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DE69327214T3 - Zusammensetzung, die sowohl eine lösliche als auch eine unlösliche Form eines Immunogens beinhaltet - Google Patents

Zusammensetzung, die sowohl eine lösliche als auch eine unlösliche Form eines Immunogens beinhaltet Download PDF

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DE69327214T3
DE69327214T3 DE69327214T DE69327214T DE69327214T3 DE 69327214 T3 DE69327214 T3 DE 69327214T3 DE 69327214 T DE69327214 T DE 69327214T DE 69327214 T DE69327214 T DE 69327214T DE 69327214 T3 DE69327214 T3 DE 69327214T3
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Karen South Sterling Biscardi
Laura Bethlehem Ferguson
Lorne Stroudsberg Erdile
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Connaught Laboratories Ltd
Connaught Laboratories Inc
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Impfung und insbesondere die Formulierung von Impfstoffen, um eine verstärkte Immunantwort gegen ein Antigen zu erhalten. Die Erfindung betrifft auch die Erzeugung von Antikörpern in Tieren zur Verwendung in der experimentellen, diagnostischen und therapeutischen Arbeit.
  • Impfung ist ein Verfahren, womit eine Immunantwort gegen ein Antigen erhalten werden kann, um einen Wirt vor Infektion zu schützen. Einige Antigene rufen eine starke Immunantwort und einige eine schwache Antwort hervor. Versuche wurden unternommen, um die Immunantwort schwach immunogener Substanzen zu verstärken. Der Einsatz bestimmter chemischer Adjuvantien in Tieren resultierte in einer Verstärkung der Immunantwort. Die meisten der eingesetzten Adjuvantien besitzen jedoch den Nachteil, daß sie toxisch sind und deshalb nicht in Menschen eingesetzt werden können.
  • Ein anderer Weg, Verstärkung zu erreichen, ist die Konjugation einer schwach immunogenen Substanz mit einer stark immunogenen Substanz und die Verabreichung des resultierenden Konjugats in einem Impfstoff. Zum Beispiel können ein Konjugat des kapsulären Polysaccharids von Haemophilus influenzae Typ b mit Diphterietoxoid, wie in den U.S. Patenten Nr. 4,496,538 und 4,619,828 beschrieben, oder ein Konjugat eines schwachen Antigens mit einem monoclonalen Antikörper, der gegen Antigen-präsentierende Zellen gerichtet ist, wie in U.S. Patent Nr. 4,950,480 beschrieben, verwendet werden.
  • WO92/13002 offenbart die Verwendung von zwei verschiedenen Formen von Influenzavirus, um einen synergistischen Effekt in einem Impfstoff zu erhalten, umfassend die Verwendung eines vollständigen inaktivierten Virus und eines löslichen Proteins M.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Antigen in einem Tier bereit, umfassend eine erste physiochemische Form des Antigens, die die Präsentation des Antigens durch B-Zellen gegenüber T-Zellen in dem Tier begünstigt, und eine zweite physiochemische Form des Antigens, die die Präsentation des Antigens durch Hilfszellen gegenüber T-Zellen in dem Tier begünstigt, dadurch gekennzeichnet, daß die erste physiochemische Form eine lösliche Form des Antigens und die zweite physiochemische Form eine unlösliche Form des Antigens ist, und dadurch gekennzeichnet, dass eine physiochemische Form des Antigens Lipide enthält und die andere physiochemische Form keine Lipide enthält.
  • Die zwei verschiedenen physiochemischen Formen desselben Antigens werden gleichzeitig einem naiven Tier verabreicht, um den höchsten Grad der Verstärkung zu erreichen.
  • Um die verstärkte Immunantwort zu erhalten, ist es notwendig, daß das Tier, dem das Antigen co-verabreicht wurde, einschließlich Menschen, naiv ist, d. h. daß das Tier nicht früher mit einer hoch-immunogenen Form des Antigens immunisiert wurde. Co-Verabreichung des Antigens an ein präimmunisiertes Tier ruft keine Verstärkung der Immunantwort hervor.
  • Während der Anmelder nicht wünscht, an irgendeine spezifische Theorie gebunden zu sein, um zu erklären, warum die vorliegende Erfindung wirksam ist, die Verstärkung einer antigenen Antwort durch die gleichzeitige Verabreichung von wenigstens zwei verschiedenen physiochemischen Formen des Antigens zu erreichen, kann die folgende theoretische Erklärung gemacht werden.
