DK169448B1 - Fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold - Google Patents

Description

i DK 169448 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold. Mere specielt angår opfindelsen en fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold, der endog kan anvendes i forbindelse med prøver, som hidtil har været vanskelige at bestemme p.g.a. tilstedevæ-5 reisen af bestemmelsesforstyrrende substanser o.l.

Pyrogener er pyrogene substanser, der i meget små mængder forøger legemstemperaturen af ensvarme dyr i unormal grad. Når et pyrogen indføres i det menneskelige legeme, fx. ved intravenøs injektion af et med denne substans forurenet medikament, vil der p.g.a. pyrogenet tillige 10 med medikamentets tilstræbte virkning optræde høj feber. I alvorlige tilfælde fører denne virkning af pyrogenet til høj feber ledsaget af kuldegysninger og rysten, og lejlighedsvis medfører den døden p.g.a. chock. Mange substanser såsom bakterielle substanser, inflammatoriske substanser, plantepolysaccharider, blodtypesubstanser o.l. vides at være 15 pyrogener. Blandt disse har bakterielle substanser den stærkeste feberfremkaldende virkning og betegnes som bakterielle toxiner. I almindelighed inddeles bakterielle toxiner i exotoxiner og endotoxiner. Den stærkeste pyrogenicitet udviser et endotoxin, der virker som såkaldt O-antigen, og hvis hovedkomponent er et cellevægslipopolysaccharid (LPS) af en 20 Gram-negativ bakterie.

Af de ovenfor anførte grunde er det af stor betydning at påvise eller bestemme pyrogenindholdet, fx. til undgåelse af pyrogenkontamine-ring ved fremstilling af lægemidler.

Hidtil kendte metoder til påvisning eller bestemmelse af pyrogen-25 indhold omfatter en febertest under anvendelse af en kanin eller en Li-mulus-test under anvendelse af en blodcelleekstrakt af Limulus polyphe-nus. Ud fra betragtninger såsom følsomhed, enkelhed, kvantitative egenskaber o.l. har navnlig Limulus-testen ofte været anvendt.

Der er imidlertid en tilbøjelighed til, at Limulus-testen bliver 30 forstyrret eller aktiveret af forskellige substanser, som er til stede under bestemmelsen, p.g.a. hvilket der kræves en kompliceret forbehandling, eller det nogle gange er vanskeligt at bestemme pyrogenindeholdet i forbindelse med visse prøver. Desuden er der andre substanser end pyrogener, der reagerer positivt på Limulus-testen og·derfor forstyrrer en • 35 nøjagtig bestemmelse af pyrogenindholdet. Som løsning på dette problem er det blevet foreslået at anvende højrensede reagenser. Sådanne reagenser er imidlertid meget kostbare. Det anses desuden for vanskeligt at bestemme en meget lille mængde pyrogen indeholdt i en substans med lav DK 169448 B1 2 opløselighed.

Fornylig er der til påvisning af et endotoxin, der er et af pyrogenerne, blevet foreslået en fremgangsmåde, der omfatter, at man til opnåelse af en let og hurtig udførelse af Limulus-testen bringer pyrogen-5 frit aktivkul opnået ved behandling med en syre, i kontakt med en prøve og omsætter aktivkullet med Limulus-lysat (japansk offentliggjort patentansøgning nr. 152425/1981). Denne fremgangsmåde er imidlertid stadig utilfredsstillende hvad specificitet, følsomhed og kvantitative egenskaber med hensyn til pyrogener angår. Endvidere omhandler US-patentskrift 10 nr. 4.491.660 anvendelse af en bestemt polymer, der kan adsorbere et endotoxin, til koncentrering og påvisning af endotoxin. Imidlertid er også denne polymer stadig utilfredsstillende med hensyn til specificitet, følsomhed og kvantitative egenskaber med hensyn til pyrogener.

Opfinderne af den foreliggende opfindelse har allerede i japansk 15 offentliggjort patentansøgning nr. 183712/1982 beskrevet, at pyrogener specifikt adsorberes til et adsorptionsmiddel, der omfatter en nitrogen-holdig heterocyklisk forbindelse, som direkte eller via et afstandsstykke er bundet til en vanduopløselig bærer. Desuden har opfinderne af den foreliggende opfindelse udført undersøgelser, der viser, at det ved an-20 vendel se af et sådant adsorptionsmiddel ved en Limulus-test er let med høj specificitet og sensibilitet at bestemme pyrogenindholdet, endog i nærvær af forskellige forstyrrende substanser eller andre Limulus-test-positive substanser.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en 25 forbedret fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold ved en Limulus-test.

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 til 3 er eksempler på kalibreringskurver anvendt ved bestemmelser i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

30 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer en prøve i kontakt med et adsorptionsmiddel bestående af en nitrogenholdig heterocyklisk forbindelse, der via et afstandsstykke er bundet til en vanduopløselig bærer, og uden eluering af det 35 til adsorptionsmiddel adsorberede pyrogen bestemmer indholdet af det ad-sorberede pyrogen ved hjælp af Limulus-metoden, hvor den nitrogenholdige heterocykli ske forbindelse er en forbindelse med formlen: 3 DK 169448 B1 R-A-X (I) hvori R er en nitrogenholdige heterocyklisk gruppe med en imidazolkerne eller en purinkerne, A en en enkeltbinding eller en alkylengruppe, X er en funktionel gruppe, alkylengruppen kan være substitueret med en carbo-5 xylgruppe, og afstandsstykket er en forbindelse med formlen NH2(CH2}nNH2’ NH2(CH2)nCOOH, NH2(CH2)n0H, eller 10 H00C(CH2)nC00H, hvori n er et helt tal fra 1 til 12.

