EA002808B1 - Бетаины, используемые в качестве адъювантов для проверки чувствительности и антимикробной терапии - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению бетаиноподобных детергентов в композициях и способах проверки чувствительности бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты, а также к индуцированию чувствительности этих бактерий.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям и способам получения характеристик чувствительности бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты. Заявленные в изобретении композиции и способы особенно применимы в качестве адъювантов при тестировании чувствительности и при антимикробной терапии, и наиболее применимы при тестировании и при терапии с использованием семейства (3лактамных антибиотиков.

Уровень техники

Современные методы лечения больных, инфицированных бактериями, предусматривают выбор антибиотиков. Обычно лечение основывается на опыте врача. Попросту говоря, врач считает, что широкий спектр антибиотиков должен быть эффективен против большинства обычных инфекционных агентов, обуславливающих определенные симптомы у больного. Однако, в некоторых случаях выбор соответствующего терапевтического средства основывается на тестировании чувствительности. Тестирование чувствительности дает практикующему медику возможность определить какое терапевтическое средство с наибольшей вероятностью окажется эффективным при лечении конкретного патогена, а какие антимикробные агенты скорее всего окажутся бесполезными. Тестирование чувствительности служит важным инструментом, особенно когда у больного подтверждена микобактериальная инфекция, и, в частности, туберкулез (ТВ: вызванный бактериями комплекса МусоЬас!етшт !иЬегси1оз1з (МТВ)). Действующие федеральные правила предусматривают тестирование чувствительности при всех новых случаях ТВ (Теиоует, Р.С. е! а1., 1оиг.С1ш.М|сго. 31:767-770 (1993)). Тестирование чувствительности является неоценимым инструментом, на который рассчитывают практически все врачи при выборе соответствующей терапии антибиотиками для своих больных.

Способы лечения бактериальных инфекций ограничены спектром активности конкретного соединения. Например, не все бактерии чувствительны к данному антимикробному соединению. Различные классы бактерий устойчивы к действию антибиотиков различных классов. Вообще говоря, спектр активности данного антибиотика приходится на отдельные группы в зависимости от класса организма, на который он действует (напр., антигрибковый против антибактериального, действующий на грамположительные бактерии против действующего на грамотрицательные бактерии).

Антибиотики проявляют свой эффект, нарушая разнообразные клеточные функции. Например, известно, что различные классы антибиотиков действуют на различных этапах синтеза клеточной стенки, синтеза РНК/ДНК, репликации ДНК или синтеза белка. Бактерии устойчивы к различным антибиотикам по различным причинам. Ουίηΐίΐίαηί. В. е! а1., 1п: Миггау, Р.В. е! а1., ебз. Мапиа1 оГ Сйшса1 М1стоЬю1оду, А8М Ртезз, ^азЫпд!оп, Ό.Ο (1995) рр. 1308-1326 рассматривают некоторые из этих механизмов устойчивости и отмечают, что антибиотик должен прежде всего проникнуть в клетку и уже затем он может проявить свой эффект в месте (сайте) действия. Основа устойчивости может лежать в проницаемости организма, молекулярная конфигурация сайта действия может оказаться неприемлемой, или его может вовсе не существовать. Кроме того, бактерии могут модифицировать, разрушать или выводить агент.

Устойчивость может быть исходной или приобретенной. Приобретенная устойчивость может быть обусловлена приобретением генетического материала (например, транспозонов) или наследуемыми нарушениями репликации ДНК (например, точечные мутации). Повидимому, микобактерии обладают дополнительным механизмом устойчивости. Нейе!з, Ь.В. 1п: Эгид ЗизсерОЬПйу ίη 1йе СйетоШетару оГ МусоЬас!епа1 1пГесйопз, Нейе!з, Ь.В. еб. СВС Ргезз, Воз!оп, МА (1991), рр. 13-57 классифицирует субпопуляции инфекционных клеток МТВ как активно растущие или находящиеся на различных стадиях спящего состояния. Спящее состояние позволяет этим субпопуляциям выжить во время лечения больного.

Лечение микобактериальных инфекций также затруднено сложным характером чувствительности. Например, при том, что инфекции МТВ обычно эффективно поддаются лечению изониазидом (ΙΝΗ) и/или пиразинамидом (ΡΖΑ), изоляты МАС обычно устойчивы к этим препаратам, а изоляты М.Гойийит и М.сйе1опае обычно устойчивы ко всем антитуберкулезным агентам первого ряда.

На сегодня туберкулез является наиболее превалирующим инфекционным заболеванием в мире, им инфицирована приблизительно треть населения земного шара, т.е. около 1,7 миллиарда человека (КосЫ, А. ТиЬегс1е 72:1-6 (1991)). Кроме того, туберкулез убивает во всем мире больше людей (приблизительно 3 миллиона ежегодно), чем любое другое инфекционное заболевание (МотЫбйу апб Моба1йу \Уеек1у Верой 42:961-964 (1993)). Подавляющее число случаев ТВ приходится на развивающиеся страны, однако, устойчивые (МЭВ) к препаратам штаммы МТВ (МОВ-ТВ) стали серьезной всемирной проблемой (\Уог1б Неа11й ОгдашхаОоп (боситеп! \УНО/ТВ/96.198) Отоирз а! В1зк. \УНО Верой оп 1йе ТиЬегси1оз1з Ер1бет1с 1996 (1996)). Если не остановить подъем МОВ-ТВ, то неизбежным окажется возврат в прошлое, когда туберкулез был наиболее частой причиной смерти как в развивающихся, так и индустриальных странах.

Другие микобактерии, такие как комплекс МусоЬас!етшт аушт (МАС), М. рага!иЬегси1оз1з, М. и1сетап8, М.1ергае, М.капзазп и ком плекс Μ.ίοΓίιιίΙιιιη. также являются распространенными патогенами (см.:Ааупе. Ь.О. С1т. М1сго. Веу.5:1-25 (1992) или Ра1кш1ат. Ι.Θ. С1ш. Мюго. Кеу.9:177-215 (199). где рассматриваются различные микобактериальные патогены). МАС вызывает диссеминированное заболевание более чем у половины больных СПИДом на поздних стадиях (№дййида1е. 8.Ό. е! а1.. 1оит. 1пГес1. Όίδ. 165:1082-1085 (1992)). Всемирная Организация Здравоохранения подсчитала, что к 2000му году число людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Ηΐν) может превысить 40 миллионов (Аог1й Неа1!1 Огдашхабоп (йоситеп! АНО/ОРАСИР^А93.1) 01оЬа1 Ргодгатте оп АШ8 (1993). М.рага!иЬегси1о818 (подвид М.аушт) вызывает болезнь Джона у жвачных. Подсчитано, что болезнь Джона обходится сельскому хозяйству США (т.е. производству мяса и молочных продуктов) приблизительно в 1.5 миллиарда долларов ежегодно из-за снижения продуктивности и плодовитости (АЫ!1оск. В.Ртосеей1пд8 оГ 1йе ТЫгй 1п1етпайопа1 Со11одшит оп Рага!иЬегси1о818. рр.514-522 (1991); АЫ!1оск. В. е! а1.. Ргосеейтдз оГ !1е 89¹¹' Аппиа1 Меейпд оГ !1е Иш!ей 8!а!е§ Ашта1 НеаИй А55оаа1юп. рр.484-490 (1985)). Вызываемые микобактериями заболевания обусловливают огромные общественные затраты.

Наиболее широко используемым на сегодня и лучше всего охарактеризованным классом антибиотиков являются β-лактамы. В силу широкого спектра действия лечение микобактериальных инфекций этими агентами дает серьезные преимущества. Применение β-лактамов в терапевтических схемах для лечения микобактериальных инфекций дало ограниченный успех (СйатЬетк. Н.Р. е! а1.. АпйтктоЬ. Адеп!§ С1ето. 39:2620-2624 (1995)). Возможность расширить чувствительность микобактерий, в частности к β-лактамам, с учетом механизмов устойчивости, имеет значительный потенциал повышения эффективности лечения микобактериальных инфекций.

Описываемое в настоящей заявке изобретение относится к новым способам и композициям, при помощи которых может быть охарактеризована чувствительность микобактерий. Эти способы и композиции изменяют чувствительность данных бактерий, повышая эффективность антибиотиков, особенно β-лактамных антибиотиков. Данные способы и композиции могут служить компонентом эффективной терапии и/или диагностики подобных инфекций.

Краткое описание изобретения

Стремясь подавить рост контаминирующих бактерий в жидких культурах, полученных из биологических образцов и обработанных по способу Т1югп1оп АО 95/27076 и и.8. 5.658.749. авторы добавили в стандартный антимикробный состав (в частности, РАИТА) цефалоспорин третьего поколения, цефтазидим (СА8®

№.72558-82-8). Авторы неожиданно обнаружили, что С₄₈-карбоксипропилбетаин (СВ-18), используемый как реагент для обработки согласно Т1югп1оп АО 95/27076 и и.8. 5.658.749 в сочетании с данным антимикробным составом, приводит к значительному и резкому снижению чувствительности в жидких культурах. Для реализации преимуществ в чувствительности диагностики согласно ТНогЩоп АО 95/27076 и и.8. 5.658.749 авторы провели исследования с целью охарактеризовать и предотвратить данное снижение чувствительности в жидких культурах. Эти исследования привели к разработке способов и композиций, с использованием которых чувствительность микобактерий к антибиотикам, в особенности антибиотикам семейства βлактамов, может быть изменена благодаря применению бетаиноподобных соединений, описанных Т1югп1оп АО 95/27076 и и.8. 5.658.749. Способы применимы для характеристики и изменения чувствительности бактерий, в частности микобактерий и в особенности бактерий комплекса М.!иЬегси1ощ8, к антимикробным соединениям, применяемым при антимикробной терапии в качестве адъювантов.

Предметом изобретения является также композиция для тестирования чувствительности, причем данная композиция содержит один или несколько антибиотиков в смеси с одним или несколькими бетаиноподобными детергентами.

Предметом изобретения является также набор для определения чувствительности микроорганизма, причем данный набор включает один или несколько бетаиноподобных детергентов и один или несколько антибиотиков в тесном соседстве или близости.

Краткое описание фигур

На фиг. 1А и 1В представлена схема экспериментов, проведенных с целью получения важных ростовых характеристик изолятов АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 в культуральной системе СВ-18/12В/ РАИТАсах.

На фиг. 2А-2Н представлены кривые роста при тестировании изолята АТСС 27294 МусоЬас!епит !иЬегси1о8щ согласно схеме, приведенной на фиг. 1А и 1В. Звездочки: РАИТА; квадраты: Р/сах.

Фиг. 2А: АТСС 27294. Ь-1, обработка в буфере, выращивание в буфере.

Фиг. 2В: АТСС 27294. Ь-1. обработка в буфере, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

Фиг. 2С: АТСС 27294. Ь-1. обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в буфере.

Фиг. 2Ό: АТСС 27294. Ь-1. обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

Фиг. 2Е: АТСС 27294. селективная 7Н11, обработка в буфере, выращивание в буфере.

Фиг. 2Р: АТСС 27294, селективная 7Н11, обработка в буфере, выращивание в в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

Фиг. 26: АТСС 27294, селективная 7Н11, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в буфере.

Фиг. 2Н: АТСС 27294, селективная 7Н11, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 3А-3Н представлены кривые роста при тестировании изолята 571/573-ВАЬ МусоЬас!епит !иЬегси1о8Щ согласно схеме, приведенной на фиг. 1А и 1В.

Звездочки: ΡΑΝΤΑ; квадраты: Р/сах.

Фиг. 3А: 571/573-ВАЬ, Ь-1, обработка в буфере, выращивание в буфере.

Фиг. 3В: 571/573-ВАЬ, Ь-1, обработка в буфере, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

Фиг. 3С: 571/573-ВАЬ, Ь-1, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в буфере.

Фиг. 3Ό: 571/573-ВАЬ, Ь-1, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

Фиг. 3Е: 571/573-ВАЬ, селективная 7Н11, обработка в буфере, выращивание в буфере.

Фиг. 3Р: 571/573-ВАЬ, селективная 7Н11, обработка в буфере, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

Фиг. 36: 571/573-ВАЬ, селективная 7Н11, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в буфере.

Фиг. 3Н:571/573 -ВАЬ, селективная 7Н11, обработка в СВ-18 (383 мкг/мл), выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 4 представлена схема экспериментов, осуществленных при выращивании с лецитином в инокулятах малого объема. Цель опыта состояла в проверке способности лецитина нейтрализовать эффект СВ-18. Целью опыта также была проверка эффекта СВ-1 8 в инокулятах различного объема.

На фиг. 5А-5Р представлены кривые роста при тестировании изолята 571/573-ВАЬ МусоЬас!епит !иЬегси1о8Щ согласно схеме, приведенной на фиг. 4.

Фиг. 5А и 5В отражают результаты экспериментов с разведением бактериального стока в 5 000 раз (приблизительно 165±54 кое).

Фиг. 5 С и 5Ό отражают результаты экспериментов с разведением бактериального стока в 25 000 раз (приблизительно 33±11 кое).

Фиг. 5Е и 5Р отражают результаты экспериментов с разведением бактериального стока в 100 000 раз (приблизительно 8±3 кое). Звездочки: буфер в К..Р.; квадраты: буфер в Р/сах; треугольники: лецитин в К..Р.; х: лецитин в Р/сах.

Фиг. 5А: выращивание в буфере или буфер/лецитин.

Фиг. 5В: выращивание в СВ-18 (17 мкг/мл) или СВ-18/ лецитин (17 мкг/мл @).

Фиг. 5С: выращивание в буфере или буфер/лецитин.

Фиг. 5Ό: выращивание в выращивание в СВ-18 (17 мкг/мл) или СВ-18/лецитин (17 мкг/мл @).

Фиг. 5Е: выращивание в выращивание в буфере или буфер/лецитин.

Фиг. 5Р: выращивание в в СВ-18 (17 мкг/мл) или СВ-18/лецитин (17 мкг/мл @).

На фиг. 6 представлена схема экспериментов по титрованию СВ-18 и ТМА-18 с целью сравнения эффекта СВ-1 8 с действием четвертичной аммониумной соли триметилоктадецил аммониумбромида (ТМА-18).

На фиг. 7А-7С представлены кривые роста при тестировании изолята АТСС 27294 МусоЬас!етшт !иЬегси1о8щ согласно схеме, приведенной на фиг. 6. Звездочки: К..Р.; квадраты: РАИТА; треугольники :Р/сах.

Фиг. 7А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 7В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

Фиг. 7С: селективная 7Н11, выращивание в ТМА-18 (конечная концентрация 3,4 мкг/мл).

На фиг. 8А-8С представлены кривые роста при тестировании изолята 571/573-ВАЬ М. !иЬегси1о818 согласно схеме, приведенной на фиг. 6. Звездочки: К..Р.; квадраты: РАИТА; треугольники :Р/сах.

Фиг. 8 А: селективная 7Н11, выращивание в буфере;

Фиг. 8В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

Фиг. 8С: селективная 7Н11, выращивание в ТМА-18 (конечная концентрация 3,4 мкг/мл).

На фиг. 9 представлена схема экспериментов, проведенных с целью титрования СВ-1 8 для проверки эффекта СВ-1 8 при различных его концентрациях на различных видах микобактерий, перечисленных в табл. 7.

На фиг. 10 А и 10В представлены кривые роста при тестировании изолята АТСС 27294 М. !иЬегси1о8Щ с титрованием СВ-18 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: К..Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: 3 мкг/мл СВ-18; х: 7 мкг/мл СВ-18; «13 мкг/мл СВ-18; кружки: 27 мкг/мл СВ-18; вертикальные риски: 54 мкг/мл СВ-18; горизонтальные риски: 109 мкг/мл СВ-18.

Фиг. 10А, титрование без Р/сах.

Фиг. 1 0В, каждое титрование проведено с Р/сах.

На фиг. 11А и 11В представлены кривые роста при тестировании изолята 571/573-ВАЬ М. !иЬегси1о8Щ с титрованием СВ-18 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: К..Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: 3 мкг/мл СВ-18;

х: 7 мкг/мл СВ-18; «13 мкг/мл СВ-18; кружки: 27 мкг/мл СВ-18; вертикальные риски: 54 мкг/мл СВ-18; горизонтальные риски: 109 мкг/мл.

Фиг. 11А, титрование без Р/сах.

Фиг. 11В, каждое титрование проведено с Р/сах.

На фиг. 12 А и 12В представлены кривые роста изолята АТСС 25291 М.аушт с титрованием СВ-18 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: В.Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: 3 мкг/мл СВ-18; х: 13 мкг/мл СВ18; «27 мкг/мл СВ-18.

Фиг. 12 А, титрование без Р/еах.

Фиг. 1 2В, каждое титрование проведено с Р/сах.

На фиг. 13А и 13В представлены кривые роста изолята комплекса М.аушт 802-ВАЬ с титрованием СВ-18 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: В.Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: 7 мкг/мл СВ-18; х: 13 мкг/мл СВ-18; «27 мкг/мл СВ-18.

Фиг. 13 А, титрование без Р/еах.

Фиг. 13В, каждое титрование проведено с Р/еах.

На фиг. 14 А и 14В представлены кривые роста изолята АТСС 5841 М£ойийит с титрованием СВ-18 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: Р.Р.; квадраты: Р-сй; треугольники: 7 мкг/мл СВ-18; х: 13 мкг/мл СВ18; «27 мкг/мл СВ-18; кружки: 54 мкг/мл СВ18; вертикальные риски: 109 мкг/мл СВ-18.

Фиг. 14 А, титрование без Р-сй.

Фиг. 1 4В, каждое титрование проведено с Р-сй.

На фиг. 15 А и 15В представлены кривые роста изолята 495-1НН М.Гойийит с титрованием СВ-1 8 согласно схеме, приведенной на фиг. 9. Звездочки: Р.Р.; квадраты: Р-сй; треугольники: 7 мкг/мл СВ-18; х: 13 мкг/мл СВ-18; «27 мкг/мл СВ-18; кружки: 54 мкг/мл СВ-18; вертикальные риски: 109 мкг/мл СВ-18.

Фиг. 15 А, титрование без Р-сй.

Фиг. 15В, каждое титрование проведено с Р-сй.

На фиг. 16 представлена схема экспериментов, проведенных на различных изолятах МТВ с целью скрининга антибиотиков и проверки эффекта СВ-1 8 вместе с различными антибиотиками на различные изоляты М. 1иЬетси1о818, перечисленные в таблице 8.

На фиг. 17 А и 17В представлены кривые роста изолята АТСС 27294 М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Квадраты:

РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Р-с£р; «:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 17А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 1 7В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 18А и 18В представлены кривые роста изолята 571/573-ВАЬ М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Р-с1р; •:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 18А: селективная 7Н11, выращивание в буфере. Фиг. 18В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 19А и 19В представлены кривые роста изолята 573-ВАЬ М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Рс£р; «Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 19А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 19В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 20А и 20В представлены кривые роста изолята 535-ВАЬ М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Рс£р; «Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 20А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 20В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 21 А и 21В представлены кривые роста изолята 896-ВАЬ М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Рс£р; «:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 21 А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 21В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 22А и 22В представлены кривые роста изолята 040-ТВК. М. 1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: РсГр; «: Р/сах; кружки: Р-сй;

Фиг. 22А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 22В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-1 8 (конечная концентрация СВ-1 8 17 мкг/мл).

На фиг. 23А и 23В представлены кривые роста изолята 061-ТВР М.1иЬегси1о818 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: РАИТА; треугольники: Р/сах; х: Рс£р; «:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 23 А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 23В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 24А и 24В представлены кривые роста изолята 512-1НН М4иЬегси1о515 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: К..Р.; квадраты: ΡΑΝΤΑ; треугольники: Р/сах; х: РсГр; ^п,:Р/сах; кружки: Р-сй;

Фиг. 24А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 24В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 25А и 25В представлены кривые роста изолята 538-1НН М. 1иЬегси1о515 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Й.Р.; квадраты: ΡΑΝΤΑ; треугольники: Р/сах; х: РсГр; ^п,:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 25А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 25В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 26А и 26В представлены кривые роста изолята 52-96-ВОЬ М. 1иЬегси1о515 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Й.Р.; квадраты: ΡΑNΤΑ; треугольники: Р/сах; х: РсГр; :Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 26А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 26В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 27А и 27В представлены кривые роста изолята 57-96-ВОЬ М. 1иЬегси1о515 в экспериментах по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Р.Р.; квадраты: ΡΑNΤΑ; треугольники: Р/сах; х: РсГр; ^п,:Р/сах; кружки: Р-сй.

Фиг. 27А: селективная 7Н11, выращивание в буфере.

Фиг. 27В: селективная 7Н11, выращивание в СВ-18 (конечная концентрация СВ-18 17 мкг/мл).

На фиг. 28А и 28В представлены кривые роста изолята 572/573-ΒΑΤ М4иЬегси1о515 в модифицированной версии экспериментов по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. Звездочки: Й.Р.; квадраты: Р/сах; звездочки: эритромицин; х: цефтриаксон.

Фиг. 28А: скрининг антибиотиков, выращивание в К..Р.

Фиг. 28В: скрининг антибиотиков, выращивание в СВ-18.

На фиг. 29 А и 29В представлены кривые роста изолята 061-ΤΒΚ. М.1иЬегси1о515 в модифицированной версии экспериментов по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. В этих экспериментах были дополнительно проверены не-β-лактамные антибиотики. Звездочки: Й.Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: полимиксин В; х: олеандомицин; ·: линкомицин; кружки: налидиксиновая кислота; вертикальные риски: пенициллин С; горизонтальные риски: цефтриаксон.

Фиг. 29А: скрининг антибиотиков, выращивание в К..Р.

Фиг. 29В: скрининг антибиотиков, выращивание в СВ-18.

На фиг. 30 А и 30В представлены кривые роста изолята 57-96-ВОЬ М.1иЬегси1о515 в модифицированной версии экспериментов по скринингу антибиотиков, схема которых приведена на фиг. 16. В этих экспериментах были дополнительно проверены не-β-лактамные антибиотики. Звездочки: Й.Р.; квадраты: Р/сах; треугольники: налидиксиновая кислота; х: пенициллин С; ·: цефтазидим; кружки: цефтриаксон.

Фиг. 30А: скрининг антибиотиков, выращивание в К..Р.

Фиг. 30В: скрининг антибиотиков, выращивание в СВ-18.

На фиг. 31 приведена схема экспериментов, направленных на скрининг бетаиноподобных детергентов и других детергентов, приведенных в таб. 10, на способность вызывать индуцированную чувствительность аналогично таковой для СВ-18.

На фиг. 32А представлены суммарные кривые роста в присутствии всех контролей, использованных в эксперименте, который отражен на фиг. 31.

На фиг. 32В представлены суммарные кривые роста в присутствии нескольких выбранных детергентов, подчеркивающие различия в результатах.

Фиг. 32А: детергентные контроли: звездочки: Буфер/КР.; квадраты: буфер/ΡΑΝΤΑ; треугольники: буфер/Р-саx;

Фиг. 32В: выбранные детергенты: звездочки: Твин 80; квадраты: стеариновая кислота; треугольники: детаин РВ; х: 8В18; =: кросултаин Е30; незакрашенные кружки: велветекс ОЬВ; закрашенные кружки: С₄₈-карбоксиэтилбетаин.

На фиг. 33 приведено сопоставление результатов, полученных с СВ-18, с таковыми, полученными для ЭДТА, при сравнении их действия в культуральной системе.

На фиг. 34А и 34В представлены кривые роста изолята АТСС 27294 М 1иЬегси1о515 при выращивании его согласно схеме, приведенной на фиг. 33.

Фиг. 34А: засев в Й.Р., Р-сах или в СВ-18 (17 мкг/мл), как указано: звездочки: буфер в Й.Р.; квадраты: буфер в Р-сах; треугольники: СВ-18 в Й.Р.; х: СВ-18 в Р-сах.

Фиг. 34В: засев вСВ-18(17 мкг/мл) с 85 мкг/мл МдС1₂ или 17 мкг/мл ЭДТА, как указано: звездочки: СВ-18 и МдС1₂ в К..Е., квадраты: СВ18 и МдС1₂ в Р-сах; треугольники: ЭДТА в К..Е.; х: ЭДТА в Р/сах.

На фиг. 35 А и 35В представлены кривые роста изолята 571/573-ВАЬ М.1иЬегси1о818 при выращивании его согласно схеме, приведенной на фиг. 33.

Фиг. 35А: засев в К..Е., Р-сах или в СВ-18 (17 мкг/мл), как указано: звездочки: буфер в К..Е.; квадраты: буфер в Р-сах; треугольники: СВ-18 В.Е.; х: СВ-18 в Р-сах.

Фиг. 35В: засев в СВ-18(17 мкг/мл) с 85 мкг/мл МдС1₂ или 17 мкг/мл ЭДТА, как указано: звездочки: СВ-18 и МдС1₂ в К..Е., квадраты: СВ18 и МдС1₂ в Р-сах; треугольники: ЭДТА в К..Е.; х: ЭДТА в Р/сах.

На фиг. 36 приведена экспериментальная схема тестирования чувствительности микобактерий, использованная для сопоставления существующей практики тестирования чувствительности микобактерий с тестом на бетаиновую чувствительность, заявленным в настоящем изобретении.

На фиг. 37 представлены кривые роста изолята АТСС 27294 М.1иЬегси1о8Щ при выращивании его согласно схеме, приведенной на фиг. 36.

На фиг. 37А представлены результаты теста на бетаиновую чувствительность, полученные с использованием в качестве инокулята 0,5 стандарта Мак Фарланда (6.28± 0.57 х 10⁵ кое).

На фиг. 37В, 37С, 37Ό и 37Е представлены кривые роста с использованием в качестве инокулята 10Х (62,800±5,700 кое), 100Х (6,280±570 кое), 1,000Х (628±57 кое), и 10,000 Х (63±6 кое) разведений стандарта Мак Фарланда, соответственно. Звездочки: К..Е.; квадраты: Р-сах; треугольники: 15 мкг/мл СВ-18; х: 30 мкг/мл СВ18; «:60 мкг/мл СВ-18; кружки: 15 мкг/мл СВ18 с Р/сах; вертикальные риски: 30 мкг/мл СВ1 8 с Р/сах; горизонтальные риски: 60 мкг/мл СВ-18 с Р/сах.

На фиг. 38 представлены кривые роста изолята 571/573-ВАЬ М.1иЬегси1о818 при выращивании его согласно схеме, приведенной на фиг. 36.

На фиг. 38А представлены результаты теста на бетаиновую чувствительность, полученные с использованием в качестве инокулята 0,5 стандарта Мак Фарланда (1.1± 0.18 х 10⁶ кое).

На фиг. 38В, 38С, 38Ό и 38Е представлены кривые роста с использованием в качестве инокулята 10Х (111,000+17,900 кое), 100Х (11,100±1,790 кое), 1,000Х (1,110+179 кое), и 10,000 Х (111±18 кое) разведений стандарта Мак Фарланда, соответственно. Звездочки: К..Е.; квадраты: Р-сах; треугольники: 15 мкг/мл СВ18; х: 30 мкг/мл СВ-18; «:60 мкг/мл СВ-18; кружки: 15 мкг/мл СВ-1 8 с Р/сах; вертикальные риски: 30 мкг/мл СВ-18 с Р/сах; горизонтальные риски: 60 мкг/мл СВ-1 8 с Р/сах.

Фиг. 39 (А,В,С).

Фиг. 39А иллюстрирует энзиматический механизм модификации миколевых кислот согласно Уиаи Υ. е1 а1., Ргос. Ка11.Асаб.8с1. 93:12828-12833 (1996).

На фиг. 39В представлен механизм, посредством которого тиатетракозаноевые кислоты могут действовать в качестве ингибиторов тех же самых ферментов. Образующийся при этом стабильный аналог переходного состояния будет сульфониумкарбоксибетаином.

На фиг. 39С представлен возможный механизм синтеза такого сульфониумкарбоксибетаина.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

В последующем описании широко используются многие термины, применяемые в фармацевтике и при тестировании чувствительности ίη х'Иго. Для того, чтобы обеспечить более полное и правильное понимание описания и формулы изобретения, включая вкладываемый в определенные термины смысл, приводятся определения следующих терминов.

Термин эффект СВ-18 означает повышение чувствительности отдельных бактерий, в частности микобактерий, к антибиотикам в присутствии бетаиноподобного детергента. Данный эффект проявляется при культивировании микроорганизма, такого как инфекционный агент, клинический изолят или его жизнеспособный экстракт, способный к росту, ίη νίΙΐΌ в присутствии эффективных количеств одного или нескольких антибиотиков с добавлением или без добавления одного или нескольких бетаиноподобных детергентов, в частности СВ-18. Присутствие бетаиноподобного детергента повышает чувствительность определенных бактерий, в частности микобактерий, к антибиотикам. Рост бактерий может быть охарактеризован количественно и качественно. Примером качественного результата является простая регистрация роста или его отсутствия. При количественной оценке регистрируют ростовой индекс в зависимости от количества дней культивирования, как это понимается из уровня техники. Примерами ростовых индексов могут быть простые условные символы (т.е.-, ±, 1+,2+,3+ и 4+) или цифровые показатели (т.е. от 0 до 999), как это предусмотрено культуральной системой ВАСТЕС 12В (Веск1оп О|к1П5оп. СоскеузуШе, МО, И8А). Эффект СВ-18 может проявляться в полном подавлении роста или не влиять на рост рег 8е, а сказываться на подавлении, задержке или в уменьшении наклона кривой роста (т.е. снижение скорости роста) в ходе экспоненциальной фазы роста, как это понимается из уровня техники. Существенная сторона эффекта СВ-1 8 состоит в том, что он проявляется в изменении одной или нескольких ростовых характеристик микроорганизма, инфекционного агента или клинического изолята, причем это изменение реализуется в контексте заявленного теста на бетаиновую чувствительность. Это проиллюстрировано в примере 10, где различные антибиотики применены в сочетании с различными бетаиноподобными детергентами. Наблюдаемое изменение совпадает с повышенной чувствительностью изолята к присутствующему антибиотику.

Термин тест на бетаиновую чувствительность означает применение одного или нескольких бетаиноподобных детергентов в сочетании с одним или несколькими антибиотиками в тесте ίη νίίτο с целью определения характера чувствительности микроорганизма (например, инфекционного агента или клинического изолята), или смеси различных микроорганизмов. При осуществлении теста на бетаиновую чувствительность образец, например, гомогенную популяцию микроорганизмов или смесь типов/вариантов/изолятов и т.д. микроорганизмов, приводят в контакт с композицией, содержащей антибиотик и бетаиноподобный детергент, и определяют чувствительность микроорганизма в образце к указанному антибиотику на основе жизнеспособности микроорганизма в образце. Тест на бетаиновую чувствительность является первым вариантом осуществления заявленных в изобретении способов. Такое тестирование бетаиновой чувствительности может быть проведено в микротитровальном варианте, в культуральных флаконах или плашках с плотной средой, как это понимается из уровня техники. Примерами стандартных жидких сред служат ВАСТЕС (ВескЮп ΩίΚιηδοη. Соскеу^Ше, ΜΌ), Е8Р Мусо 8у81ет II™ (ШЕСО БаЬогаЮпсх. Эсίτοίΐ, М1) или МТ/ВасТ™ (Огдапоп Текшка, Эиг11а т. ЫС). Примерами стандартных твердых сред служат известный из уровня техники агар Мюллера-Хинтона или другие эквивалентные среды. В подобные культуральные системы должны обязательно входить соответствующий антибиотик(и) и бетаиноподобный детергент(ы) в соответствующих комбинациях и соответствующих концентрациях, которые обсуждаются в настоящем описании. Как и в случае любого другого тестирования чувствительности, целью такого тестирования является идентификация антибиотика (антибиотиков), который с наибольшей вероятностью успешно излечит больного от инфекции.

Микроорганизм, такой как клинический изолят или инфекционный агент, считают чувствительным, если данный микроорганизм (например, МусоЬас1егшт), подвергается отрицательному воздействию антибиотика таким образом, что данный клинический изолят или инфекционный агент становится некомпетентным, неинфекционным или нежизнеспособным, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.Э.С. е1 а1., Ιη: Миггау, Р.К. е1 а1., ейк. Мапиа1 оГ Сйш са1 МюгоЬюйоду, А8М Ргекк, ^а§Ыпд!оп, Ц.С. (1995) рр.1281-1307 (работа, упоминаемая в качестве ссылки)). В данном контексте термин чувствительный синонимичен термину чувствительность. Когда определяют чувствительность микроорганизма, такого как клинический изолят или инфекционный агент, к конкретному антибиотику, считается, что антибиотик обладает активностью или активенпротив данного клинического изолята или инфекционного агента.

Термин тестирование чувствительности означает тест ш νίΙΐΌ. в котором определяется чувствительность микроорганизма, такого как клинический изолят или инфекционный агент, к ряду антимикробных соединений, как это понимается из уровня техники Цогдепкеп, 1.Н. е1 а1., 1п: Миггау, Р.К. е1 а1., ейк. Мапиа1 оГ С11шса1 М1сгоЬюйоду, А8М Ргекк, ^а§Ыпд1оп, Ц.С. (1995)рр. 1277-1280; АоосК С.Ь. е1 а1., 1п: Миггау, Р.К. е1 а1., ейк. Мапиа1 оГ СНшса1 МюгоЬюйоду, А8М Ргекк, ^акЫпдФп Ц.С. (1995) рр. 1327-1404; №10опа1 Соттй!ее Гог ЬаЬога1огу 81апйагй§. Ме1йой§ Гог О11ыНоп Ап11т1сгоЫа1 8и5сер11Ь11йу Тейь Гог Вас1епа Ша1 Сго\у АегоЫса11-Еоиг1й Еййюп. Арр^ονей 81апйагй М7-А4 V^11аηονа, РА (1997); №1юпа1 СоттШее Гог ЬаЬога1огу 81апйагй§. РегГогтапсе 81апйагй§ Гог Апйт1сгоЫа1 Этак 8и5сер11Ь11йу Те515-81х1й Ей11юп. Арр^ονей 81апйагй М2-А6 V^11аηονа, РА (1997); №йопа1 СоттШее Гог ЬаЬога1огу 81апйагйк. ^еνе1οртепΐ оГ 1п Уйго 8и5сер11Ь11йу Текйпд Сгйепа апй ОнаШу Соп!го1 Рагате1ег8. Арргсуей 81апйагй М23-А V^11апονа, РА (1994); №1юпа1 СоттШее Гог ЬаЬога1огу 81апйагй§. АпЦтусоЬас1епа1 8и5сер11Ь11йу ТеШпд Гог МусоЬас1егшт 1иЬегси1о8та; ТейаШе 81апйагй М24-А. V^11апονа, РА (1995) (все работы упоминаются в качестве ссылок). Целью любого тестирования чувствительности является более точное предсказание успешности терапевтического вмешательства.

Термин антибиотик обозначает любое известное из уровня техники соединение, обладающее отрицательным эффектом на жизнеспособность, целостность, инфекционность или компетентность инфекционного агента, как это понимается из уровня техники (см. Миггау, Р.К. е1 а1., ейк. Мапиа1 оГ Сйшса1 МюгоЬюйоду, А8М Ргекк, ^а8Й1пд1оп, Ц.С. (1995) рр.1281-1307 и Кисета, А. е1 а1., Т1е Ике оГ АпйЬюйск 4'¹' ей. ЕВ.ЫрршсоИ Со. РЫ1айе1рЫа, РА (1987); и Ьог1ап, V. ей. АпНЬюйск ш ЬаЬога1огу Мейюте 2^пй Еййюп ХУйНапъ & ВаШтоге, МЦ, все работы упоминаются в качестве ссылок. К примерам антибиотиков различных классов относятся β-лактамные антибиотики, ингибиторы β-лактамазы, аминогликозиды и аминоциклитолы, хинолоны, тетрациклины, макролиды и линкозамиды, а также гликопептиды, липопептиды и полипептиды, сульфонамиды и триметоприм, хлорамфеникол, изониазид, нитроимидазолы, рифампины, нитрофураны, метенамин и мупироцин, причем все перечисленные антибиотики могут оказаться полезны при осуществлении заявленного в изобретении способа. Термин антибиотик в данном контексте синонимичен терминам терапевтическое средство или лекарство. Все антибиотики являются лекарствами или терапевтическими средствами, но не все лекарства или терапевтические средства являются антибиотиками.

Термин адъювант означает химическое соединение, которое может обладать или не обладать антимикробной активностью, но примененное в сочетании (напр., одновременно) с одним или несколькими антибиотиками, данное соединение действует синергично и усиливает эффект этого антибиотика (или антибиотиков). Адъювант(ы) можно применять для повышения эффективности тестов на чувствительность или для антимикробной терапии. Примером терапевтического адъюванта может служить ингибитор β-лактамазы (ш£га). Способы и композиции, описанные в настоящей заявке, не подразумевают применение ингибиторов β-лактамазы в качестве адъювантов рег 8е, речь идет об использовании бетаиноподобных детергентов в качестве адъювантов, однако, бетаиноподобные детергенты можно применять сами по себе или с другими адъювантами, включая ингибиторы β-лактамазы.

