DE69325794T2

DE69325794T2 - Humanes serum albumin, herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69325794T2
Application number: DE69325794T
Authority: DE
Inventors: Jerome Becquart; Reinhard Fleer; Gerard 12 Jung
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1992-01-27
Filing date: 1993-01-26
Publication date: 2000-01-13
Anticipated expiration: 2013-01-27
Also published as: GR3030873T3; FI943512A; NO310418B1; FR2686620A1; FI943512A0; HU9401960D0; CA2126356C; EP0625202A1; HUT70570A; DE69325794D1; HU218353B; JPH07503137A; US5612196A; EP0625202B1; ES2137251T3; AU3503893A; NO942780L; NZ249153A; FR2686620B1; JP3390990B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Humanserumalbuminpräparat, ein Verfahren zu dessen Erhalt und dessen Verwendungen.
Humanserumalbumin (HSA) ist ein monomeres nichtglykosiliertes Protein mit 585 Aminosäuren, einem Molekulargewicht von 66 KD. Dessen globuläre Struktur wird durch 17 Disulfidbrücken aufrechterhalten, die eine aufeinanderfolgende Reihe von 9 Doppelschleifen erzeugen (Brown, J. R., Albumin Structure, Function and Uses, Rosenoer, V. M. et al., (Hrsg.), Pergamon Press, Oxford, (1977) 27-51). Die Gene, die HSA codieren, sind bekanntlich in hohem Maße polymorph und mehr als 30 genetische Varianten, die offensichtlich verschieden sind, wurden durch elektrophoretische Analyse unter variierenden Bedingungen ausfindig gemacht (Weitkamp, L. R. et al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973), 219-226). Das HSA-Gen ist durch 14 Intronsequenzen in 15 Exons gespalten und umfaßt 961 Nukleotide, eine Capping- Stelle, die an der ersten Additionsstelle von poly(A) vermutet wird.
Das Humanalbumin wird in den Hepatozyten der Leber synthetisiert, dann in den Blutfluß sezerniert. Diese Synthese führt zuerst zu einem Vorläufer, dem Präpro-HSA, der eine Signalsequenz von 18 Aminosäuren enthält, die das entstehende Polypeptid in den Sekretionsweg steuert.
Das HSA ist das am reichlichsten vorkommende Blutprotein mit einer Konzentration von etwa 40 g pro Liter Serum. So gibt es etwa 160 g zirkulierendes Albumin gegenwärtig im menschlichen Körper. Die wichtigste Rolle von HSA ist die Aufrechterhaltung einer normalen Osmolarität des Blutflus ses. Es besitzt auch eine außergewöhnliche Bindungskapazität für verschiedene Substanzen und spielt auch beim endogenen Transport von hydrophoben Molekülen (wie den Steroiden und den Gallensalzen) sowie dem von verschiedenen therapeutischen Substanzen, die so an ihre jeweiligen Wirkorte transportiert werden können, eine Rolle. Außerdem war HSA jüngst am Prostaglandinkatabolismus beteiligt.
HSA macht 40% des Weltmarkts der Plasmaproteine aus. Dessen kommerzielles Interesse liegt in der Tatsache, daß dieses Produkt vielfach verwendet wird, beispielsweise in den sogenannten Auffüllungsflüssigkeiten zur Kompensation von Blutverlusten während chirurgischer Eingriffe, Unfällle oder Hämorragien und wobei die Dosierungen mehrere zehn Gramm pro Tag und pro Individuum erreichen können. Gegenwärtig kann der jährliche Verbrauch von HSA auf mehr als 300 Tonnen geschätzt werden.
Bis gegenwärtig wird das auf dem Markt verfügbare HSA durch Reinigung aus biologischem Material menschlichen Ursprungs produziert. Insbesondere wird es durch die klassischen Techniken der Fraktionierung von Plasma aus Blutproben (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946), S. 459) oder durch Extraktion aus menschlicher Plazenta gemäß der von J. Liautaud et al. (13. Interanationaler IABS-Kongreß, Budapest, A: Purification of proteins. Development of biological standard, Karger (Hrsg.), Bale, 27 (1973), S. 107) beschriebenen Technik erhalten.
Die Entwicklung der Gentechnik und neuer Techniken zur Extraktion und Reinigung eröffnete die Möglichkeit, verbesserte Produkte mit viel höherer Reinheit, besserer Stabilität und ohne Risiko einer viralen Kontamination (beispielsweise Hepatitis B und AIDS) zu einem viel geringeren Kostenpreis zu erhalten. Angesichts der Bedeutung des HSA- Markts wurde die Möglichkeit, dieses Protein auf rekombinantem Weg zu produzieren, in großem Umfang untersucht. So wurden zahlreiche Expressionssysteme zur Herstellung von rekombinantem HSA untersucht.
Insbesondere was die bakteriellen Wirte betrifft, wurde bei den ersten gentechnischen Versuchen das Bakterium E. coli als Wirtsorganismus verwendet. Ebenso beschreiben die europäischen Patente EP 236 210, EP 200 590, EP 198 745 oder EP 1 929 Verfahren zur Produktion von HSA in E. coli unter Verwendung verschiedener Expressionsvektoren, verschiedene Transkriptionspromotoren und verschiedene Sekretionssignale. In der Folge wurden Arbeiten, betreffend die Sekretion von HSA in Bacillus subtilis, ebenfalls durchgeführt, selbst wenn die erhaltenen Gehalte an Albumin in diesem System noch nicht zufriedenstellend erscheinen (Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987).
Was die eukaryontischen Wirte betrifft, wurden Verfahren zur Produktion von HSA eingesetzt, bei denen Hefen als Wirtsorganismus verwendet wurde. Ebenso konnte die Sekretion von HSA, die durch sein eigenes Signalpeptid unter der Kontrolle des Gelatinepromotors gesteuert wurde, in S. cerevisiae nachgewiesen werden (Etcheverry et al., Bio/Technology 4 (1986), 726). Die Produktion von HSA wurde auch in Brauereihefe während der Herstellung von Bier unter Verwendung eines postfermentativen Verfahrens erwähnt (EP 201 239) erwähnt. Jüngst beschreibt die EP- Patentanmeldung 361 991 ein besonders leistungsfähiges System, wobei die Hefe Kluyveromvces als Wirtsorganismus verwendet wird, die mit von dem Plasmid pKD1 abgeleiteten Vektoren transformiert wurde. Besonders erhöhte Gehalte an HSA, die in das Kulturmedium sezerniert werden, konnten mit diesem System erhalten werden. Schließlich wurde auch die Produktion von rekombinantem HSA in Pichia pastoris (EP 344 459) beschrieben. Weiterhin ist auch die Reinigung von HSA Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (EP 319 067).
Dennoch ist trotz der großen Bemühungen zum Erhalt von HSA auf rekombinantem Weg dieses Produkt noch nicht auf dem Markt vorhanden. Dies ist mit der Schwierigkeit, ein ausreichend leistungsfähiges Verfahren, basierend auf der Gentechnik, einzusetzen, verbunden, das den Erhalt in industriellem Maßstab und unter ökonomisch rentablen Bedingungen eines HSA erlaubt, das pharmazeutisch einsetzbar ist. Insbesondere, da die Fragen der Produktivität kaum gelöst sind (Produktion von erhöhten Mengen eines sezernierten korrekt gereiften Albumins, das eine Tertiärstruktur besitzt, die der nativen menschlichen Serumalbumins entspricht), erlauben die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nicht den Erhalt eines pharmazeutisch verwertbaren HSA. Es ist in der Tat unverzichtbar, daß das produzierte HSA bestimmten qualitativen Normen entspricht. Insbesondere angesichts seiner pharmazeutischen Verwendung muß rekombinantes HSA die physikalisch-chemischen Eigenschaften von nativem Albumin besitzen und bestimmte Homogenitäts-, Reinheits- und Stabilitätskriterien erfüllen. So legt die Pharmakopoe eine bestimmte Anzahl von Parametern für plasmatische Albuminlösungen fest, nämlich einen pH-Wert, einen Proteingehalt, einen Polymer- und Aggregategehalt, einen Gehalt an alkalischer Phosphatase und eine bestimmte Proteinzusammensetzung. Sie verlangt außerdem eine bestimmte Absorption, die Erfüllung eines Sterilitätstests, eines Pyrogenitätstests und eines Toxizitätstests (vergleiche Albumini humani solution, pharmacopee Europeenne (1984), 255).
