EA003577B1

EA003577B1 - S-нитрозотиолы в качестве агентов для лечения нарушений кровообращения

Info

Publication number: EA003577B1
Application number: EA200100823A
Authority: EA
Inventors: Хосе Репольес Молинер; Эдуардо Салас Перес-Расилья; Франсиско Пубиль Кой; Хуан-Антонио Серда Риудаветс; Кристина Негрье Рофес; Лидия Кабеса Льоренте; Алисия Феррер Сисо; Нурия Триас Адроер; Марсель.ли Карбо Банус; Хесус Мурат Морено; Педро Мичелена Льягуно
Original assignee: Ласер, С.А.
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2003-06-26
Also published as: BG105824A; SI1157987T1; AP1439A; KR20010101767A; IL144381A0; ZA200106182B; NO20013385L; EE200100389A; CU23098A3; HUP0105203A2; IS6020A; GB2363604B; BG64983B1; US6800612B2; AP2001002247A0; HRP20010562A2; IL144381A; DE10083902T1; NO326806B1; DK1157987T3

Abstract

Новые S-нитрозотиоловые производные пеницилламина или глутатиона и их фармацевтически приемлемые соли, которые соответствуют следующей общей формуле (I)в которой А и В являются фенильными группами или же вместе образуют остаток -CH-Q-CH-, образующий шестичленное кольцо, в котором Q представляет собой атом кислорода или серы, или группу N-R, в которой Rявляется водородом или алкильной группой C-C;Rявляется ацильным остатком, который может быть алифатической ацильной группой C-Cили остатком глутаминовой кислоты, связанным через его неаминокислотный карбоксил;Rявляется гидроксильной группой или остатком глицина, связанным через его пептидную связь;при условии, что когда Rявляется алифатическим ацильным остатком, тогда Rявляется гидроксильной группой, а когда Rявляется остатком глутаминовой кислоты, тогда Rявляется остатком глицина.Указанные новые соединения обладают сосудорасширяющей активностью и ингибируют агрегацию тромбоцитов, что делает их применимыми для лечения дисфункций системы кровообращения, в частности, на уровне сердечно-сосудистой системы.

Description

Настоящее изобретение связано с новыми 8-нитрозотиоловыми производными пеницилламина или глутатиона, которые обладают сосудорасширяющими свойствами и которые ингибируют агрегацию тромбоцитов и, следовательно, могут быть полезны в изготовлении лекарственных средств для лечения дисфункций системы кровообращения, в частности на уровне сердечно-сосудистой системы.

Предпосылки создания изобретения

Хорошо известно, что соединения, способные высвобождать окись азота (N0) в организме, часто проявляют тот или иной тип активности в отношении сосудистой системы, например сосудорасширяющую активность или ингибирование агрегации тромбоцитов, что делает их потенциально полезными для лечения различных заболеваний, связанных с дисфункциями системы кровообращения.

Кроме того, описано также, что специфические производные, которые содержат 8нитрозотиоловую группу, имеют с медицинской точки зрения преимущественные свойства, благодаря которым они обладают способностью высвобождения окиси азота в организме.

Кабош8к1 е! а1., Вг.1.Рйагшасо1., (1992) 107, 745-749, описывают способность соединения 3нитрозоглутатиона (Θ8Ν0) ингибировать активность тромбоцитов.

Оойпо е! а1., Сйси1а!юп Везеагсй, 71, № 6 (1992), сообщают, что 8-нитрозоцистеин способен ингибировать активность тромбоцитов благодаря его антитромботическому действию.

У 8тИК е! а1., Ме!. Ρίπά. Ехр. С1те. Рйагтасу., (1994), 16, 5, описано, что Θ8Ν0 оказывает сильное расслабляющее действие на артериолы.

В заявке АО 95/12394 описано применение 8-нитрозоаддуктов пептидов, среди прочих 8-нитрозо-№ацетилпеницилламинов (8ΝΑΡ), в качестве защитных агентов против воспаления сосудов травматической природы.

В заявке АО 95/07691 описано применение различных 8-нитрозотиолов, в частности Θ8Ν0, в лечении и профилактике действия тромбоцитов и образования тромбозов на поверхности поврежденного сосуда.

В заявке АО 93/09806 описаны 8нитрозированные белки или аминокислотные остатки, способные высвобождать N0, которые оказывают расслабляющее действие на мускулатуру и ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов.

В патенте ЕР-В1-412699 описаны 8нитрозотиолы, которые соответствуют следующей общей формуле:

и их применение в качестве терапевтических агентов против сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, в качестве антигипертензивных агентов (повышенное кровяное давление) и в качестве агентов для лечения грудной жабы. Количество возможных соединений в рамках этой формулы огромно, и данное описание охватывает только несколько десятков таких продуктов. Далее, в данном патенте описаны только данные, относящиеся к общему сосудорасширяющему действию этих соединений, и ничего не сказано об их активности в отношении тромбоцитов.

8-Нитрозотиолы, описанные в указанных выше публикациях, сами по себе не решают множества сложных проблем в рамках лечения сосудистых заболеваний, в частности, на уровне сердечно-сосудистой системы. Следовательно, необходимы новые соединения, которые окажутся более сильнодействующими и эффективными.

Краткое описание изобретения

Объект данного изобретения связан с новыми 8-нитрозотиоловыми производными пеницилламина или глутатиона, которые оказывают как мощное сосудорасширяющее действие, так и сильное ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов.

Далее, объект данного изобретения связан с применением новых соединений для производства лекарственных средств для лечения расстройств, связанных с дисфункциями системы кровообращения, в частности, на сердечнососудистом уровне.

Подробное описание изобретения

Соединения согласно изобретению представляют собой 8-нитрозотиоловые производные пеницилламина или глутатиона и их фармацевтически приемлемые соли, которые соответствуют следующей общей формуле (I)

о в которой

А и В представляют собой фенильную группу или вместе образуют остаток -СН₂^СН₂-, образующий шестичленное кольцо, в котором С) представляет собой атом кислорода, серы или группу Ν-К³, в которой К³ является водородом или алкильной группой С₁-С₄;

К¹ представляет собой ацильный остаток, который может быть алифатической С₁-С₅ацильной группой или остатком глутаминовой кислоты, связанным через его неаминокислотный карбоксил;

К² является гидроксильной группой или глициновым остатком, связанным пептидной связью;

при условии, что когда К¹ представляет собой остаток алифатического ацила, тогда К²является гидроксильной группой, а когда К¹представляет собой остаток глутаминовой кислоты, К² является остатком глицина.

Следовательно, соединения согласно изобретению соответствуют следующим формулам

выше, а К⁴ представляет собой С₁-С₄алкильную группу, или их фармацевтически приемлемым солям.

