А), который включает, например, С-концевой цистеиновый остаток и может иммобилизоваться за счет тиоэфирного связывания с твердофазной матрицей. Такое соединение дает в результате повышенную способность к связыванию белка А.

Альтернативным связывающим агентом является белок О. Белок О является специфическим к 1дО, связываясь с высокой аффинностью с человеческим 1дС₁, 1дО₂, 1дС₃ и 1дО₄, а также мышиным 1дО₁ и 1дС₃. Белок О РЬи8 проявляет умеренную аффинность к человеческому 1дО₄ и к мышиному 1дО_2а, 1дО_2Ь и 1дО₃. Можно создать рекомбинантный белок О (г-протеин О, г-белок О), в котором удалена альбуминсвязывающая область нативного белка. Рекомбинантный белок О содержит две Рс-связывающие области.

Альтернативным связывающим агентом является белок А/О. Белок А/О представляет собой полученный методами генной инженерии (методами рекомбинантной ДНК) белок, который объединяет профили связывания с 1дО как белка А, так и белка О. Он представляет собой продукт слияния генов, секретируемый при использовании непатогенной формы ВасШик. Белок А/О содержит четыре Рссвязывающих домена из белка А и два из белка О. Белок А/О не столь зависим от рН, как протеин А, но в остальном обладает аддитивными свойствами белка А и О.

Белок А/О связывается со всеми подклассами 1дО человека, в особенности пригоден для очистки поликлональных или моноклональных 1дО антител, подклассы которых не определены. Кроме того, он связывается с 1дА, 1дЕ, 1дМ и (в меньшей степени) с 1дЭ. Белок А/О также хорошо связывается со всеми подклассами мышиного 1дО, в особенности пригоден для очистки мышиных моноклональных антител 1дО подклассов, без вмешательства 1дА, 1дМ и мышиного сывороточного альбумина (см., например, 81ккета. (1989), Атег. Вю1есй. ЬаЬ 7, 42). Отдельные подклассы мышиных моноклональных антител могут проявлять более высокую аффинность к химерному белку А/О, чем к белку А или к белку О (см., например, Ейаккои с1 а1. (1988), 1. Вю1. Сйет. 263, 4323-4327.)

В настоящем изобретении иммобилизованный Рс-связывающий агент (например, белок А) промывают раствором соли двухвалентного катиона для удаления примесей. В частности, было найдено, что нежелательные примеси, получающиеся в методах экспрессии рекомбинантного антитела, можно удалять, используя стадию промывания солью двухвалентного катиона.

Способы по настоящему изобретению могут, необязательно, включать стадии очистки после аффинной хроматографии и стадии промывания солями двухвалентных катионов. Последующие стадии очистки могут включать стадию ионообменной хроматографии и/или стадию хроматографии с гидрофобным взаимодействием (Н1С). Последующие стадии хроматографии могут быть непрерывными, прерывными (например, в виде периодического процесса) или сочетанием этих стадий. В процессе ионообменной хроматографии разделение соединений (молекул) основано на разнице общего заряда белков. Целевой белок может иметь заряд, противоположный заряду функциональной группы, соединенной со смолой для связывания. Например, антитела, которые обычно имеют общий положительный заряд, хорошо связываются с катионообменными смолами, которые содержат отрицательно заряженные функциональные группы. Так как это взаимодействие является ионным, связывание должно происходить в условиях низкой ионной силы. Элюция происходит при повышении ионной силы за счет нарушения ионного взаимодействия или при изменении рН белка. В то время как извлечение белков ионообменной хроматографией происходит за счет их зарядов, в хроматографии с гидрофобным взаимодействием используются гидрофобные свойства некоторых белков. Гидрофобные группы на белке связываются с гидрофильными группами на колонке. Чем более гидрофобным является белок, тем сильнее он связывается

- 11 015148 с колонкой. На стадии Н1С удаляются, например, примеси из клеток-хозяев (например, ДНК и другие высоко- и низкомолекулярные компоненты, имеющие отношение к продукту). Дополнительные стадии очистки могут включать стадии удаления вирусов, а также стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации по данному описанию.

В различных вариантах изобретения белок, содержащий область Ес, представляет собой антитело или содержащий антитело слитый белок, имеющий область Ес, которая связывается с Ес-рецептором Ессвязывающего агента. Применение буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, для промывания Ес-связывающего агента позволяет лучше удалять примеси, такие, например, как варианты считывания интронов и фрагменты, содержащие константную область (включая ΕΜν и υΌΒ частицы), представляющего интерес белка (например, целевого вещества в исходной жидкости).

Способы по настоящему изобретению включают одну или более стадий хроматографического разделения и, кроме того, могут содержать одну или более стадий фильтрации для отделения Άβсвязывающего белка (целевого белка) от примесей в исходной жидкости.

Например, исходную жидкость можно фильтровать, центрифугировать или обрабатывать другим способом для удаления дисперсного осадка (дебриса) и т.п. до контактирования исходной жидкости с Ессвязывающим агентом. Например, используя методы рекомбинантной ДНК, белки можно продуцировать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или секретировать непосредственно в культуральную среду. Если белок продуцируют внутриклеточно, осадок макрочастиц (дисперсный осадок), либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов можно удалять, например, центрифугированием либо ультрафильтрацией. Если белок секретируется в среду, рекомбинантные клетки-хозяева можно отделять от клеточной культуральной среды, например, тангенциальной фильтрацией.

В различных вариантах изобретения исходная жидкость, содержащая целевой белок, контактирует с Ес-связывающим агентом (предпочтительно иммобилизованным на твердой фазе и уравновешенным подходящим буфером) таким образом, что целевой белок адсорбируется на Ес-связывающем агенте (например, иммобилизованном Ес-связывающем агенте). Исходная жидкость контактирует с Ессвязывающим агентом (например, с иммобилизованным Ес-связывающим агентом) в лодинг-буфере (буфере для нанесения вещества), который может быть тем же самым, что и уравновешивающий буфер. Содержащая примеси исходная жидкость течет через твердую фазу, целевой белок адсорбируется на Ессвязывающем агенте, а различные примеси (такие как белки клеток-хозяев, если целевой белок продуцируют в рекомбинантной клетке-хозяине, или другие образующиеся в процессе примеси) проходят через твердую фазу или неспецифически связываются с ней. В различных вариантах изобретения Ессвязывающим агентом является белок Ά, а уравновешивающий буфер содержит 20 мМ Трис, 0.15 М ЫаС1, рН 7.5. Другие подходящие уравновешивающие буферы включают, например, ΒΙ8, НЕРЕЗ и т.д. в физиологических концентрациях, концентрациях в примерном интервале 0.5-100 мМ (например, 10, 20, 50 мМ и т.д.) и физиологических концентрациях солей (например, около 0.15 мМ ЫаС1) при рН 5.0-9.0.

Твердой фазой, на которой иммобилизуется Ес-связывающий агент, предпочтительно являются гранулы или макрочастицы агарозы (например, сефарозы). В различных вариантах изобретения колонку покрывают реагентом, таким как глицерин, для уменьшения или предупреждения неспецифической адгезии к колонке. В различных вариантах изобретения Ес-связывающим агентом является белок Ά. Колонка гтр РгоЮт Α Зерйатоке™ Еак! Е1оте (ЕЕ), выпускаемая АтегкЕат Вюкаепсек, представляет собой пример подходящей колонки с белком Ά для применения в указанных методах.

Затем Ес-связывающий агент промывают буферным промывающим раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления вариантов белка, связанных с твердой фазой или с Ессвязывающим агентом. В частности, было найдено, что промывание солью двухвалентного катиона может удалить значительное количество нежелательных примесей. Конкретно, было найдено, что варианты считывания интрона, низкомолекулярные варианты и варианты с недостающими дисульфидными связями антитела к Άβ можно удалить, промывая солью двухвалентного катиона. Кроме того, белки клеткихозяина (НСР) и ДНК также можно удалить, промывая солью двухвалентного катиона. Примеры подходящих хаотропных солей включают, но без ограничения, хлорид кальция (СаС1₂), хлорид никеля (Νίί,Ί) и хлорид магния (МдС1₂). Хотя в растворе для промывания может присутствовать одна соль двухвалентного катиона, в различных вариантах изобретения можно использовать две или более соли двухвалентных катионов.

В различных вариантах изобретения для удаления примесей, помимо промывающего раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, применяют другой промывающий раствор. Например, в различных вариантах изобретения для промывания Ес-связывающего агента до, после или и до и после промывания Ес-связывающего агента промывающим раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, применяют раствор, содержащий 20-50 мМ Трис, 0.75-2.0 М ЫаС1, рН 5.0-9.0, и/или раствор, содержащий 10 мМ Трис, рН 7.5.

В различных вариантах изобретения соль двухвалентного катиона предпочтительно добавляют в концентрации около 0.5-2.5 М к буферному раствору с рН в примерном интервале 5-9 и предпочтительно с рН в примерном интервале 7-8. Предпочтительные концентрации соли двухвалентного катиона вклю

- 12 015148 чают, но без ограничения, 0.6, 2.0 и 2.5 М. Подходящие для этой цели буферные растворы включают, но без ограничения, Трис или ацетатные буферы в концентрации 20-50 мМ.

После стадии (стадий) промывания целевой белок регенерируют из Рс-связывающего агента. Обычно это осуществляют с помощью буфера для элюции. Целевой белок можно, например, элюировать с колонки буфером для элюции, имеющим низкий рН, например в интервале около 2-6.5 или предпочтительно в интервале около 2.5-3.5.

В различных вариантах изобретения выделенный при этом целевой белок можно приготовить в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем и использовать для различных диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких соединений.

В различных вариантах изобретения препарат элюированного целевого белка можно пустить на стадии дополнительной очистки после стадии хроматографии на Рс-связывающем агенте. Например, типичные стадии дополнительной очистки включают, но без ограничения, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием (Н1С), хроматографию на гидроксиапатите, диализ, аффинную хроматографию (включая аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом), эксклюзионную хроматографию по размеру (8ЕС), осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию и гель-фильтрацию (гель-хроматографию). В различных вариантах изобретения за стадией хроматографии на Рс-связывающем агенте следует стадия анионообменной хроматографии и стадия Н1С. В различных вариантах изобретения после стадий хроматографии далее следует стадия фильтрации вирусов, стадия ультрафильтрации/диафильтрации и/или стадия фильтрации микробных примесей. В различных вариантах изобретения эти стадии дополнительной очистки можно проводить до стадии хроматографии на Рс-связывающем агенте.

В различных вариантах изобретения способы очистки Άβ-связывающего белка, предпочтительно антитела к Αβ, начинаются с адсорбирования целевого белка на Рс-связывающем агенте, содержащем белок Ά, иммобилизованный на твердой фазе, с последующим промыванием Рс-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей и дальнейшей регенерацией (выделением) белка из белка Ά с образованием первого элюированного пула.

В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжается анионообменной хроматографией первого элюированного пула при контактировании анионообменной смолы с первым элюированным пулом, так что примеси адсорбируются смолой, тогда как целевой белок не адсорбируется смолой. Таким образом, целевой белок можно регенерировать из потока, получая второй элюированный пул. В различных вариантах изобретения стадия анионообменной хроматографии включает далее промывание анионообменной смолы буферным промывающим раствором для регенерации по меньшей мере части адсорбированного целевого белка, который затем объединяют со вторым элюированным пулом. Или же первый элюированный пул может контактировать с анионообменной смолой таким образом, что адсорбируется антитело, а любые примеси проходят через смолу, а затем, необязательно, смолу промывают и элюируют адсорбированное антитело.

В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжает Н1С второго элюированного пула (собранных фракций): адсорбция целевого белка на смоле с гидрофобным взаимодействием (например, твердой фазе, функционализованной гидрофобными лигандами), промывание смолы с гидрофобным взаимодействием буферным раствором для промывания с ионной силой, которая не позволяет элюировать целевой белок в значительной степени, и регенерация целевого белка (обычно с применением буфера для элюции с достаточно низкой ионной силой для того, чтобы десорбировать целевой белок со смолы с гидрофобным взаимодействием) в третьем элюированном пуле. Или же второй элюированный пул может контактировать с Н1С колонкой таким образом, что целевой белок не адсорбируется, выделяя проходящий целевой белок в виде третьего элюированного пула.

В различных вариантах изобретения процесс очистки включает одну или более стадий фильтрации, например, для удаления вирусов, концентрирования и забуферивания раствора, содержащего целевой белок, и для удаления микробных загрязнений.

В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Άβсвязывающего белка, предпочтительно антитела к Άβ, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, где примеси содержат один или более ШТ вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней ШТ вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни ШТ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни ШТ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз. Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 3-5% ШТ вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц ШТ вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%.

В различных вариантах изобретения содержание ШТ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание ШТ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3,

- 13 015148 менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости.

В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Αβсвязывающего белка, предпочтительно антитела к Ав, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, при этом примеси содержат один или более ЬМ^ вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней ЬМ^ вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни ЬМ^ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни ЬМ^ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз. Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 3-5% ЬМ^ вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц ЬМ^ вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%. В различных вариантах изобретения содержание ЬМ^ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание ЬМ^ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости.

В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Авсвязывающего белка, предпочтительно антитела к Ав, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, где примеси содержат один или более иЛВ вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней иЛВ вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни иЛВ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни иЛВ вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз.

Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 20% иЛВ вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц иЛВ вариантов антитела можно понизить примерно до 10-2%. В различных вариантах изобретения содержание иЛВ вариантов снижается до менее 20, менее 15, менее 10, менее 5, менее 2 и/или менее 1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание иЛВ вариантов снижается до менее 20, менее 15, менее 10, менее 5, менее 2 и/или менее 1% от общего количества компонентов в исходной жидкости.

Также, например, в исходной жидкости (начальном образце), содержащей около 3-5% иЛВ вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц иЛВ вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%. В различных вариантах изобретения содержание иЛВ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание иЛВ вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости.

Αβ-связывающие белки для применения в способах очистки по изобретению.

Ав-связывающие белки, например антитела к Ав, подлежащие очистке по описываемому изобретению, можно приготовить общепринятыми в уровне техники методами, которые включают, например, синтетические методы (такие как методы рекомбинантной ДНК и пептидный синтез или сочетание этих методов) или их можно выделять из эндогенного источника белка. В различных вариантах изобретения антитело может представлять собой, например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. Методы получения антител подробнее описаны ниже. В других вариантах изобретения Ав-связывающий белок может представлять собой антителосодержащий слитый белок, который включает область Ес антитела, слитую с участком белка или полипептида, способного связываться с Ав. Подробнее получение антителосодержащих слитых белков также описано ниже.

Поликлональные антитела.

Поликлональные антитела можно получать иммунизацией подходящего субъекта иммуногеном. Мониторинг титра антитела у иммунизированного субъекта во времени можно проводить традиционными методами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), используя иммобилизованный целевой антиген.

