DE69333397T2

DE69333397T2 - Retro-, inverso-, und retro-inverso synthetische peptidanaloge

Info

Publication number: DE69333397T2
Application number: DE69333397T
Authority: DE
Inventors: Alfio Comis; Peter Fischer; Margaret Isabel Tyler
Original assignee: BIOCLONES Ltd Pty; BIOCLONES Pty Ltd SANDTON
Current assignee: BIOCLONES Ltd Pty; BIOCLONES Pty Ltd SANDTON
Priority date: 1992-08-27
Filing date: 1993-08-27
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2013-08-28
Also published as: BR9306984A; EP0667786A4; AU4934693A; DE69333397D1; CA2143823A1; CA2143823C; OA10129A; ATE258188T1; NZ255256A; HUT71860A; EP0667786B1; WO1994005311A1; EP0667786A1; HU9500571D0; AU667578B2; JP4116072B2; US6261569B1; CN1091138A; KR950702839A; JPH08500829A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft synthetische Peptidantigenanalogons eines nativen Peptidantigens mit Modifikationen, die partiell oder vollständig retro-, invertiert oder retro-invertiert modifiziert sind. Bei der Verabreichung als Immunogen an einen immunkompetenten Wirt induzieren die synthetischen Peptidantigenanalogons die Herstellung von Antikörpern, die das native Peptidantigen erkennen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendungen dieser Analogons, Vakzine und Verfahren zur Herstellung der Vakzine, die diese Antigenanalogons umfassen und Antikörper, die unter Verwendung dieser Antigenanalogons erzeugt werden.
STAND DER TECHNIK
Die Stereochemie von Polypeptiden kann anhand der topochemischen Anordnung der Seitenketten der Aminosäurereste über das Polypeptidgrundgerüst, das durch die Peptidbindungen zwischen den Aminosäureresten und den α-Kohlenstoffatomen der gebundenen Reste definiert ist, beschrieben werden. Außerdem haben die Polypeptidgrundgerüste definierte Enden und damit eine Ausrichtung.
Der Hauptanteil der natürlich vorkommenden Aminosäuren sind L-Aminosäuren. Natürlich vorkommende Polypeptide sind im großen Umfang aus L-Aminosäuren zusammengesetzt.
D-Aminosäuren sind Enantiomere von L-Aminosäuren und bilden Peptide, die hier als invertierte Peptide bezeichnet werden, das heißt, Peptide, die den nativen Peptiden entsprechen, allerdings aus D-Aminosäuren anstatt L-Aminosäuren aufgebaut sind.
Retropeptide sind aus L-Aminosäuren aufgebaut, worin die Aminosäurereste in entgegengesetzter Richtung zur nativen Peptidsequenz angeordnet sind.
Die retro-invertierte Modifikation von natürlich vorkommenden Polypeptiden umfasst die synthetische Anordnung von Aminosäuren mit einer α-Kohlenstoffstereochemie entgegengesetzt zu der der entsprechenden L-Aminosäuren, das heißt, D- oder D-Alloaminosäuren, in umgekehrter Reihenfolge zur nativen Peptidsequenz. Ein retro-invertiertes Analogon weist somit revertierte Enden und eine revertierte Ausrichtung der Peptidbindungen auf, während praktisch die Topologie der Seitenketten wie in der nativen Peptidsequenz erhalten bleibt.
Partielle retro-invertierte Peptidanalogons sind Polypeptide, bei denen nur ein Teil der Sequenz revertiert und durch enantiomere Aminosäurereste ersetzt ist. Da der retro-invertierte Bereich eines solchen Analogons revertierte Amino- und Carboxyltermini aufweist, sind die Aminosäurereste, die den retro-invertierten Bereich flankieren, durch seitenkettenanaloge α-substituierte paarweise Diaminomethane und Malonate ersetzt.
Verfahren für die Synthese von retro-invertierten Peptidanalogons (Bonelli et al., 1984; Verdini und Viscomi, 1985) und einige Verfahren für die Festphasensynthese von teilweise retro-invertierten Peptidanalogons sind bereits beschrieben worden (Pessi et al., 1987).
Es ist beobachtet worden, dass aufgrund der Stereospezifität der Enzyme gegenüber ihren Substraten, der Austausch von L-Aminosäureresten durch D-Aminosäurereste in den Peptidsubstraten in allgemeinen die proteolytische Enzymerkennung und/oder Aktivität zerstört, obwohl hier auch Ausnahmen bekannt sind.
Peptidhormone sind von besonderem Interesse als Targets für die Retroinvertierung gewesen, weil wahrscheinlich ihre Analogons eine mögliche Anwendung als therapeutische Mittel haben können. So sind teilweise, und in einigen Fällen vollständige, retro-invertierte Analogons von einer Anzahl von Peptidhormonen hergestellt und getestet worden (siehe beispielsweise Goodman und Chorev, 1981).
Es ist generell festgestellt worden, dass vollständig oder verlängert partielle retro-invertierte Analogons von Hormonen keine biologische Aktivität aufweisen. Der Mangel an biologischer Aktivität ist auf die möglicherweise komplexen strukturellen Änderungen, die durch die umfassende Modifikation verursacht werden, auf die Gegenwart der revertierten Kettenenden oder die Gegenwart von Prolinresten in den Sequenzen zurückzuführen ist. Einige partielle retro-invertierte Analogons, das heißt Peptide, bei denen nur ausgewählte Reste dagegen modifiziert sind, sollen die biologische Aktivität erhalten oder verstärken. Die Retroinvertierung hat ebenfalls eine Anwendung auf dem Gebiet des rationalen Designs von Enzyminhibitoren Anwendung gefunden.
Die Tatsache, dass die Retroinversion von biologisch aktiven Peptiden nur mit sehr eingeschränktem Erfolg bei der Erhaltung oder Verstärkung der Aktivität des nativen Peptids einsetzbar war, ist wahrscheinlich auf verschiedene Gründe zurückzuführen. Obwohl die Struktur sehr ähnlich ist, wurde bereits früh erkannt, dass Peptide und ihre Retroenantiomere topologisch nicht identisch sind, und Studien über die Kristallstruktur und die Lösungskonformation haben dieses bestätigt. Die biologische Aktivität eines Peptidhormons oder Neutrotransmitters hängt primär von seiner dynamischen Wechselwirkung mit einem Rezeptor und auch von Umformungsprozessen des Peptid/Rezeptor-Komplexes ab. Es ist nun klar, dass diese Wechselwirkungen komplexe Prozesse sind, bei denen mehrere Konformationseigenschaften und topologische Eigenschaften involviert sind. Es ist deswegen nicht überraschend, dass ein retro-invertiertes Analogon nicht in der Lage ist, alle diese Eigenschaften nachzuahmen.
Die Entwicklung von synthetischen Peptidvakzinen ist seit den letzten zwei Dekaden ein sehr aktives Forschungsfeld gewesen (Arnon, 1991; Steward und Howard, 1987). Leider ist nicht viel über die Chemie der Antigen-Antikörper-Bindung bekannt; bisher sind erst wenige Röntgenstrahlenkristallstrukturen von Antokörper-Antigen-Komplexen aufgelöst worden (Davies et al., 1988). Im Ergebnis war es vor der vorliegenden Erfindung nicht möglich, vorauszusagen, ob Antikörper gegenüber einem inversen, retro- oder retro-invertierten Peptid aktiv sind und ob diese Antikörper in der Lage sein können, dass native Peptidantigen, von dem die Peptidsequenz stammt, zu erkennen. Lerner und Mitarbeiter (Lerner, 1984) berichten über die Synthese von nativen, retro-, invertierten und retro-invertierten Formen eines Hämagglutininpeptids des Influenzavirus. Sie behaupten, dass Antikörper gegenüber diesen Peptiden nicht kreuzreaktiv sind und dass nur Antikörper gegen das Peptid in nativer Form an das native Peptidantigen binden.
Die Oralimmunisierung mit der Produktion von sekretorischem Immunglobulin A (IgA)-Antikörpern bei verschiedenen Mukosaerkrankungen, wird bereits seit vielen Jahren, insbesondere für Gastrointestinalinfektionen, verwendet worden. Die erfolgreiche Induktion einer systemischen Immunantwort gegenüber einem oral verabreichten Polypeptidantigen erfordert, dass mindestens ein Teil des Antigens in den Kreislauf aufgenommen wird. Es ist nun bekannt, dass der Darmpeptidtransport ein bedeutender Prozess ist, mit den Endstadien der Peptidverdauung, die intrazellulär nach einem nicht spezifischen Transport der Peptide in die Schleimhaut absorbierenden Zellen auftritt. Es gibt ebenfalls eine unwiderlegbare Effizienz, dass kleine Mengen von intakten Peptiden und Proteinen in den Kreislauf von den Därmen unter normalen Umständen eintreten. Aufgrund uneffizienter Darmabsorption und aufgrund proteolytischen Abbaus des "nativen" Polypeptidantigens überschreitet die Menge des Antigens, die für die orale Immunisierung erforderlich ist, im Allgemeinen bei weitem das, was für die parenterale Induktion der systemischen Immunität erforderlich ist. Des weiteren führt oftmals die orale Präsentation dieser großen Antigenmengen zu der simultanen Induktion einer IgA/Suppressor T-Zellenvermittelten systemischen Toleranz, was dazu führt, dass die Produktion von Immunoglobulin G (IgG)-Antikörpern vermindert wird. Deswegen besteht ein Bedarf an nicht tolerogenen effektiven oralen Vakzinen, die einem proteolytischen Angriff standhalten können.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich "retro modifiziert" auf ein Peptid, das aus L-Aminosäuren, worin die Aminosäurereste in entgegengesetzter Richtung zum nativen Peptid angeordnet sind und das somit retro-modifiziert ist.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich durchweg "invers modifiziert" auf ein Peptid, worin die Aminosäurereste in der gleichen Richtung wie im nativen Peptid angeordnet sind, so dass es invers (invertiert) modifiziert ist.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich durchweg "retro-invertiert modifiziert" auf ein Peptid, das aus D-Aminosäuren zusammengesetzt ist, worin die Aminosäurereste in umgekehrter Richtung zum nativen Peptid angeordnet sind, so dass es retro-invertiert modifiziert ist.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich durchweg der Ausdruck "nativ" auf jede Sequenz von L-Aminosäuren, die als Anfangssequenz für die Herstellung von Analogons, die teilweise oder vollständig retro-, invers- oder retro-invers modifiziert sind.