Предпочтительными примерами соединений в рамках настоящего изобретения являются следующие:

Ы-ацетил-2-амино-2-[4-(4-8-нитрозомеркаптотетрагидропиран)]уксусная кислота (1)

Ы-ацетил-2-амино-2-[4-(4-8-нитрозомеркапто-1 -метилпиперидин)]уксусная кислота (2)

Ы-ацетил-2-амино-3-бензил-3-8-нитрозомеркапто-4-фенилбутановая кислота (3)

Ы-[Ы-у-Е-глутамил-2-амино-2-(4-(4-8нитрозомеркапто)тетрагидропиран)ацетил]

Ы-[Ы-у-Е-глутамил-2-амино-2-(4-(4-8нитрозомеркапто-1 -метилпиперидин))ацетил] глицин (5)

Ы-[Ы-у-Е-глутамил-2-амин-3-бензил-3-(8нитрозомеркапто)-4-фенилбутаноил] глицин (6)

Для специалиста является очевидным, что соединения согласно изобретению включают в себя хиральные центры, и это позволяет различать возможные изомеры и/или их смеси. Должно быть понятно, что как смеси изомеров, так и чистые изомеры входят в рамки данного изобретения. Последние можно получить из смеси изомеров, используя обычные технические приемы, хорошо известные эксперту, или же путем асимметрического синтеза, который тоже хорошо известен эксперту.

Соединения согласно изобретению можно получить различными способами, и конкретно выбираемый способ зависит от их основной структуры.

Например, соединения общей формулы (II) можно получить в соответствии с последовательностью этапов, иллюстрируемых следующей схемой.

Т.е., начиная с гидрохлоридов аминокислот, которые можно получить известными способами (см., например, документы ΏΕ-Ά3023830 и ΏΕ-Ά-2801849), последующего ацилирования азотной группы аминокислоты общеизвестными приемами, например, с помощью хлорангидрида кислоты, и кончая введения нитрозогруппы через серу меркаптогруппы, также с использованием традиционных способов.

Что касается соединений общей формулы (III), они могут быть получены согласно после5 довательности этапов, проиллюстрированных на следующей схеме.

Т.е., начиная с тех же гидрохлоридов аминокислот, что и в приводимом выше случае, затем проводят защиту меркаптогруппы путем образования тиоэфира параметилбензила. Затем следует защита азота аминокислоты с помощью общеизвестной Вос-защиты, и, наконец, с помощью известных приемов твердофазных методик техники (см., например, Вагапу, С. е! а1., ТНе Рерййе8, 2, 1, Ого88, Е. Ме1епйо£ег, Ей8. Асайеш1с Рге88, ΝΥ (1980); 81е^аг1. ЕМ. е! а1., 8о11й Рйаке РерОйе 8у п(11е818, Егеетап, 8ап Егапс18со, СА (1969); Войап^ку, М. е! а1., РерОйе 8уШ11е818, 2^пй ей., ^йеу, ΝΥ (1976)) получают трипептид с остатками глутаминовой кислоты и глицина (С-концевая аминокислота).

Образование трипептида включает в себя следующие стадии:

a) закрепление С-концевой аминокислоты глицина (С1у) в виде производного третбутоксикарбонила (Вос) на параметилбензилгидриламин/полистирольной смоле;

b) удаление Вос-группы трифторуксусной кислотой и нейтрализация;

c) введение промежуточной защищенной модифицированной аминокислоты;

й) оценка реакции связывания посредством нингидрина (Ка18ег Е. е! а1., Апа1. Вюсйеш., 34, 595 (1970));

е) повторение указанной выше стадии для остатка γ-глутаминовой кислоты (у-О1и), которая включена в качестве Вос-производной или бензилзащищенной (Вос-С1и-ОВ/1);

ί) ацидолиз с помощью безводного НЕ для снятия защиты с трипептида и высвобождения его из смолы;

д) очистка и анализ свойств конечных продуктов.

Сразу после образования трипептида переходили к конечному этапу нитрозирования меркаптогруппы, высвободившейся из защищающей ее группы.

Приведенные тесты показали, что 8нитрозированные соединения согласно изобретению обладают сосудорасширяющей активностью, которая, по меньшей мере, сравнима с таковой Ο8ΝΟ, а в некоторых случаях значительно выше ее. Кроме того, они оказывают ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов, которое при сравнении близко или выше действия Ο8ΝΟ, а в некоторых случаях значительно превосходящее его.

Это означает, что соединения согласно изобретению можно очень эффективно использовать для изготовления лекарственного средства, обладающего сосудорасширяющим и антитромботическим действием, для лечения дисфункций системы кровообращения, в особенности на сердечно-сосудистом и коронарном уровнях.

Следовательно, соединения общей формулы (I), также как и их фармацевтически приемлемые соли, могут быть использованы с применением общеизвестных фармацевтических технологий для получения лекарственных средств, которые можно вводить различными способами.

В качестве примера, их можно вводить перорально в качестве лекарственных средств в виде таблеток, капсул, сиропов и суспензий. Парентерально, например, в виде растворов или эмульсий и т.д. Их можно применять также местно в виде кремов, мазей, бальзамов и т. д. или же трансдермально с применением пластырей или повязок. Их можно применять непосредственно к прямой кишке в виде суппозиториев. Указанные лекарственные средства могут включать в себя физиологически приемлемые носители, эксципиенты, активаторы, хелатирующие агенты, стабилизаторы и т.д. В случае инъекций они могут быть включены в качестве физиологически приемлемых буферов, солюбилизирующих агентов или изотонических растворов. Суточная доза может варьировать в зависимости от возраста, веса тела пациентов, способа введения и т. д., обычная суточная доза для взрослого человека может составлять от 0,1 до 500 мг, и такая доза может вводиться либо в виде однократной дозы, либо может быть разделена на несколько доз, вводимых в течение суток.

В рабочих примерах (приведенных ниже) детально описаны способы получения различных соединений, соответствующих общей формуле (I). В отношении этих примеров следует сказать, что в компетенции специалиста в данной области решать, следовать ли ему в точности приводимым в примерах методикам при получении заявленных соединений или же получать их путем соответствующих модификаций представленных здесь экспериментальных примеров.

Соответственно, представленные здесь экспериментальные примеры не следует интерпретировать как ограничивающие объем данного изобретения, а только в качестве дополнительной, более детальной иллюстрации, которая будет способствовать более глубокому пониманию данного изобретения специалистами.

Примеры

В экспериментальной части примеров использованы следующие аббревиатуры:

АсОЕ1	этилацетат
АсОН	уксусная кислота
Вос	трет-бутоксикарбонил
В/Б	бензил
ОСС	дициклогексилкарбодиимид
ОСМ	дихлорметан
О1ЕА	Ν-этилдиизопропиламин
О1Р-С1	химическая ионизация с прямым вводом
ΌΜΕ	диметилформамид
ОМ8О-б6	диметилсульфоксид-б6
ΕΙΠΆ Ыа₂	натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ЕЮН	этанол
ЕЮЕ1	диэтиловый эфир
ЕАВ	бомбардировка быстрыми атомами
СОМР	циклический гуанозин-3',5'-монофосфат
НРЬС	жидкостная хроматография высокого давления
МеСЫ	ацетонитрил
МеОН	метанол
М8	масс-спектрометрия
ООЦ	[1Н-[1,2,4]оксадизол[4-3а]хино- ксалин-1-он]
РуАОР	гексафторфосфат 7-азабензатриазол-1-ил-окситрис-(пирролидин) фосфониума
1ВиОН	трет-бутанол
ТЕА	трифторуксусная кислота

Г идрохлориды исходных аминокислот синтезированы в соответствии с описанием патентных заявок Германии ΌΕ-Ά-3023830 и ΌΕА-2801849.

Спектры ядерного магнитного резонанса получены на установке Уапаи Сеш1ш-200.

