DE69319843T2

DE69319843T2 - Verfahren und Apparat zum Nachweis biologischer Aktivitäten in einer Probe

Info

Publication number: DE69319843T2
Application number: DE69319843T
Authority: DE
Inventors: Klaus W. Stewartstown Pennsylvania 17363 Berndt
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-04
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2013-10-05
Also published as: ES2119864T3; EP0597584A1; AU668414B2; DE69319843D1; JPH06197752A; CA2107289A1; EP0597584B1; US5310658A; BR9304162A; CA2107289C; JP2604539B2; AU4865893A

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein nichtinvasives Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis biologischer Aktivitäten in einer Flüssigkeits- bzw. Fluidprobe, wie z. B. in Blut. Die Probe und ein Kulturmedium werden in einen verschließbaren Behälter eingebracht und Bedingungen ausgesetzt, die den Ablauf von Stoffwechselprozessen in Gegenwart von Mikroorganismen ermöglichen.
Gewöhnlich wird die Gegenwart von Mikroorganismen, wie z. B. von Bakterien, in Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Hilfe von Blutkulturfläschchen ermittelt. Eine geringe Menge Blut wird durch das abdichtende Gummiseptum in ein steriles Fläschchen injiziert, welches das Kulturmedium enthält. Das Fläschchen wird bei 37% inkubiert und auf Bakterienwachstum überwacht.
Eine gewöhnliche Sichtprüfung erfordert eine Überwachung der Trübung der Fluidsuspension. Bekannte instrumentelle Verfahren erfassen Veränderungen des Kohlendioxidgehalts, eines Stoffwechselnebenprodukts des Bakterienwachstums, im Kopfraum der Kulturflaschen. Die Überwachung des Kohlendioxidgehalts kann durch eingeführte, dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, zu denen radiochemische Messungen, Infrarotmessungen bei einer Spektrallinie des Kohlendioxids oder Druck-/Vakuummessungen gehören. Diese Verfahren erfordern jedoch invasive Arbeitsweisen, die zu dem bekannten Problem der Kreuzverunreinigung führen. Andererseits erzeugt im Falle einer Vakuum-/Druckmessung jede Temperaturänderung im Kopfraum des Fläschchens auch eine Druckänderung, die nicht mit biologischen Aktivitäten verbunden ist. Daher ist eine zusätzliche Messung der Kopfraumtemperatur erforderlich, um zwischen biologischen und Temperatureffekten zu unterscheiden. Die nichtinvasive Überwachung der Kopfraumtemperatur stellt jedoch ein äußerst schwieriges Problem dar, und es gibt gegenwärtig keine praktische Lösung. Ferner kann die Stoffwechselaktivität einiger Mikroorganismen zu sehr hohen Kopfraumdrücken führen. Das heißt, ein Drucksensor muß zwar empfindlich sein, um den Nachweis verschiedener Mikroorganismen-Arten zu ermöglichen, aber er muß auch gegen extremen Druck geschützt werden. Je nach der angewandten Technologie widersprechen diese Forderungen häufig einander und können nicht gleichzeitig erfüllt werden.
In letzter Zeit sind neue nichtinvasive Verfahren entwickelt worden, die chemische Sensoren innerhalb eines Fläschchens benutzen. Derartige Sensoren reagieren oft durch eine Änderung ihrer Farbe oder ihrer Fluoreszenzintensität auf Veränderungen der Kohlendioxidkonzentration. Die Ausgangssignale von diesen Sensoren basieren auf Lichtintensitätsmessungen. Das heißt, daß Fehler auftreten können, besonders wenn die zur Anregung der Sensoren verwendeten Lichtquellen oder die zur Überwachung der Intensitäten verwendeten Photodetektoren im Lauf der Zeit Alterungseffekte aufweisen.