При желании, антитела к целевому антигену можно выделять из млекопитающего (например, из крови) и очищать далее общеизвестными методами, такими как хроматография на белок А-сефарозе, для получения фракции антитела, например 1дС. В соответствующее время после иммунизации, например, когда титры антитела к антигену наиболее высоки, у субъекта можно взять антителопродуцирующие клетки и использовать их для приготовления моноклональных антител традиционными методами, такими как метод гибридом (впервые описанный КоЫет апб МЙ51с1п (1975), Ыа!иге 256: 495-497; см. также Вго\уп е! а1. (1981), 1. 1ттипо1. 127: 539-46; Вго\\'п е! а1. (1980), 1. Вю1. СЬет. 255: 4980-83; Уе11 е! а1. (1976), Ргос. Ыаб. Асаб. δα. и8А 76: 2927-31; Уей е! а1. (1982), 1п!. 1. Сапсег 29: 269-75). О получении химерных поликлональных антител см. ВиесЫет е! а1., патент США № 6420113.

Моноклональные антитела.

Для получения моноклонального антитела можно применять любые общеизвестные протоколы

- 14 015148 слияния лимфоцитов и иммортализованных линий клеток (см., например, С. Сайте е! а1. (1977), №!иге 266: 55052; Сейет е! а1., 8ошайс Се11 Сепе!., см. выше; Ьегиег, Уа1е ί. Вю1. Меб., см. выше; Кеппебг Мопос1опа1 Ли!1Ьоб1е8, см. выше). Помимо этого, рядовой специалист в данной области техники понимает, что существует множество вариантов таких методов, которые также применимы. Обычно бессмертные линии клеток (например, линия клеток миеломы) взяты из того же вида млекопитающих, что и лимфоциты. Например, мышиные гибридомы можно получать слиянием лимфоцитов мышей, иммунизированных иммуногенным препаратом по настоящему изобретению, линией иммортализованных клеток мышей. Предпочтительными бессмертными линиями клеток являются линии клеток мышиной миеломы, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ΗΑΤ). Любую из множества миеломных клеточных линий можно использовать в качестве партнера для слияния традиционными методами, например линии клеток миеломы Ρ3-Ν81/1-Α§4-1, Р3-х63Ад8.653 или δρ2/0-Α§14. Миеломные линии клеток получают от ЛТСС. Обычно ΗΑΤ-чувствительные клетки мышиной миеломы сливают с мышиными спленоцитами с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ, РЕС). Затем клетки гибридомы, образующиеся в результате слияния, отбирают, используя среду ΗΑΤ, которая убивает неслитые и непродуктивно слитые клетки миеломы (неслитые спленоциты погибают через несколько дней, так как они не трансформируются). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело по изобретению, детектируют скринингом супернатантов гибридомных культур на антитела, которые связывают целевой антиген, с применением метода ΕΟδΑ.

Рекомбинантные антитела.

В качестве альтернативы получению гибридом, секретирующих моноклональное антитело, моноклональное антитело можно идентифицировать и выделять скринингом комбинаторной библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов (например, библиотеки антител в формате фагового дисплея) с помощью целевого антигена, выделяя при этом представителей библиотеки иммуноглобулинов, которые связывают целевой антиген. Наборы для генерации и скрининга библиотек антител в формате фагового дисплея выпускаются промышленностью (например, система Рйаттааа КесотЬтап! РНаде Αи!^Ьобу 8у§!ет, Са!а1од №. 27-9400-01; и набор 8!га!адепе δωίΖΑΡ™ Рйаде Э|8р1ау Кб, Са!а1од №. 240612). Кроме того, примеры методов и реагентов, особенно пригодных для генерации и скрининга библиотеки антител в формате фагового дисплея, можно найти, например, в Ьабпет е! а1., патент СШΆ № 5223409; Капд е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № XVО 92/18619; Эо\\'ег е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 91/17271; V^и!е^ е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 92/20791; Магк1апб е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 92/15679; Втей1тд е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 93/01288; МсСаГГег!у е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 92/01047; Саггагб е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 92/09690; Ьабпет е! а1., Международная опубликованная заявка РСТ № ν0 90/02809; Гисйк е! а1. (1991), Β^о/Τесйио1о§у 9: 1370-1372; Нау е! а1. (1992), Нит. Αи!^Ьоб. НуЬйботак 3: 81-85; Нике е! а1. (1989), 8с1епсе 246: 1275-1281; Сййййк е! а1. (1993), ЕМВ0 I. 12: 725-734; Наиктк е! а1. (1992), I. Мо1. Вю1. 226: 889-896; С1агккоп е! а1. (1991), №!иге 352: 624-628; Сгат е! а1. (1992), Ргос. N811. Αсаб. 8с1. υδΑ 89: 3576-3580; Саггаб е! а1. (1991), Β^о/Τесйио1о§у 9: 1373-1377; НоодепЬоот е! а1. (1991), №с. Α№. Кек. 19: 4133-4137; ВагЬак е! а1. (1991), Ргос. №!1. Αсаб. 8ск υδΑ 88: 7978-7982; МсСаГГейу е! а1., №!иге (1990) 348: 552-554.

Химерные и гуманизированные антитела.

Помимо этого, в объем изобретения входят рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие участки как человеческого, так и нечеловеческого происхождения, которые можно получать стандартными методами рекомбинантной ДНК.

Термин гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину или к антителу, которое включает по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термин гуманизированная цепь иммуноглобулина или гуманизированная цепь антитела (т.е. гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина или гуманизированная тяжелая цепь антитела) относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к легкой или тяжелой цепи соответственно), содержащей вариабельную область, которая включает вариабельную каркасную область главным образом человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области (СЭК) (например, по меньшей мере одну СЭК, предпочтительно две СЭК, более предпочтительно три СЭК) иммуноглобулина или антитела в основном нечеловеческого происхождения и, кроме того, включает константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее участок в случае легкой цепи и три константные области в случае тяжелой цепи). Термин гуманизированная вариабельная область (например, в основном гуманизированная вариабельная область легкой цепи или гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи) относится к вариабельной области, которая включает вариабельную каркасную область в основном человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области (СЭК) иммуноглобулина или антитела в основном нечеловеческого происхождения.

Выражение в основном (главным образом, практически) человеческого иммуноглобулина или антитела или в основном (главным образом, практически) человеческий означает, что при выравнивании

- 15 015148 с аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела с целью сравнения наблюдается идентичность (т.е. локальная идентичность последовательностей) последовательности области с последовательностью человеческой каркасной или константной области по меньшей мере 8090, 90-95 или 95-99%, допуская, например, консервативные замены, замены в консенсусной последовательности, замены в зародышевой линии, обратные мутации и т.п. Введение консервативных замен, обратных мутаций и т.п. часто называют оптимизацией гуманизированного антитела или цепи. Выражение иммуноглобулина или антитела в основном (главным образом, практически) нечеловеческого происхождения или практически нечеловеческий означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности нечеловеческого организма, например млекопитающего, отличного от человека.

Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, или цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, за исключением СОЯ, практически идентичны (имеют значительную степень идентичности) соответствующим областям или остаткам одной или более нативных человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. Термин соответствующая область или соответствующий остаток относится к области или остатку на второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая занимает то же (или эквивалентное) положение, что и область или остаток на первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда в целях сравнения оптимально выравнивают первую и вторую последовательности.

Термин значительная степень идентичности (значительная идентичность) означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ САР или ВЕ8ТПТ с применением по умолчанию средневзвешенных гэпов, идентичны по меньшей мере на 50-60% (степень идентичности 50-60%), предпочтительно по меньшей мере на 60-70%, более предпочтительно по меньшей мере на 70-80%, более предпочтительно по меньшей мере на 80-90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% или выше (например, идентичность последовательностей, например, 99% или более). Термин существенная (практическая) идентичность означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ САР или ВЕ8ТР1Т с применением по умолчанию средневзвешенных гэпов, идентичны по меньшей мере на 80-90% (степень идентичности 80-90%), предпочтительно по меньшей мере на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере на 95% или выше (например, идентичность последовательностей, например, 99% или более). При сравнении последовательностей обычно одна последовательность является эталонной (контрольной) последовательностью, с которой сравнивается тестируемая последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную (контрольная) последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты последовательностей. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей, рассчитывают процентное содержание идентичности последовательностей для тестируемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности исходя из заданных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей с целью их сравнения можно проводить, например, применяя алгоритм локальной гомологии Смита-Ватермана, Λάν. Арр1. Ма111. 2: 482 (1981), алгоритм выравнивания гомологичных последовательностей Нидлмана-Вунша, I. Мо1. Вю1. 48: 443 (1970), поиском подобия по методу Пирсона и Липмана, Ргос. Май. Асаб. 8сЕ И8А 85: 2444 (1988), используя компьютерные программы с применением этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в νίδсопзт Сеиейсз 8оП\уаге Раскаде, Сеиейсз Сотри!ег Сгоир, 575 8с1еисе Иг., МаФзоп, νΐ) или визуальным исследованием (см. в целом Аизийе1 е1 а1., Сштеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду). Одним примером алгоритма подобия, применимого для определения в процентах идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм ВЬА8Т, описанный А11зски1 е1 а1., ί. Мо1. Вю1. 215: 403 (1990). Программное обеспечение для ВЬА8Т анализов доступно через №11юпа1 Сеп1ег йог Вю1ескпо1оду Ыогтайоп (по Интернету на сервере №1Еопа1 ЕъШШез ой НеаИй ИСВ1). Обычно для сравнения последовательностей можно применять параметры программы по умолчанию, хотя также можно использовать специальные параметры. Для аминокислотных последовательностей в качестве параметров по умолчанию программа ВЬА8ТР использует длину слова (ν) 3, математическое ожидание (Е) 10 и матрицу ВЬО8ИМ62 (см. Нешкойй & Нешкойй, Ргос. ЫаИ. Асай. 8сй И8А 89: 10915 (1989)).

Предпочтительно положения остатков, не являющихся идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. Для классификации аминокислотных замен в качестве консервативных или неконсервативных аминокислоты объединяют в группы следующим образом:

группа I (гидрофобные боковые цепи): 1еи, те!, а1а, νа1, 1еи, 11е;

группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): суз, зег, 11ιγ;

группа III (кислые боковые цепи): азр, д1и;

группа IV (основные боковые цепи): азп, д1п, Ыз, 1уз, агд;

группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): д1у, рго;

группа VI (ароматические боковые цепи): 1гр, 1уг, рке.

Консервативные замены включают замены между аминокислотами того же класса. Неконсерватив

- 16 015148 ные замены представляют собой замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, в три, четыре или пять раз более высокой, чем аффинность негуманизированного антитела. Например, если аффинность связывания негуманизированного антитела равна 10^-9 М, аффинность связывания гуманизированных антител будет по меньшей мере 3х10^-8, 4х10^-8, 5х10^-8 или 10^-9 М. Говорят, что цепь иммуноглобулина управляет связыванием с антигеном, когда она придает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) свойство специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) в значительной степени влияет на способность тяжелой или легкой цепи управлять связыванием антигена, если она влияет на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную боковую цепь, например, снижая ее по меньшей мере на порядок по сравнению с величиной аффинности связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация незначительно влияет (практически не влияет), например понижает, на способность цепи управлять связыванием антигена, если она влияет на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную боковую цепь, например, понижая ее только в два, три или четыре раза по сравнению с величиной аффинности связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация.

Термин химерный иммуноглобулин или антитело относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которого происходят из первого вида, а константные области происходят из второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами генетической инженерии (методами рекомбинантной ДНК) при использовании сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащего к разным видам. Не предполагается, что термины гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело охватывают химерные иммуноглобулины или антитела по определению ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей конструкции (т.е. содержат области более чем одного вида белка), они включают дополнительные признаки (т.е. вариабельные области, содержащие донорные остатки СОЯ, и акцепторные остатки каркасной области), которые отсутствуют в химерных иммуноглобулинах или антителах по определению в данном описании.

Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать известными в уровне техники методами рекомбинантной ДНК, например методами, описанными в ЯоЬшкоп е! а1., Международная патентная заявка № ΡСТ/υδ86/02269; Α1<ίη. е! а1., Европейская патентная заявка 184187; ТашдисЫ, М., Европейская патентная заявка 171496; Могпкоп е! а1., Европейская патентная заявка 173494; №еиЬегдег е! а1., опубликованная Международная патентная заявка РСТ № \¥О 86/01533; СаЬШу е! а1., патент США № 4816567; СаЬШу е! а1., Европейская патентная заявка 125023; Ве!!ег е! а1. (1988), 8с1епсе 240: 1041-1043; Ьш е! а1. (1987), Егос. №а!1. Αсаб. 8с1. υδΑ 84: 3439-3443; Ьш е! а1. (1987), 1. 1ттипо1. 139: 3521-3526; 8ип е! а1. (1987), Егос. №а!1. Αсаб. 8с1. υδΑ 84: 214-218; МкЫтига е! а1. (1987), Сапс. Яев. 47: 999-1005; \Уооб е! а1. (1985), №а!иге 314: 446-449; δίκην е! а1. (1988), 1. №а!1. Сапсег 1пв!. 80: 1553-1559; Моткоп, δ.Ε. (1985), δ^ι^ 229: 1202-1207; Οί е! а1. (1986), ВюТесЬтдиек 4: 214; ^т!ег, патент США 5225539; Шпек е! а1. (1986), №а!иге 321: 522-525; УегЬоеуап е! а1. (1988), δ^ι^ 239: 1534; Ве1б1ег е! а1. (1988), 1. 1ттипо1 141: 4053-4060.

Человеческие антитела от трансгенных животных и фаговый дисплей.

В качестве альтернативы в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), способных, после иммунизации, вырабатывать полный спектр человеческих антител, не вырабатывая эндогенный иммуноглобулин. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена шарнирной области тяжелой цепи (1_Н) антитела в химерных и зародышевой линии мутантных мышах приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов человеческого зародышевого иммуноглобулина в таких зародышевой линии мутантных мышах приводит в результате к выработке человеческих антител при контрольном заражении антигеном, см., например, патенты США № 6150584; 6114598 и 5770429.

Полностью человеческие антитела можно также получать при использовании фаг-дисплейных библиотек (НоодепЬоот е! а1., 1. Мо1. Вю1., 227-381 (1991); Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581-597 (1991)). Химерные поликлональные антитела можно также получать при использовании фаг-дисплейных библиотек (ВиесЬ1ег е! а1., патент США № 6420113).

Биспецифические антитела и конъюгаты антител.

