DE69331585T2

DE69331585T2 - Monoklonaler antikörper spezifisch für das fk-506-bindende protein, methode zur bestimmung des gehaltes an fk-506-bindendem protein in einer probe und reagenzsatz dafür

Info

Publication number: DE69331585T2
Application number: DE69331585T
Authority: DE
Inventors: Masakazu Kobayashi; Mineo Niwa; Kazuyuki Ohtsuka; Hirokazu Tanaka
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 1992-08-12
Filing date: 1993-08-11
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2013-08-12
Also published as: CA2142197C; PT672756E; EP0672756B1; US5576183A; DE69331585D1; KR950703061A; KR100243536B1; CA2142197A1; ATE213272T1; AU4761393A; JP3185221B2; EP0672756A1; AU667743B2; ES2169068T3; EP0672756A4; WO1994004700A1; DK0672756T3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der ein Protein erkennt, welches an FK506 bindet (FK506-bindendes Protein), welches wiederum eine immunsuppressive Aktivität aufweist, ein Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines FK506-bindenden Proteins und ein Kit dafür, welche auf dem medizinischen Gebiet verwendbar sind.

Stand der Technik

Eine als FK506 oder FR-900506 bezeichnete Verbindung ist gut dafür bekannt, eine potente immunsuppressive Aktivität aufzuweisen, und ist als Mittel zur Prophylaxe und Behandlung der Abstoßung bei Organtransplantation und Autoimmunerkrankungen verwendbar (beispielsweise japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 148181/1986).
Die Aktivität ist jedoch so potent, daß die Bestimmung der optimalen Dosis von höchster Wichtigkeit ist, und die Gabe einer Menge, die eine wirksame immunsuppressive Aktivität ohne Nebenwirkungen induzieren kann, extrem wichtig ist.
Neuere Studien ergaben, daß die immunsuppresive Wirkung von FK506 durch die Bindung an ein intrazelluläres FK506-bindendes Protein (im folgenden als FKBP bezeichnet) mit ähnlicher Aktivität wie Peptidylprolyl-cis-trans-isomerase verursacht wird [beispielsweise Nature, 357, 692 bis 694 und 695 bis 697 (1992)].
Es ist bekannt, daß FKBP einige Typen in Abhängigkeit vom Molekulargewicht einschließt, wie FKBP-12 (Molekulargewicht 12KDa), FKBP-13 (Molekulargewicht 13KDa), FKBP-25 (Molekulargewicht 25KDa), FKBP-56 (Molekulargewicht 56KDa), FKBP-80 (Molekulargewicht 80KDa) und ähnliche, und ihre Strukturen wurden bereits identifiziert.
Siehe beispielsweise Nature, 341, 755 bis 757 und 758 bis 760 (1989), J. Am. Chem. Soc. 113, 1409 bis 1411 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 6229 bis 6233 (1991) und ähnliches.