Die Nachteile der Verfahren auf Intensitätsbasis lassen sich überwinden, indem man Anregungslicht in Kombination mit Fluoreszenz-Sensoren verwendet, deren Abklingzeit sich als Reaktion auf eine Änderung des Kohlendioxidgehalts ändert. Mit Hilfe dieses Verfahrens werden Intensitätsmessungen durch Zeitmessungen ersetzt, und daher haben Intensitätsänderungen keinen Einfluß auf die Ergebnisse. Gegenwärtige Fluoreszenz-Abklingzeitsensoren benötigen jedoch sehr helle kurzwellige Lichtquellen (550 nm oder kürzer), die mit sehr hohen Frequenzen (typischerweise über 100 MHz) intensitätsmoduliert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform wäre ein grüner 5 mW-Helium-Neon-Laser (HeNe-Laser) (543,5 nm) mit externer Modulation durch einen akustooptischen Lichtmodulator. Die Laser/Modulator-Kombination ist teuer, und es ist zu erwarten, daß in der Praxis die Fläschchen zum Laser transportiert werden müßten, statt für jedes Fläschchen eine Lichtquelle zu haben. Ferner hätten solche Geräte bewegliche Teile, und das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Messungen für jedes Fläschchen wäre relativ lang. Außerdem ist es nicht wahrscheinlich, daß in naher Zukunft billige kurzwellige Halbleiterdiodenlaser von hoher Helligkeit entwickelt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung überwindet Probleme, die bei den bekannten Verfahren erkannt wurden, durch Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Nachweis biologischer Aktivitäten in Blutkulturflaschen, wobei das Verfahren bzw. die Vorrichtung nichtinvasiv ist, keine chemischen Sensoren oder kurzwelligen Lichtquellen von hoher Helligkeit benötigt, gegen extrem hohen Druck sicher ist, eine Kompensation der Kopfraumtemperatur aufweist und relativ billig ist, so daß jedes Fläschchen kontinuierlich überwacht werden kann, was bedeutet, daß Diagnosegeräte mit unbeweglichen Fläschchen konstruiert werden können.
Erfindungsgemäß werden ein Kulturmedium und eine Blutprobe in ein verschließbares Glasfläschchen eingebracht. Die normalerweise inkompressible Fluidsuspension wird kompressibel gemacht, und auf diese Weise kann die Bewegung des Fluidfüllstands gemessen werden, die aus Druckänderungen im Kopfraum des Fläschchens resultiert, welche mit dem Mikroorganismenwachstum verbunden sind.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, um die Fluidsuspension kompressibel zu machen, besteht darin, einen Gasbeutel in das Medium/Blut-Gemisch einzubringen und unter den oberen Fluidfüllstand, d. h. unter die Fluid-Gas- Grenzfläche, unterzutauchen. Es ist auch möglich, mehrere kleine Gasbeutel oder kompressible Teilchen in das Fluid einzubringen und dann zu befestigen. Der Inhalt des Gasbeutels können atmosphärische Luft, ein Gasgemisch oder andere kompressible Fluide sein. Wie weiter unten erläutert, kann der Druckeffekt von Kopfraumtemperaturänderungen wesentlich verringert werden, indem man einen Gasbeutel verwendet, der mit einem Gas gefüllt ist, dessen Dichte gleich derjenigen im Kopfraum ist. In einer solchen Situation führt eine identische, im Kopfraum und innerhalb des Gasbeutels auftretende Temperaturänderung zu identischen Druckänderungen. Folglich ändert sich der Fluidfüllstand durch eine Temperaturänderung nicht, so daß eine zusätzliche Überwachung der Kopfraumtemperatur nicht erforderlich ist.
Zur Überwachung des Fluidfüllstands innerhalb des Blutkulturfläschchens weist ein erfindungsgemäßes Gerät eine auf einer Seite des Fläschchens angeordnete Lichtquelle und einen großflächigen Photodetektor auf der anderen Seite des Fläschchens auf. Die Lichtquelle und der Photodetektor sind so angeordnet, daß bei einer Änderung des Fluidfüllstands der prozentuale Anteil der Photodetektorfläche, der Licht von der Lampe empfängt, gleichfalls beeinflußt wird, was zu einem veränderten Ausgangsstrom des Photodetektors führt. Auf diese Weise kann der Kopfraumdruck im Inneren des Blutkulturfläschchens durch Aufzeichnung des Photodetektor-Ausgangssignals überwacht werden.
In der Praxis wird die Fluid-Gas-Grenzfläche durch Schattenwurf auf einen großflächigen Photodetektor abgebildet. Dem Fachmann wird verständlich sein, daß zur Realisierung des gleichen Abbildungsprinzips auch ein Linsensystem verwendet werden kann. Ein erfindungsgemäßes Gerät kann ein im Lichtweg zwischen der Lichtquelle und dem Photodetektor angeordnetes Farbfilter aufweisen, um den Kanteneffekt der Fluid-Gas-Grenzfläche zu erhöhen.