В спектрах ¹Н-ЯМР указаны рабочая частота и используемый при получении спектров растворитель. Положение сигналов указано в δ (м.д.) с использованием в качестве контроля сигнала протонов растворителя. Контрольные величины составляют 7,24 м.д. в случае хлороформа и 2,49 м.д. в случае диметилсульфоксида дейтерия. В скобках указано число протонов, соответствующее каждому сигналу, измеряемому путем электронной интеграции, а тип сигнала показан следующими обозначениями: 8 (синглет), б (дублет), бб (двойной дублет), 8б (широкий сигнал), 8С (сигнальный комплекс), б.е. Ό₂Θ (исчезновение в процессе получения спектра после добавления нескольких капель дейтериевой воды).

В ¹³С-ЯМР указаны рабочая частота и растворитель, используемый при получении каждого из спектров. Положение сигналов указано в δ (м.д.), с использованием в качестве контроля сигнала протонов растворителя. Контрольные величины составляют 77,00 м.д. в случае дейтерированного хлороформа и 39,50 м.д. в случае дейтерированного диметилсульфоксида.

Далее, эксперименты ядерного магнитного резонанса проводили с помощью прилагаемого протонного теста (АРТ).

Анализы методом НРЬС с целью определения чистоты образцов проводили в следующих условиях:

А - Общий градиент

Колонка: КР-С18, Симметрия 150 х 3,9 мм, 5 μ, 100А

Мобильная фаза: Н₂О+Н₃РО₄

0,1%/СН₃СЫ+5% Н₂О+0,1% Н₃РО₄

Температура: комнатная температура Скорость потока: 1 мл/мин Вводимый объем: 10 мкл

В - Изократический

Колонка: КР-С18, Симметрия 150 х 3,9 мм, 5 μ, 100 А

Мобильная фаза: 50% Н₂О+Н₃РО₄ 0,1% до 50% СН _;С\ + 5% Н₂О +0,1% Н₃РО₄

При получении трипептидов для очистки исходного материала были использованы методика препаративной хроматографии и НРЬС, а для подтверждения идентификации продукта масс-спектрометрия и аминокислотный анализ. Степень чистоты трипептидов определяли методом НРЬС при следующих условиях: колонка типа С18 Ыис1ео8у1, 250 х 4 мм, 120 А, 10 мкм; скорость потока: 1 мл/мин; элюенты: А = Н₂О (+0,045% ТЕА) и В = СН₃СЫ (+0,036% ТЕА).

Ультрафиолетовые (ИУ) спектры получали на спектрофотометре ЗЫшабхи ИУ-160А. Для каждого из соединений указаны длина волны (λ) в нм и молекулярная абсорбция (ε) в см^-1 моль^-1 л.

Для жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС) использовали ультрафиолетовый фотодиодный детектор Не\\'1е11-Раскагб 1040 А.

Пример 1. Получение Ы-ацетил-2-амино-2[4-(4-8-нитрозомеркаптотетрагидрофуран)] уксусной кислоты (1).

Стадия 1). В 250 мл стеклянную колбу, снабженную магнитной мешалкой, вводили 4,0 г (17,6 ммоль) гидрохлорида 2-амино-2-[4-(4меркаптотетрагидропиран)]уксусной кислоты и 60 мл 0,5н. раствора гидроокиси калия. Затем добавляли 3,07 г (21,8 ммоль) безводного карбоната калия и 60 мл МеСЫ. Смесь охлаждали на ледяной бане и по каплям добавляли 1,42 мл (19,7 ммоль) уксусной кислоты, растворенной в 25 мл МеСЫ. В конце добавляли 0,5н. гидроокись калия, доводя рН до 9-10. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого добавляли 2н. соляную кислоту до тех пор, пока рН смеси не достигнет 6,0, и при пониженном давлении удаляли растворитель. Полученный твердый остаток сушили под вакуумом над пятиокисью фосфора, затем его суспендировали в 150 мл абсолютного Ε1ΘΗ и перемешивали при комнатной температуре. Нерастворимый остаток фильтровали и промывали абсолютным Ε1ΘΗ. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Получали 3,98 г сырого промежуточного продукта в виде Ы-ацетил-2амино-2-[4-(4-меркаптотетрагидропиран)]уксусной кислоты, который подвергали различным препаративным обращенно-фазовым хроматографическим очисткам с получением 80 мг продукта с 90% степенью чистоты (градиент А НРЬС, λ=205 нм).

¹Н-ЯМР (200 МГц, 1)\18О-с1.): 7,40 (1Н, д, 1=10 Гц, ΝΗ), 4,13 (1Н, д, 1=10 Гц, СН), 3,75-

3,50 (4Н, ком.с, СН₂), 1,90-1,80 (4Н, ком.с, СН₂),

1,65 (3Н, с, СН₃).

¹³С-ЯМР (50 МГц, 1)\18О-сГ): 171,50 (СОΝ), 168,90 (СО), 63,69 (СН₂), 63,27 (СН₂), 62,80 (СН), 49,18 (С), 37,58 (СН₂), 36,12 (СН₂), 23,01 (СН3).

Стадия 2). 80 мг (0,34 ммоль) №ацетил-2амино-2-(4-(4-меркаптотетрагидропиран))уксусной кислоты растворяли в 4000 мкл МеОН и затем добавляли 500 мкл 1н. раствора НС1 и 136 мкл 5М раствора ΝαΝΟ₂. Полученный в результате раствор в течение 1 мин обрабатывали в ультразвуковой бане и потом добавляли 50 мкл 10н. ΝαΟΗ и 14 мкл Н₂О.

Из полученного раствора отбирали часть А в виде аликвоты в 470 мкл и к остатку в избытке добавляли воду, замораживали и лиофилизировали, получая 190 мг гигроскопического твердого вещества В, слегка увлажненного.

№ЬС (градиент А):

λ 220 нм: степень чистоты фракции А 68% λ 339 нм: степень чистоты фракции А 95% ЯМР фракция В:

’Η-ЯМР (200 МГц, 1)\18О-сГ): 8,00-7,50 (1Н, ком.с, ΝΗ), 4,50-4,00 (1Н, ком.с, СН), 3,80-

3,40 (4Н, ком.с, СН₂), 2,40-1,80 (4Н, ком.с, СН₂),

1,88 (3Н, с, СН₃).

¹³С-ЯМР (50 МГц, 1)\18О-с1.): 173,00 (СО),

169,52 (СО), 67,69 (СН₂-О), 63,45 (СН), 53,78 (С), 32,17 (СН₂), 22,80 (СН₃).

Пример 2. Получение №ацетил-2-амино-2[4-(4-8-нитрозомеркапто-1 -метилпиперидин)] уксусной кислоты (2).

