DE69328097T2

DE69328097T2 - Akzeptor für fucosyltransferase

Info

Publication number: DE69328097T2
Application number: DE69328097T
Authority: DE
Inventors: V. Chandrasekaran; K. Jain; L. Matta
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 1992-06-29
Filing date: 1993-06-28
Publication date: 2000-09-14
Anticipated expiration: 2013-06-29
Also published as: NO945062D0; NO945062L; AU675657B2; AU4652093A; US5620864A; EP0648279B1; JPH07508730A; DE69328097D1; WO1994000596A1; EP0648279A4; EP0648279A1; DK0648279T3; CA2137008A1; NO306212B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Teile dieser Erfindung wurden mit Unterstützung des National Cancer Institute CA 35 329 und der National Science Foundation. DMB 98-15 954 gemacht. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung haben.
α-1,3-L-Fucosyltransferasen fand man mit erhöhten Werten in Seren vieler Personen, bei denen massive Tumore diagnostiziert wurden, wie Eierstockkrebs, Magenkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Dickdarmkrebs, Pankreaskrebs, Zungenkrebs und Kehlkopfkrebs sowie viele andere. Es kann auf "erhöhte Aktivitäten von Serum-α-(1 → 3)-L-Fucosyltransfererase bei menschlichem Krebs", Yazawa et al., Journal of Tumor Marker Oncology, Band 4, Nr. 4, Seiten 355 bis 361 (1989), "Fucosyltransferasen: Unterschiedliche Plasma- und Gewebeveränderungen bei Leberzellkarzinom und -zirrhose", Hutchinson et al., Hepatology, Band 13, Nr. 4, Seiten 683 bis 688 (1991), "Veränderungen beim Fucosestoffwechsel, verbunden mit starkem Trinken und Rauchen: Ein vorläufiger Bericht", Thompson et al., Clinica Chimica Acta, 201, Seiten 59 bis 64 (1991) und "Tumorabhängige Erhöhung der Serum (α-1 → 3)-L- Fucosyltransferaseaktivität bei Magenkrebs", Yazawa et al., J. Canc. Res. Clin. Oncol., 115, Seiten 451 bis 455 (1989) Bezug genommen werden. Dieses Enzym scheint somit als ein diagnostischer Marker für Krebs brauchbar zu sein.
Die Expression von mono-, di- und trimeren x-Determinanten in Glucolipiden von Dickdarmkarzinomen beruht, wie gezeigt wurde, auf der retrogenetischen Expression von Kettenvorläufern vom Typ 2 (Gal β1, 4 Glc NAcβ), die nicht in Dickdarmepitelzellen von normalen Erwachsenen gefunden wurden. Dies impliziert, daß die Art des Vorläufers die Fucosyltransferase beschränkte, die in die Überführung von Fucose in die C-3-Position von G1cNAc einbezogen war. Weiterhin überführten menschliche Dickdarm-Adenokarzinom- Colo-205-Zellen im Gegensatz zu menschlichen NCI-H 69-Zellen von kleinzelligem Lungenkarzinom sowie Lungenkarzinom-PC 9-Zellen (siehe Holmes et al. J. Biol. Chem. 260, Seiten 7619 bis 7627 [1986] und Holmes et al., J. Biol. Ghem. 261, Seiten 3737 bis 3743 [1986]) Fucose in α-1,4-Bindung an Kettenstrukturen der Lactoreihe vom Typ 1 (Gal β-1,3 Glc NAcβ) und in α-1,3-Bindung an Kettenstrukturen vom Typ 2. Ein Bericht über die Trennung von α- 1,3- und α-1,4-Fucosyltransferaseaktivitäten menschlicher Milch auf einer Sephacryl®-S- 200-Säule zeigte, daß keine Enzymfraktion absolut spezifisch für Kettenakzeptoren vom Typ 1 oder 2 war. Es wird somit evident, daß die Expression von α-1,3- und α-1,4-fucosylierten Kohlenhydratketten der Lactoreihe Fucosyltransferasen einschließt, die unterschiedliche Grade von Substratspezifität und unterschiedliche Zell- und Gewebeverteilung zeigen. Es kann auf Holmes et al., Arch. Biochem. Biphys. 274, Seiten 633 bis 647 (1989), Watkins et al., Biochimie 70, Seiten 1597 bis 1611 (1988) und Johnson et al., Biochem. Soc. Trans. 13, Seiten 1119 und 1120 (1985) Bezug genommen werden. Kohlenhydrate, die Typ 2-Kette Ga1β1, 4G1cNAcβ und die entsprechenden NeuAcα2-, 3Galβ1-, 4G1cNAcβ-Strukturen enthalten, wurden für den Nachweis von α-1,3-L-Fucosyltransferasen verwendet. Es wurde gezeigt, daß 2'-Fucosyl-LacNAc ein bevorzugtes Substrat für α-1,3-L-Fucosyltransferase menschlicher Neuroblastomzellen ist. Abgesehen von den bekannten sulfathaltigen Glycokonjugaten, wie Mucinen und Glycolipiden, wurden in jüngerer Zeit Sulfatgruppen nur in einigen Glycoproteinen identifiziert. Die Sulfatgruppe in Glycolipiden ist allgemein an eine Position gebunden, die sonst von einem Sialylrest eingenommen wird. Es wurde gefunden, daß SO&sub4; → 3Galβ1, 4G1cNAc eine terminale Sequenz der asparagingebundenen Kohlenhydratkette von Schweine-Thyroglobulin ist.
Anhaftung von zirkulierenden Leukozyten an dem Gefäß-Endothel während Entzündung wird teilweise durch ihre Wechselwirkung mit dem Endothel- Leukozytenanhaftungsmolekül ELAM-1, einem Glied der LELAM-Familie von Anhaftungsmolekülen vermittelt, und es gibt Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkungen durch bestimmte α-(1-3)-Fucosyltransferasen reguliert werden können.
Siehe "ELAM-1-abhängige Zellanhaftung an Gefäß Endothel, bestimmt durch eine übertragene menschliche Focusyltransferase cDNA", Lowe et al., Zell, Band 63, Seiten 475 bis 484, 2. November 1990.
Es ist daher erwünscht, eine Verbindung zu haben, die an α-1,3-L- Fucosyltransferasen mit genügender Spezifität bindet, so daß die α-1,3-L- Fucosyltransferasen selektiv leicht festgestellt werden können, und zwar sowohl zum Zwecke der Erforschung als auch der Diagnosen und Krankheitsvoraussagen. Außerdem kann eine solche Bindungsverbindung die Aktivität von α-1,3-L-Fucosyltransferasen beeinflussen und so erwünschtermaßen Krankheiten verlangsamen oder anhalten, bei denen sie auftritt. Eine solche Bindungsverbindung kann weiterhin an organische Strukturen binden, welche der Struktur von α-1,3-L-Fucosyltransferasen ähneln, wenigstens so weit, als Bindungsstellen betroffen sind.