Der in der Beschreibung und in den Ansprüchen durchweg verwendete Ausdruck "Peptid" soll Peptide jeder Länge bedeuten.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich der Ausdruck "antigenes Fragment" durchweg auf ein Peptid, das ein Teil eines Antigens ist, der selbst immunogen ist oder in der Lage ist, Antikörper zu binden.
Der in der Beschreibung und in den Ansprüchen durchweg verwendete Ausdruck "Antigen" soll Immunogene, je nach Zusammenhang, umfassen.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich der Ausdruck "Antigenanalogon" durchweg auf ein Peptidmolekül, das in der Lage ist, die immunologische Aktivität des nativen Peptids-Antigens im Hinblick auf ein solches, das teilweise oder vollständig retro-, invers- oder retro-invers modifiziert ist, nachzuahmen.
Die teilweise Modifikation bezieht auf ein Analogon, worin ein Teil des nativen Peptids modifiziert ist. Der modifizierte Teil bzw. die modifizierten Teile müssen mindestens als Minimum ein antigenes Fragment umfassen, das in der Lage ist, Antikörper zu produzieren und/oder zu binden. Diese Fragmente sind längenvariabel, so dass teilweise modifizierte Analogons Analogons einschließen können, in denen nur zwei aufeinanderfolgende Reste modifiziert sind. Typischerweise sind mindestens fünf oder sechs aufeinanderfolgende Reste modifiziert.
Andere Aminosäuren können in der Regel, jedoch ohne Einschränkung auf die L-Isomere, zu dem Antigenpeptid wegen der Konjugation oder der Erhöhung der Löslichkeit gegeben werden. Cystein kann als das ACM-Derivat davon hinzugefügt sein, um die Polymerisation und Cyclisierung eines Peptids zu verhindern, oder es kann auch durch Aminobuttersäure ersetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antigenanalogons von aktiven Peptidantigenen, die teilweise oder vollständig retro-, invers- oder retro-invers modifiziert sind, die, wenn man sie als Immogen an einen immunkompetenten Wirt verabreicht, die Produktion von Antikörpern induzieren, die das native Antigen erkennen. Überraschenderweise ist gezeigt worden, dass die erfindungsgemäßen Antigenanalogons eine immunologische Aktivität aufweisen, und deshalb Kandidaten für die Herstellung von Vakzinen darstellen. Der Einbau von D-Aminosäuren in die Peptidantigenanalogons erhöht ihre Stabilität gegenüber dem Abbau nach der Verabreichung. Des weiteren zeigt die Eingabe von D-Aminosäuren ein Potenzial für die orale Verabreichung der Analogons. Da gezeigt worden ist, dass Antikörper gegen retro, invertierte (invers) und retro-invertierte Antigenanalogons hervorgerufen werden können, die in der Lage sind, das native Peptidantigen, aus dem die Sequenz des Analogons stammte, zu erkennen, folgt, dass im Allgemeinen erwartet werden kann, dass retro, invertierte und retro-invertierte Antianalogons erfolgreich sind, weil die Antikörper/Antigen-Bindungswechselwirkungen von Fall zu Fall nicht fundamental voneinander verschieden sind.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptidantigenanalogon eines nativen Peptidantigens zur Verfügung gestellt, welches Analogon teilweise oder vollständig im Hinblick auf das native Antigen retromodifiziert ist.
Nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptidantigenanalogon eines nativen Peptidantigens zur Verfügung gestellt, welches Analogon teilweise oder vollständig invers modifiziert im Hinblick auf das native Antigen ist.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptidantigenanalogon eines nativen Peptidantigens zur Verfügung gestellt, welches Analogon teilweise oder vollständig im Hinblick auf das native Antigen retroinvertiert modifiziert ist. Die erfindungsgemäßen Analogons induzieren die Produktion von Antikörpern, die das native Peptidantigen erkennen, wenn sie als Immunogen einem immunkompetenten Wirt verabreicht werden. Bei den retro-invertierten Analogons ist erkannt worden, dass in speziellen Fällen eine weitere Modifizierung erforderlich sein kann. Wenn das gewählte Peptidantigen kleiner als die durchschnittliche Größe einer Antikörper bindenden Antigenstruktur ist, dann werden die C- und N-terminalen Gruppen genauso wie die internen Reste bei der Erkennung des Antikörpers und der Bindung an diesen wichtig. Eine vollständige retro-invertierte Inversion eines solchen Peptidantigens unterscheidet sich wahrscheinlich ausreichend von dem nativen Peptidantigen an seinen Enden, so dass es als Antigenanalogen ineffektiv wird. Für diese Peptide ist es wünschenswert, entweder Polymere, die aus multiplen Kopien des Peptids hergestellt sind, herzustellen oder die Enden der Peptide zu modifizieren, indem sie mit beispielsweise zusätzlichen Resten, die daran gebunden werden, geschützt werden oder durch Seitenkettenanaloge substituierte paarweise Diaminomethane und Malonate ersetzt werden. Andere Techniken, wie die Cyclisierung dieser Peptide, sind ebenfalls von Nutzen.
Typischerweise sind die entstandenen Antikörper in der Lage, die verschlechterte biologische Aktivität der nativen Peptidantigene zu neutralisieren, allerdings sollte auch verstanden werden, dass die Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Analogons, die an das native Peptidantigen, je nachdem, ob sie ebenfalls diese Neutralisation durchführen können, binden können, beispielweise in diagnostischen Anwendungen Verwendung finden. Wenn die erfindungsgemäßen Antigenanalogons zu der Produktion von Antikörpern, die das native Antigen erkennen, führen, dann folgt daraus, dass sie Kandidaten für Vakzinkomponenten in solchen Situationen sind, wo eine Vakzinierung bzw. Impfung gegen ein natives Antigen gewünscht ist. Es ist erkannt worden, dass bei einigen Individuen in einer Population von Testviren ein Teil davon nicht auf die Immunisierung antwortet, was auch eine Restriktion des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) zurückzuführen ist. Allerdings antworten solche Mitglieder der Population, die antworten, sehr gut. Dieser Mangel der Antwort ist ein allgemeines immunologisches Phänomen und sollte als eine Indikation dafür betrachtet werden, dass die retro-invertierten Antigenanalogons eine sich ändernde Effizienz aufweisen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls die erfindungsgemäßen Antigen-Analogons, wenn sie dafür verwendet werden, einen immunkompetenten Wirt zu immunisieren.
Nach einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vakzine bzw. ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der mindestens ein erfindungsgemäßes Antigenanalogon zusammen mit einem pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Adjuvans umfasst.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können Antigenanalogons, die mit einem geeigneten Träger konjugiert sind oder mit dem Analogon und einem proteinhaltigen Träger unter Bildung eines kontinuierlichen Peptids synthetisiert sind, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können unter Anwendung von Standardmethoden aus dem Stand der Technik für die Vakzinformulierung formuliert werden.
Die Auswahl geeigneter Verdünnungsmittel, Träger, Bindemittel und/oder Adjuvantien kann nach Standardtechniken aus dem Stand der Technik erfolgen.
Bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen synthetischen Peptidantigenanalogons, die D-Aminosäuren enthalten, in der Lage, Immunantworten hervorzurufen, die länger andauern als die, die man mit dem entsprechenden nativen Antigen enthält.
Typischerweise ist das native Antigen ein in der Natur vorkommendes Polypeptid oder ein antigenes Fragment davon, das in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Wirt hervorzurufen. Native Antigene in der vorliegenden Erfindung umfassen Peptide und Polypeptide jeder Länge, deren Aminosäuresequenzen von Polypeptiden von Pathogenen, wie Polymyelitis, Hepatitis B, Maul- und Klauenseuche von Viehbeständen, Tetanus, Pertussis, HIV, Cholera, Malaria, Influenza, Mittel, die Rabies oder Diptherie verursachen oder Toxine, wie Rubostoxin, Hitze labiles Toxin von pathogenen Escherichia coli Stämmen und Shiga Toxin von Shigella dysenteriae, stammen. Andere von Interesse umfassen das Amyloid β Protein (Alzheimer Erkrankung) und das humane Choriongonadotropin und Gonadotropin freisetzende Hormon (kontrazeptive Vakzine).