Eines der Hauptprobleme der Verfahren aus dem Stand der Technik, die auf gentechnische Techniken zurückgreifen, ist, daß sie ein gefärbtes rekombinantes HSA erzeugen. Dieses Phänomen ist ganz besonders im Falle von Systemen, die die Expression und Sekretion von rekombinantem HSA in dem Kulturmedium erlauben, wichtig. In dieser Hinsicht erläutern die Beispiele B1 und B2 der vorliegenden Anmeldung das Problem der Färbung im Falle eines Expressionssystems, bei dem unter den Bedingungen des Stands der Technik eine Hefe als Wirtsorganismus eingesetzt wird. Das Beispiel B1 ist nicht restriktiv, aber erläutert ein Färbungsphänomen, das für alle getesteten Stämme beobachtet wurde, unabhängig von der angenommenen Fermentationsart (feed-batch, batch, kontinuierlich). Außerdem konnte trotz zahlreicher Bemühungen in dieser Hinsicht diese Färbung niemals durch Reinigung entfernt werden (siehe Beispiel B2). Unter diesen Bedingungen wurde im Stand der Technik nie ein auf rekombinantem Weg produziertes HSA beschrieben, das diese Färbung nicht besitzt. Außerdem stellt die Anwesenheit dieser Färbung ein Hindernis gegenüber der pharmazeutischen Erforschung von rekombinantem HSA dar. In der Tat sind die so erhaltenen Produkte heterogen, da sie die für die Färbung verantwortlichen Komponenten umfassen. Außerdem ist ihre Zusammensetzung undefiniert, da die Färbung von einem Präparat zum anderen variieren kann und da der Stand der Technik nicht die Kontrolle dieser Färbung erlaubt. Unter diesen Bedingungen ist es sehr schwierig, ein reproduzierbares Verfahren zu definieren, das jedesmal den Erhalt von identischen Präparaten von rekombinantem HSA erlaubt. In der Tat, wegen der Anwesenheit der Komponenten, die für die Färbung verantwortlich ist, ist rekombinantes HSA aus dem Stand der Technik potentiell immunogen.
Einer der Gesichtspunkte der Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten HSA-Präparats mit guter Qualität, das die Eigenschaften von Extraktions-HSA besitzt und das auf dem Gebiet der Pharmazie verwendbar ist.
Insbesondere betrifft ein Gesichtspunkt der Erfindung die Bereitstellung eines Präparats von rekombinantem HSA, das nach Reinigung nach bekannten Methoden (Konzentrieren, Fällung, Chromatographie etc.) einen Kolorimetrieindex von weniger als 0,2 besitzt. Erfindungsgemäß wird unter Kolorimetrieindex das Verhältnis der Absorption bei 300 nm zu der Absorption bei 280 nm (i = OD&sub3;&sub0;&sub0;/OD&sub2;&sub8;&sub0;) verstanden.
Dieses Verhältnis charakterisiert besonders gut die Färbung von HSA, da es für eine gegebene Lösung dessen Absorption unabhängig von seiner Konzentration wiedergibt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Erhalt von industriellen Mengen mit ökonomisch rentabler Ausbeute eines rekombinanten HSA-Präparats, das pharmazeutisch verwendbar ist, bereitzustellen.
Die Anmelderin hat nun gezeigt, daß es möglich ist, eine nichtgefärbte HSA-Lösung in industriellen Mengen auf rekombinantem Weg zu erhalten. Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Nachweis, daß die Qualität von produziertem HSA nicht nur mit dem gewählten Wirt oder Vektor oder dem Reinigungsverfahren von HSA aus dem Medium verbunden ist, sondern zu einem großen Teil mit der Zusammensetzung des Produktionsmediums selbst verbunden ist. So können durch Modifikation von insbesondere den Kohlenstoffquellen und den Herstellungsbedingungen des Produktionsmediums Lösungen von rekombinantem HSA erhalten werden, die einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,2 besitzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit zunächst ein Humanserumalbumin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,2 besitzt und daß es das Ergebnis der Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt erstmalig ein rekombinantes HSA bereit, das einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,2 besitzt. Sie liefert auch ein rekombinantes HSA, das auf dem Gebiet der Pharmazie mit sehr geringen Risiken immunogener Reaktionen verwendbar ist. Außerdem besitzt, bezogen auf das plasmatische HSA, das erfindungsgemäße HSA den Vorteil, daß es homogen ist und eine perfekt definierte Zusammensetzung besitzt. In der Tat existieren wegen seines Polymorphismus zahlreiche Varianten von HSA. So be wahren unter denjenigen, die identifiziert wurden, bestimmte Varianten ein substituiertes Pro-Peptid (Brennen und Carrell, Nature 274 (1978), 908; Galliano et al., Rev. Fr. Transfus. Immuno-Hematol 27 (1984), 597), andere besitzen Punktmutationen (Winter et al., Biochemistry 11 (1972) 889; Franklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 2505; Brennan, Biochim. Biophyis. Acta 830 (1985) 320; Galliano et al., Protides Biol. Fluids Proc. Colloq. 34 (1986), 815; Takahashi et la., J. Chromatogr. 359 (1986), 181) oder Deletionen am C-terminalen Ende (Galliano et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 4283). Außerdem gibt es zahlreiche Varianten, deren strukturelle Veränderungen nicht identifiziert wurden. Deshalb umfaßt plasmatisches HSA, das durch Extraktion aus biologischem Material, das von einer sehr großen Anzahl von menschlichen Spendern stammt, erhalten wurde, potentiell alle HSA- Varianten als Ergebnis seines Polymorphismus. Die vorliegende Erfindung stellt ein homogenes und definiertes HSA aufgrund seiner Herstellung auf gentechnischem Weg durch Expression einer oder mehrerer identifizierter DNA- Sequenzen bereit.
Bevorzugt besitzt das erfindungsgemäße HSA einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,15. Noch bevorzugter besitzt das erfindungsgemäße HSA einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,1.
Andere physikalisch-chemische Eigenschaften des erfindungsgemäßen HSA sind in Beispiel B5 angegeben, nämlich insbesondere das Fluoreszensspektrum. Die Gesamtheit dieser Parameter bezeugt die Qualität des erfindungsgemäßen HSA.
Erfindungsgemäß wird unter exogener DNA-Sequenz jede DNA- Sequenz verstanden, die künstlich in den verwendeten Wirt eingebracht wurde und die HSA codiert. Insbesondere kann es sich je nach Wirt um genomische Sequenzen, cDNA, hybri de Sequenzen etc. handeln. Für eine bessere Durchführung der Erfindung wird jedoch die Verwendung einer cDNA bevorzugt. Derartige Sequenzen wurden bereits im Stand der Technik beschrieben (vergleiche insbesondere EP 361 991 und Dugaiczyk et al., J. Supramol. Struct. & Cell Biochem., Erg. 5 (1981)). Außerdem umfaßt diese exogene DNA im allgemeinen eine Transkriptions- und Translationsstartregion in der Nähe des 5'-terminalen Endes der codierenden Sequenz, so daß die Transkription und die Translation der Sequenz gesteuert und reguliert wird. Die Wahl dieser Promotorregionen kann als Funktion des verwendeten Wirts variieren.
Erfindungsgemäß ist die exogene DNA bevorzugt Teil eines Vektors, der sich autonom oder integrativ replizieren kann. Insbesondere können die autonom replizierenden Vektoren unter Verwendung von Sequenzen mit autonomer Replikation bei dem gewählten Wirt hergestellt werden. Als Beispiel kann es sich bei der Hefe um von Plasmiden abgeleitete Replikationsursprünge handeln: pKD1 (EP 241 435), 2 u (Beggs, Nature 275 (1978), 104-109) etc. oder auch um chromosomale Sequenzen (ARS) handeln. Wenn es sich um integrative Vektoren handelt, können diese beispielsweise unter Verwendung von Sequenzen, die bestimmten Regionen des Wirtsgenoms homolog sind, hergestellt werden, die durch homologe Rekombination die Integration des Vektors erlauben. In dieser Hinsicht erlaubt die Verwendung von rDNA eine multiple Integration exogener DNA und somit deren Anwesenheit in viel größerer Kopienzahl pro Zellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße HSA das Ergebnis einer Expression mit einem eukaryontischen oder prokaryontischen Wirt einer exogenen DNA-Sequenz und der Sekretion des Expressionsprodukts der Sequenz in das Kulturmedium. Es ist in der Tat besonders vorteilhaft, auf rekombinantem Weg ein HSA mit pharmazeutischer Qualität direkt in dem Kulturmedium erhalten zu können. In diesem Fall umfaßt die exogene DNA-Sequenz stromaufwärts der Sequenz, die HSA codiert oder gegebenenfalls zwischen der Region des Starts der Transkription und der Translation und der codierenden Sequenz eine Leadersequenz, die das entstehende Protein in die Sekretionswege des verwendeten Wirts steuert. Diese Leader-Sequenz kann eine natürliche Leader-Sequenz von HSA sein, aber es kann sich auch um eine heterologe Sequenz (die aus einem Gen, das ein anderes Protein codiert, hervorgegangen ist) oder auch um eine künstliche Sequenz handeln. Die Wahl einer dieser Sequenzen wird insbesondere durch den verwendeten Wirt gesteuert. Als Beispiel ist es möglich, wenn der verwendete Wirt eine Hefe ist, als heterologe Leader-Sequenz die des Pheromonfaktors α, der Invertase oder der sauren Phosphatase zu verwenden.
Unter den erfindungsgemäßen verwendbaren eukaryontischen Wirten können tierische Zellen, Hefe oder Pilze genannt werden. Insbesondere, wenn es sich um Hefen handelt, können die Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia pastoris, Schwanniomvces oder Hansenula genannt werden. Wenn es sich um tierische Zellen handelt, können die COS-, CHO-, C127-Zellen etc. genannt werden. Unter den Pilzen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können ganz besonders AsperQillus ssp. oder Trichoderma ssp. genannt werden.