Термин бетаиноподобный синонимичен термину $В-18-подобный, как они трактуются в №0 95/27076 и в и.8.5,658,749 (обе работы упоминаются в качестве ссылок). Согласно №0 95/27076 и И.8.5,658,749, бетаиноподобные детергенты обладают способностью диспергировать тяжи (и скопления) микобактерий и/или снижать плавучесть микобактерий. Диспергирование образующих тяжи микобактерий, таких, например, как организмы комплекса МусоЬас1епиш 1иЬегси1о818 (МТВ), облегчает их обнаружение, поскольку повышается вероятность того, что взятые для анализа аликвоты окажутся столь же репрезентативны, как и образец в целом. Бетаиноподобные детергенты, способные диспергировать тяжи микобактерий, имеют алкильную цепь длиной более чем 16 атомов углерода, и наиболее предпочтительна цепь длиной более чем 18-20 атомов углерода. Бетаиноподобные детергенты также облегчают сбор микобактерий, таких, например, как организмы комплекса МусоЬас1епит аущт (МАС), которые растут, не образуя скоплений, в некоторой степени снижая естественную плавучесть данных организмов. Такое снижение происходит посредством механизма, при помощи которого детергент проникает в бактериальную клетку. Бетаиноподобные детергенты, способные снижать плавучесть, предпочтительно имеют алкильную цепь длиной более чем 12 атомов уганионом γ.

лерода, и наиболее предпочтительна цепь длиной 16-20 атомов углерода. Таким образом, используемый в данном контексте термин бетаиноподобный, включает структуры, описанные в табл. 2 и 3 №0 95/27076 и и.8.5,658,749 (обе работы упоминаются в качестве ссылок), включая, например, СВ-подобные, 8В-подобные, Н8В-подобные, РВ-подобные, 81В-подобные, РйВ-подобные, 8оВ-подобные, РсуВ -подобные, АО-подобные, сАВ-подобные и 1тВ-подобные соединения, которые обладают 8В-18-подобной активностью, как описано в №0 95/27076 и и.8.5,658,749. К бетаиноподобным детергентам относится цвиттерионные соединения, имеющие структуру, приведенную в табл. 1. Считается, что данные структуры наиболее применимы для осуществления заявленных в изобретении способов.

Таблица 1. Наиболее применимые бетаиноподобные детергенты.

Приведена общая структура наиболее применимых бетаинов. В₁ представляет собой гидрофобную алкильную цепь, а α является связью, соединяющей В₁ с катионом, β. При необходимости К,₂ и Р₃ модифицируют катион. В₄ служит мостиком, соединяющим катион с

Кг I ^κιΤ<4.-β®-κ₄-[γ]^θ I К,

-СН₂-, -0-Р®-, -5®-Н, -СН₃-, -С₂Н₅-,-С₃Н₇-н, -сн₃-, -с₂н₅-,-с₃н₇-СН₂-,-С₂Н₄-,-С₃Н₆-, -С₄Н₈-, -С₅Н₁₀-, -^сб^н12---^СН2-^С6^Н4---^Ст^Н2ш-> ^где “г¹ -8О3®, -080э®, -СОО®, -ОРО3®, -РО3®, -РО3®Термин СВ-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит карбоксилатную сущность (-СОО⁰) в качестве аниона (т.е. карбоксибетаиноподобный). Термин 8В-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит сульфонатную сущность (-803^Θ) в качестве аниона (т.е. сульфобетаиноподобный). Термин Н8Вподобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит сульфонатную сущность в качестве аниона и гидроксильную группу (-ОН) в качестве мостика (т.е. гидроксисульфобетаиноподобный). Термин РВподобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит фосфатную (-ОРО3⁰), фосфанатную (-РО3⁰) или фосфинатную (-РО₂ ⁰) сущность в качестве аниона (т.е. фосфобетаиноподобный). Термин 81Вподобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит сульфатную (-0803⁰) сущность в качестве аниона (т.е. сульфатобетаиноподобный). Термин АО подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит оксидный радикал (-Ο^Θ) в качестве аниона (т.е. аминоксидоподобный). Термин РЕВ-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит фосфониумную (-Р®-) сущность в качестве катиона (т.е., фосфониумбетаиноподобный). Термин 8оВ-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит сульфониумную (-8®-) сущность в качестве катиона (т.е. сульфониумбетаиноподобный). Термин палкил бетаин означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит аммониумную (-Ν®-) сущность в качестве катиона (т.е. п-алкил бетаиноподобный). Термин 1тВ-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит имидазолиниумную сущность в качестве катиона (т.е. имидазолиниумбетаиноподобный). Термин КеуВ-подобный означает такой бетаиноподобный детергент, который содержит алкильную цепь, ковалентно присоединенную к аниону, а не к катиону (т.е. обратный бетаиноподобный). Термин сАВподобный означает такой бетаиноподобный детергент, содержит алкильную цепь, ковалентно присоединенную к мостику, а не к катиону или аниону (т.е. с-алкил бетаиноподобный).

Термин СВ-18 означает Ы-(3-карбоксипропил)-Ы,М-диметил-1 -октадеканаминиум, внутреннюю соль. СВ-18 также известен как внутренняя соль Х№диметил-Ы-(п-октадецил)М-(3-карбоксипропил)аммония или Сщ-карбоксипропилбетаин. СВ-1 8 имеет обозначение СА8® Νο.78195-27-4. Термин 8В-18 означает М-октадецил-Ы,М-диметил-3 -аммонио-1 -пропан сульфонат (СА8® Νο. 13177-41-8).

Термин 8В-16 означает Ν-гексадецилΝ,Ν-диметил-З -аммонио-1 -пропансульфонат (СА8® Νο.2281-11-0).

Термин 8В-14 означает Ν-тетрадецилΝ,Ν-диметил-З -аммонио-1 -пропансульфонат (СА8® Νο. 14933-09-6) и термин 8В-12 означает №додецилдецил^№диметил-3 -аммонио1-пропансульфонат (СА8® Νο. 14933-08-5).

Термин клинический изолят означает очищенный штамм бактериального агента, вызывающего инфекцию, при этом данный клинический изолят получен от больного, инфицированного данным инфекционным агентом. От одного больного можно получить один или несколько клинических изолятов, или один и тот же клинический изолят может быть получен от различных больных, как это имеет место при нозокомиальных вспышках (Р1йе!, Ό. е! а1, АгсЫтек ο£ 1и1егпа1 МеДюте 155:1177-1184, (1995)). Такие клинические изоляты обычно очищают сочетанием культуральных методов с методами обработки образца. Все такие клинические изоляты жизнеспособны и, следовательно, пригодны для дальнейшего анализа и тестирования в отношении чувствительности к анти биотикам в таких тестах ίη νίΐτο, как тест на чувствительность. К методам выделения таких клинических изолятов относятся известные из уровня техники способы, в частности, описанные Кеп1, Р.Т. е! а1., РиЬБс НеаИй Му^Ьа^еπο1ο§ν: А СшДе £ογ 1йе Бете1 III ^аЬο^а!ο^у, И8 ОераПтегИ ο£ НеаИй апД Нитап 8е1У1се, Сеп!егк Рэг 01кеаке СцпйЫ, А!1ап!а, СА (1985) рр.31-70 и №11е. Р.8. е! а1., 1п: Миггау, Р.Р. е! а1., еДк. Мапиа1 ο£ СНшса1 М^с^οЬ^ο^1οду, А8М Ргекк, \Уак11шдфп, Ό.Ο (1995) рр.400-437 для выделения Му^Ьа^егшт, или методы, приведенные С1апДде, ТЕ. е! а1., 1п: Миггау, Р.Р. е! а1., еДк. Мапиа1 ο£ СБшса1 М^с^οЬ^ο^1οду, А8М Ргекк, ^акРт^й Ό.Ο (1995) рр.357-378 и Веатап, В.Ь. е! а1., 1п: Миггау, Р.Р. е! а1., еДк. Мапиа1 ο£ С11тса1 М^с^οЬ^ο^1οду, А8М Ргекк, ^акЫпдЮп, Ό.Ο (1995) рр.379-399 для выделения СогупеЬас!егшт и №сагД|а, соответственно (все работы упоминаются в качестве ссылок).

Термин инфекционный агент означает инфекционный микроорганизм, в особенности инфекционную бактерию, как это понимается из уровня техники. К инфекционным агентам, представляющим особенный интерес в свете заявленных в изобретении способов, относятся такие, которые содержат структуры миколевой кислоты, например, микобактерии, и, в частности, бактерии комплекса Му^Ьа^егшт !иЬегси^кщ, вызывающие заболевание (1кепЬегд, Η.Ό. е! а1, 1п: Миггау, Р.Р. е! а1., еДк. Мапиа1 ο£ Сйшса1 М^с^οЬ^ο^1οду, А8М Ргекк, ^акЫпдЮп, Э.С. (1995) рр.5-18 (работа упоминается в качестве ссылки). Считается, что человек или животное, страдающие от болезни, вызванной данным инфекционным агентом, переносят инфекцию, вызванную данным агентом, или являются инфицированными данным агентом. Инфекционный агент, который вызывает заболевание, считается патогенным. Бактерии, которые обычно непатогенны и являются частью нормальной флоры больного, считаются сапрофитами. В определенных условиях, когда иммунитет больного ослаблен или подавлен (например, при инфекции ВИЧ, при СПИД, или после пересадки органов) такие сапрофитные микроорганизмы могут вызывать инфекцию. Больной может быть инфицирован одним или несколькими инфекционными агентами.

Под структурами миколевой кислоты понимают β-гидрокси кислоту с заменой по αположению алифатической цепью умеренной длины, как это понимается из уровня техники (Сο^еη, М.В. ВаскРет. 36:33-64 (1966) (работа упоминается в качестве ссылки). Примером организма, имеющего коринемиколевую кислоту, является 6.0^1^^1^111.1111 Д1рН(Нег1а; примером организма, имеющего нокардомиколевую кислоту, является №сагД1а аЧегоиДек; и примером организма, имеющего миколевую кислоту, является Му^Ьа^егшт ШЬегсиЦкщ (см. также Рипке, С. е! а1., СБп. Мюго.Рет. 10:125-159 (1997), где обсуждаются различные коринеформные бактерии (работа упоминается в качестве ссылки). Такие миколеподобные молекулы совокупно обозначают как структуры миколевой кислоты. Дополнительные таблицы репрезентативных структур миколевой кислоты, включая ненасыщенные, циклопропаноидные, метоксилированные и кетоновые кислоты, можно найти, например, в работах Ьебегет, Е. С11ст. Рйук. Ыр1бк 1:294-315(1967); Еебетет, Е. Риге Арр1. Сйет. 25:135-165 (1971) (обе работы упоминаются в качестве ссылок). Структуры миколевой кислоты являются кислотоустойчивыми молекулами.

Термин антимикробная терапия означает лечение больного, будь это человек или животное, ίη νίνο, эффективными количествами содержащих антибиотик композиции, примененной, например, перорально, в виде инъекции, наружно или в виде ингаляции. Доставка заявленных композиций, включающих антибиотик, может осуществляться, без ограничения перечисленным, путем внутривенных инъекций, в виде активного компонента мазей или перорально. Целью антимикробной терапии является нарушение жизнеспособности, целостности или компетентности инфекционного агента таким образом, что инфицированный человек или животное выздоравливает или преодолевает инфекцию. Антимикробная терапия может проводиться с применением одного или нескольких классов препаратов, одного или нескольких препаратов в пределах данного класса антибиотиков, примененных индивидуально или в сочетании, т.е. одновременно или последовательно.Термин антимикробная терапия синонимичен понятиям терапия антибиотиками или просто терапия.

Под эффективным количеством понимают такое количество препарата, которое достаточно для достижения конечной цели. Например, в контексте антимикробной терапии эффективным считается такое количество, применение которого приводит к излечению микробной инфекции. Такое излечение может быть результатом прямого воздействия на микроорганизм или непрямого эффекта, когда эффективное количество препарата воздействует на микроорганизм таким способом, что повышает чувствительность микроорганизма ко второму агенту.

Материал считается по существу свободным от контаминантов если он в значительной степени очищен от материалов, с которыми он был ассоциирован до такой очистки, до такой степени, которая необходима для проведения необходимых процедур или анализов. Таким образом, подобные контаминанты или полностью отсутствуют, или присутствуют в таких низких концентрациях, что их присутствие (1) не мешает нужному терапевтическому эффекту, когда содержащий подобные материалы препа рат вводят больному и (2) не наносит вреда больному после введение подобного препарата.

Термин введение больному означает введение нужной субстанции в или на нужное место больного, будь это человек или животное, которому это показано, любым известным из медицинского искусства способом, достаточным для достижения поставленной цели, включая (без ограничения перечисленными) энтеральное, парентеральное (напр., внутривенное) и ионофоретическое введение. Введение может быть также осуществлено в виде повязки, помещенной на место инфекции, при этом повязка обеспечивает эффективное высвобождение антибиотика (антибиотиков) и бетаиноподобных детергентов.

Совместное введение двух или более агентов, таких как антибиотик и бетаиноподобный детергент, больному означает введение этих агентов или вместе в виде одного препарата, или раздельно, в виде индивидуальных препаратов.

Термин фармацевтически приемлемая соль объединяет соли, образуемые фармацевтически приемлемыми кислотами или основаниями, такими, например (без ограничения перечисленными), как серная, соляная, азотная, фосфорная и др. кислоты, или такими основаниями, как гидроксиды щелочных или щелочноземельных металлов, гидроксидов аммония, гидроксидов алкиламмония и т. д.

Термин фармацевтически приемлемый носитель объединяет фармацевтически приемлемые растворители, носители, разбавители и т.п., которые используют в качестве добавок к заявленным препаратам для введения подобных соединений.

Термин лечение означает введение эффективных количеств одного или нескольких терапевтических агентов субъекту или объекту, которому показано введение подобных агентов в целях профилактики, облегчения, предотвращения или излечения заболевания, или искоренения микроорганизма, который считается чувствительным к данным агентам.

Термин приведение в контакт образца, содержащего микроорганизм, означает смешивание микроорганизма и композиции, или обеспечение контакта между микроорганизмом и композицией каким-либо другим способом.

Авторы неожиданно обнаружили, что при сочетании, по меньшей мере, одного бетаиноподобного детергента, такого как С₁₈карбоксипропилбетаин (СВ-18), с антимикробными соединениями, клинические изоляты микобактерий можно дифференцировать на основе индуцированной чувствительности. Авторы распознали, что данный феномен может быть полезен для характеристики подобных клинических изолятов, а также микроорганизмов и инфекционных агентов вообще, в отношении их чувствительности к подобным антимикробным соединениям. Кроме того, авторы также считают, что данный феномен должен быть полезен для усиления синергистическим образом чувствительности таких микобактерий к подобным антимикробным соединениям при терапии ίη νίνο.

Таким образом, в своем наиболее широком осуществлении изобретение направлено на способ характеризации чувствительности микроорганизмов к антимикробным соединениям. В предпочтительном варианте осуществления изобретения тестируемый микроорганизм является инфекционным агентом или клиническим изолятом. Согласно другому варианту осуществления изобретения, подлежащий тестированию микроорганизм получен из образца, взятого от пациента, который подозревается на инфицированность или действительно инфицирован нежелательными бактериями, содержащими структуры миколевой кислоты. Заявленный в настоящем изобретении тест на чувствительность обозначается как тест на бетаиновую чувствительность. Результатом тестирования чувствительности является характеристика исследуемого микроорганизма, присутствующего в таком образце, как клинический изолят или инфекционный агент, в отношении описываемого эффекта СВ-18. То есть, заявленный тест на чувствительность дает возможность определить является ли присутствующий в образце микроорганизм (микроорганизмы) чувствительным к проверяемому антибиотику (антибиотикам). Предпочтительно, чтобы в результате тестирования чувствительности были определены один или несколько антибиотиков, или их сочетание с другими эффективными агентами, например, бетаиноподобными детергентами, к которым чувствителен микроорганизм, присутствующий в образце. Однако важно также, чтобы в результате тестирования чувствительности были определены один или несколько антибиотиков, или их сочетание с другими эффективными агентами, например, бетаиноподобными детергентами, к которым микроорганизм, присутствующий в образце нечувствителен. Результат позволяет медику-профессионалу более эффективно выбирать соответствующую антимикробную терапию для лечения больных или, с другой стороны, сделать стерильным в отношении данного микроорганизма то место, откуда был получен образец.

Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретение направлено на способ лечения больных в ходе терапии антибиотиками с использованием бетаиноподобных детергентов в качестве адъювантов, при этом у пациента подозревают инфекцию, он рискует быть инфицированным или действительно инфицирован нежелательными бактериями. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, такие нежелательные бактерии содержат структуры миколевой кислоты. Может быть разработана терапия антибиотиком для излечения подобной инфекции путем применения комбинации одного или нескольких антибиотиков с одним или несколькими бетаиноподобными детергентами. Сочетание антибиотика с бетаиноподобным детергентом более эффективно излечивает больного, нежели терапия только антибиотиком, влияя на целостность бактерий таким образом, что инфекционные организмы становятся некомпетентными, неинфекционными или нежизнеспособными более быстро и более эффективно, нежели бы это происходило при применении антибиотика без бетаиноподобного детергента.

В третьем предпочтительном варианте осуществления изобретение направлено на способ стерилизации или предотвращения роста нежелательных микроорганизмов путем применения комбинации одного или нескольких антибиотиков с одним или несколькими бетаинами в месте инфекции и в окружении, в котором подозревается присутствие подобных микроорганизмов.

Заявленный в настоящем изобретении тест на чувствительность особенно полезен для определения и установления чувствительности микроорганизма, в частности, клинического изолята и/или инфекционного агента, к антимикробным агентам. Заболевание, вызываемое такими микроорганизмами, может быть вылечено эффективными количествами одного или нескольких антибиотиков с одним или несколькими бетаиноподобными детергентами, которые на основе результатов теста на чувствительность выбраны как рациональные компоненты терапевтического курса для излечения подобного заболевания, вызванного данными микроорганизмами.

При постановке тестов на чувствительность применение спектра концентраций данного бетаиноподобного детергента даст необходимую информацию об эффективности данного детергента, но предпочтительно тестирование более чем одного бетаиноподобного детергента. Можно протестировать сколько угодно много бетаиноподобных детергентов или их сочетаний. Предпочтительно, тестируют не менее пяти, хотя и любое другое число, например, 10, 15, 20,25 или 30 и даже более можно легко протестировать в различных разведениях. Тест на чувствительность дает возможность получить дополнительную информацию относительно эффекта сочетания таких концентраций бетаиноподобного детергента с выбранным антибиотиком (антибиотиками). Рабочая или применимая концентрация данного бетаиноподобного детергента будет зависеть от конкретного используемого детергента. Вообще, рабочие концентрации варьируют в пределах от 0,1 мкг/мл для наиболее сильных соединений до 1 мкг/мл для наиболее слабых соединений, при этом для большинства бетаиноподобных детергентов интервал концентраций от 1 до 100 мкг/мл будет наиболее применим. При постановке тестов на чувствительность такие бетаиноподобные детергенты можно использовать сами по себе или в сочетании с другими бетаиноподобными детергентами.

При том, что использование даже одного антибиотика в заявленных способах даст необходимую информацию о чувствительности, в тесте на бетаиновую чувствительность предпочтительно использовать несколько антибиотиков. Можно протестировать сколько угодно много антибиотиков или их сочетаний. Предпочтительно, тестируют не менее пяти, хотя и любое другое число, например, 10, 15, 20, 25 или 30 и даже более можно легко протестировать в различных разведениях. Концентрация данного антибиотика будет зависеть от конкретного используемого антибиотика. Вообще, рабочие концентрации варьируют в пределах от 0,1 мкг/мл для наиболее сильных антимикробных агентов до 100 мкг/мл для наиболее слабых соединений, при этом интервал концентраций от 0,5 до 64 мкг/мл будет наиболее применим для большинства антибиотиков. При осуществлении заявленных способов подобные антибиотики можно использовать сами по себе или в сочетании с другими антибиотиками.

Как и в случае других тестов на чувствительность (АооШ.С.К е! а1., Ιη: Миггау, Р.В. е! а1., еб§. Мапиа1 о£ С11п1са1 М1стоЬю1оду, Л8М Рте88, АазЫпдоп, Л.С. (1995) рр. 1327-1404), можно ожидать, что вариации в объеме инокулята будут влиять на результаты теста на бетаиновую чувствительность. Инокулят получают стандартным способом, включая перекалывание колоний или сравнение со стандартом Мак Фарланда, известным из уровня техники. Экспериментальные результаты, представленные на фиг. 5Л-5Р и в примере 8, показывают, что эффект СВ-18 сопоставим для инокулятов размером от нескольких клеток до нескольких тысяч клеток. В целом, для данных задач применим инокулят размером от 1 клетки до 10⁵ клеток, более предпочтителен инокулят от 100 до 10,000 клеток и наиболее предпочтителен инокулят 1,000 клеток. При инокуляте менее 10 клеток ошибка пипетирования может исказить результаты тестирования, а при инокуляте более 10⁵ клеток система будет перегружена, что также исказит результаты. Инокулят размером от 1,000 до 10,000 клеток дает возможность наблюдать рост контролей в зависимости от времени. Однако применим любой инокулят, дающий возможность наблюдать эффект СВ-1 8, и в этом отношении заявленный тест на бетаиновую чувствительность аналогичен другим тестам на чувствительность ίη νίΙΐΌ.

Получаемые в результате постановки описываемого теста на бетаиновую чувствительность данные являются результатом динамического взаимодействия изолята, бетаиноподобно го детергента (детергентов) и антибиотика (антибиотиков). В тесте на бетаиновую чувствительность сочетаются эти три компонента, что дает возможность профессионалу определить и подобрать концентрацию антибиотика (антибиотиков) и бетаиноподобного детергента (детергентов) с инокулятом таким образом, чтобы получить эффект СВ-18, обеспечивая тем самым сбор наиболее полезной информации относительно характера и/или чувствительности исследуемого клинического изолята.

Из примера 7 видно, что бетаиноподобные детергенты могут оказаться более полезны, нежели другие детергенты в заявленных тестах на чувствительность и терапевтических способах. Например, структуры, имеющие модификации в связи проявляют сниженную активность в тестировании чувствительности и терапевтических способах. Кроме того, бетаиноподобные детергенты, имеющие модификации в мостике, проявляют также сниженную активность в тестировании чувствительности и терапевтических способах. В таблице 1 приведены структуры, которые наиболее применимы для осуществления заявленных в изобретении способов.

Наиболее полезными бетаиноподобными детергентами служат такие, в которых нет модификаций, например, когда В! является простым алкилом, связь (α) является простым метиленом, В₂ и В₃ являются водородом или метальными группами (в зависимости от используемого катиона), а в В4 нет замен.

Токсичность бетаиноподобных детергентов для бактерий, содержащих миколевую кислоту, зависит от аниона (γ), длины мостика (ВЦ и длины алкильной цепи (В!). В целом, баланс между поверхностно-активной природой бетаина и его свойствами как адъюванта обязательно должен учитываться. Например, поверхностноактивные свойства зависят от кислотноосновного характера аниона и длины алкильной цепи. Наиболее ионными детергентами являются фосфобетаины (РО₄) и наиболее неионными детергентами являются сульфатобетаины (8О₄). Можно ожидать, что фосфобетаины окажутся исключительно токсичными, а с сульфатобетаинами будут связаны проблемы с растворимостью. Поэтому предпочтительнее сульфобетаины и карбоксибетаины, и наиболее предпочтительны карбоксибетаины. Исходя из обсуждения проницаемости (пример 9), можно предположить, что карбоксибетаины обладают наиболее предпочтительным анионом и при том, что СВ-1 8 содержит аммониумный катион, разумно предположить, что сульфониумбетаины должны обладать наиболее предпочтительным катионом. Таким образом, к предпочтительным структурам относятся η-алкил сульфобетаины, к особенно предпочтительным - η-алкил карбоксибетаины, и наиболее предпочтительным - алкил сульфониумкарбоксибетаины.

Поверхностно-активные свойства бетаинов изменяются с увеличением длины цепи. Более длинные алкильные цепи имеют более низкие критические мицеллярные концентрации (СМС), и наоборот, для более коротких алкильных цепей требуются более высокие концентрации для достижения СМС. Длина алкильной цепи может варьировать в зависимости от применения. Например, при более коротких алкильных цепях требуются более высокие концентрации для достижения СМС и поэтому во втором варианте осуществления изобретения (т.е. при антимикробной терапии) более короткие цепи предпочтительнее, особенно при внутривенном введении. Альтернативно, при терапевтическом применении путем ингаляции могут применяться композиции, которые менее зависят от отношения между концентрацией и СМС; поэтому могут применяться более длинные алкильные цепи. В первом варианте осуществления изобретения (т.е. в тесте чувствительности ίη νίίτο) длину алкильной цепи можно варьировать с тем, чтобы определить детергент, способный максимизировать наблюдаемый эффект СВ-18. Предпочтительны бетаиноподобные детергенты с длиной алкильной цепи в 8-22 атома углерода, особенно предпочтительна длина цепи в 12-18 атомов углерода, и наиболее предпочтительна длина цепи в 16-18 атомов углерода.

Мостиком минимальной длины, гарантирующим высаливание, будет пропиленовый мостик. Токсичность по отношению к микроорганизму также является функцией длины мостика (ТкиЬопе, К. е1 а1., 1оиг.Рйагт.§сг 80:441444(1991)). Например, этиленовый и бутиленовый мостики обусловливают большую токсичность, чем пропиленовый мостик. При использовании этиленового мостика могут возникнуть проблемы с растворимостью, в зависимости от используемых ионов. Поэтому необходимо принимать в расчет необходимое совпадение соответствующей длины алкильной цепи с ионами и структурой мостика для того чтобы избежать подобных проблем. Например, более длинные алкильные цепи требуют сочетания ионов с сильной полярностью (8О₄<8О₃<СО₃<РО₄) и такой структуры мостика, которая облегчает высаливание. Предпочтительна структура мостика типа -С_тН_2т- (где т>1), а наиболее предпочтителен мостик с такой же структурой с 6>т>3. Согласно ТкиЬопе, К. е1 а1., 1оиг. Рйагт. 8с1. 80:441 - 444 (1991), компоненты, используемые для модификации катиона, также вносят вклад в токсичность (т.е. токсичность обратно пропорциональна длине К.₂ и К.₃ (см. табл. 1).

Длина мостика и катионные компоненты могут варьировать в зависимости от использования. Например, во втором варианте осуществления изобретения (т.е. при антимикробной терапии), можно применять более короткие ал кильные цепи и структуры мостиков с т>2 также применимы, поскольку растворимость представляет меньшую проблему в случае коротких цепей. Альтернативно, доставка путем ингаляции необходимо требует растворимости бетаиноподобного детергента: поэтому могут потребоваться структуры мостиков с т>3. Как обсуждалось выше, полярность бетаина может быть изменена путем варьирования аниона. Опять же, соотношение длины мостика и используемых для модификации катиона компонентов может варьировать для максимизации наблюдаемого эффекта СВ-1 8 в первом варианте осуществления изобретения (т.е. в тесте ίη νίίτο).

Было проверено несколько карбоксибетаинов, которые проявили эффект СВ-18 в способах, заявленных в изобретении. К ним относятся: С1₈-карбоксиметилбетаин (СА8® Νο.693-334), С1₈-карбоксиэтилбетаин (СА8® Νο. 3061273-8), С;_8:1-карбоксиметилбетаин (СА8® Νο. 871-37-4) и С1₈-карбоксипропилбетаин (СА8® Νο. 78195-27-4).

Примерами наиболее полезных карбоксибетаинов, в которых использован метиленовый мостик (карбоксиметилбетаины: Я₄ = -СН₂-), метиленовая связь (α = -СН₂-), и которые отличаются только длиной алкильной цепи, являются: С₁₀ (СА8® Νο. 2644-45-3), С_п (СА8® Νο. 2956-38-9), С₁₂ (СА8® Νο. 683-10-3), С₁₃ (СА8® Νο. 23609-76-9), С₁₄ (СА8® Νο. 2601-33-4), С₁₅ (СА8® Νο. 23609-77-0), С₁₆ (СА8® Νο. 693-334) и С₁₈ (СА8® Νο. 820-66-6). С;₂-карбоксиметилбетаин (СА8® Νο. 6232-16-2) служит примером с Ν,Ν-диэтилом (Я₃=Я₄=-СН₂СН₃); а примером с двойной алкильной связью служит С_18:1 (СА8® Νο.871 -37-4). Примерами наиболее полезных карбоксибетаинов, в которых использован этиловый мостик (карбоксиэтилбетаины: К.4=-СН₂СН₂-), метиленовая связь (α = -СН₂-), и которые отличаются только длиной алкильной цепи, являются: С₁₂ (СА8® Νο. 16527-85-8), С₁₃ (СА8® Νο. 132621-79-5), С₁₄ (СА8® Νο. 69725-38-3), С₁₆ (СА8® Νο. 424-433) и С₁₈ (СА8® Νο. 30612-73-8). Примером карбоксиэтилбетаина, в котором К.₂ и К₄ в соответствующих условиях являются атомами водорода, служит СА8® Νο. 1462-54-0 (С_!2-бета аланин). Примерами наиболее полезных карбоксибетаинов, в которых использован пропиловый мостик (карбоксипропилбетаины: Р4 = -СН2СН2СН2-), метиленовая связь (α = -СН2-), и которые отличаются только длиной алкильной цепи, являются: Си (СА8® Νο. 150147-53-8), С₁₂ (СА8® Νο. 15163-30-1), С₁₄ (СА8® Νο. 146959-90-2), С₁₅ (СА8® Νο. 146959-91-3), С₁₆ (СА8® Νο. 71695-32-4) и С₁₈ (СА8® Νο. 7819527-4). Примером полезного карбоксибетаина, в котором использован бутиловый мостик (карбоксибутилбетаин: К.₄ = -СН₂ СН₂ СН₂ СН₂-) и метиленовая связь (α = -СН₂-), является: С₁₂ (СА8® Νο. 120139-51-7). Двумя примерами наиболее полезных карбоксибетаинов, в которых использован пентиловый мостик (карбоксипентилбетаины: Кд = -СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂-), метиленовая связь (α = -СН₂-), являются: С₁₂ (СА8® Ио. 76392-97-7) и С₁₆ (СА8® Ио. 7356598-7). Примером карбоксибетаина, в котором использован гексиловый мостик (карбоксигексилбетаин: Кд = -СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂-) и метиленовая связь (α = -СН₂-), служит С₁₂ (СА8® Ио. 132621-80-8). Имеется несколько примеров карбоксибетаинов, в которых в качестве мостика используется бензильная группа (К₄ = -СН₂ -С₆Н₄-). Имеется два примера С₁₂, в которых карбоксифункция находится в положении 4, или пара-положении (СА8® Ио.7195-313) и один, в котором карбоксифункция находится в положении 2, или орто-положении (СА8® Ио. 7195-34-6). Имеется два примера С₁₆, в которых карбоксифункция находится в положении 4, или пара-положении (СА8® Ио.7195-33-5) и один, в котором карбоксифункция находится в положении 2, или орто-положении (СА8® Ио.7195-35-7). Таким образом, термин карбоксибетаинподобный (СВ-подобный) включает не только те структуры, в которых в качестве аниона использована карбоксильная группа (у=СОО), как определено в \УО 95/27076 и И.8. 5,658,749, но и те бетаиноподобные структуры, которые приведены в табл. 1 и которые включают все возможные комбинации К_ь α, К₂, К₃, β и К4, как они определены в данном контексте.

В дополнение к карбоксибетаинам имеются другие доступные бетаины, которые могут быть использованы для целей настоящего изобретения, такие как сульфобетаины, например, высокоочищенные (т.е. реагентной чистоты) детергенты 8В-серии и, в частности, 8В-18 (Иоктадецил-И,И-диметил-3 -аммонио-1 -пропансульфонат (СА8® Ио. 13177-41-8)), 8В-16 (Игексадецил-Ν,Ν-диметил-3 -аммонио-1 -пропансульфонат (СА8® Ио.2281-11-0), 8В-14(Итетрадецил-ИХ-диметил-3 -аммонио -1 -пропансульфонат (СА8® Ио. 14933-09-6) и 8В-12 (Идодедецилдецил-Ν,Ν-диметил-3 -аммонио-1пропан-сульфонат (СА8® Ио.14933-08-5)).

Большинство коммерчески доступных бетаинов используют при производстве детергентов, шампуней, косметики и т.д. Эти бетаины исходно получают из натуральных жиров, таких как кокосовое масло, животный жир, зародыши пшеницы, бабассовое масло, касторовое масло, каноловое масло, соевое масло и рапсовое масло. Есть основания считать, что все эти бетаиноподобные детергенты будут полезны при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Настоящее изобретение особенно полезно для характеристики и проверки клинических изолятов или лечения заболеваний, вызванных инфекционными микроорганизмами, в частности микроорганизмами, являющимися липо фильными или заключенными в воскоподобную капсулу, и характеризующиеся наличием структур миколевой кислоты на своей внешней стенке (внешней мембране), таких, например, как кориномиколевые кислоты, нокардомиколевые кислоты и миколевые кислоты среди прочих.

Заявленными в изобретении способами предусматривается проверка микроорганизма, такого как МусоЬас!етшт, на чувствительность к антибиотикам. В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм представляет собой клинический изолят. Заявленные в изобретении способы направлены на терапевтическое применение, когда больной (человек или животное) подвергается терапии антибиотиками, в частности, с применением бетаиноподобных детергентов в сочетании с антибиотиками. Выбор бетаинов, используемых для тестирования или лечения согласно настоящему изобретению, будет зависеть от того, какой микроорганизм, предпочтительно бактерия, присутствует в образце.

Подобные процедуры тестирования или терапевтические схемы применимы к любому конкретному микроорганизму и, в особенности, к конкретной бактерии. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм представляет собой комплекс МусоЬас!етшт или является членом данного комплекса. Например, подлежащие тестированию бактерии могут относиться к любой группе или комплексу МусоЬас!епит, или к любому виду МусоЬас!етшт и, наиболее предпочтительно, к М.!иЬегси1о818 (МТВ) комплексу, комплексу М.аушт (МАС), комплексу МА18 и комплексу М.Гойийит. К подлежащим тестированию бактериям могут относиться как быстро растущие, так и медленно растущие микобактерии, включая идентифицированные и неидентифицированные фотохромогены, нонфотохромогены и скотохромогены. Любые микобактерии могут быть охарактеризованы или обработаны согласно настоящему изобретению, включая М.адп, М.аЬксеккш, М.асе!ат1бо1уйсит, М.аГпсаиит, М.аюШеике, М.аыайсит, М.аигит, М.аикгоаГпсаиит, М.аушт, М.Ьоук, М.Ьоущ (ВС6), М.с1е1оиае, М.сЬйае, М.сБиЬиеике, М.соокй, М.ШегпНоГеп. М.биуа1и, М.Га11ах, М.Гагстодеиек, М.йауексеик, М.Гойийит, М.дабшт, М.дайп, М.дйуит, М.догбопае, М.БаеторЬШит, М.т!гасе11и1ате, М.каикакп, М.котозкеике, М.1ергае, М.1ергаетипит, М.тапиит, М.та1тоеи8е, М.ткгой, М.топокаеизе, М.иеоаигит, М.иоисЬготодетсит, М.оЬиеизе, М.ратаГойийит, М.рага!иЬегси1о818, М.регедпиит, М.рШер М.рогстит, М.ротгГегае, М.ри1уеп8, М.тБобеыае, М.8сго&1асеит, М.зеиеда1еи8е, М.51пто1бек М.ыт1ае, М.ктедтайк, М.зрЬадш, М.8хи1да1, Мбетгае, М.Шеттотеы8ЙЬ1е, М.!ока1еи8е, М.!пу1а1е, М.!иЬегси1о818, М.и1сегаи8, М.уассае, М.хеиорг и их серовары.

М.1иЬегси1о818, М.айпсапит, Μ.ϋονίδ, Μ.ϋονίδ (В СО) и М.тютой являются членами комплекса МусоЬас1егшт.1иЬегси1о818 (МТВ). Мбеггае, М.йМа1е и М.попсйготодешсит являются членами комплекса М.1еггае. М.ахтт и М.т1гасе11и1аге являются членами комплекса МусоЬас1егшт ηνίιιιη (МАС); имеется по меньшей мере три различных серологических группы М.аушт и более чем 25 сероваров М.т1гасе11и1аге. К группе МА13 (М.ахтт1п1гасе11и1аге-8сго£и1асеит) относятся микобактерии с биохимическими свойствами комплекса М.аушт и микобактерий М.8сгоГи1асеит, но не гибридизуются с нуклеотидными зондами (например, АссиРгоЬе (Оеп-РгоЬе, Зап Эге^о. СА)), гомологичными микобактериям комплекса М.аушт.