Auch über die Herstellung eines FKBP mit einem Molekulargewicht von 11819 Daltons und 107 Aminosäuren durch Gentechnik wurde bereits berichtet [Nature, 346, 671 bis 674 (1990)].
Es wurde auch berichtet, daß FK506 von diesen FKBPs am stärksten an FKBP-12 bindet und daß seine Affinitätskonstante (Kd) 0,4 nM beträgt, und daß FKBP-12 in großen Mengen nicht nur in Lymphozyten vorhanden ist, sondern auch in verschiedenen Geweben einschließlich Erythrocyten [Trans. Proc. 23 (6), 2760 bis 2762 (1991)].
Im Hinblick auf die Tatsache, daß, wenn FKBP-12 einem Maus MLR-System gemeinsam mit einer bestimmten Menge FK506 gegeben wird, die immunsuppresive Wirkung von FK506 proportional zur Menge von zugegebenem FKBP-12 inhibiert wird, bindet FK- 506 an FKBP-12 in Plasma, falls es im Blut vorhanden ist, und die immunsuppresive Wirkung kann nicht in dem Grad erzielt werden, der von der FK506-Konzentration im Plasma erwartet wird. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß Erythrocyten von Patienten, bei denen eine Operation durchgeführt wurde, lysieren und FKBP-12 aus Erythrocyten durch das Plasma zirkuliert, und daß Patienten verschiedene Empfindlichkeiten zeigen, bestand ein Bedarf an der Entwicklung einer Technik, welche den präzisen Assay des FKBP-Spiegels im Plasma ermöglicht, wodurch die Empfindlichkeit des Patienten gegen FK506 bestimmt und ein geeigneter FK506-Spiegel im Plasma ermittelt werden kann.
Es wurden Anfangsexperimente zur Herstellung von Antikörpern gegen FK506-bindende Proteine beschrieben. Jayaraman et al. (J. Biol. Chem. 1992; 267 : 9474-9477) beschrieben Experimente zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein synthetisches Peptid, das den Aminsäuren 3 bis 16 des Proteins entspricht. Die Bildung dieses Antikörpers wird durch wiederholte subkutane Gabe des Peptids an ein Kaninchen und Isolierung des Serums aus diesem Kaninchen stimuliert. Weitere Experimente zur Herstellung von Antikörpern gegen FKBP-verwandte Proteine unter Verwendung einer Anzahl von aus FK506-bindendem Protein isoliertem Oligopeptiden durch Injektion in Kaninchen wurden von Rosborough et al. (Transplantation Proceedings 1991; 23 : 2890- 2893) beschrieben, wobei diese Experimente zu Antikörpern führten, die nur das denaturierte Protein binden konnten. So behandelte der Stand der Technik nur Antikörper gegen Teilpeptide des vollständigen Proteins.