Als prokaryontische Wirte werden bevorzugt die folgenden Bakterien E. coli, Bacillus oder Streptomyces verwendet. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HSA mit einem Kolorimetrieindex von kleiner 0,21, gemäß dem die folgenden Stufen durchgeführt werden:
- in einer ersten Stufe wird in eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle eine exogene DNA eingebracht, die Humanserumalbumin unter der Kontrolle der Transkriptions- und Translationssignale, die für den verwendeten Wirt geeignet sind, codiert,
- in einer zweiten Stufe wird die so erhaltene Zelle in einem Medium mit definierter Zusammensetzung, das mindestens eine Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus Alkoholen, nichtreduzierenden Zuckern, organischen Säuren oder am Sauerstoff des Kohlenstoffs C4 substituierte Glucosederivate umfaßt, oder in einem Medium, das so hergestellt wurde, daß es die Bildung von Verunreinigungen vom Aldehydtyp beseitigt oder begrenzt, gezüchtet und
- in einer dritten Stufe wird das so gebildete HSA isoliert.
Insbesondere kann während der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens exogene DNA in die Wirtszelle nach verschiedenen Techniken eingebracht werden. Insbesondere kann die Einbringung durch Transformation, Konjugation oder Elektroporation durchgeführt werden.
Wenn es sich um die Transformation handelt, wurden verschiedene Protokolle im Stand der Technik beschrieben. Insbesondere kann sie durch Behandeln der ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylengylkol nach der von Ito et al. beschriebenen Technik (J. Bacteriol. 153 (1983), 163-168) oder in Gegenwart von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid gemäß der Technik von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990), 7) durchgeführt werden. Ein alternatives Protokoll wurde ebenfalls in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben. Insbesondere kann für die prokaryontischen Zellen die Transformation gemäß der von Dagert et al. (Gene 6 (1979), 23-28) beschriebenen Technik durch Behandeln mit einer CaCl&sub2;-Lösung und anschließend einem thermischen Schock durchgeführt werden. Für tierische Zellen kann sie durch die Technik mit Calciumphosphat gemäß Haynes (Nucleic Acids Res. 11 (1983), 687-706) durchgeführt werden.
Wenn es sich um Elektroporation handelt, kann vorteilhafterweise die von Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985), 90) beschriebene Technik verwendet werden.
Die Wahl der einen oder der anderen dieser Methoden wird insbesondere als Funktion des verwendeten Wirts und der verwendeten exogenen DNA bestimmt.
Unter den bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren eukaryontischen Wirten können tierische Zellen, Hefen oder Pilze genannt werden, die vorstehend erwähnt wurden. Unter den prokaryontischen Wirten kann jedes vorstehend definierte Bakterium verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren unter Verwendung einer eukaryontischen Zelle als Wirtszelle durchgeführt. Noch bevorzugter wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Hefe als Wirtszelle durchgeführt.
Die exogene DNA, die in dem Verfahren verwendbare HSA codiert, ist wie vorstehend definiert. Bevorzugt handelt es sich um eine cDNA, eine genomische DNA oder eine Hybrid- DNA. Zu besseren Durchführung der Erfindung wird jedoch bevorzugt eine cDNA verwendet. Außerdem umfaßt diese exogene DNA im allgemeinen eine Transkriptions- und Translationsstartregion neben dem 5'-terminalen Ende der codierenden Sequenz, so daß die Transkription und die Translation der genannten Sequenz gesteuert und reguliert werden. Die Wahl dieser Region kann als Funktion des verwendeten Wirts variieren.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfaßt die exogene DNA stromaufwärts der Se quenz, die für reife HSA codiert, eine Leader-Sequenz, die das entstehende Protein in die Sekrektionswege des verwendeten Wirts steuert. Derartige Sequenzen wurden vorstehend definiert. Außerdem ist erfindungsgemäß die exogene DNA bevorzugt Teil eines Vektors, der sich autonom oder integrativ replizieren kann, wie vorstehend angegeben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren zur Produktion dadurch gekennzeichnet, daß die HSA in das Kulturmedium sezerniert wird. Es ist in der Tat besonders vorteilhaft, auf rekombinantem Weg eine HSA mit pharmazeutischer Qualität direkt in dem Kulturmedium zu erhalten.
Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die rekombinanten Zellen unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Expression der exogenen DNA- Sequenz, die HSA codiert, erlauben. Diese Stufe ist besonders wichtig, da sie direkt die Quantität und Qualität der produzierten HSA beeinflußt. Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmalig Kulturbedingungen, die die Produktion eines Serumalbumins mit pharmazeutischer Qualität erlauben.
Unter den Alkoholen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, können bevorzugt einfache Alkohole, die mindestens 2 Kohlenstoffatome enthalten (Ethanol etc.), oder Polyalkohole (Glycerin, Sorbit, etc.) genannt werden. Als nichtreduzierende Zucker können beispielsweise Saccharose und als anorganische Säuren die Acetate oder Lactate genannt werden. Die erfindungsgemäß verwendbaren Glucosederivate entsprechen genauer der folgenden Formel:
worin R nicht Wasserstoff ist. Als Beispiel können die Disaccharide und bevorzugt die Disaccharide mit einer Osidbindung vom 1,4-Typ, wie Maltose, Cellobiose oder Lactose genannt werden.
Es ist zu verstehen, daß die Wahl der einen oder mehrerer dieser Verbindungen durch den verwendeten Wirt gesteuert wird. Jedoch ist es auch möglich, einen Wirt zu modifizieren, damit die Assimilation einer bevorzugten Kohlenstoffquelle möglich wird.
Diese verschiedenen Kohlenstoffquellen können separat oder assoziiert verwendet werden. Beispielsweise ergibt die Assoziation eines Glucosederivats und eines Alkohols sehr gute Ergebnisse. Ebenso ergibt auch die Assoziation eines einfachen Alkohols und eines Polyalkohols ein Albumin mit sehr hoher Qualität. Außerdem ist ein überraschendes Ergebnis, daß dieser Typ von Assoziation auch in bestimmten Fällen die Erhöhung der Produktionsgehalte von HSA und somit die Verbesserungen der Ausbeuten des Herstellungsverfahrens erlaubt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in einem Medium durchgeführt werden, das so hergestellt wurde, daß es die Bildung von Verunreinigungen vom Aldehydtyp beseitigt oder beschränkt. Dieser Typ von Präparat ist im allgemeinen nutzlos, wenn in einem Medium mit definierter Zusammensetzung ein oder mehrere der vorstehend angegebenen Kohlenstoffquellen verwendet werden. Verschiedene Mittel können verwendet werden, um die Bildung derartiger Verunreinigungen zu begrenzen, deren Wahl von dem Medium (Natur der Kohlenstoffquelle) und dem in Betracht gezogenen Wirt abhängt. Als Beispiel kann es vorteilhaft sein, die Kohlenstoffquelle in der Kälte zu sterilisieren (beispielsweise durch Filtration, wie in Beispiel B4 erläutert).
Die dritte Stufe der Erfindung erlaubt die Extraktion des produzierten HSA aus dem Kulturmedium. Falls die HSA in das Medium durch die rekombinanten Zellen sezerniert wird, kann diese Extraktion direkt aus dem Kulturüberstand, der durch Zentrifugation erhalten wurde, erfolgen. Falls HSA nicht sezerniert wird, ist es vor der Extraktion notwendig, die Zellen in der Kultur zu zerstören, um das HSA, das sie enthalten, freizusetzen. Diese vorherige Stufe kann durch verschiedene physikalische oder physikalischchemische Mittel (Beschallen, Zerkleinerung, osmotischer Schock, thermischer Schock etc.) durchgeführt werden. Die Extraktion kann durch verschiedene Techniken, die einem Fachmann bekannt sind und die in der Literatur beschrieben sind, durchgeführt werden. Im allgemeinen beziehen sich diese Techniken auf Konzentrierungs-, Fällungs- und Chromatographiestufen. Einige dieser verschiedenen Techniken sind in den Beispielen erläutert.
Ein weiterer Gegenstand betrifft jede pharmazeutische Zusammensetzung, die HSA als solches, wie vorstehend beschrieben, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird vollständiger anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die als Erläuterung und nicht als Begrenzung dienen.