Eine solche Bindungsverbindung kann weiterhin an Hilfsverbindungsstrukturen, wie Toxine oder Antineoplastverbindungen angefügt werden, um solche Hilfsstrukturen zu den α- 1,3-L-Fucosyltransferasen oder organischen Strukturen, welche ihnen ähneln, zu tragen.
Eine Anzahl von Akzeptoren für Fucosyltransferasen ist bekannt, doch unterscheiden leider solche Akzeptoren nicht zwischen α-1,3-L-Fucosyltransferasen und anderen Fucosyltransferasen so gut wie es erwünscht wäre. Solche Akzeptoren sind auch nicht so empfindlich wie erwünscht und haben keine so hohe Affinität wie erwünscht.
Beispiele von Verbindungen, die mehr oder weniger als Akzeptoren für Fucosyltransferasen wirken können, sind 2'-Methyllactosamin (2'-Methyl Lac Nac), 2'-Fucosyl Lac Nac, 3-Fucosyl Lac Nac und die β-Benzylglycoside von Lac Nac, 2'-Methyl Lac Nac, Gaβ1 und 3-GalNAc.
De Waard et al., The Journal of Biological Chemistry 266 (7), Seiten 4237 bis 4243 (5. März 1991) beschreiben die Strukturen von Kohlenhydratketten, die durch enzymatischen Aufschluß von Schweine-Thyroglobulin freigesetzt werden. Die im Schema 2 als Fraktion S&sub1;-1 gezeigten Strukturen umfassen ein Disaccharid 3SO&sub4;&supmin;-Galβ(1-4)GlcNAc, und die durch die zweite Formel in der Zusammenfassung gezeigten Strukturen umfassen eine Paarung Galβ(1-4)Glc(6SO&sub4;&supmin;)Nac. Diese Gruppierungen ähneln den Oligosacchariden der vorliegenden Erfindung gemäß der Formel I in Anspruch 1, wenn R&sub7; darin Oligosaccharid wäre. Die obige Literaturstelle beschreibt aber nicht die Isolierung oder Kennzeichnung solcher Oligosaccharide und schlägt auch keine Verwendung hiervon vor.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Gemäß der Erfindung bekommt man eine Oligosaccharidverbindung, die an α-1,3-L- Fucosyltransferase bindet.
Spezieller umfaßt die Verbindung eine biologisch aktive Oligosaccharidverbindung, die wenigstens zwei L-Hexoseringe umfaßt, die durch eine glycosidische Bindung miteinander verbunden sind. Die glycosidische Bindung ist mit einem ersten der Ringe an dem Kohlenstoffatom in der Position 1' des Hexoseringsystems verbunden. Die Verbindung enthält wenigstens eine Sulfat- oder Phosphatgruppe, die mit dem ersten Ring an dem Kohlenstoffatom in Stellung 3' oder 6' des Hexoseringsystems verbunden ist. Ein Oligosaccharid der Erfindung wird durch die Formeln I oder II wiedergegeben, die in Anspruch 1 aufgeführt sind und worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder - R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin Ester, Ether, Amino oder Fluor sein kann, vorausgesetzt, daß wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind und, wenn das Oligosaccharid durch die Formel I wiedergegeben wird, R&sub7; nicht Oligosaccharid ist.
Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die die obigen Oligosaccharide umfassen.
Weiterhin schließt die Erfindung Verfahren in vitro für die Verwendung der obigen Oligosaccharide und auch jene der Formel I, worin R&sub7; Oligosaccharid ist, ein, um α-1,3-L- Fucosyltransferasen festzustellen oder die Aktivität solcher α-1,3-L-Fucosyltransferasen oder Strukturen, welche der Struktur solcher Fucosyltransferasen so weit ähneln, daß solche Strukturen Verbindungen der vorliegenden Erfindung binden, z. B. wie im Falle von HIV- Virus, zu blockieren.
Außerdem enthält die Erfindung die Verwendung der obigen Oligosaccharide und auch jener der Formel I, worin R&sub7; Oligosaccharid ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der biologischen Aktivität von 1,3-L-Fucosyltransferase, um sie für Tumore zu verlangsamen oder anzuhalten, die von Erhöhung des Serumgehaltes an 1,3-L- Fucosyltransferase begleitet sind, sowie ihre Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Replikation von HIV-Virus.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 (a&sub1;, a&sub2;, a&sub3; und b&sub1;, b&sub2;, b&sub3;): Spektren der Verbindungen 1, 4 und 5 bei Ionisierung mit schnellem Atombeschießen.
Fig. 2 Fließbild für die Herstellung der feinteiligen und löslichen Fraktionen von menschlichem Eierstocktumor.
Fig. 3 Reinigung von α-1,3-L-Fucosyltransferase auf einer Sephacryl® S-200-Säule:
Ein Eierstocktumor-α-1,3-L-Fucosyltransferasepräparat, das mit Affinitätschromatographie auf Rinder-IgG-Glycopep-Sepharose® (Probenvolumen: 2,0 ml) erhalten worden war, wurde auf eine Sephacryl®-S-200-Säule (2,6 · 88,0 cm) aufgebracht, die in dem kalten Raum mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl, 0,1% Triton®-X-100 äquilibriert worden war. Anteile von 3,0 ml wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 9,0 ml/h aufgefangen. Die Fucosyltransferase wurde mit dem Akzeptor 2'-Fucosyl LacNAc festgestellt.
Fig. 4 SDS-PAGE (Phast-Gel 8 bis 25, Pharmacia System) aus der löslichen Fraktion von menschlichem Eierstocktumor durch Reinigung erhalten: Streifen 1 → 5 : 1 ug des Enzymproteins wurde aufgebracht; Streifen 6 : 2 ug des Enzymproteins. Das Gel wurde mit Coomassieblau angefärbt.
Fig. 5 Papierchromatographie des [¹&sup4;C]-fucosylierten Produktes aus der Inkubation von 3'- Sulfo-LacNAc mit Serum -α-1,3-L-Fucosyltransferase. Bezüglich der Einzelheiten siehe den Text:

