DK173131B1 - Human alfa1-antitrypsinvariant og præparat omfattende en sådan variant - Google Patents

Description

*1 DK 173131 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt variant af humant o-j,-antitrypsin samt farmaceutiske præparater omfattende en sådan variant.

Der er tidligere beskrevet forskellige varianter af humant a^-anti-5 trypsin, især i international patentansøgning nr. WO 86/00337.

Den væsentligste funktion af or1-antitrypsin (α^-ΑΤ) er inhibering af neutrofil elastase i lungerne.

o^-AT spiller ingen rolle in vivo for reguleringen af koagulations-proteasen thrombin, ikke mere end fasekontakt-proteaserne faktor XII 10 og kallikrein.

Imidlertid fører substitution af Met-radikalet i stilling PI i det reaktive centrum af (Met35®)α^-ΑΤ med et argininradikal til effektiv inhibering af disse proteaser, hvilket påviser radikalets kritiske rolle i PI for den specifikke inhibering.

15 Det har endvidere kunnet påvises, at radikalet i P2 (stilling 357 i -a^-AT) ligeledes er vigtigt, for det første for at bevare en passende konformation af de reaktive centre og for det andet ved at påvirke de inhiberende egenskaber.

Fx har antithrombin III (AT-III), som er en specifik inhibitor af 20 thrombin xn vivo, et Arg-radikal (foretrukket spaltningssted for thrombin) i stilling PI og et Gly-radikal i stilling P2. Inhibitoren Cl, som er en dominerende inhibitor af kallikrein og af faktor XII, har også et arginin-radikal i stilling PI, men et Ala-radikal i stilling P2. Inhibitoren Cl er in vivo relativt ineffektiv med hensyn til 25 thrombin, hvilket måske afspejler en mindre størrelse af det aktive sted i tilfælde af dette enzym.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt variant af humant ffj-AT, i hvilken stillingerne PI og P2 er blevet modificeret på en sådan måde, at man forsøger at formindske omfanget af målet i denne 30 variant.

•i" 2 DK 173131 B1

Opfindelsen angår en variant i stilling 357 og eventuelt i stilling 358 af humant or^-AT eller af (åGlu1 -* Gly5)a1-AT.

Ved at erstatté prolin i stilling 357 med et Ala-radikal gendannes det reaktive sted fra inhibitoren Cl, og inhibitorvarianten rettes 5 mod kallikrein i stedet for thrombin.

Den foreliggende opfindelse angår således mere specielt en hidtil ukendt (Ala357 Arg358) α-^-AT-variant som inhibitor af kallikrein, hvilken variant kan anvendes som lægemiddel, hvilket beskrives nærmere nedenfor.

10 Opfindelsen angår også (Ala357)-varianterne af de forskellige varianter, der er beskrevet i WO 86/00337, især (Ala357)(åGlu1 -* Gly5)a1-AT samt de tilsvarende varianter i stilling 358, (Gly358), (Ala358), ] (Ile358), (Val358), (Leu358) og (Phe358).

^ Opfindelsen angår både den glycosylerede og ikke-glycosylerede form 15 af varianterne.

Kallikrein er en serumprotease, som både er impliceret i initieringen af koagulationen og i fibrinolysen. Den er ligeledes ansvarlig for spaltningen fra kininogen til bradykinin, som er et meget aktivt oli-gopeptid, der spiller en væsentlig rolle i forskellige processer, 20 især inflammatoriske, og i smerteresponset.

Det er også blevet påvist, at bradykinin kan deltage i reguleringen af blodtrykket.

Inhibitoren Cl er den vigtigste plasmatiske inhibitor af kallikrein.

Mangel på denne inhibitor fører til ukontrolleret aktivering af præ-^ 25 kallikrein og af faktor XII, hvilket fører til arveligt angioødem.

: Som beskrevet i det ovenfor nævnte patentskrift er (Arg358)ar^-AT mere effektiv end inhibitoren Cl ved inaktiveringen af både kallikrein (en ^ 4,1 gange så stor aktivitet) og faktor XII (11,5 gange højere aktivi-jj tet). Derfor synes proteinet (Arg358)-AT at have karakteristikaene — 30 for et produkt til behandling af arveligt angioødem. Dette molekyle 3 DK 173131 B1 har imidlertid også meget stor antithrombin-aktivitet, og det kan i visse tilfælde være interessant at have forskellige varianter med en mere specifik virkningsmåde, hvilket er, hvad der foreslås inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

5 Den hidtil ukendte (Ala3^7 Arg^^^-AT-variant har en i høj grad forbedret inhiberende virkning af kallikrein og har meget svage anti-thrombin-egenskaber.

Et sådant produkt kan anvendes som lægemiddel til inhibering af kallikrein, fx ved en terapi med afhjælpning af mangler på Cl-inhibitor.