Offenbarung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers, der FKBP erkennt, eines Verfahrens zur präzisen Bestimmung des Spiegels von FKBP im Plasma zur Bestimmung des geeigneten FK506-Spiegels im Plasma, und eines Kits zur Verwendung in dem Assay.
Die Erfinder haben intensive Studien durchgeführt und bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers Erfolg gehabt, der eine antigene Determinante in FKBP erkennt und die Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht inhibiert, und ein Verfahren zur präzisen Bestimmung des Spiegels von FKBP im Plasma und ein Kit für den Assay entwickelt.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper, welcher eine antigene Determinante in einem Human-FKBP-12 erkennt und die Bindung zwischen einem Human-FKBP-12 und FK506 nicht inhibiert, ein Verfahren zur Bestimmung des FKBP-Spiegels, umfassend Umsetzung dieses immobilisierten monoklonalen Antikörpers mit einem Enzym-markierten FK506 und FKBP in einer Probe, und ein Kit für einen FKBP-Spiegel-Assay, umfassend diesen monoklonalen Antikörper, FKBP und ein Enzym-markiertes FK506.
Der monoklonale Antikörper, welcher eine antigene Determinante in Human-FKBP-12 erkennt und die Bindung zwischen Human-FKBP-12 und FK506 nicht inhibiert (dieser monoklonale Antikörper wird im folgenden als Anti-FKBP-Antikörper bezeichnet), kann beispielsweise durch die übliche Zellfusionsmethode wie die grundlegende Methode von Kohler und Milstein [Nature, 256, 495 (1975)] hergestellt werden.
Bevorzugt werden Milzzellen, die aus mit FKBP immunisierten Mäusen erhalten wurden, und Maus-Myelom-Zellen unter Bildung eines Hybridoms fusioniert, aus dem ein monoklonaler Antikörper, welcher eine antigene Determinante in FKBP erkennt und die Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht inhibiert, durch die Methode hergestellt werden, die durch Beispiel 1 oder Beispiel 2 im folgenden erläutert wird. Bevorzugt gehört der Antikörper zur IgG- oder IgM-Klasse und am bevorzugtesten zu einer Unterklasse wie IgG&sub1; λ oder IgG&sub1; κ. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert insbesondere einen Anti-FKBP-Antikörper, welcher nur mit 12 kd FKBP oder sowohl mit 12 kd und 30 bis 35 kd FKBPs reagiert.
Das Verfahren zur Bestimmung eines FKBP-Spiegels der vorliegenden Erfindung ist eine Zwei-Stufen-Methode, bei der ein Anti-FKBP-Antikörper zum selektiven Assay nur des gewünschten FKBPs verwendet wird.
Die Zwei-Stufen-Methode schließt ein 1) Immobilisieren eines Anti-FKBP-Antikörpers, welcher eine antigene Determinante in einem FKBP der angestrebten Art erkennt und die Bindung zwischen FKBP und FK506 nicht beeinträchtigt, auf einer festen Phase wie einer Immunoplatte unter Verwendung von IgG wie Anti-Maus IgG(H + L); 2) Umsetzen des immobilisierten Anti-FKBP-Antikörpers mit einer Probe, welche FKBP enthält (oder seriell verdünntes FKBP, wenn eine Eichkurve gezeichnet wird) und einem mit einem Enzym wie Peroxidase (im folgenden als POD bezeichnet) markierten FK506, welches beispielsweise FK506-C32(LA)-POD sein kann, das auf die im folgenden Beispiel 1 genannte Weise produziert wird; und 3) schließlich Bestimmung des FKBP-Spiegels durch Messung der Absorption zur Bestimmung der Farbentwicklung des Substrats unter Verwendung einer Enzymsubstratlösung wie einer o-Phenylendiamin- und Wasserstoffperoxidlösung, welche proportional ist zur Menge des Enzym-markierten FK506, welches durch das FKBP abgefangen wird, das an den Anti-FKBP-Antikörper gebunden ist.
Der Anti-FKBP-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann für die Bestimmung der vorstehend genannten Zwei-Stufen-Methode als FKBP-Spiegel-Assay-Kit in Kombination mit einem FKBP-Standardprodukt und einem Enzym-markierten FK506 verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die einfache und präzisere Bestimmung des Spiegels von FKBP in Plasma, welches Einflüsse auf den immunsupressiven Effekt von FK506 ausübt, genauso wie die Bereitstellung von wichtigen Daten für die Bestimmung der optimalen Dosis von FK506.
Zusätzlich kann die Dosis von FK506 in enger Übereinstimmung mit dem Zustand von individuellen Patienten in tatsächlichen klinischen Situationen bestimmt werden, da sowohl die selektive Bestimmung des Spiegels eines bestimmten FKBP (z. B. FKBP-12) allein und die Bestimmung des Gesamt-FKBP-Spiegels je nach Bedarf ermöglicht wurden.
Die vorliegende Erfindung wird in größerem Detail durch illustrierende Beispiele erklärt, auf die die Erfindung nicht beschränkt ist.