Bekanntlich treten an der Fluid-Gas-Grenzfläche Gasblasen auf, besonders wenn die Fläschchen geschüttelt werden. Einige Formen von Mikroorganismen erzeugen gleichfalls solche Gasblasen. Um Probleme zu umgehen, die mit derartigen Gasblasen verbunden sind, kann ein erfindungsgemäßes Gerät auch einen scharfkantigen undurchsichtigen Schwimmer aufweisen, der innerhalb des Fläschchens angeordnet ist. Wenn ein solcher Schwimmer verwendet wird, dann wird die obere Schwimmerkante an einer inneren Glaswand auf den Photodetektor abgebildet.
Die Druckempfindlichkeit eines erfindungsgemäßen Geräts kann durch Verwendung eines optischen Vergrößerungseffekts erhöht werden. Der Abstand zwischen der Lichtquelle und der Fluid- oder Schwimmerkante kann um eine Vielfaches kleiner gemacht werden als der Abstand zwischen dieser Kante und dem Photodetektor.
Eine bevorzugte Lichtquelle weist mehrere beabstandete, horizontal ausgerichtete Glühfäden auf. Eine solche Lichtquelle erlaubt den Betrieb des Füllstandsüberwachungssystems mit verschiedenen in das Fläschchen eingeimpften Blutmengen.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist ein Fläschchen auf, das im Grunde ein Glasröhrchen mit zwei Flanschen ist. Ein unterer Flansch wird durch ein Septum verschlossen, an dem ein Gasbeutel befestigt ist. Der Gasbeutel kann vor dem Verschließen des Fläschchens an dem Septum befestigt werden. Der obere Flansch wird auf die gleiche Weise verwendet wie bei gewöhnlichen Fläschchen, d. h. für das Beimpfen des Mediums mit Blut.
Um die Genauigkeit des optischen Füllstandsüberwachungssystems zu erhöhen, kann der großflächige analoge Photodetektor in zwei vertikale Segmente aufgeteilt werden. Beide Segmente werden mit Durchstrahlungsmasken abgedeckt, die gitterartige horizontale Elemente enthalten. Die gitterartigen Elemente jedes Segments sind relativ zu den Elementen des anderen Segments verschoben. Außerdem weisen die beiden Masken eine leicht unterschiedliche Gesamtdurchlässigkeit auf. Die beiden Photodetektorausgänge sind mit den Eingängen eine Differenzverstärkers verbunden. Wenn sich der Fluidfüllstand bewegt, weist das Ausgangssignal des Verstärkers Schwingungen auf, die den Gitterkonstanten der Masken entsprechen, wodurch ein zeitlicher Trend bezüglich der Gleichstromkomponente des Ausgangssignals entsteht. Dieser Trend weist nach, ob der Fluidfüllstand steigt oder fällt, d. h. ob der Druck abnimmt oder zunimmt. Auf diese Weise wird die Linearität des Füllstandsüberwachungssystem durch die Masken festgelegt und kann sehr hoch sein. Es ist auch möglich, anstelle des großflächigen Photodetektors eine lineare Photodetektormatrix zu verwenden.
Außer einer Glühlampe sind andere Lichtquellen akzeptierbar, die eine äußerst schmale aktive Emissionsfläche aufweisen. Dazu gehören Lichtemitterdioden-Chips und Diodenlaser. Diese letzteren Lichtquellen ergeben eine sehr scharfkantige Abbildung und folglich ein hohes Auflösungsvermögen.
Nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein Kulturmedium und eine Blutprobe in ein verschließbares Glasfläschchen eingebracht. Das Fläschchen ist schwenkbar montiert. Die normalerweise inkompressible Fluidsuspension wird kompressibel gemacht. Im allgemeinen wird mindestens ein unvollständig aufgeblasener Gasbeutel auf einer Seite des Drehpunkts des Fläschchens unter den oberen Fluidfüllstand eingetaucht. Biologische Aktivitäten innerhalb des Blutkulturmediums, wie z. B. Bakterienwachstumsprozesse, führen zu einer Druckänderung im Kopfraum des Fläschchens. Diese Druckänderung wird durch das Fluid auf das Gas innerhalb des Gasbeutels übertragen, wodurch sich dessen Volumen ändert. Wegen der Volumenänderung des Gases im Gasbeutel bewegt sich Fluid von einer Seite des Fläschchens zur anderen, und das Drehmoment des Fläschchens ändert sich. Daher können biologische Aktivitäten, wie z. B. Bakterienwachstum, durch Überwachen des Fläschchendrehmoments nachgewiesen werden, z. B. unter Verwendung eines einfachen Kraftsensors.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die verschiedenen Merkmale, Aufgaben. Vorteile und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden beim Durchlesen der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen zusammen mit den beigefügten Ansprüchen in Verbindung mit den Zeichnungen offenbar, wobei gleiche Bezugszeichen einander entsprechende Komponenten kennzeichnen: Dabei zeigen:
Fig. 1 eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der die Fluid- Gas-Grenzfläche in der Nähe des Photodetektors abgebildet ist;
Fig. 2 eine Ausführungsform, welche die optische Vergrößerung durch Abbildung der Fluid-Gas-Grenzfläche in der Nähe der Lampe auf den Photodetektor ausnutzt;
Fig. 3 eine ähnliche Ausführungsform wie Fig. 2, aber mit einer Lichtquelle mit mehreren Glühfäden;
Fig. 4 eine Ausführungsform mit Verwendung eines ausgedehnten Gasbeutels zur Erhöhung der Druckempfindlichkeit und eines undurchsichtigen Schwimmers, um eine Verschlechterung der Druckauflösung durch Gasblasen an der Fluid-Gas- Grenzfläche zu vermeiden;
Fig. 5 eine Ausführungsform, die auf einem Fläschchen mit zwei Flanschen basiert, wobei der Gasbeutel am unteren Flansch befestigt ist;
Fig. 6 eine Detektoranordnung mit zwei großflächigen Photodetektoren, die mit gitterartigen Durchstrahlungsmasken abgedeckt und an einen Differenzverstärker angekoppelt sind;
Fig. 7 ein berechnetes Diagramm, das ein oszillierendes Ausgangssignal und die vom Fluidfüllstand abhängige Gleichstromkomponente darstellt, die man unter Verwendung der in Fig. 6 dargestellten Detektoranordnung erhalten kann;
Fig. 8 ein Diagramm des Ausgangssignals, das man unter Verwendung der Ausführungsform gemäß Fig. 2 für periodische Druckänderungen von 8 cm Wassersäule erhält;
Fig. 9 die Reaktion eines Systems nach der Ausführungsform von Fig. 2 auf starke äußere mechanische Stöße gegen das Fläschchen;
Fig. 10 das Ausgangssignal eines Geräts nach Fig. 2 für Druckschritte von 1 cm Wassersäule innerhalb des Bereichs von -5 cm bis +26 cm relativ zum Raum- bzw. Umgebungsdruck;
Fig. 11 ein Gerät zum Nachweis von biologisch aktiven Medien gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform, die einen Kraftsensor enthält.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Eine Ausführungsform eines Nachweisgeräts 20, das die Grundgedanken und Vorstellungen der vorliegenden Erfindung verkörpert, ist schematisch in Fig. 1 abgebildet. Das offenbarte Gerät weist ein Glasfläschchen 22 mit zwei Seitenwänden 24 und 25, einem Boden 28 und einer Öffnung 30 auf, die mit einem Septum 32 verschlossen ist. Das Fläschchen 22 enthält ein zusammengesetztes Gemisch 34 aus Medium und Blut, mit einem Kopfraum 36. Das normalerweise inkompressible Fluid wird durch Verwendung eines Gasbeutels 38, der unterhalb des oberen Füllstands 40 des Gemischs 34 angeordnet ist, d. h. unterhalb der Fluid- Gas-Grenzfläche. Es ist zwar ein Gasbeutel dargestellt, aber es ist auch möglich, mehrere kleine Gasbeutel oder kompressible Teilchen in das Gemisch einzubringen und dann zu befestigen, z. B. durch ein Kunststoffnetz. Um den Fluidfüllstand innerhalb des Fläschchens 22 zu überwachen, ist eine Einzelfadenlichtquelle 42 in unmittelbarer Nähe der Wand 24 angeordnet, und ein großflächiger Photodetektor 44 ist in unmittelbarer Nähe der Wand 26 angeordnet. Der Photodetektor 44 kann eine Photodiode sein. Die Lichtquelle 42 und der Photodetektor 44 sind so angeordnet, daß eine Kante bzw. ein Rand 46 des Fluids, die Fluid-Gas-Grenzfläche am inneren Umfang 48 der Wand 26, als Schatten auf den Photodetektor 44 abgebildet wird. Wenn sich der Füllstand des Gemischs 34 ändert, dann wird auch der prozentuale Anteil der Photodetektorfläche, der Licht von der Lichtquelle empfängt, beeinflußt, wodurch ein verändertes Photostrom-Ausgangssignal entsteht. So kann der Druck innerhalb des Fläschchens 22 durch Aufzeichnen des Photodetektor-Ausgangssignals überwacht werden. Andere Verfahren, einschließlich eines Linsensystems, können gleichfalls verwendet werden.