Den vanduopløselige bærer er specielt en vanduopløselig bærer med en hydroxygruppe, en aminogruppe, en carboxyl gruppe eller et halogenatom 15 i molekylet og navnlig en vanduopløsel i g bærer med en hydroxygruppe, en aminogruppe eller et halogenatom i molekylet.

Eksempler på nitrogenholdige heterocykli ske forbindelser med formel (I) omfatter sådanne, hvori R er en nitrogenholdige heterocyklisk gruppe med en imidazol kerne eller en purinkerne, A er en enkeltbinding, 20 og X er en funktionel gruppe såsom amino, hydroxy eller carboxy, eller A er en alkylengruppe med 1-12 carbonatomer såsom methylen, ethylen, propyl en, butyl en, hexyl en, octyl en, decamethylen eller dodecamethylen, og X er en funktionel gruppe såsom amino, hydroxy eller carboxyl. Den nitrogenholdige heterocykli ske gruppe R og alkylengruppen A kan eventuelt 25 være substitueret med en eller flere substituenter (fx. carboxyl, oxo, alkyl med 1-4 carbonatomer, hydroxy, amino, alkoxy med 1-4 carbonatomer, etc.). Foretrukne eksempler på nitrogenholdige heterocykliske forbindelser er sådanne med formel (I) hvori R er en nitrogenholdig heterocyklisk gruppe med imidazolkerne eller purinkerne, A er en enkelt binding, ethy-30 len eller ethylen substitueret med carboxyl, og X er amino, carboxy eller hydroxy.

I overensstemmelse med opfindelsen kan en hvilken som helst vanduopløsel ig bærer, der via afstandsstykket er bundet til den nitrogenholdige heterocykliske forbindelse med den almene formel (I), anvendes som 35 vanduopløselig bærer.

Repræsentative eksempler på vanduopløselige bærere omfatter sådanne, der indeholder hydroxy, amino, carboxyl eller halogen. Foretrukne eksempler på vanduopløselige bærere, der indeholder hydroxy, er poly- DK 169448 ΒΊ 4 saccharider (fx. cellulose, agarose, tværbundet dextan, etc.), hydroxy-alkylerede polystyrenharpikser (fx. hydroxyalkyleret styren-divinyl ben-zencopolymer, etc.), polyvinyl al kohol eller lignende. Eksempler på vand-uopløselige bærere, der indeholder aminogrupper, er aminoalkylerede po-5 lysaccharider (fx. aminoalkylerede celluloser såsom aminoethylcellulose eller aminohexylcellulose, aminoalkyleret agarose såsom aminohexylagarose, p-aminobenzylerede polysaccharider (fx. p-aminobenzylcellulose, p-aminobenzylagarose, etc.), chitosan, aminoalkylerede polystyrenharpikser (fx. aminoalkyleret styren-divinylbenzencopolymer, etc.), polyacrylami-10 der, aminoalkylerede polyacrylamider (fx. aminoethylpolyacrylamid, etc.), aminoalkyleret porøst glas (fx. porøst aminopropylglas, etc.), o.l. Eksempler på vanduopløselige bærere, der indeholder carboxyl grupper, er carboxyalkylerede polysaccharider (fx. carboxyalkyleret agarose såsom carboxyhexylagarose eller carboxypentylagarose, carboxyalkylerede 15 celluloser såsom carboxymethylcellulose, carboxyal kyleret tværbundet dextran såsom carboxymethy-tværbundet dextran, etc.), carboxyl syreharpikser (fx. acrylsyre-di vinylbenzencopolymer, etc.), o.l. Eksempler på vanduopløselige bærere, der indeholder halogen, er halogenal kyl polystyrenharpikser (fx. chlormethyleret styren-divinylbenzencopolymer, etc.), 20 o.l.

Foretrukne eksempler på adsorptionsmidler anvendt ifølge opfindelsen er sådanne, der opnås ved binding af nitrogenholdige heterocykliske forbindelser med formel (I) såsom hi stidi n, histamin, urocansyre eller adenin til det vanduopløselige polysaccharid via alkylendiamin som af-25 standsstykke under anvendelse af mindst et monoepoxid (fx. epichlorhy-drin, etc.) og et alifatisk dialdehyd (fx. glutaraldehyd, etc.).

Yderligere foretrukne eksempler på adsorptionsmidler anvendt ifølge opfindelsen er sådanne, der opnås ved binding af histidin eller histamin til et vanduopløseligt polysaccharid (fx. cellulose eller agaro-30 se) via en alkylendiamin under anvendelse af epichlorhydrin.