Стадия 1). В 250 мл стеклянную колбу, снабженную магнитной мешалкой, вводили 3,69 г (13 ммоль) дихлоргидрата 2-амино-2-[4-(4меркапто-1-метилпиперидин)]уксусной кислоты и 30 мл 0,5н. раствора гидроокиси калия. После этого добавляли 2,2 г (16 ммоль) безводного карбоната калия и 30 мл МеСК Смесь охлажда ли на ледяной бане и по каплям добавляли 1,0 мл (14 ммоль) уксусной кислоты, растворенной в 10 мл МеСК В конце добавляли 0,5н. гидроокись калия, доводя рН до 9-10. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого добавляли 2н. соляную кислоту до тех пор, пока рН смеси не достигнет 6,0, и при пониженном давлении удаляли растворитель. Полученный твердый остаток сушили под вакуумом над пятиокисью фосфора, затем высушенное твердое вещество суспендировали в 100 мл абсолютного Ε1ΟΗ и перемешивали при комнатной температуре. Нерастворимый осадок фильтровали и промывали абсолютным Ε1ΟΗ и растворитель удаляли при низком давлении. Получали 2,8 г сырого промежуточного продукта в виде К-ацетил-2-амино-2-[4-(4-меркаптометилпиперидин)]уксусной кислоты, который подвергали различным препаративным обращенно-фазовым хроматографическим очисткам с получением 0,5 г продукта с 99% степенью чистоты (градиент А ИРЬС. λ=210 нм).

'Η-ЯМР (200 МГц, 1)\18О-сГ): 8,35 (1Н, д, 1=10 Гц, ΝΗ), 4,43 (1Н, д, 1=10 Гц, СН), 3,353,00 (4Н, ком.с, СН₂), 2,70 (3Н, с, СН₃), 2,20-1,90 (4Н, ком.с, СН₂), 1,85 (3Н, с, СН₃).

¹³С-ЯМР (50 МГц, 1)\18О-сГ): 170,55 (СОΝ), 170,05 (СО), 61,77 (СН), 49,33 (СН2), 49,28 (СН2), 46,38 (С), 42,26 (СН3), 33,05 (СН2), 33,14 (СН2), 23,42 (СН3).

Стадия 2). 50 мг (0,20 ммоль) К-ацетил-2амино-2-(4-(4-меркапто-1-метилпиперидин)) уксусной кислоты растворяли в 800 мкл 1н. раствора НС1 и затем добавляли 80 мкл 5М раствора №1КО₂. Полученный в результате раствор в течение 1 мин обрабатывали в ультразвуковой бане, и потом добавляли 80 мкл 10н. NаΟΗ и 40 мкл Н₂О.

Отделяли часть полученного раствора в виде 100 мкл аликвоты А, а остаток замораживали и лиофилизировали, получая 190 мг твердого вещества В.

ЭТЬС (градиент А):

λ 230 нм: степень чистоты фракции А: 90%;

степень чистоты фракции В 93%;

λ 334 нм: степень чистоты фракции А 98%;

степень чистоты фракции В 98%;

ЯМР фракции В:

'Η-ЯМР (200 МГц, 1)\18О-сР): 4,71 (1Н, с, СН), 2,70-2,20 (8Н, ком. с, СН₂), 1,95 (3Н, с, СНз-Ν), 1,71 (3Н, с, СН₃-СО).

¹³С-ЯМР (50 МГц, 1)₂О): 172,51 (СО),

171,52 (СО), 61,08 (СН), 58,18 (С), 48,09 (СЩΝ), 48,01 (СЩ-Ν), 42,18 (СН₃-Л), 30,44 (СН₂),

29,85 (СН₂), 20,17 (СН₃-СО).

Пример 3. Получение N-ацетил-2-амино-3бензил-3-8-нитрозомеркапто-4-фенилбутановой кислоты (3).

Пример 4. Получение Ν-ΙΝ-γ-Ь-глутамил2-амино-2-(4-(4-8-нитрозомеркапто)тетрагидропиран)ацетил] глицин (4).

Стадия 1). В 100 мл стеклянную колбу, снабженную магнитной мешалкой, вводили 2,0 г (5,9 ммоль) 2-амино-3-бензил-3-меркапто-4фенилбутановой кислоты и 20 мл 0,5н. раствора гидроокиси калия. После этого добавляли 1,0 г (7,2 ммоль) безводного карбоната калия и 20 мл МеСЫ. Смесь охлаждали на ледяной бане и по каплям добавляли 0,5 мл (6,5 ммоль) уксусной кислоты, растворенной в 8 мл МеСЫ. В конце добавляли 0,5н. гидроокись калия до тех пор, пока рН смеси достигнет значений 12-13. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого добавляли 2н. соляную кислоту до тех пор, пока рН смеси не достигнет 6,0, и при пониженном давлении удаляли растворитель. Полученный неочищенный остаток суспендировали в 100 мл абсолютного Ε1ΘΗ и перемешивали при комнатной температуре. Нерастворимый остаток фильтровали и промывали абсолютным Ε1ΘΗ. Растворитель удаляли при низком давлении. Остаток перекристаллизовывали в воде. Нерастворимую часть фильтровали и отбрасывали. Фильтрат замораживали и лиофилизировали. Получали 1,64 г промежуточного продукта в виде Ы-ацетил-2-амино-3-бензил-3меркапто-4-фенилбутановой кислоты. Выход: 81%.

'Н-ЯМР (200 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 7,68 (1Н, д, 1=8 Гц, ΝΗ), 7,35-7,05 (10Н, ком.с, СН_аг), 4,36 (1Н, д, 1=8 Гц, СН), 3,42-3,02 (2Н, ком.с, СН₂С_аг), 2,95-2,55 (2Н, ком.с, СН₂), 1,82 (3Н, с, СН₃).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 172,94 (СОΝ), 169,08 (СО), 138,55 (С_аг), 138,16 (С_аг), 132,36 (2СН_аг), 131,89 (2СН_аг), 127,78 (2СН_аг), 127,53 (2СН_аг), 126,44 (СН_аг), 126,26 (СН_аг), 60,16 (СН),

55,62 (С), 43,70 (СН₂), 42,94 (СН₂), 23,14 (СН₃).

Стадия 2). 0,62 г (1,8 ммоль) Ы-ацетил-2амино-3-бензил-3-меркапто-4-фенилбутановой кислоты растворяли в 25 мл МеОН, затем добавляли 25 мл 1н. раствора НС1 и раствор из 250 мг Ν;·ιΝΟ₂ в 25 мл Н₂О. Полученный в результате раствор в течение 35 мин перемешивали при комнатной температуре, фильтровали и промывали водой. После высушивания при пониженном давлении в присутствии Р₂О₅ получали 0,33 г твердого вещества.

НРЬС (изократа В):

λ 220 нм: степень чистоты 91%;

λ 342 нм: степень чистоты 100%.

'Н-ЯМР (200 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 8,77 (1Н, д, 1=10 Гц, ЫН), 7,28-7,00 (10Н, ком.с, СН_аг), 5,33 (1Н, д, 1=10 Гц, СН), 4,12-3,90 (2Н, ком.с, СН₂), 3,88-3,38 (2Н, ком.с, СН₂), 1,86 (3Н, с, СН₃).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 171,55 (ΟΟΝ), 169,67 (СО-Ο), 135,51 (С_аг), 135,27 (С_аг),

131,52 (СНаг), 131,41 (СНаг), 128,15 (СНаг), 128,05 (СН_аг), 127,04 (СН_аг), 65,13 (СН), 56,11 (СН), 40,91 (СН2), 40,15 (СН2), 22,29 (СН3).

