EA006599B1 - Способ повышения экспрессии опухолевого антигена с применением тималфазина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение предлагает способ повышения экспрессии антигена опухолевых клеток, заключающийся в введении в клетки тималфазина в количестве, достаточном для того, чтобы повысить экспрессию ОСА по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток. Также предложены способы повышения чувствительности иммунодиагностического или иммунотерапевтического методов, включающие предварительную обработку опухолевых клеток-мишеней посредством введения в клетки тималфазина в количестве, достаточном для того, чтобы повысить экспрессию ОСА по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток, с последующим использованием иммунодиагностического или иммунотерапевтического метода. Эти способы применимы к диагностическим методам как in vivo, так и in vitro, и к иммунотерапевтическим методам in vivo.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет по ранее поданной заявке 60/391969 от 28 июня 2002 г.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области диагностики и терапии рака, а также к использованию тималфазина (тимозина α-1) в диагностике и лечении рака.

Уровень техники

Разработка вакцин от рака, методов иммунной визуализации и доставки лекарственных средств базируется на идентификации специфических молекулярных мишеней (например, опухолевых антигенов), которые расположены на мембране опухолевой клетки и, по существу, представлены молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 (ГКГ-1). Идентификация антигена по-прежнему является центральной проблемой в иммунотерапии опухолей, в частности, в разработке вакцины от рака. Несмотря на то, что идентифицировано большое количество опухолеспецифических антигенов, низкий уровень экспрессии данных антигенов и/или их непостоянное представление молекулами ГКГ-1 затрудняют развитие иммунотерапии и методов иммунодиагностики, достаточно специфичных и чувствительных для того, чтобы обнаружить присутствие раковых клеток и уничтожить их. Повышенная чувствительность для выявления опухолевых антигенов позволяет диагностировать заболевание и проводить лечение на ранних стадиях при наличии меньшего количества опухолевых клеток, а также проводить более интенсивную терапию при метастазировании.

Ранее было показано, что опухолеспецифический антиген (ОСА) экспрессируется как в опухолях человека, так и в экспериментальных опухолях и имеет консервативную последовательность. В связи с этим ОСА является хорошей мишенью для иммунодиагностических и иммунотерапевтических методов, однако, уровень экспрессии ОСА, как и большинства молекулярных мишеней опухолей, ниже уровня, необходимого для подобных целей.

Тимозин α-1, или тималфазин, является пептидом, состоящим из 28 аминокислотных остатков, который в норме обнаруживается в циркулирующей крови. Тималфазин стимулирует рост и дифференциацию тимоцитов, образование ИЛ-2, Т-клеточных ИЛ-2-рецепторов, ИТФа и ИТФу. ВахеуапХ, 1990; Вер1ег, 1994; 8етга1е, 1987; 81хет, 1989. Также было показано, что тимозин α-1 повышает экспрессию ГКГ класса I. СшИаш, 2000. Тималфазин исследовали в качестве терапевтического средства для лечения различных заболеваний, в том числе хронических гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД), подавленного ответа на вакцинацию и рака. Апбтеопе, 1996; Оатас1, 1998, 2000; ОгауепЛеш, 1986; МШсйшск, 1999; Зкегшап, 1998.

Краткое описание изобретения

Было обнаружено, что тималфазин способен усиливать экспрессию ОСА на клетках колоректального рака как ίη νίίτο, так и ίη νίνο. Такая повышенная экспрессия ОСА позволяет усовершенствовать разнообразные диагностические и терапевтические методы за счет повышенной направленности на раковые клетки, например методы радиоиммунохирургии или иммуносцинтиграфические методы. Возможность повышения экспрессии опухолевого антигена при нетоксичном лечении, например, тималфазином, могло бы быть весьма полезным как для терапевтических, так и для диагностических целей, поскольку позволило бы осуществлять более раннее выявление и лечение раковых заболеваний, а также проводить более интенсивное и полное лечение поздних стадий рака, особенно метастатических раков.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - ОСА экспрессируется на мембране клеток колоректального рака линии ΌΗΌ-Κ12;

фиг. 2 - экспрессия ОСА на поверхности клеток колоректального рака линии \У|Эг увеличивается в результате обработки тималфазином;

фиг. 3 - экспрессия ОСА на опухолевых клетках асцитов увеличивается в результате обработки животных тималфазином.