  • B-Zellen und Hilfszellen können Vorlieben für verschiedene physiochemische Formen von Antigenen haben. Es ist bekannt, daß sowohl B-Zellen als auch Hilfszellen Antigene gegenüber T-Zellen präsentieren müssen, um eine Antikörperantwort auf das Antigen in naiven Tieren zu initiieren (Dok. 1, 2, 3, 4 und 5). Diese Vorlieben können daraus folgen, daß B-Zellen und Hilfszellen verschiedene Mechanismen zur Internalisierung von Antigenen benützen.
  • B-Zellen internalisieren Antigene mittels spezifischer Bindung an ihre Zelloberflächen-Immunglobuline (Dok. 6, 7) und können lösliche Antigene in so niedrigen Konzentrationen wie 1 ng/ml präsentieren (Dok. 8). Hilfszellen andererseits, die Makrophagen und dendritische Zellen sind, internalisieren Antigene durch nicht-spezifische Phagozytose und Pinozytose (Dok. 9). Makrophagen können lösliche Antigene in Konzentrationen von ungefähr 100 μg/ml (Dok. 8) präsentieren. Andere Forschungsarbeiten (Dok. 10) haben gezeigt, daß die von Makrophagen benötigte Konzentration an löslichem Antigen verringert werden kann, indem das Antigen an eine partikuläre Struktur gebunden wird.
  • Während der Erzeugung einer Antikörperantwort präsentieren B-Zellen und Hilfszellen Antigene gegenüber T-Zellen in zwei verschiedenen Stadien der T-Zellaktivierung/differenzierung. Forschungsarbeiten haben gezeigt, daß naive T-Zellen zuerst mit Antigen-präsentierenden Hilfszellen interagieren müssen, um aktivierte Helfer-T-Zellen zu werden (Dok. 11, 12, 13, 14). Die Erfinder glauben, daß partikuläre Formen von Antigenen, die hier angewendet werden können, die Hilfszellaktivierung von naiven T-Zellen wirksam vermitteln. Diese Wechselwirkung reicht jedoch nicht aus, die B-Zellen zu veranlassen, auf ein T-Zell-abhängiges Antigen zu antworten. Direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen B-Zellen und aktivierten Helfer-T-Zellen ist für die Auslösung der Antikörpersekretion von B-Zellen erforderlich (Dok. 15). Diese Wechselwirkung wird von B-Zellen, die das Antigen prozessieren und einer aktivierten T-Zelle präsentieren, vermittelt (Dok. 16). Diese Art von B-Zell-T-Zell-Wechselwirkung wird als verwandte T-Zellhilfe bezeichnet. Die Erfinder glauben, daß eine lösliche Form des Antigens, die hier angewendet werden kann, die Wechselwirkung von B-Zellen mit Helfer-T-Zellen am besten vermittelt.
  • Die Forderung, die zwei physiochemischen Formen des Antigens gleichzeitig an derselben Injektionsstelle zu verabreichen, könnte einen gewissen Zusammenhang haben mit dem Befund, daß die Reihenfolge der zwei Wechselwirkungen wichtig ist, um die erforderliche Immunantwort in naiven T-Zellen hervorzurufen. Vor kurzem wurde gezeigt, daß die Antigenpräsentation von B-Zellen gegenüber T-Zellen eher T-Zelltoleranz als Aktivierung auslöst (Dok. 2, 3). Eine optimale Immunantwort scheint die Antigenpräsentation sowohl durch B-Zellen als auch durch Hilfszellen zu erfordern.
  • Eine physiochemische Form des Antigens ist löslich und die andere physiochemische Form des Antigens ist unlöslich, z. B. das Haemagglutininantigen (HA) des Influenzavirus.
  • Eine physiochemische Form des Antigens kann ein Protein sein, das Lipide enthält, in dem Fall ist die andere physiochemische Form ein Protein, das keine Lipide enthält, z. B. das OspA-Antigen.
  • Eine physiochemische Form kann ein Protein sein mit einem hydrophoben Bereich, in dem Fall ist die andere physiochemische Form ein Protein ohne einen hydrophoben Bereich.
  • Mindestens eine der physiochemischen Formen des Proteinantigens kann verändert worden sein, z. B. durch Gentechnik oder durch chemische Synthese, um es mit gewünschten Epitopen oder Bereichen zu versehen, oder um gewünschte Epitope oder Bereiche zu entfernen.
  • Das Antigen kann schützende Epitope enthalten, die zur Folge haben, daß das Antigen nur eine schwache Immunantwort hervorruft.