Bevorzugte erfindungsgemäße Analogons sind Analogons des Maleriaantigens, das das immundominante Epitop des Zirkumsporozitmantelproteins von P, falciparum sporozoites ist, oder ein Diphterietoxinantigen oder ein HIV-1-Antigen, HBV-Antigen oder Robustoxin. Insbesondere bevorzugt sind die Analogons der retro-invertierten Formen dieser Moleküle.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können an Wirte, die eine solche Behandlung benötigen, durch Injektion verabreicht werden. Vakzine, die die D-Aminosäuren enthaltenden Analogons umfassen, können ebenfalls oral verabreicht werden. Wenn die Vakzine durch Injektion verabreicht werden soll, kann das Antigenanalogon mit einem geeigneten Trägermolekül konjugiert sein und über herkömmliche Methoden, wie beispielsweise intramuskulär, injiziert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Impfen eines Wirts, der eine solche Behandlung benötigt, zur Verfügung, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Antigenanalogons oder einer erfindungsgemäßen Vakzine an einen Wirt umfasst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Antikörper, die durch Immunisierung eines Wirts mit den erfindungsgemäßen Antigen Analogons, hergestellt werden, zur Verfügung gestellt. Diese Antikörper sind als Mittel bei der Diagnose, Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, und auch für die Arzneimittelabgabe geeignet.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Analyse einer Probe auf Antikörper gegen ein natives Peptidantigen zur Ver fügung, wobei ein erfindungsgemäßes Antigenanalogon des Antigens verwendet wird.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Analyse einer Probe auf die Gegenwart eines nativen Peptidantigens zur Verfügung, wobei die erfindungsgemäßen Antikörper, die das Antigen erkennen, verwendet werden.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Diagnosekit zur Verfügung, der mindestens ein erfindungsgemäßes Antigenanalogon oder einen erfindungsgemäßen Antikörper zusammen mit positiven und negativen Kontrollstandards umfasst. Wenn der Kit dafür verwendet werden soll, Antikörper gegenüber einem besonderen nativen Antigen nachzuweisen, umfasst der Kit das Antigenanalogon des nativen Antigens. Der positive Standard kann ein erfindungsgemäßer Antikörper gegenüber diesem Antigenanalogen sein. Der negative Standard kann jeder nicht kreuzreagierende Antikörper sein. Wenn der diagnostische Kit für den Nachweis eines nativen Antigens verwendet werden soll, umfasst der Kit den Antikörper gegenüber einem Analogon des nativen Antigens. Das Analogon des nativen Antigens kann als positiver Standard benutzt werden. Ein Peptid, das nicht vom Antikörper erkannt wird, wird als negativer Standard verwendet.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Antigenanalogons eines nativen Peptidantigens zur Verfügung, wobei ein teilweise oder vollständiges retro-invertiertes oder retro-invertiertes Analogon des nativen Peptidantigens synthetisiert wird.
Andere Aminosäuren können in der Regel, allerdings ohne Einschränkung auf L-Isomere, in das Antigenpeptid für die Konju gation oder die Erhöhung der Löslichkeit hinzugegeben werden. Cystein kann als sein AcM-Derivat eingebaut werden, um die Polymerisation oder Cyclisierung eines Peptids zu verhindern oder durch Aminobuttersäure ersetzt werden.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen ein natives Peptidantigen zur Verfügung, welche Methode folgendes umfasst: Bereitstellen eines retro-, invertierten oder retro-invertierten Analogons des nativen Peptidantigens und Vermischen einer effektiven Menge des Antigenanalogons mit einem pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel und/oder Adjuvans. Das Verfahren zur Herstellung einer Vakzine kann außerdem die Konjugation des Antigenanalogons an ein geeignetes Trägermolekül umfassen.
Abkürzungen

Ab: Antikörper
BOP: (Benzotriazolyloxy)tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (Castro-Reagenz)
DMF: Dimethylformamid
BSA: Rinderserumalbumin
ELISA: Enzym gebundener Immunsorbtionsassay
Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Ig: Immunoglobulin
in: invers (invertiert)
i. p.: intraperitoneal
KLH: "Keyhole limpet" – Hämocyanin
Mod: Modell
no: normal (nativ)
PBS: Phosphatpuffersalzlösung (10 mMol Phosphat, 150 mMol NaCl, pH 7,4)
Pfp: Pentafluorphenyl
PVC: Polyvinylchlorid
re: retro
ri: retro-invertiert
TFA: Trifluoressigsäure

Aminosäuren
Die L-Aminosäuren werden durch eine verkürzte Buchstabenfolge angegen, das heißt, Ala bedeutet L-Alanin.
Die D-Aminosäuren werden durch Buchstabenfolgen mit kleinen Buchstaben abgekürzt, z. B. ala bedeutet D-Alanin.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 erläutert Modifikationen, die an der Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können. R¹, R², R³ und R⁴ bedeuten Aminosäureseitenketten, und Xaa bedeutet jeden Aminosäurerest.
2 zeigt die Ergebnisse eines ELISA eines retroinvertierten Modells mit (mod)-Peptid-KhH-Antiserum gegenüber verschiedenen immobilisierten Peptid-BSA. -noMod (☐), riMod (+), reMod (♢), inMod (Δ), Kontrolle 1 (x), Kontrolle 2 (∇).
Die 3 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von Malaria (Mal) -Peptidantiseren (orale Immunisierung) gegenüber Peptid-BSA. – Serum/immobilisiertes Antigen: riMal/riMal (Δ), riMal/noMal (+), noMal/noMal (☐), noMal/riMal (♢), Nichtimmunserum/noMal (X).
Die 4 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von Diphterie (DIP)-Peptid-KLH-Antiseren gegen immobilisierte Peptid-BSA. – Serum/immobilisiertes Antigen: riDip/riDip (Δ), riDip/noDip (+), noDip/noDip (☐), noDip/riDip (♢), Nichtimmunserum/noDip (x).
Die 5 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von Diphterie (Dip)-Peptid-KLH Antiseren gegen immobilisiertes Diphterietoxin. – Anti-riDip (+), anti-noDip (☐), Nicht-Immunserum (♢).
Die 6 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von oralinduzierten Diphterie (Dip)-Peptidantiseren gegen immobilisiertes Diphterietoxin. – Anti-noDip, 2 Wochen (☐); Anti-riDip, 2 Wochen (+), anti-riDip, 8 Wochen (♢).
Die 7 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von HIVgp41 (735–753)-Antiseren gegenüber immobilisiertem Peptid: Serum/immobilisiertes Antigen.
Die 8 zeigt die Ergebnisse eines ELISA von HIVgp41 monoklonalen Antikörpern mit gp41 Peptiden.
Die 9 zeigt in der Graphik die ELISA-Ergebnisse von Beispiel 14.
☐ riHBV-Plattenbeschichtung

noHBV-Plattenbeschichtung
10 zeigt in der Graphik die ELISA-Ergebnisse von Beispiel 15.
S1: no-Peptid beschichtete Löcher
S2: ri-Peptid beschichtete Löcher
Die 11 zeigt in der Graphik die ELISA-Ergebnisse von Beispiel 16.
Fette Linien: Antiseren gegen ri-HBV-Peptid
Normale Linien: Antiseren gegen noHBV-Peptid
Kreis- und Diamandsymbole: noHBV-Peptid beschichtete Löcher.
Viereckige und Dreieckige Symbole: riHBV-Peptid beschichtete Löcher.
12 zeigt in der Graphik die ELISA-Ergebnisse von Beispiel 17.
Fette Linien: Antiseren gegenüber ri-HBV-Peptid
Normale Linien: Antiseren gegenüber no-HBV-Peptid
Kreis- und Diamandsymbole: no-HBV-Peptid beschichtete Löcher.
Viereckige und Dreieckige Symbole: riHBV-Peptid beschichtete Löcher.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM FÜR DIE ERFINDUNG
Es werden erfindungsgemäße Antigenanalogons nach Standardtechniken für die Herstellung von L- und D-Aminosäure haltigen Peptiden, insbesondere wie in Beispiel 1 angegeben ist, hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Vakzine werden nach Standardtechniken für die Vakzineformulierung unter Verwendung von standardmäßi gen Trägern, Verdünnungsmitteln, Bindemittel und Adjuvantien, die für die Formulierung von oralen und injizierbaren Vakzinen geeignet sind, formuliert. Effektive Mengen der Antigenanalogons, die in die Vakzine eingegeben werden sollen, können nach Standardmethoden bestimmt werden.
Die angewendeten Vakzinierungsregime sind Standardregime für die Vakzinierung von tierischen oder menschlichen Wirten. Diese Regime können angewendet werden, wenn die Immunisierung des Wirts erwünscht ist oder wenn der Wirt dafür verwendet wird, Antikörper für die exogene Anwendung zu produzieren. Die erfindungsgemäßen Diagnosekits werden nach Standardmethoden für die Herstellung der Reagenzien und Kontrollen dieser Kits hergestellt.
Im Allgemeinen liegen die Diagnosekits in Formaten von Radioimmunassay (RIA) oder Immunfluoreszenz oder ELISA vor: Der letztere kann, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt werden.
Wenn die Analogons oder die dagegen entstandenen Antikörper beim Nachweis eines nativen Antigens oder eines Antikörpers dagegen verwendet wird, kann das geeignete Mittel in Immunassayformat gegen eine zu testende Probe mit geeigneten Kontrollen verwendet werden.
Die Erfindung wird weiterhin in folgenden Beispielen beschrieben, die die Erfindung erläutern sollen, allerdings sollen auf keinen Fall ihren Umfang einschränken.