Биспецифические антитела (βκΑ^) представляют собой антитела, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере к двум различным эпитопам. Такие антитела можно получать при использовании полноразмерных антител или фрагментов антител (например, Р(аЬ)'₂ биспецифических антител). Способы получения биспецифических антител известны в уровне техники. Традиционные способы получения полноразмерных (полной длины) биспецифических антител основаны на коэкспрессии двух пар

- 17 015148 тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, причем две цепи обладают различными специфичностями (МШк!ет е! а1., №а!иге, 305: 537-539 (1983)). Ввиду случайного набора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) дают возможную смесь различных антител (см. Международную патентную заявку \УО 93/08829 и в Тгаипескег е! а1., ЕМВО 1., 10: 3655-3659 (1991)).

Биспецифические антитела включают также перекрестно сшитые или гетероконъюгатные антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином или другой полезной нагрузкой. Гетероконъюгатные антитела можно получать, используя любые обычные методы сшивания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в уровне техники и раскрываются в патенте США № 4676980 наряду с рядом методов сшивания.

Еще в одном варианте изобретения антитело может быть конъюгировано химическими или генетическими методами с полезной нагрузкой, такой как реактивная, детектируемая или функциональная частица, например иммунотоксин, для получения конъюгата антитела. Такие полезные нагрузки включают, например, иммунотоксины, химиотерапевтические вещества и радиоизотопы, которые все хорошо известны в уровне техники.

Аβ-связывающий белок, имеющий Рс-область, применяемый в данном изобретении, может представлять собой слитый белок, который содержит, по меньшей мере, Рс-участок антитела, слитый с отличным от антитела белком или полипептидом, способным связывать Аβ. Так, создают растворимый слитый белок, который способен связывать Аβ и который имеет Рс-родственные функции (такие как сывороточная стабильность, Рс-рецепторное связывание и т. п.). Антитело(содержащие)-слитые белки (также в уровне техники называемые Рс-слитые белки или 1д-слитые белки) можно получать традиционными методами рекомбинантной ДНК, они описаны в уровне техники, см., например, патенты США № 5116964, 5225538, 5336603 и 5428130, все принадлежат Сароп е! а1.

Антитела к Аβ.

В целом антитела по настоящему изобретению включают различные антитела для лечения амилоидных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, за счет нацеливания на Аβ-пептид.

Термины Аβ-антитело, антитело к Аβ и анти-Аβ в данном описании применяются взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое связывается с одним или более эпитопов или антигенных детерминант человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), Аβ-белка или и того, и другого. Типичные эпитопы или антигенные детерминанты могут находиться внутри АРР, но предпочтительно находятся внутри Аβ-пептида АРР. Существует множество изоформ АРР, например АРР⁶⁹⁵, АРР⁷⁵² и 770 770

АРР⁷⁷⁰. Аминокислотам в АРР номера даются в соответствии с последовательностью изоформы АРР⁷⁷⁰ (см., например, СепВапк Ассеккюп Νο. Р05067).

В настоящее время примеры конкретных изотипов АРР, известные у человека, представляют собой полипептид из 695 аминокислот, описанный Капд е! а1. (1987) №а!иге 325: 733-736, который принимается за нормальный АРР; полипептид из 751 аминокислот, описанный Роп!е е! а1. (1988), №а!иге 331: 525-527 (1988) и Тап/ί е! а1. (1988), №а!иге 331: 528- 530; и полипептид из 770 аминокислот, описанный КбадисЫ е! а1. (1988), №а!иге 331: 530-532. Образованный в результате протеолитического расщепления (процессирования) АРР различными секретазами шугуо или ш кби, Аβ существует как в короткой форме, длиной в 40 аминокислот, так и в длинной форме, протяженностью 42-43 аминокислоты. Короткая форма, Аβ₄₀, состоит из остатков 672-711 АРР. Длинная форма, например Аβ₄₂ или Аβ₄з, состоит из остатков 672-713 или 672-714 соответственно. Часть гидрофобного домена АРР находится на карбоксиконце Аβ и может отвечать за способность Аβ к агрегации, в особенности в длинной форме. Аβ-пептид может находиться в жидкостях организма человека и других млекопитающих, например цереброспинальной жидкости, включая как здоровых индивидуумов, так и индивидуумов, страдающих амилоидными нарушениями.

Термины β-амилоидный белок, β-амилоидный пептид, β-амилоид, ’Άβ и 'Άβ-пептид в данном описании применяются на равных правах. Аβ-пептид (например, Аβз9, Аβ₄₀, Ар₄₁, Аβ₄₂ и Аβ₄з) представляет собой внутренний фрагмент АРР протяженностью ~4 кДа, содержащий 39-43 аминокислоты. Например, Аβ₄₀ состоит из остатков 672-711 АРР, а Аβ₄₂ состоит из остатков 672-713 АРР. Аβ-пептиды включают пептиды, получающиеся при расщеплении АРР секретазами, и синтетические пептиды, имеющие такую же или практически такую же последовательность, что и продукты расщепления. Аβпептиды можно получать из различных источников, например тканей, линий клеток или жидкостей организма (например, сыворотки и цереброспинальной жидкости (ликвора, спинно-мозговой жидкости)). Например, Аβ можно получать при использовании АРР-экспрессирующих клеток, таких как клетки яичников китайского хомячка, стабильно трансфецируемые АРР717_у^_р, описанным, например, в ^а1кР е! а1., №а!иге, 416, с. 535-539. Препарат Άβ можно получать из тканевых источников описанными ранее методами (см., например, ,1о11пкоп-\Уооб е! а1. (1997), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 94: 1550). Или же Άβпептиды можно синтезировать методами, хорошо известными специалистам в данной области техники, см., например, Р1е1бк е! а1., 8уп!Ре!ю Рерббек: А Икег'к Ошбе, еб. Огап!, \У.Н. Ргеетап & Со., №е\у Уогк, ΝΥ, 1992, р. 77). Так, пептиды можно получать твердофазным синтезом (методом Меррифилда) либо с

- 18 015148 трет-Вос, либо с Р-тос группами для защиты аминокислот в боковой цепи на автоматическом синтезаторе пептидов, например на синтезаторе Аррйеб Вю8уб!ет8 Рерйбе БуШйсбхсг Модель 430А или 431. Более протяженные пептидные антигены можно синтезировать общеизвестными методами рекомбинантной ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий пептид или слитый пептид, можно синтезировать или получать молекулярным клонированием и вводить в подходящий экспрессирующий вектор для трансфекции и гетерологичной экспрессии при использовании подходящей клетки-хозяина. Ав-пептид относится также к родственным Ав последовательностям, которые образуются в результате мутаций в Авобласти нормального гена.

Типичные эпитопы, или антигенные детерминанты, с которыми связывается Ав-антитело, могут находиться внутри человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), но предпочтительно находятся внутри Ав-пептида АРР. Типичные эпитопы, или антигенные детерминанты, внутри Ав расположены в пределах Ν-конца, центральной области или С-конца Ав. Ν-концевой эпитоп представляет собой эпитоп, или антигенную детерминанту, локализованную внутри Ν-конца Ав-пептида или включая Ν-конец Ав-пептида. Типичные Ν-концевые эпитопы включают остатки внутри аминокислот 1-10 или 112 Ав, предпочтительно из остатков 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6 или 3-7 Ав₄₂. Другие типичные Νконцевые эпитопы начинаются в остатках 1-3 и заканчиваются в остатках 7-11 Ав. Другие типичные Νконцевые эпитопы включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 Ав, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 Ав или остатки 4-7, 8, 9 или 10 Ав₄₂. Центральные эпитопы представляют собой эпитопы, или антигенные детерминанты, содержащие остатки, локализованные внутри центрального или среднего участка Ав-пептида. Типичные центральные эпитопы включают остатки внутри аминокислот 13-28 Ав, предпочтительно из остатков 1427, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23 или 19-22 Ав. Другие типичные центральные эпитопы включают остатки внутри аминокислот 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 или 19-24 Ав. С-концевые эпитопы, или антигенные детерминанты, расположены внутри С-конца или включая С-конец Ав-пептида и включают остатки внутри аминокислот 33-40, 33-41 или 33-42 Ав. С-концевые эпитопы представляют собой эпитопы, или антигенные детерминанты, локализованные внутри С-конца Ав-пептида (например, примерно внутри аминокислот 30-40 или 30-42 Ав). Дополнительные типичные С-концевые эпитопы, или антигенные детерминанты, включают остатки 33-40 или 33-42 Ав.

Если говорят, что антитело связывается с эпитопом внутри указанных остатков, таких как Ав 3-7, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим указанные остатки (т.е. Ав 3-7 в данном примере). Такое антитело необязательно контактирует с каждым остатком в Ав 3-7. Не каждая единичная аминокислотная замена или делеция внутри Ав 3-7 обязательно сильно влияет на аффинность связывания. В различных вариантах изобретения антитело к Ав является специфическим к концу. Термин специфический к концу по данному описанию относится к антителу, которое специфически связывается с Ν-концевыми или С-концевыми остатками Ав-пептида, но которое не распознает такие же остатки в более протяженных Ав, содержащих эти остатки, или в АРР. В различных вариантах изобретения Ав антитело является специфическим к С-концу. Термин специфический к С-концу по данному описанию означает, что антитело специфически распознает свободный С-конец Ав-пептида. Примеры антител к Ав, специфических к С-концу, включают такие антитела, которые узнают конец (окончание) Ав-пептида в остатке 40, но не узнают конец Ав-пептида в остатке 41, 42 и/или 43; узнают конец (окончание) Ав-пептида в остатке 42, но не узнают конец Ав-пептида в остатке 40, 41 и/или 43 и т.д.

В одном варианте изобретения антитело к Ав может представлять собой 3Ό6 антитело или его вариант или 10Ό5 антитело или его вариант, оба эти антитела описаны в опубликованной патентной заявке США № 20030165496 А1, опубликованной патентной заявке США № 20040087777 А1, опубликованной Международной патентной заявке № ХДО 02/46237 А3 и в Международной опубликованной патентной заявке № ХДО 04/080419 А2. Описание антител 3Ό6 и 10Ό5 можно найти также в Международной опубликованной патентной заявке № ХДО 02/088306 А2 и в Международной опубликованной патентной заявке № ХДО 02/088307 А2. Дополнительные 3Ό6 антитела описаны в патентной заявке США № 11/303478 и Международной патентной заявке № РСТ/и805/45614. 3Ό6 является моноклональным антителом (тАЬ), которое специфически связывается с Ν-концевым эпитопом, локализованным в человеческом вамилоидном пептиде, конкретно с остатками 1-5. Для сравнения, 10Ό5 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с Ν-концевым эпитопом, локализованным в человеческом в-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-6. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 3Ό6 (ВВ96 3Ό6.32.2.4), депонирована в Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиЙше Со11есбоп (АТСС)), Мапаббаз, УА 20108, И8А, 8 апреля 2003 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-5130. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 10Ό5 (ВВ44 10Ό5.19.21), депонирована в АТСС 8 апреля 2003 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-5129.

Типичными вариантами антител 3Ό6 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные

- 19 015148 как 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8Е0 ΙΌ N0: 5, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 4 или 8Е0 ΙΌ N0: 6. Другие типичные варианты 3Ό6 антител представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как 8Е0 ΙΌ N0: 7, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как 8Е0 ΙΌ N0: 8.

Типичными вариантами антител 10Ό5 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 8Е0 ΙΌ N0: 11, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 10 или 8Е0 ΙΌ N0: 12. Другие типичные варианты 10Ό5 антител представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как 8Е0 ΙΌ N0: 13, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как 8Е0 ΙΌ N0: 14. Такие варианты антител подробно описаны в Международной патентной заявке \¥0 02/088307 А2.

В другом варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 12В4 или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке СШЛ № 20040082762 Ά1 и в Международной опубликованной патентной заявке № \¥0 03/077858 А2. 12В4 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с ^концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7.

Типичными вариантами антител 12В4 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь (или легкую цепь), содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 15 или 8Е0 ΙΌ N0: 17, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 18 или 8ЕО ΙΌ N0: 19.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 12Ά11 или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке СШΆ № 20050118651 Ά1, патентной заявке СШΆ регистрационный № 11/303478, Международной опубликованной патентной заявке № \¥0 04/108895 А2 и в Международной патентной заявке регистрационный № РСТ/И805/45614. 12Ά11 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с ^концевым эпитопом, локализованным в человеческом βамилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 12Ά11, депонирована в ΆТСС 13 декабря 2005 г. согласно Будапештскому договору под номером РТ^^Е

Типичными вариантами антител 12Ά11 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области, представленную как 8Е0 ΙΌ N0: 20, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 ΙΌ N0: 21, 8Е0 ΙΌ N0: 22, 8Е0 ΙΌ N0: 23, 8ЕО ΙΌ N0: 24, 8ЕО ΙΌ N0: 25, 8ЕО ΙΌ N0: 26, 8ЕО ΙΌ N0: 27, 8ЕО ΙΌ N0: 28, 8ЕО ΙΌ N0: 29, 8ЕО ΙΌ N0: 30, 8ЕО ΙΌ N0: 31, 8ЕО ΙΌ N0: 32, 8ЕО ΙΌ N0: 33, 8ЕО ΙΌ N0: 34, 8ЕО ΙΌ N0: 35, 8ЕО ΙΌ N0: 36, 8ЕО ΙΌ N0: 37, 8ЕО ΙΌ N0: 38, 8ЕО ΙΌ N0: 39, 8ЕО ΙΌ N0: 40 или 8ЕО ΙΌ N0: 41.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 6С6 или его вариант, описанные в патентной заявке СШΆ № 11/305899 и Международной патентной заявке № РСТ/и805/45860. 6С6 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с ^концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 6С6, депонирована в ΆТСС 1 ноября 2005 г. согласно Будапештскому договору под номером РТ^7200.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 2Н3 или его вариант, описанные в патентной заявке СШΆ № 11/305899 и Международной патентной заявке № РСТ/И805/45860. 2Н3 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с ^концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 2-7.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 3Ά3 или его вариант, описанные в патентной заявке СШΆ № 11/305899 и Международной патентной заявке № РСТ/И805/45860. 3Ά3 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с ^концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7.

Линии клеток, продуцирующие антитела 2Н3 и 3Ά3, имеющие регистрационные номера в ΆТСС РТ^7267 и РТ^7269 соответственно, депонированы 13 декабря 2005 г. согласно Будапештскому договору.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 15С11 или его вариант, описанные в патентной заявке СШΆ № 11/304896 и Международной патентной заявке № РСТ/И805/45515, озаглавленной Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид. 15С11 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 19-22. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 15С11, депонирована в 13 декабря 2005 г. согласно Буда

- 20 015148 пештскому договору под номером РТА-7270.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 266 или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке США № 20050249725 А1 и Международной патентной заявке № \¥О 01/62801 А2. 266 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 1624. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 266, депонирована в АТСС 20 июля 2004 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-6123.