Подробное описание

Экспрессию ОСА антигена можно увеличивать путем обработки тималфазином. Повышенная экспрессия могла бы привести к более эффективным СТЬ ответам в результате индукции специфической популяции СЭ8. Кроме того, такая повышенная экспрессия могла бы способствовать лучшему обнаружению клеток и нацеливанию на них при проведении иммуноориентированной радиотерапии или иммуно-сцинтиграфических методов. Более того, наличие экспериментальной опухоли, для которой свойственно экспрессировать человеческий антиген, могло бы иметь широкое применение в разработке предклинических моделей. Усиление экспрессии опухолевого антигена методами настоящего изобретения повышает чувствительность как диагностических, так и иммунотерапевтических методов, что, в свою очередь, делает возможным более раннее обнаружение и лечение раковых заболеваний, а также проведение более интенсивного и полного лечения поздних стадий рака, включая метастатические раковые заболевания.

Определение дозы пептида тималфазина, необходимое для повышения экспрессии ОСА, можно установить экспериментальным путем с помощью обычных методов титрования. Повышение регуляции ОСА может быть достигнуто ίη νίνο при введении тималфазина в дозе от 2 мкг/кг до 6 мг/кг массы тела, предпочтительно от 20 до 200 мкг/кг. Установлено, что тималфазин безопасен при введении в таких высоких дозах, как 16 мг/дозу/сутки для людей и 6 мг/кг/сутки для крыс.

Тималфазин можно вводить одним из известных способов, например путем инъекций или вливаний внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или непосредственно в окружающую опухоль область. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пептид тималфазин представлен в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекций, физиологический раствор или другой подобный растворитель. Период полувыведения из плазмы введенного подкожно тималфазина составляет всего около 2 ч. Κοχ( и др., 1998. Однако конъюгация полимера с пептидом тималфазином существенно увеличивает период его полувыведения из плазмы. Каи и др. (неопубликованные результаты). При использовании в контексте конъюгированного тималфазина, указанные выше дозировки отражают только представленный в композиции пептид тималфазин без учета веса конъюгированного с ним полимера.

Выделение, характеристика и использование тималфазин-пептидов описывается, например, в патентах И8 4079127, И8 4353821, И8 4148788 и И8 4116951. В настоящем изобретении могут быть использованы такие тималфазин-пептиды, как природный тималфазин, синтетический тималфазин и рекомбинантный тималфазин, имеющие аминокислотную последовательность природного тималфазина, аминокислотные последовательности в значительной степени близкие природному тималфазину, или форму укороченной последовательности; также в настоящем изобретении могут использоваться биологически активные аналоги, в состав которых входят модифицированные последовательности (замещения, делеции, элонгации, замены и др.), обладающие биологической активностью, в значительной степени близкой активности тималфазина, например тималфазин-пептид, чья аминокислотная последовательность имеет достаточную гомологию аминокислотной последовательности тималфазина, что позволяет ему функционировать, по существу, тем же способом, что и тималфазин, и с той же активностью.

Пример 1 (ίη νίΐτο).

Клеточные линии колоректального рака νίΌτ (человека), 1А-Хх8ВК (крысы) и ΌΗΌ-Κ12 (крысы) обрабатывают тималфазином в концентрации 5-100 мкг/мл в течение 6-48 ч. Экспрессию антигена ОСА определяют посредством проточной цитометрии (ПЦ) и локализацию антигена - посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), используя ОСА-антисыворотку, полученную против белкового эпитопа ОСА (С8Н-275), состоящего из 9 аминокислот.

ОСА естественным образом экспрессируется во всех трех клеточных линиях колоректального рака, как в цитоплазме, колеблясь в пределах 30-55% клеток (при использовании ПЦ и КЛСМ после повышения проницаемости), так и на клеточной мембране, колеблясь в пределах 10-20% клеток (методом ПЦ).