  • Das Antigen kann ein Protein aus Viren, Bakterien, Pilzen, Protozooen oder Parasiten sein.
  • Das Antigen kann das Haemagglutininantigen (HA) des Influenzavirus oder andere virale Proteine, die mit viralen Membranen assoziiert sind, sein.
  • Das Antigen kann das Zelloberflächenprotein A (OspA) des Spirochaeten B. burgdorferi (d. h. ein bakterielles Protein) sein. Lipide enthaltendes OspA ist ein starkes Immunogen und daher ist die Co-Verabreichung mit anderen Formen von OspA in der Regel nicht erforderlich. Die vorgestellten Ergebnisse deuten jedoch die allgemeine Anwendbarkeit des Verfahrens an.
  • Die zweite Form des Antigens kann von der ersten durch Reinigung und/oder Modifikation hergeleitet sein.
  • Die verschiedenen physiochemischen Formen des Antigens für die Co-Verabreichung können stark variieren, abhängig von dem gewählten Antigen und den spezifischen antigenen Formen des Antigens, die verfügbar sein könnten. Bevorzugt werden jedoch die zwei Formen für die Bereitstellung zur Antigenpräsentation sowohl durch B-Zellen als auch durch Hilfszellen gegenüber T-Zellen zurechtgeschnitten, um eine Antikörperantwort auszulösen.
  • Die Erfindung wird jetzt mittels nachstehender Beispiele 1 bis 4 beschrieben werden und in Bezugnahme auf die 1 bis 9, in denen:
  • 1 und 2 Säulendiagramme sind, die die Haemagglutininhemmungstiter (HAI) darstellen, die von verschiedenen Formen des HA-Antigens in naiven Meerschweinchen erreicht wurden, wie nachstehend ausführlich in Beispiel 1 beschrieben;
  • 3 bis 5 Säulendiagramme sind, die IgG-anti-HA-Antworten darstellen, die von verschiedenen Formen des HA-Antigens in Meerschweinchen erreicht wurden, wie nachstehend ausführlich in Beispiel 2 beschrieben;
  • 6 und 7 Säulendiagramme sind, die HAI-Titer darstellen, die von verschiedenen Formen des HA-Antigens in präimmunisierten Meerschweinchen erreicht wurden, wie nachstehend ausführlich in Beispiel 3 beschrieben; und
  • 8 und 9 graphische Darstellungen von Daten der Immunantworten sind, die von verschiedenen Formen von OspA in naiven Mäusen erreicht wurden, wie nachstehend in Beispiel 4 ausführlich beschrieben.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Das Hervorrufen von Immunantworten in Meerschweinchen durch die Co-Verabreichung von verschiedenen physiochemischen Formen des HA des Influenzavirus – Nachweis der Immunantwort durch Haemagglutininhemmung (HAI)
  • Von HA gibt es mehrere verschiedene physiochemische Formen, nämlich HA (p), gespaltenes HA und inaktiviertes vollständiges Virus. HA (p) ist eine hochreine Form von HA, deren hydrophober Schwanz entfernt wurde und die wasserlöslich ist. Gespaltenes HA ist eine Detergenz-extrahierte und teilweise gereinigte Form des HA-Antigens. Inaktiviertes vollständiges Virus besteht aus Formalin-inaktivierten vollständigen Viruspartikeln.
  • Gespaltenes HA und inaktiviertes vollständiges Virus sind in naiven Tieren und Menschen immunogen. HA (p) ist in naiven Tieren oder Kindern nicht immunogen, obwohl es in Antikörper-Antigen-Reaktionen antigen ist.
  • Zwei Experimentreihen wurden durchgeführt, in denen Meerschweinchen mit verschiedenen physiochemischen Formen von HA des A'/Taiwan-Influenzastammes, einzeln oder in Kombination, immunisiert wurden, und ihre Antworten mittels Haemagglutininhemmungs(HAI)titer gemessen wurden, wobei bekannt ist, daß HAI-Titer gut mit schützenden Immunantworten korrelieren. Die in den Experimenten erhaltenen Ergebnisse wurden graphisch dargestellt und sind in 1 und 2 enthalten.
  • In diesen Experimenten wurde die Menge an HA (p) konstant gehalten (1.0 μg) und die Menge an zugegebenem vollständigem inaktiviertem Virus wurde variiert. Von den drei verwendeten Mengen an zugegebenem vollständigem inaktiviertem Virus (1.0 μg, 0.1 μg und 0.01 μg) wurden Immunantworten am besten durch Co-Verabreichung unter Verwendung von 0.1 μg vollständigem inaktiviertem Virus verstärkt, wie in 1 und 2 abgebildet.