Die folgenden Beispiele zeigen, dass die erfindungsgemäßen Antigenanalogons Antikörper hervorbringen können, die die native Sequenz, nicht nur in Form eines Peptids, sondern ebenfalls wenn sie in dem Protein, aus dem sie stammt, enthalten ist, erkennen können. Drei Antigensequenzen wurden gewählt und auf ihre Fähigkeit getestet, Antikörper zu produzieren, die die native Elternsequenz (Beispiele 5, 6 und 7) erkennen und damit in Wechselwirkung treten können. Eine Antigensequenz (Beispiel 5) war ein Modell ohne biologische Relevanz, während die anderen zwei Antigensequenzen (Beispiel 6 und 7) synthetische Peptidantigene darstellen, deren Potential als Vakzine gegen Malaria und Diphterie bereits zuvor gezeigt worden ist. Die beobachtete Kreuzreaktivität von Antikörpern gegen "native" und retro-invertierte Peptide zeigt stark an, dass die Antikörper die Antigene primär durch die Konstellation ihrer Aminosäureseitenketten unabhängig von ihrem Grundgerüst erkennen. In allen drei untersuchten Fällen schienen die polyclonalen Antikörperpräparationen gegen retro-invertierte Peptidantigene gleich gut an die Elternsequenz und an das retro-invertierte Antigen zu binden.
Es ist gezeigt worden, dass eine konventionelle Immunisierung mit retro-invertierten Antigenen, die an Trägerproteine konjugiert sind und die orale Imunusierung mit freien retroinvertierten Antigenen machbar sind. Die Fähigkeit, kreuzreaktive Serumantikörper zu retro-invertierten Antigenen zu induzieren, zeigt die Eignung dieser Antigene als Vakzine an. Wie gezeigt wurde, sind diese Antigene einer Immunisierung ohne Trägerproteine, nicht durch Injektion, sondern ebenso durch orale Verabreichung, zugänglich. Wahrscheinlich ist dieses von mindestens einem T-Zellenepitop, das vorhanden ist, abhängig. Diese Beobachtung, zusammen mit der Feststellung, dass die Immunantwort gegenüber retro-invertierten Antigenen relativ langlebig ist, zeigt die Eignung dieser Analogons an, die bei den Hauptprobleme, die bei experimentellen synthetischen Peptidvakzinen vorhanden sind, zu überwinden, an.
BEISPIEL 1
Peptidsynthese
Die Peptide wurden nach einer Festphasenmethode auf Polyamid-(Aeshady et al., 1981) oder Polyhipe-Trägern unter Verwendung von Seitenketten geschützten Fmoc-Aminosäuren (Carpino & Han, 1972), im wesentlichen nach der Beschreibung von Eberle et al., (1986) durchgeführt. Es wurden nur reine Aminosäurederivate, die kommerziell oder über die Synthese erhältlich sind, verwendet. Die Polyamidsyntheseharze, die durch Verknüpfungsmittel auf der Basis von p-Alkoxybenzylalkohol derivatisiert sind, wurden quantitativ mit den praktisch vorgeformten C-terminalen symmetrischen Fmoc-Aminosäureanhydriden in Gegenwart von 0,2 molaren Äquivalenten von N,N-Dimethylaminopyridin und N-Methylmorpholin verestert. Das mit dem Fmoc-Rink-Verknüpfungsmittel (Rink, 1987) derivatisierte Polyhipeharz brauchte keine Veresterung der ersten Aminosäure. Die Kettenverlängerung wurde unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurepentafluorphenylester (Atherton et al., 1988) oder durch Castro-Reagenz/1-Hydroxybenzotriazol-Kupplung (Hudson, 1988) durchgeführt. Das Fortschreiten der Synthese wurde unter Anwendung eines spezifischen Farbentests (Hancock & Battersby, 1976) und/oder einer Aminosäureanalyse der Säure hydrolysierten Peptidylharzproben beobachtet.
Die Peptide wurden von den Harzen abgespalten und die Seitenkette wurde mit Hilfe von TFA, die eine geeignete Mischung ei ner Reinigungschemikalie (Tam, 1988) enthielt, von der Seitenkettenschutzgruppe befreit. Nach der Filtration und Vakuumverdampfung wurden die Peptide mit Diethylether pulverisiert, abzentrifugiert und aus einer wässrigen Ammoniumbicarbonatlösung lyophilisiert.
Mit allen Peptiden wurde am Anfang eine Entsalzungs- und Reinigungsstufe über die Säulenchromatographie auf geeigneten Gelfiltrationsmedien in wässrigen Lösungsmitteln durchgeführt. Danach wurden die bis zur Homogenität über Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Wasser/Acetonitril (enthält 0,05–0,1 TFA)-Gradientenelution gereinigt. Die Reinheit der synthetischen Peptide wurde durch die Gasphasensäurehydrolyse/pminosäure-Analyse (Bidlingmeyer et al., 1987) und, falls notwendig, durch automatische Gasphasensequenzierung (Hunkapiller & Hood, 1983) bestätigt.
BEISPIEL 2
Peptid/Trägerprotein-Konjugation
Es wurden synthetische Peptide über ihre Cysteinthiolgruppen an Trägerproteine unter Anwendung einer Methode in Annäherung von Liu et al., (1979) wie folgt gebunden:
KLH (40 mg) oder BSA (100 mg) wurden in 3 ml 50 mMol Phosphatpuffer, pH 6,0 gelöst.
Es wurde m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS; 0,2 ml einer frischen 25 mg/ml Vorratslösung in N,N-Dimethylformamid) langsam hinzugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Sie wurde dann sofort durch eine 0,8 mm Membran gefiltert und auf eine Sephacryl S-300-Säule (11 × 170 mm). Dieses wurde bei 0,25 ml/Min mit einem Puffer mit pH 6 entwickelt. Die Protein-MB-haltigen Fraktionen wurden gesammelt, zusammengelegt und in eine vorbereitete Peptidlösung (10 μMol Phosphatpuffer, pH 7,5) gegeben. Der pH dieser Mischung wurde auf 7,5 mit 0,1 Mol NaOH eingestellt; sie wurde dann mit Stickstoff gespült, verschlossen und magnetisch für 2,5 Stunden gerührt. Nach einer ausgiebigen Dialyse M_r (12.000–15.000 Ausgang) gegen verdünntes Ammoniumdicarbonat wurden die Protein/Trägerprotein-Konjugate durch Lyophilisierung isoliert. Alle wässrigen Lösungen wurden vor der Anwendung entgast.
BEISPIEL 3
Immunisierung
Es wurden junge Albinomäuse aus der Schweiz für die Immunisierung verwendet. Es wurden intraperitoneale (i. p.) Injektionen von Peptid-KLH-Konjugaten ohne irgendein Adjuvans hergestellt. Die oralen Immunisationen wurden durchgeführt, indem ausgehungerte Mäuse mit Nahrungspellets, in die die geeignete Antigenlösung eingesogen war, gefüttert wurden.
BEISPIEL 4
ELISA-Prozeduren
Die Löcher von PVC-Mikrotiterplatten wurden mit dem geeigneten Antigen (0,25–10 μg/Loch), das in verdünntem Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,2 gelöst war, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Ansaugen wurde eine Blockierung durch die Inkubation für 2 Stunden mit 4%igem BSA oder gekochtem Casein, 0,05% Tween-20 in PBS, durchgeführt. Die Löcher wurden dann mehrere Male mit 0,1% Tween-20 in PBS vor der Zugabe von Antiserum, das serienmäßig in der Blockierungslösung verdünnt wurde, gewaschen. Nach der Inkubation für 4 Stunden wurden die Platten dann wieder gewaschen. Gebundenes IgG wurde durch Inkubation für 1 Stunde mit entsprechend verdünnter (in der Blockierungslösung) affinitätsgereinigter anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase nachgewiesen, wonach gewaschen wurde und mit 0,5 mg/ml O-Phenylendiamin, 0,01% Peroxid bei pH 5 im Dunklen entwickelt. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von 4 Mol Schwefelsäure gestoppt. Die Platten wurden dann gleich bei einer Wellenlänge von 492 nm gelesen.
Alle Inkubierungsschritte, mit der Ausnahme des Beschichtens, wurden bei Raumtemperatur und unter Bewegung der Platten durchgeführt.
BEISPIEL 5
Analyse der Antikörperproduktion und der Aktivität von Antikörpern gegenüber einer synthetischen Antigensequenz ohne biologische Relevanz
Die folgenden Modelldodecapeptide wurden unter Schutz der Cysteinthiolgruppe als Tritylthioether und anschließender Spaltung vom Peptitylharz mit 5% Thiophenol in TFA für 90 Minuten synthetisiert. Die Proteinkonjugate wurden zum Zwecke der Immunisierung hergestellt.
Normales (natives) Peptid (L-Aminosäuren, N→C-Richtung) noMod: H-Gly-Cys-Gly-Pro-Leu-Ala-Gln-Pro-Leu-Ala-Gln-Gly-OH (SEQ ID Nr. 1)
Retro-invertiertes Peptid (D-Aminosäuren, C→N-Richtung) riMod: H-Gly-gln-ala-leu-pro-gln-ala-leu-pro-Gly-Cys-Gly-OH
Retro-Peptid (L-Aminosäuren, C→N-Richtunng)
Remod: H-Gly-gln-Ala-Leu-Pro-Gln-Ala-Leu-Pro-Gly-Cys-Gly-OH (SEQ ID Nr. 2)
Invertiertes Peptid (D-Aminosäuren, N→C-Richtung) inMod: H-Gly-Cys-Gly-pro-leu-ala-gln-pro-leu-ala-gln-Gly-OH
Intraperitoneale Immunisierung
Es wurden Gruppen mit vier Mäusen pro Antigen intraperitoneal mit 0,2 mg/Dosis KLH-Peptid in 0,1 ml PBS immunisiert. Weitere Gaben wurden 4,9 und 16 Tage später gegeben. Die Antipeptidantikörper in den zusammengelegten Seren (aus jeder Gruppe) wur den in einem ELISA unter Verwendung immobilisierter BSA-Peptidkonjugate gemessen.