LEGENDE DER FIGUREN

Fig. 1: Konstruktion des Hybridpromotors PGK/GAL. P = Promotor, UAS = Upstream Activating Sequence.
Fig. 2: Konstruktionsstrategie und Darstellung des Vektors pYG401. P = Promotor; T = Transkriptionsterminator; bla = Gen, das Ampicillinresistenz verleiht; aph = Gen, das Geneticinresistenz verleiht (G418).
Fig. 3: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pP4-33.
Fig. 4: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pYG65.
Fig. 5: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pYG70.
Fig. 6: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pYG72.
Fig. 7: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pG404ΔHindIII.
Fig. 8: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pYG128.
Fig. 9: Konstruktion und Darstellung der Plasmide pYG131 und pYG132.
Fig. 10: Restriktionskarte des Plasmids pYG600, bla = β- Lactamasegen, das Ampicillinresistenz verleiht.
Fig. 11: Konstruktionsstrategie des Plasmids pYG70-2, aph = 3'-Aminoglycosidphosphotransferasegen, das Geneticinresistenz verleiht (G418); prom = Promotor; IR = umgekehrt repetierte Sequenz; ORI = Replikationsorigin; LacZ' = Strukturgen der β-Galactosidase. Die mit einem (*) markierten Stellen besitzen mit den entsprechenden Stellen kompatible Enden, ohne nach Ligierung von den Enzymen erkannte Spaltstellen neu zu bilden.
Fig. 12: Synthetische Oligonukleotidsequenz A-F, die für die Konstruktion der Adapteren 1 bis 3 gedient hat.
Fig. 13: Konstruktionsstrategie des Plasmids pYG70-3. Bezüglich der Legende wird auf Fig. 11 verwiesen. term - Terminator.
Fig. 14: Konstruktionsstrategie des Plasmids pYG1003. Bezüglich der Legende wird auf Fig. 11 verwiesen.
Fig. 15: Konstruktionsstrategie des Plasmids pYG1023. Bezüglich der Legende wird auf Fig. 11 verwiesen.
Fig. 16 und 17: UV-Spektren verschiedener Albuminpräparate; Fig. 16 (1): Albumin BCQ750 der Beispiele B1 und B2; (2) Albumin BCQ804LE des Beispiels B5; (3) Kontrollalbumin (IM); Fig. 17: Albumin BCQ835GE des Beispiels B5.
Fig. 18 und 19: Fluoreszenzspektren verschiedener Albuminpräparate bei 430 nm (Fig. 18) und 360 nm (Fig. 19).

ALLGEMEINE CLONIERUNGSTECHNIKEN

Die klassischen Methoden der molekularen Biologie, die die Zentrifugation der Plasmid-DNA in einem Caesiumchlorid/Ethidiumbromid-Gradienten, die Spaltung durch Restriktionsenzyme, die Gelelektrophorese, die Elektroelution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, die Transformation in E. coli etc. sind in der Literatur (Maniatis et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986, Ausubel et al., (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987) beschrieben.
Die durch Oligodesoxynukleotide in vitro gesteuerte Mutagenese wird nach dem von Taylor et al. (Nucleic Acids Res. 13, (1985), 8749-8764) entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham beschriebenen Kits durchgeführt. Die Sequenzierung der Nukleotide wird gemäß dem von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 74, (1977), 5463-5467) beschriebenen Didesoxyverfahren durchgeführt. Die enzymatische Amplifikation der spezifischen DNA-Fragmente wird durch PCR-Reaktion (Polymerase-katalysierte Kettenreaktion) unter den von Mullis und Faloona (Meth. Enzym., 155, (1987), 355-350) und Saiki et al. (Science 230, (1985), 1350-1354) beschriebenen Bedingungen unter Verwendung ei nes DNA-Thermozyklers (Perkin Eimer Cetus) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

BEISPIELE

A - Konstruktion von Expressionsvektoren für Humanserumalbumin

1. Konstruktion eines Expressionsvektors von HSA unter der Kontrolle eines Hybridpromotors PGK/GAL: Plasmid pYG401.
Ein Expressionsvektor des Humanserumalbumins wurde aus dem Plasmid pYG19 (EP 361 991) hergestellt. Dieses zuletztgenannte umfaßt die folgenden Elemente:
- die Sequenz des Plasmids pKD1, die aus pYG19 ein Plasmid mit Mehrfachkopien macht, das stabil ist und sich in Hefen der Gattung Kluyveromyces replizieren kann (EP 361 991),
- eine Expressionskassette von Humanserumalbumin, die das Strukturgen, das die Prepro-Form codiert, unter Kontrolle des Promotors des PGK-Gens von S. cerevisiae enthält,
- ein Replikon und einen Selektionsmarker (bla-Gen, das Ampicillinresistenz verleiht) von Bakterien und
- das aph-Gen, das der Hefe G418-Resistenz verleiht.
Der Vektor pYG401 wurde aus dem Plasmid pYG19 durch Modifikation in der Expressionskassette von Humanserumalbumin konstruiert. In pYG401 ist das Albumingen nicht unter der Kontrolle des Promotors des PGK-Gens von S. cerevisiae, sondern unter der Kontrolle eines Hybridpromotors aus den Promotoren der Gene PGK und GAL1/GAL10 von S. cerevisiae. Dieser Hybridpromotor wurde durch Ersetzen der UAS-Region (Upstream Activating Sequence) des Promotors PGK (Stanway et al., Nucleic Acid. Res., 15, (1987), 6855) durch die UAS-Region des Promotors GAL1/GAL10 (Johnston und Davies, Mol. Cell. Biol. 4, (1984), 1440; West et al., Mol. Cell. Biol., 4, (1984), 2467) erhalten.
Dieser Hybridpromotor wurde wie folgt konstruiert (vergleiche Fig. 1):
Der Erhalt des Plasmids pYG29 wurde ausführlich in der Anmeldung EP 369 991 beschrieben. Dieses Plasmid umfaßt den Promotor des PGK-Gens von S. cerevisiae, das aus dem pYGlO-Plasmid in Form eines SalI-HindIII-Fragments isoliert wurde und in den Bakteriophagen M13mp18 cloniert wurde. Es wurde anschließend durch gesteuerte Mutagenese zur Einschleusung der folgenden Restriktionsspaltstellen modifiziert:
- 1 zusätzliche HindIII-Spaltstelle in Position -25, bezogen auf ATG. Die Einschleusung dieser Spaltstelle erlaubt die Wiederherstellung einer Nukleotidregion in der Nähe von ATG, die mit der nativen Region des PGK-Promotors identisch ist, nach verschiedenen Clonierungsstufen. Die Umgebung des ATG-Codons ist in der Tat dafür bekannt, daß sie sensibel die Effizienz der Initiation der Translation der Eukaryontengene beeinflußt (Kozak, M., Microbiol. Rev. 47, (1983), 1-45; Hamilton, R., Nucleic Acid Res., 15, (1987), 3581-3593).
- 2 NotI-Spaltstellen beiderseits der UAS-Region.
Die UAS-Region des Promotors GAL1/GAL10 wurde aus dem Plasmid pGl, das von Miyajima et al. (Nucl. Acid. Res., 12, (1984), 6397-6414), Cloning Vectors, Pouwels et al., Elsevier (1985) VI-B-ii-2) beschrieben ist, isoliert. Dieses Plasmid ist bei der ATCC unter Hinterlegungsnummer 37305 hinterlegt.
Das Plasmid pGl umfaßt ein 0,8 kb Fragment, das den GAL1/GAL10-Promotor von S. cerevisiae enthält, der in die HindII-Spaltstelle des Plasmids pUC8 insertiert wurde, aus dem es in Form eines BamHI-PstI-Fragments herausgeschnitten werden kann (Fig. 1):
Dieses Fragment wurde aus pG1 herausgeschnitten, gereinigt, dann mit den Enzymen RsaI und AluI gespalten, deren spezifische Spaltstellen beiderseits der UAS-Region lokalisiert sind. Ein Fragment mit 143 bp wurde so durch Elektroelution isoliert, dann in Form eines NotI-Fragments durch Anfügen eines Linkers 5'-GCGGCCGC-3' gebracht. Dieses Fragment wurde anschließend in das Plasmid pYG29, das zuvor mit NotI gespalten worden war, cloniert.
Das so erhaltene Plasmid wird als pYG32 bezeichnet (Fig. 1).
Zum Erhalt des Expressionsvektors, der diesen Hybridpromotor enthält, wurde das Fragment SalI-HindIII, das den Hybridpromotor enthält, von pYG32 isoliert und mit einem synthetischen Adapter HinIII-BstEII aus den zwei folgenden Komplementärsträngen ligiert: 5'-AGC TTT ACA ACA AAT ATA AAA ACA ATG AAG TGG-3' und 5'-GT TAC CCA CTT CAT TGT TTT TAT ATT TGT TGT AA-3' (das Transkriptionsinitiationscodon ist fett gedruckt). Dieser Adapter stellt die 22 bp, die unmittelbar stromaufwärts des PGK-Strukturgens von S. cerevisiae lokalisiert sind, wieder her und umfaßt die ersten Codons des Gens, das das Prepro-HSA codiert, bis zu einer BstEII-Spaltstelle, die in dem nativen Gen vorhanden ist (Fig. 1).
Die Expressionskassette des Humanserumalbumins wurde anschließend durch Ligieren des so erhaltenen SalI-PstEII- Fragments, das den Hybridpromotor und das 5'-Ende des A1- buminstrukturgens enthält, mit dem BstEII-SacI-Fragment, das aus dem Plasmid pYG19 isoliert wurde und das den Rest des Albumingens enthält, und dem Terminator des PGK-Gens von S. cerevisiae rekonstituiert (Fig. 2).
Die so erhaltene Kassette wurde anschließend verwendet, um die SalI-SacI-Expressionskassette, die von dem Plasmid pYG19 getragen wird, zu ersetzen.
Der so erhaltene Vektor wird als pYG401 bezeichnet (Fig. 2).