Beispiel 1: Herstellung eines Anti-FKBP-Antikörpers

(1) Herstellung und Eigenschaften von FKBP-12

Eine DNA (48-mer), entsprechend dem C-Terminus von FKBP-12, wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (hergestellt von Applied Biosystem) aus der DNA- Sequenz hergestellt, über die von S. L. Schreiben et al., Havard Universität berichtet wurde [Nature, 346, 671 bis 674 (1990)].
5'-CCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATGA-3'
Der Terminus dieses 48-mers wurde mit ²&sup5;P markiert, und unter Verwendung desselben als Sonde wurde die Human-T-Zellen cDNA-Bibliothek HL1016b (CLONTECH), 500000 Plaques, gescreent, wobei ein positiver Plaque erhalten wurde. Ein Fragment [pUC-23(Ec)], welches FKBP-12-cDNA enthielt, wurde aus diesem Plaque subkloniert. Das pUC-23(Ec) wurde sequenziert, wobei eine Deletion der 1 bis 32 DNA-Sequenz gefunden wurde, die dem N-Terminus entspricht. DNA zur Ergänzung des fehlenden Teils und etwa 80b.p. AT-reiche stille Mutanten-N-terminale DNA, hergestellt zur Erhöhung der Expression in Echerichia coli, wurden als eine EcoRI-BamHI-Stelle in ein Plasmid eingeführt, welches zur Expression unter der Kontrolle eines Tryptophan- Promoters fähig ist, wodurch ein Expressions-Vektor pFKBP333 erhalten wurde. Unter Verwendung dieses Vektors wurde E. coli HB101 transformiert, wobei eine Expressionszelle HB101/pFKBP(AT)311 erhalten wurde. Die Zelle wurde in L-amp.- Kulturflüssigkeit während 19 Stunden inkubiert, und die Proteinsynthese wurde durch Zugabe von IAA (Indol-Acrylsäure) bis zu einer Endkonzentration von 90 ug/ml induziert. E. coli wurde isoliert, und die Zellen wurden mit einer French-Presse in 50 mM Tris-HCl, 2 mM β-ME, 2 mM CaCl&sub2;, 10 mM MgCl&sub2; und 5% Glycerin zerstört und bei 4ºC während 30 Minuten bei 6000 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde bei 60ºC während 15 Minuten wärmebehandelt, zentrifugiert (4ºC, 6000 · g, 45 min. + 4ºC, 18000 · g, 20 min. · 2), dialysiert [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4ºC, über Nacht] und einer reversed phase HPLC mit DEAT-Toyo-Pearl 650M (C4) zur Reinigung von FKBP- 12 unterzogen.

(2) Immunisierung von Mäusen mit FKBP-12

FKBP-12 in Phosphatpuffer (im folgenden als PBS bezeichnet), 250 ug/ml, 0,1 ml, und die äquivalente Menge Freunds vollständiges Adjuvans (FCA) wurden gemischt und zur intraperitonealen Immunisierung von BALB/c-Mäusen verwendet. Dieselbe Menge FKBP-12 wurde mit Freund's unvollständigem Adjuvans (FIA) gemischt und für einige intraperitoneale Immunisierungen ca. alle 10 Tage verwendet.

(3) Bestimmung des Antikörper-Titers im Blut

Blut (10 ul) wurde aus der Schwanzvene der Mäuse entnommen, mit PBS (990 ul) gemischt und als Probe verwendet. Zum Assay wurde eine FKBP-12-PBS-Lösung (10 ug/ml, 50 ul) in Immunoplatten-Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur während 3 Stunden zur Bindung an die Oberfläche umgesetzt. Dann wurden die Vertiefungen gewaschen, und die Bindungsstelle wurde mit 0,2% Milchblocker-PBS geblockt. Nach erneutem Waschen wurde die verdünnte Serumprobe wie oben erhalten zugegeben und bei Raumtemperatur während einer Stunde umgesetzt. Dann wurde Anti-Maus-IgG (H + L)-POD (100 ul/Vertiefung, hergestellt von Vector Lab.) zugegeben und bei Raumtemperatur während einer Stunde umgesetzt. Nach Waschen wurde die Farbe durch eine übliche Methode unter Verwendung von o-Phenylendiamin entwickelt.