Es wurde festgestellt, dass alle vier Antigene, mit denen, die die D-Aminosäure enthielten, immunogen waren. Die Antiseren zeigten sehr ähnliche Antikörpergehalte, wenn sie gegen praktisch gleiche Menge von immobilisierten BSA-Konjugaten ihrer jeweiligen Peptidantigene überprüft wurden. Des weiteren haben die Antikörper in jedem der Antiseren an die anderen drei Peptidantigene ebenfalls gebunden. Die Ergebnisse eines solches Assays, wo die Bindung des retro-invertierten Peptid-KLH Antiserums an alle vier Peptide gemessen wurde, sind in 2 gezeigt. Die Tatsache, dass nicht nur eine Kreuzreaktion von noMod- und riMod-Antikörpern beobachtet wurde, sondern ebenfalls von Antikörpern gegen die nicht isosterischen Antigene, war insbesondere überraschend. Das würde zeigen, dass die untersuchten Antikörper die Aminosäureseitenkettengruppierungen im Antigen ohne Rücksicht auf die Sequenzrichtung und absolute Konfiguration der α-Kohlenstoffatome erkennen. Des weiteren wurde durch die Gegenwart der Prolinreste in den Peptidsequenzen nicht verhindert, dass die D-Aminosäure haltigen Peptide erfolgreich die native Sequenz nachahmen, wie es auch bei den retro-invertierten Peptidhormonanalogen beobachtet worden ist.
Zur Klärung der Antikörper, die spezifisch für die Trägerproteinbindungsstelle -Gly-Cys-Gly- sind, das heißt, der Bereich der allen Antigenen gemeinsam ist, wurde ebenfalls ein Antiserum gegen ein KLH-Konjugats eines 14-Restpeptids mit vollständig unverwandter Sequenz, allerdings mit der gleichen Bindungsstelle, untersucht (Kontrolle 1 in 2). Wie man sehen kann, scheinen die Antikörper für diese Stelle nicht signifi kant zur beobachteten Kreuzreaktivität beizutragen (die Kontrolle 2 betrifft die beobachtete Bindung des riMod-KLH-Antiserums nur an BSA).
Orale Immunisierung
Die orale Immunisierung mit den freien, das heißt, nicht konjugierten, nativen und retro-invertierten Modellpeptiden wurde wie folgt durchgeführt: 0,3 mg/Dosis der Peptide in 50 ml PBS wurden an Gruppen von Mäusen nach dem für die i. p. Immunisierung beschriebenen Schema verabreicht. Die Ergebnisse des ELISA der erhaltenen Seren sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Ergebnisse aus den entsprechenden Immunisierungen durch Injektion sind für Vergleichszwecke eingeschlossen.
Tabelle 1 ELISA von Modellpeptidantiseren
Die orale Immunisierung ergab nur eine nachweisbare Serum-igG-Antwort im Fall des retro-invertierten Peptids. Wieder schienen die Antikörper im retro-invertierten. Antiserum vollständig mit dem nativen Peptidkreuz zu reagieren. Wahrscheinlich war das retro-invertierte Peptid, im Gegensatz zum nativen Peptid in der Lage, in den Kreislauf in ausreichender Menge einzutreten, um eine IgG-Antwort auszulösen. Dass das retro-invertierte Peptid nur langsam abgebaut wird, wird ebenfalls durch die Tatsache angezeigt, dass das Anti-Peptid-IgG im Blutstrom der Tiere für viele Wochen verblieb.
BEISPIEL 6
a) Analyse der Antikörperherstellung und Aktivität der Antikörper gegenüber Peptidsequenzen, die dem immundominanten Epitop des Zirkumsporozoitmantelproteins von P. falciparum sporozoites entsprechen
Die folgenden vier Peptide wurden, auf der Basis des Immundominanten Epotops des Zirkumsporozoitmantelproteins von P. falciparum sporozoites, synthetisiert:
Die Cysteinderivate wurden als Tritylthioether für die Synthese geschützt. Sequenzinterne Asparagine wurden ohne Seitenkettenschutz als Pentafluorphenylester gebunden. Die Schutzgruppenentfernung der Fmoc-Asn-Pro-Peptidylharze wurde auf 3 Minuten verkürzt, wonach dann drei 15 s DMF-Waschungen und eine sofortige Acylierung mit Fmoc-Ala-OH/BOP-HOBt erfolgte, um den Verlust (ca. 50%) des Peptids aufgrund der Diketopiperazinbildung zu minimieren. Das Asparagin wurde an das Syntheseharz als das symmetrische Fmoc-Asn(Mbh)-OH-Anhydridderivat gekoppelt.
Die Abspaltung/Schutzgruppenentfernung wurde mit 5% Thiophenol in TFA für die noMalCys- und riMalCys-Peptidylharze und mit 5% wässriger TFA für die noMal- und riMal-Harze durchgeführt. Nach der Abspaltung wurde das riMal-Rohpeptid weiterhin für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 5% Thioanisol in TFA behandelt, um vollständig die Dimethoxybenzhydrilschutzgruppe zu entfernen.
Es wurden Gruppen von Mäusen i. p. in wöchentlichen Abständen für insgesamt vier Wochen mit 100 μg Dosen noMalCys- und riMalCys-KLH-Konjugaten immunisiert. Es wurde Blut nach fünf Wochen entnommen und die Serumtiter durch ELISA festgestellt (Tabelle 2).
TABELLE 2 ELISA von Antiseren gegen Malariapeptid-KLH-Konjugate
Hier wurde festgestellt, dass das native Antigen immunogener als das retro-invertierte Antigen ist. Wie bei den vorherigen Beispielen waren die Antiserien vollstärdig kreuzreaktiv. Es wurden Mäuse oral mit den noMal und riMal-Peptiden in wöchentlichen Abständen für insgesamt vier Wochen immunisiert. Es wurde Blut entnommen und über ELISA nach fünf Wochen untersucht. Die Ergebnisse der Titration sind in 3 gezeigt. Nur das retro-invertierte Peptid induzierte einen signifikanten Titer der Anti-Peptidantikörper. Es gab wohl eine vollständige Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit dem normalen Peptid, in der gleichen Weise wie die Peptid-KLH-Antiseren vollständig kreuzreaktiv waren.
b) Test von no/riMal-Peptiden mit Seren von Malariapatienten
Es ist gezeigt worden, dass hohe Gehalte von Antikörpern, die gegen die Wiederholungssequenzen der Zirkumsporozoitproteins gerichtet sind, die Sporozoitentwicklung inhibieren können (Mazier et al., 1986). Des weiteren haben sich eine rekombinante Vakzine, die diese Wiederholungen enthält und auch eine PeptidVakzine, die drei NANP-Wiederholungen, die an das Tetanus Toxoid gebunden sind, besteht, als vielversprechend in klinischen Versuchen gezeigt (Herrington et al., 1987 & 1990). Nachdem gezeigt worden ist, dass Antiseren, die in Tieren gegenüber den noMal- und riMal-Peptiden entstanden waren, kreuzreaktiv waren, war es wichtig zu zeigen, dass Anti-Sporozoitantikörper in Menschen mit Malaria beide Peptide erkannten.
Serumproben von Thaipatienten mit Malaria wurden hergestellt. Es war bekannt, dass diese Seren Antikörper gegen das immundominante Epitop des Plasmodiumfaciparum circumsporozoit-Proteins (Wirt et al., 1989) enthalten. Mit wenigen Ausnahmen wurde bei allen Patienten klinisch Malaria diagnostiziert, die erst kürzlich Attacken erlitten hatten.
Wir testeten diese Seren auf Antikörper, die an ein rekombinantes Zirkumsporozoitkonstrukt, ein synthetisches Polymer und noMal, alle davon enthalten NANP-Wiederholungen und auch riMal, binden können. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Wie man sehen kann, gibt es für die meisten Seren eine gute Korrelation der Ergebnisse, wobei die Bindung an solche Antigene, die eine große Anzahl von NANP-Wiederholungen enthalten, stärker war. In jedem Fall wurde eine Kreuzreaktion der Antiseren zwischen den normalen und retro-invertierten Formen des (NANP)₃-Peptids beobachtet.
Tabelle 3
IgG-Antikörper in menschlichen Seren von Malariapatienten erkennen noMal und riMal-Peptide
Beschichte ELISA-Platten wurden mit serienweise verdünnten menschlichen Seren inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen und die gebundenen Antikörper wurden unter Verwendung von anti-humanem IgG, das an Meerrettichperoxidase gebunden war, nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden auf einer Skala ausgedrückt, wo + ein Titer (höchste Serumverdünnung, wie ein signifikantes Signal ergibt) von 1/320 bis +++++, was einen Titer > 2.560 anzeigt, bedeutet. Alle Ergebnisse wurden für eine nicht-spezifische Bindung unter Verwendung von zwei nicht-verwandten Peptiden, die an BSA in der gleichen Weise wie noMal und riMal konjugiert waren, als Kontrollen korrigiert.