2. Konstruktion eines Expressionsvektors für HSA unter Kontrolle des Promotors RlADH4: Plasmid pYG132.

2. 1. Isolierung des Promotors KIADH4 von K. lactis

Der Promotor KlADH4 wurde durch Absuchen einer gesamten genomischen DNA-Bank von Kluyveromyces lactis (CSB2359/152) mit einer heterologen Sonde aus dem ADH2-Gen von S. cerevisiae erhalten. Genauer wurde die Bank durch Clonieren der DNA von K. lactis CBS2359/152 in die BamHI- Spaltstelle des Ersatzvektors Lambda-L47 des Produkts einer Teilspaltung durch das Sau3A-Enzym erhalten. Die zur Hybridisierung verwendete Sonde ist ein EcoRV-BamHI- Fragment mit 980 bp, das die codierende Region des Strukturgens ADH2 von 5. cerevisiae, ausgenommen die 70 ersten bp, enthält (Sonde A). Dieses Fragment wurde durch enzymatische Spaltung aus einem Plasmid mit der Bezeichnung pBR322.ADR2.BSa (Williamson et al., Cell 23, (1981), 605- 614, Russell et al., J. Biol. Chem., 258 (1983), 2674- 2682) erhalten.
Ein etwa 8 kb großes Fragment wurde so isoliert und in die BamHI-Spaltstelle des Plasmids pBR322 subcloniert, um das Plasmid p6-4-98 zu erzeugen (Fig. 3). Die Insertion von BamHI, die von diesem Plasmid getragen wird, wurde anschließend mit einem Restriktionsenzym kartographiert, und die Promotorregion des KlADH4-Gens wurde auf diesem Frag ment durch differentielle Hybridisierungen unter Verwendung der Sonde A sowie einer zweiten Sonde, die dem BamHI- EcoRV-Fragment zu etwa 1100 bp des Plasmids pBR322.ADR2.BSa entspricht, lokalisiert (Sonde B).
In einer zweiten Stufe wurde das Plasmid p6-4-98 mit dem Enzym HindIII gespalten, und ein 2, 2 kb Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend mit Standardtechniken gereinigt und in die HindIII-Spaltstelle des Plasmids pTZ19 subcloniert, um das Plasmid p6-2200-2 zu erzeugen (Fig. 3). Die Analyse des subclonierten Fragments zeigt, daß es die ersten 14 Codons des Gens KlADH4 und die stromaufwärts davon gelegene Region, die die Elemente der Regulation der Expression enthält, umfaßt.
Der Teil zwischen der BglII-Spaltstelle und dem Startcodon der Translation ATG (Fragment zu etwa 1,2 kb) wurde unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, (1977), 5463) sequenziert.

2.2. Konstruktion eines tragbaren KlADH4-Promotors (BglII- BamHI)

Ein tragbarer Promotor wurde durch Insertion einer BamHI- Restriktionsspaltstelle in Position 16, bezogen auf das ATG-Codon des Gens KlADH4 in dem 2, 2 kb HindIII-Fragment, das auf dem Plasmid p6-2200-2 vorhanden ist, hergestellt.
Die Insertion dieser Spaltstelle erlaubt die Erzeugung eines BglII-BamHI-Fragments zu 1,2 kb, das ausschließlich die Promotorregion KlADH4 umfaßt. Es erlaubt auch die Einschleusung jedes Gens, das exprimiert werden soll, stromabwärts des so erhaltenen Promotors.
Die BamHI-Spaltstelle wurde in Position 16, bezogen auf die Translationsinitiationsstelle (ATG) des Gens KlADH4 durch gesteuerte Mutagenese unter Verwendung der Doppel startertechnik (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) eingeschleust. Die Sequenz der für diese Mutagenese verwendeten synthetischen Oligodesoxynukleotide ist nachstehend angegeben. Die erzeugte BamHI-Spaltstelle ist unterstrichen, ATG ist kursiv angegeben, und die Sternchen bezeichnen die bezüglich der anfänglichen Sequenz modifizierten Basen. SI = Anfangssequenz, SM = modifizierte Sequenz
Das so erhaltene Plasmid wird als pP4-33 bezeichnet (Fig. 3).

2. 3. Konstruktion eines Expressionsvektors von Humanserumalbumin (HSA):

Zur Konstruktion eines Expressionsvektors von Humanserumalbumin wird ein Plasmid pYG404 (siehe EP 361 991) hergestellt, das enthält:
- ein Hefereplikon (quasi vollständige Sequenz des natürlichen Plasmids pKD1),
- das Gen, das Human-Prepro-Albumin (HSA) unter der Kontrolle des Promotors des Gens LAC4 von K. lactis codiert und auf das der Terminator des PGK-Gens von S. cerevisiae folgt; dem Strukturgen, das HSA codiert, geht eine 25-Nukleotidsequenz entsprechend der Region, die direkt stromaufwärts des PGK-Gens von S. cerevisiae liegt, voraus
- das aph-Gen, das der Hefe Geneticinresistenz (G418) verleiht, und
- ein Replikon und ein Selektionsmarker (bla-Gen, das Ampicillinresistenz verleiht) für E. coli.
Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pYG404ΔH unterscheidet sich von pYG404 nur durch die Zerstörung der HindIII- Spaltstelle, die in dem anh-Gen lokalisiert ist, durch gesteuerte Mutagenese. Diese Modifikation erlaubte anschließend die Substitution des LAC4-Promotors, der in dem Plasmid pYG404ΔH vorhanden ist, in Form eines SalI-Hindill- Fragments durch den Promotor KlADH4, der auch in Form eines SalI-HindIII-Fragments konstruiert ist.
(a) Konstruktion des Plasmids pYG404ΔH (Fig. 4 bis 7) Um die Deletion der HindIII-Spaltstelle in dem Clonierungsvektor pYG404 zu bewirken, wurden verschiedene Subclonierungsstufen bewirkt, die zu einer intermediären Konstruktion führten: pYG72 (Fig. 6). Dieser Vektor entspricht dem Plasmid pKan707 (EP 361 991), in dem das SacI- Fragment, das das URA3-Gen enthält, beseitigt wurde, ebenso die einzigartige HindIII-Spaltstelle, die in dem anh- Gen vorhanden ist. Um die gesteuerte Mutagenese an dieser Stelle durchzuführen, wurde das PstI-Fragment mit 1,3 kb, das das aph-Gen trägt, aus dem Plasmid kKan707 in den Bakteriophagen M13mp7 subcloniert, wodurch der Vektor pYG64 erhalten wurde (Fig. 4). Die HindIII-Spaltstelle wurde durch gesteuerte Mutagenese (vergleiche allgemeine Clonierungstechniken) unter Verwendung des folgenden Oligodesoxynukleotids zerstört: 5'-GAA ATG CAT AAG CTC TTG CCA TTC TCA CCT-3', was den Ersatz des Tripletts CTT, das Leucin 185 codiert, durch das Triplett CTC erlaubt. Diese Veränderung modifiziert nicht die so erhaltene Proteinsequenz. Das erhaltene Plasmid wurde als pYG65 bezeichnet (Fig. 4). Um das Plasmid pYG72 zu konstruieren, wurde der Teil, der das bakterielle Replikon des Vektors pKan707 enthält, durch Spaltung mit dem EcoRI-Enzym und Rezirkularisation mit der T4-DNA-Ligase isoliert, wodurch das Intermediärplasmid pYG69 erzeugt wurde. Das in diesem vor handene PstI-Fragment, das das aph-Gen enthält, wurde anschließend durch das äquivalente mutierte Fragment aus dem Plasmid pYG65 ersetzt. Diese Konstruktion wurde als pYG70 bezeichnet (Fig. 5). Die Sequenz von pKD1 mit 4,7 kb, die zwischen den EcoRI- und SacI-Spaltstellen enthalten ist, wurde anschließend in diesen Vektor eingeschleust, wodurch pYG72 erhalten wurde (Fig. 6).·
Der Vektor pYG404ΔH wurde durch Insertieren der Expressionskassette aus dem Plasmid pYG404 (EP 361 991) in Form eines SalI-SacI-Fragments in die entsprechenden Spaltstellen von pYG72 erhalten (Fig. 7).