Типичными вариантами антител 266 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8ЕО Ш N0: 42 или 8Е0 Ш N0: 44, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как 8Е0 Ш N0: 43 или 8Е0 Ш N0: 45. Другие типичные варианты антител 266 представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как 8Е0 Ш N0: 46, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как 8Е0 Ш N0: 47. Такие варианты антител подробно описаны в опубликованной патентной заявке США № 20050249725 А1 и опубликованной Международной патентной заявке \¥0 01/62801 А2.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 2В1 или его вариант, описанные в патентной заявке США № 11/305899 и Международной патентной заявке № РСТ/И805/45860, озаглавленной Антитела к Αβ для применения с целью улучшения познавательной способности. 2В1 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 19-23.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 1С2 или его вариант, описанные в патентной заявке США № 11/305899 и Международной патентной заявке № РСТ/И805/45860, озаглавленной Антитела к Ав для применения с целью улучшения познавательной способности. 1С2 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 16-23.

Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 9С8 или его вариант, описанные в патентной заявке США № 11/304986 и Международной патентной заявке № РСТ/и805/45515. 968 представляет собой тАЬ, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом В-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 16-21.

Линии клеток, продуцирующие антитела 2В1, 1С2 и 968, депонированы 1 ноября 2005 г. в АТСС согласно Будапештскому договору и им присвоены регистрационные номера РТА-7202, РТА-7199 и РТА-7201 соответственно.

Антитела, которые специфически связываются с С-концевыми эпитопами, локализованными в человеческом β-амилоидном пептиде, для применения в настоящем изобретении включают, но без ограничения, 369.2В, описанное в патенте США № 5786180, озаглавленном Моноклональное антитело 369.2В, специфическое к β А4 пептиду. Более подробное описание антител для применения в настоящем изобретении можно найти, например, в Ви881еге е! а1. (Ат. 1. Ра11ю1. 165(3): 987-95 (2004)), Вагб е! а1. (РNΑ8 100(4): 2023-8 (2003)), Ка|ко\\№1 е! а1. (1. Вю1. Скет. 276(22): 18748-56 (2001)), 6атез е! а1. (Апп. БГУ Асаб. δει. 920: 274-84 (2000)), Вагб е! а1. (№11. Меб. 6(8): 916-9 (2000)) и в Международной патентной заявке № XV 0 03015691 А2, озаглавленной Осуществление быстрого улучшения познавательной способности у субъекта, страдающего болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна, церебральной амилоидной ангиопатией или слабой когнитивной недостаточностью, заключается во введении антитела к А бета. Более подробное описание фрагментов антител для применения в настоящем изобретении можно найти, например, в Ва1ез е! а1. (реферат Р4-396, с. 8587, представленный на постерной сессии Р4: Тйегареибсб апб Тйегареибс 8!га!ед1е8-Тйегареибс 81га!ед1еб, Ату1о1б-Вабеб) и 2атеег е! а1. (реферат Р4-420, с. 8593, представленный на постерной сессии Р4: Тйегареибсб апб Тйегареибс 8!га!ед1е8-Тйегареи!1с 81га!ед1еб, Ату1о1б-Вабеб).

Антитела для применения в настоящем изобретении можно получать методами рекомбинантной ДНК или синтетическими методами. Например, антитело можно получать, используя культуру рекомбинантных клеток, например СНО клеток, NIΗ 3Т3 клеток, РЕР.С6® клеток, N80 клеток, УЕР0 клеток, фибробластов эмбрионов цыплят и ВНК клеток. Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются антитела с минорными модификациями, которые сохраняют основное функциональное свойство связывать Аβ-пептид. В конкретном варианте изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело 3Ό6 к Аβ-пептиду, которое селективно связывает Аβ-пептид. Более конкретно, гуманизированное 3Ό6 антитело к Аβ-пептиду создано для специфического связывания с НН₂-концевым эпитопом, например аминокислотными остатками 1-5, локализованными в человеческом β-амилоидном 1-40 или 1-42 пептиде, обнаруженном в отложениях в виде бляшек в мозге (например, у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера).

Примером гуманизированного антитела к Аβ-пептиду является вариант 2 гуманизированного антитела 3Ό6 (13Ό6ν2). Полные аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей 13Ό6ν2, пред- 21 015148 сказанные исходя из последовательностей ДНК соответствующих экспрессирующих векторов, показаны на фигуре (где нумерация остатков начинается с Ν^-конца легкой и тяжелой цепей в виде остатка номер 1) и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 соответственно. Последний аминокислотный остаток, кодированный последовательностью ДНК тяжелой цепи, Ьук⁴⁴⁹, наблюдался в зрелой секретированной форме 1ι3Ό6ν2. и без связи с какой-либо конкретной теорией можно сказать, что он, по-видимому, удаляется в ходе внутриклеточного процессирования с помощью СНО клеточных протеаз. Следовательно, СООН-конец тяжелой цепи Ρ3Ό6ν2, необязательно, представляет собой С1у⁴⁴⁸. В рекомбинантных антителах и антителах плазмы наблюдается процессирование и СООН-концевого лизина, и, по-видимому, это не влияет на их функцию (Натк (1995), I. СЬгота!одг. Α. 705: 129-134). Очищенное 1ι3Ό6ν2 модифицируют после трансляции, присоединяя Ν-связанные гликаны к Рс-участку тяжелой цепи, которая, как известно, содержит консенсусный сайт Ν-гликозилирования. Сайт Ν-гликозилирования выявляет три главные биантенные структуры нейтральных олигосахаридов, обычно наблюдаемых в аналогичном сайте Νгликозилирования 1дС белков млекопитающих.

Другим примером гуманизированного антитела к Άβ-пептиду является вариант 1 гуманизированного антитела 3Ό6 (Ρ3Ό6ν1), имеющий последовательность, представленную на фигуре, за исключением замены Ό^Υ в положении 1 легкой цепи, замены δ^Ά в положении 75 тяжелой цепи (положение 74 по нумерации КаЬа!), замены Т^8 в положении 78 тяжелой цепи (положение 77 по нумерации КаЬа!) и замены У^Ь (положение 89 по нумерации КаЬа!).

Различные аспекты и варианты настоящего изобретения описываются подробнее с помощью нижеприведенных примеров. Примеры предлагаются только в качестве иллюстрации, но ни в коем случае не как ограничение.

Примеры

Нижеприведенные примеры предлагаются только с целью иллюстрации.

Приводятся примеры, в которых используются два различных моноклональных антитела к Άβ. Описаны шесть экспериментов, каждый из которых включает комбинацию удаления антитела и примесей.

Материалы и методы.

В целом при применении настоящего изобретения на практике, если не указано иначе, используются традиционные методы химии, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК, иммунологии (особенно, например, методы с применением иммуноглобулинов) и стандартные методы электрофореза, см., например, ЗатЬгоок, Ргйкск апб Матабк, Мо1еси1аг С1ошпд: Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк (1989); АпбЬобу Епдтееппд Рго!осо1к (Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1оду), 510, Раи1, δ., Нитаиа Рг (1996); АибЬобу Еидтеепид: А Ргасбса1 АрргоасЬ (Ргасбса1 АрргоасЬ 8ейек, 169), МсСаГГеПу, Еб., 1г1 Рг (1996); АпбЬоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Наг1оте е1 а1., С.8.Н.6. Ргекк, РиЬ. (1999); Сиггеп! РгоЮсо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду, ебк. АикиЬе1 е1 а1., 1оЬп ^11еу & 8опк (1992); Воикке е1 а1., Рго1ет 8ίχ6ι§ оп а МюгосЫр, Апа1. Скет. 73, 12071212 (2001); Кпарр е1 а1., СоттегааНхеб апб Етегдтд ЬаЬ-оп-а-СЫр Аррбсабопк; 1п: Ргосеебтдк оГ 1ке цТА8 2001 8утрокшт, Ваткеу, РМ. & νаη беп Вегд, А., 7-10 (2001); МЬа1ге е1 а1., 81га1ец1ек Гог 1осабпд б1ки1Г1бе Ьопбк ш а топос1опа1 апбЬобу νίη такк кресботебу, Вар1б Соттип. Макк 8ресбот, 13 (24): 2503-2510 (1999).

Получение целевого антитела.

Целевое антитело можно получать, например, используя рекомбинантную линию клеток млекопитающих, выращенную в суспензионной культуре. Кондиционированную среду, содержащую представляющее интерес антитело, получают в продукционном биореакторе. Получающийся в результате продукт можно собирать и осветлять любым подходящим методом осветления, например либо микрофильтрацией и фильтрацией с тонкостью фильтра 0.22 мкм или центрифугированием, либо фильтрацией через слой (зернистого материала) и фильтрацией с тонкостью фильтра 0.22 мкм.

Очистка целевого антитела.

Очистка целевых моноклональных антител, приводимых в качестве примеров в данном описании (ΆΆВ или 12А11), состоит из улавливания (захвата) целевого соединения при аффинной хроматографии на твердой фазе с белком Ά. Она может содержать гтр Рго1ет А 8ербагоке™ Рак! Р1оте, Рго1ет А 8ербагоке™ Рак! Р1о\у или МаЬ8е1ес1 Рго1ет Ά. Затем смолу промывают, как описано в каждом эксперименте, и продукт элюируют и проверяют на содержание примесей.

Диализ целевого антитела.

Для количественного определения ШТ в образцах моноклонального антитела ΆАВ применяют обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ, ВР-НРЬС). Эксклюзионную хроматографию (8ЕС-ВЭЖХ) используют для определения процентного содержания мономерного белка (мономерного 1дС), высокомолекулярного (НМ\У) и низкомолекулярного (ЬМ^) белков. Для определения относительного количества видов с недостающими дисульфидными связями (ИОВ) в образцах проводят денатурирующую 8ЕСВЭЖХ. Уровни НСР в испытуемых образцах определяют твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А).

Методы анализа: определение ШТ и ИОВ.

- 22 015148

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (анализ ЛЛВ ΙΚΤ).

ОФ-ВЭЖХ проводят следующим образом. Восстановление дисульфидной группы в каждом образце проводят инкубацией при 40°С в течение 60 мин в присутствии 2.5 мМ ΌΤΤ. Άлкилирование проводят, инкубируя при комнатной температуре в присутствии 5.5 мМ йодуксусной кислоты. После восстановления и алкилирования во все образцы добавляют (гасят) 5 мкл 1 М ΌΤΤ. Точность количественных определений в данном анализе составляет 0.5%. Около 40 мкг каждого восстановленного алкилированного образца вводят в колонку для ОФ-ВЭЖХ РОКО8 К1/Н КР-НРЬС и хроматографируют в течение 70 мин в следующих условиях.

Колонка: Рогоз К1/Н КР-НРЬС Со1итп;

Температура: 50°С;

Подвижная фаза Ά: 0.1% ТФК (вес./об.) в воде;

Подвижная фаза В: 0.1% ТФК (вес./об.) в 95% в ацетонитриле;

Скорость потока: 1.0 мл/мин;

Детекция: 217 нм;

Время цикла: 70 мин;

Ввод: трехкратное введение по 40 мкг каждый ввод;

Время градиента указано в табл. 1.

Таблица 1

Время градиента в методе ОФ-ВЭЖХ

Время градиента	%А	%В
0-1	95	5
2	70	30
54	60	40
55.1-70	95	5

68ЕС-ВЭЖХ (анализ ^В ЦБВ).

Денатурирующую ЗЕС-ВЭЖХ проводят следующим образом. Предварительная обработка образцов для анализа методом денатурирующей ЗЕС-ВЭЖХ включает смесь реагент/образец с конечной концентрацией белка 200 мкг/мл, 3 М гуанидин НС1 и 100 мМ Трис, рН 7.4. Образцы нагревают при 80°С в течение 20 мин при перемешивании в процессе превращения. В данном анализе используют два контроля для установления пределов (вилки, ограничения) уровней ΕΙ9Β. В качестве контрольных используют внутренние эталоны с низким и высоким уровнями ΕΙ9Β.

Хроматографию/анализ проводят в следующих условиях.

Колонка: 'ГокоН ВюЗер 03000 8νχ1;

Температура в колонке: комнатная;

Подвижная фаза: 3 М гуанидин НС1, 25 мМ \аРО₄, рН 6.8;

Градиент: изократический (постоянный состав элюента);

Скорость потока: 0.5 мл/мин;

Детекция: 280 нм;

Время цикла: 50 мин;

Ввод: трехкратное введение по 50 мкл (10 мкг).

Пример 1.Сравнение промывающих буферов для выделения ΙΚΤ.

В данном примере содержащий примеси раствор, содержащий моноклональное антитело к Άβ ΆΆВ очищают адсорбцией на колонке с белком Ά с последующим первым промыванием буфером, содержащим либо СаС1₂, МдС1₂, \аС1, либо пропиленгликоль.

Культуру, содержащую моноклональное антитело, очищают в малом масштабе на колонке гтр РгоГет А ЗерЬагозе™ ЕЕ (8.9 мл), связанной с хроматографической системой ОЕ Неа1ГЬсаге ΑΚΤΑ ЕРЬС. Во всех стадиях хроматографии на гтр РгоГет А ЗерЬагозе™ ЕЕ используют нижеприведенные условия (исключения отмечены в отдельных описаниях эксперимента).

Размеры колонки - 1.0 смх11.4 см;

Рабочая скорость потока - 150 см/ч;

Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ \аС1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ \аС1, рН 7.5 (1 объем колонки);

Промывание 1 - переменный состав (см. табл. 2) за исключением опыта № 1, в котором отсутствует промывание 1;

Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М \аС1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ \аС1, рН 7.5 (7 объемов колонки);

Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ \аС1, рН 3.1 (6 объемов колонки);

Десорбция 1 - 20 мМ цитрата натрия, рН 2.7 (5 объемов колонки);

Десорбция 2 - 6 М гуанидин НС1 (2 объема колонки);

Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ \аС1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки);

- 23 015148

Рабочая температура - 2-8°С.

Колонку с гтр Рго1ет А ЗераРгозе™ РР уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). В колонку загружают продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (1 объем колонки) и промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Все растворы 1 для промывания (промывающие растворы 1) приведены в табл. 2. Промывание 1 проводят во всех опытах, кроме опыта № 1. После промывания 1 промывают 20 мМ Трис, 1.0 М №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки) и 10 мМ Трис, 75 мМ №С1, рН 7.5 (7 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки раствором 50 мМ глицина, 75 мМ №С1, рН 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.9-8.1 раствором 2 М Трис, рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. В табл. 2 приводятся уровни ΙΚΤ вариантов и РМА в объединенных фракциях (пулах) из различных опытов. Промывание хлоридом магния и хлоридом кальция снижает уровни ΙΚΤ и РМА частиц.