BEISPIEL 7
Analyse der Antikörperproduktion und Aktivität von Antikörpern, die aus Peptidsequenzen entstanden sind, die der Aminosäuresequenz des Diphterietoxins entsprechen
Die folgenden zwei Peptide wurden, auf der Basis der Loopsequenz der 14 Aminosäurereste, abgeteilt durch die Disulfidgruppe nahe am Aminoterminus des Diphtherietoxinmoleküls, synthetisiert:
Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Cystein, tert.-Butoxycarbonyl für Lysin, tert.-Butyl für Serin und 4-Methoxy-2,3,-6-trimethylbenzolsulphonyl für Arginin. Asparagin wurde als freies Seitenkettenamid und in Form des Pentafluorphenylesters (Gausepohl et al, 1989) in beiden Fällen gebunden. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurde durch Umsetzen der Peptidylharze für 75 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2-Ethandithiol (Yajima et al., 1988) enthielt, durchgeführt.
Es wurden Mäuse (4 pro Antigen) mit 100 μm Dosen von KLH-konjugiertem normalen und retro-invertierten Peptid am Tag 0 i. p. immunisiert, gefolgt von weiteren Auffrischungen an den Tagen 4, 9 und 16. Es wurde Blut am 21. Tag entnommen und die Seren wurden zusammengefasst. Die IgG-Antikörper gegen die Peptide wurden unter Verwendung eines ELISA mit immobilisierten BSA-Peptidkonjugaten gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 zusamengefasst. Sowohl das normale als auch das retroinvertierte Peptid-KLH-Konjugat produzierten ähnliche Titer von Antikörpern, was wieder zeigt, dass die Gegenwart unnatürlicher Aminosäuren im Antigen zur Beibehaltung der Immunogenizität führt. Des weiteren zeigen die Ergebnisse, dass das IgG in beiden Antiseren beide Antigene gleich gut erkennt.
Die Antiseren wurden weiterhin auf ihre Fähigkeit untersucht, ihre Antigensequenz im Diphtherietoxin selbst zu erkennen. Es wurde für diesen Zweck ein ELISA mit immobilisierten Diphtherietoxin (1 μm/Loch) verwendet. Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die IgG-Antikörper in beiden Antiseren an das Toxin binden. Das retro-invertierte Peptid-KLH-Antiserum zeigte einen sehr hohen Antitoxintiter (ca. 10 × höher als der Titer des normalen Antiserums).
Ein weiteres überraschendes Ergebnis wurde bei der oralen Immunisierung mit freien nativen und retro-invertierten Diphtheriepeptiden verzeichnet. Hier wurden Mäusen eine Einzeldosis von ca. 1 mg Peptid gegeben. Nach 1 und 2 Wochen enthielten Serumproben von Tieren, die mit dem Peptid jeweils immunisiert waren, Antikörper, die an das Diphtherietoxin gebunden haben. In beiden Fällen war der Antitoxintiter beträchtlich. Acht Wochen nach der Immunisierung schienen andererseits nur die Tiere, die das retro-invertierte Peptid erhalten haben, die Antitoxin-Antikörper (6) zu enthalten.
Des weiteren war der gemessene Titer sehr hoch und vergleichbar mit dem, der durch weitere i. p. Immunisierung mit den entsprechen KLH-Konjugaten erhalten wurde.
BEISPIEL 8
HIV-1-Peptide
Viele AIDS-Vakzine, die aus rekombinanten Virenproteinen oder synthetischen Peptiden bestehen, sind bereits vorgeschlagen und auch getestet worden (Spalding, 1992). Eine Vielzahl von Epitopen, am meisten die von den Virusmantelglykoproteinen gp120 und gp41 sind mit der Fähigkeit in Zusammenhang gebracht worden, virusneutralisierende Antikörper zu induzieren. Für unsere Studien haben wir die gp41-Sequenzen 735–753 (Chanh et al., 1986) und 583–599 (Klasse et al., 1988) gewählt, und es wurden die folgenden Peptide hergestellt:
Die Synthesen wurden wie üblich durchgeführt, allerdings unter Verwendung eines Syntheseharzes mit Trialkoxydiphenylamid-Bindungen (Rink, 1987). Es wurden Konjugate mit BSA und KLH durch Glutaraldehyd Polymerisation nach Mariani et al. (1987) hergestellt. Es wurden Gruppen von Mäusen mit 100 μg/Dosis der HIVgp41 (735–753)-Peptid/KLH-Konjugate in Freund'schen vollständigen Adjuvans immunisiert, wonach dann zwei weitere Injektionen mit dem Freund'schen unvollständigem Adjuvans in 14tägigen Intervallen folgten. Es wurde Blut 2 Wochen nach der letzten Gabe gesammelt und es wurden Seren hergestellt.
Marine monoklonale Hybridomzelllinien produzierende Antikörper gegen das HIV-lgp41-Protein wurden durch Immunisierung mit rekombinantem gp41 erhalten. Die Milzzellen des Tieres mit der besten Immunantwort wurden isoliert und mit NS-1-Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol 4.000 fusioniert. Die erhaltenen Zellen wurden ausplattiert und mit limitierender Verdünnung kloniert.
Die polyklonalen Antiseren gegen beide HIV-gp41 (735–753)-Peptide wurden mit ELISA analysiert. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die ELISA-Platten wurden mit noHIVgp41 (735–753)-BSA und riHIVgp41 (735–753)-BSA bei 5 μg/Loch für 1 Stunde in Carbonatpuffer, pH 9,6, beschichtet. Nach 1 Stunde wurden die Platten mit einer gekochten Caseinlösung blockiert. Sie wurden dann für 1 Stunde mit serienmäßig verdünnten Serien von Mäusen, die mit den Peptid-KLH-Konjugaten immunisiert waren, inkubiert. Der Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase markiert war, wurde für den Nachweis verwendet. Die Ergebnisse wurden für die nicht spezifische Bindung (bestimmt unter Verwendung nicht verwandter Peptid-BSA-Konjugate) korrigiert. Der Durchschnitt von 5 Datenpunkten (entspricht 5 individuellen Mäusen pro Antigengruppe) wurde aufgetragen. Die Datenpunktmarkierungen (z. B. no/no) beziehen sich auf das beschichte Antigen/Antiserum. So ist das Ausmaß der Kreuzreaktion zwischen den Antikörpern zu den beiden Formen des Peptids deutlich. Zur Bestimmung, ob die individuellen Antikörper in der Lage sind, verschiedene Formen eines Peptids zu erkennen, wurden ELISA-Experimente unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen gp41 durchgeführt. Die Ergebnisse mit den HIVgp41 (583–599)-Peptiden sind in 8 gezeigt. Eine Libary von Zelllinien produzierenden Antikörpern gegen HIVgp41 wurde über ELISA unter Verwendung von noHIVgp41 (583–599)-BSA immobilisiert auf Mikrotiterplatten, vorgeprüft. 24 Klone wurden weiterhin getestet: 100 μl Zellüberstand wurde mit 5 μg/Loch von jedem der drei Peptid/BSA-Konjugate inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und die gebundenen Antikörper mit Hilfe eines anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugats nachgewiesen. Die unkorrigierten Farbsignale nach der Entwicklung mit o-Phenylendiamin/Peroxid wurden gegen die Zelllinienbezeichnungen aufgetragen. In jedem Fall, wo ein monolonaler Antikörper eine Form des Peptids erkannte, hat er ebenfalls an die anderen beiden Formen gebunden; tatsächlich schien das Ausmaß der Kreuzreaktion vollständig zu sein. Einige Zelllinien gegen pg41, die die HIVgp41 (735–753)-Peptide erkannten, wurden ebenfalls identifiziert, und es wurde wieder eine Kreuzreaktion festgestellt.
BEISPIEL 9
Retro-invertiertes Robustoxin (riRtx)
Das potentiell letale Robustoxin wird im Spinnengift der männlichen Trichternetzspinne gefunden (Nicholson et al., 1991).
Es hat sich gezeigt, dass die Immunisierung mit einer Vakzine, die aus einem synthetischen Analogon dieses Toxins hergestellt ist, Mäuse und Affen von Angriffen mit dem nativen Toxin schützen kann (Mylecharane et al., 1991). Um die Eignung der retro-invertierten Peptide als Vakzine zu zeigen, wurde ein retro-invertiertes Analogon von Rubustoxin mit der folgenden Sequenz hergestellt:
Das Peptid wurde gereinigt und seine Struktur durch Gasphasensequenzanalyse verifiziert. Die Vakzine wurde durch Polymerisieren von 0,2 mg des Peptids und 0,8 mg KLH in 1 ml Phosphat gepufferter Salzlösung mit 10 μl wässrigem 25%igen Glutaraldehyd bei Raumtemperatur über Nacht hergestellt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl einer 2%igen Lysinlösung gestoppt.
Es wurden Gruppen von Mäusen mit diesem Material oder mit einer Vakzine, die ähnlich hergestellt wurde, immunisiert, wobei allerdings normales Cys(Acm)-geschütztes synthetisches Rubotoxin nach folgendem Schema verwendet wurde: 14tägige Injektionen mit 50 μg Peptid-KLH, die ersten beiden subkutan und die drei weiteren Auffrischungen intraperetoneal. Diese Tiere, und auch die nicht-immunisierten Kontrollen wurden dann 14 Wochen nach der letzten Immunisierung mit 2 minimal letalen Dosen (die Bestimmung der letalen Dosis wurde kurz vor der Konfrontierung) des Trichternetzspinnengifts durch intravenöse Injek tion konfrontiert. Die nicht immunisierten Tiere starben innerhalb von 10 Minuten, während diejenigen, die mit der nativen Vakzine immunisiert waren, überlebten. Von den riRtx-KLH-immunisierten Individuen verstarb eines nach 24 Stunden, während die verbliebenen sieben der Herausforderung standhielten.
BEISPIEL 10
Hepatitis-C-Virushüllenpeptid
Es wurden die folgenden zwei Peptide auf der Basis der Hüllensequenz (306–330) des Hepatitis C Virus synthetisiert.