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

"Oligosaccharid", wie hier verwendet, bedeutet mehrere miteinander verbundene Hexose- und Pentoseringe, die gewöhnlich durch ein oder mehrere Ethersauerstoffatome verbunden sind.
Die am meisten bevorzugten Oligosaccharide der Erfindung sind Hexosedisaccharide, die gewöhnlich Lactosederivate sind.
Die Verbindungen können unter Bezugnahme auf die Kohlenstoffatomzahl in dem Oligosaccharid genannt werden, welche beispielsweise im Falle von Lactosederivaten numeriert wird, wie in der folgenden Strukturformel gezeigt ist.
Mehrere bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung können daher folgendermaßen benannt werden:
1: Natrium-3'-O-sulfo-2N-acetyllactosamin-β-1 → 0-Benzyl und
2: Natrium-6-O-sulfo-2N-acetyllactosamin-β-1 → 0-Benzyl, und wenn der Ethersauerstoff mit dem 3-Kohlenstoffatom statt dem 4-Kohlenstoffatom verbunden ist:
3: Natrium-3'-O-sulfolacto-2N-biose-1-β1-0-benzyl und
4: Natrium-6-O-sulfolacto-2N-biose-I-β1-0-benzyl.
Höhere Polysaccharide werden gemäß der Erfindung in Betracht gezogen, z. B. solche, worin jeder Ring getrennt numeriert ist und jeder Kohlenstoffatome 1 bis 6 hat. Die obigen Verbindungen 1 und 3 können als Benzyl-4-O-(natrium-β-D-galactopyranosyl-3-sulfat)-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosid und Benzyl-3-O-(natrium-β-D-galactopyranosyl-3- sulfat)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosid bezeichnet werden.
Überraschenderweise macht das Vorhandensein der Sulfat- oder Phosphatgruppe an dem Kohlenstoffatom 3' oder 6 die Verbindung selektiv für 1,3-L-Fucosyltransferase.
Wichtigerweise kann irgendeine andere funktionelle Gruppe an die Saccharidringe angefügt werden, vorausgesetzt, daß solche Gruppen die Bindungseigenschaften der Verbindungen nach der Erfindung an die erwünschte 1,3-L-Fucosyltransferase nicht ernsthaft behindern.
Solche Substitutionen können an den R&sub1;-R&sub8;-Gruppen durchgeführt werden, wie in den Formeln gezeigt ist, die in Anspruch 1 aufgeführt sind. Solche Substitutionen werden entweder durch Ersatz der gesamten -OH-Gruppe, z. B. durch Substitution durch eine Amino- oder Fluoridgruppe, oder durch Ersatz des Wasserstoffatoms in einer Hydroxylgruppe, z. B. durch Ester- oder Etherbildung oder durch Substitution an einem aromatischen Ring vorgenommen werden.
Die Gruppen R&sub1; bis R&sub8; können -OH, OR&sub9; oder R&sub1;&sub0; sein, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander niedermolekulares Alkyl, niedermolekulares Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosaccharide, Oligosaccharid, Toxine, Antikörper, Enzyme, Aminosäuren und Aminosäureketten einschließlich Peptiden und Proteinen sind und R&sub1;&sub0; Fluor oder Ester-, Ether- oder Aminogruppen sein kann, die weiterhin Saccharide, Aminosäuren, Aminosäurekettenenzyme, Antikörper und Toxine binden können.
Gewöhnlich sind zur Vermeidung einer Hinderung wenigstens drei und gewöhnlich vier Gruppen R&sub1; bis R&sub8; -OH-Gruppen.
Es ist verständlich, daß jede der obigen Gruppen weiter substituiert sein kann, wie zum Beispiel mit einer oder mehreren niedermolekularen Alkylgruppen, -OH-Gruppen, Ethergruppen, Estergruppen, Carboxylgruppen, Aminogruppen, Fluoratomen, Sacchariden, Antikörpern, Toxinen, Enzymen, Radioisotopen und Nucleinsäuren.
Antikörper können mit dem Grundoligosaccharid nach Methoden gebunden werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie sie beispielsweise in Fitzgerald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84, Seiten 4288 bis 4292, Juni 1987 beschrieben sind. Antikörper, die gebunden werden können, sind solche vieler Typen einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper.
Toxine, die gebunden werden können, schließen solche Strukturen wie das Kettenbruchstück Ricin A ein. Verfahren zur Bindung der Ricin A-Kette sind dem Fachmann bekannt, z. B. durch kovalente Bindung. Andere Toxine oder Arzneimittel, die angebunden werden können, können zytotoxische Mittel, wie Methotrexat, einschließen.
Andere Enzyme, von denen einige hormonartige Aktivität haben können und die gebunden werden können, schließen biologische Reaktionsmodifiziermittel, wie Interleukine, Interferone und Wachstumsfaktoren ein und können Enzyme vom Phosphasetyp einschließen.
Radioisotope und Nucleinsäuren sowie Derivate können nach bekannten Methoden angefügt werden.
Besonders erwünschte Gruppen R, wie z. B. in der Stellung R&sub7;, sind Aromaten, wie Benzyl und Nitrophenyl, da sie ein bestimmtes NMR-Resonanzbild haben, welches ihre Auffindung unterstützt. Die Gruppen R&sub5; und R&sub7;, welche distal von dem Bereich entfernt sind, von dem angenommen wird, daß er mit 1,3-L-Fucosyltransferasen reaktiv ist, sind besonders geeignet oftmals durch Ester-, Ether- oder Aminogruppen zu größeren Gruppen, wie zusätzlichen Saccharidringen und Peptidketten.
Beispiele von Sacchariden, die angefügt werden können, wie die R&sub5;- und R&sub7;- Gruppen, gewöhnlich durch eine Etherbindung, sind Glucose, Fructose, Aldose, Mannose, Ribose und Galactose.
Die Verbindungen nach der Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge von α-1,3-L-Fucosyltransferase festzustellen. Dies kann leicht erreicht werden, indem man eine Verbindung nach der Erfindung mit einer Probe inkubiert, die α-1,3-L-Fucosyltransferase enthält, wie nachfolgend unter Bezugnahme auf die speziellen Beispiele beschrieben ist.
Einige Derivate von LacNAc wurden synthetisiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, als Akzeptoren für α-1,3-L-Fucosyltransferase zu wirken, die in Seren von Patienten mit Eierstockkrebs und in feinteiligen und löslichen Fraktionen von menschlichem Eierstockturmor vorliegt. Diese Verbindungen waren 3'-Sulfo-LacNAc, 6'-Sulfo-LacNAc, 6-Sulfo- LacNAc und das β-Benzylglycosid von 3'-Sulfo-LacNAc.
Diese Verbindungen wurden mit 2'-Methyl-LacNAc als Standard verglichen, also einer Verbindung, die bekanntermaßen Akzeptoreigenschaften für zahlreiche Fucosyltransferasen hat.
In den Vergleichen wurden die Aktivitäten auf die Fähigkeit von 2'-Methyl-LacNAc bezogen, als ein Akzeptor mit einem Grundwert von 100% zu wirken.
Im Vergleich mit 2'-Methyl-LacNAc war 3'-Sulfo-LacNAc etwa drei- bis fünfmal empfindlicher bei der Messung des Enzymgehaltes von α-1,3-L-Fucosyltransferasen in Blutseren gegenüber 2'-Methyl-LacNAc. Das Serumenzym hatte auch eine sehr hohe Affinität (Km) zu 3'-Sulfo-LacNAc.
Bei Verwendung kompetitiver Analyse war Km für 3'-Sulfo-LacNAc in Gegenwart von 3,0 mM 2'-Methyl-LacNAc 0,12 mM, und jenes für 2'-Methyl-LacNAc in Gegenwart von 0,3 mM 3'-Sulfo-LacNAc war 6,67 mM. Je geringer die Zahl ist, desto größer ist die Affinität, so daß 3'-Sulfo-LacNAc eine viel größere Affinität zu den Enzymen hat als 2'-Methyl- LacNAc.
Wenn spezieller Eierstockkrebsserum als die Enzymquelle verwendet wurde, verbesserte die Sulfatgruppe am C-3 von LacNAc die Akzeptorfähigkeit (Empfindlichkeit) auf 341% im Vergleich mit 2'-Methyl-LacNAc bei 100% Standard. Vergleichsweise senkte eine Sulfatgruppe am C-2' oder C-6' die Aktivität auf 22 bzw. 36%. Die Sulfatgruppe am C-6 steigerte die Aktivität auf 172% im Vergleich mit 2'-Methyl-LacNAc bei 100%.
Die β-Benzylierung von C-1 von 2'-Methyl-LacNAc steigerte die Aktivität von LacNAc auf das Zwei- bis Dreifache, doch senkte sie die Aktivität von 3'-Sulfo-LacNAc.
Die Enzyme der löslichen Tumorfraktion wurden teilweise (16mal bei 39% Ausbeute) durch Affinitätschromatographie auf IgG-Glycopeptid-Sepharose® vom Rind gereinigt. Weitere Reinigung bis zu offensichtlicher Homogenität, wie durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (Mr = < 67 000) gezeigt, wurde durch Sephacryl® S-200- Chromatographie (66mal, 6%ige Ausbeute) erreicht. Das Fucosyltransferase- Enzymgemisch ist bei vollständiger Reinigung instabil.
Das Enzymgemisch der löslichen Fraktion zeigte selbst größere Aktivität als die Serumfraktion gegenüber 3'-Sulfo-LacNAc, 447 und 272% für 6'-Sulfo-LacNAc im Vergleich mit 2'-Methyl-LacNAc bei 100%. Im Gegensatz dazu zeigen 2'-Sulfo-LacNAc und 6'-Sulfo- LacNAc nur 33 bzw. 5% Aktivität.
Das Enzymgemisch von löslichem Tumor ist auch sehr aktiv mit Gaβ1, 3-GlcNAc (566%), den β-Benzylglycosiden von Gaβ1, 3-GlcNAc (1005%) und 3-Sulfo-~Galβ1, 3-GlcNAc (415%), was die Koexistenz von α-1,3- und α-1,4-Fucosyltransferase in diesem Gemisch zeigt.