М.капзазп, М.таппит, М.81т1ае и М.а81айсит служат примерами фотохромогенов. М.8сгоГи1асеит, М.ххиЦак М.хепор1, М.догбопае и М.йауезсепз являются примерами скотохромогенов. М.аушт, М.тйасе11и1аге, М.да8й1, М.та1тоеп8е, Мбеггае и М.йМа1е все служат примерами нонфотохромогенов.

М.айпсапит, М.а81айсит, М.ау1ит,

М.Ьоуй, М.Ьоу18 (ВСО), М.сооки, М.даЧгк М.догбопае, М.йаеторЫйит, М.тйасе11и1аге, М.капзази, М.1ергае, М.1ергаетигшт, М.таппит, М.та1тоеп8е, М.ткгой, М.попскготодепюит, М.рата1иЬегси1о818, М.8сгоГи1асеит, М.8Ыто1бе1, М.81т1ае, М.1еггае, М.йМа1е, М.1иЬегси1о818, М.и1сегап8 и М.хепор1 являются медленно растущими видами микобактерий (для выращивания требуется более семи дней). М.адп, М. аЬвсеззиз, М.асе1ат1бо1уйсит, МтсШепзе, М.аигит, М.аи8гоаГпсапит, М.сНе1опае, М.сБйае, М.скиЬиепзе, МШегпйоГеп, М.б^а1п, М.Га11ах, М.Гагстодепе8, М.Пауехсепх, М.Гойийит, М.дабшт, М.дйуит, М.котоззепзе, М.топокаепзе, М.пеоаигит, М.регедппит, М.оЬиепзе, М.рагаГойийит, М.рй1е1, М.рогсп пит, М.рогйегае, М.ри1уег18, М.гЬобе81ае, М.8епеда1еп8е, М.зтедтайз, М.8рЬадш, М.Шегтоге818ЙЬ1е, М.1ока1еп8е и М.уассае являются быстро растущими видами микобактерий (для выращивания требуется менее семи дней).

Примерами заболеваний и болезненных состояний, в которых участвуют микобактерии различных видов и которые можно лечить в соответствии с предложенными в изобретениями способами, являются прежде всего туберкулез (комплекс М.1иЬегси1о818), проказа (М.1ергае (проказа человека) и М.1ергаетипит (проказа грызунов)), болезни птиц, вызываемые бактериями комплекса МусоЬас1епит аутт. оппортунистические инфекции и суперинфекции больных СПИДом и другие заболевания, вызываемые Мдаит (№дБ1тда1е, 3.Ό. е1 а1., 1оиг.1пГес1.П18. 165:1082-1085 (1992)), и любые инфекции, вызываемые конкретными микобактериальным агентом, таким как, например, М.Ьоу18 (представляет особую важность для ветеринарии), М.Гойийит (почвенная бактерия, выделенная из повреждений у животных и человека), Млпйасе11и1аге (вызывает оппортунистические инфекции, особенно у больных, инфицированных вирусом СПИД), М.рагаШЬегси1о818 (представляет особый интерес при диагностике болезни Крона (регионального илеита) у людей), МусоЬас1епит кап8а8Й (редкий, но разрушительный агент, обычно связанный с заболеваниями легких), МусоЬас1егшт таппит (инфицирует холоднокровных животных и рыб; выделена также из подкожных гранулом конечностей у человека), МусоЬас1епит рагаШЬегси1о818 (каузативный агент болезни Джона у телят; очень медленно растет в культуре, требуется 16 недель, прежде чем можно убедиться в отрицательном результате) и М.и1сегапсе (причина язвы Бурули). Многие из перечисленных видов микобактерий, а также и другие их виды обсуждаются ^аупе, Ь.С. е1 а1., С1т М|сго.К.е\'.5: 1-25 (1992) и Ра1кшйат, О., С1т М1сго. Йех. 9: 177215 (1996) (обе работы упоминаются в качестве ссылок).

Бетаиноподобные детергенты можно использовать в качестве адъювантов сами по себе (если детергент обладает антимикробной активностью) или в сочетании с антибиотиками. Например, согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, бетаиноподобный детергент (детергенты) являются компонентом панели для проверки чувствительности (как описано в примере 10), при этом такие детергенты применяют сами по себе или в комбинации с антибиотиками или другими бетаиноподобными детергентами для характеризации чувствительности клинического изолята. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения бетаиноподобные детергенты применяют сами по себе или в комбинации с антибиотиками для антимикробной терапии. При том, что бетаиноподобные детергенты можно применять сами по себе, ш Беи антибиотиков, более предпочтительно применять их в сочетании с такими антибиотиками. В любом варианте осуществления изобретения бетаиноподобные детергенты применяют сами по себе или в сочетании с другими адъювантами, одновременно или последовательно. Например, бетаиноподобные детергенты можно использовать в сочетании с другими бетаиноподобными детергентами или с другими адъювантами, такими как ингибиторы β-лактамазы.

Согласно второму варианту осуществления изобретения, заявленные способы применяются для лечения больного, будь это человек или животное, которому это показано, эффективными количествами заявленных композиций, содержащих бетаиноподобный детергент сам по себе или антибиотик в сочетании с бетаиноподобным детергентом. Понятие антимикробной терапии также включает применение подобных комбинаций. Доставка бетаиноподобных детер гентов может быть осуществлена любым способом, который обеспечит поступление больному эффективных количеств препарата, например, перорально или внутримышечной инъекцией, или, в частности, внутривенной капельницей, и, наиболее эффективно, вдыханием или наружным применением указанных композиций.

Антибиотик может вводиться отдельным способом и в другом растворе, или же вводиться вместе с бетаиноподобным детергентом. Очевидно, бетаиноподобные детергенты должны хорошо переноситься при пероральном введении и внутримышечных инъекциях, внутривенные капельницы также могут служить важным способом доставки; однако, должны быть предприняты меры предосторожности в отношении концентрации бетаина в крови. При том, что введение бетаина в дозе, превышающей критическую мицеллярную концентрацию (СМС) может быть переносимо, могут возникнуть осложнения при превышении его общего уровня в крови выше СМС из-за солюбилизации компонентов крови. Инъекция в место инфекции, очевидно, является эффективным способом доставки, однако, это возможно лишь в редких случаях. Предпочтительно, чтобы композиция или, по меньшей мере, один бетаиноподобный детергент доставлялись наиболее прямым способом или, по-возможности, прямо в место инфекции. В этом отношении, применительно к тем микобактериальным инфекциям, которые, как туберкулез, являются респираторными инфекциями, ингаляция является наиболее предпочтительным способом доставки. Примером ингаляционного устройства для доставки бетаиноподобных детергентов, заявленных в изобретении, должен служить ингалятор, используемый в настоящее время для доставки альбутерола, βблокатора для астматиков (т.е. Уеп1о1т®, продаваемый А11еп&НапЬшу, подразделением 61ахо, Кекеагсй ТпапДе Рагк, ЫС). Микобактериальные инфекции, вызываемые, например, М.и1сегап8 (язва Бурули) предпочтительно лечить наложением бетаиноподобного детергента прямо на повреждение (вместе с антибиотиками или без них) в виде мази.

Дозировки и расписание введения данного бетаиноподобного детергента больному могут быть определены клиницистом, опытным в лечении микробных инфекций подобного рода. Обычно дозировки антибиотика и бетаиноподобного детергента будут варьировать в зависимости от следующих соображений: тип используемых антибиотика и бетаиноподобного детергента: возраст больного: состояние его здоровья; заболевание, подлежащее излечению; тип возможной конкурентной терапии; частота лечения и природа желаемого эффекта; степень повреждения ткани, пол больного, продолжительность симптомов и возможные противопоказания среди других переменных факторов должны учитываться врачом. Для достижения желаемого результата доза может вводиться однократно или многократно. Вообще, рабочие концентрации могут варьировать в пределах от 0,1 мкг/мл для наиболее сильных соединений (например, карбоксиэтилбетаинов) до 1 мкг/мл для наиболее слабых соединений (например, тех карбоксибетаинов, которые в табл. 10 отмечены, как не давшие эффекта), при этом для большинства бетаиноподобных детергентов интервал концентраций от 1 до 100 мкг/мл будет наиболее применим. При применении бетаиноподобных детергентов в виде мази рабочие концентрации могут варьировать в пределах от 0,1 мкг/мл для наиболее сильных соединений до 1 мкг/мл для наиболее слабых соединений, при этом для большинства бетаиноподобных детергентов интервал концентраций от 1 до 100 мкг/мл будет наиболее применим. При осуществлении заявленных терапевтических способов такие бетаиноподобные детергенты могут применяться сами по себе или в сочетании с другими бетаиноподобными детергентами. Предпочтительно бетаин вводят на протяжении того же времени, что и антибиотик.

Концентрация данного антибиотика будет зависеть от того, какой антибиотик используется. Согласно заявленным способам антибиотики могут применяться в терапевтически эффективных дозах, известных из уровня техники, или в таких концентрациях, которые определены как терапевтически эффективные в в заявленных тестах на чувствительность. К примерам различных классов антибиотиков, применимых при осуществлении заявленного способа, относятся β-лактамные антибиотики, аминогликозиды, аминоциклитолы, хинолоны, тетрациклины, макролиды, линкозамиды, гликопептиды, липопептиды, полипептидные антибиотики, сульфонамиды, триметоприм, хлорамфеникол, изониазиды, нитроимидазолы, рифампины, нитрофураны, метенамин и мупироцин.

К антибиотикам, обладающим значительной активностью против микобактерий, относятся, без ограничения перечисленными, амикацин, азитромицин, любой β-лактам в сочетании с любым ингибитором β-лактамазы, капреомицин, цефметазол, цефокситин, ципрофлоксацин, кларитромицин, клофазамин, циклосерин, дапзон, эритромицин, этамбутол (ЕМВ), этионамид, имипенем, изониазид (ΙΝΗ), канамицин, миноциклин, офлоксацин, парааминосалициловая кислота, протионамид, пиразинамид (ΡΖΑ), рифампин (КРМ), рифабутин, спарфлоксацин, сульфаметоксазол в сочетании с триметопримом, стрептомицином (8М), тетрациклином, триацетазолом и виомицином (Чпбегйеб. С.В. е1 а1., Ιη: Миггау, Р.К е1 а1., ебк. Мапиа1 о£ Сйшса1 М1сгоЬ1о1о§у, А8М Ргекк, ХУакйтдЮц Э.С. (1995) рр. 1385-1404), и Кисегк, А. е1 а1., ТНе Ике о£ АпбЫобск 4‘^ь еб. б.В.Ырртсоб Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр. 1352-1437). Все перечислен ные антибиотики могут применяться при осуществлении заявленных способов.

Термин β-лактам означает любой пенициллиновый, цефалоспориновый, монобактамный или карбапенемный антибиотик, в чью структуру входит β-лактамное кольцо, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Мапиа1 οί С11шса1 М1егоЫо1оду, Ά8Μ Рге88, АаЧппфоп. Ό.Ο (1995) рр.1281-1282); Кисег8, А. е! а1., ТНе Ике οί ΑηΐίЬюИс8 4^!Ь еб. ТВ.Ырртсой Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.3-584). Все перечисленные β-лактамы могут применяться при осуществлении заявленных способов.

Термин пенициллин означает антибиотик, имеющий в качестве химического ядра 6аминопеннициллановую кислоту, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Мапиа1 οί С11п1са1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, АакЫпдоп, Ό.Ο (1995) рр.1282-1285). Примерами пенициллинов, без ограничения перечисленными, служат метициллин, нафциллин, клоксациллин, диклоксациллин, оксациллин, ампициллин, бакамипициллин, карбенициллин, трикациллин, мезлоциллин, пиперациллин и, в особенности, азлоциллин. Есть основания считать, что пенициллины с химической структурой, гомологичной таковой для приведенных выше пенициллиновых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин цефалоспорин означает антибиотик, имеющий в качестве химического ядра 7аминоцефалоспораниловую кислоту, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Мапиа1 οί С11шса1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, АазЬтдощ Ό.Ο (1995) рр.1282-1285). Примерами цефалоспоринов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, цефадроксил, цефазолин, цефалексин, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефрадин, цефаклор, цефамандол, цефоницид, цефоранид, цефпрозил, цефуроксим, лоракарбеф, цефметазол, цефотетан, цефиксим, цефотаксим, цефпродоксим, цефтидоксим и, в особенности, цефтриаксон. Есть основания считать, что цефалоспорины с химической структурой, гомологичной таковой для приведенных выше цефалоспориновых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин монобактам означает антибиотик, имеющий в качестве химического ядра βлактамное кольцо, как это понимается из уровня техники (Уао, Ι.Ό.Ο е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Маша1 οί С’1писа1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, АакИтдощ Ό.Ο (1995) р.1285). Примером монобактама, применимого для осуществления заявленных способов, является, без ограничений названным, азтреонам. Есть основания считать, что монобактамы с химической структурой, гомологичной таковой для приведенного выше монобактама, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин карбапенем означает антибиотик, имеющий в качестве химического ядра βлактамное кольцо, боковую гидроксиэтиловую цепь в положении 6 (в транс конфигурации) и не имеющий атома серы или углерода в ядре, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Маша1 οί Сйи!са1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, ^8^^^, Э.С. (1995) рр. 1285-1286). Примерами карбапенемов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, имипенем, меропенем, панипенем и биапенем. Есть основания считать, что карбапенемы с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше карбапенемных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин ингибитор β-лактамазы означает антибиотик, имеющий в качестве химического ядра модифицированную β-лактамную структуру, как это понимается из уровня техники (Уао, ТО.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Μаηиа1 οί С11шса1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, ^кИп^ои, Ό.Ο (1995) рр. 1286-1287). Известно, что эти соединения, обладая в чистом виде слабой антибактериальной активностью, действуют синергично с β-лактамами. Ингибиторы β-лактамазы интерферируют с ферментами, которые деградируют β-лактамы (т.е. с β-лактамазами). Например, β-лактамазы разрушают β-лактамы. Обладая такой функцией, микроорганизм эффективно избегает действия β-лактамов, что обуславливает устойчивость инфекционного агента. Следовательно, ингибиторы β-лактамазы полезны в сочетании с β-лактамными антибиотиками, в качестве адъювантов при β-лактамной терапии. Примерами ингибиторов β-лактамазы, применимых для осуществления заявленных способов наряду с β-лактамом, являются, без ограничения перечисленными, клавулановая кислота, сульбактам и тазобактам. Есть основания считать, что ингибиторы β-лактамазы с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше ингибиторов βлактамазы, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термины аминогликозид и аминоциклитол означают антибиотик, имеющий аминосахара, связанные гликозидиловыми связями с аминоциклитольным ядром, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.И.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб8. Маша1 οί С’1йиса1 М1сгоЬю1оду, А8М Рге88, ^кИп^ои, Ό.Ο (1995) рр.12871288); и Кисег8, А. е! а1., Тйе И8е οί Ап!1Ыойс8 4‘^ь еб. ЕВ.Ырршсо!! Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.585-750). Примерами аминогликозидов и аминоциклитолов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, стрептомицин, канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин, сисомицин, нетилмицин, неомицин, фрамицетин и паромомицин. Есть основания считать, что аминогликозиды и аминоциклитолы с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше аминогликозидных и аминоциклитольных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термины хинолон или флуорохинолон означают антибиотик, имеющий нафтиридиновое ядро с различными боковыми цепями, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ Сйшса1 М1сгоЬю1оду, А8М Ргекк, ^акЫпдоп, Э.С. (1995) рр.1288-1290); и Кисегк, А. е! а1., ТЬе Ике о£ АпбЬшбск 4'¹' еб. ЕВ.Ырршсо!! Со. Р1п1абе1рЫа, РА (1987) рр. 1203-1275). Примерами хинолонов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, оксолиновая кислота, циноксацин, флумеквин, милоксацин, розоксацин, пипемидиловая кислота, норфлоксацин, эноксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин, темафлоксацин, флероксацин, пефлоксацин, амифлоксацин, спарфлоксацин, левофлоксацин, цинафлоксацин и, в особенности, налидиксиновая кислота. Есть основания считать, что хинолоны или флуорохинолоны с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше хинолонных или флуорохинолонных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин тетрациклин означает антибиотик, имеющий в качестве ядра гидронафтаценовую структуру, как это понимается из уровня техники (Уао, I. Ό. С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ С11шса1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргекк, ^акЫпдоп, ΌΌ. (1995) рр.1290-1291); и Кисегк, А. е! а1., ТЬе Ике о£ АпбЫобск 4'¹' еб. ЕВ.Ырршсоб Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.9791044). Примерами тетрациклинов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин, диметилхлортетрациклин, демеклоциклин, метациклин, лимециклин, кломоциклин, доксициклин и миноциклин. Есть основания считать, что тетрациклины с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше хинолонных или тетрациклиновых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин макролид означает антибиотик, имеющий макроциклическое лактоновое кольцо с двумя присоединенными сахарами, декозамином и кладинозой, и различными заменами, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1; 1п: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ С11шса1 М1сгоЬш1оду, А8М Ргекк, ^акйшд!оп, Э.С. (1995) рр. 1291-1292); и Кисегк, А. е! а1., ТЬе Ике о£ АпбЫобск 4'¹' еб. ЕВ.Ырршсоб Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.851-892). Примерами макролидов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, эритромицин, олеандомицин, спирамицин, йозамицин, розарамицин, кларитромицин, азитромицин (известный также как азалид), диритромицин, рокситомицин, флуритромицин и рокитамицин. Есть основания считать, что макролиды с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше макролидных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин линкозамид означает антибиотик, имеющий аминокислоту, соединенную с аминосахаром, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.О.С. е! а1., 1п: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ Сйшса1 М1сгоЬю1оду, А8М Ргекк, ^акЫпдоп, О.С. (1995) рр.1292-1293); и Кисегк, А. е! а1., ТЬе Ике о£ АпбЫобск 4'¹' еб. ЕВ.Ырршсо!! Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.819850). Примерами линкозамидов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, линкомицин и клиндамицин. Есть основания считать, что линкозамиды с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше линкозамидных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термины гликопептидили липопептид означают антибиотик, имеющий комбинацию пептида с углеводородным или липидным компонентом, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.О.С. е! а1., 1п: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ С1шка1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргекк, ^акЫпдоп, ΌΌ. (1995) рр.1293); и Кисегк, А. е! а1., ТЬе Ике о£ АпбЫобск 4'¹' еб. ЕВ.Ырршсой Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) р. 1045-1072). Примерами гликопептидов и липопептидов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, ванкомицин, тейкопланин, даптомицин (известный также как УЬ 146032) и рамопланин (известный также как МОЬ 62198). Есть основания считать, что гликопептиды и липопептиды с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше гликопептидных и липопептидных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин полипептидный антибиотик означает антибиотик, имеющий циклическую полипептидную структуру, или аминокислоты, соединенные с пептидом, как это понимается из уровня техники (Уао, Ю.С. е! а1., 1п: Миггау, Р.К. е! а1., ебк. Мапиа1 о£ С11шса1 М1сгоЫо1оду,

Α8Μ Рге55, \Уа51ппдЮп, Ό.Ο. (1995) рр.12951296); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Αηί^Ь^о!^С5 4'¹' еб. ЬВ.Ырртсоб Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр.899-913 и 751-753). Примерами полипептидных антибиотиков, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, полимиксины А, В, С, Ό и Е, бацитрацин и грамицидин. Есть основания считать, что полипептидные антибиотики с химической структурой, гомологичной таковой для перечисленных выше полипептидных антибиотиков, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин сульфонамид означает антибиотик, имеющий ядерную структуру, аналогичную парааминобензоиловой кислоте, как это понимается из уровня техники (Уао, I. Ό. С. е! а1., Ιη: Миггау, Р. К. е! а1., еб5. Мапиа1 оГ С11шса1 М1сгоЬ1о1оду, Α8Μ Рге55, \Уа51ппд1оп. Ό. С. (1995) рр.1293-1295); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ ΑηбЫобс5 4'¹' еб. I. В. ЫрртсоИ Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр. 1075-1117). Примерами сульфонамидов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, сульфаниламид, сульфацетамид, сульфапиридин, сульфатиазол, сульфадиазин, сульфамеразин, сульфадимидин, сульфазомидин, сульфасалазин, манефид, сульфаметоксазол, сульфаметоксипиридазин, сульфадиметоксин, сульфазимазин, сульфадоксин, сульфаметопиразин, сульфагуанидин, сукцинилсульфатиазол и фталисульфатиазол. Триметоприм применим для осуществления заявленных способов сам по себе или в сочетании с любым из сульфонамидов. Есть основания считать, что сульфонамиды и аналоги триметоприма с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше сульфонамидных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин нитроимидазольный антибиотик означает антибиотик, имеющий нитроимидазольное ядро, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.О.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб5. Мапиа1 оГ С11шса1 М1сгоЫо1о§у, Α8Μ Рге55, ^а5Ыпд!оп, Ό.Ο (1995) р.1297); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Лп1|Ь1о11с5 4'¹' еб. ЬВ.Ырртсо!! Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр. 1290-1343). Примерами нитроимидазольных антибиотиков, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, метронидазол, тинидазол, ниморазол, орнидазол, карнидазол и секнидазол. Есть основания считать, что нитроимидазолы с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше нитроимидазольных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин хлорамфеникольный антибиотик означает антибиотик, имеющий нитробензено вое кольцо в качестве структурного ядра, как это понимается из уровня техники (Уао, I. Ό. С. е! а1., Ιη: Миггау, Р. К. е! а1., еб5. Мапиа1 оГ С11П1са1 М1сгоЫо1о§у, Α^ Рге55, ^а5Ь^ηдιоη, Э.С. (1995) рр. 1296-1297); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Αη!^Ь^оί^С5 4'¹' еб. I. В. Ырртсоб Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр.757-807). Примерами хлорамфениколов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, хлорамфеникол и тиамфеникол. Есть основания считать, что хлорамфениколы с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше хлорамфеникольных соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин рифампицин означает антибиотик, имеющий анза- или макроциклическое структурное ядро (анзамициновые антибиотики), как это понимается из уровня техники (Уао, I. Ό. С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб5. Магша1 оГ Сйшса1 М1сгоЫо1о§у, Α^ Рге55, ^а5Ь^ηдιоη, Ό.Ο (1995) рр. 1298); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Αη^ώ!^ 4'¹' еб. I. В. Ырршсо!! Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр.914-970). Примерами рифампицинов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, рифампин, рифамицин 8У, рифамицин В (рифамид) и рифабутин. Есть основания считать, что рифампицины с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше рифампициновых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин нитрофуран означает антибиотик, имеющий гетероциклическое кольцо с нитрогруппой, как это понимается из уровня техники (Уао, 1Э.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб5. Маша1 оГ С1|шса1 М1сгоЫо1о§у, Α8Μ Рге55, Ш5Ып§!оп, Ό.Ο (1995) рр. 1276-1289); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Αη^ώ!^ 4'¹' еб. ТВ.Ырртсоб Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр.1276-1289). Примерами нитрофуранов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленными, нифурател, нитрофуразон, фуразолидон и нитрофурантоин. Есть основания считать, что нитрофураны с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше нитрофурановых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин метенамин означает антибиотик, имеющий четвертичный амин, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.О.С. е! а1., Ιη: Миггау, Р.К. е! а1., еб5. Маша1 оГ С1ипса1 МкгоЬю1оду, Α8Μ Рге55, ^а5Ь^ηд!оη, Ό.Ο (1995) р. 1299); и Кисег5, Α. е! а1., Т1е И5е оГ Αη!^Ь^оί^С5 4'¹' еб. ТВ.Ырршсо!! Со. РЫ1абе1рЫа, ΡΑ (1987) рр. 1344-1348). Примерами метенаминов, применимых для осуществления заявленных способов, являются, без ограничения перечисленны ми, метенамин, манделат, метенаминагиппурат. Есть основания считать, что четвертичные амины с химическими структурами, гомологичными таковой для перечисленных выше метенаминовых соединений, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Термин мупироцин(известный также как псевдомониковая кислота) означает антибиотик, имеющий уникальную сущность 9-гидроксинонаноиловой кислоты, как это понимается из уровня техники (Уао, 1.И.С. е! а1., 1п: Миггау, Р.В. е! а1., ебз. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргезз, ^азЫп§1оп, И.С. (1995) рр.12991300); и Кисегз, А. е! а1., Тйе Изе оГ АпНЫойсз 4^!Ь еб. ЬВ.Ырртсой Со. РЫ1абе1рЫа, РА (1987) рр.754-756). Есть основания считать, что соединения с химическими структурами, гомологичными таковой для приведенного выше мупироцинового соединения, также будут применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Терапия больных, инфицированных бактериями комплекса МусоЬас!егшт !иЬегси1оз1з (МТВ), предусматривает использование одного препарата или комбинации препаратов. К предпочтительным первичным препаратам (препараты первого ряда) для лечения ТВ относятся изониазид (ΙΝΗ), рифампин (ВМР), пиразинамид (ΡΖΑ), стрептомицин (8М) и этамбутол (ЕМВ); а к вторичным препаратам (препараты второго ряда) относятся ципрофлоксацин, офлоксацин, этионамид и циклосерин. К дополнительным препаратам, которые в настоящее время проходят испытания, относятся амикацин, рифабутин, рифапентин и спарфлоксацин (1пбегНеб, С.В. е! а1., 1п: Миггау, Р.В. е! а1., ебз. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргезз, ^азЫпд1оп, И.С. (1995) рр. 1385-1404). Любой препарат, обладающий активностью против содержащих структуры миколевой кислоты бактерий, будет применим при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Антимикробная терапия больных, инфицированных бактериями комплекса МусоЬас!епит ау1ит (МАС), обычно предусматривает применение одного препарата или сочетания ограниченного числа препаратов. Препаратами первого ряда для лечения МАС-инфекций являются азитромицин, кларитромицин и ЕМВ к препаратам второго ряда относятся амикацин, клофазамин, ципрофлоксацин и рифабутин. К альтернативным лекарствам относятся циклосерин и 8М (1пбег11еб, С.В. е! а1., 1п: Миггау, Р.В. е! а1., ебз. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргезз, ^азЫп§1оп, И.С. (1995) рр. 1385-1404). Все перечисленные антибиотики применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Инфекцию, вызываемую другими важными микобактериальными патогенами, например, М. капзази, обычно лечат одним препаратом или сочетанием препаратов, используемых для лечения инфекций ТВ или МАС, как это обсуждалось выше. Инфекции, вызываемые быстро растущими организмами (напр., М.Гойш!ит и М.сйе1опае) можно лечить амикацином или кларитромицином, а также β-лактамами и, в особенности цефалоспоринами (1пбег11еб, С. В. е! а1., 1п: Миггау, Р. В. е! а1., ебз. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЫо1оду, А8М Ргезз, ^азЫпд!оп, И.С. (1995) рр. 1385-1404). Все перечисленные антибиотики применимы при осуществлении заявленных в изобретении способов.

Бетаиноподобные детергенты и/или антибиотики, применимые при осуществлении заявленных в изобретении способов, в частности терапевтических, могут вводиться в любой фармакологически или фармацевтические приемлемой форме, включая, при необходимости, фармацевтически приемлемую соль или носитель. Они могут вводиться в любой форме, которая оказывает профилактический, паллиативный, превентивный или лечебный эффект при микробной инфекции людей или животных. Дозы антибиотиков, применимых при осуществлении заявленных способов, обычно рекомендованы производителем. Эти дозировки можно найти, например, в Настольном справочнике врача (РВЭ), Меб1са1 Есопоткз Сотрапу, Моп1уа1е, №\ν 1егзеу, И8А. Дозировки при ветеринарном применении можно найти, например, в Тйе Мегк Уе!егтагу Мапиа1, Мегск & Со., 1пс., Вай^ау, №\ν 1егзеу, И8А.

Когда антибиотик (антибиотики) и бетаиноподобный детергент (детергенты) вводятся больному в виде индивидуальных препаратов, предпочтительно, чтобы концентрации каждого агента были эффективными, т. е. совпадали во времени. То есть, микроорганизм в месте инфекции у данного больного должен подвергаться в одно и то же время воздействию эффективных концентраций как антибиотика (антибиотиков), так и бетаиноподобного детергента (детергентов), независимо от того, каким образом данные агенты были индивидуально введены больному. Поэтому, например, больному может быть назначено совместное введение антибиотика и бетаиноподобного детергента, например, перорально - антибиотик, а бетаиноподобный детергент - ингаляцией или внутривенно. Если больному назначено совместное введение антибиотика (антибиотиков) и бетаиноподобного детергента (детергентов), то они могут быть применены одновременно, в одном и том же препарате, например, в виде мази или повязки, обеспечивающей поступление как антибиотика (антибиотиков), так и бетаиноподобного детергента (детергентов).

Кроме того, больному может быть назначена предобработка как антибиотиком, так и бетаиноподобным детергентом в отсутствие другого компонента, а также обработка (лечение) антибиотиком или бетаиноподобным де тергентом, с применением того компонента, который отсутствовал при предобработке, будь это антибиотик или бетаиноподобный детергент, на протяжении времени, за которое не утрачен эффект предобработки на микроорганизм. Поэтому, например, больной может быть предобработан бетаиноподобным детергентом с тем, чтобы нарушить проницаемость и/или жизнеспособность микроорганизма до введения антибиотика вместе с бетаиноподобным детергентом или без него. Альтернативно, больной может быть предобработан антибиотиком до введения бетаиноподобного детергента вместе с антибиотиком или без него.

При смешивании каждый антибиотик (антибиотики) и бетаиноподобный детергент (детергента) могут быть в растворе, или же каждый из них быть в твердой форме (в частности, в виде суспензии). Альтернативно, один или несколько антибиотиков и/или один или несколько бетаиноподобных детергентов могут присутствовать в твердой форме в растворе других антибиотиков или детергентов.

Примерами композиций согласно настоящему изобретению, предназначенных для парентерального введения, служат стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами полезных неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, рыбий жир и органические эфиры для инъекций. К водным растворителям относятся вода, растворы спирта в воде, эмульсии или суспензии, включая раствор хлорида натрия, рингеровский раствор декстрозы, раствор хлорида натрия с декстрозой, раствор Рингера, содержащий лактозу или стабилизированные масла. Примерами носителей для внутривенного введения служат заместители жидкости, электролитные заместители, основанные на растворе Рингера с декстрозой и им подобные.

Инъекционные препараты, такие как масляные растворы, суспензии или эмульсии, можно получить, исходя из уровня техники, с применением приемлемых диспергирующих, увлажняющих или суспендирующих агентов, в зависимости от необходимости. Когда активные соединения водорастворимы, например, существуют в виде водорастворимых солей для приготовления стерильных инъекционных препаратов можно использовать нетоксические парентеральные разбавители или растворители, такие как стерильная непирогенная вода или 1,3бутандиол. Среди других приемлемых носителей и растворителей, которые могут применяться, можно назвать 5%-ную декстрозу для инъекций, раствор Рингера для инъекций и изотонический раствор хлорида натрия для инъекций (как описано в υ8Ρ/ΝΕ - Фармакопее США). Когда активные соединения представляют собой неводорастворимую форму, используют стерильные масляные суспензии, содержащие приемлемые липофильные растворители или носители, такие как жирные масла, например, сезамовое (кунжутное) масло или синтетические эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Альтернативно, могут использоваться водные инъекционные суспензии, содержащие вещества, повышающие вязкость, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и/или декстран в сочетании со стабилизаторами.

Фармацевтические препараты для орального применения можно получить путем сочетания активных соединений с твердыми наполнителями, дополнительным гранулированием полученной смеси. После добавления приемлемых дополнительных компонентов, смесь или гранулы при желании или необходимости можно покрыть оболочкой и придать ей форму таблеток или драже.

Приемлемыми носителями являются, в частности, такие наполнители, как сахара, например, лактоза и сахароза, маннитол или сорбитол, препараты целлюлозы и/или фосфаты кальция, например, трикальций фосфат или гидроксифосфат кальция, а также связующие, полученные с применением крахмалов и паст, таких, например, как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал или картофельный крахмал, желатин, акация, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, и/или поливинилпирролидон, и/или, по желанию, дезинтегрирующие агенты, такие как упоминавшиеся выше крахмалы, карбоксиметил крахмалы, поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соли, например, альгинат натрия. Дополнительные компоненты включают, кроме перечисленных выше веществ, агенты, регулирующие текучесть, и любриканты, например, кремний, тальк, стеариновую кислоту или ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, с соответствующим покрытием, которое может быть устойчивым к действию желудочного сока, и с этой целью, среди прочего, могут вводиться концентрированные растворы сахара, которые могут дополнительно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лаков и приемлемые органические растворители или смесь растворителей. Для того, чтобы получить покрытие, устойчивое к действию желудочного сока, применяют растворы соответствующих препаратов целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. В покрытие таблеток или драже могут вводиться краски или пигменты, например, для идентификации или для характеристики различных сочетаний активного соединения в дозировочной форме.

К другим фармацевтическим формам для орального применения относятся сборные капсулы, изготовленные из желатина, а также мяг кие, заплавленные капсулы, изготовленные из желатина с таким пластификатором, как глицерин или сорбитол. Сборные капсулы могут содержать активные соединения в виде гранул, смешанных, например, с такими наполнителями, как лактоза, такими связующими, как крахмалы, и/или такими любрикантами, как тальк или стеарат магния, и, дополнительно, со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворены или суспендированы в соответствующих липидах, таких как жирные кислоты, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли; в этом случае также возможно добавление стабилизаторов.

Суппозитории для ректального применения соединений согласно настоящему изобретению могут быть получены путем смешивания препарата с соответствующим основанием для суппозиториев, к которым относятся такие нераздражающие наполнители, как кокосовое масло, природные или синтетические триглицериды, парафиновые углеводороды, полиэтиленгликоли или высшие алканолы и особенно основания, которые остаются твердыми при нормальной температуре, но становятся жидкими при температуре тела и потому плавятся в прямой кишке, высвобождая препарат. Кроме того, возможно применение желатиновых ректальных капсул, состоящих из комбинации активного соединения и основания; к возможным материалам в этом случае относятся жидкие триглицериды, полиэтиленгликоли или парафиновые углеводороды.

К твердым дозировочным формам для орального применения относятся капсулы, таблетки, пилюли, пастилки, леденцы, порошки и гранулы. В таких твердых дозировочных формах активное соединение может быть смешано, по меньшей мере, с одним инертным наполнителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозировочные формы могут быть одеты соответствующим покрытием, регулирующим высвобождение активных компонентов.

К жидким дозировочным формам для орального применения относятся фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные нетоксические растворители, обычно применяемые для подобных целей, такие как вода и спирт. Такие композиции могут также содержать адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, осладители, ароматизаторы и отдушки.

Композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться при помощи микронасосов или в виде форм поддерживаемого высвобождения. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть доставлены в конкретные органы в высоких концентрациях при использовании соответствующих катетеров или же путем введения таких молекул в состав химерных молекул (или комплексов), предназна ченных для нацеливания на конкретный орган.

Введение в виде форм поддерживаемого высвобождения более удобно для больного, когда ему показаны повторные инъекции на протяжении длительного времени.

Бетаиноподобные детергенты или антибиотики, применяемые в композициях и способах согласно настоящему изобретению, могут назначаться в таких дозировочных формах, как таблетки, капсулы, содержащие порошок мази, порошки, или жидкие растворы для орального применения в том случае, если биологическая активность материала не разрушается в ходе пищеварения и если характеристики соединения делают возможным его всасывание в желудочно-кишечном тракте.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены способом, известным из уровня техники, например, при помощи обычного смешивания, гранулирования, приготовления драже, растворения, лиофилизации или аналогичными процессами.

Способы согласно настоящему изобретению, в частности тест на чувствительность, также удобно осуществимы если компоненты, используемые в таком тесте, поставляются в виде набора. Такой набор предпочтительно содержит соответствующие буферы, соли, бетаиноподобные детергенты или их комбинацию, антибиотик (антибиотики) или их комбинацию и, при необходимости, воду соответствующей степени чистоты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения поставляются коллекция различных бетаиноподобных детергентов и коллекция различных антибиотиков. Бетаиноподобные детергенты и/или антибиотики в коллекции могут быть такими, которые специально подобраны для конкретного микроорганизма, или же коллекция может быть составлена без учета специфики конкретного микроорганизма. Предпочтительно, поставляются не менее пяти различных бетаиноподобных детергентов, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения поставляется более широкий выбор, т.е. более 5-ти, например, 10, 15, 20, 25 или 30, или же любое число в этих пределах. Предпочтительно, поставляются не менее пяти различных антибиотиков, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения поставляется более широкий выбор, т.е. более 5ти, например, 10, 15, 20, 25 или 30, или же любое число в этих пределах. Конкретные наборы, по желанию, содержат, среди прочего, конкретную микобактерию, в частности, МусоЬаНепит, для использования в качестве стандарта. В таком наборе, если небактериальные компоненты еще не смешаны, такие компоненты находятся в непосредственной близости друг к другу, пусть даже в различных контейнерах или упаковках, и в непосредственной близости к любым микробиологическим образцам, входящим в набор.