Таблица 2

Величины ΙΚΤ и РМА для различных промывающих бус	зеров 1
Опыт#	Условия	%ΤΜ\ν	%1КГ
1	Контрольный (Отсутствует промывание 1)	4.4	2.5
2	20% пропиленгликоля; рН 7.5	4.7	2.5
3	50 мМ Трис, 2.0 М хлорида магния, рН 7.5	1.6	1.5
4	50 мМ Трис, 2.5 М хлорида магния, рН 7.5	1.5	1.3
5	50 мМ ацетата, 2.0 М хлорида магния, рН 4.5	0.9	0.8
6	50 мМ Трис, 4.0 М хлорида натрия, рН 7.5	4.4	2.5
7	50 мМ Трис, 2.0 М хлорида кальция, рН 7.5	1.8	1.4
8	50 мМ Трис, 2.5 М хлорида кальция, рН 7.5	0.8	0.8

Как видно из результатов, промывание хлоридом магния и хлоридом кальция снижает уровни ΙΚΤ и РМА белков, тогда как промывание хлоридом натрия и пропиленгликолем не уменьшает содержание ΙΡΤ и РМА белков.

Пример 2. Хроматография на белке Ά с промыванием СаС1₂ для удаления ΙΚΤ.

В этом примере в большем масштабе проводят очистку антитела хроматографией на белке Ά с промыванием СаС1₂ для удаления ΙΚΤ вариантов.

Культуру, содержащую моноклональное антитело, очищают в масштабе пилотной установки на колонке МаЪЗе1ес1 РЮет А (2.4 л), связанной с хроматографической системой МПРроге К-Рпте 400. Два опыта на МаЪЗе1ес1 проводят, как описано ниже.

Размеры колонки - 13 смх18 см;

Рабочая скорость потока - 150 см/ч, 300 см/ч;

Уравновешивание 1-20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (2 объема колонки);

Промывание 1 - 50 мМ Трис, 2.0 М СаС1₂, рН 7.5 в опыте № 1, в опыте № 2 промывание 1 отсутствует;

Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 25 мМ №С1, рН 3.1 (6 объемов колонки);

Десорбция 1 - 50 мМ глицина, 0.5 М №С1, рН 2.7 (5 объемов колонки);

Десорбция 2 - 6 М гуанидин НС1 (2 объема колонки);

Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки);

Рабочая температура - 2-8°С.

Колонку с МаЪЗе1ес1 РЮет Ά уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). На носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (2 объема колонки) и промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Раствор 1 для промывания (промывающий раствор 1) содержит 50 мМ Трис, 2.0 М СаС1₂, рН 7.5 в опыте 1, тогда как в опыте 2 его полностью исключают. После промывания 1 промывают раствором 50 мМ Трис, 1.0 М №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки) и раствором 10 мМ Трис, 75 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки МаЪЗе1ес1 Рго1ет Ά раствором 50 мМ глицина, 25 мМ №С1, рН 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.8-8.2 раствором 2 М Трис рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 3.

Таблица 3 Содержание ΙΡΤ (%) в опытах в масштабе пилотной установки с промыванием хлористым кальцием и в отсутствие промывания хлористым кальцием

- 24 015148

Результаты показывают, что в масштабах пилотной установки промывание хлористым кальцием удаляет ΙΚΤ из объединенных фракций (пула) продукта.

Пример 3. Удаление ДНК.

В данном примере изучается способность промывающего раствора СаС1₂ удалять ДНК клетокхозяев из препарата, содержащего моноклональное антитело ААВ.

Небольшое количество культуры, содержащей моноклональное антитело, очищают на колонке МаЬЗе1ес! Рго(ет А (19 мл), связанной с хроматографической системой ОЕ Неа1Шсаге АКТА РРЬС. Проводят три описанных ниже опыта с МаЬЗе1ес!.

Размеры колонки - 1.1 смх20 см;

Рабочая скорость потока - 300 см/ч;

Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (2 объема колонки);

Промывание 1 - 50 мМ Трис, 2.0 М СаС1₂, рН 7.5 (5 объемов колонки) (только опыты 2 и 3); Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки) (только опыты 1 и 3); Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ №С1, рН 7.5 (7 объемов колонки);

Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ №С1, рН 3.0 (6 объемов колонки); Десорбция 1 - 50 мМ глицина, 0.5 М №С1, рН 2.7 (5 объемов колонки);

Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки);

Рабочая температура - 18-24°С.

В опытах колонку с МаЬЗе1ес( Рго(ет А уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). Затем на носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 40 мг продукта/мл смолы. После этого смывают (промывают) уравновешивающим буфером (2 объема колонки). В опытах 2 и 3 за этой стадией следует промывание промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). В опытах 1 и 3 колонку промывают промывающим раствором 2 (5 объемов колонки). Во всех трех опытах используют 7 объемов раствора 3 для промывания (промывающего раствора 3). Моноклональное антитело элюируют с колонки МаЬЗе1ес! Рго(ет А раствором 50 мМ глицина, 75 мМ №С1, рН 3.0. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.5-8.0 раствором 2 М Трис, рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 4.

Таблица 4 Удаление ДНК промыванием раствором с хлористым кальцием

Опыт	Промывание 1	Промывание 2	ДНК (нг/мл)	ДНК (м.д.)
1	Отсутствует (Контроль)	20 мМ Трис, 1 Μ ΝαΟ, рН 7.5	3.6	0.37
2	50 мМ Трис, 2 М СаС12, рН 7.5	Отсутствует	0.9	0.09
3	50 мМ Трис, 2 М СаС12, рН 7.5	20 мМ Трис, 1 М ЫаС1, рН 7.5	0.3	0.03

Результаты показывают, что добавление 50 мМ Трис, 2.0 М хлористого кальция, рН 7.5 в 10 раз уменьшает количество ДНК по сравнению с применением \'аС1 в растворе для промывания.

Пример 4. Удаление белка клеток-хозяев.

В данном примере в опытах по очистке, в которых проверяют влияние различных условий на способность удалять белки клеток-хозяев (НСР), используют второе моноклональное антитело к Ав, 12А11.

Для стадии МаЬЗе1ес( проводят высокопроизводительный скрининг (НТЗ) в формате 96-луночного фильтрационного планшета для удаления примесей, таких как НСР. В этом скрининге варьируют наполнители (эксципиенты), концентрацию наполнителей и рН промывающего раствора наполнителей (эксципиентов) для того, чтобы определить их влияние на обусловленные процессом примеси, такие как НСР.

Смолу МаЬЗе1ес! уравновешивают буфером 5 мМ Трис, 10 мМ №С1, рН 7.3, и продукт наносят на колонку. Затем смолу выгружают, перемешивают и вносят 50 мкл смолы в каждую лунку 96-луночного фильтрационного планшета. Смолу в каждой лунке уравновешивают в растворе 5 мМ Трис, 10 мМ №С1, рН 7.3, а затем промывают промывающими растворами, содержащими каждый из различных наполнителей (эксципиентов), в 3 стадии, на каждой стадии используют 300 мкл буфера для промывания. После промывания наполнителем проводят второе промывание буфером, содержащим 5 мМ Трис, 10 мМ №С1, рН 7.3, в 4 стадии, по 300 мкл буфера в каждой. Затем продукт элюируют со смолы в 3 стадии по 300 мкл. Продукты стадий элюции 1 и 2 объединяют и проверяют уровни НСР.

Объем смолы - 50 мкл;

Наполнители для промывающего раствора - хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния;

Концентрации наполнителей - 100, 250, 500, 1000,1500 и 2000 мМ;

рН наполнителя - 6.0 и 7.5;

Буферы для элюции - 25 мМ Нерек, 10 мМ №С1, рН 3.0, 25 мМ Нерек, 100 мМ №С1, рН 3.0, 50 мМ глицина, 10 мМ №С1, рН 3.0, 50 мМ глицина, 100 мМ №С1, рН 3.0 и 100 мМ аргинина, 10 мМ №С1, рН 3.0, 100 мМ аргинина, 100 мМ №С1, рН 3.0;

Рабочая температура - 18-24°С.

Результаты показаны в табл. 5 и 6.

- 25 015148

Таблица 5 Величины НСР, полученные при промывании смолы МаЪ8е1ес! растворами хлорида натрия, хлорида кальция или хлорида магния с рН 6.0

Буфер для элюции	Элюция ]\аС1 Конц. (мМ)	Эксципиент для промыв. Конц. (мМ)	Эксципиент для промывания
ХаС1	| СаС12	I М§С12
НСР (м.д.)
50 мМ глицина		100	46800	28500	30800
25 мМ НЕРЕ8		250	35300	17900	22000
100 мМ аргинина	10	500	40900	17700	18400
50 мМ глицина		1000	34300	12600	14200
25 мМ НЕРЕ8		1500	37000	7,00	10700
100 мМ аргинина		2000	43900	5800	9300

Таблица 6 Величины НСР, полученные при промывании смолы МаЪ8е1ес! растворами хлорида натрия, хлорида кальция или хлорида магния с рН 7.5

Буфер для элюции	Элюция МаС! Конц. (мМ)	Эксципиент для промыв. Конц. (мМ)	Эксципиент для промывания
ХаС1	| СаС12	I МёС12
НСР (м.д.)
50 мМ глицина		100	27900	17900	21800
25 мМ НЕРЕ8		250	24700	16600	18200
100 мМ аргинина	100	500	26500	14000	17300
50 мМ глицина		1000	30100	14500	17700
25 мМ НЕРЕ8		1500	35300	12000	12500
100 мМ аргинина		2000	41700	8200	11700

Результаты показывают, что как хлорид кальция, так и хлорид магния снижают уровни НСР в пуле пика на МаЪ8е1ес! по сравнению с хлоридом кальция при рН 6.0 (табл. 5) и рН 7.5 (табл. 6).

Пример 5. Удаление антител с недостающими дисульфидными связями (иЭВ).

В данном примере изучается способность промывающего раствора с СаС1₂ удалять антитела с недостающими дисульфидными связями (ЦЮВ).

Проводят два опыта на колонке гтр Рго!ет А 8ерЬаго8е™ ЕЕ практически, как описано в примере 1.

Размеры колонки - 1.0 смх11.4 см;

Рабочая скорость потока - 150 см/ч;

Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ КаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ КаС1, рН 7.5 (1 объем колонки); Промывание 1 - 50 мМ ацетата, 2.0 М СаС1₂, рН 5.0 в опыте 1; отсутствует в опыте 2; Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М КаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ КаС1, рН 7.5 (7 объемов колонки);

Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ КаС1, рН 3.1 (6 объемов колонки);

Десорбция 1 - 20 мМ цитрата натрия, рН 2.7 (5 объемов колонки);

Десорбция 2 - 6 М гуанидин НС1 (2 объема колонки);

Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ КаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки);

Рабочая температура - 2-8°С.

Колонки с гтр Рго!ет А 8ераЕго8е™ ЕЕ уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ КаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки). В колонки загружают продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (1 объем колонки), а затем промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Этот раствор для промывания 1 (промывающий раствор 1) содержит 50 мМ ацетата, 2.0 М СаС1₂, рН 5.0 в опыте 1; совершенно отсутствует в опыте 2. После промывания 1 промывают 20 мМ Трис, 1.0 М КаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки) и 10 мМ Трис, 75 мМ КаС1, рН 7.5 (7 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки гтр Рго!ет А 8ераЕго8е™ ЕЕ раствором 50 мМ глицина, 75 мМ КаС1, рН 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.9-8.2 раствором 2 М Трис рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 7.

- 26 015148

Таблица 7

Содержание ϋΒΏ (%) в опытах с промыванием хлористым кальцием и в отсутствие промывания хлористым кальцием

Опыт#	Образец	% ивп
1	50 мМ ацетата, 2.0 М СаС12, рН 5.0	9.5
2	Контрольный (Отсутствует промывание)	20.8

В опыте с дополнительным промыванием раствором, содержащим 50 мМ ацетата, 2.0 М СаС1₂, рН 5.0, наблюдается двукратное уменьшение уровней СОВ.

Пример 6. Удаление НСР и ΙΚΤ промыванием другими солями двухвалентных катионов.

В данном примере изучается способность раствора для промывания, содержащего МпС1₂ или \1С1₂, удалять примеси из препарата, содержащего моноклональное антитело к Άβ ААВ.

Для проверки действия промывающих растворов, содержащих другие соли двухвалентных катионов, таких как МпС1₂ или \1С1₂, проводят два опыта. Также проводят два контрольных опыта один с буфером для промывания, содержащим 20 мМ Трис, 1.0 М ИаС1, рН 7.5 (не ожидается удаления ΙΚΤ или НСР), а другой с буфером для промывания, содержащим 50 мМ Трис, 2.0 М СаС1₂, рН 7.5.

Небольшое количество культуры, содержащей моноклональное антитело, очищают на колонке МаЪЗе1ес1 Рго1еш А (9 мл), связанной с хроматографической системой СЕ Неа11Есаге АКТА ЕРЬС. Опыты с МаЪ8е1ес1 проводят, как описано ниже. Как указано ниже, все рабочие параметры идентичны в четырех опытах, за исключением буфера для промывания 1, который все время меняется (табл. 8).

Размеры колонки - 1.0 смх11.5 см (9 мл);

Рабочая скорость потока - 300 см/ч (уравновешивание, промывание 2, элюция, регенерация, хранение);

Рабочая скорость потока - 230 см/ч (нанесение нагрузки (образца), быстрое промывание, промывание 1);

Уравновешивание 1 - 50 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Промывание 1 - меняется (см. состав в табл. 8);

Промывание 2 - 50 мМ Трис, 1.0 М №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Элюция - 50 мМ глицина, 10 мМ \аС1, рН 3.0 (3 объема колонки);

Регенерация - 50 мМ \а(')11, 0.5 М Ха₂ЗО₄ (5 объемов колонки);

Хранение - 16% этанол, 50 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки);

Рабочая температура - 18-24°С.

Колонку с МаЪ8е1ес1 Рго1еш А уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). На носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 40 мг продукта/мл смолы. Оставшуюся часть загрузки смывают (струей) буфером 50 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). После этого колонку промывают одним из растворов, описанных в табл. 8. Перед элюцией колонку промывают раствором 50 мМ Трис, 10 мМ ИаС1, рН 7.5 (5 объемов колонки). Продукт элюируют с колонки МаЪ8е1ес1 Рго1еш А раствором 50 мМ глицина, 10 мМ \аС1, рН 3.0.

Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 8.0 раствором 2 М Трис, рН 9.0. Проводят десорбцию с колонки раствором 50 мМ \аО11, 0.5 М Ха₂ЗО₄ (5 объемов колонки). Затем хранят с 16% этанола, 50 мМ Трис, 150 мМ №С1, рН 7.5 (5 объемов колонки). Результаты показаны в табл. 8 (очистка от НСР) и в табл. 9 (очистка от ΙΚΤ).

Таблица 8 Удаление НСР различными растворами для промывания

Опыт#	Условия Промывания 1	НСР (м.д.)
1	50 мМ Трис, 1.0 Μ ЫаС1, рН 7.5	17600
2	50 мМ ацетата натрия, 1.5 М МпС12, рН 5.0*	10600
3	50 мМ ацетата натрия, 1.5 М №С12, рН 5.0*	4000
4	50 мМ Трис, 2.0 М СаС12, рН 7.5	6500

рН 5.0 выбирают из-за растворимости МпС1₂ и №С1₂.