Beispiele

Seren wurden von gesunden Frauen und Eierstockkrebspatientinnen vom Roswell Park Cancer Institute in Buffalo, New york, USA gesammelt. Eierstocktumorgewebe wurden während chirurgischer Eingriffe von Patientinnen mit Eierstockkrebs erhalten. Sowohl die Seren als auch die Gewebe wurden bis zur Verwendung bei -70ºC eingefroren gelagert.
Isolierung von Glycopeptiden aus Rinder-IgG durch Pronaseaufschluß, Gelfiltration und Con-A-Sepharose®-Chromatographie und anschließende Kopplung an Sepharose® 4β erfolgte, wie von C. S. Foster et al. (1991), J. Biol. Chem. 226, Seiten 3526 bis 3531 beschrieben.
Diese Affinitätsmatrix (30 ml im Bettvolumen) wurde bei 4ºC mit 25 mM Tris-HCl pH 7,0 mit einem Gehalt von 35 mM GmCl&sub2;, 10 mM NaN&sub3; und 1 mM ATP gewaschen und äquilibriert.
Papierchromatographische Identifizierung des [¹&sup4;C]-fucosehaltigen Produktes aus dem 3'-Sulfo-LacNAc-Inkubationsgemisch (100 ul) erfolgte durch Fleckenbildung auf einem Whatman®-3MM-Chromatographiepapier, und es erfolgte Chromatographie in Ethylacetat/Pyridin/Wasser (12/5/4) während 48 h. Das chemisch synthetisierte Produkt 3'-Sulfo-3- Fucosyl-LacNAc wurde auf dem Papier auch parallel gefahren. Die Radioaktivität wurde auf dem Papier bestimmt, indem 1 cm große Abschnitte abgeschnitten, in 1 ml Wasser in Kolben vollgesaugt wurden und die Radioaktivität durch Szintillationsauszählung bestimmt wurde. Der nichtradioaktive Standard wurde auf dem Papier durch alkalisches Silberreagenz lokalisiert. Protein wurde durch die BioRad-Mikromethode mit BSA als Standard geprüft. Protein in Gegenwart von Triton X-100 wurde nach einem modifizierten Lowry-Verfahren bestimmt (Trevelyn et al. [1950], Nature [London], 166, Seiten 444 und 445).

Bestimmung von α-1,3-Fucosyltransferase

Ein Inkubationsgemisch enthielt 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 5 mM MnCl&sub2;, 7 mM ATP, 3 mM NaN&sub3;, den Akzeptor in einer Menge von 0,3 mM (für Serumenzym) oder 3,0 mM (für Tumorenzym), 0,125 uCi GDP-[U-¹&sup4;C] Fuc (Sp. Act. 216 mCi/mmol) und Enzym in einem Gesamtvolumen von 0,10 ml; das Kontrollinkubationsgemisch hatte alles mit Ausnahme des Akzeptors. Am Ende der Inkubation bei 37ºC während 18 h wurde das Gemisch mit 1 ml Wasser verdünnt und durch eine Dowex®-1-C1-Säule (1 ml in einer Pasteur-Pipette) geführt. Die Säule wurde zweimal mit 1 ml Wasser gewaschen. Der Durchbruch und die Waschflüssigkeit, welche den [¹&sup4;C]-fucosylierten neutralen Akzeptor enthielt, wurden zusammen in einem Szintillationskolben aufgefangen und hinsichtlich der Radioaktivität unter Verwendung des Szintillationscocktails 3a70 (Research Products International, Mount Prospects, Illinois) und von Beckman® LS 9000 ausgezählt. Die Dowex®-Säule wurde dann nacheinander mit 3 ml von jeweils 0,1 M und 0,2 M NaCl eluiert. Diese Eluate, die die [¹&sup4;C]-fucosylierten sulfatierten Akzeptoren enthielten, wurden hinsichtlich der Radioaktivität wie oben ausgezählt. Korrekturen wurden durch Abziehen der Radioaktivität in Wasser und in den NaCl-Eluaten des Kontrollinkubationsgemisches aus den entsprechenden Testfraktionen vorgenommen. Die Probendoppelversuche ergaben fast identische Werte, wobei der Unterschied kleiner als 5% war.

Chemische Synthese

β-D-Galactopyranosyl-(1 → 4)-natrium-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose-6-sulfat (Verbindung 1):

Glycosylierung von Benzyl-2-acetamido-3-O-benzyl-2-deoxy-6-O-(4-methoxybenzyl)- α-D-glucopyranosid mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactosylbromid ergab das vollständig geschützte Disaccharid. Die selektive Entfernung der 4-Methoxybenzylgruppe mit DDQ in Dichlormethan ergab den Alkohol (Verbindung 2). Umsetzung von 2 mit 5molaren Äquivalenten von Schwefeltrioxid-Pyridinkomplex in N,N-Dimethylformamid ergab 3 als sein Natriumsalz nach Kationenaustausch (Na&spplus;). O-Deacetylierung von 3 in methanolischem Natriummethoxid, gefolgt von Hydrogenolyse der Benzylgruppe in Gegenwart von Palladium auf Kohle ergab die Verbindung 1 als einen amorphen Feststoff nach Durchgang durch eine Kationen (Na&spplus;)-Austauscherharzsäule. [α]D + 26,5 (c 1,3, Wasser) für ¹³C-NMR und m/z-Werte (siehe Tabelle I).

Natrium-β-D-galactopyranosyl-3-sulfat-(1 → 4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose (Verbindung 4):

Die Umsetzung von Benzyl-2-acetamido-2-deoxy-3-,6-di-O-benzyl-4-O-(4,6-O- benzyliden-2-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-α-D-glucopyranosid in N,N-Dimethylformamid mit SO&sub3;. Pyridinkomplex bei Raumtemperatur ergab das entsprechende 3'-O-Sulfoderivat, welches bei Hydrogenolyse und anschließender Reinigung über Dowex®-1-Säule (Acetatform) und Behandlung mit Na&spplus;-Harz Verbindung 4 als einen amorphen Feststoff ergab. [α]D + 21,3 (C 0,5, H&sub2;O). Für ¹³C-NMR und m/z-Werte siehe Tabelle I.