Adsorptionsmidlet, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er karakteriseret ved, at det specifikt kun adsorberer pyrogener. Således kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved at bringe adsorptionsmidlet i kontakt med en prøve til adsorption- af et pyrogen i 35 prøven, vaske prøven til fjernelse af andre substanser end pyrogenet, og uden eluering af det adsorberede pyrogen underkaste det en konventionel Limulus-test til bestemmelse af pyrogenindeholdet.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bør prøven, der skal under- 5 DK 169448 B1 søges, anvendes i opløst tilstand, fx. i en vandholdig eller vandig opløsning, idet en vandig opløsning er foretrukket. Absorptionsmidlet, der anvendes ifølge opfindelsen adsorberer ikke forstyrrende substanser, fx. aminosyrer (fx. L-cystein, etc.), antibiotika (fx. penicillin G, strep-5 tomycin, etc.), proteindenaturanter (fx. urinstof, etc.), serinprotease-inhibitorer (fx. diisopropylfluorphosphorsyre, etc.), saccharider (fx. glucose, etc.), sukkeralkoholer, natriumchlorid, Ringer's opløsning o.l. Adsoptionsmidlet adsorberer heller ikke andre Limulus-test-positive substanser end pyrogener, fx. polysaccarider såsom dextran, (l->3)-/?-D-glu-10 can o.l. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan derfor anvendes på prøver indeholdende disse substanser, hvis pyrogenindhold hidtil har været vanskeligt at bestemme.

Pyrogenadsorptionsprocessen kan udføres ved at bringe prøven i kontakt med adsorptionsmidlet fx. ved blanding og omrøring af prøven med 15 et adsorptionsmiddel i en beholder eller ved at lede prøven gennem en med adsorptionsmidlet pakket kolonne. Adsorptionsprocesbetingelserne kan udvælges under hensyntagen til den pågældende prøve. Sædvanligvis kan pyrogenet specifikt og effektivt adsorberes ved anvendelse af 3 til 100 mg, fortrinsvis 7 til 40 mg adsorptionsmiddel pr. 1 ml prøve og ved at 20 udføre adsoptionen under betingelser, der omfatter temperaturer i området fra 4 til 40°C, pH-værdier fra 4 til 8, fortrinsvis 6 til 7, og en ionstyrke på ikke mere end 0,1, fortrinsvis 0 til 0,05. Ved at udføre adsorptionsprocessen i ca. 30 minutter eller mere under disse betingelser bliver pyrogenet i prøven næsten fuldstændigt adsorberet på adsorp-25 tionsmidlet og kondenseret derpå. Desuden kan der efter adsorptionens afslutning også udføres en readsorption, hvorved bestemmelsesfølsomheden kan forøges.

Adsorptionsmidlet, der har adsorberet pyrogenet, adskilles fra prøven under anvendelse af kendte fremgangsmåder og vaskes dernæst med 30 pyrogenfrit vand, pyrogenfri pufferopløsning eller lignende til fjernelse af andre substanser end pyrogenet.

I overenstemmelse med den foreliggende opfindelse kan det således vaskede adsorptionsmiddel underkastes Limulus-testen direkte som det er.

Generelt kan Limulus-testen inddeles i en syntetisk substratmetode 35 og en geldannelsesmetode, og den syntetiske substratmetode kan yderligere inddeles i kolorimetri og fluorimetri alt efter arten af substrat.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan en hvilken som helst af disse metoder anvendes. For eksempel omsættes adsorptionsmidlet, hvorpå pyroge- DK 169448 B1 6 net er blevet adsorberet, med Limulus-lysat ved 25 til 40°C, sædvanligvis ved 37°C, i 10 til.120 minutter, reaktionsopløsningens turbidi-tet, der skyldes geldannelse, måles med tiden, og prøvens pyrogenkoncen-tration kan derpå bestemmes på basis af en kalibreringskurve, der frem-5 stilles separat under anvendelse af en autentisk prøve (fx. LPS, etc.) iht. den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. Alternativt omsættes adsorptionsmidlet, hvorpå pyrogenet er blevet adsorberet, med Limulus-lysat og et syntetisk substrat indeholdende en kromofor eller fluorofor under samme betingelser. Efter reaktionens afslutning underkastes reaktions-10 blandingen kolorimetri eller fluorimetri, og prøvens pyrogenindhold bestemmes under anvendelse af en kalibreringskurve, der er blevet fremstillet separat på den ovenfor beskrevne måde. Når der anvendes kolorimetri, kan bestemmelsen udføres under anvendelse af et syntetisk substrat, fx. Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (hvori Boc er t-butoxycarbonyl, og pNA er 15 p-nitroanilin) og måling af adsorbansen ved en bølgelængde på 405 nm.

Når der anvendes fluorimetri, kan bestemmelsen udføres under anvendelse af et syntetisk substrat, fx. Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (hvori Boc har den ovenfor anførte betydning, og MCA er 7-amino-4-methylcumarin) og måling af fluorescensen ved en excitationsbølgelængde på 380 nm eller en fluo-20 rescensbølgelængde på 460 nm.

Det i overensstemmelse med opfindelsen anvendte adsorptionsmiddel kan fx. fremstilles på samme måde som beskrevet., i den ovenfor anførte japanske offentliggjorte patentansøgning nr. 183712/1982.

I overensstemmelse med opfindelsen kan Limulus-testens bestemme!-25 sesfølsomhed forbedres i allerhøjeste grad, og selv pyrogenindholdet i en prøve, der indeholder forstyrrende substanser, og som hidtil har været anset for vanskelig at måle, kan nu bestemmes. Desuden kan adskillelse og bestemmelse af pyrogener udføres, selvom prøven indeholder andre Limulus-test-positive substanser end pyrogener. Ydermere er det mu-30 ligt at anvende et billigere reagens i stedet for Limulus-reagenset. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af pyrogenindhold er således egnet til anvendelse i forbindelse med kontrol prøver under fremstilling af lægemidler o.l.