  • Bei Vergleich der Titer für diese Kombination mit den Titern für HA (p) oder 0.1 μg vollständigem inaktiviertem Virus allein verstärkte die Co-Verabreichung die Immunantworten vier- bis siebenfach zwei bis vier Wochen nach dem Boost. Bei der höheren Dosis von 1.0 μg an vollständigem inaktiviertem Virus, waren die Immunantworten der Co-Verabreichung identisch zu den Antworten auf das Virus allein, wie ebenfalls in 1 und 2 gezeigt. Bei den niedrigen Dosen von 0.01 μg an vollständigem inaktiviertem Virus war die Immunantwort sowohl der Co-Verabreichung als auch des vollständigen inaktivierten Virus allein niedrig (siehe 2). Da HAI-Titer gut mit schützenden Immunantworten korrelieren, legen diese Ergebnisse nahe, daß die Co-Verabreichung schützende Immunantworten in Meerschweinchen verstärkt.
  • Die Co-Verabreichung von gespaltenem HA und HA (p) verstärkt auch anti-HA-Antikörper-Antworten in Meerschweinchen. Maximale Verstärkung durch Co-Verabreichung wurde mit 0.1 μg von HA (p) und 0.1 μg von gespaltenem HA beobachtet, wie in den Ergebnissen der 1 und 4 abgebildet. Eine drei- bis siebenfache Verstärkung der HAI-Titer wurde mit diesen Mengen des Antigens beobachtet.
  • Beispiel 2: Hervorrufen von Immunantworten wie in Beispiel 1 – Nachweis und Quantifizierung mittels Enzym-gekoppeltem immun-absorbierendem Test (ELISA)
  • Die Antikörperantworten von Beispiel 1 wurden auch mittels EIA (ELISA-Immuntest) analysiert, um zu bestimmen, ob die Verstärkung der HAI-Titer durch Co-Verabreichung mit der Gesamtmenge an erzeugtem IgG-anti-HA-Antikörper zusammenhing. In diesen Experimenten wurde HA-e (eine hochreine Form von HA, die ihren hydrophoben Schwanz behält) zur Beschichtung der Vertiefungen der EIA-Platte verwendet und anti-Meerschweinchen-IgG wurde als ein Nachweis-Antikörper verwendet.
  • Die Verdünnungskurven der experimentellen Antiseren wurden mit der Verdünnungskurve eines Standard-Meerschweinchen-Antiserums verglichen, und auf der Basis dieses Vergleichs wurden die Einheiten von IgG-anti-HA in jedem Serum berechnet.
  • Bei Verwendung derselben Meerschweinchen-Sera wurde eine gute Korrelation gefunden, wenn die Ergebnisse des EIA, wie in 3 gezeigt, mit den Ergebnissen des HAI, wie in 2 gezeigt, verglichen wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Co-Verabreichung des HA in verschiedenen Formen die Gesamtmenge an gegen HA erzeugtem IgG verstärkt.
  • Die Ergebnisse des EIA von Seren aus einem Experiment mit gespaltenem HA, wie in 5 gezeigt, deuten an, daß die erhöhten HAI-Titer der Co-Verabreichung das Ergebnis erhöhter Mengen an anti-HA-Antikörpern waren. Aus den in den Beispielen 1 und 2 dargelegten Ergebnissen ist offensichtlich, daß die Level der nach Co-Verabreichung mit gespaltenem HA erzeugten Antikörper allgemein geringer waren als die nach Co-Verabreichung mit vollständigem inaktiviertem Virus, wie in 1 und bei Vergleich der 2 und 4 und 3 und 5 zu sehen.
  • In den in den Beispielen 1 und 2 dargestellten Experimenten wurden naive Tiere zur Bewertung der Co-Verabreichung verwendet.
  • Beispiel 3: Der Effekt der Co-Verabreichung verschiedener Formen von HA in präimmunisierten Tieren
  • Meerschweinchen wurden entweder mit 1.0 μg vollständigem inaktiviertem Virus (Ergebnisse dargestellt in 6) oder 1.0 μg gespaltenem HA (Ergebnisse dargestellt in 7) präimmunisiert. Drei Wochen später wurden die Meerschweinchen entweder mit einzelnem Flu-Antigen oder co-verabreichtem Flu-Antigenen zum zweiten Mal immunisiert. Die in den 6 und 7 dargestellten Ergebnisse deuten an, daß die Co-Verabreichung die anti-HA-Ergebnisse in präimmunisierten Tieren nicht verstärkt, und daß die Co-Verabreichungstechnik daher nur in naiven Tieren brauchbar ist, wenn eine verstärkte Immunantwort erhalten werden soll.