O-α-L-Fucopyranosyl-(1 → 3)-[natrium-O-β-D-galactopyranosyl- 3-sulfat-(1 → 4)]-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose (Verbindung 5):

Glycosylierung von Benzyl-2-acetamido-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- galactopyranosyl)-6-O-benzyl-2-deoxy-α-D-glucopyranosid mit Methyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1- thio-β-L-fucopyranosid in Gegenwart von Kupfer-II-bromid-Tetrabutylammoniumbromid, gefolgt von O-Deacetylierung mit methanolischem Natriummethoxid ergab bekanntes Benzyl-2- acetamido-6-O-benzyl-3-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl-4-O-(β-D- galactopyranosyl)-2-deoxy-α-D-glucopyranosid (Verbindung 6). Isopropylidenierung von 6 nach dem Verfahren von Catelani et al. ergab 3',4-O-Acetylderivat (Verbindung 7) [α]D + 21 (c 0,9, CHCl&sub3;), ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,44-7,16 (m, 25H, arom.), 1,50 (s, 3H, Nac), 1,45 und 1,25 (jeweils s, 3H, CMe&sub2;), 1,13 (d, J ~ 6 Hz, 3H, CMe). Acetylierung von 7 mit Pyridin- Essigsäureanhydrid, gefolgt von einer Abspaltung der Isopropylidengruppe mit 80%iger wäßriger Essigsäure ergab das Diol: [α]D + 5,75 (c 0,8, CHCl&sub3;), ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,45- 7,10 (m, 25H, arom.), 2,03 (s, 3H, OAc), 198 (s, 3H, Oac), 1,54 (s, 3H, Nac), 1,17 (d, J 6 Hz, 3H, CMe). Dieses wurde in sein 3',4'-(Ethylorthoacetat), welches mit 80%iger wäßriger Essigsäure hydrolysiert wurde, um 3'-Hydroxy-Schlüsselzwischenprodukt 8 zu ergeben, umgewandelt. [α]D + 10,4 (c 0,5, CHCl&sub3;), ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 7,38-7,08 (m, 25 H. arom.), 2,01 (s, 6H, 2 · Oac), 1,91 (s, 3H, Oac), 1,51 (s, 3H, Nac), 1,17 (d, J - 6 Hz, 3H, CMe). Sulfatierung von 8 in analoger Weise zu jener, die für 2 (um 3 zu ergeben) beschrieben ist, ergab 9 als Natriumsalz. O-Deacetylierung von 9 in methanolischem Natriummethoxid, gefolgt von Entfernung der Benzylether-Schutzgruppen ergab das Natriumsalz von O- α-L-Fucopyranosyl-(1 → 3)-[O-[3-D-galactopyranosyl-3-sulfat-(1 → 4)]-2-acetamido-2-deoxy- D-glucopyranose (5) nach Reinigung auf einer Dowex®-1-Säule (Acetatform), gefolgt von einer Behandlung mit Kationen (Na&spplus;)-Austauscherharz; [α]D - 10,7 (anfangs) → -8,9 (nach 72 h). (C 0,3, H&sub2;O) für ¹³C-NMR und m/z-Werte siehe Tabelle I. Hydrogenolyse der Benzylgruppen von 6, gefolgt von säulenchromatographischer Reinigung auf Kieselgel ergab bekanntes freies Trisaccharid 10. Für ¹³-C-NMR und m/z-Werte siehe Tabelle I. Die chemische Synthese anderer Verbindungen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, findet sich woanders.
Die Reinheit der synthetischen sulfatierten Verbindungen 1, 4 und 5 wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel sowie auf Celluloseplatten und auch durch Papierchromatographie geprüft. Ihre strukturelle Zuschreibung wurde durch ¹³C-NMR (Tabelle I) und FAB-Massenspektroskopie (Fig. 1) bestätigt.
In dem ¹³C-Spektrum von 1 litt die Resonanz für C-6 des 2-Acetamido-2-deoxy-D- glucoserestes (GlcNAc) unter einem Feldabfallwechsel von 6,3 ppm im Vergleich mit jener des Gegenstückes in dem Spektrum der Verbindung 4, was zeigt, daß O-6 die Stelle der Sulfatierung war. In den Spektren sowohl von 4 als auch 5 wurden analoge Feldabfallwechsel von 7,6 bzw. 7,7 ppm für C-3-Resonanzen ihrer entsprechenden Gal-Reste beobachtet, was bestätigt, daß die Sulfatierung bei O-3' bei beiden Verbindungen erfolgte.

Reinigung von α-1,3-L-Fucosyltransferase aus der löslichen Fraktion von menschlichem Eierstocktumor

Wie in Fig. 2 gezeigt, wird das Ausgangseierstocktumorgewebe (A) in der Verfahrensstufe 1 durch Homogenisieren mit 50 mM Natriumphosphat pH 5,5 (Gewicht/Volumen 1 : 20) mit einem Gehalt von 0,1% NaN&sub3; behandelt und bei 40ºC 1/2 h mit 13 000 G zentrifugiert. Dies führt zu dem obenschwimmenden Produkt (B) und dem Sedimentprodukt (C).
Das Sedimentprodukt (C) wird dann wie in der Verfahrensstufe 1 unter Bildung von obenschwimmendem Produkt (D) und Sedimentprodukt (E) erneut homogenisiert und zentrifugiert.
Die obenschwimmenden Produkte (B) und (D) werden vereinigt und einer Affinitätschromatrographie auf Fucosylamin-Sepharose® im Verfahren der Stufe 3 unterzogen. Dies führt zu α-L-fucosidasegebundenem Material (F) und Durchbruch plus Waschlösung mit einem Gehalt von α-L-fucosidasefreiem Gewebeextrakt (G).
40 g Extrakt (G) werden dann mit 80%igem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; ausgefällt und mit 13 000 G 1/2 h in der Verfahrensstufe 4 zentrifugiert, um Ausfällung (H) zu erzeugen. In der Verfahrensstufe 5 wird die Ausfällung (H) in 25 mM Tris-HCl pH 7,0 mit einem Gehalt von 10 mM NaN&sub3;, 35 mM MgCl&sub2; und 1 mM ATP (1/20 V der obigen Lösung) aufgelöst und gegen 1 l des gleichen Puffers mit vier Wechseln während 48 h bei 4ºC dialysiert, um dialysierte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fraktion (I) zu erzeugen. In der Verfahrensstufe 6 wird die Fraktion (I) Affinitätschromatographie auf einer Rinder-IgG-Glycoprep-Sepharose®-Säule unterzogen und dann mit 1 M NaCl in dem obigen Puffer eluiert, um das NaCl-Eluat (J) zu erzeugen. In der Stufe 7 wird NaCl-Eluat (J) durch Ultrafiltration auf etwa 5 ml konzentriert und gegen 1 l des Tris- Puffers mit einem Gehalt von ATP, MgCl&sub2; und NaN&sub3; während 4 h bei 4ºC dialysiert und bei 4ºC gelagert, um eine proteinpositive Fraktion (K) zu erzeugen.
In der Verfahrensstufe 8 wird das Sediment (E) mit 50 mM Tris-HCl pH 7,0 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl und 1%Triton®-X-100 (1/10 V des Homogenats) homogenisiert und dann bei 18 000 G während 1 h bei 4ºC zentrifugiert, um das obenschwimmende Material (L) (löslichgemachtes feinteiliges Präparat) zu erzeugen.
Schließlich wurden 2 ml der Fraktion (K) dann auf eine Sephacryl -S-200-Säule (superfein: 2,6 · 88,0 cm) aufgegeben, bei 4ºC mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl und 0,1% Triton -X-100 äquilibriert und mit dem gleichen Puffer eluiert. Fraktionen von 3,0 ml wurden aufgefangen. Die Fucosyltransferaseaktivität wurde in den Auslauffraktionen lokalisiert, indem zunächst jede fünfte Fraktion geprüft wurde und dann das Aktivitätsprofil durch Prüfen der abwechselnden Fraktionen in dem Bereich unter Verwendung von 2'-Fucosyl-LacNAc als Akzeptor erhalten wurde.
Fig. 3 zeigt das Eluierprofil von x-1,3-Fucosyltransferase aus der Säule, wie durch α-1,3-Fucosyltransferaseaktivität auf der Y-Achse angegeben (bestimmt durch [¹&sup4;C]- Fucoseeinlagerung in 2-Fucosyl-LacNAc [CPM · 10&supmin;&sup4;/50 ul]) gegen das Eluiervolumen (ml). Ihre Eluierposition, welche etwas später als BSA ist, auf der gleichen Säule getrennt ablaufend, zeigt ihr Molekulargewicht mit < 67.000 Dalton. Einer SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (Phast-Gel 8-25, Pharmacia-Apparatur) unterzogen zeigte das Präparat eine einzelne diffuse Bande (angefärbt durch Coomassieblau) mit Mr = < 67.000 (Fig. 4). Tabelle II zeigt die Ergebnisse der Reinigung des Enzyms. Das Enzym wird 66 mal über dem löslichen Extrakt mit einer Gewinnung von 6,2% gereinigt. Das Enzym verlor in dieser Stufe seine Aktivität entweder auf -20ºC gefroren gehalten oder bei 4ºC mehr als eine Woche gehalten. Das Enzym am Ende der vorausgehenden Stufe war jedoch während wenigstens zwei Monaten bei 4ºC ziemlich stabil. So wurde dieses Enzympräparat bei Akzeptorfähigkeitsvergleichsversuchen verwendet.