^νη2 о ына ©

Стадия 1). В 250 мл стеклянной колбе, снабженной магнитной мешалкой, перемешивали 5,8 г (25,5 ммоль) гидрохлорида 2-амино-2(4-(4-меркаптотетрагидропиран))уксусной кислоты, 4,7 г (25,5 ммоль) α-бром-параксилола и 100 мл смеси НЮ/ЕЮН 3:1. Добавляли 11 мл триэтиламина и смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем добавляли еще 50 мл НЮ/ЕЮН 3:1 и перемешивали еще в течение 2 ч. Полученную суспензию отфильтровывали и промывали 100 мл воды и 50 мл ЕЮН. Получали твердое вещество, которое сушили при пониженном давлении. На полученное твердое вещество добавляли 300 мл концентрированной соляной кислоты, и растворитель удаляли при пониженном давлении. Последнюю обработку соляной кислотой повторяли второй раз, и в результате получали твердое вещество, которое высушивали при пониженном давлении. Получали 1,59 г искомого промежуточного продукта.

'Н-ЯМР (200 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 8,80-8,30 (3Н, шир.с, 4₃Ν+), 7,26 (2Н, д, 1=8 Гц, СНаг),

7,12 (2Н, д, 1=8 Гц, СНаг), 4,03 (1Н, с, СН-Ν), 3,85-3,55 (6Н, ком.с, СН₂-С_аг, СН-Ο), 2,26 (3Н, с, СН₃), 2,05-1,08 (4Н, ком.с, СН₂).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): 168,98 (СО), 136,64 (С_аг), 133,80 (С_аг), 129,55 (СНаг), 129,29 (СНаг), 62,36 (СН₂Ю), 59,85 (СН-Ν), 49,15 (С), 32,03 (СН₂), 31,19 (СН₂), 30,84 (СН₂), 20,69 (СН3).

Стадия 2). 1004 мг гидрохлорида 2-амино2-(4-(4-(параметилбензилмеркапто)тетрагидропиран))уксусной кислоты (3,029 ммоль) суспендировали в 20 мл ίΒиΟΗ/Η₂Ο 2:1 и добавляли 5% NаΟΗ до тех пор, пока рН не установится равным 9. После этого добавляли 3 эквивалента ВосЮ, и смесь оставляли на 30 мин для прохождения реакции, после чего рН еще раз доводили до 9,0. Реакцию проводили еще 30 мин, после чего вновь производили коррекцию значения рН. Путем сравнения с исходной аминокислотой с помощью тонкослойной хроматографии (ТЬС) делали заключение о завершении реакции.

Продукт выделяли путем двух последовательных экстракций 50 мл гексана и водную фазу обрабатывали 1н. НС1 для достижения рН 2. После этого проводили три стадии экстракции: 60 мл ΛοΟΕί каждая. Раствор ΛοΟΕί суши ли безводным Мд§О₄ и,после удаления растворителя путем его упаривания продукт вновь растворяли в ЭСМ и вновь упаривали. После повторения этой стадии еще дважды получали 1191 мг (3,015 ммоль) Ν-Вос-защищенного продукта.

Полученный продукт был охарактеризован следующим образом:

a) ТЬС, в которой в качестве подвижной фазы использовали СНС1₃/МеОН/АсОН 85:10:5. КТ = 0,48, сигнал исходного материала не обнаруживался.

b) НРЬС с градиентом от 10 до 100% МеСN в течение 30 мин + изократично при 100% МеСN 5 мин. Полученная в результате степень чистоты соответствовала 96% (220 нм).

c) Масс-спектрометрия с помощью РАВ: М вычисленная = 395, (М+Н)⁺ экспериментальная = 396,0.

б) ЯМР (СЭС1₃) 7,18 (2Н, д, 1=8 Гц), 7,09 (2Н, д, 1=8 Гц), 5,54 (1Н, д, 1=11,2 Гц), 4,44 (1Н, д, 1=8,3 Гц), 3,69 (1Н, д, 1= 11,2 Гц), 3,57 (1Н, д, 1=11,2 Гц), 3,75-3,98 (4Н, шир.с), 2,32 (3Н, с),

1,26-2,19 (4Н, шир.с), 1,46 (9Н, с).

Стадия 3). Трипептид получен методом твердофазного синтеза, начиная с 1595 мг Вос61у-ОСН₂-Рат-смолы (№о5у51ст. геТ Νο КР00801) при замещении 0,63 ммоль/г. Рабочий диапазон составляет 1,005 ммоль.

Общая методика добавления остаточного азота:

1) Набухание смолы в результате 5 промываний ЭС.’М (по 0,5 мин);

2) Удаление Вос-группы с помощью 40% ТРА в ЭСМ, 1 х 1 мин + 1 х 20 мин;

3) Промывка ЭСМ, 5 х 0,5 мин;

4) Тестирование нингидрином;

5) Промывка ЭМР, 3 х 1 мин;

6) Связывание в течение 1,5 ч;

7) Промывка ЭМЕ, 3 х 1 мин;

8) Промывка ЭСМ, 5 х 0,5 мин;

9) Тестирование нингидрином.

В случае, когда тест на нингидрин на последней стадии оказывался положительным, проводили повторное связывание, повторяя стадии 5-8.

Связывание производили с использованием 6 эквивалентов (экв.) ΌΙΕΑ, 3 экв. Восаминокислоты и 3 экв. активного агента, которым в данном случае являлся РуАОр (гексафторфосфат 7-азабензотриазол-1-ил-окситрис (пирролидино)фосфония). Для связывания у-61ц использовали Вос-С1и-(а-ОВ/1).

Завершая последовательность стадий связывания, пептидил-смолу подвергали ацидолизу НР/паракрезолом (9:1) в течение 1 ч при 0°С. После упаривания образовавшийся осадок экстрагировали безводным Ε10Ε1, а затем выделяли пептид путем экстракции 10% АсОН. Сразу после упаривания неочищенный осадок лиофилизировали и анализировали с помощью

a) НРЬС с градиентом от 5 до 65% МеСN в течение 30 мин.

b) масс-спектрометрии с электрораспылением: М_ВЫЧИсл = 377, (М+Н⁺)э_Ксперим= 378,2.

Количество пептида определяли путем аминокислотного анализа: т = 329 мг (0,873 ммоль). Во всех количественных оценках пептидов для гидролиза пробы при пептидном анализе пользовались добавлением извне патрона 11е (изолейцина).

Очистку трипептида (в два приема) производили методом препаративной НРЬС. При этом использовали следующую систему:

- Колонка: С18 ШсКохуЕ 200 х 20 мм, 120 А, 10 мкм.

- Элюенты: А = Н₂О (+0,1% ТРА), В = МеСN (+0,1% ТРА).

- Градиент: Изократический режим: 0% В в течение 40 мин + градиент от 0 до 10% В в течение 40 мин.

Поток: 25 мл/мин.

Всего получено 227 мг (0,602 ммоль) промежуточного трипептида, который характеризовался

a) НРЬС в градиенте от 5 до 45% МеСN в течение 20 мин. Полученная в результате степень чистоты соответствовала 95% (220 нм). При возрастающем разведении нанесенного образца минорный пик при 8,4 мин пропорционально уменьшался, вплоть до полного исчезновения. Соответственно, было сделано заключение, что он соответствует агрегации трипептида (а не окислению) и, следовательно, он был признан в качестве значимого продукта.

b) Масс-спектрометрией с электрораспы^лением: М^вычисл.= ^{377, (М+Н )}эксперим.= ^378,2.