Die Synthese von noCEnv wurde auf einem Polyamid-PepsynKA-Harz, das mit Fmoc-Ala vorverestert war, durchgeführt, und das riCEnv befand sich auf einem Polyhipe-Rink-Harz. Die verwendeten Seitenschutzgruppen waren: Trityl für Cystein, Histidin und Asparagin, tert.-Butyl für Serin, Threonin und Asparaginsäure und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurden durch Umsetzen der Peptitylharze für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, das 0,25 Mol 1,2-Ethandithiol (Yajima et al., 1988) enthielt, durchgeführt. Die Peptide wurden wie in Beispiel 2 beschrieben, an BSA konjugiert. Beide Peptide wurden in ELISA unter Anwendung der in Beispiel 11 beschriebenen Methode gegen Seren von HCV-positiven Patienten in China getestet. NoCEnv wies 15/30 (50%) der getesteten positiven Sera nach und riCEnv ergab ähnliche Ergebnisse.
BEISPIEL 11
Hepatitis C-Kapselpeptid
Die folgenden zwei Peptide wurden auf der Basis der Kapselsequenz (39–74) des Hepatitis C-Virus synthetisiert.
Die Synthese von noCCap wurde auf Polyamid-PepsynKA-Harz, das mit Fmoc-Arg(Mtr) vorverestert war, durchgeführt, und das RiC-Cap befand sich auf dem Polyhipe-Rink-Harz. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Cystein und Glutamin, tert.-Butyl für Serin, Threonin und Glutaminsäure, tert.- Butoxycarbonyl für Lysin und 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Die Abspaltung und Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurde durch Umsetzen der Peptidylharze für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2-Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988). Die Peptide wurden wie in Beispiel 2 beschrieben an BSA konjugiert.
Die Löcher von PVC-Mikrotiterplatten wurden mit dem geeigneten Antigen (0,05–1 μm/Loch), das in einem verdünnten Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, gelöst war, beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Ansaugen wurde eine Blockierung durch Inkubation für 1 Stunde bei 37°C mit Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, der 20% Kalbsserum enthielt, durchgeführt. Die Löcher wurden dann vier Mal mit 0,2% Tween 20 in PBS vor der Zugabe des Antiserums, das serienmäßig in PBS-Puffer doppelter Stärke, der 0,5% BSA, 10% Kalbsserum und 0,2% Triton X 100 (Antikörperbindungspuffer) enthielt, verdünnt war, gewaschen. Nach der Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten wieder gewaschen. Das gebundene IgG wurde durch Inkubation für 30 Minuten bei 37°C mit entsprechend verdünnter Affinität gereinigter anti-humaner IgG-Meerrettichperoxidase in Antikörperbindungspuffer nachgewiesen. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 3,3'5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), 0,01% Peroxid bei pH 5 im Dunklen entwickelt. Die Farbentwicklung wurde durch die Zugabe von 2 Mol Schwefelsäure gestoppt, und die Platten wurden bei Wellenlängen von 450 nm/630 nm gelesen.
Die BSA-konjugierten Peptide noCCap und riCCap wurden auf ELISA-Platten aufgetragen und gegen Seren von chinesischen Hepatitis C-Patienten getestet. Die Ergebnisse sind in der Ta belle unten zusammengefasst. In jedem Fall wurde eine Kreuzreaktion zwischen normalen und retro-invertierten Formen des Kapselpeptids beobachtet, und mit dem Serum Nr. 1 ergab das retro-invertierte Peptid höhere Titer als das normale Peptid.
BEISPIEL 12
HIV-Diagnosepeptide
Peptide vom Hüllenprotein des humanen Immundefizienzvirus
Die folgenden zwei Peptide wurden auf der Basis der Reste 579–611 des Hüllenproteins des humanen Immundefizienzvirus synthetisiert.
Die Synthese von noHIVgp41 (579–611) wurde auf Polyamid-PepsynKA-Harz, das mit Fmoc-Cys(trt) vorverestert war, durchgeführt, und das riHIVgp41 (579–611) befand sich auf dem Polyhipe-Rink-Harz. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für terminales Cystein, Glutamin und Asparagin, tert.-Butyl für Serin, Threonin, Aspartamsäure, Glutaminsäure und Tyrosin, tert.-Butoxycarbonyl für Lysin und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Cystein wurde durch Aminobuttersäure (Aba) in noHIVgp41 (579–611) und durch Cystein mit einer Acetamidomethyl (Acm)-Schutzgruppe der Sulfhydrylgruppe in riHIVgp41(579–611) ersetzt. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurde durch Umsetzen der Peptitylharze für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2-Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988). Die Acetamidomethyl (Acm)-Schutzgruppe von Cystein wurde bei dieser Prozedur nicht entfernt. Die Peptide wurden an BSA wie in Beispiel 2 beschrieben konjugiert.
BEISPIEL 13
Peptide von gp41 des menschlichen Immundefizienzvirus
Die folgenden zwei Peptide wurden auf der Basis der pg41-Proteinsequenz 735–752 des humanen Immundefizienzvirus synthetisiert.
Die Synthese beider Peptide wurde auf Polyhipe-Rink-Harz durchgeführt. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: tert.-Butyl für Serin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Tyrosin und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Die Abspaltung und Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurden durch Reaktion der Peptitylharze für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2- Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988). Es wurde eine Silfhydrylgruppe am N-Terminus dieser Peptide durch Umsetzen mit 2-Iminothiolan.HCl (Traut'sches Reagenz) eingeführt (Jue, R. et al., 1978). Die Peptide wurden an BSA wie in Beispiel 2 beschrieben konjugiert.
Die Löcher von PVC-Mikrotiterplatten wurden mit dem geeigneten Antigen (0,05–1 μg/Loch), das in einem verdünnten Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 gelöst war, beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Ansaugen wurde eine Blockierung durch Inkubation für 1 Stunde bei 37°C mit Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, der 20% Kalbsserum enthielt, bewirkt. Die Löcher wurden dann vier Mal mit 0,2% Tween 20 in PBS vor der Zugabe von Antiserum gewaschen, serienmäßig in PBS-Puffer doppelter Stärke, der 0,5% BSA, 10% Kalbsserum und 0,2% Triton X 100 (Antikörperbindungspuffer) enthielt, verdünnt. Nach der Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurden die Platten wieder gewaschen. Gebundenes IgG wurde durch Inkubation für 30 Minuten bei 37°C mit geeigneter verdünnter affinitätsgereinigter anti-humaner IgG-Meerrettichperoxidase in Antikörperbindungspuffer nachgewiesen. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 3,3'5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), 0,01% Peroxid bei pH 5 im Dunklen entwickelt. Die Farbentwicklung wurde durch die Zugabe von 2 Mol Schwefelsäure gestoppt und die Platten wurden bei Wellenlängen von 450 nm/360 nm gelesen.
Die BSA-konjugierten Peptide noHIVgp41 (579–611), riHIVgp41 (579–611) von Beispiel 12 und noHIVgp41 (735–753) und ri-HIVpg41 (735–753) aus diesem Beispiel wurden auf ELISA-Platten aufgetragen und in China gegen Seren von Patienten mit HIV-positiven Seren getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst. In jedem Fall wurde eine Kreuzreaktion zwischen normalen und retro-invertierten Formen des gp41-Peptids beobachtet.
BEISPIEL 14
Analyse der Antikörperherstellung und Aktivität von Antikörper gegen Peptidsequenzen, die den Resten 126–137 des Oberflächenproteins des Hepatitis B Virus entsprechen
Die folgenden zwei Peptide wurden auf der Basis der Reste 126–137 des Oberflächenproteins des Hepatitis B Virus synthetisiert.
Die Synthese von noHBV-S (126–137) wurde auf Polyamid-PepsynKA-Harz, das mit Fmoc-Ser(tBu) vorverestert war, durchgeführt, und das riHBV-S (126–137) befand sich auf dem Polyamid-PepsynKA-Harz, das mit Fomoc-Cys(trt) vorverestert war. Das Lysin war nicht Teil der HBV-Sequenz, aber es war darin enthalten, um die Löslichkeit zu verbessern. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Cystein, Glutamin und Asparagin, tert.-Butyl für Serin, Threonin und Tyrosin und tert.-Butoxycarbonyl für Lysin. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurden durch Umsetzen der Peptidylharze für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 10 ml TFA, 0,25 ml 1,2-Ethandithiol, 0,5 ml Thioanisol, 0,5 ml Wasser und 0,75 g Phenol durchgeführt.
Das noHBV-S (126–137) wurde an KLH konjugiert und beide Peptide wurden voneinander unabhängig an BSA konjugiert.
Das KLH-Konjugat wurde in Freund'schen vollständigen Adjuvans (1 : 1) emulgiert und dafür verwendet, weiße Mäuse aus der Schweiz nach dem folgenden Schema immunisieren:
Den Mäusen (4 in jeder Gruppe) wurde retro-orbital 5 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen, und das Serum wurde in einem ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit 1 μg/Loch des geeigneten Peptids, das an BSA konjugiert war, beschichtet waren, verwendet.
Diese Ergebnisse sind in graphischer Form in 9 gezeigt.
BEISPIEL 15
Analsyse der Antikörperproduktion und Aktivität von Antikörpern gegenüber Peptidsequenzen, die den Resten 126–137 des Oberflächenproteins des Hepatitis B-Virus entsprechen
Das folgende Peptid wurde auf der Basis der Reste 126–137 des Oberflächenproteins des Hepatitis B-Virus synthetisiert.