3'-Sulfo-LacNAC, ein einzigartiges Substrat für α-1,3-Fucosyltransferase

Die Überlegenheit von 3'-Sulfo-LacNAc gegenüber 2'-Methyl-LacNAc als das Substrat zur Messung von Serum-α-1,3-Fucosyltransferase wurde auf drei unterschiedlichen Wegen getestet. Zunächst enthielten die Inkubationsgemische in doppelter Ausführung 0,3 mM 3'-Sulfo-LacNAc und variierende Mengen von 2'-Methyl-LacNAc (0 bis 7,5 mM). Die Einlagerung von [¹&sup4;C]-Fucose durch das Serumenzym in beide Substrate wurde gemessen (Tabelle III). Die Einlagerung von [¹&sup4;C]-Fucose in 3'-Sulfo-LacNAC nahm ab, und die in 2'- Methyl-LacNAc nahm zu, wenn die Konzentration des letzteren zunahm. Die höchste in dem Experiment verwendete Konzentration von 2'-Methyl-LacNAc (7,5 mM) war in der Lage, nur etwa 43% Hemmung der [¹&sup4;C]-Fucoseeinlagerung in 3'-Sulfo-LacNAc zu ergeben, dessen Konzentration nur 0,3 mM war, d. h. 25 mal weniger als 2'-Methyl-LacNAc. Zweitens enthielten die Inkubationsgemische in doppelter Ausführung 3,0 mM 2'-Methyl-LacNAc und variierende Mengen von 3'-Sulfo-LacNAc (0 bis 0,75 mM). Die Einarbeitung von [¹&sup4;C]-Fucose durch das gleiche Serumenzym in beide Substrate wurde gemessen (Tabelle III). Die [¹&sup4;C]- Fucoseeinarbeitung in 2'-Methyl-LacNAc nahm ab, und die in 3'-Sulfo-LacNAc nahm zu, wenn die Konzentration des letzteren gesteigert wurde. 3'-Sulfo-LacNAc mit 0,75 mM (die höchste Konzentration, die in dem Experiment verwendet wurde, die ein 1/10 der höchsten Konzentration von 2'-Methyl-LacNAc bei Verwendung in dem vorausgehenden Experiment ist) ergab etwa 68% Hemmung der [¹&sup4;C]-Fucoseeinarbeitung in 2'-Methyl-LacNAc, dessen Konzentration 3,0 mM war, was die vierfache Menge von 3'-Sulfo-LacNAc war. Drittens wurden sowohl 2'-Methyl-LacNAc als auch 3'-Sulfo-LacNAc in einer Konzentration von 0,3 mM getrennt in doppelter Ausführung mit sechs Eierstockkrebsseren und einem normalen Serum inkubiert. Die Einarbeitung von [¹&sup4;C]-Fucose in diese Akzeptoren wurde quantitativ bestimmt (Tabelle IV). Die Einarbeitung von [¹&sup4;C]-Fucose in 3'-Sulfo-LacNAc war erheblich höher (4 bis 5 mal) als jene in 2'-Methyl-LacNAc einschließlich der Bestimmung des Normalserums. Im Vergleich mit dem normalen Serum zeigte das Krebsserum eine höhere α-1,3- Fucosyltransferaseaktivität im Bereich von 176 bis 434% bei Messung mit 2'-Methyl-LacNAc und 200 bis 636% mit 3'-Sulfo-LacNAc. Diese Werte zeigen somit die Übereinstimmung und Überlegenheit von 3'-Sulfo-LacNAc als das Substrat zur Messung des Gehaltes von Serumα-1,3-Fucosyltransferase. Der Km-Wert, berechnet für 2'-Methyl-LacNAc in Gegenwart von 0,3 mM 3'-Sulfo-LacNAc (siehe Tabelle III) war 6,67 mM und für 3-Sulfo-LacNAc in Gegenwart von 3,0 mM 2'-Methyl-LacNAc (Tabelle III) war 0,12 mM. Diese Werte zeigen, daß 3'- Sulfo-LacNAc ein Akzeptor mit sehr hoher Affinität für α-1,3-Fucosyltransferase ist. Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde das [¹&sup4;C]-fucosylierte Produkt, das von 3'-Sulfo-LacNAc stammt, vorläufig als 3'-Sulfo, 3-Fucosyl-LacNAc (Peak links) durch genauen Vergleich seiner Mobilität auf Papier mit der synthetischen authentischen Standardverbindung 3'-Sulfo, 3-Fucosyl- LacNAc (Peak rechts) identifiziert.

Eierstockkrebsserum-α-1,3-Furosyltransferaseaktivität mit verschiedenen synthetischen Akzeptoren (siehe Tabelle V):

Die Aktivität von Serum-α-1,3-Fucosyltransferase wurde mit dem spezifischen Substrat 2'-Methyl-LacNAc gemessen und der Fähigkeit mehrerer anderer synthetischer Substrate, als ein Akzeptor für Fucose zu wirken, verglichen. LacNAc und Gaβ1, 3GlCNAc waren jeweils 93,4 und 13,1% aktiv, was nahelegt, daß α-1,3-Fucosyltransferase die vorherrschende Fucosyltransferase (> 90%) in dem Eierstockkrebsserum der vorliegenden Untersuchung ist. Dieses Ergebnis wurde weiter durch die Werte gestützt, daß die β-Benzylglycoside von 2'-Methyl-LacNAc und LacNAc gleich aktiv waren (307,9 bzw. 358,8%), während das gleiche Glycosid von Gaβ1, 3GlcNAc nur 21,7% Aktivität zeigte. Die Überführung von Fucose auf C-3 von GlcNAc war aus den Ergebnissen ersichtlich, gemäß denen 2'-Fucosyl- LacNAc als ein sehr gutes Substrat (253% aktiv) wirkte, während 3-Fucosyl-LacNAc fast inaktiv (nur 4,7% aktiv) war. Ähnlich der Beobachtung mit den β-Benzylglycosiden von LacNAc und 2'-Methyl-LacNAc war das β-Benzylglycosid von 2'-Fucosyl-LacNAc ein wirksameres Substrat (425%) als die Ursprungsverbindung (253,1%).
Die Struktur des Akzeptors 2'-Methyl-LacNAc wurde durch Austausch der Methylgruppe gegen die Sulfatgruppe in der Stellung C-2', -3'-, -6' oder -6 und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, als der Akzeptor von Fucose zu wirken, getestet, wobei sich die folgenden neuen Auffindungen ergaben. 3'-Sulfo-LacNAc war der aktivste Akzeptor (340,8%) im Vergleich mit anderen sulfatierten Derivaten und den nichtsulfatierten Akzeptoren, wie 2'-Methyl-LacNAc und 2'-Fucosyl-LacNAc. Unter den anderen sulfatierten Derivaten war 6-Sulfo-LacNAc beachtlich aktiv (172,4%), und die 2'- und 6'-Sulfo-Verbindungen waren weniger aktiv (22,0 bzw. 36,2%). Das β-Benzylglycosid von 3'-Sulfo-LacNAc war recht aktiv (168,4%), doch weniger als die Ausgangsverbindung. Aus der vorliegenden Studie ergibt sich somit, daß β- Benzylierung eine Steigerung der Aktivität von nichtsulfatierten LacNAc-Derivaten um das Zwei- bis Dreifache ergibt, aber eine Abnahme von 50% der Aktivität von sulfatiertem LacNAc (d. h. 170% im Vergleich mit 2'-Methyl-LacNAc bei 100% Standard), 3-Sulfo-Gaβ1, 3GlcNAcβ-O-Bn zeigten keine Aktivität, was auf die Abwesenheit von α-1,4- Fucosyltransferaseaktivität in diesem Serum schließen läßt.