(4) Produktion eines Anti-FKBP-12-Antikörpers

Die Mäuse, welche einen erhöhten Antikörper-Titer zeigten, erhielten eine Injektion von FKBP-12 [250 ug/ml (PBS), 0,2 ml] in die Schwanzvene zur Endimmunisierung. Vier Tage später wurde die Milz zur Präparation von 1,44 · 10&sup8; Milzzellen entfernt. Daneben wurden Mäuse-Myelom-Zellen P3 · 63Ag8U.1 auf eine Konzentration von 2,9 · 10&sup7; Zellen eingestellt und einer Zeltfusion in 50% PEG 4000 (Endkonzentration) unterzogen. Dann wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium in einer 24-Vertiefungs-Platte mit 106 Zellen/ml · 1 ml/Vertiefung gescreent. Zwei Wochen später wurden 144 Vertiefungen, in denen Zellen in HAT-Medium wuchsen, auf ihre Anti-FKBP-12- Antikörperproduktion gescreent. Spezifisch wurde im Fall von Antikörper-Titer im Blut FKBP-12 (5 ug/ml, end) auch zugegeben, wenn eine Anti-FKBP-12-Antikörper enthaltende Probe zur Reaktion zugegeben wurde, und die Vertiefungen, die in Gegenwart von FKBP-12 keine Farbe entwickelten, wurden ausgewählt. Darüber hinaus wurden 32 Klone mit hohen Antikörper-Titern gegen FKBP-12 selektiert.

(5) Selektion von Anti-FKBP-12-Antikörper, welcher FKBP-12 erkennt und die Bindung zwischen FK506 oder FK506-C32(LA)-POD und FKBP-12 nicht inhibiert.

Ein Anti-Maus-IgG(H + L) wurde an eine feste Phase gebunden und der gescreente Antikörper gebunden. Dann wurde FKBP-12 (50 ul/l ug/ml) und im folgenden (6) erhaltenes FK506-C32(LA)-POD (1000fach verdünnt, 50 ul) zugegeben, so daß Koexistenz bestand, und die Klone, welche eine erhöhte Absorption bei 490 nm aufgrund der Reaktion mit o-Phenylendiamin zeigten, wurden ausgewählt. Verschwinden der Farbentwicklung in Gegenwart von FK506 (10 ug/ml) zeigt die Erkennung von FK506 aus FK506-C32(LA)-POD durch FKBP-12 an, welches an den Anti-Maus-IgG(H + L) gebunden ist. Als Ergebnis wurden fünf Arten Antikörper (5-1-A5, 5-1-B3, 5-1-C5, 5-2- D1 (IgG&sub1;), 5-4-D2) durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von FKBP-12 als Antigen erhalten; und die gesamten sieben Arten von monoklonalen Antikörpern wurden durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von Harnstoffdenaturiertem FKBP-12 als Antigen im folgenden (7) - IA4 (IgM), 3A8 (IgG&sub3;), IF7, 3B8 - und durch die Immunisierungsmethode unter Verwendung von FKBP-12 als Antigen erhalten, das an Ovalbumin gebunden war, wie im folgenden (8) - 4F8 erhalten.

(6) Herstellung von FKBP506-C32(LA)-POD

Bernsteinsäure-FR-90056-Substanz-Halbester (230 mg), erhalten auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 92659/1989, N- Hydroxysuccinimid (35 mg) und eine Lösung (10 ml) von 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (43 mg) in Methylenchlorid wurden bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der erhaltene Rücksatnd (250 mg) wurde mit 11-Aminoundecansäure (120 mg) und Triethylamin (60 mg) in einem Lösungsmittel aus Dimethylformamid-Wasser (1 : 1, 20 ml) bei Raumtemperatur während 6 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde auf eine Kieselgel-Säule unter Verwendung von Chloroform als Entwicklungslösungsmittel aufgetragen und ergab 120 mg 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12- [2-(4-N-(10-carboxydecyl)-(4-amino-1,4-dioxo-1-butyloxy))-3 -methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo [22.3.1.04.9]octacoctacos-18-ene-2, 3,10,16-tetraon.
NMR (CDCl&sub3;, δ): 1.2-1.4 (m), 5.9-6.1 (1H, m)
FAB Masse: 1109 (M + Na)&spplus;
Unter Verwendung der oben erwähnten Verbindung wurde eine FK506-C32(LA)-POD- Lösung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, 3) der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 92659/1989 durch Umsetzung mit Meerrettich-Peroxidase erhalten.