Ein potentielles T-Zellenepitop wurde aus dem Oberflächenprotein ausgewählt, Reste 20–33:
Diese Peptide wurden auf MAP (Multiples Antigenpeptid)-Harz mit acht Peptidverzweigungen über Lysin an jeden MAP-Kern, der mit einem Cystein, das durch die Acetamidomethylgruppe geschützt war, gebunden war, synthetisiert. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Glutamin und Asparagin, tert.-Butyl für Serin, Threonin, Asparaginsäure und Tyrosin und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin.
Die Abspaltung und Seitenkettenschutzentfernung von noHBV-S (126–137) wurde durch Umsetzung des Peptidylharzes für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 10 ml TFA, 0,25 ml 1,2-Ethandithiol, 0,5 ml Thioanisol, 0,5 ml Wasser und 0,75 g Phenol durchgeführt. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung des potentiellen T-Zellenepitops wurden durch Umsetzen des Peptidylharzes für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2 Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988).
Die Dimerisierung der beiden MAPs, noHBV-S (126–137) und des potentiellen T-Zellenepitops wurde in äquimolaren Mengen durch Oxidation des Disulfids mit Jod in Essigsäure nach der Methode von Tam und Lu (1989) durchgeführt.
Das obige Konstrukt wurde in Freund'schem. vollständigen Adjuvans (1 : 1) emulgiert und dafür verwendet, weiße Schweizer Mäuse nach dem folgenden Schema zu immunisieren:
Von den Mäusen (4 in jeder Gruppe) wurde retro-orbital 5 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen, und das Serum wurde in einem ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit 1 μg/Loch, entweder no-HBV-S (126–137) oder ri-HBV-S (126–137) wobei beide an BSA konjugiert waren, beschichtet waren, verwendet.
Diese Ergebnisse sind in graphischer Form in 10 gezeigt.
BEISPIEL 16
Analsyse der Antikörperproduktion und Aktivität von Antikörpern gegenüber Peptidsequenzen, die den Resten 126–140 des Pre-S-Proteins des Hepatitis B-Virus entsprechen
Die folgenden zwei Peptide wurden auf der Basis der Reste 127–140 des Pre-S-Proteins des Hepatitis B-Virus hergestellt.
Die Synthese von noHBV-PreS (127–140) wurde auf Polyamid-PepsynKR-Harz, das mit Fmoc-Cys (tert) vorverestert war, durchgeführt und das riHBV-PreS (127–140) befand sich auf Polyhipe-Rink-Harz. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Cystein, Histidin und Glutamin, tert.-Butyl für Threonin, Asparaginsäure und Tyrosin und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung wurden durch Umsetzen der Peptidylharze für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylbromidthioanisol in TFA, die 0,25 Mol 1,2-Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988).
Beide Peptide waren voneinander unabhängig entweder an KLH oder BSA konjugiert.
Die KLH-Konjugate wurden in Freund'schen vollständigen Adjuvans (1 : 1) emulgiert und dafür verwendet, weiße Schweizer Mäuse nach dem folgenden Schema zu immunisieren:
Den Mäusen (4 in jeder Gruppe) wurde retro-orbital 5 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen, und das Serum wurde in einem ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit 1 μg/Loch des geeigneten Peptids, das an BSA konjugiert war, beschichtet waren, verwendet.
Diese Ergebnisse sind in graphischer Form in 11 gezeigt.
BEISPIEL 17
Analsyse der Antikörperproduktion und Aktivität von Antikörpern gegenüber Peptidsequenzen, die den Resten 127–140 des Pre-S-Proteins des Hepatitis B-Virus entsprechen
Die folgenden beiden Peptide wurden auf der Basis der Reste 127–140 des Pre-S-Proteins des Hepatitis B-Virus synthetisiert.
Ein potentielles T-Zellen-Epitop wurde aus dem preS-Protein ausgewählt, Reste 52–64:
Diese Peptide wurden auf MAP (Multiples Antigenpeptid)-Harz mit acht Peptidverzweigungen über Lysin an jeden MAP-Kern, der an ein Cystein, das mit einer Acetamidomethylgruppe geschützt war, verbunden war, synthetisiert. Die verwendeten Seitenkettenschutzgruppen waren: Trityl für Histidin, Glutamin und Asparagin, tert.-Butyl für Threonin und Asparaginsäure, tert.-Butoxycarbonyl für Lysin und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl für Arginin. Die Abspaltung und Seitenkettenschutzgruppenentfernung von noHBV-PreS (127–140) und riHBV-PreS (127–140) wurden durch Umsetzen des Peptidylharzes für 90 Minuten bei 0°C mit 1 Mol Trimethylsilylpromidanisol in TFA, die 0,2 Mol 1,2-Ethandithiol enthielt, durchgeführt (Yajima et al., 1988). Die Abspaltung und die Seitenkettenschutzgruppenentfernung des potentiellen T-Zellenepitops wurden durch Umsetzen des Peptidylharzes für 90 Minuten. bei Raumtemperatur mit 1,2-Ethandithiol (5 Vol-%) und Wasser (5-Vol-%) in TFA durchgeführt.
Die Dimerisierung der beiden MAPs, noHBV-PreS(127–140) und des potentiellen T-Zellenepitops wurde in äquimolaren Mengen durch Oxidation des Disulfids mit Jod in Essigsäure nach der Methode von Tam und Lu (1989) durchgeführt. In ähnlicher Weise wurden die beiden MAPs, ri HBV-PreS (127–140) und noHBV-PreS (52–64) dimerisiert.
Die obigen Konstrukte wurden in Freund'schen vollständigen Adjuvans (1 : 1) emulgiert und dafür verwendet, weiße Schweizer Mäuse nach dem folgenden Schema zu immunisieren:
Den Mäusen (4 in jeder Gruppe) wurde retro-orbital 5 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen, und das Serum wurde in einem ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit 1 μg/Loch, entweder noHBV-PreS (127–140) oder riHBV-PreS (127–140), wobei beide an BSA konjugiert waren, beschichtet waren, verwendet.
Diese Ergebnisse sind in graphischer Form in 12 gezeigt.
INDUSTRIELLE ANWENDUNG
Die erfindungsgemäßen Antigenanalogons zeigen einen Bereich potentieller Anwendungen bei der Auslösung immunogener Antworten in einem Wirt. Diese Antigenanalogons können bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen und bei der Arzneimittelabgabe und Therapie von Erkrankungszuständen verwendet werden. Insbesondere können diese Antigenanalogons in Vakzinen in Tieren, einschließlich Menschen, für den Schutz gegenüber Pathogenen und dergleichen verwendet werden.
Außerdem haben die synthetischen Antigenanalogons das Potential, als diagnostische Werkzeuge in Assays zum Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern gegenüber nativen Antigenen oder in der Forschung, wie Untersuchungen der Antigen/Antikörper-Erkennung, Spezifität, Antigenizität und immunogene Antwort, verwendet werden zu können.
Antikörper gegenüber den Antigenanalogen der Erfindung können für diagnostische Zwecke verwendet werden, wo ein Nachweis des nativen Antigens in Proben gewünscht ist oder bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die durch die Antikörper neutralisiert werden oder bei der Arzneimittelabgabe.
REFERENZEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Synthetisches Peptidantigenanalogon eines nativen Peptidantigens, worin dieses Analogon retro-invertiert modifiziert ist und mindestens fünf aufeinanderfolgende D-Aminosäuren enthält, worin die Aminosäurereste in entgegengesetzter Richtung im Hinblick auf das native Antigen angeordnet sind und das synthetische Peptidantigenanalogon in der Lage ist, die Produktion von Antikörpern, die das native Peptidantigen erkennen, zu induzieren.
Synthetisches Peptidantigenanalogon nach Anspruch 1, das im Hinblick auf das native Antigen vollständig retroinvertiert modifiziert ist.
Antigenanalogon nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Aminosäurereste, die die retro-invertierte Sequenz flankieren, durch Seitenketten analoge α-substituierte paarweise Diaminomethane und Malonate substituiert sind.
Synthetisches Peptidantigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Immunisierung eines immunkompetenten Wirts.
Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das native Antigen ein natürlich vorkommendes Polypeptid oder ein antigenes Fragment davon ist.
Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Antigenanalogon folgendes Analogon ist: das immundominante Epitop des Zircumsporozoitmantelproteins von P. falciparum sporozoites; oder ein Diphtherietoxinantigen; oder Robustoxin; oder ein Hepatitisvirusantigen oder ein HIV-Antigen.
Antigenanalogon nach Anspruch 1, das in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, die länger als die Immunantwort dauert, die mit dem entsprechenden nativen Antigen erhalten wird.
Vakzine, die ein Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Corrigens und/oder Adjuvans umfasst.
Vakzine, die ein Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Konjugation mit einem geeigneten Trägermolekül für die Verabreichung an einen Wirt umfasst.
Vakzine, die ein Antigenanalogon nach Anspruch 1 umfasst, worin das Analogon ein Analogon eines minimal antigenen Fragments ist, das in der Lage ist, Antikörper zu produzieren und/oder zu binden und das Analogon so modifiziert ist, dass der C- und N-Terminus geschützt ist.
Vakzine nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die Vakzine oral verabreicht wird.
Antikörper gegenüber einem Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einer Vakzine nach einem der Ansprüche 8 bis 11.
Diagnosekit, das einen Antikörper nach Anspruch 12 oder ein Antigenanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammen mit einem positiven und einem negativen Kontrollstandard umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Antigenanalogons eines nativen Peptidantigens, wobei ein retro-invertiertes Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 synthetisiert wird.