α-1,3-Fucosyltransferase der löslichen Eierstocktumorfraktion

Wenn die α-1,3-Fucosyltransferaseaktivität des teilweise gereinigten Enzympräparates aus dem löslichen Teil von Eierstocktumor gemessen und mit der Aktivität anderer Akzeptoren verglichen wurde, erhielt man die folgenden Ergebnisse. 2'-Methyl-LacNAc, LacNAc und Gaβ1, 3GalcNAc waren jeweils 100,0, 60,6 und 5565,5% aktiv, was die Gegenwart sowohl von α-1,3- als auch α-1,4-Fucosyltransferaseaktivitäten in diesem Präparat zeigt. Wie zu folgern, waren die β-Benzylglycoside der obigen Akzeptoren aktiver als die entsprechende Ausgangsverbindung. Insbesondere war das β-Benzylglycosid von Gaβ1, 3GlcNAc etwa zweimal so aktiv wie Gaβ1, 3GlcNAc (1004,5 bzw. 565,5%). Im Gegensatz zu dem Serumenzym, welches eine über zweifache Steigerung der Aktivität mit β- Benzylglycosid von 2'-Methyl-LacNAc (307,9% aktiv) zeigte, wurde nur eine kleine Steigerung mit dem Enzym der löslichen Tumorfraktion (113,2%) zu sehen, 2'-Fucosyl-LacNAc und sein β-Benzylglucosid waren 436,1 bzw. 373,0% aktiv, während 3-Fucosyl-LacNAc fast inaktiv (nur 1,9% aktiv) war, was die Überführung von Fuc auf C-3 von GlcNAc zeigt.
Unter den sulfatierten Derivaten von LacNAc war 3'-Sulfo-LacNAc der aktivste Akzeptor (447,1%) gefolgt von 6-Sulfo-LacNAc (272,6%) und 2'-Sulfo-LacNAc (32,7%). 6'- Sulfo-LacNAc war der am wenigsten aktive Akzeptor (5,3%). Sowohl 3'-Sulfo- als auch 6- Sulfo-LacNAc zeigten größere Aktivität mit dem Tumorenzym im Vergleich zu dem Serumenzym (447,1 bzw. 272,6% verglichen mit 340,8 bzw. 172,4%). Wie mit dem Serumenzym beobachtet, war das β-Benzylglycosid von 3'-Sulfo-LacNAc weniger aktiv als die Ausgangsverbindung gegenüber dem löslichen Tumorenzym. Der Akzeptor 3-Sulfo-Gaβ1, 3GlcNAcβ-O-Bn war stark aktiv (415,4%), wie zu erwarten war, da dieses Präparat α-1,4- Fucosyltransferaseaktivität enthielt, wie oben angegeben, wenn die Akzeptoren Gaβ1, 3GlcNAc und sein β-Benzylglycosid verwendet wurden.

Mit der feinteiligen Fraktion des Eierstocktumors verbundene α-1,3-L-Fucosyltransferase (siehe Tabelle V):

Das feinteilige Enzym war weniger aktiv mit LacNAc (61,8%) und Gaβ1, 3GglcNAc (34,2%), was anzeigt, daß in dieser Fraktion die Hauptfucosyltransferase als α-1,3 (> 60 5) vorliegt. Dieses Ergebnis ist recht verschieden von dem, was wir mit der löslichen Fraktion fanden, wo α-1,4-Fucosyltransferaseaktivität größer als α-1,3-Fucosyltransferaseaktivität zu sein scheint. Im Gegensatz zu dem Enzym der löslichen Fraktion, welches 436,1% Aktivität mit 2'-Fucosyl-LacNAc zeigte, war das feinteilige Enzym nur 144,7% aktiv, was den Unterschied in der katalytischen Fähigkeit der obigen Enzyme erläutert. Die unterschiedliche Natur der obigen Enzyme wurde weiter klar, wenn sulfatierte Derivate von LacNAc als Akzeptoren getestet wurden. Wenn sich 3'-Sulfo-LacNAc als ein stark aktiver Akzeptor mit den Enzymen der löslichen Fraktion (447,1%) sowie dem Serum (340,8%) erwies, zeigte das feinteilige Enzym nur 39% Aktivität. Wie mit anderen Enzymquellen war das β-Benzylglycosid von 3'-Sulfo-LacNAc weniger aktiv (33,3%) als die Ausgangsverbindung mit dem feinteiligen Enzym. Selbst die anderen sulfatierten Derivate zeigten Unterschiede in ihrer Affinität gegenüber diesen Enzymen aus dem Tumor. Wenn 3'-Sulfo-LacNAc der aktivste sulfatierte Akzeptor mit dem Enzym der löslichen Fraktion war, waren 6'-Sulfo- und 6-Sulfo-LacNAc aktiver (42,6 und 53,3%) als 3'-Sulfo-LacNAc (39,0%), und 2'-Sulfo-LacNAc war mit dem feinteiligen Enzym am geringsten aktiv (9,8%). Das feinteilige Enzym zeigte sehr niedrige Aktivität (2,9%) mit 3-Sulfo-Galβ1, 3GlcNAcβ-O-Bn im Gegensatz zu der löslichen Fraktion, was anzeigt, daß in dem feinteiligen Extrakt α-1,4-Fucosyltransferaseaktivität fast fehlt.
Die obigen Beispiele demonstrieren, daß 3'-Sulfo-LacNAc die α-1,3-L- Fucosyltransferase der feinteiligen Fraktion des Eierstocktumors von jener der löslichen Fraktion unterscheiden kann. Diese Enzyme zeigen einen extremen Unterschied der Aktivitäten gegenüber diesem Substrat im Vergleich zu 2'-Methyl-LacNAc. 3'-Sulfo-LacNAc war 447 bzw. 39% aktiv mit löslichen und feinteiligen Fraktionen des Eierstocktumors. In dieser Hinsicht ähnelte das Serumenzym der löslichen Tumorfraktion (340% aktiv mit 3'-Sulfo- LacNAc).
Die Verbindungen der Erfindung haben auch biologische Aktivität in bezug auf Proteine, welche α-1,3-L-Fucosyltransferase ähneln, wenigstens insoweit als solche Verbindungen der Erfindung beide binden.
Um eine solche Aktivität zu zeigen, wurde Natrium-3'-O-sulfo-N-acetyllactosamin-β1- OH(SE-3Galβ1-4 GlcNAcβ1) hinsichtlich der Hemmung von HIV-Virus getestet.
Die Fähigkeit der Verbindung, die Replikation von HIV in Gewebekultur zu hemmen, wurde nach der Methode von Pauwels et al. (J. Virol. 16, Seiten 171 bis 185, 1987) gemessen. Die Verbindung wurde in Medien verdünnt und zu MT-4-Zellen zusammen mit etwa zehn infektiösen Dosen des MN-Stammes von HIV-1 zugegeben. Anteile von Gewebekulturflüssigkeit wurden aus der Reaktion entfernt, und die in der Kultur auftretende HIV- Replikation wurde durch die Messung von P24-Antigen durch Enzymimmunoassay (Coulter) überwacht. Eine prozentuale Hemmung wurde durch Vergleich mit der Konzentration von P24-Antigen berechnet, welche in HIV-infizierten Zellen gemessen wurde, denen keine Verbindung zugesetzt worden war. Die Mindesthemmkonzentration (MIC&sub5;&sub0;) ergibt die interpolierte Verbindungskonzentration wieder, welche zu 50%iger Hemmung in den Tagen 8 und 10 führte, welche auf die Infektion der Zellen folgten. Tabelle I Vorgeschlagenes ¹³C-NMR und m/za
a Alle Verbindungen ergaben zufriedenstellende Elementaranalyse Tabelle II Teilreinigung von α-1,3-L-Fucosyltransferase aus der löslichen Fraktion von menschlichem Eierstocktumor Tabelle III Die Akzeptorfähigkeit von 3'-Sulfo-LacNAc in Gegenwart des kompetitiven Substrates 2'-Methyl-LacNAc und umgekehrt mit Eierstockkrebsserum als die Quelle von α-1,3-L- Fucosyltransferase
* Es gab keine Hemmung durch 2'-Methyl-LacNAc, wenn 3'-Sulfo-LacNAc in einer Konzentration von 3,0 mM vorlag. Der für 2'-Methyl-LacNAc in Gegenwart von 0,3 mM 3'-Sulfo-LacNAc berechnete Km-Wert war 6,67 mM und jener für 3'-Sulfo- LacNAc in Gegenwart von 3,0 mM 2'-Methyl-LacNAc war 0,12 mM Tabelle IV Brauchbarkeit von 3'-Sulfo-LacNAc als ein hochempfindlicher Akzeptor für die Ermittlung von Serum-α-1,3-L-Fucosyltransferase Einarbeitung von [¹&sup4;C]-Fucose (CPM) in den Akzeptor (0,30 mM)
Die Werte in Klammern sind der Prozentsatz des Verhältnisses zwischen dem für Krebsserum und für normales Serum erhaltenen CPM. Tabelle V Differenzierung der bestimmten Spezifizierungen von Eierstockkrebs-α-1,3-L-Fucosyltransferasen in den feinteiligen und löslichen Fraktionen unter Verwendung synthetischer Substrate Quelle von α-1,3-L-Fucosyltransferase

