DK2788499T3

DK2788499T3 - Udvidet rod for polymer-tags

Info

Publication number: DK2788499T3
Application number: DK12795266.1T
Authority: DK
Inventors: Michael P Weiner
Original assignee: Illumina Inc
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2016-03-21
Also published as: US20140342921A1; EP2788499B1; WO2013085710A3; US9200274B2; EP2788499A2; WO2013085710A2; US20160083718A1; US9909121B2

Claims

1. Fremgangsmåde omfattende (a) at tilvejebringe en flerhed af nukleinsyremolekyler, omfattende enkeltvise nukleinsyretyper med en tag-sekvens, hvor tag-sekvensen omfatter sekvensen (N-i)n(N2)n, hvor Ni and N2 er nukleotider, der hver især komplementerer forskellige nu-kleotider, hvor n er et heltal, der ikke er nul, og som kan variere for Ni og N2, hvor flerheden af nukleinsyremolekyler omfatter mindst 48 af tagsekvenserne, der ikke er ens; (b) at detektere de enkeltvise nukleinsyrer under betingelser til at skelne signalintensiteter for (N-i)n-sekvenser med forskellige værdier for n og til at skelne signalintensiteter for (N2)n-sekvenser med forskellige værdier for n; og (c) at skelne nukleinsyre-tags baseret på signalintensiteterne, der blev detek-teret i trin (b).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor tag-sekvensen omfatter sekvensen (Ni)n(N2)n(N3)n, hvor N-ι, N2 og N3 er nukleotider, der hver især komplementerer forskellige nukleotider, hvor n er et heltal, der ikke er nul, og som kan variere for N-ι, N2 og N3, og hvor trinnet (b) omfatter at detektere de enkeltvise nukleinsyrer under betingelser til at skelne signalintensiteter for (N-i)n-sekvenser med forskellige værdier for n, til at skelne signalintensiteter for (N2)n-sekvenser med forskellige værdier for n og til at skelne signalintensiteter for (N3)n-sekvenser med forskellige værdier for n.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor tag-sekvensen omfatter sekvensen (Ni)n(N2)n(N3)n(N4)n, hvor N-ι, N2, N3 og N4 er nukleotider, der hver især komplementerer forskellige nukleotider, hvor n er et heltal, der ikke er nul, og som kan variere for N-ι, N2, N3 og N4, og hvor trin (b) omfatter at detektere de enkeltvise nukleinsyrer under betingelser til at skelne signalintensiteter for (Ni)n-sekvenser med forskellige værdier for n, til at skelne signalintensiteter for (N2)n-sekvenser med forskellige vær dier for n, til at skelne signalintensiteter for (N3)n-sekvenser med forskellige værdier for n og til at skelne signalintensiteter for (N4)n-sekvenser med forskellige værdier for n.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,2 eller 3, hvor tag-sekvensen for hver af de enkeltvise nukleinsyretyper i flerheden har samme længde.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor detektering af trin (b) omfatter: (i) at bringe nukleinsyremolekylerne i kontakt med en primer og en polymerase, (ii) at levere nukleotid Ni eller komplementet deraf under betingelser til at udvide primeren til dannelse af en udvidet primer, omfattende en sekvens (N-i)n eller komplementet deraf, (iii) at detektere de enkeltvise nukleinsyrer under betingelser til at skelne signalintensiteter for (N-i)n-sekvenser med forskellige værdier for n, og (iv) sekventielt at gentage trinnene (ii) og (iii) for efterfølgende nukleotider N2, N3 eller N4 eller komplementer deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor detekteringen omfatter at detektere frigivelsen af pyrophosphat eller protoner ved tilsætning af nukleotiderne eller komplementerne deraf, når primeren udvides, og/eller hvor nukleotiderne eller komplementerne deraf ikke omfatter en blokeringsenhed, når de tilsættes til primeren.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor nukleotiderne eller komplementerne deraf omfatter mærker, og hvor detekteringen omfatter at detektere mærkerne, og eventuelt hvor det samme mærke fastgøres til forskellige typer af nukleotiderne eller komplementerne deraf.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor de enkeltvise nukleinsyrer detekteres i et array.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor detekteringen af trin (b) omfatter: (i) at bringe nukleinsyremolekylerne i kontakt med en primer og en polymerase, (ii) at levere en blanding, der omfatter nukleotid Ni og nukleotid N2 eller komplementerne deraf under betingelser til at udvide primeren til dannelse af en udvidet primer, der omfatter en sekvens (Ni)n(N2)n eller komplementet deraf, og (iii) at detektere de enkeltvise nukleinsyrer under betingelser til at skelne signalintensiteter for (Ni)n(N2)n-sekvenser med forskellige værdier for n.

10. Fremgangsmåde til identificering af tag-sekvenser, omfattende (a) at tilvejebringe en flerhed af nukleinsyremolekyler, hvor forskellige nukleinsyremolekyler i flerheden omfatter forskellige tagsekvenser, hvor de forskellige tag-sekvenser omfatter mindst to forskellige nukleotidty-per, der hver især har et forskelligt mærke; (b) at detektere hvert af nukleinsyremolekylerne i nærvær af de mindst to forskellige nukleotidtyper, der hver især har et forskelligt mærke; (c) at skelne mængden af de to forskellige mærker eller forholdet mellem de to forskellige mærker for nukleinsyremolekylerne; og (d) at identificere tag-sekvenserne baseret på mængden af de to forskellige mærker eller forholdet mellem de to forskellige mærker.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, endvidere omfattende at skelne nukleinsyremolekylerne på baggrund af tag-sekvenserne, der blev identificeret i trin (d).

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor nukleinsyremolekylerne detekteres i et array af nukleinsyremolekylerne.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor trinnet (c) omfatter at skelne mængden af de to mærker, der kan skelnes, og forholdet mellem de to mærker, der kan skelnes, til nukleinsyremolekylerne.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor de forskellige tag-sekvenser omfatter mindst tre forskellige nukleotidtyper, hvor de mindst tre forskellige nu- kleotidtyper har forskellige mærker.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor de forskellige tag-sekvenser omfatter mindst fire forskellige nukleotidtyper, hvor de mindst fire forskellige nu-kleotidtyper har forskellige mærker.