De følgende eksempler skal tjene til belysning af opfindelsen.

Eksempel 1

Undersøgelse under anvendelse af kalibreringskurve

Til pyrogenfrit vand (3 ml) sattes en forud bestemt mængde LPS

35 8 DK 169448 B1

Eksempel 2

Reproducerbarhed af data opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen Til pyrogenfrit vand (3 ml) sattes en forud bestemt mængde LPS 5 (stammende fra E. coli 0128: B12) og omrørtes til opnåelse af en vandig LPS-opløsning indeholdende 2 pg/ml LPS. På samme måde som i eksempel 1 bestemtes LPS-indholdet (relativ intensitet RI ved fluorimetri) i LPS-opl øsni ngen eller pyrogenfrit vand (3 ml, svarende til 0 pg/ml LPS-kon-centration) under anvendelse af det i efterfølgende referenceeksempel 1 10 fremstillede adsorptionsmiddel (30 mg). De efter 4 forsøg pr. opløsning opnåede resultater er vist i tabel 2.

Tabel 2 15 Mængde LPS (pg/ml) 0 2 8,9 73,2 20 RI 9,3 73,0 7.8 73,7 7.8 77,5 25 , Som det klart fremgår af tabel 2 er de data, der opnås ved den kvantitative bestemmelse (relativ intensitet RI ved fluorimetri), når arten og indholdet af LPS er konstant, også konstante. Reproducerbarheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således høj.

30 Eksempel 3

Anvendelighed af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til forskellige pyro-qener

Anvendeligheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til forskellige pyrogener (LPS) undersøgtes som følger. 1 35

Bestemmelse af LPS-indhold i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til pyrogenfrit vand (3 ml) sattes forskellige fra mikroorganismer DK 169448 B1 7 (stammende fra E. coli 0128: B12) til fremstilling af en vandig LPS-op-løsn'ing'(LPS-koncentration 0, 1, 2 eller 3 pg/ml). Til opløsningen sattes det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (30 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 50 opm ved 5 stuetemperatur i 1 time. Dernæst centrifugeredes blandingen ved 3000 opm 1 5 minutter, og det præcipiterede adsorptionsmiddel vaskedes grundigt med pyrogenfrit vand (3 ml). Til præcipitatet sattes en substratopløsning, dvs. en vandig opløsning af 0,4 mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (50 μΐ) og Limulus-amebocyt-lysat [fremstillet ved opløsning af 1 glas (for 0,2 ml, 10 følsomhed: gel dannelse ved 0,1 ng/ml som FDA-reference-endotoxin EC-2-koncentration) Wako Limulus-enkelttest (fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 0,4 M Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0, 1,5 ml) indeholdende 0,04 M magnesiumchlorid] (50 μΐ), og blandingen omsattes ved 37°C i 30 minutter. Derefter tilsattes 12,5% vandig eddikesyreop-15 løsning (2,3 ml) for at bringe reaktionen til ophør, og blandingen centrifugeredes ved 3000 opm i 5 minutter. Dernæst udførtes fluorimetri ved en excitationsbølgelængde på 380 nm og en fluorescensbølgelængde på 460 nm. Resultaterne er vist i tabel 1.

Når de opnåede data indtegnedes i et diagram, hvor ordinatværdier-20 ne viste den relative intensitet (RI) ved fluorimetri, og abscisseværdierne viste LPS-koncentrationen, fremkom den i fig. 1 afbildede kalibreringskurve.

Som det fremgår af fig. 1 viser kalibreringskurven en god lineær relation, selv i området med lav LPS-koncentration.

25

Tabel 1

Forsøg nr. LPS-koncentration (pg/ml) RI

30 1 0,0 13,6 2 0,0 17,1 3 1,0 54,0 4 1,0 59,0 5 2,0 99,0 35 6 2,0 107,0 7 3,0 148,0 8 3,0 152,0 DK 169448 Bl 9 stammende LPS-typer som beskrevet i tabel 3 til opnåelse af forskellige vandige LPS-opløsninger med LPS-koncentrationer fra 1,25 til 6 pg/ml. På samme måde som i eksempel 1 bestemtes LPS-indhol det i hver opløsning under anvendelse af det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede 5 adsorptionsmiddel (30 mg). Endotoxinenheder (EU) i forskellige LPS-typer bestemtes på basis af LPS-indeholdet i hver prøveopløsning under anvendelse af LPS stammende fra E. coli 0128: B12 (10,4 EU/ng) som endotoxin-standard.

10 (2) Bestemmelse af LPS-indhold iht. Limulus-metoden under anvendelse af fluorescerende syntetisk substrat (kontrolmetode).

Til vandige opløsninger af forskellige LPS-typer med koncentrationer fra 2,5 til 6 pg/ml (100 pi) sattes hhv. den i eksempel 1 anvendte substratopløsning (50 pi) og det i eksempel 1 anvendte Limulus-amebocyt-15 lysat (50 pi), og blandingen omsattes ved 37°C i 65 minutter. Reaktionen bragtes til ophør ved tilsætning af en 12,5% vandig eddikesyreopløsning (3 ml). På samme måde som i eksempel 1 bestemtes så LPS-indholdet ved måling af den relative intensitet ved fluorimetri. På den ovenfor beskrevne måde bestemtes endotoxinenhederne af forskellige LPS-typer 20 under anvendelse af LPS stammende fra E. coli 0128: B12 som endotoxin-standard. Resultaterne er vist i tabel 3 nedenfor.