Таблица 9

Удаление ΙΚΤ различными растворами для промывания

Опыт#	Условия Промывания 1	тт (%)
1	50 мМ Трис, 1.0 М ЯаС1, рН 7.5	2.78
2	50 мМ ацетата натрия, 1.5 М МпС12, рН 5.0*	0.77
3	50 мМ ацетата натрия, 1.5 Μ ΝίΟ12, рН 5.0*	0.47
4	50 мМ Трис, 2.0 М СаС12, рН 7.5	0.87

рН 5.0 выбирают из-за растворимости МпС1₂ и №С1₂.

В табл. 8 показано, что уровни НСР в образцах из опытов с промыванием растворами, содержащими соли двухвалентных катионов, в 1.5-3.5 раз ниже, чем уровни НСР в контрольных образцах (промывание раствором 1.0 М \аС1). В табл. 9 показано, что промывание растворами, содержащими соли двухвалентных катионов, обеспечивает >3.5-кратное удаление ΙΚΤ по сравнению с образцами из опытов с

- 27 015148 промыванием растворами 1.0 М №С1. Таким образом, эти результаты показывают, что промывание солями других двухвалентных катионов (например, МпС1₂ или \|С1₂), отличных от СаС1₂, также эффективно удаляет примеси.

Эквиваленты.

Специалисты в данной области техники знают или могут выяснить с помощью лишь обычных экспериментов многие эквиваленты конкретных экспериментов по изобретению в данном описании. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются нижеприведенной формулой изобретения.

Перечень последовательностей <110> ЭЛАН ФАРМА ИНТЕРНЭШНЛ ЛИМИТЕД <120> СПОСОБЫ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ К БЕТА-АМИЛОИДУ <130> ЕЬЫ-053РС <150> 60/691,821 <151> 2005-06-17 <160> 47 <170> РаЬепЫп νθΓΞΪοη 3.3 <210> 1 <211> 219 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая конструкция

<400> 1

Θΐη

Зег Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

<31у

Азр 1

Уа1

Уа1

Мер

ТЬг 5

С1и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз Ьуз

Зег

Зег

<31п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

Азр

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп Тгр

Ьеи

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

О1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Θΐη

Агд

Ьеи

11е

Туг

Ьеи Уа!

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

О1и

А1а

С1и

Азр Уа!

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Тгр

С1п

С1у

85

90

95

ТЬг

ΗΪ3

РЬе

Рго

Агд

ТЬг

РЬе <31у

01п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

115

120

125

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

А1а Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

130

135

140

- 28 015148

Туг 145

Рго

Агд (31и А1а

Ьуз 37а1 150

С1п Тгр Ьуз

Уа1 Азр Азп 155

А1а Ьеи С1п 160

Зег

С1у

Азп

Зег

61п

С1и

Зег

Уа1

Ткг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

165

170

175

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

Ткг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

180

185

190

Ьуз

ΗΪ8

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

Ткг

Η13

С1п

<31у

Ьеи

Зег

Зег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

Рке

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

215

<210> 2 <211> 449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая конструкция <400> 2

С1и 1

Уа1

<31п Ьеи

Ьеи С1и 5

Зег

(31у <31у С1у Ьеи Уа1 10

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

Рке

Ткг

Рке

Зег

Азп

Туг

20

25

30

С1у

Мек

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Зег

Не

Агд

Зег

С1у

С1у

С1у

Агд

Ткг

Туг

Туг

Зег

Азр

Азп

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

Рке

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

<31п

Мек

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

Ткг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Туг

Азр

Нхз

Туг

Зег

С1у

Зег

Зег

Азр

Туг

Тгр

С1у

(31п

С1у

100

105

но

- 29 015148

ТЬг Ьеи Уа1

ТЬг Уа1

Зег

Зег А1а 120

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго 125

Зег

Уа1

РЬе

115

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

ΗΪ3

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

180

185

190

5ег

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

Не

Суз

Азп

Уа1

Азп

ΗΪ5

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

(31и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

210

215

220

ТЬг

ΗΪ8

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Рго

225

230

235

240

Зег

Да1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЪ

11е

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

ΗΪ3

С1и

Азр

260

265

270

Рго

(31и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Η13

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

(Ни

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

340

345

350

- 30 015148

Ьеи

Рго

Рго 355

Зег

Агд С1и

С1и

Мер 360

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1 365

Зег Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

370

375

380

Зег

Азп

<Э1у

<31п

Рго

<31и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мер

ΗΪ8

С1и

420

425

430

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Азп

Нтз

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

435

440

445

Ьуз <210> 3 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (1) <223> Азр или Туг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (7) <223> Зег или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (10) <223> Зег или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (15) <223> Ьеи, Не, или Уа1 <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (50) <223> Агд или Ьуз

- 31 015148 <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (88) <223> νβΐ или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (109) <223> Уа1 или Ьеи <400> 3

Хаа 1

Уа1

Х7а1

Мер

ТЬг 5

<31п

Хаа Рго Ьеи

Хаа Ьеи 10

Рго Уа1 ТЬг Хаа 15

С1у

С1п

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

Азр

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Ьеи

С1п

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Хаа

Агд

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

О1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

(31и

Азр

Хаа

61у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Тгр

61п

<31у

85

90

95

ТЬг

Η13

РЬе

Рго

Агд

ТЬг

РЬе

С1у

(31у

С1у

ТЬг

Ьуз

Хаа

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

Агд

<210> 4

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (3) <223> Θΐη, Ьуз, или Агд <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (78)

- 32 015148 <223> Зег или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (87) <223> Агд или Ьуз <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (88) <223> А1а, Зег, или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (114) <223> Ьеи, ТЬг, Не, или Уа1 <400> 4

С1и 1

Уа1 Хаа

Ьеи

Уа1 5

<31и

Зег

<31у С1у С1у Ьеи Уа1 10

О1п

Рго

61у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

С1у

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

Туг

20

25

30

С1у

Мер

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

(31и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Зег

11е

Агд

Зег

С1у

С1у

<31у

Агд

ТЬг

Туг

Туг

Зег

Азр

Азп

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

С1и

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Хаа

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Хаа

Хаа

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Туг

Азр

ΗΪ3

Туг

Зег

С1у

Зег

Зег

Азр

Туг

Тгр

С1у

Θΐη

С1у

100

105

но

ТЬг Хаа Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210> 5 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 5

Азр Уа1 Уа1 МеЪ ТЬг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЬг Ьеи <31у

- 33 015148

О1и Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз

Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр

3540

Рго Агд Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1

5055

Азр Агд РЬе Зег С1у Зег <31у Зег

6570

Зег Агд \7а1 С1и А1а С1и Азр Уа1

Тпг Н1ь РЬе Рх<_> А1у ТЬг РЬе С1у

100

	10					15
Зег 25	Зег	С1п	Зег	Ьеи	Ьеи 30	Азр	Зег
Ьеи	С1п	С1п	Агд	Рго 45	б1у	С1п	Зег
Зег	Ьуз	Ьеи	Азр 60	Зег	С1у	Уа1	Рго
С1у	ТЬг	Азр 75	РЬе	ТЬг	Ьеи	Ьуз	11е 80
С1у	Уа1 90	Туг	Туг	Суз	Тгр	Θΐη 95	(31у
С1п 105	С1у	ТЬг	Ьуз	ν&ι	С1и но	Не	Ьуз

Агд <210> 6 <211> 119 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 6

(31 и Уа.1 1

Θΐη

Ьеи

Уа1 5

(31 и

Зег

<31у

(31у

С1у 10

Ьеи Уа1

С1п Рго

С1у 15

(31у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

<31у

Зег

(31у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

Туг

20

25

30

С1у

МеЕ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

<31у

Ьуз

С1у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Зег

11е

Агд

Зег

(31у

(31у

С1у

Агд

ТЬг

Туг

Туг

Зег

Азр

Азп

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

С1и

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

- 34 015148

Ьеи

(31п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Туг

Азр

Η13

Туг

Зег

С1у

Зег

Зег

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

<31у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210> 7 <211> 219 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 7

Азр 1

Уа1

Уа1

Мер

ТЬг 5

О1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи 15

С1у

(31п

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

Азр

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Ьеи

61п

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Агд

Агд

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

<31у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Тгр

Θΐη

О1у

85

90

95

ТЬг

ΗΪ3

РЬе

Рго

Агд

ТЬг

Рпе

<31у

<31у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

(31и

11е

Ьуз

100

105

но

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

115

120

125

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

130

135

140

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

145

150

155

160

- 35 015148

Зег

С1у Азп

Зег С1п 61и 165

Зег Х7а1

ТЬг С1и Θΐη 170

Азр

Зег

Ьуз Азр 175

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

180

185

190

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

(31и

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

С1п

61у

Ьеи

Зег

Зег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

215

<210> 8 <211> 449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 8

С1и 1

Уа1

<31п Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у Ьеи 10

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

О1у

Зег

<31у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

Туг

20

25

30

С1у

МеЬ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

<31у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Зег

Не

Агд

Зег

61у

<31у

61у

Агд

ТЬг

Туг

Туг

Зег

Азр

Азп

Уа1

50

55

60

Ьуз

<31у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

<31и

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Туг

Азр

ΗΪ3

Туг

Зег

С1у

Зег

Зег

Азр

Туг

Тгр

<31у

С1п

С1у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

- 36 015148

130 135 140

С1у 145

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр Туг 150

РЬе

Рго

С1и Рго 155

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр 160

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

ΗΪ3

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

Θΐη

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

180

185

190

Зег

Зег

Ьеи

61у

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

ΗΪ3

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

210

215

220

ТЬг

ΗΪ3

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

<31и

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Мер

11е

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

ΗΪ3

61и

Азр

260

265

270

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

ΗΪ3

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

ΗΪ8

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

<31п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

340

345

350

Ъеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

61и

370 375 380

- 37 015148

5ег Азп 385

С1у

СЯп

Рго

<31и 390

Азп Азп Туг

Ьуз

ТЬг 395

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи 400

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Η13

С1и

420

425

430

А1а

Ьеи

ΗΪ8

Азп

ΗΪ8

Туг

ТЬг

<31п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

435

440

445

Ьуз <210> 9 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (3) <223> \7а1 или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (7) <223> Зег или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (14) <223> ТЬг или Зег <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (17) <223> 61п, Азр, или Азп <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (30) <223> Не или Уа1 <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (50)

- 38 015148 <223> Агд или Ьуз <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (88) <223> \7а1 или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (105) <223> С1у или А1а <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (109) <223> Уа1 или Ьеи

<400> 9

Рго

Ьеи

Зег Ьеи 10

Рго

Уа1

Хаа

Ьеи 15

С1у

Азр 1

Уа1

Хаа МеЬ

ТЬг С1п 5

Хаа

Хаа

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

<31п

Азп

11е

Хаа

Η13

Зег

20

25

30

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Хаа

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

<31у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Хаа

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

РЬе

Θΐη

С1у

85

90

95

Зег

Η13

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

Хаа

61у

ТЬг

Ьуз

Хаа

61и

11е

Ьуз

100

105

но

Агд <210> 10 <211> 123 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

- 39 015148

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (1) <223> <31п или <31и

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (2)

<223> \7а1 или А1а

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (64)

<223> Зег или ТЬг

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (77)

<223> Ьуз или Агд

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (78)

<223> Зег или ТЬг

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (83)

<223> ТЬг или Зег

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (84)

<223> Меи, 11е, или Ьеи

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

<222> (86)

<223> Азп, Зег, или ТЬг

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (87) <223> Мер, ν&1, или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (118) <223> Ьеи или Зег <400> 10

Хаа 1

Хаа

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

О1и

Зег С1у

Рго Уа1 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

С1и

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

О1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

О1у

Ме£

С1у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

<31п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

- 40 015148

Тгр Ьеи

А1а

ΗΪ3

Не Туг

Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд Туг

Азп

Рго

Хаа

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Хаа

Хаа

(31п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Хаа

Хаа

ТЬг

Хаа

Хаа

Азр

Рго

Х7а1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

Уа1

Агд

Агд

Рго

11е

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Меб

Азр

Туг

100

105

110

Тгр

С1у

(31п

С1у

ТНг

Хаа

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 11 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 11

Азр Уа1 1

Уа1

Меб

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег Ьеи 10

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи С1у 15

С1п

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Азп

11е

11е

Н1з

Зег

20

25

30

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

<31у

Зег

<31у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

О1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

РЬе

С1п

61у

85

90

95

Зег

ΗΪ3

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Т1е

Ьуз

100

105

110

Агд

- 41 015148 <210> 12 <211> 123 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 12

Бег

С1у Рго

Уа1 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

ТЬг 15

С1и

С1п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

О1и

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Бег

С1у

РЬе

Бег

Ьеи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

С1у

Мер

С1у

Уа1

Бег

Тгр

Не

Агд

Θΐη

Рго

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Нтз

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Бег

С1п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

ТЬг

Мер

ТЬг

Азп

Мер

Азр

Рго

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

85

90

95

Суз

Уа1

Агд

Агд

Рго

Не

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

А1а

Мер

Азр

Туг

100

105

110

Тгр

(31п

σΐη

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 13

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 13

Азр Уа1 Уа1

Мер

ТЬг

С1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Ьеи

О1у

1

5

10

15

С1п Рго А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

С1п

Азп

Не

Не

ΗΪ5

Бег

20

25

30

- 42 015148

Азп С1у

Азп 35

ТЬг Туг Ьеи

С1и

Тгр 40

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго 45

С1у

С1п

Бег

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Агд

РЬе

Бег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Бег

С1у

Бег

С1у

Бег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа1

С1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

РЬе

С1п

<31у

85

90

95

Бег

ΗΪ3

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

<31у

61у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Бег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Бег

Азр

С1и

115

120

125

С1п

Ьеи

Ьуз

Бег

01у

ТЬг

А1а

Бег

Уа1

\7а1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

130

135

140

Туг

Рго

Агд

С1у

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

145

150

155

160

Бег

61у

Азп

Бег

С1п

С1и

Бег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Бег

Ьуз

Азр

Бег

165

170

175

Туг

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

180

185

190

Ьуз

Η13

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

С1п

С1у

Ьеи

Бег

Бег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Бег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210 215 <210> 14 <211> 453 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 14

С1и Уа1 ТЬг Ьеи Ьуз 61и Бег С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1и