(b) Konstruktion eines tragbaren KlADH4-Promotors [SalI- HindIII] (Fig. 8)

Der Promotor KlADH4, der auf dem BglII-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pP4-33 enthalten ist, wurde wie folgt modifiziert, um ihn der Verwendung in den von dem Plasmid pYG404ΔH abgeleiteten Expressionsvektoren anzupassen.
Nach Spaltung des Plasmids pP4-33 durch die Enzyme BglII und BamHI, gefolgt von einer Behandlung mit Mungbohnennuklease, um die Enden glatt zu machen, wurde das 1,2 kb Fragment, das den Promotor KlADH4 enthält, aus einem Agarosegel isoliert und in den Vektor pBC SK+ subcloniert (Stratagene, La Jolla, CA, USA), der zuvor mit dem Enzym ClaI linearisiert, und mit der Mungbohnennuklease ebenso wie mit alkalischer Kälberphosphatase (CIP) behandelt worden war. Das so erhaltene Plasmid (pYG128, Fig. 8) erlaubt die Isolierung des Promotors KIADH4 in Form eines SalI-HindIII-Fragments mit 1,2 kb.

(c) Konstruktion des Vektors pYG132 (Fig. 9)

Die Spaltung des Expressionsvektors pYG404ΔH (vergleiche 2.3.(a)) durch die Enzyme SalI und HindIII erlaubt den Er satz des Promotors LAC4 durch den vorstehend beschriebenen Promotor KlADH4.
Um diese Clonierung zu bewirken, wurden das SalI-HindIII- Fragment mit 8,7 kb, das den pKD1-Teil und die Selektionsmarker enthält, ebenso wie das HindIII-HindIII-Fragment mit 1,9 kb, das das Gen, das Prepro-HSA codiert, enthält, aus dem Vektor pYG404ΔH isoliert und in Gegenwart des SalI-HindIII-Fragments mit 1,2 kb, das aus dem Plasmid pYG128 hervorgeht und das den Promotor KlADH4 trägt, religiert. Zwei Plasmide wurden so erhalten:
- pYG131 (Fig. 9), entsprechend einem Clonierungsvektor, der die Insertion jedes Gens, das man unter der Kontrolle des Promotors KlADH4 exprimieren möchte, in die einzigartige HindIII-Spaltstelle erlaubt und
- pYG132 (Fig. 9), das mit dem Plasmid pYG131 identisch ist, außer daß es das in die HindIII-Spaltstelle eingeschleuste Prepro-HSA-Gen enthält.

3. Konstruktion eines Expressionsvektors von HSA unter der Kontrolle des Promotors des Gens LAC4 von R. lactis: Plasmid pYG1023.

3.1. Isolierung des PGK-Gens von K. lactis

Das PGK-Gen wurde aus K. lactis CBS2359 durch Absuchen einer genomischen Teilbank mit einer heterologen Sonde, die dem N-terminalen Teil des PGK-Gens von S. cerevisiae (Dobson et al., Nucl. Acid. Res. 10, (1982), 2625-2637) entspricht, isoliert. Genauer entspricht die verwendete Sonde dem PvuI-EcoRI-Fragment mit 1,3 kb.
In einem Southern Blot (Southern et al., J. Biol. Chem. 98, (1975), 503) hybridisiert die verwendete Sonde insbesondere an eine DNA-Sequenz, die in einem 4 kb HindIII HindIII-Fragment enthalten ist. Diese Sequenz wurde durch Hybridisierung auf Kolonien mit der vorstehenden Sonde isoliert. Dafür wurde eine beschränkte genomische DNA-Bank des Stamms CBS2359, bestehend aus HindIII-Fragmenten mit einer Größe zwischen 3 und 5 kb, die in die HindIII-Stelle des Plasmids pUC18 eingeschleust wurden, hergestellt und abgesucht.
Ein Clon, der das Plasmid pYG600 (Fig. 10) enthält, wurde so isoliert. Die Sequenz des PGK-Gens, die auf diesem Plasmid enthalten ist, wurde von Fournier et al. (Nucl. Acid. Res. 18, (1990), 369) beschrieben.

3.2. Konstruktion eines Expressionsvektors von Humanserumalbumin, der das PGK-Gen von K. lactis enthält

Das Plasmid pYG70, das in Fig. 5 beschrieben ist, wurde wie folgt modifiziert:

(a) Modifikation der Restriktionsspaltstellen des Plasmids pYG70 (Fig. 11).

Um die nachfolgenden Clonierungsstufen zu erleichtern, wurden bestimmte Restriktionsspaltstellen supprimiert (i) und 2 Adapteren wurden an das Plasmid pYG70 angefügt (11 und iii).

(i) Entfernung der SphI-Spaltstelle

Das Plasmid pYG70 wurde mit SphI gespalten, und die cohäsiven Enden wurden anschließend durch Spaltung in Gegenwart von DNA-Polymerase des T4-Phagen beseitigt. Nach Ligierung in Gegenwart von Ligase wurde das Plasmid pYG704ΔSphI erhalten (siehe Fig. 11).

(ii) Insertion des Adapters 1

Der Adapter 1 wurde durch Hybridisierung der Syntheseoligonukleotide A und B, die in Fig. 12 dargestellt sind, erhalten. Dafür wurden 2 ug jedes Oligonukleotids in einem Hybridisierungspuffer qsp 20 ul (Tris-HCl-Puffer 30 mM, pH 7,5; NaCl 30 mM; MgCl&sub2; 7,5 mM; ATP 0,25 mM; DTT 2 mM; EDTA 0,2 mM) inkubiert, dann wurde die Temperatur während 10 Minuten auf 80ºC erhöht und langsam auf Umgebungstemperatur zurückgeführt.
Der so erhaltene Adapter enthält Spaltstellen für die folgenden Enzyme: SacI, SalI, MluI, BssHII und Stil und erlaubt während seiner Einschleusung die Beseitigung der in dem Plasmid pYG704ΔSphI vorhandenen SalI-Spaltstelle. Dieser Adapter wurde durch Ligierung in das Plasmid pYG704ΔSphI, das zuvor mit den Enzymen SalI und SacI gespalten worden war, eingeschleust.
Das so erhaltene Plasmid wird als pYG70-1 bezeichnet.
(iii) Insertion des Adapters 2
Der Adapter 2 wurde unter Befolgung des für den Adapter 1 beschriebenen Protokolls unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide C und D, die in Fig. 12 beschrieben sind, hergestellt. Dieser Adapter enthält die Spaltstellen für die folgenden Enzyme: Sfii, AatII, SphI, NarI und SacI und erlaubt während seiner Einschleusung die Beseitigung der in dem Plasmid pYG70-1 enthaltenen EcoRI-Spaltstelle. Er wurde durch Ligierung in das Plasmid pYG70-1, das zuvor mit den Enzymen EcoRI und SacI gespalten worden war, eingeschleust, wodurch das Plasmid pYG70-2 gebildet wurde (Fig. 11).
(b) Einschleusung einer Expressionskassette von Humanserumalbumin
Die verwendete Expressionskassette von Humanserumalbumin umfaßt:
- den induzierbaren Promotor des LAC&sub4;-Gens von K. lactis
- das Strukturgen, das Humanserumalbumin codiert (gebildete Prepro-Form), und
- den Terminator des PGK-Gens von S. cerevisiae Diese Kassette wurde aus dem Plasmid pYG404 (EP 361 991) in Form eines SalI-SacI-Fragments isoliert, dann durch Ligierung in das Plasmid pYG70-2, das zuvor mit den entsprechenden Enzymen gespalten worden war, eingeschleust.
Das so erhaltene Plasmid wird als pYG70-3 bezeichnet (Fig. 13).