(7) Herstellung von Harnstoff-denaturiertem FKBP-12

Harnstoff (312 mg) wurde zu einer FKBP-12 (847 ug/ml) enthaltenden 0,08%igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung (460 ul) gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur zur Herstellung von 650 ul einer Lösung von FKBP-12 (600 ug/ml) gerührt, die für die Immunisierung verwendet wurde.

(8) Herstellung von Ovalbumin-gebundenem FKBP-12

FKBP-12 (1032 ug, verwendet wurden 1032 ul mit 1 mg/ml) und eine Lösung (1032 ul) Ovalbumin (Sigma, Chargen-Nr. 76F-8040) in PBS (2 mg/ml) wurden gemischt. Dazu wurde tropfenweise 0,62 ml einer 0,13M Glutaraldehyd-PBS-Lösung gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 14 Stunden gerührt und dreimal gegen PBS (1 l) dialysiert und als Immunogen verwendet.
Das Mischungsverhältnis von FKBP-12 und Ovalbumin war FKBP-12 1032 ug Ovalbumin 2064 ug und die Lösungsmenge war 2,7 ml.

Beispiel 2: Herstellung eines Anti-FKBP-12-Antikörpers

(1) Mäuse wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (1) und (2) immunisiert.

(2) Bestimmung des Antikörper-Titers in Blut

Eine Lösung (50 ul) FKBP-12 (20 ug/ml) in PBS wurde in jede Vertiefung einer 96- Vertiefungs-Platte zum ELISA verteilt und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die FKBP-12-Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, und die Vertiefung wurde dreimal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Eine 0,2% Milch/PBS-Lösung (250 ul) wurde in jede Vertiefung der Platte gegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten stehengelassen. Die 0,2%ige Milch/PBS-Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, eine Lösung (100 ul) jedes Antiserums, verdünnt mit einer 0,2%igen Milch/0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung, wurde in die Vertiefungen gegeben, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur während 2 Stunden stehengelassen. Dann wurde das verdünnte Antiserum in den Vertiefungen durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden dreimal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Eine mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Maus IgG (H + L)-Lösung, 1000fach verdünnt mit einer 0,2 %igen Milch/0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung, wurde in 100 ul in jede Vertiefung gegeben, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur während 2 Stunden stehengelassen. Die mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-Maus IgG(H + L)-Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden fünfmal mit einer 0,05%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen. Dann wurde eine Lösung von 0,1 mM 4-Methylumbelliferylphosphat (4MU-P, Sigma) in einem Puffer (10 mM Diethanolamin/0,5% MgCl&sub2;/H&sub2;O) in 100 ul in jede Vertiefung gegeben, und die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur während 15 Minuten stehengelassen. Die Fluoreszenz-Intensität (Anregung: 360 nm, Emission: 460 nm) jeder Vertiefung wurde auf einem Floureszenzplattenlesegerät abgelesen.

(3) Die Maus mit dem höchsten Antikörper-Titer wurde selektiert und erhielt eine Injektion mit 0,2 ml einer PBS-Lösung, enthaltend 1,5 mg/ml FKBP-12 in die Schwanzvene zur Endimmunisierung 10 Tage nach der vierten Injektion.

(4) Zellfusion

Zellen wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1-(4) zur Herstellung von Hybridomen fusioniert (3-3-D4-C6, 2C1-87, 3F4-70).