Пилотное исследование СВ-18

Описываемое изобретение уходит корнями в наблюдения, сделанные при осуществлении изобретения ТНопДоп АО 95/27076 и И8А 5.658.749 (способ, описанный в примере 1). В примере 2 приведены результаты экспериментов с описанной процедурой обработки, показывающие, что чувствительность жидких культур подвержена сильному влиянию сочетания СВ18 с антимикробной добавкой РАИТА, усиленной цефтазидимом (сах) (табл. 6). Из табл. 6 видно, что чувствительность культур ИАЬС/ ИаОИ в жидкой и плотной среде составляла 98.4 и 75.4%. соответственно, тогда как чувствительность в жидкой и плотной среде того же набора образцов, обработанных СВ-18, составляла 64.0 и 83.1%. соответственно. Другими словами, чувствительность в жидкой культуре с СВ-18 была подавлена даже когда СВ-18 обеспечивал на 46% общее повышение чувствительности (табл. 3). Более существенным оказалось наблюдение, что разница в чувствительности в жидких культурах положительных и отрицательных образцов составляла только 4% для осадков ИАЬС/ИаОИ (т.е. 100% против 95.8%). а такое же сравнение применительно к СВ-1 8 показало разницу в 65% (т.е. 75.0% против 45.4%). Поскольку разница в чувствительности на плотных средах для положительных и отрицательных образцов, обработанных двумя различными способами, была сопоставима (34% против 39% для ИАЬС/ИаОН и СВ-18, соответственно), исходно считали, что усиление РАИТА добавлением сах полностью ответственно за утрату чувствительности в жидких культурах. Пример 3 (фиг. 3А-3Н), однако, выявил, что СВ-1 8 обладает способностью не только влиять на ростовые характеристики тестируемого изолята (571/573-ВАЬ: см. таблицу 8). но что РАИТА сам по себе или в сочетании с сах также обладал способностью влиять на ростовые характеристики данного изолята. Этот эффект, так называемый эффект СВ-18, был синергичным и ступенчатым когда СВ-18 добавлялся в сочетании с антибиотиками.

РАИТА содержит полимиксин В, амфотерицин В, налидиксиновую кислоту, триметоприм и азлоциллин. Назначение амфотерицина В состоит в предотвращении контаминации грибами, а все остальные антибиотики обладают антибактериальной активностью. Полимиксин В является полипептидом, который взаимодействует с фосфолипидами, приводя к изменениям проницаемости. Налидиксиновая кислота - это хинолон, интерферирующий с синтезом ДНК (на уровне ДНК-гиразы). Триметоприм является аналогом пиримидина, обычно применяемым в сочетании с сульфонамидами, который также влияет на синтез ДНК (на уровне дегидрофолатредуктазы). Азлоциллин - это пеннициллиновый антибиотик, относящийся к семейству βлактамных антибиотиков и проявляющий свое действие на уровне синтеза структур клеточной стенки. Показано, что налидиксиновая кислота, Триметоприм и азлоциллин обладают активностью в отношении различных видов микобактерий. Тот факт, что СВ-1 8 может влиять на рост в сочетании с РАИТА без сах (пример 3. фиг. 3Б и 3 Н), показывает, что данный феномен не определяется полностью присутствием цефтазидима, но широко применим к различным классам антибиотиков (кирга). Фиг. 28-30 иллюстрируют широту применения различных классов антибиотиков. Есть основания полагать, что данный феномен будет наблюдаться при использовании различных классов антибиотиков.

Первоначально цефтазидим был введен в систему детекции СВ-18/12В/РАИТА для предотвращения контаминации (пример 1). но не за счет жизнеспособности микобактерий. Это заключение было сделано после экспериментов по проверке действия различных цефалоспоринов на жизнеспособность микобактерий. К проверенным комбинациям ΡΑΝΤΑ-цефалоспорин, с добавлением цефтазидима, относятся цефоперазон (сГр), цефотаксим (сГ!) и цефтриаксон (сах) в различных сочетаниях (например, сГр/сй. сГр/сах и сГр/сй/сах).

Данные эксперименты были проведены с использованием СВ-18 в концентрации 7-15 мкг/мл и различных АТСС штаммов М.!иЬегси1о818 (АТСС 27294). М.аушт (АТСС 25291). М.каикакп (АТСС 12478). М.Гойийит (АТСС 6841). М.хепор1(АТСС 19250). М.догйопае (АТСС 14470). Сочетание СВ-18/12В/ РАИТА/ сах было единственным составом, оказавшим минимальное воздействие на эти изоляты в ходе предварительных исследований. Например, все сочетания РАИТА с сГр/сГ!. сГр/сах и сГр/сГ!/сах вызывали заметную задержку роста всех проверенных изолятов. РАИТА/сах вызывал задержку роста проверенного изолята М.аушт и заметную задержку роста проверенного изолята М. догйопае.

В пилотном исследовании СВ-1 8 в системе СВ-18/12В/РАИТА/сах было проверено 14 положительных изолятов из мазков (табл. 6). Анализ этих 14-ти положительных изолятов показал, что 5 из них относились к МТВ, а другие 9 к различным видам МОТТ, включая 4 МАС. 2 М.Гойийит и по одному М.с1е1опае. М.5хи1да1 и М.капкакй. Существенный вывод, следующий из этих результатов, состоит в том, что система СВ-18/12В/РАИТА/сах влияет на широкий спектр микобактерий, как МТВ, так и МОТТ.

Эффект СВ-18 наблюдался и в отсутствие цефтазидима (пример 3). т.е. другие антибиотики (т.е. оба цефалоспорина, другие компоненты РАИТА и дополнительные антибиотики) могли вызывать задержку роста различных микобактерий и очевидная чувствительность системы к концентрациям В-18 привела к постановке экс периментов, описанных в примерах 5 и 6. Опыты примера 5 были направлены на тестирование изолятов М.1иЬегси1о515, комплекса М.аушт и комплекса М.Гойийит в отношении концентрации СВ-18, а в пример 6 посвящен определению характера чувствительности изолятов МЛиЬегси1ок1к. В табл. 7 суммированы результаты опытов примера 5, в на фиг. 10-15 представлены результаты опытов с различными видами микобактерий. В табл. 8 суммированы результаты опытов примера 6, в на фиг. 17-27 представлены результаты опытов с протестированными изолятами М4иЬегси1ок1к. Из фиг. 28-30 видно, что данный феномен не ограничивается только проверенными β-лактамами. При том, что в описанных в примерах 5 и 6 опытах наблюдались существенные различия между видами и изолятами, на всех проверенных видах и изолятах в той или иной степени проявлялся синергизм действия СВ-18 и антибиотиков. Изоляты М.1иЬегси1ок1к оказались наиболее чувствительными из всех проверенных микобактериальных видов, а для быстрорастущих видов была характерна меньшая чувствительность, но наивысший синергизм при применении СВ-18 в сочетании с антибиотиками. Изоляты комплекса М. аушт проявляли промежуточный ответ. В основном, все изоляты могут быть дифференцированы на основе их ростовых характеристик в присутствии СВ-18 и различных антибиотиков. Таким образом, эффект СВ-1 8 зависит от изолята и использованного антибиотика, и наличие СВ-1 8 в соответствующей концентрации необходимо для дифференцирования изолятов.

Это наблюдение привело к выводу о том, что различные бетаины могут обеспечивать более высокую степень чувствительности в отношении дифференцируемых изолятов. В примере 7 использованы различные детергенты в сочетании с раствором для реконституции (В.Е.), ΡΑΝΤΑ или ΡΑΝΤΑ/сах. В таблице 10 суммированы результаты этих опытов и на фиг. 32В представлены результаты, полученные с несколькими различными детергентами (в присутствии только Р-сах). Таким образом, эффект СВ1 8 зависит от динамического взаимодействия изолята, детергента и антибиотика и именно в данном взаимодействии заключается возможность использования эффекта СВ-18.

Антимикробное лечение, устойчивость к лекарствам и проницаемость

Антибиотики различаются в отношении их сайта действия. Например, Уао, Ю.С. е1 а1., 1п: Миггау, Р.В. е1 а1., е<к. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЬ1о1оду, А8М Ргекк, №акЫп§1оп, И.С. (1995) рр. 1281 -1307) рассматривает различные классы антибактериальных агентов и отмечает, что спектр сайтов действия сильно варьирует от воздействия или интерференции с различными аспектами синтеза и целостности клеточной стенки и клеточной мембраны, до синтеза белка, синтеза нуклеиновых кислот (т.е. предшествен ников РНК и ДНК), репликации ДНК, а некоторые препараты просто облегчают мутагенез.

Бактерии нечувствительны (т.е. устойчивы) к различным антибиотикам по ряду причин. РшпйНаш, В. е1 а1., 1п: Миггау, Р.В. е1 а1., е<к. Мапиа1 оГ С11шса1 М1стоЫо1о§у, А8М Ргекк, №акЫп§1оп, И.С. (1995) рр. 1308-1326) (работа упоминается в качестве ссылки) рассматривает некоторые из этих механизмов. В целом антибиотик должен сначала проникнуть в клетку и затем оказать эффект в сайте действия. Основой устойчивости могут служить: (а) проницаемость организма, (б) молекулярная конфигурация сайта действия антибиотика может быть неподходящей или данный сайт может вообще не существовать в конкретном клиническом изоляте, или (в) бактерии могут модифицировать, разрушать или удалять антибиотик из внутриклеточного пространства. В первом случае, если бактерия непроницаема для препарата, антибиотик не может достичь сайта действия и оказать эффект. Во втором случае, если препарат может проникнуть в бактерию, но сайт действия (т.е. трехмерная структура сайта-мишени) таков, что антибиотик не может связаться, или сайт действия вовсе не существует (т. е. адресные структура или фермент не являются частью экспрессируемых компонентов), и поэтому данный препарат не оказывает влияния на бактерию. В последнем случае антибиотик может проникнуть в клетку, и мишень его действия существует, но бактерия может эффективно избежать действия препарата, деградируя антибиотик, модифицируя его со снижением токсичности, или удаляя антибиотик из внутриклеточной среды.

Лечение микобактериальных инфекций сильно ограничено (кирга), сильнее, чем в случае других микроорганизмов (1п<ет11еБ, С.В. е1 а1., 1п: Миггау, Р.В. е1 а1., е<к. Мапиа1 оГ СНшса1 М1сгоЬ1о1оду, А8М Ргекк, №акЫп§1оп, И.С. (1995) рр. 1385-1404). Нечувствительность этих микроорганизмов отчасти объясняется непроницаемой природой этого класса бактерий: микобактерии в 1,000 - 10,000 раз менее проницаемы, чем ЕксйепсЫа сой (ЛагИег. V., е1 а1., Лоит.Вас!. 172: 1418-1423 (1990) и ЫйсаШо, Н., е1 а1., Век.М1стоЬю1. 142:437-443 (1991)). Соппе11, Ν.Ό., е1 а1., 1п: ТиЬегси1ок1к. РаШодепекЕ, Рго1есйоп ап< Сойто1. В1оот, В.В. е<. А8М Ргекк, №акЫп§1оп, И.С. (1994) рр. 333-352 рассматривает характеристики проницаемости микобактерий и констатирует, что низкая проницаемость клеточной стенки М.сйе1опае полностью объясняет уровень устойчивости данного организма к цефалоспорину.

Низкая проницаемость частично ответственна за сложный характер чувствительности, характерный для микобактерий. Например, при том, что инфекции МТВ можно эффективно лечить ΙΝΗ и/или Р2А, изоляты МАС обычно устойчивы к этим препаратам. Кроме того, изо ляты М.[ог1ш1ит и М.сНе^пае обычно устойчивы ко всем антитуберкулезным лекарствам переднего края (1пбег11еб, С.В. еί а1., Ιη: Миггау, Р.Я. еί а1., ебх. Мапиа1 οΓ Сбшса1 МкгоЬюЦду, А8М Ргехх, \ν;·ΐ51ιίη§1οη. Э.С. (1995) рр.13851404). Суηатοη, М.Н. еί а1., Ιη: Эгид 8ихсербЬ1111у ίη 1Не Οκιηοΐίκηιρ'τ οΓ МусοЬасίе^^а1 1пГссίίοηχ, Не1£ей, Ь.В. еб. СЯС Ргехх, Βοκίοη, МА (1991), рр. 147-159 обсуждает лечение инфекций, вызываемых быстрорастущими микроорганизмами, в свете их различной чувствительности. Например, для каждой категории рассмотренных антибиотиков (β-лактамы, сульфонамиды, макролиды, аминогликозиды и т. д.) описан разброс чувствительности от нескольких процентов до 100%, а интервал от 30 до 60% считается нормой (в зависимости от препарата и его концентрации). НебеК Ь.В. Ιη: Эгид 8ихсербЬ1111у ίη Не Οκιηο11κηρ\· οΓ МусοЬасίе^^а1 1п£ссίίοηχ, Небей, Ь.В. еб. СяС Ргехх, Βοκίοη, МА (1991), рр. 13-57 суммирует аналогичные исследования, выполненные на МТВ и МАС, обсуждает разнообразие в чувствительности и отмечает, что характер чувствительности, весьма разнообразный, не слишком вариабелен.

При том, что проницаемость вносит существенный вклад в характер чувствительности микобактерий, эти микроорганизмы имеют два дополнительных механизма, играющих важную роль в их устойчивости. Во-первых, инфекции МТВ обусловлены несколькими субпопуляциями клеток. Эти субпопуляции могут быть классифицированы как (а) активно растущие, (б) полуспящие в силу низкого рН макрофага, (в) полуспящие со спорадическими взрывами метаболизма и (г) спящие (Небе^, Ь.В. Ιη: Эгид 8и8сер(1Ь1111у ίη Не СЬетοίЬегару οΓ МутоЬас1епа1 Ιη^ύοηχ, НебеКЬ.В. еб. СЯС Ргехх, Βο8ίοη, МА (1991), рр. 13-57). Спящее состояние дает возможность этим субпопуляциям выживать во время лечения. Другим механизмом, по-видимому, является генетическая нестабильность. Образование точечных мутаций обуславливает молекулярную вариабельность в потенциальной мишени терапевтического агента. В целом, вариабельность в характере чувствительности представляет собой сочетание этих механизмов и то, какой механизм является доминирующим, зависит от вида и даже изолята микроорганизма.

В целом к механизмам устойчивости, наиболее значимым для микобактерий, относятся проницаемость, регуляция пролиферации (т.е. спящее состояние) и структурная вариабельность сайта (сайтов) мишени. В подходах, направленных на преодоление устойчивости, должны использоваться модификация проницаемости, понимание механизмов пролиферации и воздействие на них, или модификация химической структуры антибиотика с тем, чтобы он более полно совпадал с сайтом мишени.

В свете подобных перспектив должны быть рассмотрены пять соображений, представленных в примерах. Во-первых, механизм действия СВ-1 8 отличается от такового для четвертичных солей аммония. Эта группа детергентов обладает общим поверхностно-активным эффектом, приводящим к разрыву клеточной мембраны и денатурации клеточных белков (Ниде, V. В. Ιη: 8. С. I. МοηοдгарЬ ηο.19: 8игГасе-Ас1Ье АдегИх ίη МкгоЬюЦду. Γοη6οη 8ο^ СНет. Ιηбихбу, Γοη6οη (1964) рр.69-82). На фиг. 7А-7С и 8А-8С проведено сравнение действия ТМА-18 и СВ-18, которое подтверждает, что эффект СВ18 отличен от действия четвертичных детергентов. Однако в высоких концентрациях бетаины напоминают четвертичные детергенты и вызывают общий отрицательный эффект.

Во-вторых, не наблюдается постантибиотиковый эффект (РАЕ). Например, 90-минутная обработка СВ-18 в концентрации 383 мкг/мл не оказывала явного воздействия на ростовые характеристики (фиг. 3С и 36). Если эффект СВ18 специфичен, т. е. не вызывает общего отрицательного эффекта, а наоборот, требуются его минимальные концентрации на фоне активного метаболизма, тогда РАЕ должен быть минимальным. Изониазид является противотуберкулезным агентом, не обладющим РАЕ (НебеК Ь.В. Ιη: Эгид 8и8сер(1ЬПИу ίη Не СЬетοίЬегару οΓ МусοЬасίе^^а1 Ιη&6ίοηχ, НебеКЬ.В. еб. СЯС Ргезз, Βο8ίοη, МА (1991), рр. 13-57).

Третье соображение обусловлено тем фактом, что применительно к некоторым изолятам эффект СВ-18 наблюдается в присутствии только жидкости для реконституции (Я.Е.) (т.е. в отсутствие антибиотиков) (фиг. 10-15). Тот факт, что данный эффект зависит от изолята (фиг. 17-27), дает основания предполагать существование специфического сайта действия для СВ-18. Другими словами, эффект СВ-18 является отражением микрогетерогенности в характере чувствительности среди микобактерий, в частности среди микобактерий комплекса.

В-четвертых, эффект СВ-1 8 отличается от действия ЭДТА (фиг. 34-35). ЭДТА изменяет проницаемость, экстрагируя и хелатируя двухвалентные катионы металлов, которые стабилизируют структуры клеточной стенки. ЯахЮдг Ν. еί а1., ΛηΙίιιιΚίΌό. АдегИх СНеито. 34:759-764 (1990) сообщают, что выращивание в присутствии 1 мМ ЭДТА (372,5 мкг/мл) имело столь разрушительный эффект, что полученные результаты не могли быть использованы в анализе Χ/Υ коэффициента, примененного этими авторами.

ЭДТА и СВ-18 использовали в описанных в примере 7 опытах в концентрации 17 мкг/мл (приблизительно эквимолярные количества) и было показано, что они ведут себя по-разному в заявленных тестах. Кроме того, Τχιιόοικ. К., ^οи^.РЬа^т.8с^. 50:1051-1054 (1991) показывает, что практически не существует корреляции (или она очень невелика) между хелатирующей активностью различных фосфобетаинов и антимикробной активностью. Кроме того, в табл. 10 рассмотрены различные протестированные бетаины. Те карбоксибетаины, которые содержали амидопропильную связь, оказались неэффективны по сравнению с карбоксибетаинами с тем же самым мостиком, но без амидопропильной связи (сравнены Хетаин (Не1ате СЬА) или Шеркотаин (8сбегсо1аше \УОАВ) с ДеТаином (ЭеТате РВ) и Велветексом (Уе1уе1ех ОЬВ)). Амидопропильная связь не должна препятствовать хелатированию между центрами заряда, но должна интерферировать с эффектом СВ-18 в сайте действия, физиологическом по своей природе (т.е. ферменте).

В-пятых, в примере 7 (фиг. 32В) в данном тесте был проверен Твин 80: он не оказал эффекта на изолят 571/573-ВАЬ в концентрации 17 мкг/мл (13 мкМ). Это довольно примечательный результат, поскольку несколько авторов сообщали о том, что введение Твина 80 в культуральную среду также вызывает индукцию чувствительности (Нш, 1., е! а1., АпбшкгоЬ. Адепб Сбето. 11:773-779 (1977); Υато^^, 8. е! а1., М1сгоЫо1. 1ттипо1. 35:921 -926 (1991)). Представленные нами результаты дают основания полагать, что механизм, при помощи которого Твин 80 проявляет свой эффект, отличен от такового для СВ-18. Например, при высоких концентрациях Твина 80 (т.е. 1% (10 мг/мл) рост действительно оптимален и даже концентрация, равная 10%, не оказывала подавляющего воздействия (8бп§оп, М.\У. е! а1., Ат.Кеу.Ке8р.П18. 104:717727 (1971)). Напротив, СВ-18 в концентрации 37 мкг/мл не оказывал воздействия на рост, но в концентрации 54 мкг/мл полностью подавлял рост изолятов АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ (фиг. 1 0А и 11А). Эффект СВ-1 8 наблюдался в узком интервале концентраций (приблизительно между 13 мкг/мл и 27 мкг/мл, в зависимости от изолята).

Наконец, лецитин отменял эффект СВ-18. Этот факт противоречит результатам Ваггу, С.Е. е! а1., (υ.8. 5,610,198). Ваггу, С.Е. е! а1., (υ.8. 5, 610, 198) приводят лецитин в качестве адъюванта при осуществлении своего изобретения. Согласно описываемому здесь изобретению, данный фосфолипид должен действовать или нейтрализуя СВ-1 8 (аналогично его электростатическому взаимодействию с четвертичными солями), или как конкурентный ингибитор (интерферируя с СВ-18 в сайте действия). Поскольку СВ-1 8 имеет суммарный нейтральный заряд, последняя гипотеза выглядит более правдоподобной (т.е. стабильное электростатическое взаимодействие должно быть минимальным). Если такие липиды, как лецитин, действуют как конкурентные ингибиторы, то этим можно объяснить отсутствие РАЕ.

Если СВ-1 8 задерживается в липидных тельцах, как предполагает Тбогйоп \УО 95/27076, тогда бетаиноподобные детергенты не могут действовать как поверхностно-активные агенты. Если микобактерии гетерогенны в отношении сайта реализации эффекта СВ-18, то различные клинические изоляты должны вести себя по-разному в присутствии различных бетаиноподобных детергентов (пример 7). Кроме того, если изменение проницаемости облегчает доступ терапевтического агента к сайтумишени, а популяция клинического изолята гетерогенна в отношении сайта-мишени антибиотика, то можно ожидать вариаций также и на этом уровне (как видно из примеров 5 и 6). Можно ожидать, что сочетания бетаиноподобных детергентов и различных антибиотиков будут проявлять значительную вариабельность в отношении поведения. Таким образом, тест на бетаиновую чувствительность может давать информацию о двух различных сайтах действия.

Изобретение может быть направлено на один или несколько механизмов устойчивости (т.е., проницаемость, спящее состояние или молекулярная совместимость). Без стремления ограничиться изложенной гипотезой нижеследующие объяснения приводятся для иллюстрации применимости изобретения. Задержка роста может быть проявлением стимуляции механизма, ответственного за спящее состояние. Например, поскольку большинство антибиотиков имеет естественный срок полужизни, если эффект СВ-1 8 вызывает снижение метаболизма микобактерий на тот период, пока токсические уровни антибиотика не понизятся, то эффект СВ-18 может быть использован для определения природы клинического изолята в отношении его пролиферационных характеристик. Эта информация полезна клиницисту при выборе препарата и определении продолжительности лечения.

Другой механизм устойчивости обусловлен проницаемостью микобактерий. Без стремления ограничиться изложенной гипотезой нижеследующие объяснения приводятся для иллюстрации применимости изобретения. Бетаиноподобные детергенты могут изменять проницаемость микобактерий путем модификации конформаций миколевой кислоты. Конечным результатом будет индуцированная чувствительность к антибиотикам. Эта информация полезна клиницисту при выборе препарата для наиболее эффективной терапии.

Концепция о том, что эффект СВ-1 8 может являться результатом изменений модификации миколевой кислоты, частично основана на работе Υιη-ιι-γΥ. е! а1., Ргос.№-111.Асаб.8с1. 93:1282812833 (1996) и подробно проверена в Примере 9. Вообще, модификации миколевой кислоты могут быть прямо связаны с текучестью клеточной стенки. Определенные модификации снижают текучесть клеточной стенки, что коррелирует со снижением проницаемости. Считается, что низкая проницаемость микобактерий играет существенную роль в устойчивости против антимикробных препаратов (Уиап.У. е! а1., Ргос.Ма11.Лсаб.8с1.92:6630-6634 (1995); Вгеппап, Р.1. е! а1., Аппи.Веу.ВюсЬет. 64:29-63 (1995)). Напомним, что Соппе11, N. Ό. е! а1., 1п: ТиЬегси1о515. РаШодепезК, Рго!есбоп апб Соп!го1. В1оот, В.В. еб. Л8М Ргезз, АазЫпдФп, Л.С. (1994) рр.333-352 приписывают устойчивость М.сЬе1опае к цефалоспоринам исключительно проницаемости.

Модификации миколевых кислот происходят через серию 8-аденозил метионин (8АМ)зависимых ферментных реакций (фиг. 39А). Ваггу, С.Е. е! а1., (И.8. 5,610,198) отмечают, что тиолированные жирнокислотные производные (тиатетракозаноевые кислоты) могут быть использованы для ингибирования этих 8ЛМзависимых модификаций миколевых кислот (фиг. 39В), т.е. для лечения заболеваний, вызываемых патогенными микобактериями. Структура переходного состояния тиатетракозаноевых кислот напоминает бетаиноподобный детергент (Уиап,¥. е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. 93:12828-12833 (1996)), в особенности основанный на сульфониуме карбоксибетаин (табл. 1 и фиг. 39В). Для активации сульфониумкарбоксибетаинов не требуется энзиматического катализа и они будут ингибировать эти 8АМзависимые ферменты.

В отличие от бетаиноподобных детергентов, тиатетракозаноевые кислоты крайне нерастворимы. Другими словами, Крафтовы температуры тиатетракозаноевых кислот будут выше физиологически нормальной (т.е. 37°С). Сульфониумкарбоксибетаины будут значительно более растворимы (даже при В₁=18-20, но особенно при В₄>3 (табл. 1; ЬаидЫт, В., Ьапдтшг 7: 842-847 (1991)). Бетаиноподобные структуры должны облегчить проблему растворимости и, в некоторой степени, проблему введения. Например, тиатетракозаноевые кислоты скорее всего останутся в твердой фазе при внутривенном введении. Поскольку бетаины более растворимы, внутривенное введение небольшой дозы будет более простым в силу более низкой Крафтовой температуры бетаинов.

Ваггу, С.Е. е! а1., (И.8. 5,610,198) указывают, что тиатетракозаноевые кислоты будут специфичны в отношении медленно растущих патогенных микобактерий. Ваггу, С.Е. е! а1., (И.8. 5,610,198) также отмечают, что только те антибиотики, которые нарушают синтез миколевой кислоты, будут действовать синергично с этими тиолированными жирнокислотными производными. В настоящем описании констатируется, что бетаиноподобные детергенты применимы в отношении широкого спектра бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты (т.е. коринебактерий, №сагб1а, а также и микобактерий (пример 9)), и что широкий круг антибиотиков может быть использован в соответствии со спо собами, заявленными в настоящем изобретении (примеры 5 и 6).

Синтез сульфониумкарбоксибетаина может быть осуществлен согласно схеме, приведенной на фиг. 39С, однако, любой метод, приводящий к тому же конечному результату с применением известных из уровня техники способов, также приемлем (МагсЬ, Абуапсеб Огдашс СНетШгу. Веасбопз, МесЬашзтз апб 81гис!иге5, ЕоийЬ Еб., 1оЬп Абеу & 8опз, №\ν Уогк, ΝΥ (1992) и Иезег, е! а1., Веадеп!з £ог Огдатс ЗупШезК уо1. 1-16, 1оНп Абеу & 8опз, №\ν Υо^к, ΝΥ (1992) обе работы упоминаются в качестве ссылок).

Без стремления ограничиваться приведенными далее объяснениями, можно подытожить, что эффект СВ-18, по-видимому, является следствием взаимодействия между бетаиноподобным детергентом и конкретным сайтом действия. Если это взаимодействие модифицирует проницаемость бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты, то конечным результатом будет повышение эффективной концентрации антибиотика в сайте действия. Например, что касается изолятов, использованных в пилотном исследовании СВ-1 8 (табл. 7 и 8). Если эти микобактерии проявляют гетерогенность как в отношении сайта-мишени (т. е. синтез пептидогликана), так и в отношении сайта β-лактамазы, то можно ожидать еще большей степени дискриминации в тесте на бетаиновую чувствительность. Например, возможен сценарий, когда конкретный изолят должен быть чувствителен к данному β-лактаму, но из-за низкой проницаемости данный изолят может избежать действия антибиотика. Если бетаиноподобные детергенты способны повышать проницаемость данного изолята, то β-лактамаза может обладать или не обладать способностью разрушать антибиотик до того, как он проявит свое действие. Если βлактамаза тестируемого изолята дефицитна в отношении способности разрушать конкретную β-лактамную структуру, изменения проницаемости может оказаться достаточно для проявления заметного отрицательного эффекта, наблюдаемого как эффект СВ-18. Есть основания считать, что различные бактерии, содержащие структуры миколевой кислоты, обладают существенными различиями в отношении места действия трех различных молекул, обсуждаемых в настоящем примере (β-лактам, бетаиноподобный детергент и β-лактамаза). Поэтому, чем больше число имеющихся антибиотиков (особенно, β-лактамов), используемых в сочетании с большим количеством имеющихся бетаиноподобных детергентов, тем выше будет степень дискриминации.

Тест на чувствительность, заявленный в настоящем изобретении, открывает возможность использования β -лактамов в качестве терапевтических адъювантов при антитуберкулез ной терапии, что чрезвычайно важно, поскольку количество наиболее используемых и хорошо охарактеризованных антибиотиков гораздо шире, чем только класс β-лактамов. В силу широкого спектра действия этих антибиотиков лечение микобактериальных инфекций этими агентами должно иметь существенные преимущества. Применение β-лактамов в терапевтических схемах, направленных на лечение микобактериальных инфекций, до настоящего времени имело ограниченный успех. Например, СйатЬега, Н.Р. е! а1., Лийткго.Лдейъ С1ето. 39:26202624 (1995) проверили пять клинических изолятов МТВ и несколько различных классов βлактамов. Большинство изолятов оказались устойчивы к пеннициллинам и большинству цефалоспоринов; однако, имипенем (карбопенем) проявил некоторую активность. Для достижения значительной чувствительности необходимо сочетание почти всех β-лактамов с ингибитором β-лактамазы.

Как обсуждалось выше, ингибиторы βлактамазы влияют на механизм устойчивости, при помощи которого организм разрушает антибиотик. Это является примером терапии антибиотиками, направленной на механизм устойчивости и потому усиливающий любую химиотерапию с применением β-лактамов. Возможность расширить чувствительность микобактерий к антибиотикам, в частности, антибиотикам β-лактамного ряда, имеющая целью механизмы усточивости, чрезвычайно важна для эффективного лечения микобактериальных инфекций. В описываемом изобретении используются молекулы, которые влияют на механизм устойчивости бактерий таким образом, который ранее описан не был. Анализ изолятов 512-1НН (фиг. 24) и 53 8-ШН (фиг. 25), а также понимание того факта, что СВ-18 обладает существенным воздействием на изолят, подвергнутый антитуберкулиновой терапии ίη νίνο (табл. 9), подчеркивает терапевтическую применимость бетаиноподобных детергентов.

При том, что изобретение полностью описано, квалифицированному специалисту будет понятно, что изобретение может быть осуществлено в широких и эквивалентных пределах условий, параметров и т.п., без нарушения идеи или объема изобретения или любого из вариантов его осуществления. Все процитированные работы приведены в качестве ссылок.

Примеры

Пример 1.

Описываемое изобретение в значительной мере явилось результатом наблюдений, проведенных в ходе разработки новых способов обработки клинических образцов с целью обнаружения микобактерий. Данные процедуры основаны на методах ΤΗοπιΙοη. описанных в νθ 95/27076 и направленных на первичную методологию выделения бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты, в частности микобактерий, из клинических образцов, в частности, из респираторных образцов. Способ Т1югп!οη (νθ 95/27076) описан ниже, а приготовление реактивов для данной процедуры описано в конце данного примера.

(1) Поместите 1-10 мл мокроты или бронхиального смыва в 50 мл коническую пробирку.

Примечание: при том, что респираторные образцы являются преобладающим типом образцов, которые будут использоваться при проведении описываемой процедуры, пробы другого типа, такие как вода, почва, ткани, фекалии и другие, также могут быть использованы. Некоторые из этих проб должны быть предварительно осветлены путем суспендирования в воде или буфере и пропусканием смеси через колонку δρίη-Χ II, заполненную стеклянной смесью 2060 мкм (Соттд СоДаг, Βοκΐοη, МА). Такая колонка может также содержать матрикс, такой как 8ерйабех® (8ерйабех 0-50®: Рйагташа, Ρίδса1атау, N1), или другую эквивалентную смолу для усиления очистки. Любой образец может быть обработан описанным ниже способом.

(2) Добавьте к образцу равный объем ожижающего раствора 0,5% ΝΑΡί.’ (см. ниже: 0.5% ΝΑ^^ мМ цитрата натрия) и перемешайте.

(3) Инкубируйте при комнатной температуре 10 мин (перемешать через 5 мин и перед следующим этапом).

(4) Откройте пробирку и добавьте к образцу стерильную, фильтрованную воду до конечного объема около 35 мл (Примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., О1ВСО/ВВЬ, СайЬекЬшд, ΜΌ, Са!. #15230022)).

(5) Добавьте 4 мл концентрированного раствора, содержащего бетаиноподобный детергент, буфер 10Χ СВ-18, например (см, ниже): 10Χ СВ-18=10 мМ СВ-18, 0.5М ТП8-НС1, рН 8.0, 50 мМ ΝΑ^ и 1 мМ №С1.

(6) Хорошо перемешайте образец.

(7) Инкубируйте при 37°С 90 мин при встряхивании (140 об/мин).

(8) Перемешайте образец и центрифугируйте при 4,000 х д 20 мин при 30°С.

(9) Декантируйте супернатант и добавьте к образцу 500 мкл стерильной воды или буфера.

(10) Полностью ресуспендируйте осадок и подготовьте образец для обнаружения бактерий такими методами, как быстрое кислотное окрашивание (т.е., микроскопия), культивирование, амплификация нуклеиновых кислот или иммунодиагностика.

В предварительных экспериментах, направленных на определение природы контаминантов, вырастающих на жидкой среде ВАСТЕС 12В с добавлением ΡΑΝΤΑ, были использованы респираторные образцы (п=277) от Опей ΟίηηοδΙχδ - ВаШтоге. (Примечание: жидкая культуральная система ВАСТЕС 1 2В является одним из стандартных методов культивирования микобактерий, а РАЫТА представляет собой антимикробную добавку, содержащую полимиксин В, азлоциллин, налидиксиновую кислоту, триметоприм и амфотерицин В: эта культуральная система была обозначена как 12В/РАЫТА(Веск1оп скитков, СоскеуетШе, МО.)). Образца забирали и обрабатывали СВ-18 в соответствии с описанной выше процедурой. Приблизительно 400-500 мкл каждого осадка засевали на 12В/РАЫТА. Всех контаминантов идентифицировали морфологически и окраской по Граму, а затем дифференцировали как положительные или отрицательные по оксидазе/каталазе. Затем определяли вид контаминантов и их чувствительность к антибиотикам с использованием панелей М1сго8сап® (Пабе, \Уек1 8асгатейо, СА). Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Идентификация контаминантов в системе ВАСТЕС 12В/РАЫТА (п=277)

Группа	#	%
Г рамотрицательные	48	84,2%
Г рамположительные	5	8,8%
Дрожжи	3	5,3%
Грибы	1	1,8%
Всего:	57

От 40 больных: контаминация = 14.4%

Из табл. 2 видно, что из 40 образцов было выделено 57 контаминантов. Частота контаминации в расчете на образец составляла 14,4% (40-277). Эти данные дают основание считать, что главной проблемой при обработке респираторных образцов в соответствии с \¥О 95/27076 (т.е. СВ-18), является присутствие грамотрицательных организмов (>84%). Приблизительно 31 (64%) из 48 грамотрицательных изолятов были Еп1егоЬас1епасеае. Наиболее частыми изолятами были Ргоу|бепс1а йиайи (п=13), виды Ркеиботопак (п=11) и Рго1еик т1гаЬШк (п=7). Поэтому значительное снижение частоты контаминации требует существенного подавления грамотрицательных организмов. Данные по чувствительности показывают, что 40 из 48 грамотрицательных бактерий были чувствительны к цефтазидиму (в конечной концентрации 8 мкг/мл) при подавлении контаминации грамотрицательными организмами (система 12В/РАЫТА с добавлением цефтазидима (сах) обозначена как 12В/РАЫТА/сах). На основе параллельных опытов с использованием нескольких АТСС микобактериальных штаммов было показано, что цефтазидим должен снижать частоту грамотрицательной контаминации без значительного влияния на жизнеспособность микобактерий.

Приготовление 10Х СВ-18 буфера (1) 20Х буферные соли: 1М Трис-НС1 рН 8.0,2мМ ЫаС1

Трис-основание (121,14 г/моль) 54,27 г

Трис-НС1 (157.64 г/моль) 87,02 г

ЫаС1 0,117г

Добавьте воду до 1 л (ί) Налейте приблизительно 250 мл воды в 1 -литровый мерный цилиндр.

(ίί) Добавьте трис-основание (81дта, 8кЬошк, Мо, Сак#: Т 1503), Трис-НС1 (81дта, 8ΐ. Ьошк, Мо, Сак#: Т3253) и ЫаС1 (81дта, 8к Ьошк, Мо, Сак#: 8 7653) и перемешайте (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВкЬ, СаййегкЬигд, МО, Сак#15230-022)).

(ш) Доведите объем до 1 литра и убедитесь в полном растворении солей.

(ίν) Проверьте рН в аликвоте. Значение рН должно быть 8,0±0,2.