(c) Insertion des PGK-Gens von K. lactis

Das PGK-Gen von K. lactis wurde aus dem Plasmid pYG600 (Fig. 10) isoliert, in das Plasmid pYG1002 subcloniert, wodurch das Plasmid pYG1003 erzeugt wurde, dann aus diesem letzteren in Form eines MluI-BssHII-Fragments isoliert. Die Subclonierung in pYG1002 erlaubte den Erhalt des PGK- Gens von K. lactis, ohne seinen Promotor in der Form eines MluI-BssHII-Fragments.
Das Plasmid pYG1003 wurde wie folgt erhalten (Fig. 14).
Das Plasmid pIC20H (Marsh et al., Gene 32, (1984), 481) wurde durch BglII und EcoRI gespalten, um den Adapter 3 einzuschleusen. Dieser Adapter, der die Spaltstellen Eco- RI, BssHII, ClaI, NheI, MluI und BlgII beifügt, wurde wie vorstehend (2.(a)(11)) beschrieben, durch Hybridisierung der Oligonukleotide E und F (Fig. 12) erhalten. Das so erhaltene Plasmid wird als pYG1002 bezeichnet. Das PGK-Gen von K. lactis wurde in dieses neue Plasmid in Form eines ClaI-NheI-Fragments, das aus dem Plasmid pYG600 hervorgegangen ist, eingeschleust. Das so erhaltene Plasmid wird als pYG1003 bezeichnet (Fig. 14).
Das aus dem Plasmid pYG1003 hervorgegangene MluI-BssHI- Fragment, das das PGK-Gen von K. lactis enthält, wurde anschließend in die entsprechenden Spaltstellen auf dem Plasmid pYG70-3 eingeschleust, um das Plasmid pYG70-4 zu erzeugen (Fig. 15).
Auf diesem Plasmid ist das PGK-Gen unter der Kontrolle des bidirektionellen k1-Promotors des Killertoxins ruhiggestellt.

(d) Insertion des Hefereplikons

Die Plasmide pYG70-4 (Fig. 15) und pKD1 (EP 361 991) wurden mit SphI gespalten und in Gegenwart von Ligase zusammenligiert. Am Ende dieser Ligierung können 4 Vektoren erhalten werden, je nach Konformation des Plasmids pKD1 (Form A oder Form B) und Orientierung des entsprechenden Teils des Plasmids pYG70-4 bezüglich pKD1.
Eine dieser Konstruktionen wurde selektioniert und als pYG1023 (Fig. 15) bezeichnet. Dieser Vektor umfaßt:
- die ganze Sequenz des pKD1-Plasmids, das aus pYG1023 ein Plasmid mit vielen Kopien macht, das stabil ist und sich in Hefen und bevorzugt in Hefen der Gattung Kluyveromyces replizieren kann,
- eine Expressionskassette von Humanserumalbumin, die das Strukturgen enthält, das die Prepro-Form unter Kontrolle des induzierbaren Promotors das LAC4-Gens von K. lactis und des Terminators des PGK-Gens von S. cerevisiae codiert,
- ein Replikon und einen Selektionsmarker (bla-Gen, das Ampicillinresistenz verleiht) für E. coli,
- zwei Selektionsmarker für einen K. lactis-Stamm pgR: das mutierte aph-Gen unter Kontrolle des bidirektionellen k1-Promotors des Killertoxins und das PGK-Gen von K. lactis unter Kontrolle des gleichen Promotors, aber divergierend, bezogen auf das aph-Gen, transkribiert.

B - Produktion von Humanserumalbumin auf rekombinantem Weg

B1. Dieses Beispiel beschreibt ein klassisches Verfahren zur Produktion von rekombinantem HSA unter Verwendung der Hefe K. lactis CBS683, die durch den Vektor pYG401 transformiert wurde (Beispiel A1). Dieses Beispiel erläutert den Stand der Technik.
Diese Kultur wurde in einem 2 l Fermenter bei 28ºC im Fed- Batch-Verfahren durchgeführt. Zuerst enthält der Fermenter 0,7 Liter Grundmedium (2 g/l Glucose, 3 g/l Hefeextrakt, Salze). Eine Kultur zu 50 ml in exponientieller Wachstumsphase (inokuliert aus einer abgekühlten Suspension) wurde zur Inokulation des Fermenters verwendet. Nach einer anfänglichen Wachstumsphase vom Batch-Typ wird die Komplementärcharge (Glucose, Maisquellwasser, Ammoniumsalze: 40%/13%/7% [Gew./Vol.]) exponentiell hinzugefügt. Nach 64stündiger Kultur wird die Brühe abzentrifugiert und der Überstand über eine 2 u Membran mikrofiltriert. Das Reinigungsprotokoll umfaßt eine Affinitätschromatographiestufe über Bleu Trisacryl (IBF, Frankreich), auf der das Albumin mit einer starken Salzkonzentration (NaCl 3,5 M) eluiert wird, anschließend, nach Konzentrieren und Diafiltration eine Passage über einen Ionenaustauscher vom Typ Q- Sepharose fast flow. Das so gereinigte HSA besitzt eine homogene Bande in der SDS-PAGE-Elektrophorese und unter scheidet sich nicht von natürlichen Albuminen, die als Referenz in zahlreichen Tests zur biochemischen Charakterisierung verwendet wurden. Dennoch besitzt eine so erhaltene HSA-Lösung eine Gelbfärbung bis zu einem Kolorimetrieindex i = 0,26, dessen Verminderung durch eine noch stärkere Reinigung und/oder durch Behandlungen, wie die Verwendung von Aktivkohlen, nicht möglich ist, so daß eine anormale Fluoreszenz nach Anregung mit 360 nm auftritt (siehe die Fig. 16, 18 und 19).
B2. Eine Charge rekombinantes Albumin BCQ 759, erhalten unter den in Beispiel B1 beschriebenen Bedingungen, zeigt einen Kolorationsindex i = 0,26 nach Reinigung (Fig. 16). Zahlreiche zusätzliche Chromatographietests und physikalisch-chemische Behandlungen erlauben keine Verminderung dieser Färbung.
Um die Natur der Bindung dieser Färbung von Albumin zu analysieren, wurde ein Denaturierungs-Renaturierungs- Zyklus wie folgt durchgeführt:
50 mg BCQ 759 werden durch Inkubation in 2 ml Guanidin-HCl 7M und 0,3M β-Mercaptoethanol denaturiert. Diese Lösung wird 1 Stunde auf 100ºC erhitzt. Nach Abkühlen werden 500 ul denaturiertes rHSA in eine TSK-Säule 3000 SW, die mit 8M Harnstoff und 0,3M β-Mercaptoethanol equilibriert wurde, injiziert, um die kleinen Moleküle zu entfernen, die stark (aber nicht covalent) an das HSA gebunden werden könnten. Die Fraktionen, die bei 280 nm absorbieren, werden gegen eine Lösung aus 50 mM Tris HCl, 8M Harnstoff, pH 8,0, für eine Nacht unter Stickstoff, dann gegen 1 l Renaturierungspuffer, der 50 mM Tris HCl, pH 9,5, der 50 mM NaCl, 1 mM reduziertes Glutathion und 0,1 mM oxidiertes Glutathion enthielt, unter Stickstoff 48 Stunden lang dialysiert. Nach der abschließenden Dialyse gegen Wasser wird ein UV-Spektrum durchgeführt, und es wird ein Färbungsindex i&sub2; = 0,22 berechnet. Unter den gleichen Bedingungen ergibt ein Plazentaalbumin als Kontrolle (Institut Merieux, i = 0,07) nach der Renaturierung einen i&sub2;-Wert von 0,14. Dieses Beispiel weist klar die im wesentlichen covalente Natur der Bindung des Pigments an Albumin nach. Es ist somit nutzlos, zu versuchen, ein rekombinantes Albumin durch das Reinigungsverfahren signifikant zu entfärben.
B3. In diesem Beispiel ist ein einfaches Experiment beschrieben, das den Nachweis erlaubt, daß die Kohlenstoffquelle eine wesentliche Ursache der Entwicklung der Färbung ist.
Das Kontrollalbumin (i = 0,07) wird in verschiedenen Kulturmedien in Erlenmeyer-Kolben ohne Inokulation mit Hefe inkubiert. Die getesteten Medien bestehen aus einem definierten Grundmedium Bo, das wie folgt definiert ist:
Salze Ammoniumacetat 7 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 4,4 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 4 g/l
MgSO&sub4;, 7H&sub2;O 0,5 g/l
CaCl&sub2;, 2H&sub2;O 0,1 g/l
MnSO&sub4;, H&sub2;O 10 mg/l
ZnSO&sub4;, 7H&sub2;O 100 mg/l
FeSO&sub4;, 7H&sub2;O 15 mg/l
AlCl&sub3;, 6H&sub2;O l mg/l
CoCl&sub2;, 6H&sub2;O 2 mg/l
CuSO&sub4;, 5H&sub2;O 0,13 mg/l
KI 0,33 mg/l
H&sub3;B0&sub3; 1,47 mg/l
Na&sub2;MoO&sub4; 0,67 mg/l
Vitamine Mesoinosit 2 mg/l
Nicotinsäure 2 mg/l
Biotin 2 mg/l
Calciumpantothenat 2 mg/l
Aminosäuren L-Glu 0,6 g/l
L-Phe 0,15 g/l
DL-Ala 0,7 g/l
L-Leu 0,35 g/l
L-Lys, HCl 0,30 g/l
DL-His, HCl 0,30 g/l
L-Ile 0,10 g/l
DL-Met 0,15 g/l
L-Pro 0,3 g/l
und eine Kohlenstoffquelle:
Erlenmeyer-Kolben
E1: Glucose (mikrofiltiert) 20 g/l
E2: Lactose 20 g/l
E3: Kontrolle (ohne Kohlenstoffquelle)
Die drei Erlenmeyer-Kolben werden mit HSA in einer Konzentration von 50 mg/l inkubiert und bei 28ºC 3 Tage lang inkubiert.
Nach 3 Tagen wird das Medium zentrifugiert und über eine 0,2 p Membran filtriert. Es werden 5 ml Affinitätsträger Bleu Trisacryl M (IBF Frankreich) hinzugefügt, und es wird sanft gerührt. Nach 1 Stunde werden die Mutterlaugen über eine Glasfritte abgetrennt, und das Albumin wird mit einer 3,5 M NaCl-Lösung eluiert. Das Eluat wird anschließend konzentriert und mit Wasser über eine 10 kD Ultrafiltrationsmembran diafiltriert.
Eine spektrophotometrische Analyse ergibt die folgenden Ergebnisse für die Färbungsindices von Albumin:
Erlenmeyer-Kolben E1 i = 0,16
E2 i = 0,12
E3 i = 0, 09
Kontroll-HSA i = 0,07
Dieses Beispiel zeigt nun klar, daß die Kohlenstoffquelle eine Erhöhung der Färbung des Albumins unter den Kulturbedingungen ohne Hefe induziert.
B4. Um die in dem vorstehenden Beispiel erhaltenen Ergebnisse zu vervollständigen, wurde das Referenzalbumin unter den gleichen Bedingungen und in Gegenwart von Erlenmeyer-Kolben
E4 Bo-Medium + autoklavierte Glucose 20 g/l
E5 Bo-Medium + mikrofiltrierte Glucose 20 g/l
E6 Bo-Medium + mikrofiltrierte Saccharose 20 g/l inkubiert.
Nach Konzentrieren und Diafiltration des Mediums, um die kleinen Moleküle zu entfernen, wurde der Farbindex mittels UV bestimmt:
E4 i = 0,22
E5 i = 0,15
E6 i = 0,14
B5. Um die in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Schlußfolgerungen in einer reellen Kultur zu verifizieren, wurde die Färbung von rekombinantem Albumin, das in einem Erlenmeyer-Kolben durch die Hefe K. lactis produziert wurde, analysiert.
a) Stamm K. lactis pgk&supmin; CBS 295.91, transformiert durch den Vektor pYG1023, beschrieben in Beispiel 3:
Erlenmeyer-Kolben:
E7 = Bo + Lactose 10 g/l + Ethanol 10 g/l
E8 = Bo + Lactose 20 g/l
E9 = Bo + mikrofiltrierte Glucose 20 g/l
E10 = Bo + Lactose 10 g/l + Glucose 10 g/l
Das nach 72stündiger Kultur im Batch-Modus und im 250 ml Erlenmeyer-Kolben bei 28ºC produzierte rekombinante Albumin wurde über eine Anionenaustauschersäule Mono Q HR5/5 (Pharmacia) gereinigt und mit Aktivkohle behandelt, um die Färbung zu entfernen, die nicht covalent an das Protein gebunden ist. Die nach der W-Analyse erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:
E7 i = 0,11 BCQ 804 LE (siehe Fig. 16, 18 und 19)
E8 i = 0,14 BCQ 804 L
E9 i = 0,17 BCQ 804 G
E10 i = 10,15 BCQ 804 LG
b) Stamm K. lactis CBS 293.91, transformiert durch den Vektor pYG132, beschrieben in Beispiel A2:
Erlenmeyer-Kolben:
E11 = Bo + Glycerin 10 g/l + Ethanol 10 g/l
Unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend ergibt das produzierte rekombinante Albumin nach einer einfachen Reinigung über Mono Q einen Färbungsindex i = 0,09 (BCQ 835 GE): siehe Fig. 17.