  • Diese Ergebnisse zeigen auch, daß das bessere Antigen für wachrufende Gedächtnisantworten HA (p) allein war, während die Immunisierung mit HA (p) nach der primären und sekundären Immunisierung keine signifikante Immunantwort erzeugte. Diese Ergebnisse zeigen, daß HA (p) Gedächtnisantworten gegen das HA-Antigen wachrufen, aber seinerseits kein Gedächtnis erzeugen kann.
  • Beispiel 4: Das Hervorrufen von Immunreaktionen in Mäusen durch verschiedene physiochemische Formen des OspA-Proteins des Spirochaeten B. burgdorferi
  • OspA-Lipoprotein (OspA-L) ist ein sehr wirksames Immunogen. Die Entfernung des Lipidteils von OspA verringert seine Immunogenität dramatisch, aber nicht seine Antigenität, wie in WO 93/08299 beschrieben.
  • Eine kleine Dosis OspA-L wurde C3H/He-Mäusen mit einer großen Dosis OspA-NL co-verabreicht und die Antwort mit den Antworten von OspA-L und OspA-NL allein verglichen. Die Mäuse wurden am Tag 0 oder 21 mit den Antigenen immunisiert und ihnen wurde am Tag 35 Blut abgenommen. Die Verdünnungskurven eines ELISA-Tests von Seren der Mäuse wurden graphisch dargestellt und die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Immunantworten werden auch in 9 gezeigt. Die Daten zeigen eine Verstärkung der OspA-Antwort durch Co-Verabreichung von OspA-L und OspA-NL verglichen mit der Verabreichung von OspA-L und OspA-NL allein.
  • Während die Erfindung insbesondere mit den vorstehenden Beispielen 1 und 2 beschrieben wurde, sind viele Variationen und Modifikationen davon möglich innerhalb des Umfangs der Erfindung, wie in den angehängten Patentansprüchen definiert.
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    • 12. „Restricted Helper function of F. Hybrid T Cells Positively Selected to Heterologous Erythrocytes in Irradiated Parental Strain Mice. I", Sprent, J. Exp. Med., 1978, Bd. 147, S. 1142–1158.
    • 13. „Restricted Helper function of F. Hybrid T Cells Positively Selected to Heterologous Erythrocytes in Irradiated Parental Strain Mice. II", Sprent, J. Exp. Med., 1978, Bd. 147, S. 1159–1174.
    • 14. „The Role of H-2-Linked Genes in Helper T-Cell Function", Swierkosz et al., J. Exp. Med., 1978, Bd. 147, S. 554–570.
    • 15. „Role of the Major Histocompatibility Complex in T Cell Activation of B Cell Subpopulations", Singer et al., J. Exp. Med., 1981, Bd. 154, S. 501–516.
    • 16. „Antigen-specific Interaction between T and B Cells", Lanzavecchia, Nature, Bd. 314, April 1985, S. 537–539.

Claims (4)

  1. Zusammensetzung zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Antigen in einem Tier, umfassend eine erste physiochemische Form des Antigens, die die Präsentation des Antigens durch B-Zellen gegenüber T-Zellen in dem Tier begünstigt, und eine zweite physiochemische Form des Antigens, die die Präsentation des Antigens durch Hilfszellen gegenüber T-Zellen in dem Tier begünstigt, dadurch gekennzeichnet, dass die erste physiochemische Form eine lösliche Form des Antigens und die zweite physiochemische Form eine unlösliche Form des Antigens ist und dadurch gekennzeichnet, dass eine physiochemische Form des Antigens Lipide enthält und die andere physiochemische Form keine Lipide enthält.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen das Haemagglutininantigen (HA) des Influenzavirus oder das OspA-Protein ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen HA ist und die unterschiedlichen physiochemischen Formen des Antigens das vollständige inaktivierte Virus und HA(p) umfassen, oder dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen OspA von B. burgdorferi ist und die unterschiedlichen physiochemischen Formen des Antigens OspA-L und OspA-NL umfassen.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung mit einem physiologisch verträglichen Träger zu einem Impfstoff formuliert ist.
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