(ν) Простерилизуйте фильтрованием (фильтр 0,22 мк), разделите на 50 мл аликвоты и храните при комнатной температуре.

(2) 100Х стоковый раствор СВ-18: 100мМ СВ-18 *СВ-18 (383 г/моль) 1.915 г

Изопропанол:вода (1:) до 50 мл *СВ-18: Х,Х-диметил-Ы-(п-октадецил)-Ы(3-карбоксипропил)аммониум, внутренняя соль (СА8® Ыо.78195-27-4).

(ί) Смешайте 25 мл изопропанола аналитической чистоты (Вах1ег, МсСате Рагк, 1Ь, Сак#:3043-1 ΝΥ) с 25 мл воды в градуированном цилиндре и получите 50 мл смеси 1:1 изопропанол: вода (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВКЬ, СаййегкЬигд, МП, Сак#15230022)).

(ίί) Перенесите 25 мл смеси изопропанол:вода (1:1) в коническую пробирку на 50мл.

(ΐϊϊ) Взвесьте 1,915 г СВ-18 и перенесите в градуированный цилиндр с оставшимися 25 мл смеси изопропанол:вода (1:1). Перемешайте вращением.

(ίν) Добавьте еще смеси изопропанол:вода (1:1), приблизительно до 40 мл и осторожно перемешайте вращением. Дайте раствору постоять около 20 мин, осторожно помешивая каждый 5 мин.

(ν) Когда СВ-18 растворится (приблизительно через 30 мин) доведите конечный объем до 50 мл смесью изопропанол:вода (1:1) и перемешайте перевертыванием цилиндра.

(νί) Разлейте раствор в две стерильные пластиковые конические пробирки на 50 мл и храните при комнатной температуре.

(3) Буфер 10Х СВ-18 (ί) Определите количество образцов, которые будут тестироваться и введите это число в таблицу, приведенную ниже (прибавьте к этому числу один, чтобы иметь достаточный объем буфера), вычислите окончательное количество каждого компонента, необходимого для приго товления соответствующего количества 10Х СВ-18 как описано ниже.

Компонент	Фактор умножения	Оконча- тельное количество
20Х буферные соли	2мл	х	Количество =
100ХСВ-18	400 мкл	х	образцов =
АА1.С (163.2 г/моль)	0,033 г	х	плюс =
Добавьте воду до:	4мл	х	один =

(ίί) Непосредственно перед использованием смешайте 20Х буферные соли, ХАБС (Р1ика, ^п^пкста, ΝΥ, Са!.#:01039), 100Х СВ-18 и доведите объем стерильной фильтрованной водой (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВКЬ, СаййегкЬигд, МО, Са!.#15230-022)).

Примечание: Если в буфере в любой момент проведения процедуры образовался осадок, не используйте этот буфер. Раствор при хранении и использовании должен быть теплым (т.е. выше 20°С). Не храните этот раствор в холодильнике.

Приготовление ожижающего раствора 0,5% NА^С (1) 10Х стоковый раствор Να-цитрата: 0,25 мМ натрий цитрат дигидрат.

Тринатрий цитрат дигидрат (294,1 г/моль) 7,35 г

Добавьте воду до: 100 мл (ί) Налейте около 25 мл воды в 100 мл градуированный цилиндр (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВКЬ, СаййегкЬигд, МО, Са!.15230-022)).

(ίί) Добавьте тринатрий цитрат дигидрат (81дта, 8!. Εοω^ МО, Са!.#% С-3434) и перемешайте вращением. Добавьте оставшуюся воду до 10 мл и перемешайте переворачиванием.

(ш) Стерилизуйте фильтрованием (фильтр 0,22 мк), разделите на 50 мл аликвоты в конических пробирках и храните при комнатной температуре.

(2) Ожижающий раствор 0,5% NА^С (ежедневно готовится заново).

(ί) Определите примерный объем требуемого ожижающего раствора ΝΛΕΟ (ίί) Смешайте 10Х стоковый раствор Νιцитрата и НАБС (Р1ика, ^п^пкста, ΝΥ, Са!.#:01039) в 50 мл конической пробирке или градуированном цилиндре и доведите конечный объем водой (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВКЬ, СаййегкЬигд, МО, Са!.#15230022)).

(ш) Используйте немедленно, а неиспользованный раствор выбросьте.

Приблизительное количество образцов

3-10 7-25 12-37 15-50

10Х стоковый раствор

Να-цитрата \А1.С (163.2 г/моль) Добавьте воду до:

2,5мл	5 мл	7,5мл	10 мл
0,12 г	0,25 г	0,38 г	0,5 г
25 мл	50мл	75 мл	100мл

Приготовление стокового раствора цефтазидима и РВ/РАЖА/сах (1) Стоковый раствор цефтазидима (36 мг/мл).

Цефтазидим 72мг

1М Να-бикарбонат 85,6 мкл

Добавьте воду до 2мл (ί) В мерной колбе на 2 мл смешайте 1 мл воды и 1М Να-бикарбонат (81дта, 8!. Εοω^ МО, Са!.#: 8 6297) (растворите 8.40 г Να-бикарбоната в 100 мл воды, простерилизуйте фильтрованием и храните в замороженном виде в 10 мл- и 1 мл аликвотах) (примечание: используйте стерильную фильтрованную воду (напр., С1ВСО/ВРЕ СаййегкЬигд, МО, Са!.#15230-022)).

(ίί) Добавьте цефтазидим (81дта, 8!. Εοω^ МО, Са!.#: С 3809) и немедленно доведите объем водой до 2 мл.

(ш) Осторожно перемешивайте переворачиванием до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Не нагревайте раствор выше комнатной температуры (т.е. не грейте раствор в руках).

(ίν) Немедленно разделите на 50 мкл порции в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и до использования храните при -70°С.

(2) Усиление и применение ΡΑΝΤΑΑαζ.

(ί) Достаньте из холодильника лиофилизированный РАИТА и жидкость для реконституции (КБ.), а из морозильника - одну 50 мкл аликвоту стокового раствора цефтазидима (36 мг/мл).

(ίί) Когда цефтазидим оттает, с помощью 5 мл шприца добавьте 1 мл К.Р. к стоку цефтазидима. Перемешайте набором в шприц один раз. Шприцом перенесите весь раствор во флакон с РАЭТА.

(ш) Добавьте еще 4 мл К.Р. во флакон с РАЭТА (конечный объем = 5 мл). Обозначьте РАNТА/саζ.

(ίν) Добавьте 100 мкл РАИТА/сах в каждый флакон 12В до использования (добавление антибиотика должно происходить в пределах 2 часового интервала от добавления образца).

(ν) Храните неиспользованный раствор при -20°С не более 48 ч (т.е. не замораживайте и оттаивайте более 1 раза).

Пример 2. Пилотное исследование СВ-18.

СВ-18 был использован при обработке респираторных образцов для обнаружения микобактерий (кислые быстрорастущие бациллы, ас1Д Рак! Ьас1Ш: АРВ) с тем, чтобы оценить способы ΤΙιοπιΙοπ XV О 95/27076. Респираторные образцы (п=573) собирали в ТВ-лаборатории Квест Диагностикс-Балтимор (ВАЬ), Квест Диагностикс-Тетерборо (ТВК), Вашингтон, Д.С.

Лабораторном Бюро (ВОЬ), Госпитале Джона Хопкинса(ГНН) и в Университете Мэриленда в Балтиморе (ИМВ). В лабораториях, где проводился забор, каждый образец делили на две порции и одну порцию обрабатывали на месте стандартным ИАЬС/ИаОН способом (Кеп!. Р.Т. е! а1.. РиЬНс Неа1!1 МусоЬас!епо1оду. ш А. Сшйе Гог Не Ьеуе1 III ЬаЬога!огу. и.8. ЬераПтеп! оГ Неа1!1 апй Нитап 8егу1се. Сеп!егк Гог Ь|кеаке Соп1го1. (1985) рр.31-46) и засевали в жидкую среду (ВАСТЕС 12В или ВВЬ М61Т) и на плотную среду (7Н11, Ь-1 или СептиЧек (8ерйСЬеск)), а другую порцию каждого образца посылали в лабораторию Квест ДиагностиксБалтимор, где образцы ежедневно обрабатывали СВ-18, как это описано в примере 1. Обработанные СВ-18 осадки засевали в 12В/РАИТА/сах и на 7Н11 -селективные косяки как описано выше. Все анализы мазков проводили в соответствии с рекомендованными процедурами (Кеп!. Р.Т. е! а1. РиЬНс НеаИЬ МусоЬас!епо1оду. ш А Сшйе Гог Не Ьеуе1 III ЬаЬога!огу. и.8. ЬераПтеп! оГ Неа1!1 апй Нитап 8егу1се. Сеп!егк Гог О1кеаке Соп!го1. (1985) рр.57-69). Результаты данного исследования обозначены как Пилотное исследование СВ-18.

Из 573 обработанных образцов было 106 ΑΓΒ-положительных по всем методам (т.е. с использованием ИаОН или СВ-18, в жидких или плотных культурах). Было 8 изолятов М.догйопае. Они оказались несовпадающими, отрицательными по мазкам и распределились поровну между двумя методами (т.е. 4 изолята, распознанных методом ИаОН. не были узнаны при обработке СВ-18, и наоборот). Поскольку изоляты М.догйопае считаются контаминантами ограниченного клинического значения (Ааупе. Ь.С. е! а1.. С1т. МюгоЬюГВеу. 5:1-25 (1992)). они были опущены при дальнейшем анализе: т.е. было проанализировано 98 АГВположительных образцов. В табл. 3 суммированы результаты, полученные в культурах без учета изолятов М.догйопае.

Было 52 конкордантных положительных образца, 467 конкордантных отрицательных образцов и 46 дисконкордантных. ИаОН идентифицировал всего 61 положительный образец с чувствительностью 62.2%. СВ-18 идентифицировал всего 89 положительных образцов с чувствительностью 90.8%. СВ-18 повысил суммарную чувствительность в культурах приблизительно на 40%.

Таблица 3

Суммарные результаты чувствительности в культурах в Пилотном исследовании СВ-18 ИАЬС/ИаОН п=573 + + 52 37 90.8%

СВ-18 - 9 467

62.2% Всего АГВ=98

Из 98 положительных по культуральным данным образцов 69 содержали микобактерии, отличные от туберкулезных (МОТТ), а 29 МТВ. ИаОН идентифицировал 33 из МОТТ положительных образцов, но только 25 образцов МТВ. Чувствительность в культурах для образцов, обработанных ИаОН. составляла 47.8% и 96.6% для МОТТ и МТВ, соответственно. Чувствительность в культурах для образцов, обработанных СВ-18. составляла 92.8% и 86.2% для МОТТ и МТВ соответственно. СВ-1 8 повышал чувствительность в культурах для МОТТ на 94.1%. но снижал чувствительность в культурах для МТВ на 12.1%.

В табл. 4 приведены результаты анализа мазков. Из 61 образца, положительного по культуральным данным, все 61 дали положительные мазки при любом способе обработки. 18 образцов дали одинаковые значения при обоих способах обработки, и 19 образцов при обоих способах обработки дали положительные мазки, но значение, полученное с СВ-18, было выше. Не было случаев, когда бы при обработке ИаОН были получены более высокие значения среди положительных мазков. Было 23 случая, когда при обработке СВ-18 мазок считался положительным, а при обработке ИаОН - отрицательным. Был только 1 случай, когда при обработке ИаОН мазок считался положительным, а при обработке СВ-1 8 - отрицательным. ИаОН идентифицировал 38 мазков из 98. положительных по культуральным данным с чувствительностью 38.8%. а СВ-18 идентифицировал 60 мазков с чувствительностью 61.2%. Из табл. 4 также видно, что повышение чувствительности мазков является следствием увеличения обнаружения как туберкулезных микобактерий (МТВ), так и микобактерий, отличных от туберкулезных (МОТТ).

Таблица 4

Анализ мазков в пилотном исследовании СВ-18

	Всего	МОТТ	МТВ
Идентичные показатели мазков	18	8	10
Показатели мазков СВ-18 >	19	9	10
показатели мазков ИаОН
Показатели мазков ИаОН >	0	0	0
показатели мазков СВ-18
Мазки СВ-18 ф и мазки ИаОН Θ	23	16	7
Мазки ИаОН ф и мазки СВ-18 Θ	1	1	0
Общие ф культуры и ф мазки	61	34	27
Общие ф АГВ культуры в опыте	98	69	29
Чувствительность мазков ИаОН	38.8%	26.1%	69.0%
Чувствительность мазков СВ-18	61.2%	42.8%	93.1%

При том, что отмечено повышение чувствительности мазков с СВ-18, специфичность анализа мазков составляла 99.8% и 96.8% для ИАЬС/ИаОН и СВ-18, соответственно. Имелось большое количество образцов с СВ-18. которые были оценены как ± мазок, и для которых не было подтверждающих культуральных результатов с СВ-18. Согласно рекомендациям СЭС (Кеп!. Р.Т. е! а1.. РиЬНс Неа1!1 МусоЬас!епо1оду. 1п А Сшйе Гог !1е Ьеуе1 III ЬаЬога!огу. и.8.

Оерайтеп! оГ Неа1!й апб Нитап 8егуюе, Сеп!егз Гог Э|зеазе Сопйо1, (1985) рр.57-69), лаборатории должны считать такие ±мазки сомнительными в отсутствие подтверждающих культуральных результатов.

При обработке образцов СВ-1 8 отмечено крайне высокое число ±мазков. Анализ независимо каждым способом вместо учета результатов, полученных при использовании альтернативных способов обработки, и учет результатов этих ±мазков, давали совсем другую картину. Например, данные табл. 5 показывают, что 37 из 61 образца, которые были положительны в культуре при обработке ЫАЬС/МаОН, дали также положительные мазки при обработке ЫАЬС/МаОН. Из 89 образцов, обработанных СВ-18 и положительных в культуре, 56 также дали положительные мазки при обработке СВ18.

Чувствительность и специфичность анализа мазков с использованием ЫАЬС/МаОН составляли 60,6% и 99,6% соответственно, а в случае СВ-18 - 62,9% и 91,2% соответственно.

Из 31 ±мазка (5+26=31), полученных с СВ-18, приблизительно для 42% (п=13) имелись подтверждающие культуральные результаты, полученные другим способом, или полученные на других образцах, или же данный результат мог быть связан с предыдущим заболеванием, или же имелся положительный результат по амплификации ДНК( т. е. подтверждающий наличие микобактериальной ДНК). (Примечание: согласно рекомендациям СЭС, 16 мазков со значением 1 + и 2+ в случае культуральноотрицательных обработанных СВ-1 8 образцов, считались мазок-положительными в анализе, приведенном в таблице 4 - отсюда и исходное снижение специфичности (99,8% против 96,8% (табл. 4)). В целом, специфичность мазков составляла 99,6% и 91,2% для ЫАЬС/МаОН и СВ18, соответственно, в соответствии с анализом, представленным в таблице 5, хотя СВ-18 обеспечивал общее повышение чувствительности в культурах (табл. 3).

Представленные в табл. 5 результаты показывают, что обработка в СВ-1 8 не оказывала эффекта на саму методику мазка. Например, СВ-18 не изменял липучесть бактерии в отношении ее контакта со стеклом. Это основывается на наблюдении, что СВ-18 повышал чувствительность мазков в отношении культуральноположительных образцов на 58% по сравнению с обработкой ЫАЬС/МаОН (табл. 4); однако, каждый способ оставался приблизительно эквивалентным в отношении культурально-положительных образцов, проверенных при помощи мазков данным способом (табл. 5: 60.6% против 62.9%). Другими словами, культивирование остается более чувствительным диагностическим методом, но СВ-18, по-видимому, повышает общую чувствительность обоих методов в равной степени.

Таблица 5

Независимая оценка при обработке двумя различными способами

Показатель мазка Отрица-	ЛАГС/ЛаОН	СВ-18
АРВ® 24	АРВО 502	АРВ® 33	АРВО 434
тельный
±	3	0	5	26
1 +	7	1	8	14
2+	8	1	6	2
3+	5	0	7	0
4+	14	0	30	0
ВСЕГО	61	504	89	476
Мазок:	Чувстви-	Специфич-	Чувстви-	Специфич-
	тельность	ность	тельность	ность
	60,6%	99,6%	62,9%	91,2%

В целом количества культуральноотрицательных и положительных по мазкам образцов (т.е. мазки + и мазки ±), идентифицированных каждым методом, резко отличались: при обработке ЫАЬС/МаОН отмечено только 2 положительных по мазкам и культуральноотрицательных, а при обработке СВ-1 8 - 42 положительных по мазкам (включая СВ-18 образцы, давшие ± мазки, но негативные при культивировании :табл. 5). Вопрос о значимости этих ± мазков (т. е. утрата специфичности мазков) имеет важное значение. В частности, если приведенное выше заключение верно (т.е. СВ-18 повышает общую чувствительность обоих методов обнаружения в равной степени), то СВ-1 8 снижает специфичность анализа мазков. Этот факт может быть существенным для лабораторного исследователя. Если заключение неверно и результаты анализа мазков значимы (т.е. данные больные в действительности могут быть инфицированы микобактериями), тогда чувствительность анализа мазков с СВ-18 может быть выше, чем показано в табл. 4 и 5. Это последнее заключение может оказаться важным для врача. Для того чтобы объяснить данные результаты, был проведен анализ, результаты которого показаны в табл. 6.

Была независимо проверена чувствительность жидких и плотных культур при двух различных способах обработки, примененных в Пилотном исследовании СВ-1 8 (табл. 6). Для каждого способа обработки (ΝηΟΝ против СВ18) было проанализировано количество АРВ культурально-положительных образцов, выделенных данным культуральным методом. Из 61 обработанных ΝηΟΝ образцов 45 оказались положительными в жидких и плотных культурах, 15 - положительны только в жидких и 1 - положителен только в плотной культуре. Из 89 обработанных СВ-1 8 культурально-положительных образцов 42 оказались положительными в жидких и плотных культурах, 15 - положительны только в жидких и 32 положительны только в плотных культурах. Чувствительность жидких культур при обработке ΝηΟΝ и СВ-18 составляла 98,4% и 64,0%, соответственно. Чувствительность плотных культур при обработке ΝηΟΝ и

СВ-18 составляла 75,4% и 83,1%, соответственно.

Ожидаемый результат был получен для образцов, обработанных ΝηΟΝ: жидкие культуры оказались приблизительно на 31% более чувствительны, чем культуры на плотных средах. Напротив, когда образца обрабатывали СВ18 (как описано в примере 1), и засевали на 12В/РАЫТА/сах и 7Н11-селективные косяки, то культуры на плотных средах были приблизительно на 30% более чувствительны.

Таблица 6

Сравнение жидких и плотных культур Результат в культуре Чувствительность

	Жидкие и плотные	Только жидкие	Только плотные	Всего АРВ	Жидкие	Плотные
ЫаОН Мазок®	31	6	0	27	100%	83,8%
Мазок®	14	9	1	24	95,8%	62,5%
Всего	45	15	1	61	98,4%	75,4%
СВ-18 Мазок®	38	4	14	56	75,0%	92,9%
Мазок®	4	11	18	33	45,4%	66,7%
Всего	42	15	32	89	64,0%	83,1%

В приведенных результатах отмечается важная и неожиданная дихотомия. Например, при том, что суммарная чувствительность в культурах повышалась приблизительно на 46% (табл. 3), это повышение было обусловлено исключительно увеличением выделения МОТТ (т. е., имело место снижение чувствительности в культурах в отношении МТВ). Резкой противоположностью этому служило резкое повышение общей чувствительности мазков, при этом данный вклад был обусловлен в равной степени положительными образцами МОТТ и МТВ (табл. 4).

Т1югп1оп XVО 95/27076 предполагал, что повышенные чувствительности обусловлены (1) снижением отрицательного воздействия при обработке по сравнению с обработкой ЫаОН, (ίί) увеличенной эффективностью выделения при центрифугировании в результате компенсации внутренней плавучести организмов и (ш) увеличенной вероятностью обнаружения из-за диспергирования организмов, образующих тяжи. При том, что повышенная культуральная чувствительность может являться результатом сочетания всех трех указанных аспектов, повышенная чувствительность мазков обусловлена только или дисперсией, или повышенным выявлением (жизнеспособность никак не отражается на мазке). Поскольку организмы МОТТ обычно не образуют тяжи в той же степени, что и бактерии МТВ, повышенная чувствительность мазков скорее всего обусловлена повышенным выявлением. Альтернативно, жизнеспособность должна быть существенным моментом культуральной чувствительности. Дихотомия коренится в том факте, что результаты мазков указывают на повышенное выявление как организмов МОТТ, так и организмов МТВ, а культуральные данные указывают на повышенную жизнеспособность организмов МОТТ, но сниженную жизнеспособность организмов МТВ.

Обратная чувствительность в жидких и плотных культурах для обработанных СВ-18 образцов (табл. 6) дает основания считать, что дихотомия является следствием сочетания СВ18 с антибиотиками в добавке РАЫТА/ цефтазидим. Например, сравнение чувствительности в плотных культурах мазок-положительных и мазок-отрицательных образцов, обработанных двумя различными способами, показало значительное сходство. Чувствительность в плотных культурах для мазок-положительных образцов была на 34% выше, чем для мазокотрицательных образцов, обработанных ЫАЬС/ ЫаОН, и на 39% выше при обработке СВ-18. Такое же сопоставление данных для жидких культур показало незначительную разницу в чувствительности между мазок-положительными и мазок-отрицательными образцами при обработке ЫАЬС/ЫаОН (т.е. разница в 4%), но существенную разницу между теми же группами при обработке СВ-18 (т.е. разница в 65%). 75%-ная чувствительность в культурах среди мазок-положительных образцов, обработанных СВ-18, была неожиданной и крайне необычной (эти 14 образцов представляли: 5-МТВ и 9МОТТ: 4 МАС2-М.Гойш1ит и по одному М.с1е1опае, М.8хи1да1 и М.капкаки). Не была удивительной 100%-ная чувствительность в жидких культурах мазок-положительных образцов, обработанных ЫАЬС/ЫаОН. §!опе, В.Ь. е1 а1., 1оиг.С1ш-М1сго. 35:1030-1031 (1997) сообщают, что чувствительность в жидких культурах мазок-положительных образцов (обработанных ЫАЬС/ЫаОН) также составляла 99.3% (это было значительно более широкое исследование, п=439).

Из приведенных данных следуют два вывода. Во-первых, система СВ-18/12В/РАЫТА/ сах влияет на широкий круг микобактерий. Например, при том что 5 пропущенных изолятов МТВ имели высокую общественную значимость, изоляты МТВ составляли только 36% (514) мазок-положительных культуральноотрицательных образцов и 30% (29-98) всех изолятов АРВ, использованных в данном исследовании. Аналогично, изоляты МОТТ составляли 64% (9-14) мазок-положительных культурально-отрицательных образцов и 70% (69-98) всех изолятов АРВ, использованных в данном исследовании. Поскольку соотношение изолятов было таким же, данный феномен может иметь широкое применение: губительное сочетание СВ-18 и антибиотиков сходно влияет на МТВ и МОТТ.

Во-вторых, вклад системы СВ-18/12В/ РАЫТА/сах может зависеть от инокулята. Например, аналогично результатам Епд, К.К., е1 а1., АпНт1сгоЬ.Ад.СНетоФег. 26:42-47 (1984) для Ркеийотопак аегидтока, минимальная ингибирующая концентрация (М1С) цефтазидима повышалась с увеличением инокулята. Поскольку мазок прямо отражает количество организмов в единице объема, мазок-отрицательные образцы будут более подвержены действию системы СВ-18/12В/РАХТА/сах - отсюда и следует различие в 65% в чувствительности жидких культур мазок-положительных и мазокотрицательных образцов.

В данном исследовании СВ-1 8 применяли в концентрации 1 мМ (383 мкг/мл). Концентрация СВ-18 в образцах, засеянных на ВАСТЕС 12В вероятно варьировала в пределах от 35 мкг/мл до 7 мкг/мл в зависимости от исходной консистенции образца, способности СВ-1 8 ожижать образец и количества остаточного смыва, остающегося после декантирования (т.е., исходной жидкости для обработки). В худшем случае (т.е., плотная, тяжелая мокрота) образец разжижался не слишком хорошо и оставался большой объем исходной жидкости для обработки. При таких условиях образец обязательно засевали в растворе для обработки. Добавление 400-500 мкл осадка во флакон ВАСТЕС 12В с конечным объемом а 4,5 мл давало разведение а в 11 раз (т.е. 35 мкг/мл). В лучшем случае, (т. е., легкий бронхиальный смыв) оставалось около 100 мкл исходной жидкости для обработки. Осадок ресуспендировали в 500 мкл воды, получая 5-кратное разведение. Концентрация в таких образцах должна составлять около 7 мкг/мл. При том, что неизвестна концентрация СВ-1 8 для каждого конкретного образца, разумным кажется предположение о том, что СВ-1 8 гомогенно растворен в среде для обработки, и поскольку его не отмывали, то интервал концентраций для каждого образца находится в пределах 7-35 мкг/мл.

Плотная среда сильно отличается от жидкой. Во-первых, к косяку добавляется значительно меньший объем (а 100 мкл). Меньший объем инокулята частично объясняет разницу в чувствительности культуральных систем. Вовторых, любой объем СВ-18, добавленный к косяку, будет минимизирован в силу капиллярности: детергент будет адсорбирован средой, не вступая в контакт с бактериями, что сводит к минимуму его эффект.

Суммируя, можно заключить, что антибиотики и СВ-18 оказывают синергичный отрицательный эффект, и этот эффект широко проявляется на всех микобактериях.

Пример 3. Обработка в СВ-18 против засева в СВ-18.

Для расширения понимания динамических взаимодействий СВ-18 в культуральной системе 12В/РАХТА/сах, были поставлены эксперименты, отраженные на фиг. 1А и 1В (примечание: фиг. 1А и 1В представляют один и тот же опыт, два изображения обусловлены сложностью экспериментальной схемы). Было использовано два различных изолята М.!иЬегси1о818: АТСС 27294 (АТСС, КоскуШе,МЭ) и клинический изолят 571/573-ВАЬ, использованный в пилотном исследовании СВ-18 (примечание: 571/573-ВАЬ обозначает один из двух изолятов, причем оба изолята были получены от одного и того же больного, но в виде двух независимых анализов (т.е. 571-ВАЬ и 573-ВАЬ (см. табл. 8 и сравните фиг. 18 и 19), взятых в один день. Эти два изолята вели себя идентично во всех смыслах и использовались взаимозаменяемо в опытах, описываемых в настоящем и последующих примерах).

Каждый изолят культивировали или на косяках Ловенштейна-Енсена (ЬЛ) или на косяках селективной среды 7Н11 (7Н11-селективные косяки были усилены добавлением полимиксина В, карбенициллина, амфотерицина В и триметоприма (Веск1он ^^ск^η8οη, Соскеу8уШе, МО)). Клетки соскребали с косяков и переносили в буфер или буфер, содержащий 1 мМ СВ-1 8 (как описано в в примере 1), а затем разводили в 1,000 раз тем же буфером (фиг. 1А и 1В). Затем каждый бактериальный сток инкубировали 90 мин при 37°С при встряхивании (140 об/мин) перед дальнейшими разведениями. Затем каждый бактериальный сток опять разводили буфером или 0,5 мМ СВ-18 с тем, чтобы получить конечные разведения 25,000Х, 50,000Х и

100,000Х (по отношению к исходному стоку (фиг. 1А и 1В)). Каждое разведение засевали в параллелях (400 мкл каждая) во флаконы с ВАСТЕС 12В, с добавлением РАЫТА или РАИТА, усиленной сах, так что конечная концентрация сах составляла 8 мкг/мл (Р/сах). Концентрация СВ-1 8 в этих опытах составляла приблизительно 17 мкг/мл (как обсуждалось в примере 2, она составляла от 7 до 35 мкг/мл в большинстве флаконов). Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для всех шести флаконов каждой серии усредняли и строили график зависимости от сроков культивирования. Результаты для изолята АТСС 27294 приведены на фиг. 2А-2Н, а результаты для изолята 571/573-ВАЬ приведены на фиг. 3А-3Н.

На изолят АТСС 27294 в целом не влияли ни условия культивирования (ЬЛ против 7Н11), ни антибиотики (РАИТА против РАИТ Асах), ни раствор для обработки (буфер против СВ18), ни раствор для засева(буфер против СВ-18) не оказывали существенного воздействия на ростовые характеристики изолята АТСС 27294 (фиг. 2А-2Н).

Альтернативно, на изолят 571/573-ВАЬ влияли почти все компоненты экспериментальной схемы. Например, поведение изолята 571/573-ВАЬ зависело не только от того, как он был подготовлен к опыту (ЬЛ против 7Н11селективной среды), но и от присутствия цефтазидима и состава раствора для засева (т.е. буфер против СВ-18). В действительности, наиболее существенным параметром, по-видимому, явля ется присутствие СВ-1 8 в растворе для засева (сравните фиг. 3А с 3В; 3С с 3Ό; 3Е с 3Е; и 36 с 3 Н). Клетки, которые были обработаны в буфере и затем засеяны в СВ-18, не входили в контакт с СВ-18 до засева. Из фиг. 3Е видно, что изолят, засеянный в присутствии Р/сах. не рос. В действительности, рост наблюдался только в 3 из 12 флаконов, использованных для получения ростовых кривых в присутствии Р/сах.

По-видимому, обработка вносит незначительный вклад в ростовые характеристики. Например, эксперимент был задуман таким образом, чтобы обработанные в СВ-18 клетки разводились с получением конечной концентрации СВ-18 в культуральном флаконе, варьирующей от 0,68 мкг/мл (@25,000Х), 0,34 мкг/мл (@50,000Х) до 0,17 мкг/мл (@ 100,000Х). Существенных различий в ростовых характеристиках между этими разведениями не отмечено. Сравнение фиг. 3А и 3С с фиг. 3Е и 36 показывает, что клетки могут быть обработаны в СВ-18, но если концентрация СВ-18 в культуральном флаконе остается ниже, например, 1 мкг/мл, то это не влияет на рост. Другими словами, постантибиотиковый эффект в случае СВ-1 8 не происходит. НебеК Ь.В. 1п: Эгид 8иксербЬйбу 1п !бе Сбето!бегару оГ МусоЬас1епа1 1пГесбопк, Не!Ге1к, Ь.В. еб. СВС Ргекк, ВокЮп, МА (1991), рр.13-57.

В целом приведенные выше результаты, в сочетании с данными пилотного исследования СВ-18, показывают, что различные изоляты ведут себя по-разному и в чувствительность данного изолята вносит вклад способ обращения с ним (например, предыдущий контакт с антибиотиками: клетки культивировали на 7Н11селективной среде (фиг. 3Е-3Н)). Однако более существенно, что присутствие бетаина (т.е. СВ18) в культуральной среде значительно усиливало чувствительность данных изолятов к антибиотикам, также присутствовавшим в культуральной среде.

Пример 4. Добавление лецитина преодолевает эффект СВ-18: проверка малых инокулятов и сравнение с четвертичными аммониумными солями.

Эксперимент, описанный в примере 3 (фиг. 1А и 1В), показывает, что использование СВ-1 8 в качестве первичного диагностического инструмента требует дальнейших уточнений. Например, надо ли удалять СВ-1 8 из раствора для засева, стоит ли использовать менее токсичный бетаин или же действие СВ-1 8 должно быть нейтрализовано. Эти соображения привели к гипотезе о том, что действие СВ-1 8 может быть нейтрализовано лецитином, аналогично тому, как это имеет место в случае четвертичных аммониумных солей (напр., 2ерб1гап® или бензалкониум хлорид), описанных Рабегкоп, В.А. Атег. 1оиг. РиЬИс Неа1!б 46:1429-1430 (1956) и ^аупе, Ь.6. Атег.Веу.Векр.О1к.80:912-913 (1959).

Считается, что четвертичные аммониумные соли оказывают общее отрицательное воздействие на бактериальные и, в частности, микобактериальные организмы. Нидо, XV.В. 1п: 8.С.1. Моподгарб по. 19: 8шГасе-Асбуе Абеп!к т М1сгоЫо1оду. Ьопбоп 8ос.Сбет. 1пбикбу, Ьопбоп (1965) рр. 69-82 делает обзор литературы и суммирует действие четвертичных аммониумных солей, как вызывающее разрыв клеточной мембраны и общую денатурацию (т.е. инактивацию) внутриклеточных белков.

Рабегкоп, В. А. Атег. 1оиг. РиЬбс Неабб 46:1429-1430 (1956) и №аупе, Ь.6. Атег. Веу. Векр. Όίκ. 80:912-913 (1959) показали, что отрицательный эффект четвертичных аммониумных солей в микобактериальной культуре может быть преодолен лецитином (фосфатидилхолин, фосфолипид). На фиг. 4 представлена экспериментальная схема, разработанная для проверки предположения о том, что лецитин может преодолевать эффекты СВ-1 8 в отношении повышения чувствительности изолята 571/573-ВАЬ;

В данном опыте изолят 571/573-ВАЬ культивировали в 7Н11-селективной среде и последовательно разводили ЫАЬС/цитратом приблизительно в 1,000Х. Для того, чтобы проверить какой вклад в результаты данного теста вносит объем инокулята, было приготовлено три различных стока, причем одну серию разведений готовили в буфере, а другую в СВ-18. Соответственно, последующие разведения (2,500Х; 12,500Х и 50,000Х) готовили в буфере или 1.0 мМ СВ-18. Раствор для засева получали смешивая эти три стоковые раствора 1:1 с буфером или забуференным раствором лецитина (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО; Са!.#: Р5394 (7,5% лецитин готовили в виде 100Х концентрата в 100% этаноле (3 грамма в 40 мл) и разводили Трис-буфером, использованным в примере 1, непосредственно перед использованием). Конечные разведения трех различных растворов для засева составляли приблизительно 5,000Х, 25,000Х и 100,000Х. Конечная концентрация СВ-1 8 и лецитина в соответствующих растворах для засева составляла приблизительно 0,5 мМ. Каждое разведение засевали в четырех параллелях (400 мкл каждая) во флаконы с ВАСТЕС 1 2В с добавлением жидкости для реконституции (В.Е.) или РАКГА, усиленной цефтазидимом в концентрации 8 мкг/мл (Р/сах). Конечная концентрация лецитина и СВ-1 8 в ходе инкубации составляла приблизительно 17 мкг/мл. Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и затем строили график зависимости ростовых индексов от времени культивирования.

Аликвоты трех стоковых растворов (т.е., 5,000Х, 25,000Х и 50,000Х) были также использованы для количественного культивирования на чашках 7Н10 7Н10 (Веск!оп Оккткоп, СоскеукуШе, МО)). Анализ чашек 7Н10 показал, что в каждый флакон было засеяно приблизительно 165±54 колоние-образующих единиц (кое) при разведении 5,000Х, приблизительно 33±11 кое при разведении 25,000Х и приблизительно 8±3 кое при разведении 100,000Х. На фиг. 5А представлены результаты для разведения 5,000Х, засеянного в буфер или в буфер с лецитином, а на фиг. 5В представлены результаты для разведения 5,000Х, засеянного в СВ-18 или в СВ-18 в сочетании с лецитином. На фиг. 5С представлены результаты для разведения 25,000Х, засеянного в буфер или в буфер с лецитином, а на фиг. 5Ό представлены результаты для разведения 25,000Х, засеянного в СВ-18 или в СВ-18 в сочетании с лецитином. На фиг. 5Е представлены результаты для разведения 100,000Х, засеянного в буфер или в буфер с лецитином, а на фиг. 5Р представлены результаты для разведения 100,000Х, засеянного в СВ-18 или в СВ-18 в сочетании с лецитином.

Из фиг. 5А, 5С и 5Е видно, что добавление лецитина в данных концентрациях не вносит вклада в чувствительность теста ВАСТЕС В 12. Кроме того, лецитин в некоторой степени обладал способностью преодолевать отрицательный эффект состава антибиотиков (Р/сах) в отсутствие СВ-18. Из фиг. 5В, 5Ό и 5Р видно, что лецитин оказался способен преодолевать отрицательный эффект СВ-1 8 самого по себе или в сочетании с антибиотиками. При уменьшении инокулята от 165±54 кое до 33±11 кое и 8±3 кое способность лецитина преодолевать эффект антибиотиков, СВ-18 или комбинации этих препаратов, снижалась. Однако во всех случаях, когда лецитин добавляли в раствор для засева, все повторяющиеся флаконы были отрицательными (фиг. 5В, 5Ό и 5А). Очевидно, что лецитин способен преодолевать эффект СВ-1 8. Повторные опыты подтвердили полученные результаты.

Четвертичные соли аммония

Результаты, представленные на фиг. 5А5Р, дают основания считать, что механизм действия СВ-18 аналогичен таковому для четвертичных соединений аммония (т.е. общие поверхностно-активные свойства). Этот вывод основывается на концепции о том, что лецитин нейтрализует как четвертичные аммониумные детергенты, так и СВ-18. Предположительно нейтрализация происходит посредством электростатического взаимодействия двух липидов. Если взаимодействие катионных четвертичных детергентов с анионными фосфолипидами выглядит логичным, то бетаины имеют нейтральный суммарный заряд. Взаимодействие бетаинлецитин должно быть временным (транзиторным).