- 43 015148

10 15

Ткг Ьеи Ткг

Ьеи 20 Уа1

Ткг Зег

Суз Тгр

Ткг 11е

Рке Зег С1у Рке

Зег Ьеи

Зег 30 А1а

Ткг Ьеи

Зег 61и

25

Рго

<31у Мек

С1у 35

Агд 40

О1п Рго

С1у

Ьуз 45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ3

11е

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

Ткг

Не

Зег

Ьуз

Азр

Ткг

Зег

Ьуз

Зег

С1п

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Ьеи

Ткг

Мек

Ткг

Азп

Мек

Азр

Рго

Уа1

Азр

Ткг

А1а

Ткг

Туг

Туг

85

90

95

Азр

Суз

Уа1

Агд

Агд

Рго

Не

Ткг

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Мек

Азр

Туг

100

105

но

Тгр

С1у

С1п

С1у

Ткг

Ьеи

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

Ткг

Ьуз

С1у

115

120

125

Рго

Зег

Уа1

Рке

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ткг

Зег

61у

61у

130

135

140

Ткг

А1а

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

Рке

Рго

С1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

Ткг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

Ткг

Зег

(31у

Уа1

Н13

Ткг

Рке

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

180

185

190

Ткг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

С1у

Ткг

С1п

Ткг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Η13

Ьуз

Рго

Зег

Азп

Ткг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

210

215

220

Зег

Суз

Азр

Ьуз

Ткг

Н1з

Ткг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

С1у

О1у

Рго

Зег

Уа1

Рке

Ьеи

Рке

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

Ткг

- 44 015148

245 250 255

Ьеи

МеЬ

11е

Зег Агд 260

ТЬг

Рго

(31и Уа1 265

ТЬг

Суз

Уа1 Уа1

Уа1 270

Азр

Уа1

Зег

Η13

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

275

280

285

С1и

Уа1

ΗΪ3

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

290

295

300

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Η13

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

<31и

Рго

340

345

350

Θΐη

\7а1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

355

360

365

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1п

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Туг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

61п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

420

425

430

Уа1

МеЬ

Н1з

<31и

А1а

Ьеи

ΗΪ8

Азп

ΗΪ3

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

435

440

445

Ьеи Зег Рго С1у Ьуз

450 <210> 15 <211> 132 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 45 015148 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1) .. (20) <220>

<221> зрелый пептид <222> (21)..(132) <400> 15

МеЪ -20

Агд Ьеи

Рго

А1а

<31п Ьеи Ьеи <31у Ьеи Ьеи

Мек Ьеи

Тгр

Уа1

Зег -5

-15

-10

С1у

Зег

Зег

С1у

Азр

Уа1

Уа1

Мек

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

-1

1

5

10

Уа1

ТЬг

Рго

С1у

О1и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Азп

15

20

25

Не

Уа1

ΗΪ5

Зег

Азп

<31у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

<31п

Ьуз

30

35

40

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

45

50

55

60

Зег

О1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

Туг

80

85

90

Суз

РЬе

Θΐη

61у

Зег

ΗΪ3

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

<31п

С1у

ТЬг

Ьуз

95

100

105

Ьеи С1и 11е Ьуз

110 <210> 16 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)..(19)

- 46 015148 <220>

<221> зрелый пептид <222> (20)..(142) <400> 16

Мер

Ьуз

ΗΪ8

Ьеи

Тгр -15

РЬе РЬе

Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 -10

А1а

А1а Рго

Агд -5

Тгр

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

(31 и

Зег

(31у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

-1

1

5

10

Рго

Зег

(31и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

С1у

Мер

С1у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

<31п

Рго

Рго

О1у

Ьуз

30

35

40

45

61у

Ьеи

(31и

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

11е

Туг

Тгр

Азр

С1и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

Азп

Θΐη

Уа1

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд

Агд

11е

11е

Туг

Азр

Уа1

О1и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

110 115 120 <210> 17 <211> 131 <212> БЕЛОК <213> Домовая мышь <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1) . . (19) <220>

<221> зрелый пептид <222> (20)..(131) <400> 17

Мер

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1 -15

Агд

Ьеи

Ьеи

Уа1

Ьеи -10

Мер

РЬе

Тгр

Не

Рго -5

А1а

Зег

Зег

Зег

Азр

Уа1

Ьеи

Мер

ТЬг

С1п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

- 47 015148

5 10

Зег

Ьеи <31у 15

Азр <31п А1а

Зег 20

11е

Зег Суз Агд

Зег 25

Зег <31п

Азп

11е

Уа1

Н1з

Зег

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

О1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

30

35

40

45

61у

<31п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

61у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

<31у

Зег

<31у

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

65

70

75

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Ьеи

<31у

Уа1

Туг

Туг

Суз

80

85

90

РЬе

С1п

С1у

Зег

Низ

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

100 105 <31и Ьеи Ьуз

110 <210> 18 <211> 142 ' <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)..(19) <220>

<221> зрелый пептид <222> (20)..(142)

<400> 18

Ьеи -10

Уа1

А1а

А1а

Рго

Агд -5

Тгр

Мер

Ьуз

ΗΪ3

Ьеи

Тгр -15

РЬе

РЬе

Ьеи

Ьеи

Уа1

Ьеи

Зег

<31п

Ьеи

С1п

Ьеи

О1п

<31и

Зег

<31у

Рго

<31у

Ьеи

Уа1

Ьуз

-1

1

5

10

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

- 48 015148

Зег 30

ТЬг

Азп 61у

МеЬ

С1у Уа1 35

Зег Тгр

11е Агд С1п 40

Рго

Рго

С1у

Ьуз 45

О1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

С1у

Η13

11е

Туг

Тгр

Азр

О1и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

Азп

О1п

РЬе

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд

Агд

11е

11е

Туг

Азр

Уа1

С1и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

<31п

<31у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

110

115

120

<210> 19 <211> 142 , <212> БЕЛОК ' <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> СИГНАЛ <222> (1) .. (19) <220>

<221> зрелый пептид <222> (20) .. (142)

<400> 19

Ьеи Тгр -15

РЬе

РЬе

Ьеи Ьеи

Ьеи Уа1 -10

А1а А1а

Рго Агд Тгр -5

МеЕ

Ьуз

Нгз

Уа1

Ьеи

Зег

<31п

Ьеи

С1п

Ьеи

Θΐη

61и

Зег

61у

Рго

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

-1

1

5

10

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

<31у

МеЬ

С1у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

<31п

Рго

Рго

<31у

Ьуз

30

35

40

45

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

С1у

ΗΪ5

11е

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

- 49 015148

Азп

Рго

Зег

Ъеи 65

Ъуз

Зег Агд

Уа1

ТЬг 11е Зег Ьуз Азр ТЬг

Зег

Ьуз

70

75

Азп

61п

Уа1

Зег

Ъеи

Ъуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд

Агд

11е

11е

Туг

Азр

Уа1

С1и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

61п

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

110

115

120

<210> 20 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 20

Азр 1

Уа1

Уа1

МеЕ

ТЬг 5

<31п

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго Уа1

ТЬг

Рго 15

С1у

С1и

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег

11е

Уа1

ΗΪ8

Зег

20

25

30

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

<31у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

<31у

Уа1

Туг

Туг

Суз

РЬе

С1п

Зег

85

90

95

Зег

ΗΪ8

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

С1у

Θΐη

О1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210> 21 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

- 50 015148 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 21

С1п Уа1

С1п Агд

Ьеи Уа1

61и Зег

<31у С1у С1у Уа1 10

Уа1 Зег

С1п Ьеи

Рго Зег 30

С1у Агд 15

1 Зег

Ьеи

Ьеи 20

5 Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег 25

С1у

РЬе

ТЬг

Зег

О1у

МеЬ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

(31п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

Θΐη

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

<31у

<31п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
	115	120
<210>	22
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 22

σΐη 1

Уа1

О1п Ьеи Уа1 5

С1и

Зег

61у (31у С1у Уа1 10

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

О1у

Мер

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

<31п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

- 51 015148

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

О1п

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

НО

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 23 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 23

<31п Уа1 1

С1п Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег С1у С1у

С1у Уа1 Уа1 <31п 10

Рго С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

61у

МеЕ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

<31п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

О1п

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

но

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

- 52 015148 <210> 24 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 24

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег С1у С1у

С1у Уа1 10

Уа1

С1п

Рго

<31у 15

Агд

Зег

Ъеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Мек

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ5

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Рке

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

Θΐη

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

61п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
	115	120
<210>	25
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 25
С1п Уа1 О1п Ьеи Уа1	О1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1	С1п Рго О1у Агд
1 5	10	15

Зег Ьеи Агд Ьеи	Зег Суз А1а РЬе Зег С1у РЬе ТЬг Ьеи Зег ТЬг Зег
20	25	30

- 53 015148

61у

Мер

Бег Уа1 35

61у

Тгр 11е Агд 40

С1п А1а Рго

С1у

Ьуз 45

61у

Ьеи С1и

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

<31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
	115	120
<210>	26
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 26

С1п 1

Уа1 С1п

Ьеи

Уа1 5

61и

Бег

С1у С1у С1у Уа1 Уа1 10

<31п Рго

С1у 15

Агд

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

РЬе

Бег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

С1у

Мер

Бег

Уа1

<31у

Тгр

11е

Агд

<31п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Η13

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

<31п

Мер

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд' Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

но

- 54 015148

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг \7а1 Зег Зег

115 120 <210> 27 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 27

С1п Уа1 1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

<31у С1у \7а1 10

Уа1

С1п

Рго

<31у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

О1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Меб

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ8

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

(31п

Меб

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

О1у

Θΐη

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 28 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 28

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у <31у (31у Уа1 Уа1 Θΐη Рго С1у Агд

10 15

- 55 015148

Зег Ьеи

Агд

Ьеи 20

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег 25

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег 30

ТЬг

Зег

С1у

Мек

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

(31у

Ьуз

<31у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Η13

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Мек

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

О1у

С1п

100

105

110

(31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 29 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое _г гуманизированное антитело <400> 29

<31п Уа1 1

(31п Ьеи

Уа1 5 Зег

С1и Суз

Зег С1у

С1у С1у Уа1

Уа1 Зег

С1п Рго Ьеи Зег 30

С1у Агд 15

Агд

Ьеи 20

А1а

РЬе

Зег 25

10 61у

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Мек

Зег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1 и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ5

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Мек

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

- 56 015148

Суз А1а Агд Агд Ткг Ткг Ткг А1а Азр Туг Рке А1а Туг Тгр О1у О1п
100	105	110

О1у Ткг Ткг Уа1 Ткг Уа1	Бег Бег
115	120

<210> 30 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 30

Θ1Π 1

Уа1

О1п Ьеи Уа1 5

С1и Бег О1у

О1у

О1у Уа1 10

Уа1 О1п

Рго

О1у 15

Агд

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

Рке

Бег

О1у

Рке

Ткг

Ьеи

Бег

Ткг

Бег

20

25

30

С1у

Мек

Бег

Уа1

О1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Ьеи

Ткг

11е

Бег

Ьуз

Азр

Ткг

Бег

Ьуз

Азп

Ткг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

О1п

Мек

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

01 и

Азр

Ткг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

Ткг

Ткг

Ткг

А1а

Азр

Туг

Рке

А1а

Туг

Тгр

О1у

О1п

100

105

110

О1'г Ткг Ткг Уа1 Ткг	Уа1 Бег Бег 120
	115
<210>	31
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

- 57 015148 <400> 31

О1п 1

Уа1

С1п Ьеи

Уа1 5

61и

Зег

О1у С1у 01у Уа1 10

Уа1

О1п

Рго

С1у Агд 15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Мер

Зег

Уа1

<31у

Тгр'

Не

Агд

<31п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ8

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

\7а1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

Θΐη

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

(31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

61у

С1п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг \7а1 ТЬг Уа1 Зег Зег
	115	120
<210>	32	(
<211>	121
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 32

61п Уа1 1

С1п Ьеи \7а1 5

С1и

Зег

<31у С1у <31у Уа1 Уа1 10

О1п Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

(31у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Меи

Зег

Уа1

<31у

Тгр

Не

Агд

С1п

А1а

Рго

(31у

Ьуз

С1у

Ьеи

<31и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ5

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

- 58 015148

Туг Ьеи Θΐη Мер

Азп 85

Зег Ьеи Агд А1а

(31и 90

Азр ТЬг А1а

Уа1

Туг 95

Туг

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

Уа1

115

120

<210> 33 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 33

Θΐη 1

Уа1

(31п

Ьеи Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у С1у 10

Уа1 Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

МеР

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

МеР

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

61п

100

105

110

(31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег Уа1
	115	120
<210>	34
<211>	120
<212>	БЕЛОК

- 59 015148 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 34

<31п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег С1у С1у

С1у Уа1 10

Уа1 С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

МеЬ

Зег

Уа1

61у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

Ηίβ

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

61у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 35 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 35

С1п 1

Уа1

С1п Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

(31у <31у Уа1 10

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

<31у

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

МеЬ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

- 60 015148

Тгр Ьеи А1а ΗΪ8 50

11е

Тгр

Тгр Азр Азр Азр Ьуз Туг Туг

Азп Рго

Бег

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

61у

С1п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 5ег Бег
	115	120
<210>	36
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 36

(31п 1

Уа1

61п Ьеи

Уа1 5

61и Бег (31у

О1у С1у Уа1 10

Уа1

е1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

РЬе

Бег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

С1у

МеЬ

Бег

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

(31п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

Η13

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

О1п

Мек

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

- 61 015148 <210> 37 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 37

Уа1 5

С1и

Бег

С1у С1у О1у Уа1 10

Уа1

С1п

Рго

61у 15

Агд

Θΐη Уа1 1

Θΐη

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

РЬе

Бег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

С1у

Мер

Бег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

□ и

□ □

ои

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115 120 <210> 38 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 38 (31п Уа1 61п Ьеи Уа1 С1и Бег 61у С1у <31у Уа1 Уа1 С1п Рго С1у Агд

10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а РЬе Бег <31у РЬе ТЬг Ьеи Бег ТЬг Бег

25 30

- 62 015148

С1у

МеЕ

Бег 35

Уа1

О1у Тгр

11е Агд 40

61п

А1а

Рго С1у Ьуз 45

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ5

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ъуз

Бег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65

70

75

80

Туг

Ьеи

<31п

МеЕ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а.

Туг

Тгр

61у

С1п

100

105

110

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 39 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 39

С1п 1

Уа1

С1п Ьеи

Уа1 5

<31и

Бег

<31у С1у <31у Уа1 10 .

Уа1

С1п

Рго ,61у Агд 15

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

РЬе

Бег

С1у

РЬе

Бег

Ьеи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

С1у

МеЕ

Бег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

<31у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Уа1

А1а

ΗΪ3

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

65 .