Tabel 3 25 LPS Fremgangsmåde ifølge Kontrol - opfindelsen (EU/ng) metode (EU/ng) LPS stammende fra E. coli 0128: B12 10,4 10,4 30 LPS stammende fra E. coli 0111: B4 7,9 8,0 LPS stammende fra E. coli 055: B5 11,6 12,1 LPS stammende fra 35 E. coli UKT-B 24,9 22,7 LPS stammende fra

Klebsiella pneumoniae 11,5 10,4 DK 169448 B1 10

Som det klart fremgår af tabel 3 kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes til bestemmelse af indholdet af forskellige LPS-typer ved den kendte Limulus-metode under anvendelse af et fluorescerende synte-5 tisk substrat.

Eksempel 4 Måling af pyrogenkoncentrationen i en vandig phenyl alaninopløsning

Til en 2% vandig phenyl alaninopløsning (30 ml) sattes det i efter-10 følgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (500 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 50 opm ved stuetemperatur i 4 timer. Dernæst fjernedes adsorptionsmidlet til fremstilling af en pyrogenfri vandig phenyl alaninopløsning.

Til den vandige phenylalaninopløsning sattes LPS (stammende fra E.

15 coli 0128: B12) til opnåelse af en LPS-koncentration fra 1 pg/ml til 2 pg/ml, og blandingen omrørtes til opnåelse af en LPS-opløsning. Til opløsningen (3 ml) sattes det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (30 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time. Dernæst centrifugeredes blandingen 20 ved 3000 opm i 5 minutter, og det præcipiterede adsorptionsmiddel vaskedes med pyrogenfri phosphatpuffer (pH 7,0 β = 0,02) (3 ml). Til præcipi-tatet sattes en vandig opløsning af 0,4 mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (50 /il) som en substratopløsning og Limulus-amebocyt-lysat [fremstillet ved opløsning af 1 glas (for 0,2 ml, følsomhed: geldannelse ved 0,1 ng/ml som 25 FDA-reference-endotoxin EC-2-koncentration) Wako Limulus-enkelttest (fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 0,4 M Tris-hydro-chloridpuffer (pH 8,0, 1,5 ml) indeholdende 0,04 M magnesiumchlorid] (50 /il), og blandingen omsattes ved 37°C i 30 minutter. Derefter tilsattes 12,5% vandig eddikesyreopløsning (2,3 ml) for at standse reaktionen, og 30 blandingen centrifugeredes ved 3000 opm i 5 minutter. Dernæst udførtes fluorimetri ved en excitationsbølgelængde på 380 nm og en fluorescensbølgelængde på 460 nm. Pyrogenkoncentrationen bestemtes ved den relative intensitet på basis af kalibreringskurven. Resultaterne er vist i tabel 4.

______ 35 11 DK 169448 B1

Tabel 4 Mængde af LPS RI LPS-indhold (pg/ml) (pg/ml) 5 _

Intet 20,7 0,01 1 83,3 0,99 2 149,0 2,02 10

Hidtil var grænsen for bestemmelse af denne type LPS ved Limulus-testen en koncentration på 1 pg/ml i 0,5% vandig phenylalaninopløsning, dvs. 200 pg pr. 1 g aminosyre. Derimod fremgår det klart af tabel 4, at der ifølge den foreliggende opfindelse kan bestemmes 1 pg/ml LPS i en 2% 15 vandig phenylalaninopløsning, dvs. 50 pg pr. 1 g aminosyre. Følsomheden er således i allerhøjeste grad blevet forbedret.

Eksempel 5 Måling af pyrogenkoncentrationen i en vandig methioninopløsning 20 Til en 5% vandig methioninopløsning (30 ml) sattes det i efterføl gende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (500 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 50 opm ved stuetemperatur i 4 timer. Dernæst fjernedes adsorptionsmidlet til fremstilling af en pyro-genfri vandig methioninopløsning.

25 , På den i eksempel 4 beskrevne måde sattes LPS til den resulterende opløsning til bestemmelse af pyrogenindhol det. Resultaterne er vist i tabel 5.

Tabel 5 30 Mængde af LPS RI LPS-indhold (pg/ml) (pg/ml)

Intet 26,9 0,11 35 1 84,9 1,02 2 148,0 2,01 12 DK 169448 B1 I tilfælde af en vandig methioninopløsning har grænsen for bestemmelse af LPS-indholdet hidtil været 100 pg pr. 1 g aminosyre. Det fremgår imidlertid klart af tabel 5, at der ifølge opfindelsen kan bestemmes 1 pg/ml LPS i 5% vandig methioninopløsning, dvs. 20 pg pr. 1 g af amino-5 syren. Følsomheden er således i allerhøjeste grad blevet forbedret.

Eksempel 6 Måling af pyrogenkoncentration i en vandig cysteinhydrochloridopløsning En 0,25% vandig cysteinhydrochloridopløsning indstilledes til pH 10 6,1 med natriumhydroxid, og til opløsningen sattes LPS til fremstilling af en vandig cysteinhydrochloridopløsning, der hhv. indeholdt 1 pg/ml og 2 pg/ml LPS.

På den i eksempel 4 beskrevne måde bestemtes LPS-indholdet under anvendelse af det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede ad-15 sorptionsmiddel. Til vask af adsorptionsmidlet anvendtes pyrogenfrit vand (3 ml). Resultaterne er vist i tabel 6.