(5) Herstellung und Reinigung von Antikörpern

Die durch Sceenen und Klonen erhaltenen Hybridome 2C1-87 und 3F4-70 wurden jeweils in einen F75-Kolben mit 5 · 10&sup4; Zellen/ml (50 ml/F75) angeimpft und während 4 Tagen kultiviert. Die Kultur wurde zentrifguiert, zweimal mit einem Medium ohne Serum gewaschen und in 0,5 ml suspendiert. Eine Hybridom-Suspension (0,5 ml) wurde intraperitoneal BALB/C-Mäusen (BALB/C, weiblich, 6 Wochen alt) transplantiert, die zwei Wochen zuvor eine intraperitoneale Injektion von Pristan (0,5 ml) erhalten hatten. Zehn Tage später wurde bei den Mäusen eine Laparotomie durchgeführt, und Ascites (5 ml) wurde aus jeder Maus erhalten. Die jeweiligen Ascites wurden unter Verwendung von Affigel Protein A MAPS-II-Kit (Bio-Rad) gereinigt und ergaben gereinigte monoklonale Anti-FKBP-12-Antikörper 2C1-87 (Subtyp: IgG&sub1; λ) und 3F4-70 (Subtyp: IgG&sub1; κ). Das Hybridom 3-3-D4-C6 wurde auf dieselbe Weise kultiviert, und der monoklonale Anti-FKBP-12-Antikörper 3-3-D4-C6 (Subtyp: IgM) wurde erhalten.

Beispiel 3: Assay des FKBP-12-Spiegels (Zwei-Stufen-Methode)

Eine Lösung von Anti-Maus-IgG (H + L) (10 ug/ml) wird in eine Immunoplatte in 50 ul pro Vertiefung gegeben, bei 4ºC über Nacht stehengelassen und dreimal mit 0,05% Tween 20-PBS gewaschen. 0,2% Milchblocker-PBS (200 ul/Vertiefung) wird bei Raumtemperatur während einer Stunde zur Blockierung der Bindungsstelle umgesetzt, und 0,2% Milchblocker-0,05% Tween 20-PBS (50 ul/Vertiefung) und die Anti-FKBP- 12-Antikörper (5-2-D1)-Kultur (50 ul/Vertiefung), im Beispiel 1 erhalten, wird in die Vertiefungen gegeben und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die Vertiefungen werden dreimal mit 0,05%iger Tween 20-PBS gewaschen und bei Raumtemperatur während 2,5 Stunden mit FKBP-12 (50 ul/Vertiefung) umgesetzt, das seriell mit 0,05% Tween 20- PBS verdünnt war. Die Vertiefungen werden dreimal mit 0,05% Tween 20-PBS gewaschen. Eine FK506-C32(LA)-POD-Lösung (50 ul/Vertiefung), 500fach mit PBS verdünnt, wird zugegeben, und die Vertiefungen werden bei Raumtemperatur während 2 Stunden stehengelassen. Die Vertiefungen werden fünfmal mit 0,05% Tween 20-PBS gewaschen und einer Farbentwicklung durch eine übliche Methode unter Verwendung einer o-Diphenylamin/Wasserstoffperoxid-Lösung unterzogen. Der Grad der Farbentwicklung, der entsprechend der Menge an FKBP-12 einer Veränderung unterliegt, wird bestimmt.
Normales Human-Plasma wurde anstelle des seriell verdünnten FKBP-12 durch die oben erwähnte Methode untersucht. Der FKBP-12-Spiegel war ungefähr 100 ng/ml.
Die Genauigkeit des Resultats wurde durch ein Reagens bestätigt, das das Recovery- Verhältnis von FKBP-12 zeigte (1 ug) und zu normalem Human-Plasma (1 ml) gegeben wurde.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der eine antigene Determinante in einem Human- FKBP-12 erkennt und die Bindung zwischen einem Human-FKBP-12 und FK506 nicht inhibiert.

2. Verfahren zur Bestimmung eines Spiegels an FK506-bindendem Protein, umfassend Reaktion eines immobilisierten monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 mit einem Enzym-markierten FK506 und einem FK506-bindenden Protein in einer Probe.

3. Kit zur Bestimmung des Spiegels eines FK506-bindenden Proteins, umfassend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1, ein FK506-bindendes Protein und ein Enzym-markiertes FK506.