Результаты, представленные на фиг. 3С и 30, показывают, что на клетках, обработанных в СВ-1 8, но засеянных в буфере, не наблюдается пост-антибиотикового эффекта. Если механизм действия СВ-1 8 аналогичен таковому для четвертичных солей (т.е. в целом разрушитель ный), то была бы понятна некоторая задержка. Например, если эффект СВ-18 является следствием поверхностно-активных свойств детергента, то нарушение клеточной функции должно иметь не только продолжительные неспецифические последствия, но должно также не зависеть от изолята. С тем, чтобы проверить сходство механизмов действия, СВ-1 8 был протестирован параллельно с триметилоктадециламмониум бромидом (ТМА-18 (А1бпсЬ, Мй^аикее, ^1, Са!#35,924-6): был приготовлен 100Х стоковый раствор в воде:изопропаноле 1:1, аналогично тому, как это описано для СВ-1 8 в примере 1). Экспериментальная схема приведена на фиг. 6.

В этом опыте изоляты АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ культивировали в селективной среде 7Н11 и затем серийно разводили ИАЬС/цитратом в 10,000 раз. Раствор для засева (т.е. конечное разведение 50,000Х) получали разведением в буфере, 0,5мМ СВ-18, или 0,1 мМ ТМА-18 (все концентрации отражают конечную концентрацию детергента в растворе для засева). Каждую серию затем засевали в повторных инокулятах (400 мкл каждый) во флаконы с ВАСТЕС 12В с добавлением жидкости для реконституции (К.Р.), РАИТА, или РАИТА, усиленной цефтриаксоном (конечная концентрация 8 мкг/мл: Р/сах). Конечная концентрация СВ-18 при инкубации составляла приблизительно 17 мкг/мл. Конечная концентрация ТМА-18 при инкубации составляла приблизительно 3,4 мкг/мл. Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и затем строили график зависимости ростовых индексов от времени культивирования. Фигуры 7А-7С отражают один из опытов, в котором клетки АТСС 27294 засевали в различных растворах, приведенных выше, а фиг. 8А-8С отражают параллельный эксперимент, в котором аналогично засевали клетки 571/573-ВАЬ.

Результаты, полученные на изоляте АТСС 27294, показывают, что Р/сах проявлял более сильное разрушительное действие, нежели просто РАИТА (фиг. 7А), или сочетание РАИТА/сах (сравните фиг. 2А и 7А). В присутствии 17 мкг/мл СВ-18 отмечены небольшие задержки роста в РАИТА, а в составе Р/сах отмечены значительные задержки роста (фиг. 7В). При культивировании изолята АТСС 27294 в присутствии 3,4 мкг/мл ТМА-18 во всех флаконах отмечены значительные задержки роста (фиг. 7С).

Поведение изолята 571/573-ВАЬ во многих отношениях было подобно таковому для изолята АТСС 27294 с небольшими, но значительными различиями. Например, присутствие 17 мкг/мл СВ-1 8 вызывало очевидные задержки роста во всех вариантах, а в составе Р/сах отмечено резкое падение роста (фиг. 8В). Культура 571/573-ВАЬ в присутствии 3,4 мкг/мл ТМА-18 была идентична таковой для АТСС 27294: во всех флаконах наблюдалась значительная задержка роста (фиг. 8С).

Предположение, для проверки которого были поставлены данные опыты, состояло в том, что механизм, посредством которого СВ-1 8 проявляет свой эффект, отличен от такового для четвертичных аммониумных солей (т.е. ТМА18). Например, кривые роста АТСС 27294 и 571/573-ΒЛ^ в отсутствие какого-либо детергента (сравните фиг. 7 А и 8 А) или в присутствии низких концентраций СВ-18 (сравните фиг. 10А и 11А) были практически идентичны. По мере повышения концентраций СВ-18, появлялась возможность дифференцировать изоляты (сравните фиг. 7В и 8В). Когда концентрация СВ-18 повышалась еще сильнее, изоляты опять же вели себя сходно: ни один из них не мог расти в высоких концентрациях СВ-18 (опять же сравните фиг. 1 0А и 11А). Это явно отличалось от поведения двух данных изолятов в присутствии ТМА-18 (сравните фиг. 7С и 8С): изоляты вели себя практически одинаково. Если место действия СВ-1 8 и ТМА-18 одно и то же, что можно ожидать одинакового поведения изолятов во всех условиях. Если места действия двух различных детергентов различны, то можно ожидать различий в поведении двух изолятов в соответствующих культуральных условиях.

Важно помнить, что подобный результат был предсказан при обсуждении фиг. 3С и 3С: СВ-1 8 не проявляет постантибиотикового эффекта (пример 3).

Другой вывод, который следует из полученных результатов, состоит в том, что комбинация СВ-18-Р/сах главным образом синергична. Например, при том, что СВ-1 8 (фиг. 7В) и Р/сах (фиг. 7 А) по отдельности оказывали слабое воздействие на изолят АТСС 27294, сочетание этих двух компонентов приводило к синергичному, а не аддитивному эффекту. Альтернативно фиг. 8 А и 8В показывают, что Р/сах и СВ1 8 по отдельности оказывают воздействие на изолят 571/573-ΒЛ^, однако, комбинация СВ18-Р/сах, будучи в некоторой степени аддитивной, прежде всего синергична. Напротив, ТМА18 сам по себе обладает бактериостатическим действием (фиг. 7С и 8С) и в сочетании с антибиотиками вносит аддитивный эффект. Дополнительные опыты с СВ-1 8 и ТМА-1 8 на данных и других изолятах подтвердили тонкие, но существенные различия в действии двух данных детергентов.

Заключение

Из сравнения фиг. 2Н и 7В (изолят АТСС 27294), а также сравнения фиг. 3Н и 8В с 5В, 5Ό, 5Р (изолят 571/573-ΒЛ^), в отношении чувствительности к антибиотикам в присутствии СВ-18, следует важный вопрос. Например, как видно из фиг. 3Н и 8В, изолят 571/573-ΒЛ^ рос в присутствии СВ-1 8 с антибиотиками. Напротив, из фиг. 5В, 5Ό и 5Р видно, что в аналогич ных условиях в случае изолята АТСС 27294 роста не наблюдалось. Априорно, эти различия можно логически объяснить вариациями в действительной концентрации СВ-18, концентрации антибиотика или в объеме использованного инокулята (см. пример 2 и обсуждение табл. 6 в статье Εη§, К.К. е! а1., Αη!^т^с^оЬ. Αд.СЬето!Ье^. 26:42-47 (1984) и инокулят), или их сочетаниями. Например, более высокие концентрации СВ1 8 или антибиотиков могли быть случайно использованы в опытах, результаты которых представлены на фиг. 7В или 5В, 5Ό и 5Р, по сравнению с опытами, результаты которых представлены на фиг. 2Н или 3Н и 8В, соответственно; или инокулят в случае опытов, представленных на фиг. 7В, 5В, 5Ό и 5Р, был меньше, чем в соответствующих параллелях. В силу способа, которым СВ-18, антибиотики и инокулят вносили в каждый флакон (т.е., с помощью 1 мл шприца), вариации для всех трех компонентов от флакона к флакону вполне ожидаемый понятны: т.е. они будут скорее правилом, нежели исключением. Если использованная в данных опытах культуральная система гиперчувствительна к одному из компонентов, то должны наблюдаться отличия, аналогичные описанным. В опыте, экспериментальная схема которого приведена на фиг. 4, а результаты - на фиг. 5Α5Р, отмечены различия в ходе кривых роста в зависимости от инокулятов. Эти различия состояли в первичных задержках роста, которые ожидаемы при малых инокулятах. Вариации в концентрациях антибиотика должны быть минимальны по сравнению с изменениями концентрации СВ-18 и объема инокулята. Повидимому, культуральная система должна быть значительно более эластичной в отношении изменений концентрации СВ-18.

Пример 5. Титрование СВ-18: Сравнение МТВ, ΜΑС и быстрорастущих штаммов.

Результаты пилотного исследования СВ-1 8 (пример 2) давали основания полагать, что эффект СВ-1 8 широко применим к большому спектру микобактериальных видов (табл. 6), а из примера 4 следовало, что система эластична в отношении концентраций СВ-18. Для проверки этой гипотезы был поставлен эксперимент, проиллюстрированный на фиг. 9, с использованием различных микобактериальных видов, некоторые из которых были использованы и в пилотном исследовании СВ-18.

В данном эксперименте были проверены изоляты комплекса М.!иЬегси1о515, комплекса М. аушт и комплекса М.Гойийит. К проверенным изолятам комплекса М. !иЬегси1о515 относились АТСС 27294 и 571/573-ΒЛ^. К проверенным изолятам комплекса М.аушт относились АТСС25291 и 802-ΒЛ^; и к проверенным изолятам комплекса М.Гойийит относились АТСС 6841 и 495-ШН. Характеристики этих изолятов и результаты данных экспериментов суммированы в табл. 7.

Все изоляты культивировали на 7Н11 селективной среде, а затем последовательно разводили ЫЛЬС/цитратом до 1,000Х. Раствор для засева (т.е., конечное разведение (5,000Х) получали разведением в буфере или в различных концентрациях СВ-18. Эти концентрации составляли: 0,1 мМ СВ-18, 0,2 мМ СВ-18, 0,4 мМ СВ-18, 0,8 мМ СВ-18, 1,6 мМ СВ-18 или 3,2 мМ СВ-18. Все концентрации отражают конечную концентрацию детергента в растворе для засева и не все изоляты были проверены на всех концентрациях.

Каждую серию затем засевали в триплицированных инокулятах (400 мкл каждый) во флаконы с ВАСТЕС 12В с добавлением жидкости для реконституции (В.Р.), РАЭТА, или РАКГА, усиленной цефтриаксоном (конечная концентрация 8 мкг/мл: Р/сах), цефтазидимом (конечная концентрация 8 мкг/мл: Р/сах) или цефокситином (конечная концентрация 8 мкг/мл: Р/сй). Изоляты М.!иЬегси1о818 засевали в Р/сах, изоляты М.аушт засевали в Р/сах и изоляты М.Гойштит засевали в Р/сй. Конечная концентрация СВ-1 8 при инкубации составляла приблизительно 3 мкг/мл для серии 0,1 мМ, приблизительно 7 мкг/мл для серии 0,2 мМ, приблизительно 13 мкг/мл для серии 0,4 мМ, приблизительно 27 мкг/мл для серии 0,8 мМ, приблизительно 54 мкг/мл для серии 1,6 мМ и приблизительно 109 мкг/мл для серии 3,2 мМ. Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и затем строили график зависимости ростовых индексов от времени культивирования.

Фиг. 1 0А и 1 0В отражают один эксперимент, в котором изолят М.!иЬегси1о818 АТСС 27294 засевали в различных растворах, приведенных выше, а фиг. 11А и 11В отражают параллельный эксперимент, в котором изолят М.!иЬегси1о818 571/573-ВАЬ засевали в тех же разведениях. Фиг. 1 2А и 1 2В отражают один эксперимент, в котором изолят М. аушт АТСС 25291 засевали в различных растворах, приведенных выше, а фиг. 13А и 13В отражают параллельный эксперимент, в котором изолят М.аушт 802-ВАЬ засевали в тех же разведениях. Фиг. 14 А и 14В отражают один эксперимент, в котором изолят М.Ьойштит АТСС 6841 засевали в различных растворах, приведенных выше, а фиг. 15А и 15В отражают параллельный эксперимент, в котором изолят М. !иЬегси1о818 495-ШНЬ засевали в тех же разведениях.

Жизнеспособность изолята М.!иЬегси1о818 АТСС 27294 падала когда концентрация СВ-18 достигала 54 мкг/мл (фиг. 10А), тогда как жизнеспособность изолята М.!иЬегси1о818 571/573ВАЬ падала когда концентрация СВ-18 достигала 27 мкг/мл (фиг. 11А). При введении антибиотиков в культуральную среду жизнеспособность изолята АТСС 27294 падала когда концентрация

СВ-1 8 достигала 27 мкг/мл (фиг. 1 0В), и жизнеспособность изолята 571/573-ВАЬ падала при достижении СВ-1 8 концентрации, равной 13 мкг/мл (фиг. 11В). Очевидно, что система была очень чувствительна к изменениям концентрации СВ-18. Отклонения результатов от эксперимента к эксперименту легко объяснить этой чувствительностью.

Жизнеспособнось изолята М.аушт АТСС 25291 падала когда концентрация СВ-18 достигала 27 мкг/мл (фиг. 12А), тогда как на жизнеспособность изолята комплекса М. аушт (МАС) 802-ВАЬ проверяемые концентрации воздействия не оказали (фиг. 13 А). Когда в состав культуральной среды входили антибиотики, то жизнеспособность изолята АТСС 25291 падала при достижении концентрации СВ-1 8 уровня в 13 мкг/мл (фиг. 12В), а жизнеспособность изолята 802-ВАЬ падала при достижении концентрации СВ-18 уровня в 27 мкг/мл (фиг. 13В). При концентрации 27 мкг/мл кривая выходила на плато, поскольку только один из трех флаконов оставался положительным (фиг. 13В). Опять же, система была чувствительна к изменениям концентрации СВ-18.

Жизнеспособность обоих изолятов М.£ойш!ит (АТСС 6841 и 495-1НН) снижалась когда концентрация СВ-1 8 достигала 109 мкг/мл (фиг. 14А и 15А, соответственно). Когда в культуральную среду были введены антибиотики жизнеспособность изолята АТСС 6841 падала при достижении концентрации СВ-18 уровня в 54 мкг/мл (фиг. 14В), и жизнеспособность изолята 495-ШН падала при достижении концентрации СВ-18 уровня в 27 мкг/мл (фиг. 15В).

Быстрорастущие штаммы, как группа в целом, оказались более устойчивы к действию СВ18 самого по себе, но на них хорошо проявился синергизм действия СВ-18 и антибиотиков. Например, изолят 495-1НН оставался жизнеспособен при концентрации СВ-18, равной 109 мкг/мл, но его жизнеспособность снижалась при концентрации СВ-18 в интервале 13-27 мкг/мл в присутствии Р-сй (фиг. 15А и 15В). Альтернативно, изолят 571/573-ВАЬ оставался жизнеспособен при концентрации СВ-18, равной 13 мкг/мл, но жизнеспособность снижалась при концентрации СВ-1 8 в интервале 7-13 в присутствии Р-сах (фиг. 11А и 11В).

Результаты, полученные с двумя быстрорастущими штаммами, представляют интерес в свете работы Соппе11, Ν.Ό. е! а1., 1п: ТиЬегси1о818, РаШодепезК, Рто!есйоп апб Соп!го1. В1оот, В.В. еб. А8М Ргезз, АазЫпдоп, Л.С. (1994) рр.333352, в которой устойчивость быстрорастущих штаммов к цефалоспоринам приписывается проницаемости. Как предполагалось в примере 9, СВ-18 каким-то образом влияет на проницаемость, поэтому полученный результат был вполне ожидаем.

Таблица 7

Проскринированные виды микобактерий

ΝΛΙ.ΓΝπΟΙΙ СВ-18

Культура Культура

ю	Мазок	Жидкая	Плотная	Мазок	12В	7Н11
АТСС 27294	МТВ	т	т	т	т	т	т	Жизнеспособность падала в интервале концентраций СВ-1 8 самого по себе 27-54 мкг/мл и в интервале 13-27 мкг/мл в присутствии антибиотиков
573 - ВА1.	МТВ	1+	Ф/28	0	3+	Ф	0/20	Жизнеспособность падала в интервале концентраций СВ-18 самого по себе 13-27 мкг/мл и в интервале 7-13 мкг/мл в присутствии антибиотиков
АТСС 25291	М.ау.	т	т	т	т	т	т	Жизнеспособность падала в интервале концентраций СВ-18 самого по себе 13-27 мкг/мл и в интервале 7-13 мкг/мл в присутствии антибиотиков
802 ВА1.	МАС	0	Ф/10	Ф/11	1+	0	Ф/20	На жизнеспособность не влияли проверенные концентрации СВ-1 8 самого по себе, но она падала в интервалах концентрации 13-27 мкг/мл в присутствии антибиотиков
АТСС 6841	М.Го.	т	т	т	т	т	т	Жизнеспособность падала при достижении СВ-1 8 концентрации выше 109 мкг/мл6 а в присутствии антибиотиков - в интервале 2754 мкг/мл.
495 - М.Го.	0	Ф/9	0	±	0	Ф/14	Жизнеспособность падала при достижении

.11III СВ-18 концентрации выше 109 мкг/млб а в присутствии антибиотиков - в интервале 1327 мкг/мл.

*3начения мазков приведены в соответствии с рекомендациями СПС. Положительные культуры обозначены знаком Ф с числом через дробь. Это число обозначает время в днях, потребовавшееся для получения положительного результата. Отрицательные культуры обозначены знаком -. Косяки, утраченные из-за контаминации, обозначали символом соп1, а жидкие культуры, направленные на повторный анализ, обозначены символом 0. Штамм АТСС 27294 не был получен в пилотном исследовании СВ18, поэтому культуральные результаты обозначены как неприменимые ('ТСА). М.ау. обозначает М.аушт. М.Го. обозначает М.Гог!ш1ит.

Из полученных результатов следует несколько выводов. Во-первых, имеется минимальная применимая концентрация СВ-18: низкие концентрации СВ-18 не оказывали индуцирующего эффекта, а высокие концентрации СВ18 были бактерицидны (даже в отсутствие антибиотиков). Способность к индукции зависит от вида микобактерий, а также от изолята.

Пример 6. Характеристика изолятов МТБ и антибиотиков.

Принципиальный вывод, сделанный на основе примеров 2, 3 и 5, состоит в том, что СВ-18 делает некоторые виды микобактерий чувствительными к антибиотикам, к которым они не были чувствительны в обычных условиях. Таким образом, была исследована широта этого феномена в терминах изолятов и антибиотиков. Несколько изолятов, использованных в пилотном исследовании СВ-18 (пример 2), были проверены в отношении различных β-лактамных антибиотиков в присутствии и в отсутствие СВ18. В дополнительной серии опытов были проверены другие (т.е. не-β-лактамные) антибиотики.

На фиг. 16 представлена экспериментальная схема, использованная для тестирования различных изолятов МТВ. Эти изоляты (табл. 8) культивировали на 7Н11-селективных косяках и последовательно разводили ЫАЬС/ цитратом до 10,000Х.

Раствор для засева (т.е. конечное разведение (приблизительно 50,000Х) получали путем дальнейшего разведения буфером или 0,5 мМ СВ-1 8 (конечная концентрация). Каждую серию затем засевали в параллельных инокулятах (400 мкл каждый) во флаконы с ВАСТЕС 12В с добавлением жидкости для реконституции (В.Е.), РА№ТА, или РАЭТА, усиленной цефтазидимом в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р/са7'), цефоперазоном в конечной концентрации 16 мкг/мл (Р/сГр) (81дта, 81. Ьошк, М0, Са1.# С4292: цефоперазон растворяли в воде в концентрации 72 мг/мл и добавляли способом, описанным для цефтазидима (пример 1)), цефтриаксоном в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р/сах) (81дта, 81. Ьошк, М0, Са1.# С-5793: цефтриаксон растворяли в воде в концентрации 36 мг/мл и добавляли способом, описанным для цефтазидима (пример 1)), или цефокситином в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р/сй) (81дта, 81. Ьошк, М0, Са1.# С-4786: цефокситин растворяли в воде в концентрации 36 мг/мл и добавляли способом, описанным для цефтазидима (пример 1)). Опять же, конечная концентрация СВ-1 8 при инкубации составляла приблизительно 17 мкг/мл. Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и затем строили график зависимости ростовых индексов от времени культивирования.

Было проскринировано одиннадцать изолятов (включая штамм АТСС 27294). В табл. 8 суммированы использованные клинические изоляты и результаты их тестирования. Репрезентативные изоляты приведены на фиг. 17-27.

Отмечены существенные различия между этими тесте.

изолятами в отношении поведения в данном

Таблица 8

Проскринированные изоляты МТВ ИАЬС/ИаОН СВ-18

Культура

КультураΙΏ	Мазок	Жидкая	Плотная	Мазок	12В	7Н11
АТСС 27294	ИА	ИА	ИА	ИА	ИА	ИА	Минимальная индуцированная СВ-1 8 чувствительность к проверенным антибиотикам, однако, чувствительность к сах резко усиливалась СВ-1 8
571-ВАЬ	1+	Ф/28	Ф/42	1+	Θ	Θ/сои!	Сильная индуцированная СВ-1 8 чувствительность ко всем проверенным антибиотикам (аналогично 573ВАЬ).
573-ВАЬ	1+	Ф/28	Θ	3+	Θ	Ф/20	Сильная индуцированная СВ-1 8 чувствительность ко всем проверенным антибиотикам (аналогично 571 ВАЬ).
535-ВАЬ	4+	Ф/3	Ф/28	4+	Ф/3	Ф/11	Минимальные индуцированные СВ-18 эффекты по отношению к проверенным антибиотикам, чувствительность к сах независима от СВ-18
896 -ВАЬ	4+	Ф/1	Ф/14	4+	Ф/1	Ф/5	Минимальная индуцированная СВ-18 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков, чувствительность к сах слегка усиливалась СВ-18. Штамм обладает множественной лекарственной устойчивостью:ШН, К1Р & Р/А.
040-ТВК	Θ	Ф/29	Ф/42	1+	Φ/14/Θ	Θ	Малая индуцированная СВ-18 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков, чувствительность к сах резко усиливалась СВ-18.
061-ТВК	Θ	Ф/29	Ф/35	2+	Ф/10	Ф/19	Незначительная индуцированная СВ-1 8 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков, чувствительность к сах резко усиливалась СВ-18. 1 Штамм устойчив к 1ИН.
512-.1НН	2+	Ф/4	Θ	4+	Ф/3	Ф/12	Незначительная индуцированная СВ-1 8 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков (аналогично 538-ТИН)
538-1НН	Θ	Ф/31	®/33	2+	Θ	Ф/49	Незначительная индуцированная СВ-1 8 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков (аналогично 512-.1НН)
52-96-ВОЬ	1+	Ф/25	Ф/27	1+	Θ	Ф/39	Незначительная индуцированная СВ-1 8 чувствительность к большинству проверенных антибиотиков,однако, чувствительность к сах резко усиливалась СВ-1 8
57-96-ВОЬ	1+	Ф/25	Ф/27	3+	Θ	Ф/25	Умеренная чувствительность к большинству антибио-

тиков и умеренная индуцированная СВ-18 чувствительность к большинству антибиотиков. Устойчивый штамм (МОК).

*Значения мазков приведены в соответствии с рекомендациями СПС. Положительные культуры обозначены знаком ф с числом через дробь. Это число обозначает время в днях, потребовавшееся для получения положительного результата. Отрицательные культуры обозначены знаком -. Косяки, утраченные из-за контаминации, обозначали символом сои!., а жидкие культуры, направленные на повторный анализ, обозначены символом Θ. Штамм АТСС 27294 не был получен в Пилотном исследовании СВ18, поэтому культуральные результаты обозначены как неприменимые (ИА).

Изолят АТСС 27294 не показал отличий (или показал незначительные отличия) в отношении СВ-18-индуцированной чувствительности, за исключением небольших задержек когда СВ-18 комбинировали с Р-сах (фиг. 17А и 17В). Эти результаты подтверждаются более ранними данными по проверке Р-сах (сравните фиг. 2Р с Фигурой 1 7В) и Р-сах (сравните фиг. 7В с фиг. 17В). Явное различие в индуцированной чувствительности к РАИТА, видимое на фиг. 7В, но не на фиг. 17В, по-видимому, является результатом изменений концентрации СВ-1 8 от опыта к опыту, как это обсуждалось в примере 5.

Изоляты 571-ВАЬ (фиг. 18А и 18В) и 573ВАЬ (фиг. 19А и 19В) показали значительную индукцию чувствительности ко всем проверенным препаратам. Только когда антибиотики комбинировали с СВ-18, отмечен синергистический отрицательный эффект на 571/573-ВАЬ.

Аналогично изоляту АТСС 27294, изолят 535-ВАЬ не поддавался воздействию СВ-18 в использованных концентрациях, однако, на данный изолят влиял Р-сах (фиг. 20А и 20В). Поведение изолята 896-ВАЬ, который был устойчив к 1ИН, К1Р и Р2А, было аналогичным таковому у изолята АТСС 27294 (сравните фиг. 17А и 17В с фиг. 21А и 21В). На изоляты 040ТВК и 52-96-ВОЬ СВ-18 оказывал некоторое воздействие, однако, чувствительность к сах значительно возрастала при наличии СВ-1 8 в случае обоих изолятов (фиг. 22А и 22В и фиг. 26А и 26В, соответственно). Напротив изоляты 061 -ТВК и 57-96-ВОЬ поддавались воздействию антибиотиков в отсутствие СВ-18, однако, эффект антибиотиков значительно усиливался в присутствии СВ-18 (фиг. 23А и 23В и фиг. 27А и 27В, соответственно).

Пара 512-1НН и 538-1НН (фиг. 24А и 24В и фиг. 25А и 25В, соответственно) представляла интерес с этой точки зрения поскольку в пилотном исследовании СВ-1 8 при экспозиции СВ-1 8 один из них (512-РНН) был нативным, а другой экспонировался СВ-1 8 на фоне антитуберкулиновой терапии (538-1НН). Четыре образца были получены от этого больного (табл. 9). Первый образец был получен 8 февраля 1996 г. и был квалифицирован как положительный по мазку в течение первых 24-х часов (срок, считающийся обязательным для такого рода диагностики), а в течение четырех дней он был квалифицирован как положительный по ЛРВ-культивированию. Второй образец от того же больного (527-1НН) был получен спустя десять дней после первого образца, приблизительно спустя 1 неделю после выделения АЕВ из культурального флакона и через 5 дней, после того как было начато лечение данного больного. Все три образца, полученные после начала лечения антибиотиками, были СВ-18/12В/РАЫТА/са7-отрицательными, и только два (538-1НН и 541-1НН) были положительными на косяке 7Н11. При том, что контаминация не играла какой-либо роли в этих различиях в отношении СВ-18/12В/РА№ТАса7, тот факт, что 527-1НН имел самый низкий показатель по мазку из всех четырех изолятов, может объяснить выпадающий результат с 7Н11; однако, значительная задержка роста изолята 538ШН на плотной среде (т.е. 49 дней) необычна для мазок-положительного образца. При том, что для аналогичных образцов, обработанных NΑ^С/NаОН, также отмечена задержка в росте, СВ-1 8 в ходе лечения внес значительный вклад в снижение жизнеспособности данного изолята. Этот факт совпадает с обсуждением примера 3 и серией экспериментов, приведенных на фиг. 3 (сравните фиг. 3В с 3Р и фиг. 3Ό с 3Н) и подтверждает клиническую применимость бетаиноподобных детергентов в качестве терапевтических адъювантов.

ΝΑΓ-С ΝπΟΠ

Таблица 9*. Изоляты М.1иЬегси1оз18, полученные от одного больного

СВ-18

Культура Культура

ю	Мазок	Жидкая	Плотная	Мазок	Жидкая	Плотная	Комментарий
512-ШН	МТВ	2+	®/4	Θ	4+	®	®	2/8/96 Нелеченный
527-.1НН	МТВ	-	®/24	-	±	Θ	Θ	2/17/96Терапия
538-ШН	МТВ		®/31	Ф/33	2+	Θ	®	2/27/96Терапия
54ЫНН	МТВ		®/31	®/33	2+	Θ	®	2/27/96Терапия

*3начения для мазков приведены в соответствии с рекомендациями СОС. Положительные культуры обозначены знаком ®, за которым следует число. Это число отражает время в днях, которое потребовалось для достижения положительного результата. Отрицательные культуры обозначены знаком

Экспериментальная схема, приведенная на фиг. 16, была также использована для того, чтобы оценить широту эффекта СВ-1 8 в отношении других, не-β-лактамных антибиотиков. В этих опытах антибиотики (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО) приготавливали в виде стоковых растворов в воде или буфере, а затем разводили жидкостью для реконституции и добавляли в культуральные флаконы перед инокуляцией. Нистатин (конечная концентрация 100 мкг/мл), эритромицин (конечная концентрация 4 мкг/мл), олеандомицин (конечная концентрация 2 мкг/мл), пенициллин (конечная концентрация 8 мкг/мл), налидиксиновая кислота (конечная концентрация 30 мкг/мл), линкомицин (конечная концентрация 2 мкг/мл), цефтриаксон (конечная концентрация 32 мкг/мл), цефтазидим (конечная концентрация 16 мкг/мл) (цефтазидим выпускается в 1 0%-ном бикарбонате натрия) были проверены на изолятах АТСС 27294,571/573-ВАЬ, 061 ТВК, 52-96-ВОЬ и 57-96-ВОЬ. На фиг. 28 представлены результаты, полученные на изоляте 571/573-ВАЬ с эритромицином и цефтриаксоном. На фиг. 29 представлены результаты, полученные на изоляте 061-ТВР с полимиксином В, олеандомицином, линкомицином, налидиксиновой кислотой, пенициллином 0 и и цефтриаксоном. На фиг. 30 представлены результаты, полученные на изоляте 57-96-ВОЬ с налидикси новой кислотой, пенициллином 0, цефтазидимом и цефтриаксоном.

Эти результаты показывают, что эффект СВ-1 8 зависит и от изолята, и от антибиотика. Примечательно, что цефтазидим сам по себе (т.е., в отсутствие ΡΑΝΤΑ) в конечной концентрации 16 мкг/мл оказался одним из самых менее безвредных препаратов.

Заключение

Полученные результаты подчеркивают микрогетерогенность комплекса М.1иЬегси1о818 в отношении антимикробной чувствительности. При том, что механизмы, участвующие в этих процессах, еще не определены полностью, СВ18 делает возможной высокую степень дискриминации изолятов М4иЬегси1о818 на основе чувствительности. Эта информация может быть полезна при выборе наиболее эффективных терапевтических схем для лечения микобактериальных инфекций, в частности инфекций МТВ. Кроме того, тот факт, что СВ-1 8 индуцирует чувствительность, создает возможность применения данного соединения в качестве терапевтического адъюванта.

Эффект СВ-18, т.е. способность индуцировать чувствительность, зависит от динамического взаимодействия бетаиноподобного детергента (т.е. СВ-18), антибиотика (антибиотиков) и изолята. Наиболее применимые концентрации бетаиноподобных детергентов будут зависеть от того, какой конкретный бетаиноподобный детергент используется, и могут быть определены применением способов скрининга, заявленных в настоящем изобретении.

Пример 7. Скрининг детергентов и других бетаиноподобных структур.

С целью расширения результатов, полученных в примере 6, был разработан тест для скрининга гомологов СВ-18. В табл. 10 перечислены детергенты, использованные в тесте, проиллюстрированном на фиг. 31. Из-за чувствительности изолята 571/573-ВАЬ к индукции чувствительности, данный изолят был использован как репортерный в данных экспериментах по скринингу. Изолят 571/573-ВАЬ культивировали на косяках 7Н11 и последовательно разводили ИЛЬС/цитратом до приблизительно 10,000Х. Раствор для засева, т.е. окончательное разведение (приблизительно 50,000Х) получали дополнительным разведением в буфере 0,5 мМ СВ-1 8 или в соответствующем детергенте. Все детергенты готовили в виде 1 00Х концентратов в смеси изопропанол : вода 1:1 и использовали как растворитель на последних стадиях в данных экспериментальных разведениях.

Конечная концентрация каждого детергента была такова, что в каждый флакон с 1 2В данный детергент вносился в конечной концентрации около 17 мкг/мл. Каждую опытную серию наряду с контролями (буфер и СВ-1 8) засевали в параллельных инокулятах (400 мкл каждый) во флаконы с ВАСТЕС 12В с добавлением жидкости для реконституции (В.Р.), РАЫТА, или РАЫТА с добавлением цефтриаксоном в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р/сах). Одновременно проверяли от пяти до семи детергентов. Каждый разведенный детергент, содержащий клетки МТБ, засевали в параллельных инокулятах (400 мкл каждый) во флаконы с ВАСТЕС 12В с добавлением РАИТА или Р/сах. Почти все детергенты проверяли дважды. Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и затем строили график зависимости ростовых индексов от времени культивирования.

В табл. 10 суммированы проверенные детергенты и полученные с их применением результаты. Следующие детергенты были получены от А1бпс11 СНет1са1 Сотрапу (Мб^аикее, XVI): бензилдиметилстеарил аммониум хлорид (Са!.# 22,901-6), бензилдиметилтетрадецил аммониум хлорид (Са!.# 29,279-6) и октадецилтриметил аммониум бромид (Са!.# 35,924-6). Следующие детергенты были получены от (81дта СЬетка1 Сотрапу, 8!.Ьошз, МО): смешанный алкилтриметил аммониум бромид (Са!.# М-7635), пальмитиновая кислота (Са!.# Р0500), стеариновая кислота (Са!.# 8-4751), СНАР8 (Са!.# С-3023), дезоксихолиевая кислота (Са!.# Ό-6750), 8В-18 (С_!8-сульфопропилбетаин) (Са!.# О-8004), Бридж 97 (олеил(полиоксиэтилен)1₀) (Са!.# Р-6136) и Бридж 56 (цетил(пойоксиэтилен)10) (Са!.# Р-5759). Твин 80 (полиоксиэтилен сорбитанэфир олеиновой кислоты) (Са!.# Р-1334 875) был получен от ВоеЬппдег Маппбет (1пб1апаробз, ΙΝ). К специально приготовленным детергентам относились: С1₈-карбоксиэтилбетаин, С1₈-сульфобутилбетаин, С1₆-гидроксипропилсульфобетаин, С_!6-амидопропилсульфатобетаин, синтезированные

ЕсосЬет ВезеагсЬ, 1пс. (СЬазка, МЫ), и С₁₆АНТМАР (обратный бетаин), который был получен в виде дара от КАО 1пзб!и!е оГ Рипбатеп!а1 ВезеагсЬ (ТосЫд1, 1арап). Хембетаин-8 (сойамидопропил-карбоксиметилбетаин) был получен в виде образца от СЬетгоп Согрогабоп (Разо ВоЬ1ез, СА). ДеТаин РВ (ЬеТате РВ) (цетил-карбоксиметилбетаин) был получен в виде образца от ОеРогез!, 1пс., (Воса Ва!оп, РЬ). Хетаин СЬА (Не!а1пе СЬА) (каноламидопропил карбоксибетаин) был получен в виде образца от Не!егепе, 1пс. (Ра!егзоп, ΝΡ). Ревотерик АМВ-4 (Ве\\'о1епс АМ В-4) (жирный глицинат) был получен в виде образца от 8Ьегех СЬетка1 Сотрапу (ЬнЫт. ОН). Шеркотаин 1АВ (8сЬегсо!ате 1АВ) (стеарилмидопропилкарбоксибетаин) и Шеркоатин VΟΑВ (8сЬегсоа!ше VΟΑВ) были получены в виде образцов от 8сЬег СНеписа1з, 1пс. (Сбйоп, ΝΡ). Велветекс ОЬВ-50 (Уе1уе!ех ОЬВ-50) (олеилкарбоксиметилбетаин) был получен в виде образца от Непке1 Согрогабоп, Етогу Сгоир СозЬра (НоЬокеп, ΝΡ). Кросултаин Е-30 (Сгозб!а1пе Е-30) (эрукамидопропил гидроксипропил сульфобетаин) был получен в виде образца от Сгоба, 1пс. (Рагаррапу, ΝΡ). Макаимин О2 (Маскатте О2)(оксид олеамина) был получен в виде образца от МсбИуге Сгоир, бТЬ. (Ишуегзйу Рагк, 1Ь).

Контроли к данным экспериментам приведены на фиг. 32 А, а репрезентативные результаты, полученные с детергентами, приведены на фиг. 32В. На фиг. 32 А результаты, полученные на параллельных флаконах для каждой контрольной серии в восьми экспериментах, усреднены и представлены графически с тем, чтобы показать относительный вклад антибиотиков (♦-РАНТА, и Δ -Р/сах), СВ-18 (х-СВ-18 только), и сочетания двух компонентов ( -СВ18/РАХТА, и »-СВ-18/Р/сах). Ростовые кривые, приведенные на фиг. 32В, основываются на средних значениях, полученных для параллельных флаконов, в обоих экспериментах, когда клетки засевали в соответствующем детергенте в ВАСТЕС 1 2В с добавлением Р/сах.

Как указывалось ранее, изолят 571/573ВАЬ не поддавался воздействию (или поддавался в минимальной степени) РАКТА или Р/сах в отсутствие СВ-18 (сравните фиг. 3А, 3Е, 8А и 18А/19А с фиг. 32а). Альтернативно СВ-18 сам по себе оказывал воздействие на рост изолята 571/573-ВАЬ, а сочетание СВ-18 с антибиотиками было синергистически отрицательньм, при этом сочетание с Р/сах обеспечивало наибольшее подавление роста (фиг. 32А: х-СВ-18 только, -СВ-18/РАЫТА, и •-СВ-18/Р/сах).