10 Det er også muligt at forudsige dets anvendelse til behandling af septiske chok og ligeledes til regulering af blodtrykket og behandling af hypertension.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående, ikke-begrænsende eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Ekspression af modificeret of1-AT i E. coli

De plasmider og genetiske materialer, der blev anvendt i disse konstruktioner, er beskrevet i ovennævnte patentskrift.

Mutagenese af det humane gen for ot^-AT

20 Erstatning af resten Met358 i o^-AT med arginin og resten Pro357 med Ala blev udført ved direkte mutagenese ved hjælp af oligonukleotider.

Klonet cDNA fra ar^-AT blev subklonet i vektoren M13, og DNA fra den enkeltstrengede fag blev anvendt som model for et syntetisk komplementært oligonukleotid indeholdende den ønskede modifikation (5' . 25 GATAGACCTAGCTATGGCC 3')· Den anden streng syntetiseres under anven delse af Xlenow-polymerase, derefter udføres en transformation, og de plaques, der indeholder det muterede gen, identificeres ved screening ved hjælp af oligonukleotider.

4 DK 173131 B1

Mutationerne bekræftes ved direkte sekventering.

oprindelig sekvens: Ala Ile Pro Met Ser Ile

GCC ATA CCC ATG TCT ATC

muteret sekvens: Ala Ile Ala Arg Ser Ile

5 GCC ATA GCT AGG TCT ATC

Denne teknologi er beskrevet i detaljer i det ovenfor nævnte patentskrift.

Fragmentet af o^-AT-varianten indføres dernæst i plasmidet pTG983 som beskrevet i patentskriftet.

10 På denne måde fås et plasmid med betegnelsen pTG1946, som er identisk med plasmidet pTG983 bortset fra a^-AT-genet, som er blevet modificeret i stilling 357 og 358.

I det følgende er de anvendte plasmider nedenstående: pTG983 (ikke-modificeret or-pAT) 15 pTG1900 (Arg358 c^-AT) 5 pTG1946 (Ala357 Arg358 c^-AT).

] Ekspression af modificeret α^-AT i E. coli i

Varianten ifølge den foreliggende opfindelse, som er vundet ved fer-' mentering af E. coli-bakterier transformeret med pTG1946, blev sam- 20 menlignet med pTG983 og pTG1900.

Klarede sonikerede ekstrakter blev fremstillet ud fra inducerede kulturer af E. coli TGE900 indeholdende ét af de tre ovenfor nævnte plasmider.

Alikvoter af ekstrakter blev testet for deres evne til at inhibere *" 25 human neutrofil elastase (denne teknik er allerede beskrevet).

- li "51

Claims (8)

1. 5 Antikallikrein-aktiviteten bedømmes ved at måle (ved 410 nm) den resterende grad af hydrolyse af chromozymet PK (benzoyl-Pro-Præ-Arg 4-nitroanilid-acetat, Boehringer Mannheim). 2,6 pmol human plasmatisk kallikrein præinkuberes ved 37eC med en voksende mængde inhibitor i phosphatpuffer (0,1 M Na, 0,15 M NaCl).
2. 10 Efter 30 minutter standses reaktionen ved tilsætning af 900 μιηοΐ substrat (slutkoncentration 0,5 mM), og den enzymatiske restaktivitet bestemmes. I fig. 2 vises, at or^-AT-varianten (Ala357 Arg350) er i stand til hurtigt at inhibere kallikrein. Inhiberingskurverne for thrombin 15 (fig. 3) og sammenligning med a1-AT (Arg388) viser, at of-^-AT-varian-ten (Ala357 Arg388) kun i meget ringe grad inhiberer humant thrombin. Forbindelsen ifølge opfindelsen kan således anvendes inden for terapien som erstatning for inhibitoren Cl. Ved at anvende den ovennævnte teknik og de i WO 86/00337 beskrevne 20 fremgangsmåder fås de øvrige omhandlede varianter. Følgende stamme blev den 6. juni 1986 deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrig, tinder deponeringsnummeret 1-560: stamme E. coli TGE900 pTG1946.
3. 25 PATENTKRAV l. Variant i stilling 357 og eventuelt i stilling 358 af humant a?!-antitrypsin eller af human åGlu1 -* Gly8)cf1-AT. DK 173131 B1 e
4. 2. Variant ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er en variant i stillids 387 358.
5. 3. Variant ifølge krav 1 eller 2, 5 kendetegnet ved, at den er varianten Ala357.
6. 4. Variant ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den har formlen (Ala337 Arg35®)o^-AT.
7. 5. Farmaceutisk præparat, 10 kendetegnet ved, at det omfatter en variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4.
8. 6. Farmaceutisk præparat ifølge krav 5, til inhibering af kallikrein, kendetegnet ved, at det omfatter en variant ifølge krav 4. *^ 7. Farmaceutisk præparat ifølge krav 5, 15 kendetegnet ved, at det omfatter en variant med formlen (Ala357 Arg358)of1-AT. rv t Λ rim t-m !~T*i >’1·