Фиг. 1. Тималфазин может увеличивать экспрессию данного антигена во всех исследованных клеточных линиях.

Фиг. 2. Уровень повышения экспрессии и локализация на мембране в сравнении с цитоплазмой варьирует в зависимости от дозировки и времени обработки и может достигать уровней экспрессии 90% клеток.

Пример 2 (ίη νίνο).

Крысам линии ΒΌ-ΙΧ вводят внутрибрюшинно изогенные клетки ΌΗΌ-Κ12 и обрабатывают тималфазином внутрибрюшинно или подкожно. Экспрессию и локализацию ОСА определяют, как описано выше, на опухолевых клетках, полученных как от асцитов, так и от опухолевых образований.

Опухолевые клетки животных, обработанных тималфазином, показывают увеличение экспрессии ОСА подобное таковому, наблюдаемому ίη νίΐτο. Фиг. 3.

Библиография

Апбгсопс Р., Стихаю С., Сгатсп/ί А., е( а1. А гапбопи/сб соп1го11сб 1па1 οΓ Ιΐινηιοχίη а1рйа 1 усгхпх йИсгГсгоп а1рйа 1геа1теп1 ίη ρηΐίοηΐχ \νίΐΗ Πορηΐίΐίχ В е ап11§еп ηηΐί6ο6ν - апб Πορηΐίΐίχ В νίιυχ ΌΝΑ - ροχίΐίνο сйгошс йераййх Β, НераЮкду 24(4), 1996, сс. 774-777.

Вахехатх С-Ν., еΐ а1., Епйапсетеп( οΓ йитап Т 1утрйοсуΐе ΓιπκΙίοη Ьу ргсЦйупюхш а1рйа: шсгеахеб ргобис1юп οΓ 1п1ег1еик1п-2 апб ехргеххюп οΓ 1п1ег1еик1п-2 гесерФтх ίη ηοππηΐ йитап репрйета1 Νοο6 Т 1утрйοсуΐеχ, Iттиηοрйа^тасο1. ΙπππποϊοχκοΕ 12(4), 1990, сс. 595-617.

Вер1ег С., ΤίΛτιιοχίη а1рйа-1 ах аб)ипс1 Γοτ сοηνеηΐ^οηа1 (йегару οΓ тайдпап( Ишюгх: а ге\зе\\·. Сапсег [пуехЕ 12, 1994, сс. 491-496.

Сагас1 Е., еΐ а1. А ^аηбοт^ζеб ^πϊτο1Ε6 хШбу Γοτ (йе еνа1иаΐ^οη οΓ (йе асЬтИу οΓ а 1пр1е ^ιιιΝηηΙίοη οΓ ζ^бονиб^ηе, (йуц-юхт а1рйа 1, апб ^ηΐе^Γе^οη а1рйа ίη ΗIV-^ηΓесΐеб шбМбиа1х \\йй СЭ4 οοϋηΐδ ЬеЕуееп 200 апб 500 се11х/тт³, Ап(Мга1 Тйег. 3, 1998, сс. 103-111.

Сатаа Е., Рка Е., Ках1 С., апб ЕатаШ С. ТИу-пюхт а1рйа 1 ίη (йе 1геа1теп1 οΓ сапсег: Егот Ьахк гехеагсй ΐο сйшса1 арр11са1юп, Ιηΐ. 1. [ттшюрйагт. 22, 2000, сс. 1067-1076.

Сшйат С., Nарοйΐаηο С., ΜηχΙίηο А., Эа νίι^ηζο 8., ΟΆβοχΙίηί С., СгеШ 8., Виса I., 8шдет Ό.8., ΚοΗη Ь.О., Μοηοοο Е., Сагас1 Е. & ЕатаШ С. Τйутοχ^η-а1 гедп1а1ех МНС с1ахх I ехргеххюп ίη ЕК.ТЬ-5 се11х аΐ ΐ^аηχс^^рΐ^οηа1 1сус1, Еиг. 1. [ттшю1. 30, 2000, сс. 778-786.