Опять же, имелось примечательное различие в результатах в зависимости от структуры детергента. В целом, все проверенные четвертичные аммониумные соли были крайне активны и в использованной концентрации полностью подавляли рост (табл. 10). Альтернативно, ни анионные жирные кислоты, ни желчные соли, которые были проверены, не оказывали эффекта на рост.

Только те карбоксибетаины, которые не были модифицированы, проявляли активность. Например, те карбоксибетаины, в которых использована амидопропильная группа для связи алькильной цепи с катионом (α в табл. 1) не проявили активности в используемом тесте. Альтернативно, карбоксибетаины без замен проявили сильную способность подавлять рост в сочетании с антибиотиками, особенно С₁₈карбоксиэтилбетаин (гомолог СВ-18 с этиловым мостиком). Дальнейшие исследования С₁₈карбоксиэтилбетаина с использованием изолята АЕСС27294 показали очень узкий интервал активности (приблизительно 7-13 мкг/мл). На фиг. 32А и 32В показана вариабельность при использовании в данном тесте простых (т.е., немодифицированных) карбоксибетаинов с метиленовым (Детаин РВ и Велветекс ОЬВ), этиленовым (С₁₈-карбоксиэтилбетаин) и пропиленовым (СВ18) мостиком. Это совпадает с данными ТкиЬопе К., боиг.Рйагт.8с1. 80:441-444 (1991) о том, что токсичность коррелирует с длиной мостика.

Бетаиноподобные детергенты, относящиеся к категории другие, показали смешанные результаты. Ни обратный бетаин, ни сульфатобетаин (т.е. -8О₄) не подавляли рост. Только один из четырех сульфобетаинов (-8О₃) (т.е., Кросултаин Е-30), два из трех неионных детергентов (Бридж 56 и Бридж 97) и один оксид амина (олеамин оксид) обладали способностью значительно подавлять рост (табл. 10).

При том, что явная бактерицидная активность оксида амина не удивительна, если принять во внимание применение этих соединений в антимикробных составах (Мкйаейк, Е.В. и.8. 564,454 и и.8. 641,728), то активность соединений Бридж и КросултаинаЕ-30 оказалась неожиданной. В отличие от Кросултаина Е-30, единственным другим сульфобетаином, проявившим значительную активность в данном тесте, оказался 8В-18. Дальнейшие исследования 8В-18 на изоляте 571/573-ВАЬ показали очень широкий спектр активности (приблизительно 20-75 мкг/мл). Все остальные сульфобетаины имели амидопропильные связи или гидроксипропильные мостики, что роднило их с карбоксибетаинами. Модификации скелетной структуры, по-видимому, интерферируют с описываемой здесь активностью. Кросултаин Е-30 также имеет амидопропильную связь и гидроксипропильный мостик. Поскольку соединения Бридж не имеют модификаций скелета, эти реагенты должны стимулировать рост. Исторически известно, что неионные детергенты загрязнены примесями и стимулируют рост только в очищенном виде (ОиЬок, Кб. е! а1., боиг. Ехр!1. Меб. 83:409-423 (1946)). Присутствие примесей может объяснить результаты, полученные с детергентами Бридж и Кросултаином Е-30.

Из приведенных данных вытекает возможность того, что наблюдаемый эффект обусловлен примесями. Однако СВ-1 8 поставляется приблизительно 98% чистоты (личное сообщение Боба Карлсона, Есосйет Векеагсй, 1пс., Сйакка, МЫ). Поэтому любая примесь дожна проявиться в этих тестах в концентрации около 0,34 мкг/мл (если 2% добавленного СВ-18 составляют примеси, то 2% от 17 мкг/мл будет оставлять примерно 0,34 мкг/мл). ТМА-18 оказывал в данном тесте подавляющий эффект в десять раз меньших концентрациях (фиг. 7С и 8С). Кроме того, при том, что многие коммерчески доступные бетаины могут быть контаминированы четвертичными солями, образовавшимися в ходе синтеза (т.е. предшественниками или синтетическими побочными продуктами), возможность того, что четвертичные соли образуются в ходе синтеза СВ-18, маловероятна (личное сообщение Боба Карлсона, Есосйет Векеагсй, 1пс., Сйакка, МЫ). Кроме того, считается, что побочные продукты, образующиеся в ходе синтеза СВ-18, осуществленного модифицированными методами ^еегк, б. е! а1., Ьапдтшг 7:854-867 (1991) или Κι/но (6Р 8125139), не должны быть токсичными (личное сообщение Боба Карлсона, Есосйет Векеагсй, 1пс. (Сйакка, МЫ).

Данные эксперименты (фиг. 32В) также показали, что Твин 80 в концентрации 17 мкг/мл не оказывал воздействия на изолят 571/573ВАК Нш, б. е! а1., АпйткгоЬ.АдеШк Сйето. 11:773-779 (1977) варьировали концентрации Твина 80 и показали, что индукция чувствительности к рифампину не достигалась до концентрации приблизительно 0,005% (50 мкг/мл)). Что еще более важно, более высокие концентрации Твина 80 (до 0,05% (500 мкг/мл(380 мкМ)) только стимулировали рост. 8йпкоп, М.№. е! а1., Ат.Кгу.Векр.П1к. 104:717-727 (1971) сообщили, что максимальная стимуляция достигалась при 1% (10 мг/мл (7.69 мМ), а такие большие концентрации, как 10%, не давали дополнительных преимуществ, но не оказывали подавляющего эффекта. Добавление Твина 80 в культуральную среду было наиболее значительным диагностическим достижением микобактериологии в этом столетии, поскольку оно вызывало быстрый рост (ОиЬок, Кб. е! а1., боиг.ЕхрЙ.Меб. 83:409-423 (1946). Уатогк 8. е! а1., М1сгоЫо1.1ттцпо1.35: 921-926 (1991)) сообщили об изменениях характера чувствительно сти к отдельным препаратам при титровании Твина 80 от 0 до 0,5 и 2%. Присутствие ОЭЛС (культуральная добавка, содержащая БСА, №С1, декстрозу, каталазу и олеиновую кислоту) вызывает существенные изменения в чувствительности в сочетании с Твином 80. С другой стороны, СВ18 в концентрации 3-7 мкг/мл не вызывает изменений роста, но полностью подавляет рост в концентрации 13-27 мкг/мл (фиг. 10А и 11А).

Вывод, который можно сделать на основании этих экспериментов, состоит в том, что для осуществления заявленных в изобретении способов применим широкий спектр бетаиноподобных детергентов, а индукция чувствительности варьирует в соответствии со структурой бетаиноподобного агента. Каждый бетаиноподобный детергент должен быть оптимизирован для использования в соответствии с заявленными в изобретении способами. Исключительная степень дискриминации возможна при диффе ренцировании изолятов путем сочетания различных антибиотиков с различными бетаиноподобными детергентами.

Таблица 10

Детергент Результат

Катионные детергенты

Бензилдиметилстеарил Полное подавление аммониум хлорид роста

Бензилдиметилтетрадецил Полное подавление аммониум хлорид Смешанный алкилтриметил аммониум бромид Октадецилтриметил аммониум бромид

Анионные детергенты роста

Полное подавление роста

Полное подавление роста

Пальмитиновая кислота Нет эффекта Стеариновая кислота Нет эффекта

Желчные соли

СНАР8 Нет эффекта

Дезоксихолиевая кислота Нет эффекта

Карбоксибетаины

С18-карбоксиэтилбетаин Полное подавление

Хембетаин-8 (сойамидопропил-карбоксиметилбетаин)

Де Таин РВ (цетилкарбоксиметилбетаин) Хетаин СЬА (каноламидопропил карбоксибетаин) Реиотерик АМ Я-4 (жирный глицинат) Шеркотаин IЛΒ (стеариламидопропилкарбоксибетаин) Шеркотаин VΟЛΒ Велветекс ОЬВ-50 роста

Нет эффекта

Сильное подавление роста

Нет эффекта

Нет эффекта

Нет эффекта

Нет эффекта

Очень сильное подавление роста

Другие бетаины

С1₆-АНТМАР (обратный Нет эффекта бетаин)

С18-сульфобутилбетаин Слабая задержка роста

С16-гидроксипропил сульфобетаин

С16-амидопропилсульфатобетаин

Кросултаин Е-30 (эрукамидопропил гидроксипропил сульфобетаин) 8В-18(С;₈-сульфопропилбетаин)

Макамин О₂ (олеамин оксид)

Твин 80 (полиоксиэтилен сорбитан эфир олеиновой

Слабая задержка роста

Нет эффекта

Сильное подавление роста

Умеренное подавление роста

Полное подавление роста

Нет эффекта

Неионные детергенты кислоты

Бридж 97 (олеил(полиоксиэтилен)₁₀)

Бридж 56 (цетил(полиоксиэтилен)₁₀)

Очень сильное по давление роста

Очень сильное по давление роста

Эффект СВ-18 и ЭДТА

Из примера 4 видно, что действие СВ-18 отличается от такового для ТМА-18, а из фиг. 32В видно, что эффект СВ-1 8 отличается от эффекта Твина 80. Результаты тестирования различных бетаиноподобных детергентов дают основания полагать, что немодифицированные структуры должны быть наиболее полезны (табл. 10). Для того, чтобы еще более дифференцировать эффект СВ-18 от действия других агентов, например хелатирующих металлы (т.е. ЭДТА), были проведены опыты, описанные на фиг. 33.

ЭДТА изменяет проницаемость бактерий, экстрагируя и хелатируя катионы двухвалентных металлов, которые стабилизируют структуру клеточной стенки. ЯазФдц Ν. еί а1., Аηί^т^с^οЬ.Адеηί8 СНеито. 34:759-764 (1990) сообщили, что при попытках выращивать микобактерий в 1 мМ ЭДТА (372.5 мкг/мл) отмечено значительно влияние на жизнеспособность. С учетом того, что бетаины высаливаются на основе их способности связывать воду (Τδπρΐ, К. еί а1., Ιο иг. РНух. СНет. 82:1610-1614 (1978) возникло предположение о том, что эффект СВ-1 8 является результатом хелатирующей активности этого соединения.

С тем чтобы дифференцировать эффект СВ-1 8 от действия хелаторов металлов, таких как ЭДТА, был разработан тест на вычленение действия СВ-18 (фиг. 33). Изоляты АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ выращивали на 7Н11-селективных косяках, а затем каждый последовательно разводили ХАЬС/цитратом приблизительно в 10,000 раз. Раствор для засева (приблизительно 10,000Х) получали путем дальнейшего разведения в буфере, 0,5 мМ СВ-18. 0,5 мМ СВ-18, содержащего 2,5 мМ МдС1₂, или 0,5 мМ ЭДТА (Ьбе ΤесНηο1οд^е5. СайНегхЬегд, МО).Конечная концентрация СВ-1 8 и ЭДТА составляла во время инкубации приблизительно 17 мкг/мл, а концентрация МдС12 во время инкубации со ставляла приблизительно 85 мкг/мл. Каждую экспериментальную серию засевали в три флакона с ВАСТЕС 1 2В (400 мкл в каждый), с добавлением жидкости для реконституции (В.Г.) или РАИТА с цефтриаксоном в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р/сах). Флаконы периодически проверяли и регистрировали ростовые индексы. Ростовые индексы для каждой серии усредняли и строили график зависимости от дней культивирования. На фиг. 34А и 34В представлены результаты, полученные с изолятом АТСС 27294. а на фиг. 35 А и 35В представлены результаты, полученные с изолятом 571/573ВАЬ.

ЭДТА в использованных концентрациях не оказал эффекта на ростовые характеристики ни одного изолята (фиг. 34В и 35В). Концентрация ЭДТА в этих опытах была почти в 22 раза ниже, чем использованная в опытах Вак!од1. И. е! а1.. Апйт1стоЬ.Адеп!к СНето. 34:759-764 (1990) (372 мкг/мл против 17 мкг/мл).

Наиболее интересный аспект этих опытов состоял в комбинации СВ-18/МдС1₂. Гипотеза состояла в том, что СВ-18 способен хелатировать МдС12 и потому эффект СВ-18 будет нейтрализовываться таким взаимодействием (в некоторой степени). При том, что на изолят АТСС 27294 СВ-18 сам по себе (фиг. 34А: т.е. в отсутствие МдС1₂) не влиял, изолят 571/573-ВАЬ подавлялся одним СВ-18 (фиг. 35А). Добавление пятикратного молярного избытка МдС1₂ не оказало эффекта на характер роста изолята 571/573ВАЬ (фиг. 35В). Ни АТСС 27294. ни 571/573ВАЬ не проявили ярко выраженной задержки роста в присутствие только Р/сах; однако, Р/сах в присутствии СВ-1 8 действовал синергично отрицательно, причем это сильнее проявилось на изоляте 571/573-ВАЬ (фиг. 34А и 35А). Добавление МдС12 к комбинации СВ-18/Р/сах в некоторой степени ослабляло отрицательный эффект комбинации СВ-18/Р/сах (фиг. 34В и 35В), причем эффект СВ-18/Р/сах сильнее проявился на изоляте 571/573-ВАЬ. Если МдС1₂ не смягчает эффект СВ-18 в отсутствие Р/сах, но МдС1₂ снижает чувствительность в присутствии Р/сах, то МдС12 должен интерферировать с действием Р/сах. Поскольку цефтриаксон (сах) поставляется в виде двунатриевой соли, антибиотик имеет суммарный отрицательный заряд (т.е. -2) и должен взаимодействовать с МдС1₂.

ТкиЬопе К., 1оит.РЬатт.8с1. 80:1051-1054 (1991) показал, что, как правило, нет зависимости (или она невелика) между хелатирующей активностью различных фосфобетаинов и их антимикробной активностью. Этот вывод согласуется с наблюдением о том, что эффект СВ-1 8 не является следствием хелатирования ионов металлов.

Пример 8. Тестирование чувствительности микобактерий и эффект СВ-18.

Имеется ряд методов тестирования чувствительности. К стандартным используемым в настоящее время методам относятся: (а) диффузионный тест с дисками, (б) микроразведения в бульоне, (в) агаровый градиент и (г) быстрые автоматизированные инструментальные методы. При осуществлении этих методов изменяют концентрацию препарата и оценивают ростовые характеристики. Известно, что объем инокулята существенно влияет на результаты тестирования чувствительности.

В современных микобактериологических тестах чувствительности следуют методу 1 %ной пропорции, описанному Vек!а1. А.Ь. Сеп!егк Гог Ьекеаке Соп!го1. |Ьер1. ОГ Неа1!1. Ейисайоп апй Ае1Гаге риЬйсайоп по (СЭС) 76-8230] рр.97115 (1975). В нем используется разведение контроля в 100 раз (1 00Х) и сравнение роста в присутствии антитуберкулина с контролем. Если более 1% инокулята устойчиво к препарату, то рост исследуемого изолята будет равен или выше контрольного. Если изолят чувствителен, или менее 1% инокулята устойчиво, тогда рост будет меньше, чем в контроле.

Золотыми стандартами в тестировании чувствительности туберкулеза являются тесты ВАСТЕС® 8.ЬВ.Е. или ВАСТЕС® Р2А (Веск!оп Оккткоп. СоскеукуШе. МО). Это автоматизированный жидкостный метод (8шйет. 8.Н. е! а1.. ,1оиг. С1ш. М1сго. 13:908-912 (1981); ^пке. 6.. е! а1.. 1оит. АпйтктоЬ.СйетШег. 10:351-354 (1982); ВоЬейк. 6. Ό.. е! а1.. 1оиг. С1т. М1сго. 18 : 689-696 (1983); и Таггапй. 1. 1. е! а1.. 1оиг. С1т. М1сго. 27:941-946 (1985)). В описании фирменного теста указывается, что после того, как ростовой индекс контроля (СО превысит 30 (6ί_!=₀). флакон надо учитывать на следующий день (Οί_!+ι) и определять разницу между этими двумя днями (6^1 - Оф = ЛС1_соп4го1). Флаконы с тестируемым препаратом учитывают в те же самые два дня и определяют А61_йгид для препарата таким же образом. Если >А61_йгид изолят считается чувствительным. Если АбО^ы > А61_йгид изолят считается пограничным. Если Абйот^ы < А61_йгид изолят считается нечувствительным. Нейе!к. Ь.Апйт1стоЬ.Адеп!к СНето. 40:1759-1767 (1996) указывает, что 6I в присутствии препарата не должен превышать 50 в течение 8 дней культивирования (когда величина инокулята в содержащих препарат флаконах составляет от 1 0⁴ до 1 0⁵ кое/мл).

С тем, чтобы провести корреляцию полученных в наших экспериментах результатов с пропорциональным методом, используемым в тесте 8.НИ.Е.. был проведен эксперимент, представленный на фиг. 36. Данная экспериментальная схема был разработана для приведения в соответствие существующих методов тестирования микобактериальной чувствительности с результатами, полученными с бетаиноподобными детергентами.

Например, контролем для флаконов, содержащих стандарт Мак Фарланда с препара том, будет служить флакон 100Х-К.Р.; контролем для флаконов, содержащих 10Х-кратные разведения препарата, будет служить флакон 1,000Х-К.Р.; а контролем для флаконов, содержащих 100Х-кратные разведения препарата, будет служить флакон 10,000Х-К.Р.

В этом опыте изоляты М.ШЬегсиЦкшк АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ культивировали на 7Н11-селективной среде 2 недели. Клетки соскребали и ресуспендировали в ХАРС/цитрат, обрабатывали ультразвуком 60 с и затем клеткам давали возможность осесть. Раствор доводили до 0,5 стандарта Мак Фарланда и последовательно десятикратно разводили до 10,000 раз.

Каждую серию разведений, за исключением разведения 10,000Х, засевали в параллелях на 7Н11 для подсчета колоний и инокулировали в параллелях во флаконы, содержащие К.Р., РАИТА с цефтриаксоном в конечной концентрации 8 мкг/мл (Р-сах), только СВ-18 в концентрации 15 мкг/мл, 30 мкг/мл или 60 мкг/мл, или СВ-18 в сочетании с Р-сах (СВ-1 8 в концентрации 15 мкг/мл, 30 мкг/мл или 60 мкг/мл). Разведение 10,000Х засевали в параллелях на 7Н11 и инокулировали в параллелях во флаконы, содержащие К.Р. или только Р-сах.

Подсчет колоний давал возможность определения 0,5 стандарта Мак Фарланда для каждого изолята. Эти определения были затем использованы для определения количества кое, инокулированных с каждым разведением во флаконы 1 2В. Количество кое, засеянных в каждой серии, приведено ниже. Результаты, полученные на изоляте АТСС 27294, приведены на фиг. 37А37Е, а результаты, полученные на изоляте 571/573-ВАЬ, приведены на фиг. 38А-38Е.

	Кое, засеянные в 1 2В	Кое, засеянные в 12В
Разведение	АТСС 27294	571/573-ВАЬ
0,5 Мак Фарланд 6,28±0,57х105	1,11±0,18х106
10Х	62,800±5,700	111,000±17,900
100Х	6,280±570	11,100±1,790
1,000Х	628±57	1,11±179
10,000Х	63±6	111±18

При высокой посевной дозе (>1х10⁵ кое) ростовые кривые обоих изолятов АТСС 27294 и 571/573-ВАЬ проявили необычный характер (фиг. 37А и 38А). Даже при концентрации СВ18, равной 30 мкг/мл изоляты росли беспрепятственно в течение первой недели. При концентрации СВ-18, равной 30 мкг/мл, в сочетании с Р-сах, оба изолята после первой недели показали необычную задержку роста. При концентрации СВ-18, равной 60 мкг/мл (в присутствии антибиотиков или без них) оба изолята росли, но необычным образом: оба начинали рост, но затем тормозили развитие. Только изолят АТСС 27294 при этом выживал.

В тесте ВАСТЕС используется анализ высвобождения ¹⁴СО2. Поскольку флаконы учитывали ежедневно, то высвобождаемый в результате метаболизма ¹⁴СО2 в течение первых двух недель уходил из флаконов каждый день. Разница в С1 ото дня ко дню является отражением количества нового ¹⁴СО₂, образовавшегося с момента последнего учета. Поскольку флаконы учитывали ежедневно только в течение первых двух недель, положительный С1 отражает рост, но не увеличивающийся экспоненциально С1: указывал только на отсутствие нового роста. Через 2 недели флаконы учитывали каждые 3-5 дней. В течение этого времени С1 накапливался. С использованием обсуждавшегося выше показателя АС ни в одном из вариантов с применением стандарта Мак Фарланда в качестве инокулята нельзя было определить изолят как чувствительный или дифференцировать изоляты. Поэтому инокулирование флаконов посевной дозой, превышающей 1 0⁵ кое, не будет продуктивным и потому не рекомендуется.

Анализ 1 0Х разведений начал давать учитываемые результаты. Оба изолята оказались чувствительными при концентрации СВ-18, равной 60 мкг/мл в присутствии Р-сах. Только изолят 571/573-ВАЬ оказался чувствительным при концентрации СВ-18, равной 30 мкг/мл в присутствии Р-сах.

Анализ серийных разведений показал, что в 100Х разведении изолят АТСС 27294 чувствителен к СВ-18 в концентрации, равной 30 мкг/мл в присутствии Р-сах. Инокулят этого разведения изолята 571/573-ВАЬ был чувствителен к СВ-1 8 в концентрации, равной 15 мкг/мл в присутствии Р-сах. Проверка разведений 1,000Х дала результаты, идентичные для разведении 100Х, но ростовые кривые изолята 571/573-ВАЬ в этих двух последних случаях (т.е. 100Х и 1,000Х) сильно напоминали более ранние кривые (фиг. 5А-5Р и фиг. 11).

Из этих опытов можно сделать два вывода. Во-первых, изоляты АТСС 27294 и 571/573ВАЬ можно дифференцировать, но не во всех условиях. Во-вторых, низший предел тестирования представляет один организм, тогда как, с другой стороны, использование дозы в 10⁵ бактерий перегружает систему. Посевные дозы между 100 и 10⁴, дают возможность дифференцировать изоляты, а инокулят в 1 0³ и 10⁴ бацилл дает возможность получать воспроизводимые результаты в зависимости от времени.

Пример 9. Проницаемость микобактерий и эффект СВ-18.

Одно из возможных объяснений механизма, посредством которого СВ-18 проявляет свой эффект, состоит в проницаемости микобактерий. Без стремления ограничиваться следующей гипотезой, мы приводим ее только в целях иллюстрации изобретения. Бетаиноподобные детергенты могут изменять проницаемость бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты, делая тем самым эти бактерии более чувствительными к антибиотикам. В частности, эффект СВ-1 8 может являться результатом изме нений в распределении конформаций структур миколевой кислоты.

Это предположение основано прежде всего на работе Уиап, Υ. е! а1., Ргос.Ыа!1.Асай.8с1. 93:12828-12833 (1996). В целом, некоторые микобактерии обладают способностью изменять текучесть своей клеточной стенки (Ьш, 1., е! а1., 1оиг.Вю1.Сйет. 271:29545-29551 (1996)). Это достигается или изменением длины миколевых кислот, или изменением структурной конформаций миколевых кислот, или обоими способами. Другими словами, как длина, так и конформация миколевых кислот клеточной стенки влияют на температуру плавления клеточной стенки. Например, с изменением длины миколевых кислот или отношения транс/цис двойных связей, или количества и/или конформаций циклопропанов, степени гидроксилирования, метилирования и карбонилирования меняется и температура плавления миколевых кислот (Валу, С.Е. е! а1., 1оиг. Вю1.С1ет. 271:29545-29551 (1996)). Например, в случае М.ктедтаИк, при повышении температуры выращивания наблюдается соответствующее возрастание доли транс-олефинов в проксимальной двойной связи миколевых кислот, что приводит к повышению температуры плавления этих липидов (т.е. снижению текучести). В случае М.!иЬегси1о818 и М.атшш с увеличением доли транс-циклопропанов в проксимальном положении соответственно повышается температура плавления миколевых кислот.

Считается, что текучесть микобактериальной клеточной стенки играет важную роль в проницаемости и, соответственно, в устойчивости ^иап, Υ. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. 8сР92:66306634 (1995); Вгеппап, Р.1. е! а1., Аппи. Кет. В1осНет. 64:29-63 (1995)). Устойчивость

М.с1е1опае к цефалоспоринам обусловлена исключительно проницаемостью (Соппе11, Ν.Ό. е! а1., 1п: ТиЬегси1о818. Ра!одепе818, Рго!ес!юп апй Соп1го1. В1оот, В. К. ей. А8М Ргекк, ’№акЫпд!оп, Ό. С. (1994) рр.333-352). Например, Валу, С.Е. е! а1., 1оиг. Вю1. С1ет.271:29545-29551 (1996) показали, что при снижении текучести клеточной стенки М.ктедтайк (т.е. с возрастанием доли транс-олефинов) проникновение норфлоксацина и хенодезоксихолата также снижается. Капейа, К., е! а1., 1оиг.6еп.М1сгоЫо1.134:22132229 (1988) показали, что у высокоустойчивых быстрорастущих штаммов большая часть проксимальных двойных связей представлена транс-олефинами.

Образование конформаций различных миколевых кислот происходит прежде всего при помощи структурно родственных 8-аденозилметионин (8АМ)-зависимых ферментов. Молекулярный анализ показал, что у М.!иЬегси1о818 имеется четыре структурно родственных гена, кодирующих синтазы метоксимиколевой кислоты (ММА8), которые ответственны за многие из этих модификаций (Анап, Υ. е! а1., Ргос. Ыа!1.

Асай. 8сР 93:12828-12833 (1996)). Продукты этих четырех генов (ММА8-1, ММА8-2,

ММА8-3 и ММА8-4) обладают сильной гомологией последовательностей с циклопропановой жирнокислотной синтазой Е.соН (СРА8) и циклопропан миколевыми синтазами М.1ергае и М.!иЬегси1о818 (СМА8-1 и СМА8-2). Считается, что они используют один и тот же механизм. В этом механизме задействованы 8АМ и углеродный интермедиат (фиг. 39А). Различные продукты получаются потому, что различные синтазы имеют в своих активных сайтах различные доноры/акцепторы электронов, что приводит к образованию олефинов, циклопропанов, метилированию и сочетанию гидроксилирования с метилированием (Уиаи Υ. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. 80.93:12828-12833 (1996)).

Валу е! а1., в патенте и.8. 5,610,198 указывают, что тиатетракозаноевые кислоты (тиолированные жирнокислотные производные) могут применяться для ингибирования циклопропанирования и оксигенирования миколевых кислот патогенных микобактерий посредством ингибирования 8АМ-зависимых реакций (фиг. 39В). Четыре тиатетракозаноевые кислоты были проверены в этом отношении и эффект их показан.

В целом, механизм ингибирования этими аналогами предусматривает их участие в качестве субстратов в первой части синтазной энзиматической реакции (в частности, переноса метильной группы от 8АМ). После катализа образуется структура, которая называется стабильным аналогом переходного состояния (фиг. 39В). По существу, соединение не высвобождается из активного центра и действует как классический конкурентный ингибитор. Структура переходного состояния напоминает бетаиноподобный детергент. В частности, основанный на сульфониуме бетаин (табл. 1 и фиг. 29В): для активации сульфониумкарбоксибетаинов не требуется ферментативный катализ и они будут прямо подавлять 8АМ-зависимые модификации.

Ваггу е! а1., в патенте и.8. 5,610,198 также констатируют, что тиатетракозаноевые кислоты неэффективны против таких сапрофитных микобактерий, как М.ктедтаИк. В отличие от описания Валу е! а1., (И.8. 5,610,198), из настоящего изобретения следует, что такие сапрофитные микобактерии чувствительны к действию бетаиноподобных детергентов: из проверенных штаммов М.Гойш!ит показала наибольшую степень синергизма между СВ-18 и цефалоспорином. Например, на рост клинического изолята 495-1НН не влияло присутствие цефокситина и он был способен к росту в присутствии СВ-1 8 в концентрации 109 мкг/мл (фиг. 15). Однако, когда цефокситин сочетался всего лишь с 13 мкг/мл СВ-18, рост данного изолята тормозился и полностью подавлялся при концентрации СВ18, равной 27 мкг/мл.

Если бетаиноподобные детергенты влияют на проницаемость микобактерий на уровне текучести клеточной стенки, посредством 8АМзависимых ферментов, то представленные на фиг. 14 и 15 результаты можно считать вполне ожидаемыми. Основание для таких ожиданий лежит в сходстве М.Гойш!ит и

М.ктедтаДк.ПоЬкоп, С., е! а1., 1п: СообГе11о^, М. е! а1., ебк. СЬетка1 Ме!Ьобк ш Вас!епа1 8ук!ета!1ск, Асабетк Ргекк, Ьопбоп (1985) рр. 237265 и Вгеппап, Р.1. е! а1, Аппи.Кеу.ВшсЬет. 64:29-63 (1995) суммируют распределение миколевых кислот микобактерий различных видов и показывают, что быстро растущие штаммы (напр., М.Гойийит, М.сЬе1опае, М.ктедтайк и т.д.) имеют сходный характер распределения миколевой кислоты:первичная миколевая кислота является кислотой а' типа. Ьш, 1., е! а1., 1оиг. Вю1. СЬет. 271:29545-29551 (1996) показали, что с повышением температуры выращивания главные миколаты М.ктедтаДк становятся миколатами типа а_ь и а₂. Типы а_ь и а₂ длиннее, чем тип а' (а'=С₆₄, а а₂=С_78-79), а тип а₂ обладает проксимальным транс-олефином, структурой, придающей меньшую текучесть и делающей клеточную стенку менее проницаемой. Тип а₂ преобладает при более высоких температурах (структуры а', а₁ и а₂ миколевых кислот приведены Сеогде, К., е! а1., 1оиг.Вю1.СЬет. 270:27292-27298 (1995)).

Значение этих данных становится очевидным в свете механизма, предложенного Уиап, Υ. е! а1., Ргос.Иа!1.Асаб.8с!93:12828-12833 (1996) для этих 8ЛМ-зависимых ферментов (фиг. 39 А): транс-олефин является продуктом 8АМзависимого метилирования, а текучесть обязательно пропорциональна содержанию трансолефина. Добавление в культуральную среду СВ-1 8 должно подавлять образование трансолефина, повышая тем самым текучесть клеточной стенки и повышая проницаемость клеток для антибиотиков. С повышением проницаемости антибиотики легче приникают в клетку. Эффективность данного антибиотика будет зависеть от природы собственно изолята (т.е. взаимодействия антибиотика с мишенью действия препарата в исследуемом изоляте). Окончательный результат будет проявляться в виде эффекта СВ-18.

Если 8ЛМ-зависимые модификации жирных кислот являются общим механизмом, посредством которого микобактерии регулируют текучесть своих клеточных стенок, как это предполагают (Ьш, 1., е! а1., 1оиг.Вш1.СЬет. 277:29545-29551 (1996)), то бетаиноподобные детергенты должны влиять на широкий спектр структур миколевой кислоты, таких, например, как коринемиколаты (Оигапб, Е. е! а1., Еиг.1оиг.В1осЬет.93:103-112 (1979)), и, следовательно, нокардиомиколаты.

Приведенные рассуждения объясняют крайний синергизм, наблюдаемый между цефокситином и СВ-18 в случае М.Гойийит (табл. 7), однако не объясняют чрезвычайной чувствительности М.!иЬегси1ок1к к бетаиноподобным детергентам (табл. 8). Например, рост

М.!иЬегси1ок1к штамма АТСС 27294 в отсутствие антибиотиков незначительно тормозится при 27мкг/мл СВ-1 8 и полностью подавлялся при добавлении 54 мкг/мл СВ-18. В присутствии антибиотиков рост данного изолята был незначительным при 13мкг/мл СВ-18 и полностью прекращался при 27мкг/мл СВ-1 8 (фиг. 10). Рост изолята 571/573-ВАЬ М.!иЬегси1ок1к в отсутствие антибиотиков в небольшой степени тормозился при 13 мкг/мл СВ-18 и полностью подавлялся при добавлении 27мкг/мл СВ-18. В присутствии антибиотиков рост данного изолята не наблюдался уже при 1 3 мкг/мл СВ-1 8 (фиг. 11). В отличие от М.Гойийит (фиг. 14 и 15), М.!иЬегси1ок1к оказалась значительно более чувствительной к бетаиноподобным детергентам самим по себе.

Очевидно, медленно растущие микобактерии, такие как М.!иЬегси1ок1к, не регулируют текучесть клеточной стенки, подобно тому, как это происходит у быстро растущих микобактерий, таких как М.ктедтаДк (Ьш, 1., е! а1., 1оиг.Вш1.СЬет. 271:29545-29551 (1996)). Например, Такауата, К. е! а1., Ат.Кеу.Кекр1г.П1к. 118:113-117 (1978) показали крайнюю чувствительность М.!иЬегси1ок1к к температуре выращивания: при температуре, отличающейся от оптимальной всего на несколько градусов, синтез миколевых кислот прекращается и М.!иЬегси1ок1к неспособна к выживанию. Чувствительность М.!иЬегси1ок1к к заявленным бетаиноподобным детергентам или к тиатетракозаноевым кислотам, описанным Ваггу, С.Е. е! а1., (И.8. 5,610,198) в сочетании с антибиотиками может являться следствием родовой чувствительности изолятов М.!иЬегси1ок1к к нарушениям синтеза миколевых кислот. Например, подавление циклопропанирования или оксигенации миколевых кислот будет оказывать эффект на проницаемость и, следовательно, на чувствительность; нарушение синтеза миколевых кислот в целом может иметь летальные последствия. Индуцированная чувствительность к антибиотикам будет наблюдаться только при низких концентрациях СВ-18 и на медленнорастущих микобактериях.

Если мишенью действия бетаиноподобных детергентов являются 8АМ-зависимые синтазы бактерий, содержащих структуры миколевой кислоты, то можно ожидать, что данные детергенты будут ингибировать модификации жирных кислот (т. е. миколевых кислот) и в некоторых случаях вызывать прекращение синтеза миколевых кислот. Следовательно, бетаиноподобные детергенты будут играть только вспомогательную терапевтическую роль при лечении инфекций, вызываемых быстрорастущими орга97

Например, исходя из структуры, алкилсульфониумкарбоксибетаин может быть идеальным соединением для подавления модификаций миколевой кислоты. Алкилсульфониумкарбоксибетаин можно синтезировать модифицированным методом 21ттег, К.Е. (и.8. 3,560,393). Например, октадецилмеркаптан может быть метилирован и К₁-8-К₂ очищен эфиром галида соответствующего типа (фиг. 39С). Очистка катионообменной хроматографией удалит эфир с получением кислоты.

Пример 10. Панели бетаиновой чувствительности для скрининга клинических изолятов.

Из примеров 5 и 6 видно, что различные клинические изоляты ведут себя по-разному в тестах, в которых один бетаин используется с рядом различных антибиотиков. Из примера 6 видно, что один клинический изолят по-разному ведет себя в тесте, в котором различные детергенты используются с составом антибиотиков Р/сах. Из этого следует, что для целей тестирования чувствительности может быть разработана и уточнена панель бетаиновой чувствительности. В такой панели различные бетаины будут сочетаться с различными антибиотиками. В настоящем примере описывается создание такой панели и ее применение для тестирования чувствительности. Данный пример приводится только в целях иллюстрации создания подобной панели и не ограничивает объем изобретения.

С использованием различных бетаинов, например, пяти, обладающих широким спектром действия в отношении различных клинических изолятов, в сочетании с несколькими, например, пятью, антибиотиками, обладающими широким спектром действия в отношении различных клинических изолятов, создайте панель бетаиновой чувствительности. Например, определите пять антибиотиков α-1, α-2, α-3, α-4 и α-5, и пять бетаинов β-1, β-2, β-3, β-4 и β-5. Пять различных бетаиновых позиций в панели могут представлять собой различные концентрации одного и того же детергента, или комбинации различных детергентов. Аналогично, пять различных позиций антибиотиков в панели могут представлять собой различные концентрации одного и того же антибиотика, или комбинации различных антибиотиков. Из табл. 11 видно, как могут быть скомбинированы эти пять бетаинов с этими пятью антибиотиками с тем, чтобы определить наиболее действенные сочетания бетаин/антибиотик.

низмами, но должны приводить к летальным последствиям в случае многих медленнорастущих микобактерий. Например, если проницаемость медленнорастущих микобактерий с присутствии δΆΜ-зависимых ингибиторов будет обусловливать индуцированную чувствительность к антибиотикам, то отрицательный эффект на выживаемость в силу интерференции с синтезом миколевой кислоты будет важным, возможно доминирующим фактором. С другой стороны, быстрорастущие микобактерии, как правило, не будут подвергаться воздействию бетаиноподобных детергентов самих по себе, для которых характерен выраженный синергизм с антибиотиками в силу подавления механизма, регулирующего текучесть мембраны.