Стадия 4). К раствору, содержащему 14,2 мг (0,38 ммоль) трипептида, полученного на стадии 3, в 800 мкл 1н. НС1 добавляли 76 мкл 0,5М раствора ΝαΝ0₂. После перемешивания в ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 1 мин добавляли 80 мкл 10н. раствора №1ОН. Полученный раствор замораживали и лиофилизировали, получая в результате твердое вещество, имеющее следующие свойства:

^!Н-ЯМР (200 МГц, ЭМЗО-бе): 8,90-8,50 (2Н, шир.с, Ν^, 5,35 (1Н, д, 1=10 Гц, СН), 4,103,00 (3Н, ком.с, СН₂, СН), 1,95-1,65 (4Н, ком.с, 2СН2).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ЭМ8О-б₆): 172,18 (СОΝ), 171,21 (СО-Ν), 168,40 (СО-О), 63,03 (СН₂),

62,31 (С), 59,56 (СН), 53,19 (СН), 41,20 (СН₂), 32,94 (СН₂), 31,71 (СН₂), 31,41 (СН₂), 27,12 (СН2).

НРЬС (Метод А):

λ 220 нм (степень чистоты 94%);

λ 334 нм (степень чистоты 95%) ИУ: λ 346 нм е(Н₂О) 502 см^-1моль^-1л.

Пример 5. Получение Ν-ΙΝ-γ-Ь-глутамил2-амино-2-(4-(4-8-нитрозомеркапто-1-метилпиперидин))ацетил] глицина (5).

^Нз<\

ΝΗϊ О ΝΚζ о

Стадия 1). В 100 мл стеклянной колбе, снабженной магнитной мешалкой, смешивали 6,4 г (23 ммоль) дигидрохлорида 2-амино-2-(4(4-меркапто-1-метилпиперидин))уксусной кислоты, 54,3 г (23 ммоль) α-бром-параксилола и 40 мл смеси Η₂Ο/Ε1ΟΗ 1:1. Добавляли 13 мл триэтиламина, создавали атмосферу аргона и смесь перемешивали в течение 42 ч при комнатной температуре. Из полученного в результате раствора при пониженном давлении удаляли растворитель и к полученному неочищенному остатку добавляли 20 мл абсолютного Ε1ΟΗ. Образовавшееся твердое вещество фильтровали и промывали абсолютным Ε1ΟΗ и Ε1ΟΕ1, затем сушили при пониженном давлении. Получали 2,11 г промежуточного продукта в виде гидрохлорида 2-амино-2-(4-(4-(параметилбензилмеркапто)-1-метилпиперидин))уксусной кислоты. Выход: 29,6%.

Спектр ЯМР регистрировали в Ω₂Ο, а в качестве эталона было взято 4,75 м.д. для ΗΟΟ.

Ή-ЯМР (200 МГц, ΙΤΟ): 7,28 (2Н, д, 1=8 Гц, СНГ 7,15 (2Н, д, 1=8 Гц, СН_аг), 3,64-3,74 (2Н, ком.с, СН₂-С_аг), 3,62 (1Н, с, СН-Ν), 3,4-3,1 (4Н, ком.с, ΟΗ₂-Ν), 2,76 (3Н, с, СНз-Ν), 2,24 (3Н, с, СН₃), 2,15-1,92 (4Н, ком.с, СН₂).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ΙΤΟ): 173,15 (СО), 141,00 (С_аг), 136,39 (С_аг), 132,58 (0Η_3Γ), 131,95 (0Η_3Γ), 63,57 (ΟΗ-Ν), 52,48 (СИ₂)+, 50,65 (С),

45,66 (ΟΗ₃-Ν), 34,05 (ΟΗ₂), 32,35 (ΟΗ₂), 31,28 (ΟΗ₂), 22,77 (СН₃).

Стадия 2). Начиная с 1016 мг (2,958 ммоль) промежуточного продукта, полученного на предыдущей стадии, и продолжая действовать по схеме, описанной в стадии 2 примера 4, получали 1016 мг (2,490 ммоль) Ν-Восзащищенного промежуточного соединения, характеризуемого следующими показателями:

a) ССЕ (мобильная фаза СНС1₃/МеОН/ АсОН 85:10:5).

Яг = 0,32, сигнал исходного материала не обнаруживался.

b) градиент ИРГС’ от 10 до 100% ΜеСN в течение 30 мин. Степень чистоты 96% (220 нм).

c) Масс-спектрометрия с помощью ЕАВ: Мвычисл = 408 (М+Н⁺) Мэксперим = 408,9

б) Масс-спектрометрия с электрораспылением: (М+Н⁺)эксперим. = 409,3.

Стадия 3). Методом, описанным в стадии 3 примера 4, получено трипептидное промежуточное соединение, начиная с 794 мг смолы, указанной выше. Рабочий диапазон составляет 0,5 ммоль. Из-за трудностей солюбилизации Вос-производной, вместо ΩΙΕΑ, в указанной выше реакции был выбран в качестве основания Ν-метилморфолин (3 экв.). После введения γС1и образовывался трипептид, и связь пептидсмола подвергали ацидолизу тем же способом, что и описанный выше. В результате получали неочищенное вещество в 10% АсОН, которое затем лиофилизировали и количественно оценивали. Получали 137 мг (0,351 ммоль) промежуточного трипептида, характеризуемого следующими показателями:

a) ПРЬС, изократический градиент 0% в течение 10 мин + 5->65% ΜеСN в течение 30 мин. Показано, что вводимый продукт в кислом растворе элюируется с фронтом, что делает необходимым лиофилизацию аликвоты для удаления кислоты, а затем повторное растворение лиофилизата в 1 мМ НС1. Таким образом пептид можно было хроматографировать, и он элюировался за 6,8 мин в используемом градиенте.

b) Масс-спектрометрия с электрораспылением: М_Вычисл= 390 (М+Н⁺)эксперим. = 391,2.

Очистку полученного неочищенного вещества производили методом ПРЬС, в препаративном диапазоне, причем параметры процесса соответствовали уже описанным в примере 4. Применяли также изократический режим 0% В в течение 40 мин, затем градиент от 0 до 10% В в течение 40 мин. Таким образом получали 107 мг (0,274 ммоль) продукта, имеющего следующие характеристики:

a) градиент ЭТЬС от 0 до 0% в течение 10 мин плюс от 0 до 30% в течение 20 мин. Степень чистоты - 94% (220 нм). Подтвердилось, что дополнительный пик на 8,0 минуте в этом случае также соответствует агрегации, и он может быть отнесен к целевому продукту.

b) Масс-спектрометрия с электрораспылением: Мвычисл. = 390 (М+Н⁺)эксперим= 391,1.

Стадия 4). Начиная с 10,0 мг (0,026 ммоль) промежуточного трипептида, полученного на предыдущей стадии, проводили нитрозирование, как описано в стадии 4 примера 4, используя 52 мкл 0,5М ΝαΝΟ₂. Полученный продукт имеет следующие характеристики:

¹³С-ЯМР (50 МГц, 1)\18С)-сЕ): 171,57 (ΟΟΝ), 170,99 (ΟΟ-Ν), 170,76 (ΟΟ-Ν), 168,20 (СОΟ), 60,23 (С), 59,53 (СН), 51,57 (СН), 49,02 (СН₂), 42,20 (СН₃), 41,59 (СН₂), 30,49 (СН₂), 29,75(СН2), 29,31 (СН2), 26,05 (СН2).