Claims

1. Oligosaccharid der Formeln:

Formel I

oder Formel II

worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Ester, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind und wobei R&sub7; kein Oligosaccharid ist, wenn das Oligosaccharid der Formel I entspricht.

2. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub5; oder R&sub7; ein Monosaccharid ist, das aus der Gruppe Glukose, Fruktose, Aldose, Mannose, Ribose und Galaktose ausgewählt ist.

3. Oligosaccharid der Formel I nach Anspruch 1, worin R&sub1; Na&spplus;&supmin;O&sub3;SO- ist, R&sub2; -OH ist, R&sub3; -OH ist, R&sub5; N-Acetylamino ist, R&sub6; -OH ist, R&sub7; -OH, Nitrophenyl oder Benzyl ist und R&sub8; -OH ist.

4. Oligosaccharid der Formel II nach Anspruch 1, worin R&sub1; Na&spplus;&supmin;O&sub3;SO- ist, R&sub2; -OH ist, R&sub4; -OH ist, R&sub5; N-Acetylamino ist, R&sub6; -OH ist, R&sub7; -OH, Nitrophenyl oder Benzyl ist und R&sub8; -OH ist.

5. Oligosaccharid der Formel I nach Anspruch 1, worin R&sub1; -OH ist, R&sub2; Na&spplus;&supmin;O&sub3;SO- ist, R&sub3; -OH ist, R&sub5; N-Acetylamino ist, R&sub6; -OH ist, R&sub7; -OH, Nitrophenyl oder Benzyl ist und R&sub8; -OH ist.

6. Oligosaccharid der Formel II nach Anspruch 1, worin R&sub1; -OH ist, R&sub2; Na&spplus;&supmin;O&sub3;SO- ist, R&sub4; -OH ist, R&sub5; N-Acetylamino ist, R&sub6; -OH ist, R&sub7; -OH, Nitrophenyl oder Benzyl ist und R&sub8; -OH ist.

7. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub1; eine Sulfatgruppe ist.

8. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub2; eine Sulfatgruppe ist.

9. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub5; N-Acetylamino ist.

10. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub7; -OR&sub9; ist, worin R&sub9; para-Nitrophenyl ist.

11. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub7; -OR&sub9; ist, worin R&sub9; Benzyl ist.

12. Oligosaccharid nach Anspruch 1, worin R&sub7;-OR&sub9; ist, worin R&sub9; para-Nitrobenzyl ist.

13. Verfahren zum Analysieren des Vorhandenseins von 1,3-L-Fucosyltransferaseenzym, bei dem man eine Fucosyltransferase enthaltende Probe mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in Berührung bringt.

14. Verfahren zur Hemmung der biologischen Aktivität von 1,3-L-Fucosyltransferase in vitro, indem man die 1,3-L-Fucosyltransferase an eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bindet.

15. Verfahren zur Hemmung der Replikation von HIV-Virus in vitro, indem man das Virus einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 aussetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem man das Virus einer Verbindung nach Anspruch 3 aussetzt.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfaßt.

18. Verfahren zum Analysieren des Vorhandenseins von 1,3-L-Fucosyltransferaseenzym, bei dem man eine Fucosyltransferase enthaltende Probe mit einer Oligosaccharidverbindung der Formeln:

Formel I

oder Formel II

in Berührung bringt, worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Esther, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind.

19. Verfahren zur Hemmung der biologischen Aktivität von 1,3-L-Fucosyltransferase in vitro, bei dem man die 1,3-L-Fucosyltransferase an eine Oligosaccharidverbindung der Formeln Formel I

oder Formel II

bindet, worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Esther, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind.

20. Verfahren zur Hemmung der Replikation von HIV-Virus in vitro, bei dem man das Virus einer Oligosaccharidverbindung der Formeln

Formel I

oder Formel II

aussetzt, worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Esther, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind.

21. Verwendung einer Oligosaccharidverbindung der Formeln

Formel I

oder Formel II

worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, Toxinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Esther, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der biologischen Aktivität von 1,3-L-Fucosyltransferase, um die von einer 1,3-L-Fucosyltransferaseerhöhung im Serum begleiteten massiven Tumore zu verlangsamen oder zu stoppen.

22. Verwendung einer Oligosaccharidverbindung der Formeln:

Formel I

oder Formel II

worin wenigstens eine der Gruppen R&sub1; und R&sub2; Sulfat oder Phosphat ist und die restlichen Gruppen R unter -OH, -OR&sub9; oder -R&sub1;&sub0; ausgewählt sind, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus niedermolekularem Alkyl, niedermolekularem Alkenyl, Allyl, Phenyl, Benzyl, Monosacchariden, Oligosacchariden, To xinen, Antikörpern, Enzymen, Aminosäuren und Aminosäureketten besteht, und worin R&sub1;&sub0; weiterhin ein Esther, Ether, Amino oder Fluor sein kann, wobei wenigstens drei der restlichen Gruppen R -OH sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Replikation von HIV-Virus.