Tabel 6 20 Mængde af LPS RI LPS-indhold (pg/ml) (pg/ml)

Intet 16,3 0 1 69,8 1,04 25 2 118,0 2,05 I tilfælde af en vandig cysteinhydrochloridopløsning har grænsen for bestemmelse af LPS-indholdet hidtil været 1000 til 2000 pg pr. 1 g 30 aminosyre. Det fremgår imidlertid klart af tabel 6, at der ifølge opfindelsen kan bestemmes 1 pg/ml LPS i 0,25% cysteinhydrochloridopløsning, dvs. 400 pg pr. 1 g aminosyre og at følsomheden er blevet forbedret i allerhøjeste grad.

35 Eksempel 7 Måling af pyrogenkoncentrationen i en vandig opløsning af penicillin G Til en 1% vandig opløsning af penicillin G (30 ml) sattes det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (1 g, 13 DK 169448 B1 vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 58 opm i 4 timer ved stuetemperatur. Dernæst fjernedes adsorptionsmidlet til opnåelse af en pyrogenfri vandig opløsning af penicillin G.

På den i eksempel 4 beskrevne måde sattes en forud bestemt mængde 5 LPS til opløsningen, og LPS-indeholdet bestemtes under anvendelse af det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel. Py-rogenfrit vand (3 ml) anvendtes til vask af adsorptionsmidlet. Resultaterne er vist i tabel 7.

10 Tabel 7 Mængde af LPS RI LPS-indhold (pg/ml) (pg/ml) 15 Intet 5,5 0,00 1 32,3 0,90 2 69,5 2,07 20 I tilfælde af en vandig opløsning af penicillin G har grænsen for bestemmelse af LPS-indholdet hidtil været 200 pg pr. 1 g penicillin G.

Det fremgår imidlertid klart af tabel 7, at der ifølge opfindelsen kan bestemmes 1 pg/ml LPS i 1% vandig opløsning af penicillin G, dvs. 100 pg pr. 1 g penicillin G, og at følsomheden er blevet forbedret i allerhøje-25 ste grad.

Eksempel 8

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen til bestemmelse af pyrogenindholdet Til pyrogenfrit vand (3 ml) sattes en forud fastsat mængde LPS 30 (stammende fra E. coli 0128: B12), og blandingen omrørtes til fremstilling af en vandig LPS-opløsning (LPS-koncentration 0, 10 og 20 pg/ml).

Til opløsningen sattes det i efterfølgende referenceeksempel 1 fremstillede adsorptionsmiddel (100 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 50 opm ved stuetemperatur i 1 time. Dernæst centrifugeredes 35 blandingen ved 3000 opm i 5 minutter. Til det præcipiterede adsorptions-middel sattes 0,2 M pyrogenfrit Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0, 0,5 ml), indeholdende 0,02 M magnesiumchlorid, og blandingen omrørtes og henstod derefter i 30 minutter. Efter henstand centrifugeredes blanding- 14 DK 169448 B1 en, og LPS-koncentrationen i supernatanten bestemtes ved Limulus-metoden under anvendelse af et fluorescerende syntetisk substrat som følger.

Supernatantvæsken fortyndedes successivt med pyrogenfrit vand til opnåelse af en prøveopløsning. Til prøveopløsningen (100 μ!) sattes en 5 substratopløsning (50 /zl) og Limulus-amebocyt-lysat (50 /zl), og blandingen omsattes ved 37°C i 90 minutter. Reaktionen bragtes til ophør ved tilsætning af 12,5% vandig eddikesyreopløsning (2,3 ml), og dernæst bestemtes den relative intensitet ved fluorimetri som beskrevet i eksempel 1, og LPS-indholdet bestemtes under anvendelse af LPS, der stammende 10 fra E. coli 0128: B12, som LPS-standard. Resultaterne er vist i tabel 8.

Tabel 8

Forsøg nr. Tilsat LPS (pg) Målt LPS (pg) 15 _ 1 0 <0,1 2 0 <0,1 3 30 26 4 30 36 20 5 60 41 6 60 62

Som det klart fremgår af tabel 8, blev det tilsatte LPS næsten 25 fuldstændigt udvundet fra den eluerede supernatant. Derfor er det muligt at måle koncentrationen af LPS ved adsorbering på adsorptionsmidlet og efterfølgende eluering.

Eksempel 9 30 Undersøgelse under anvendelse af kalibreringskurve

Til pyrogenfri phosphatpuffer (pH 7,0, /zm 0,02, 3 ml) sattes en forud bestemt mængde LPS (stammende fra E. coli 0128: B12) til fremstilling af en vandig LPS-opløsning (LPS-koncentration 0, 5, 10 eller 15 pg/ml). Til opløsningen sattes det i efterfølgende referenceeksempel 2 35 fremstillede adsorptionsmiddel (30 mg, vægt i våd tilstand), og blandingen omrørtes ved 50 opm ved stuetemperatur i 1 time. Dernæst centrifugeredes blandingen ved 3000 opm i 5 minutter. Til præcipitatet sattes en vandig opløsning af 0,4 mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA (50 /il) som en substrat- 15 DK 169448 B1 opløsning og Limulus-amebocyt-lysat [fremstillet ved opløsning af 1 glas (for 0,2 ml, følsomhed: geldannelse ved 0,1 ng/ml som FDA-reference-en-dotoxin EC-2-koncentration) Wako Limulus-enkelttest (fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 0,4 M Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0, 5 1,5 ml) indeholdende 0,04 M magnesiumchlorid] (50 /il), og blandingen om sattes ved 37°C i 20 minutter. Derefter tilsattes 12,5% vandig eddikesyreopløsning (2,3 ml) for at bringe reaktionen til ophør, og blandingen centrifugeredes ved 3000 opm i 5 minutter. Dernæst udførtes fluorimetri ved en excitationsbølgelængde på 380 nm og en fluorescensbølgelængde på 10 460 nm. Resultaterne er vist i tabel 9.