Claims

1. Humanserumalbumin als Ergebnis der Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einer Hefe der Gattung Kluyveromyces, das einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,2 besitzt, und durch Durchführen des Verfahrens zur Herstellung des Humanserumalbumins erhalten werden kann, das die folgenden Stufen umfaßt:

- in einer ersten Stufe wird in eine Wirtszelle eine exogene DNA, die Humanserumalbumin unter der Kontrolle von für den verwendeten Wirt geeigneten Transkriptions- und Translationssignalen codiert, eingebracht,

- in einer zweiten Stufe wird die so erhaltene Zelle in einem Medium mit definierter Zusammensetzung, das mindestens eine Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus Alkoholen, nichtreduzierenden Zuckern, organischen Säuren und Glucosederivaten, die am Sauerstoff des Kohlenstoffatoms C4 substituiert sind, enthält, oder in einem Medium, das so hergestellt wurde, daß die Bildung von Verunreinigungen vom Aldehydtyp beseitigt oder beschränkt ist, gezüchtet, und

- in einer dritten Stufe wird das gebildete HSA isoliert.

2. Humanserumalbumin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,15 besitzt.

3. Humanserumalbumin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kolorimetrieindex von kleiner 0,1 besitzt.

4. Humanserumalbumin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA aus cDNA-Sequenzen, genomischen DNA-Sequenzen und Hybridsequenzen, die HSA codieren, ausgewählt ist.

5. Humanserumalbumin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA eine Transkriptionsstartregion in der Nähe des 5'-Endes der Sequenz, die HSA codiert, besitzt.

6. Humanserumalbumin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA Teil eines Vektors ist, der sich autonom oder integrativ replizieren kann.

7. Humanserumalbumin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er das Ergebnis der Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einer Hefe der Gattung Kluyveromyces und der Sekretion des Expressionsprodukts der Sequenz in das Kulturmedium ist.

8. Humanserumalbumin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA stromaufwärts der Sequenz, die für reifes HSA codiert, eine Leader -Sequenz umfaßt, die das entstehende Protein in die Sekretionswege des verwendeten Wirts steuert.

9. Humanserumalbumin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA-Sequenz in der 5'-3'-Richtung eine Startregion der Transkription und der Translation, eine Leader-Sequenz, die das entstehende Protein in die Sekretionswege der verwendeten Wirtszelle steuert, und eine cDNA, die Humanserumalbumin codiert, umfaßt.

10. Humanserumalbumin nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader- Sequenz die natürliche Leader-Sequenz von HSA, eine heterologe Leader-Sequenz oder eine künstliche Leader- Sequenz sein kann.

11. Verfahren zur Herstellung von Humanserumalbumin mit einem Kolorimetrieindex von kleiner 0,2, dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stufen durchführt:

- in einer ersten Stufe wird in eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle eine exogene DNA, die Humanserumalbumin unter der Kontrolle von für den verwendeten Wirt geeigneten Transkriptions- und Translationssignalen codiert, eingebracht,

- in einer zweiten Stufe wird die so erhaltene Zelle in einem Medium mit definierter Zusammensetzung, das mindestens eine Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus Alkoholen, nichtreduzierenden Zuckern, organischen Säuren und Glucosederivaten, die am Sauerstoff des Kohlenstoffs C4 substituiert sind, enthält, oder in einem Medium, das so hergestellt wurde, daß die Bildung von Verunreinigungen vom Aldehydtyp beseitigt oder begrenzt ist, gezüchtet und in einer dritten Stufe wird das gebildete HSA isoliert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die exogene DNA wie in einem der Ansprüche 4, 5, 6, 8, 9 oder 10 definiert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das HSA in das Kulturmedium sezerniert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der eukaryontische Wirt aus tierischen Zellen, Hefen und Pilzen ausgewählt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der prokaryontische Wirt aus den Bakterien E. coli, Bacillus und Streptomyces ausgewählt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt aus den Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces und Hansenula ausgewählt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt aus den Hefen der Gattung Kluyveromyces ausgewählt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol aus einfachen Alkoholen, die mindestens zwei Kohlenstoffatome enthalten, und Polyalkoholen ausgewählt werden kann.

19. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucosederivate aus Disacchariden und bevorzugt aus Disacchariden, die eine Osidbindung vom 1-4-Typ besitzen, ausgewählt werden.

20. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine Kombination aus mehreren Kohlenstoffquellen umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle aus der Assoziation eines Glucosederivats und eines Alkohols oder der Assoziation eines einfachen Alkohols und eines Polyalkohols zusammengesetzt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zuvor in der Kälte sterilisiert wurde.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das HSA nach einem der Ansprüche 1 bis 10.