ПРЕС (Метод В):

λ 220 нм (степень чистоты 74%);

λ 334 нм (степень чистоты 88%);

ИУ: λ 346 нм ε(Π₂Ο) 198 см^-1моль^-1л.

Пример 6. Получение Ν-ΙΝ-γ-Ь-глурамил2-амино-3-бензил-3-(8-нитроаомеркапто)-4фенилбутаноил] глицина (6).

Стадия 1). В 100 мл стеклянной колбе, снабженной магнитной мешалкой, смешивали 1,25 г (3,7 ммоль) гидрохлорида 2-амино-3бензил-3 -меркапто-4-фенилбутановой кислоты, 0,68 г (3,7 ммоль) α-бром-параксилола и 40 мл смеси Н₂О/Е!ОН 1:1. Добавляли 1,6 мл триэтиламина и растворяли основную часть суспендированного твердого вещества. В атмосфере аргона смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Этанол и часть триэтиламина удаляли при пониженном давлении. Полученную водную суспензию фильтровали и получали твердое вещество белого цвета.

Затем его очищали, используя обращеннофазовую колоночную хроматографию с СН₃СЛН₂О. К полученному твердому веществу добавляли 100 мл МеОН/НС1 1:1 и растворитель удаляли при пониженном давлении. Получали 0,5 г промежуточного продукта, гидрохлорида 2амино-3-бензил-3-(4-метилбензилмеркапто)-4фенилбутановой кислоты.

Ή-ЯМР (200 МГц, ИМ8О-б₆): 8,95-8,50 (3Н, шир.с, Η₃Ν+), 7,45-7,25 (10Н, ком.с, СН_аг), 7,08 (2Н, д, 1=10 Гц, СН_аг), 6,98 (2Н, д, 1=10 Гц, СН_аг), 4,05 (1Н, с, СН-Ν), 3,55-3,0 (4Н, ком. с, СН₂-С₆Н₅, СН₂-С_аг), 2,90-2,60 (2Н, ком.с, СН₂),

2,20 (3Н, с, СН3).

¹³С-ЯМР (50 МГц, ИМЗО-бЦ: 168,70 (СО),

136,53 (С_аг), 136,00 (С_аг), 134,94 (С_аг), 132,50 (Саг), 131,18 (СНаг), 129,169 (СНаг), 128,90 (СНаг), 128,26 (СН_аг), 128,02 (СН_аг), 127,07 (СН_аг), 57,06 (СН-Ν), 53,64 (С), 42,22 (СН₂), 41,65 (СН₂), 31,90 (СН₂-З), 20,48 (СН₃).

Стадия 2). Начиная с двух фракций, полученных на предыдущей стадии (180 мг со степенью чистоты 83% и 530 мг со степенью чистоты 94%), и в соответствии с описанным в стадии 2 примера 4, получали 733 мг (1,45 ммоль) промежуточного Ν-Вос-защищенного продукта, имеющего следующие характеристики:

a) ССР (СНС1₃/МеОН/НОАс 85:10:5), ВТ = 0,63.

b) Градиент НРЬС от 10 до 100% МеСН 30 мин, изократично 100%, 5 мин, степень чистоты: 91% (220 нм)

c) ΕΜ-ΜΑΓΌΙ-ТОР (масс-спектр): Подложка из дигидроксибензойной кислоты, ^Мвычисл = ^{505, (М+Н+)}эксперим= ^528,585

б) ЯМР: Наличие защитной Вос-группы подтверждено.

Стадия 3). Методом, описанным в стадии 3 примера 4, получали промежуточный трипептид, начиная с 0,43 ммоль указанной выше смолы. После ацидолитической стадии выделяли неочищенное вещество, содержащее 14,4 мг (29,96 ммоль) промежуточного трипептида, имеющего следующие характеристики:

a) Аналитическая НРЬС с градиентом от 5 до 65% в течение 30 мин, примерная степень чистоты 95%.

b) Масс-спектроскопия с электрораспылением Мрасч. = 487 (М+Н⁺), Мэ_Ксперим= 488,3.

Стадия 4). Начиная с 5,7 мг (0,012 ммоль) промежуточного трипептида, полученного на предыдущей стадии, с использованием 24 мкл 0,5М NаNО₂ проводили нитрозирование в соответствии с описанным в стадии 4 примера 4. Полученный продукт имел следующие характеристики:

НРЬС (Метод А):

λ 220 нм (степень чистоты 68%); λ 334 нм (степень чистоты 86%); υν: λ 345 нм е(Н₂О) 368 см^-1моль^-1л. Пример 7. Тесты по расширению сосудов ίη νίίτο.

Использованный в данных исследованиях метод по существу является методом, описанным в следующих публикациях:

Ригс1що1. В.Р. Ме11юб ίη пйпс ох1бе гекеагсй. РееШй & 31ат1ет еб§. 1о1т \УПеу & 8оп§, СЫсйейег, Епд1апб, рр.567-581.

Тгопдташсйпат, К. е! а1., 1рп.1.Рйаттасо1., 1996; 71: 167-173.

8а1а§, Е. е! а1., Еиг.ГРйагтасоР, 1994; 258: 47-55.

Соединения тестировали при 5 различных концентрациях, варьирующих от 0,001 до 10 мМ, при этом при исследовании эффекта каждой из концентраций использовали от 6 до 9 артериальных колец. Полученные результаты сравнивали с результатом действия З-нитрозоглутатиона (СЗНО), который использовали в качестве контрольного продукта.

Результаты приведены в табл. 1 ниже и представлены в виде СЕ50 (эффективная концентрация 50), которая представляет собой концентрацию каждого из тестируемых соединений, которая вызывает 50% расширение артериального кольца, предварительно сократившегося под действием 1 мкМ норэпинефрина.

Таблица 1

Тест на расширение сосудов

Соединение	СЕ₅₀ мкМ (среднее ± 8Б)
СЗЫО	1,56±0,55
Продукт, полученный в примере 1	0,375±0,05
Продукт, полученный в примере 2	0,024±0,003
Продукт, полученный в примере 3	0,63±0,21
Продукт, полученный в примере 4	1,73±0,27
Продукт, полученный в примере 5	1,89±0,82

Как следует из таблицы, все тестируемые соединения обладают сосудорасширяющей способностью, сходной с активностью контрольного продукта (Ο8ΝΟ) или превосходящей ее, а соединение 2 обладает сосудорасширяющей активностью, значительно более высокой, нежели у контрольного продукта.

Пример 8. Тесты ίη νίίτο на ингибирование агрегации тромбоцитов.

Использованный в данных исследованиях метод, по существу, воспроизводит метод, описанный в следующих источниках:

Ьоксако 1. с! а1., Еп: Ме11юб ίη ηίίτίο ох1бе Гс5сагс11 (Рее118сй М, 81ат1ег 18. еб§.) 1ойп \УПеу & 8оп§, СЫсйеДег, Епд1апб, рр.583-591.

Работай Μ\ν. е! а1., Вг.1.Рйагтасо1., 1987; 92: 181-187.

8а1а§ Е. е! а1., ВгЭ.РйагтасоР, 1994; 112: 1071-1076.

Соединения тестировали при четырех различных концентрациях, используя тромбоциты от 5 до 23 различных доноров. Полученные результаты сравниваются с таковыми, полученными при действии 8-нитрозоглутатиона (Ο8ΝΟ), который использовали в качестве контрольного продукта.