70

75

80

Туг

Ьеи

С1п

МеЕ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

Θΐη

100

105

110

- 63 015148

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 40 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность ' <220>

<223> Описание искусственной, последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 40

Θΐη Уа1 1

С1п Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег 61у

С1у С1у 10

Уа1

Уа1

Θΐη

Рго

61у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

РЬе

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

<31у

Мер

Зег

Уа1

61у

Тгр

Уа1

Агд

Θΐη

А1а

Рго

<31у

Ьуз

<31у

Ьеи

61и

О с

Л г\

Л с

□

и

Тгр

Ьеи

А1а

Нгз

Не

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи Ьуз Зег Агд Ьеи ТЬг Не Зег Ьуз Азр ТЬг Зег Ьуз Азп ТЬг Уа1
65	' 70	75	80

Тух* И>еи Οΐπ хх£Х1 5от* Τ>αιί	Агд А1а С1и	Ζ,οη ФЪт- ΔΊ= \Ζ=Ί Т-.гг Πΐι,τν
85	90	95

Суз А1а Агд Агд ТЬг ТЬг ТЬг А1а Азр Туг РЬе А1а Туг Тгр (31у О1п
100	105	110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
	115	120
<210>	41
<211>	120
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 41

С1п Уа1 61п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 О1п Рго <31у Агд 15 10 15

- 64 015148

Зег

Ьеи Агд Ьеи 20

Зег Суз А1а

РЬе

Зег С1у РЬе 25

Зег

Ьеи Зег ТЬг 30

Зег

С1у

МеЕ

Зег

Уа1

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Η13

11е

Тгр

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

65

70

75

80

Туг

Ьеи

(31п

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

А1а

Азр

Туг

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 42 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220> ' <223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (2) <223> Уа1 или 11е <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (7) <223> Зег или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК .

<222> (14) <223> ТЬг или Зег <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (15) <223> Ьеи или Рго <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК

- 65 015148 <222> (30) <223> 11е или Уа1 <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (50) <223> Агд, С1п, или Ьуз <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (88) ' <223> Уа1 или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (105) <223> 61п или С1у ’ <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (108) <223> Ьуз или Агд <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (109) <223> Уа1 или Ьеи

<400> 42

Хаа

Рго

Ьеи

Зег Ьеи 10

Рго

Уа1

Хаа

Хаа 15

С1у

Азр Хаа 1

Уа1

Мер

ТЬг С1п 5

Θΐη

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Θΐη

Зег

Ьеи

Хаа

Туг

Зег

20

25

30

Азр

С1у

Азп

А1а

Туг

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

<31п

Зег

35

40

45

Рго

Хаа

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Хаа

61у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Зег

С1п

Зег

85

90

95

ТЬг

ΗΪ8

Уа1

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

С1у

Хаа

С1у

ТЬг ’

Хаа

Хаа

<31и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

- 66 015148 <210> 43 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной по гуманизированное антитело <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (1) <223> С1и или С1п <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (7) <223> Зег или Ьеи <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (46) <223> С1и, Уа1, Азр, или Зег <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (63) <223> ТЬг или Зег <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (75) <223> А1а, Зег, Уа1, или ТЬг <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (76) <223> Ьуз или Агд <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (89) <223> О1и или Азр ' <220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ОСТАТОК <222> (107) <223> Ьеи или ТЬг <400> 43

Хаа Уа1 Θΐη Ьеи \7а1 О1и Хаа С1у

5 следовательности.: Синтетическое

С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго (31у С1у .10 . . 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а

Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг

30

- 67 015148

Бег МеЪ

Бег Тгр 35

Уа1

Агд С1п

А1а 40

Рго'С1у Ьуз

С1у

Ьеи 45

Хаа Ьеи

Уа1

А1а

С1п

11е

Азп

Бег

Уа1

О1у

Азп

Бег

Ткг

Туг

Туг

Рго

Азр

Хаа

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

Рке

Ткг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

Хаа

Хаа

Азп

Ткг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

Хаа

Азр

Ткг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Бег

С1у

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

Ткг

Хаа

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

Бег

100

105

но

<210> 44 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 44

Бег

Рго Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго

Уа1

Ткг

Ьеи 15

С1у

Азр 1

Уа1

Уа1

Мек

Ткг <31п 5

С1п

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

Θΐη

Бег

Ьеи

11е

Туг

Бег

20

25

30

Азр

О1у

Азп

А1а

Туг

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

Рке

Ьеи

Θΐη

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Бег

35

40

45

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Агд

Рке

Бег

61у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

Рке

Бег

С1у

Бег

О1у

Бег

С1у

Ткг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

Ьуз

11е

с ε

7 п

75

о п

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

61и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Ткг

Туг

Суз

Бег

С1п

Бег

85

90

95

Ткг

Н1з

Уа1

Рго

Тгр

Ткг

Рке

<31у

<31п

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

- 68 015148 <210> 45 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 45

С1и 1

Уа1

С1п Ьеи

Уа1 5

С1и

Бег

С1у С1у С1у Ьеи 10

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Бег

Агд

Туг

20

25

30

Бег

Меб

Бег

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Ьеи

Х7а1

35

40

45

А1а

Θΐη

11е

Азп

Бег

Уа1

О1у

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Туг

РГО

Азр

ТЬг

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Бег

С1у

Азр

Туг

Тгр

61у

С1п

61у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

100

105

но

,<210> 46 <211> 219 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело <400> 46

Азр 1

Х7а1

Уа1

Меб

ТЬг 5

С1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег Ьеи 10

Рго Уа1

ТЬг

Ьеи 15

С1у

С1п

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

С1п

Бег

Ьеи

11е

Туг

Бег

20

25

30

Азр

б1у

Азп

А1а

Туг

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

РЬе

Ьеи

<31п

Ьуз

Рго

<31у

С1п

Бег

35

40

45

- 69 015148

Рго

Агд 50

Ьеи

Ьеи

11 е

Туг Ьуз Уа1 55

Бег Азп

Агд

РЬе 60

Бег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Бег

61у

Бег

С1у

Бег

СЯу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

\7а1

СЯи

А1а

61и

Азр

Уа1

СЯу

Уа1

Туг

Туг

Суз

Бег

С1п

Бег

85

90

95

ТЬг

Η13

Уа1

Рго

Тгр

ТЬг

РЬе

<31у

СЯп

СЯу

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

110

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Бег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Бег

Азр

<31и

115

120

125

СЯп

Ьеи

Ьуз

Бег

С1у

ТЬг

А1а

Бег

уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

130

135

140

Туг

Рго

Агд

<31и

А1а

Ьуз

Уа1

СЯп

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

СЯп

145

150

155

160

Бег

С1у

Азп

Бег

С1п

С1и

Бег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Бег

Ьуз

Азр

Бег

165

170

175

ТЬг

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

180

185

190

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

СЯп

С1у

Ьеи

Бег

Бег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Бег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

215

<210> 47 <211> 442 <212> БЕЛОК .

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическое гуманизированное антитело

<400> 47
<31и Уа1 СЯп Ьеи Уа1	С1и Бег 61у С1у С1у Ьеи Уа1	С1п Рго 61у С1у
1 5	10	15

Бег Ьеи Агд Ьеи	Бег Суз А1а А1а Бег 61у РЬе ТЬг РЬе Бег Агд Туг
20	25	30

- 70 015148

Зег Меи

Зег 35

Тгр Уа1

Агд

С1п А1а 40

Рго

О1у Ьуз

С1у

Ьеи 45

<31и

Ьеи

Уа1

А1а

Θΐη

11е

Азп

Зег

Уа1

С1у

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

ТЬг

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Меи

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

<31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Зег

С1у

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

100

105

но

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

115

120

125

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

<31у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

130

135

140

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

<31у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

145

150

155

160

(31у

Уа1

ΗΪ3

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

Θΐη

Зег

Зег

<31у

Ьеи

Туг

Зег

165

170

175

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

С1у

ТЬг

Θΐη

ТЬг

180

185

190

Туг

Не

Суз

Азп

Уа1

Азп

ΗΪ5

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

195

200

205

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

210

215

220

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

61у

61у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

225

230

235

240

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Меи

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

245

250

255

Уа!

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

ΗΪ3

С1и

Азр

Рго

<31и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

260

265

270

- 71 015148

Туг

Уа1

Азр О1у Уа1 <31и Уа1 Ншз

Азп

А1а Ьуз ТЬг Ьуз 285

Рго

Агд

<31и

275

280

61и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

290

295

300

ΗΪ5

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

305

310

315

320

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

<31у

325

330

335

С1п

Рго

Агд

(31и

Рго

(31п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

<31и

340

345

350

гпТ-. ν

/Т\

тт— Ί

Суз

Т 7-, Ί

Ьуз

<31 у

тлЪ.

ЪСи.

и. нх

Ъуз

Азп

V С1Х

Зеп

'.Ьеи

ТнГ

Ьеи

ναι

Туг

355

360

365

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

370

375

380

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

385

390

395

400

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

(31у

Азп

405

410

415

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мек

ΗΪ8

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ8

Азп

ΗΪ8

Туг

ТЬг

420

425

430

Θΐη

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

435

440

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (40)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ очистки Άβ-связывающего белка, содержащего область Рс, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, включающий стадии адсорбции Άβ-связывающего белка на Рс-связывающем агенте;

   промывания Рс-связывающего агента буферным раствором, содержащим СаС1₂ в концентрации от примерно 0,5 до примерно 3 М для удаления одной или более примесей;

   регенерации Άβ-связывающего белка из Рс-связывающего агента раствором для элюции.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой нежелательный вид белка, имеющего область Рс.
3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный нежелательный вид белка выбирают из группы, состоящей из вариантов считывания интронов (1КТ), вариантов с недостающими дисульфидными связями (ϋΌΒ), высокомолекулярных (НМШ) и низкомолекулярных (ШШ') вариантов частиц.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный нежелательный вид белка представляет собой 1КТ.
5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что Άβ-связывающий белок представляет собой антитело.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что антитело выбрано из группы, состоящей из слитого антитела, мышиного антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и человеческого антитела.
7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что Άβ-связывающий белок представляет собой гуманизированное антитело к Άβ.
8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что гуманизированное антитело к Άβ выбрано из группы, состоящей из 3Ό6, 10Ό5, 12А11, 266, 15С11 и 12В4.
9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что Άβ-связывающий белок получен методами рекомбинантной ДНК.
10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что Άβ-связывающий белок получен методами рекомбинант

    - 72 015148 ной ДНК в клетке яичника китайского хомячка (СНО).
11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что Ес-связывающий агент представляет собой белок Ά, или белок О, или их смесь.
12. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что Ес-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе.
13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что твердая фаза представляет собой гранулу, гель или смолу.
14. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что буферный раствор, содержащий СаС1₂, имеет величину рН в примерном интервале 4-8.
15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что буферный раствор, содержащий СаС12, имеет величину рН в примерном интервале 7,3-7,7.
16. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация СаС1₂ в буферном растворе равна примерно 0,5-2,5 М.
17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что концентрация СаС1₂ в буферном растворе равна примерно 1,0-2,5 М.
18. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что концентрация СаС1₂ в буферном растворе равна примерно 1,0-2,0 М.
19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, концентрация СаС1₂ в буферном растворе составляет около 2 М.
20. 20. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадии адсорбции Άβ-связывающего белка на Ессвязывающем агенте и промывания Ес-связывающего агента проводят в примерном температурном интервале 2-24°С.
21. 21. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна или более примесей выбраны из группы, состоящей из белка клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белка клеточной культуры и их смесей.
22. 22. Способ по п.2, отличающийся тем, что нежелательный вид Άβ-связывающего белка содержит одну или более цепей антитела или их фрагменты, имеющие последовательность считывания интрона, одну или более цепей антитела или их фрагменты, имеющие неподходящую дисульфидную связь, половину антитела или фрагмент этой половины антитела, димер легкой цепи или его фрагмент и димер тяжелой цепи или его фрагмент.
23. 23. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия регенерации Άβ-связывающего белка из Ессвязывающего агента включает использование буфера для элюции, имеющего рН в примерном интервале 2,0-6,5.
24. 24. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию хроматографии, выбранную из группы, состоящей из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла и хроматографии с гидрофобным взаимодействием (Н1С).
25. 25. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию очистки, выбранную из группы, состоящей из хроматографии на гидроксиапатите, диализа, аффинной хроматографии, осаждения сульфатом аммония, осаждения этанолом, обращенно-фазовой хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) и хроматофокусирования.
26. 26. Способ по п.2, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой один или более вариантов белка, полученного считыванием интронов, уровень которых в элюате по меньшей мере в 5 раз ниже, чем их уровень в исходной жидкости.
27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что уровень вариантов белка, полученного считыванием интронов, в элюате по меньшей мере в 10 раз ниже, чем их уровень в исходной жидкости.
28. 28. Способ по п.2, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой один или более вариантов белка, полученного считыванием интронов, составляющих менее 1% частиц указанного белка в элюате.
29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что варианты белка, полученного считыванием интронов, составляют менее примерно 0,8%, менее примерно 0,5%, менее примерно 0,2% частиц указанного белка в элюате.
30. 30. Способ по п.2, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой один или более вариантов частиц низкомолекулярного белка, составляющих менее примерно 1% частиц указанного белка в элюате.
31. 31. Способ по п.30, отличающийся тем, что низкомолекулярные варианты составляют менее примерно 0,8%, менее примерно 0,5%, менее примерно 0,2% частиц указанного белка в элюате.
32. 32. Способ по п.2, отличающийся тем, что одна или более примесей представляют собой один или более вариантов белка с недостающими дисульфидными связями, составляющих менее примерно 15% частиц указанного белка в элюате.
33. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что варианты с недостающими дисульфидными связями составляют менее примерно 10%, менее примерно 5%, менее примерно 2% частиц указанного белка в элюате.

    - 73 015148
34. 34. Способ по п.1, дополнительно включающий промывание Рс-связывающего агента, связанного с Ав-связывающим белком, буферным раствором, содержащим Νοί.Ί в концентрации по меньшей мере приблизительно 10 мМ после промывания СаС1₂.
35. 35. Способ по п.8, отличающийся тем, что гуманизированное антитело к Ав представляет собой гуманизированное антитело 3Ό6, включающее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Ε^ ΙΌ NО: 1, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Ε^ ΙΌ ^: 2.
36. 36. Способ по п.8, отличающийся тем, что гуманизированное антитело к Ав представляет собой гуманизированное антитело 3Ό6, включающее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Ε^ ΙΌ NО: 1, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности остатков 1-448 8Ер ΙΌ 2.
37. 37. Способ по п.5, отличающийся тем, что антитело представляет собой изотип 1дМ, Ι§Ο₁, Ι§Ο₂, Ι§Θ₃ или Ι§Ο₄.
38. 38. Способ по п.37, отличающийся тем, что антитело представляет собой изотип человеческого Ι§θ1.
39. 39. Способ по п.23, отличающийся тем, что буфер для элюции имеет рН в интервале от примерно 2,0 до примерно 4,0.
40. 40. Способ по п.36, отличающийся тем, что гуманизированное антитело 3Ό6 получено элюцией с использованием буфера, имеющего рН в интервале от 2,0 до 4,0.

    Лёгкая цепь

    РУУМТ<23РЕЗ

    ЕРУТРБЕРАЗ

    КЫУЪУЗКЪР

    ЗБУРРКЕЗБЗ