Når de resulterende data indtegnedes i et diagram, hvor ordinatværdierne viste den relative intensitet (RI) ved fluorimetri og abscisseværdierne viste LPS-koncentrationen, fremkom den i fig. 2 afbildede kalibreringskurve. Kurven i fig. 2 udviser en god lineær relation, selv 15 i området med lav LPS-koncentration.

Tabel 9

Forsøg nr. LPS-koncentration (pg/ml) RI

20 _ 1 0 12,9 2 0 16,1 3 5 52,8 4 5 56,2 25 5 10 73,7 6 10 82,0 7 15 108 8 15 118 30

Eksempel 10

Undersøgelser under anvendelse af kalibreringskurve

Fluorimetri udførtes på samme måde som i eksempel 9 bortset fra, at det i efterfølgende referanceeksempel 3 fremstillede adsorptionsmid-35 del erstattede det i referenceeksempel 2 fremtillede. Resultaterne er vist i tabel 10.

Når de resulterende data indtegnedes i et, diagram, hvor ordinatværdierne viste den relative intensitet (RI) ved fluorimetri og abscis- > 16 DK 169448 B1 seværdierne viste LPS-koncentrationen, fremkom den i fig. 3 afbildede kalibreringskurve. Kurven i fig. 3 udviser en god lineær relation, selv i området med lav LPS-koncentration.

5 Tabel 10

Forsøg nr. LPS-koncentration (pg/ml) RI

1 0 29,0 10 2 0 30,4 3 5 54,1 4 5 57,8 5 10 82,3 6 10 80,5 15 7 15 97,8 8 15 98,9

Referenceeksempel 1 20 (1) Sepharose CL-4B (handelsbetegnelse for et agarosederivat frem stillet af Pharmacia Fine Chemicals, 30 g, vægt i våd tilstand) suspenderedes i destilleret vand. 2 N vandigt natriumhydroxid (300 ml) og epi-chlorhydrin (50 ml) tilsattes, og blandingen omrørtes ved 40°C i 2 timer. Efter reaktionens ophør filtreredes blandingen, og remanensen va-25 skedes med destilleret vand til opnåelse af epichlorhydrin-aktiveret "Sepharose CL-4B". Den således opnåede epichlorhydrin-aktiverede "Sepharose CL-4B" suspenderedes i 0,6% vandig hexamethylendiaminopløsning (1,4 1), der var blevet opvarmet til 60°C, og suspensionen omrørtes ved 60°C i 2 timer. Efter reaktionens ophør filtreredes blandingen, og re-30 manensen vaskedes med destilleret vand til opnåelse af 3-(6-aminohexyl-amino)-2-hydroxypropyleret "Sepharose CL-4B" (370 g, vægt i våd tilstand). Når aminohexylindhol det af den resulterende Sepharose måltes ved titrering, var den ca. 37,6 μηιοΐ/g (vægt i våd tilstand).

(2) 3-(6-aminohexylamino)-2-hydroxy-propyleret "Sepharose CL-4B 35 (370 g, vægt i våd tilstand) suspenderedes i 4 N vandigt natriumhydroxid (700 ml). Epichlorhydrin (700 ml) sattes til suspensionen ved 65°C, og blandingen omrørtes. Efter at blandingens temperatur havde nået 90°C, omrørtes der i yderligere 8 minutter. Efter reaktionens ophør sattes 17 DK 169448 B1 vand til blandingen for at afkøle den til 50°C eller derunder. Dernæst filtreredes blandingen, og remanensen vaskedes med destilleret vand til opnåelse af epichlorhydrin-aktiveret 3-(6-amin0hexylamino)-2-hydroxy-propyleret "Sepharose CL-4B". Denne suspenderedes i en vandig opløsning 5 af 20% histidinhydrochloridhydrat (der indstilledes til pH 12 med vandigt natriumhydroxid, 2,1 1), der var blevet opvarmet til 90°C, og suspensionen omrørtes ved 80 til 90°C i 30 minutter. Efter reaktionens ophør filtreredes blandingen, og remanensen vaskedes grundigt med destilleret vand. Remanensen suspenderedes i destilleret vand (1 1), 10 underkastedes autoklavering ved 120°C i 20 minutter og filtreredes derefter. Remanensen vaskedes grundigt successivt med 0,2 N vandig saltsyre, 0,2 N vandigt natriumhydroxid, 1,5 M vandigt natriumchlorid og destilleret vand. Således opnåedes et vanduopløseligt adsorptionsmiddel, der indeholdt agarose som bærer, histidin som ligand og hexamethylendi-15 amin som afstandsstykkecenter (390 g, vægt i våd tilstand). Indholdet af histidin pr. 1 g (vægt i våd tilstand) adsorptionsmiddel var 20,4 μιηοΐ.