Результаты показаны в табл. 2 и выражены в виде С1₅₀ (ингибирующая концентрация 50), представляющей собой концентрацию каждого из тестируемых соединений, при которой происходит 50% ингибирование агрегации, происходящей под действием субмаксимальной концентрации коллагена (1 мкг/мл).

Таблица 2

Тесты на ингибирование агрегации тромбоцитов

Соединение	1С₅₀ мкМ (среднее ± 8Б)
Ο8ΝΟ	0,48±0,19
Продукт, полученный в примере 1	0,07±0,02
Продукт, полученный в примере 2	0,19±0,02
Продукт, полученный в примере 3	0,24±0,027
Продукт, полученный в примере 4	0,20±0,12
Продукт, полученный в примере 5	0,047±0,011
Продукт, полученный в примере 6	0,35±0,11

Из табл. 2 видно, что все тестируемые соединения обладают потенциальной ингибирующей агрегацию тромбоцитов активностью, которая сравнима или же превосходит активность контрольного продукта (Ο8ΝΟ), а соединения 1 и 5 обладают ингибирующей агрегацию тромбоцитов активностью, которая значительно превосходит таковую контрольного продукта.

Пример 9. Тесты ίη νίΙΐΌ по увеличению внутритромбоцитарных уровней цГМФ.

Соединения, полученные в примере 5 (5), тестировали ίη νίΙΐΌ с целью проверки их способности вызывать увеличение уровней цГМФ в тромбоцитах в отмытых препаратах тромбоцитов человека.

Использованный в данном тесте метод в основном совпадает с методом, описанным в публикациях, приведенных в примере 8.

Соединения тестировали в четырех различных концентрациях, используя тромбоциты 5 разных доноров. Полученные результаты сравнивали с таковыми, полученными при действии Ο8ΝΟ (контрольный продукт), и с исходными значениями. Результаты приведены в таблице 3 и выражены в пмоль/10⁹ тромбоцитов.

Таблица 3

Тест на увеличение внутритромбоцитарных уровней цГМФ

мкМ	цГМФ (пмоль/10⁹ тромбоцитов)
	Ο8ΝΟ	Соединение 5
3	27±6,0	-
1	24±0,5	21,1±0,5
0,3	6,6±0,6	6,50±0,5
0,1	1±0,5	1,50±0,4
0,03	-	1,60±0,5
0	1,33±0,38	1,33±0,38

Соединение 5, наподобие Ο8ΝΟ, способствует повышению уровней внутритромбоцитарного цГМФ. Следует отметить, что при значениях, близких к 1С₅₀, соединение 5 индуцирует более низкие уровни цГМФ, чем те, которые индуцируются под действием Ο8ΝΟ, используемым в концентрациях, близких к его значению 1С₅₀.

Пример 10. Тест ίη νίΙΐΌ на блокирование ингибирования агрегации тромбоцитов.

Использованный в данном тесте метод в основном совпадает с методом, описанным в публикациях, приведенных в примере 8, которые можно дополнить следующей ссылкой:

Мого МА. е! а1., Рг.№РАсаб.8с.и8А, 1996; 93:1480-1485.

Соединение ΟΩΟ тестировали ίη тйго на его способность блокировать ингибирование агрегации тромбоцитов, вызываемой полученными продуктами, на отмытых препаратах тромбоцитов человека.

Соединение, полученное в примере 5 (5), тестировали при трех различных концентрациях, в присутствии или в отсутствие ΟΩΟ (1 мкМ), используя тромбоциты 5 различных доноров. Полученные результаты сравнимы с таковыми, получаемыми при действии Ο8ΜΟ (контрольный продукт), и с величинами, получаемыми в отсутствие ΟΩΟ. Результаты представлены в табл. 4 и 5 и выражены в виде процента ингибирования максимальной агрегации.

Таблица 4

Контрольный продукт (Θ8ΝΟ)

мкМ	% ингибирования без ΟΙ)(,)	% ингибирования в присутствии ΟΙ)(,)
1	92,6±0,9	32,65±0,9
0,3	79,33±17	3,3±3
0,1	34,2±25	0

Таблица 5

Соединение 5

мкМ	% ингибирования без ООО	% ингибирования в присутствии ООО
0,3	96	0
0,1	96	0
0,03	83±1,4	0
0,01	17	0
0,003	0	0

Соединение ООО (1 мкМ) способно блокировать ингибирующий эффект Ο8ΝΟ и соединения 5 при использовании их в дозе 1С₅₀. При более высоких, чем 1С₅₀, дозах эффект ингибирования агрегации блокировался сильнее под действием соединения 5, нежели под действием контрольного продукта.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. 8-Нитрозотиоловые производные пеницилламина или глутатиона и их фармацевтически приемлемые соли, которые соответствуют в которой

А и В являются фенильными группами или же вместе образуют остаток -СН₂^-СН₂-, образующий шестичленное кольцо, в котором р представляет собой атом кислорода или серы, или группу Ν-В³, в которой В³ является водородом или алкильной группой С₁-С₄;

В¹ является ацильным остатком, который может быть С₁-С₅ алифатической ацильной группой или остатком глутаминовой кислоты, связанным через его неаминокислотный карбоксил;

В² является гидроксильной группой или остатком глицина, связанным через его пептидную связь;

при условии, что когда В¹ является алифатическим ацильным остатком, тогда В² является гидроксильной группой, а когда В¹ является остатком глутаминовой кислоты, тогда В² является остатком глицина.
2. 8-Нитрозотиолы по п.1, которые соответствуют следующей общей формуле (II) о

по в которой А и В имеют значения, указанные выше, и В⁴ представляет собой С₁-С₄алкильную группу.
3. Соединение по любому из пп.1 или 2, представляющее собой №ацетил-2-амино-2-[4(4-8-нитрозомеркаптотетрагидропиран)]уксусную кислоту (1)
4. Соединение по любому из пп.1 или 2, представляющее собой №ацетил-2-амино-2-[4(4-8-нитрозомеркапто-1 -метилпиперидин)]уксусную кислоту (2)
5. Соединение по любому из пп.1 или 2, представляющее собой №ацетил-2-амино-3бензил-3-8-нитрозомеркапто-4-фенилбутановую кислоту (3)
6. 8-Нитрозотиолы по п.1, которые соответствуют следующей общей формуле (III) в которой А и В принимают значения, указанные выше.
7. Соединение по любому из пп.1 или 6, представляющее собой №[№у-Б-глутамил-2амино-2-(4-(4-8-нитрозомеркапто)тетрагидропиран)ацетил] глицин (4)
8. Соединение по любому из пп.1 или 6, представляющее собой №[№у-Б-глутамил-2амино-2-(4-(4-8-нитрозомеркапто-1-метилпиперидин))ацетил] глицин (5)
9. Соединение по любому из пп.1 или 6, представляющее собой №[№у-Б-глутамил-2амино-3-бензил-3-(8-нитрозомеркапто)-4фенилбутаноил] глицин (6)
10. Применение 8-нитрозотиолов по любому из пп.1-9, в качестве активного агента для лечения дисфункций кровообращения.
11. Применение по п.10, в котором указанный агент предназначен для лечения дисфункций сердечно-сосудистой системы.