Сгауепх1еш 8., Егхй1ег ν.Β., Огитахкш 8., 8сй\таЬ К., Уекх1ег М.Е., АпЦ-шПиегиа аηΐ^Ьοбу ^еχрοηχе: аидтеηΐаΐ^οη ίη е1бег1у ηοη-^еχрοηбе^χ Ьу [йунюхт а1рйа 1, Се^οηΐο1οд^χΐ 26, 1986, с. 150А.

-2006599

Ми1сЬшск М.О. е! а1. Ткутозш а1рка 1 1теа!теп1 о£ скготс кераййз В: гезийз о£ а рказе III шиШееп1ге, гапдот1/ед, доиЬ1е-Ь1тд апд р1асеЬо-соп!го11ед з!иду,, I. У1га1 Нер. 6, 1999, ее. 397-403.

Коз! К.Б., \\'1епс11 Мазауик Р., Ти!кШ С.^. апд Неггшапп \\'.М. Ркагтасокшейсз о£ 1кутозт α1 айег зиЬси!апеоиз 1п|ее!1'оп о£ !кгее дйГегеп! £огти1а!юпз ΐη кеаЙку уо1ип!еегз, Еиг. I. С11п. Ркагтасо1. 37, 1998, се. 51-57.

8егга!е 8., 8ски1о£ К., ЬеопдапФз Б., Оо1дз!ет А.Б., 8/1ет М.В. Моди1айоп о£ китап па!ига1 кШег се11 су!о!ох1с ас!1У11у, 1утркокте ргодисйоп, апд т!ег1еикт 2 гесер!ог ехргеззюп Ьу 1кут1с когтопез, I. 1ттипо1. 139, 1987, се. 2338-2343.

Зкегтап К.Е., Зкегтап 8.Ν. «кПечТетоп р1из 1кутозт а1рка 1 !геа!теп! о£ скгошс кераййз С Ыесйоп: а те!а-апа1уз1з,» в «Ткегар1ез £ог У1га1 Нераййз» (ред. ЗсЫпаг!, КР, 8оттадозз1, Ι-Р, Ткотаз, НС), 1п!егпа!юпа1 Мед1са1 Ргезз, 1998, се. 379-383.

З^ет М. апд Зегга!е 8. СкагасЮп/аиоп о£ !ке 1ттипогеди1а!огу ргорегИез о£ 1кутозт а1рка 1 оп т!ег1еикт-2 ргодисйоп апд т!ег1еикт-2 гесер!ог ехргеззюп т погта1 китап 1утркосу!ез, 1п!. I. 1ттипоркагтасо1. 11, 1989, се. 789-800.

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ повышения экспрессии опухолевого антигена, включающий обработку опухолевых клеток тималфазином в количестве, достаточном для повышения экспрессии опухолевого антигена по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток.
2. 2. Способ по п.1, в котором введение проводят больному ш у1уо.
3. 3. Способ по п.2, в котором тималфазин вводят в дозе от 2 мкг/кг веса тела до 6 мг/кг массы тела.
4. 4. Способ по п.3, в котором тималфазин вводят в дозе от 20 до 200 мкг/кг массы тела.
5. 5. Способ по п.1, в котором указанным опухолевым антигеном является ОСА.
6. 6. Способ повышения чувствительности иммунодиагностического или иммунотерапевтического способа, включающий предварительную обработку опухолевых клеток-мишеней посредством введения в клетки тималфазина в количестве, достаточном для повышения экспрессии опухолевого антигена по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток, с последующим использованием иммунодиагностического или иммунотерапевтического метода.
7. 7. Способ по п.6, в котором введение проводят больному ш у1уо.
8. 8. Способ по п.7, в котором тималфазин вводят в дозе от 2 мкг/кг массы тела до 6 мг/кг массы тела.
9. 9. Способ по п.8, в котором тималфазин вводят в дозе от 20 до 200 мкг/кг веса тела.
10. 10. Способ по п.1, в котором введение проводят в клетки ш уйго.
11. 11. Способ по п.6, в котором введение проводят в клетки ш уйго.