Referenceeksempel 2

Den i referenceeksempel 1 beskrevne fremgangsmåde gentoges med 20 undtageles af, at "Cel lul ofine GCL-2000-m" (handelsbetegnelse for et cellulosederivat fremstillet af Chisso Co., Ltd., 350 g) anvendtes i stedet for "Sepharose CL-4B". Således opnåedes et vanduopløseligt adsorptionsmiddel, der indeholdt cellulose som bærer, histidin som ligand og hexamethylendiamin som afstandsstykkecenter (340 g, vægt i våd til-25 stand). Indholdet af histidin pr. 1 g (vægt i våd tilstand) adsorptionsmiddel var 58 /zmol.

Referenceeksempel 3

3-(6-aminohexylamino)-2-hydroxy-propyleret "Sepharose CL-4B", der 30 var blevet fremstillet på samme måde som beskrevet i referenceeksempel 1 (18 g, vægt i våd tilstand), suspenderedes i 0,05 M phosphatpuffer (pH

7,0, 45,5 ml). En 25% vandig glutaraldehydopløsning (19,2 ml) sattes til suspensionen, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Efter reaktionens ophør filtreredes blandingen, og remanensen vaskedes grun-35 digt med 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,0) til opnåelse af glutaraldehyd-ak-tiveret 3-(6-aminohexylamino)-2-hydroxy-propyleret "Sepharose CL-4B".

Denne suspenderedes i 15 mM histamin-0,1 M phosphatpuffer (pH 7,0 59,6 ml), og suspensionen omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Efter re- DK 169448 Bl 18 aktionens ophør filtreredes blandingen, og remanensen vaskedes med en 1 M vandig natriumchlori dopiøsning (600 ml). Remanensen suspenderedes i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,0, 30 ml). Natriumborhydrid (0,3 g) sattes til suspensionen, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time.

5 Efter reaktionens ophør filtreredes blandingen, og remanensen vaskedes grundigt med en 1 M vandig natriumchloridopløsning og destilleret vand. Således opnåedes et vanduopløseligt adsorptionsmiddel, der indeholdt agarose som bærer, histamin som ligand og hexamethylendiamin som afstandstykkecenter (20, 7 g, vægt i våd tilstand). Histaminindholdet pr.

10 1 g (vægt i våd tilstand) adsorptionsmiddel var 4,1 /imol.

«

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af pyrogenindhold, KENDETEGNET ved, at man bringer en prøve i kontakt med et adsorptionsmiddel beståen-5 de af en nitrogenholdig heterocyklisk forbindelse, der via et afstandsstykke er bundet til en vanduopløselig bærer, og uden eluering af det til adsorptionsmiddel adsorberede pyrogen bestemmer indholdet af det ad-sorberede pyrogen ved hjælp af Limulus-metoden, hvor den nitrogenholdige heterocykli ske forbindelse er en forbindelse med formlen: 10 R-A-X (I) hvori R er en nitrogenholdige heterocyklisk gruppe med en imidazolkerne eller en purinkerne, A en en enkeltbinding eller en alkylengruppe, X er 15 en funktionel gruppe, alkylengruppen kan være substitueret med en carbo-xylgruppe, og afstandsstykket er en forbindelse med formlen NH2(CH2)nNH2, NH2(CH2)nC°°H *

20 NH2(CH2)nOH, eller HOOC(CH2)nCOOH, hvori n er et helt tal fra 1 til 12. 25 , 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den nitrogen holdige heterocykli ske forbindelse er en forbindelse med formel I, hvori A en enkeltbinding eller en alkylengruppe med 1 til 12 carbonatomer, der kan være substitueret med en carboxyl gruppe, og X er amino, hydroxy el-1 er carboxyl. 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den nitrogenholdige heterocykliske forbindelse er en forbindelse med formel I, hvori A er en enkeltbinding, ethyl en eller ethyl en substitueret med en carboxyl gruppe, og X er en aminogruppe. 35

4. Fremgangsmåde ifølge kr'av 1, KENDETEGNET ved, at den nitrogenholdige heterocykliske forbindelse (I) er udvalgt blandt histidin, histamin og adenin. * DK 169448 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, KENDETEGNET ved, at den vanduopløselige bærer er en vanduopløselig bærer med en hydroxygruppe, en aminogruppe eller et halogenatom i molekylet. 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at adsorptionsmidlet er den nitrogenholdige heterocykliske forbindelse (I) bundet til den vanduopløselige bærer via en alkylendiamin som afstandsstykke ved anvendelse af i det mindste et monoepoxid og/eller et alifatisk aldehyd. 10

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at adsorptions-midlet er den nitrogenholdige heterocykliske forbindelse (I) bundet til den vanduopløselige bærer via afstandsstykket ved anvendelse af epichlorhydrin som monoepoxidet. 15

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, KENDETEGNET ved, at den vanduopløselige bærer er et vanduopløseligt polysaccharid.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at den vanduop- 20 løselig bærer er et vanduopløseligt polysaccharid udvalgt blandt agarose og cellulose. 1 2 35 Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at prøven er en vandholdig opløsning eller en vandig opløsning. 25 2 Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at adsorptionsmidlet anvendes i en mængde fra 3 til 100 mg pr. 1 ml prøve, og at adsorptionen udføres ved en temperatur i området fra 4 til 40°C, en pH-værdi fra 4 til 8, og en ionstyrke på ikke mere end 0,1. 30