Валу е! а1., (и.8. 5,610,198) также утверждают, что только антимикобактериальные препараты, такие как изониазид, этамбутол, стрептомицин, рифампин, дапзон, рифабутин, кларитромицин, ципрофлоксацин, клофозамин, азитромицин, этионамид, амикацин или резорциномицин А могут применяться в сочетании с тиатетракозаноевыми кислотами. Настоящее изобретение, проиллюстрированное примерами 5 и 6, показывает, что присутствие СВ-18 определенным образом изменяет физиологию бактерий, предположительно посредством обсуждаемого здесь механизма, индуцируя чувствительности к широкому спектру антибиотиков. Поэтому, согласно изобретению, использование теста на бетаиновую чувствительность на основе эффекта СВ-1 8 в сочетании с разнообразными антибиотиками для определения природной чувствительности тестируемого изолята, может дать врачу более эффективные рекомендации.

Заявленные в настоящем изобретении бетаиноподобные детергенты имеют существенные преимущества по сравнению с тиатетракозаноевыми кислотами, описанными Валу е! а1., (и.8. 5,610,198). Например, тиатетракозаноевые кислоты крайне нерастворимы. Другими словами, Крафтовы температуры этих реагентов значительно выше физиологически нормальной. Введение соответствующей концентрации становится невозможным. Напротив, бетаиноподобные детергенты, полученные согласно настоящему изобретению, в большинстве случаев растворимы. Например, Нобде, Ό. е! а1., Бандтшг 7:878-884 (1991) синтезировали С₂₀карбоксигексилбетаин с Крафтовой точкой 20°С.

При том, что для описания эффекта СВ-1 8 был использован СВ-18, понятно, что в этом отношении полезны также и другие бетаины.

Таблица 11. Панель чувствительности к бетаину Бетаиноподобные детергенты

Антибиотик	φ	β-1	β-2	β-3	β-4	β-5
φ		β-1	β-2	β-3	β-4	β-5
α-1	α-1/	α-1/β-1	α-1/β-2	α-1/β-3	α-1/β-4	α-1/β-5
α-2	α-2/	α-2/β-1	α-2/β-2	α-2/β-3	α-2/β-4	α-2/β-5
α-3	α-3/	α-3/β-1	α-3/β-2	α-3/β-3	α-3/β-4	α-3/β-5

100 α-4 α-4/ α-4/β-1 α-5 α-5/ α-5/β-1

Панели чувствительности к бетаину

Используйте приведенную в табл. 11 панель как описано ниже.

(1) Вырастите испытуемый клинический изолят в жидкой культуре (например, ВАСТЕС 12В) или на плотной среде (например, косяки 7Н11).

(2) Бетаины и антибиотики могут быть лиофилизированы в соответствующем флаконе, а затем растворены ростовой средой, или же смешаны в виде индивидуальных растворов антибиотика, бетаина и бульона с получением того же результата. Первый вариант предпочтителен.

(3) Таким образом приготовьте бактериальный стоковый раствор, чтобы в каждый флакон или пробирку попало соответствующее количество клеток (т.е. от 100 до 10,000 кое). Количество клеток в таком стоковом растворе может быть доведено путем получения суспензии на основе стандартов Мак Фарланда, как это известно из уровня техники, с последующими разведениями.

(4) Инкубируйте планшеты, пробирки или флаконы в течение предопределенного времени и проверяйте рост одним из выбранных способов. Мониторинг роста может быть основан на высвобождении ¹⁴С (т.е., ВАСТЕС 12В: ВесЮмПхсЕхп^оп, Соскеу5У111е, МО), потреблении О₂ (Е8Р Мусо 8у5!ет ΙΙ™, ΩΙΕίΌ ЬаЬога!опе5, Эе!гой, МЦ изменениях рН (МВ/ВасТ®, Отдано η Текшка, ΌигЬат, ΝΟ) или на других стандартных способах, известных из уровня техники, таких как помутнение.

Такая панель может также использоваться для классификации клинических изолятов. Например, если известен механизм(ы), посредством которого бетаины проявляют свой эффект в отношении усиления антимикробной терапии, то подобная информация будет полезна при разработке более эффективных терапевтических схем в зависимости (или без зависимости) от применяемого сочетания бетаин-антибиотик. Таким образом, имеется два аспекта изобретения. Согласно первому аспекту, панель чувствительности к бетаину используется как средство классификации клинических изолятов. Подобная классификация направлена на выбор более эффективной терапевтической схемы вне зависимости от применения бетаина в качестве терапевтического адъюванта. Согласно второму аспекту, целью тестирования бетаиновой чувствительности является определение комбинации конкретного бетаиноподобного детергента (детергентов) и конкретным антибиотиком (антибиотиками) (как описано в следующем примере (пример 11).

α-4/β-2 α-4/β-3 α-4/β-4 α-4/β-5 α-5/β-2 α-5/β-Ί α-5/β-4 α-5/β-5

Пример 11. Применение бетаиноподобных детергентов в качестве терапевтических адъювантов.

Как следует из примера 10, имеется два аспекта тестирования чувствительности. Согласно одному аспекту, бетаиновая панель используется как классический тест на чувствительность для целей выбора более эффективной терапевтической схемы для элиминации инфекции, в частности, одного из антибиотиков панели, приведенной в примере 10. В этом случае терапевтическая схема не предусматривает использование бетаиноподобного детергента (детергентов) в качестве терапевтического адъюванта (адъювантов).

Согласно другому аспекту, терапевтическая схема основывается на использовании одной или нескольких комбинаций антибиотик: бетаиноподобный детергент, включенных в панель. В этом случае информация, полученная при использовании панели, приведенной в примере 10, указывает специалисту конкретную комбинацию антибиотика (антибиотиков) и бетаиноподобного детергента (детергентов). В этом случае бетаин должен взаимодействовать с больным. Цель настоящего примера состоит в описании использования бетаина (бетаинов) в качестве терапевтических адъювантов Данный пример служит иллюстрацией получения такой панели и не ограничивает объем изобретения.

Примеры и приведенные результаты показывают, что бетаиноподобные детергенты, обладая ограниченной антимикробной эффективностью при использовании в изолированном виде, наиболее эффективны при использовании в сочетании с одним или несколькими антибиотиками. Для того, чтобы любая антимикробная терапия была эффективна, антибиотик (антибиотики) должен быть доставлен к микроорганизму. Доставка антибиотика рег 5е в соответствии с заявленными способами может быть осуществлена стандартными методами, известными из уровня техники для доставки антибиотиков. Цель настоящего примера состоит в описании того, как бетаин (бетаины) могут быть доставлены к инфекционному агенту. Так, если больной проходит лечение адъювантом в соответствии с заявленными способами, по желанию бетаин (бетаины) могут вводиться одним способом, а антибиотик (антибиотики) - другим.

Стандартные способы доставки бетаиноподобного детергента (детергентов) известны из уровня техники и включают пероральное применение, внутримышечные инъекции, внутривенные капельницы, инъекции в место инфекции или ингаляцию. Однако бетаиноподобные детергенты являются поверхностно-активными веществами и будут не слишком хорошо переноситься при пероральном применении или

101

102 внутримышечных инъекциях. Например, проглатывание больших количеств бетаиноподобного детергента по всей вероятности может привести к нарушению работы желудочнокишечного тракта, а инъекция больших количеств бетаина может привести к солюбилизации клеточных структур, вызывая раздражение в месте инъекции. При использовании внутривенных капельниц должны быть предприняты меры предосторожности в отношении концентрации бетаина в крови. При том, что введение бетаина в дозе, превышающей критическую мицеллярную концентрацию (СМС) может быть переносимо, могут возникнуть осложнения при превышении его общего уровня в крови выше СМС из-за солюбилизации компонентов крови. Возможна также инъекция в место инфекции; однако, к сожалению, это возможно лишь в редких случаях, таких как туберкулезные повреждения или грануломатозные повреждения, например при диссеминированной инфекции МАС. В предпочтительном варианте осуществления изобретения бетаин(ы) вводится ингаляцией.

Туберкулез является прежде всего респираторной инфекцией. Туберкулезные повреждения обычно наблюдаются в верхних долях легких. Учитывая, что поверхность легких покрыта естественным сурфактантом, эффективный путь доставки бетаиноподобных детергентов к месту инфекции будет аналогичен доставке β-блокаторов и стероидов у астматиков. Например, некоторые стероиды и β-блокаторы обычно производятся в микрокристаллической форме, такой как УепЮБп® (выпускаемый А11еп & НапЬигу, подразделением компании О1ахо, Ке8еагсЬ Тпапд1е Рагк, N0).

При том, что изобретение полностью описано, квалифицированному специалисту будет понятно, что изобретение может быть осуществлено в широких и эквивалентных пределах условий, параметров и т.п., без нарушения идеи или объема изобретения или любого из вариантов его осуществления.

Claims (70)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, предусматривающий приведение микроорганизма, имеющего на своей внешней мембране структуры миколевой кислоты, в контакт с композицией, содержащей антибиотик и бетаиноподобный детергент, с последующей оценкой чувствительности указанного микроорганизма к указанному антибиотику на основе жизнеспособности указанного микроорганизма в указанной композиции.
2. 2. Способ по п. 1 , отличающийся тем, что указанный бетаиноподобный детергент выбран из группы, включающей СВ-подобные, 3Вподобные, НЗВ-подобные, РВ-подобные, С1Вподобные, РБВ-подобные, ЗоВ-подобные, йемВ подобные, АО-подобные, сАВ-подобные и 1тВподобные детергенты.
3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный СВ-подобный детергент имеет структуру к,

   Κ,-[α]„-β®-Κ₄-[γ]^θ

   I К₃ где К₁ является С₈-С₂₂;

   а является -СН₂-, -СН(ОН)-, -(СО)-NН-СН₂

   СН2СН2-, -О- или -С(0)-;

   η является 0 или 1;

   β является -Ν®-, -Р®-, или -3®-;

   Κ2 является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С₄Н₉-; Κ3 является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С₄Н₉-; Κ4 является -СН₂-, -С₂Н₄-, -С₃Н₆-, -С₄Н₈-, ^-^^5^^Н10^-, -С6Н12-, -СН2-С6Н4-, -СтН2т-,

   -СН(ОН)СН2 СН2-, -СН2 СН(ОН) СН2- или -С_тН_2т.1(ОН)-, где т > 1;

   γ является -СОО⁰.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный бетаиноподобный детергент выбран из группы, включающей №(карбоксиметил)-Н№диметил-1-гексадеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №. 693-33-4), кококарбоксиметилбетаин и САЗ® №. 68424-94-2), №(карбоксиметил)-Н№диметил-9-октадеценаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №.87137-4),

   Ν-( карбоксиметил) -Ν,Ν-диметил-З -((1 оксооктадецил)амино)-1 -пропанаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №.6179-44-8),

   3-амино-№карбоксиметил)-Н№диметил1 -пропанаминиум №С₈-С₂₂а цилпроизводные, внутреннюю соль (САЗ® №.840-44-0), №(карбоксиметил)-3-(( 12-гидрокси-1 оксо-9-окстадеценил)амиио)-Н№диметил-1пропанаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №.71850-81-2), кокоамидопропилкарбоксиметилбетаин (САЗ®№.61789-39-7 и САЗ® №.61789-40-0), №(2-карбоксиэтил)-Н№диметил-1 -додеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №. 16527-85-8), №(2-карбоксиэтил)-Н№диметил-1 -тридеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №. 132621-79-5), №(2-карбоксиэтил)-Н№диметил-1 -тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ^®

   №.69725-38-3), №(2-карбоксиэтил)-Н№диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ® №.42416-43-3), №(2-карбоксиэтил)-Н№диметил-1октадеканаминиум, внутреннюю соль (САЗ^® №.30612-73-8),

   103

   104

   Ν-додецил-бета-аланин (СА8® №.1462-540),

   N-(3 -карбоксипропил)^^-диметил-1 ундеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.150147-53-8),

   N-(3 -карбоксипропил)-^№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.15163-30-1),

   N-(3 -карбоксипропил)-^№диметил-1 тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.146959-90-2),

   N-(3 -карбоксипропил)-^№диметил-1 пентадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.146959-91-3),

   N-(3 -карбоксипропил)-^№диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.71695-32-4),

   N-(3 -карбоксипропил)-^№диметил-1 октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.78195-27-4), №(4-карбоксибутил)-^№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.120139-51-7),

   N-(5 -карбоксипентил)^^-диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.76392-97-7),

   N-(5 -карбоксипентил)^^-диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.73565-98-7), №(6-карбоксипентил)-^№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.132621-80-8),

   4-карбокси-№додецил-^№диметил-1 бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.71695-31-3),

   2-карбокси-№додецил-^№диметил-1 бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.71695-34-6),

   4-карбокси-№гексадецил-^№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.71695-33-5),

   2-карбокси-№гексадецил-^№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.71695-35-7), жирный глицинат (СА8® №.707-46-8), сойамидопропил карбоксиметилбетаин и бабассуамидопропил карбоксиметилбетаин.
5. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный карбоксибетаин является №(3-карбоксипропил)-Н№диметил-1 -октадеканаминиумом, внутренней солью (СВ-18) (СА8®

   №.78195-27-4).
6. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный 8В-подобный детергент выбран из группы, включающей 8В-18, 8В-16, 8В-14 и 8В12.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанная композиция содержит два или более бетаиноподобных детергента.
8. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный антибиотик является представителем класса, выбранного из группы, включающей β лактамный антибиотик, аминогликозид, аминоциклитол, хинолон, тетрациклин, макролид, линкозамид, гликопептид, липопептид, полипептидный антибиотик, сульфонамид, триметоприм, хлорамфеникол, изониазид, нитроимидазол, рифампицин, нитрофуран, метенамин и мупироцин.
9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный β-лактамный антибиотик выбран из группы, включающей пенициллиновые, цефалоспориновые, монобактамные и карбапенемные антибиотики.
10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный пенициллин выбран из группы, включающей азлоциллин, метициллин, нафциллин, клоксациллин, диклоксациллин, оксациллин, ампициллин, бакампициллин, карбенициллин, трикарциллин, мезлоциллин и пиперациллин.
11. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный цефалоспорин выбран из группы, включающей цефокситин, цефоперазон, цефтазидим, цефтриаксон, цефадроксил, цефазолин, цефалексин, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефрадин, цефаклор, цефамандол, цефоницид, цефоранид, цефпрозил, цефуроксим, лоракарбеф, цефметазол, цефотетан, цефиксим, цефотаксим, цефподоксим и цефтизоксим.
12. 12. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный монобактам является азтреонамом.
13. 13. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный карбапенем выбран из группы, включающей имипенем, меропенем, панипенем и биапенем.
14. 14. Способ по любому из пп.8-13, отличающийся тем, что указанная композиция также содержит ингибитор β-лактамазы.
15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный ингибитор β-лактамазы выбран из группы, включающей клавуланиковую кислоту, сульбактам и тазобактам.
16. 16. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный антибиотик является аминогликозидом или аминоциклитолом.
17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанные аминогликозид или аминоциклитол выбраны из группы, включающей стрептомицин, канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин, сисомицин, нетилмицин, неомицин, фрамицетин и паромомицин.
18. 18. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный хинолон выбран из группы, включающей наладиксиковую кислоту, оксолиниковую кислоту, циноксацин, флумеквин, милоксацин, розоксацин, пипемидиковую кислоту, норфлоксацин, эноксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин, темафлоксацин, флероксацин, пефлоксацин, амифлоксацин, спарфлоксацин, левофлоксацин, клинафлоксацин.
19. 19. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный макролид выбран из группы, вклю

    105

    106 чающей эритромицин, олеандомицин, спирамицин, йозамицин, розарамицин, кларитромицин, азитромицин, диритромицин, рокситромицин, флуритромицин и рокитамицин.
20. 20. Способ по п.8, отличающийся тем, что композиция содержит два или более антибиотика.
21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанные антибиотики являются сульфонамидом и триметопримом.
22. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный сульфонамид является сульфаметоксазолом.
23. 23. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный рифампицин выбран из группы, включающей рифампин, рифамицин 8ν, рифамицин В (рифамид) и рифабутин.
24. 24. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный антибиотик выбран из группы, включающей амикацин, азитромицин, любой βлактам в сочетании с любыми ингибиторами βлактамазы, капреомицин, цефметазол, цефокситин, ципрофлоксацин, кларитромицин, клофазамин, циклосерин, дапзон, эритромицин, этамбутол, этионамид, имипенем, изониазид, канамицин, миноциклин, офлоксацин, парааминосалициловую кислоту, протионамид, пиразинамид, рифампин, рифабутин, спарфлоксацин, сульфаметоксазол в сочетании с триметопримом, стрептомицином, тетрациклином, триацетазолом и виомицином.
25. 25. Способ антимикробной терапии инфицированного микроорганизмом больного или человека, подвергающегося риску инфекции микроорганизмом, имеющим на внешней мембране структуры миколевой кислоты, предусматривающий совместное введение данному больному бетаиноподобного детергента и антибиотика в таком количестве и на протяжении такого времени, которые достаточны чтобы убить указанный микроорганизм.
26. 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный бетаиноподобный детергент выбран из группы, включающей СВ-подобные, 8Вподобные, Н8В-подобные, РВ-подобные, С1Вподобные, РЬВ-подобные, 8оВ-подобные, ВсуВподобные, АО-подобные, сАВ-подобные и 1тВподобные детергенты.
27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный СВ-подобный детергент имеет структуру к₂

    I

    К.-И-β®-К₄-[γ]^θ

    I А где В! является С₈-С₂₂;

    α является -СН₂-, -СН(ОН)-, -(ί.Ό)-ΝΗ-ί.Ή_; СН₂СН₂-, -О- или -С(О)-;

    η является 0 или 1;

    β является -Ν^φ-, -Р^Ф- или -8^Ф-;

    В₂ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    В₃ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    В₄ является -СН₂-, -С₂Н₄-, -С₃Н₆-, -С₄Н₈-, -С5Н10-, -С6Н12-, -СН2-С6Н4-, -СтН2т-, -СН(ОН) СН2СН2-, -СН2 СН(ОН) СН2-, или -СтН2т-1 (ОН)-, где т>1;

    γ является -СОО⁰.
28. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный СВ-подобный детергент выбран из группы, включающей

    Ν-( карбоксиметил) -Ν,Ν-диметил-1 -гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 693-33-4), кококарбоксиметилбетаин и СА8® №. 68424-94-2), №(карбоксиметил)-^№диметил-9-октадеценаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.87137-4),

    Ν-( карбоксиметил) -Ν,Ν-диметил-З -((1 -оксооктадецил)амино)-1 -пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.6179-44-8),

    3-амино-№(карбоксиметил)-Н,№диметил-

    1 -пропанаминиум №С₈-С₂₂а цилпроизводные, внутреннюю соль (СА8® №.840-44-0), №(карбоксиметил)-3-(( 12-гидрокси-1 оксо-9-окстадеценил)амино)-Н,№диметил-1пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 71850-81-2), кокоамидопропилкарбоксиметилбетаин (СА8® №.61789-39-7 и СА8® №.61789-40-0), №(2-карбоксиэтил)-И,№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 16527-85-8), №(2-карбоксиэтил)-И,№диметил-1 -тридеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 132621-79-5), №(2-карбоксиэтил)-И,№диметил-1 -тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 69725-38-3), №(2-карбоксиэтил)-И,№диметил-1 -гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 42416-43-3), №(2-карбоксиэтил)-И,№диметил-1 -октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 30612-73-8),

    Ν-додецил-бета-аланин (СА8® №.1462-540),

    Ν-(3-карбоксипропил)-Н№диметил-1 ундеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 150147-53-8),

    Ν-(3 -карбоксипропил) -Ν,Ν-диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8®№. 15163-30-1),

    Ν-(3 -карбоксипропил) -Ν,Ν-диметил-1 тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.146959-90-2),

    Ν-(3 -карбоксипропил) -Ν,Ν-диметил-1 пентадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® №.146959-91-3),

    107

    108

    N-(3 -карбоксипропил)-И^-диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.71695-32-4),

    N-(3 -карбоксипропил)-И^-диметил-1 октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.78195-27-4), №(4-карбоксибутил)-И^-диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 120139-51-7),

    N-(5 -карбоксипентил)-И^-диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 76392-97-7), №(5-карбоксипентил)-И^-диметил-1-гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 73565-98-7), №(6-карбоксипентил)-И^-диметил-1 -додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 132621-80-8),

    4-карбокси-Ы-додецил-Н,№диметил-1 -бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 71695-31-3),

    2-карбокси-Ы-додецил-Н,№диметил-1 бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.71695-34-6),

    4-карбокси-Ы-гексадецил-Н,№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.71695-33-5),

    2-карбокси-Ы-гексадецил-Н,№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.71695-35-7), жирный глицинат (СА8® Ио.707-46-8), сойамидопропил карбоксиметилбетаин и бабассуамидопропилкарбоксиметилбетаин.
29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный карбоксибетаин является №(3-карбоксипропил)-И,№диметил-1 -октадеканаминиумом, внутренней солью (СВ-18) (СА8® Ио. 78195-27-4).
30. 30. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный 8В-подобный детергент выбран из группы, включающей 8В-18, 8В-16, 8В-14 и 8В12.
31. 31. Способ по любому из пп.26-30, отличающийся тем, что больному вводят два или более бетаиноподобных детергента.
32. 32. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный антибиотик является членом класса, выбранного из группы, включающей βлактамный антибиотик, аминоциклитол, хинолон, тетрациклин, макролид, линкозамид, гликопептид, липопептид, полипептидный антибиотик, сульфонамид, триметоприм, хлорамфеникол, изониазид, нитроимидазол, рифампицин, нирофуран, метенамин и мупироцин.
33. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный Ь-лактамный антибиотик выбран из группы, включающей пенициллиновые, цефалоспориновые, монобактамные и карбапенемные антибиотики.
34. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный пенициллин выбран из группы, включающей азлоциллин, метициллин, нафцил лин, клоксациллин, диклоксациллин, оксациллин, ампициллин, бакампициллин, карбенициллин, трикарциллин, мезлоциллин, пенициллин и пиперациллин.
35. 35. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный цефалоспорин выбран из группы, включающей цефокситин, цефоперазон, цефтазидим, цефтриаксон, цефадроксил, цефазолин, цефалексин, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефрадин, цефаклор, цефамандол, цефоницид, цефоранид, цефпрозил, цефуроксим, лоракарбеф, цефметазол, цефотетан, цефиксим, цефотаксим, цефподоксим и цефтизоксим.
36. 36. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный монобактам является азтреонамом.
37. 37. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный карбапенем выбран из группы, включающей имипенем, меропенем, панипенем и биапенем.
38. 38. Способ по любому из пп.32-37, отличающийся тем, что указанный способ также включает введение больному ингибитора βлактамазы.
39. 39. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанный ингибитор β-лактамазы выбран из группы, включающей клавуланиковую кислоту, сульбактам и тазобактам.
40. 40. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный антибиотик является аминогликозидом или аминоциклитолом.
41. 41. Способ по п.40, отличающийся тем, что указанные аминогликозид или аминоциклитол выбраны из группы, включающей стрептомицин, канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин, сисомицин, нетилмицин, неомицин, фрамицетин и паромомицин.
42. 42. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный хинолон выбран из группы, включающей наладиксиковую кислоту, оксолиниковую кислоту, циноксацин, флумеквин, милоксацин, розоксацин, пипемидиковую кислоту, норфлоксацин, эноксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин, темафлоксацин, флероксацин, пефлоксацин, амифлоксацин, спарфлоксацин, левофлоксацин и клинафлоксацин.
43. 43. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный макролид выбран из группы, включающей эритромицин, олеандомицин, спирамицин, йозамицин, розарамицин, кларитромицин, азитромицин, диритромицин, рокситромицин, флуритромицин и рокитамицин.
44. 44. Способ по п.32, отличающийся тем, что композиция содержит два или более антибиотика.
45. 45. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанные антибиотики являются сульфонамидом и триметопримом.
46. 46. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанный сульфонамид является сульфаметоксазолом.

    109

    110
47. 47. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный рифампицин выбран из группы, включающей рифампин, рифамицин 8У, рифамицин В (рифамид) и рифабутин.
48. 48. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный антибиотик выбран из группы, включающей амикацин, азитромицин, любой βлактам в сочетании с любыми ингибиторами βлактамазы, капреомицин, цефметазол, цефокситин, ципрофлоксацин, кларитромицин, клофазамин, циклосерин, дапзон, эритромицин, этамбутол, этионамид, имипенем, изониазид, канамицин, миноциклин, офлоксацин, парааминосалициловую кислоту, протионамид, пиразинамид, рифампин, рифабутин, спарфлоксацин, сульфаметоксазол в сочетании с триметопримом, стрептомицином, тетрациклином, триацетазолом и виомицином.
49. 49. Способ по п. 1 или 25, отличающийся тем, что указанный микроорганизм является МусоЬас!етшт.
50. 50. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанная Микобактерия выбрана из группы, включающей М.адп, М.аЬзсеззиз, М.асе!ат1бо1уйсит, М.аГлсапит, М.аюЫепзе, М.а81а!юит, М.аигит, М.аизгоаГпсапит, М.аушт, М.Ьоущ, М.Ьоу18 (ВС6), М.сйе1опае, М.сЬйае, М.сЬиЬиепзе, М. сооки, М.б1егпЬоГег1, М.биуа1и, М.Га11ах, М.Гагстодепез, М.Дауезсепз, М.Гойш!ит, М.дабшт, М.дазДт, М.дПуит, М.догбопае, М. ЬаеторШшт, Млп!гасе11и1аге, М.капзази, М.котоззепзе, М.1ергае, М.1ергаетигшт, М.тагтит, М.та1тоепзе, М.тюгой, М.топокаепзе, М.пеоаигит, М.попсЬготодешсит, М.оЬиепзе, М.рагаГопийит, М.рага!иЬегси1о818, М.регедгтит, М.рЬ1е1, М.рогстит, М.ропГегае, М.ри1уеи8, М.гЬобе81ае, М.зсгоГШасеит, М.зепеда1епзе, М.8Ыто1бе1, М.81Ш1ае, М.зтедтайз, М.зрЬадт, М.5/и1дак М.!еггае, М.111егтоге518ЙЬ1е, М.!ока1епзе, М.!пу1а1е, М.!иЬегси1о818, М.и1сегап8, М.уассае, М.хепорЬ
51. 51. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанная микобактерия является членом комплекса МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 (МТВ).
52. 52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанный микроорганизм является М.!иЬегси1о818.
53. 53. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный микроорганизм является членом комплекса МусоЬас!егшт аушт (МАС).
54. 54. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный микроорганизм является членом группы МА18.
55. 55. Композиция для проверки чувствительности микроорганизмов, имеющих на своей внешней мембране структуры миколевой кислоты, к антибиотикам, отличающаяся тем, что содержит один или несколько антибиотиков в смеси с одним или несколькими бетаиноподобными детергентами.
56. 56. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что хотя бы один из бетаиноподобных детергентов выбран из группы, включающей СВподобные, 8В-подобные, Н8В-подобные, РВподобные, ОВ-подобные, РЬВ-подобные, 8оВподобные, ВеуВ-подобные, АО-подобные, сАВподобные и 1тВ-подобные детергенты.
57. 57. Композиция по п.56, отличающаяся тем, что указанный СВ-подобный детергент имеет структуру к₂ I β®-К<-[γ]^θ I в, где В₁ является С₈-С₂₂;

    α является -СН₂-, -СН(ОН)-, -(СО)-Ж-СН₂ СН2СН2-, -О- или -С(О)-;

    η является 0 или 1;

    β является -Ν®-, -Р®- или -8®-;

    В₂ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    В₃ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    В₄ является -СН₂-, -С₂Н₄-, -С₃Н₆-, -С₄Н₈-, -С5Н10-, -С6Н12-, -СН2-С6Н4-, -СтН2т-, -СН(ОН) СН₂СН₂-, -СН₂СН(ОН)СН₂- или -С_тН_2т-1(ОН)-, где т>1;

    γ является -СОО⁰.
58. 58. Композиция по п.57, отличающаяся тем, что указанный СВ-подобный детергент выбран из группы, включающей

    Ы-(карбоксиметил)-Ы,Ы-диметил-1-гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ыо. 693-33-4), кококарбоксиметилбетаин и СА8® №. 68424-94-2),

    Ы-(карбоксиметил)-Ы,Ы-диметил-9-октадеценаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.87137-4),

    Ν-( карбоксиметил) -Ы,Ы-диметил-3 -((1 оксооктадецил)амино)-1 -пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® №.6179-44-8),

    3-амино-Ы(карбоксиметил)-Ы,Ы-диметил1 -пропанаминиум №С₈-С₂₂а цилпроизводные, внутреннюю соль (СА8® №.840-44-0),

    Ы-(карбоксиметил)-3-(( 12-гидрокси-1оксо-9-окстадеценил)амино)-Ы,Ы-диметил-1пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 71850-81-2), кокоамидопропилкарбоксиметилбетаин (СА8® №.61789-39-7 и СА8® №.61789-40-0),

    Ы-(2-карбоксиэтил)-Ы,Ы-диметил-1 -додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 16527-85-8),

    Ы-(2-карбоксиэтил)-Ы,Ы-диметил-1 -тридеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 132621-79-5),

    Ы-(2-карбоксиэтил)-Ы,Ы-диметил-1 -тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® №. 69725-38-3),

    111

    112

    Ы-(2-карбоксиэтил)-Ы,Ы-диметил-1 -гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8®

    Νο.42416-43-3),

    Ы-(2-карбоксиэтил)-Ы,Ы-диметил-1 -октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Νο. 30612-73-8),

    Ν-додецил-бета-аланин (СЛ8® Νο.1462-540), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1ундеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 150147-53-8), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 15163-30-1), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο.146959-90-2), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1пентадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο.146959-91-3), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Νο.71695-32-4), №(3-карбоксипропил)-Н^диметил-1октадеканаминиум, внутреннюю соль СА8^® Νο.78195-27-4),

    N-(4-карбоксибутил УМЖдиметил-1 -додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Νο. 120139-51-7), №(5-карбоксипентил)-Н№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 76392-97-7), №(5-карбоксипентил)-^№диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 73565-98-7), №(6-карбоксипентил)-^№диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 132621-80-8),

    4-карбокси-№додецил-^№диметил-1 бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Νο. 71695-31-3),

    2-карбокси-№додецил-Н№диметил-1 бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 71695-34-6),

    4-карбокси-№гексадецил-Н№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο.71695-33-5),

    2-карбокси-№гексадецил-^№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο.71695-35-7), жирный глицинат (СА8® Νο.707-46-8), сойамидопропил карбоксиметилбетаин и бабассуамидопропил карбоксиметилбетаин.
59. 59. Композиция по п.58, отличающаяся тем,что указанный карбоксибетаин является Ν(3-карбоксипропил)-^№диметил-1-октадеканаминиумом, внутренней солью (СВ-18) (СА8® Νο.78195-27-4).
60. 60. Композиция по п.56, отличающаяся тем, что указанный 8В-подобный детергент выбран из группы, включающей 8В-18, 8В-16, 8В14 и 8В-12.
61. 61. Композиция по любому из пп.55-60, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит два или более бетаиноподобных детергента.
62. 62. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что указанный антибиотик является членом класса, выбранного из группы, включающей βлактамный антибиотик, аминоциклитол, хинолон, тетрациклин, макролид, линкозамид, гликопептид, липопептид, полипептидный антибиотик, сульфонамид, триметоприм, хлорамфеникол, изониазид, нитроимидазол, рифампицин, нирофуран, метенамин и мупироцин.
63. 63. Набор для определения чувствительности микроорганизмов, имеющих на внешней мембране структуры миколевой кислоты, к антибиотикам, отличающийся тем, что он содержит один или несколько бетаиноподобных детергентов и один или несколько антибиотиков в непосредственной близости или соседстве.
64. 64. Набор по п.63, отличающийся тем, что хотя бы один из бетаиноподобных детергентов выбран из группы, включающей СВ-подобные, 8В-подобные, Н8В-подобные, РВ-подобные, С1В-подобные, РИВ-подобные, 8οΒ-подобные, ЯеνΒ-подобные, АО-подобные, сАВ-подобные и 1тВ-подобные детергенты.
65. 65. Набор по п.64, отличающийся тем, что указанный СВ-подобный детергент имеет структуру

    К₂ I κ-[«]_π-β®-κ₄-[γ]^θ I к₃ где Я] является С₈-С₂₂;

    α является -СН₂-, -СН(ОН)-, -(СО)-КН-СН₂ СН2СН2-, -О- или -С(О)-;

    η является 0 или 1;

    β является -Ν®-, -Р®- или -8®-;

    Я₂ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    Я₃ является -Н, -СН₃-, -С₂Н₅-, -С₃Н₇- или -С4Н9-;

    Яд является -СН₂-, -С₂Н₄-, -С₃Н₆-, -С₄Н₈-, -С5Н10-, -С6Н12-, -СН2-С6Н4-, -СтН₂т-, -СН(ОН) СН₂СН₂-, -СН₂СН(ОН) СН₂- или -СтН^./ОН)-, где т>1;

    γ является -СОО®.
66. 66. Набор по п.65, отличающийся тем, что указанный СВ-подобный детергент выбран из группы, включающей №(карбоксиметил)-Н^диметил-1-гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 693-33-4), кококарбоксиметилбетаин и СА8^® Νο. 68424-94-2), №(карбоксиметил)-Н^диметил-9-октадеценаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Νο. 871-37-4),

    113

    114

    И-(карбоксиметил)-И,И-диметил-3 -((1 оксооктадецил)амино)-1 -пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.6179-44-8),

    3-амино -Ν( карбоксиметил)-И,И-диметил1 -пропанаминиум И-С₈-С₂₂ацилпроизводные, внутреннюю соль (СА8® Ио.840-44-0), №(карбоксиметил)-3 -((12-гидрокси-1 оксо-9-окстадеценил)амино)-Х№диметил-1пропанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 71850-81-2), кокоамидопропилкарбоксиметилбетаин (СА8® Ио.61789-39-7 и СА8® Ио.61789-40-0), №(2-карбоксиэтил)-^№диметил-1-додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 16527-85-8),

    N-(2 -карбоксиэтил)-^№диметил-1 -триде канаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 132621-79-5), №(2-карбоксиэтил)-Х№диметил-1-тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 69725-38-3), №(2-карбоксиэтил)-Х№диметил-1-гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^®

    Ио.42416-43-3), №(2-карбоксиэтил)-Х№диметил-1-октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 30612-73-8), №додецил-бета-аланин (СА8® Ио.1462-540),

    N-(3 -карбоксипропил)^^-диметил-1 ундеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 150147-53-8),

    N-(3 -карбоксипропил)-Х^диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио. 15163-30-1),

    N-(3 -карбоксипропил)^^-диметил-1 тетрадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.146959-90-2),

    И-(3 -карбоксипропил)-Х^диметил-1 пентадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.146959-91-3),

    N-(3 -карбоксипропил)-Х^диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.71695-32-4),

    И-(3 -карбоксипропил)-И,И-диметил-1 октадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.78195-27-4), №(4-карбоксибутил)-Х^диметил-1додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.120139-51-7),

    И-(5-карбоксипентил)-И,И-диметил-1додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.76392-97-7),

    N-(5 -карбоксипентил) -Н^диметил-1 гексадеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.73565-98-7),

    N-(6 -карбоксипе нтил) -Н^диметил-1 додеканаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.132621-80-8),

    4-карбокси-№додецил-Х№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.71695-31-3),

    2-карбокси-№додецил-Х№диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.71695-34-6),

    4-карбокси-№гексадецил-Х^диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8^® Ио.71695-33-5),

    2-карбокси-№гексадецил-Х^диметил-1бензенметанаминиум, внутреннюю соль (СА8® Ио.71695-35-7), жирный глицинат (СА8® Ио.707-46-8), сойамидопропил карбоксиметилбетаин и бабассуамидопропил карбоксиметилбетаин.
67. 67. Набор по п. 66, отличающийся тем, что указанный карбоксибетаин является №(3-карбоксипропил)-Ц№диметил-1-октадеканаминиумом, внутренней солью (СВ-18) (СА8®

    Ио.78195-27-4).
68. 68. Набор по п.64, отличающийся тем, что указанный §В-подобный детергент выбран из группы, включающей 8В-18, 8В-16, 8В-14 и 8В12.
69. 69. Набор по любому из пп.63-68, отличающийся тем, что указанный набор содержит коллекцию различных бетаиноподобных детергентов.
70. 70. Набор по п.63, отличающийся тем, что указанный антибиотик является представителем класса, выбранного из группы, включающей βлактамный антибиотик, аминогликозид, аминоциклитол, хинолон, тетрациклин, макролид, линкозамид, гликопептид, липопептид, полипептидный антибиотик, сульфонамид, триметоприм, хлорамфеникол, изониазид, нитроимидазол, рифампицин, нитрофуран, метенамин и мупироцин.