Das Nachweisgerät 20 weist außerdem ein Farbfilter 50 auf, das zwischen der Lichtquelle 42 und dem Photodetektor 44 angeordnet ist. Es wird verwendet, um die Kantenwirkung der Fluid-Gas-Grenzfläche zu erhöhen. Die Lichtquelle 42, der Photodetektor 44 und das Filter 50 bilden das Füllstandsüberwachungssystem des Nachweisgeräts 20. Bekannt ist, daß Blut im roten Spektralbereich einer geringere Absorption aufweist als im grünen/blauen Bereich. Daher ist das Filter 50 ein Kurzwellendurchlaßfilter mit einer Grenzwellenlänge von höchstens etwa 600 nm.
Die Funktion des Gasbeutels 38 wird in Verbindung mit der folgenden bekannten Gleichung erläutert:
pV = mRT (1)
In (1) sind das Gasbeutelvolumen V, der Gasdruck p im Gasbeutel und die Gastemperatur T im Gasbeutel voneinander abhängige Parameter. Die Masse des im Gasbeutel eingeschlossenen Gases wird durch m bezeichnet, während R die universelle Gaskonstante ist. Eine mit Bakterienwachstum zusammenhängende Druckänderung innerhalb des Kopfraums 36 wird auf den Gasbeutel 38 übertragen und führt zu einer Volumenänderung dV des Gasbeutels. Bei konstanter Temperatur läßt sich aus Gleichung (1) die folgende druckbezogene Volumenänderung ableiten:
Wenn man annimmt, daß der Gasbeutel eine Querschnittsfläche A, die mit der inneren Querschnittsfläche des Fläschchens identisch ist, und eine Höhe h aufweist, dann führt eine Änderung des Gasbeutelvolumens V = Ah zu einer Änderung dh des oberen Fluidfüllstands, die durch die folgende Gleichung gegeben ist:
In Fig. 1 hat der Luftbeutel 38 tatsächlich eine Querschnittsfläche A, die mit der inneren Querschnittsfläche A des Fläschchens 22 identisch ist. Gleichung (3) zeigt, daß die druckbezogene Änderung des Fluidfüllstands dh von der Querschnittsfläche des Fläschchens unabhängig, aber proportional zur Höhe des Gasbeutels ist. Es wird angenommen, daß Bakterien einen Druckanstieg von typischerweise +20 cm Wassersäule erzeugen. Daher wird für einen Gasbeutel von 3 cm Höhe eine Abnahme des Fluidfüllstands um 0,6 mm erwartet, wobei für den Gasbeutel ein Druck p = 1000 cm Wassersäule angenommen wird, der annähernd gleich dem Atmosphärendruck ist.
Der Gasbeutel 38 muß nicht aus elastischem Material bestehen. Es ist nicht das Material des Gasbeutels, sondern das darin eingeschlossene Gas, das als eine nahezu ideale "Volumenfeder" wirkt. Diese Tatsache ermöglicht eine hervorragende Langzeitstabilität der erfindungsgemäßen Drucksensoranordnung. Bakterien können auch einen vorübergehenden Druckabfall hervorrufen, der jedoch zu einer Ausdehnung der Gase innerhalb des Gasbeutels 38 führt. Infolgedessen sollte der Gasbeutel 38 unvollständig mit Gas gefüllt sein, um mögliche Ausdehnungen des Gasvolumens zuzulassen.
Fig. 2 veranschaulicht eine Anordnung, die einen optischen Vergrößerungseffekt ausnutzt. Das Nachweisgerät 60 ist dem Gerät 20 sehr ähnlich. Es weist ein Glasfläschchen 22 mit zwei Seitenwänden 24 und 26, einem Boden 28 und einer Öffnung 30 auf, die mit einem Septum 32 verschlossen ist. Das Fläschchen 22 enthält ein zusammengesetztes Medium/Blut-Gemisch 34 mit einem Kopfraum 36. Unterhalb des oberen Füllstands 40 des Gemischs 34 ist ein Gasbeutel 38 angeordnet. Das Füllstandnachweissystem mit einer Lichtquelle 42, einem Photodetektor 44 und einem Filter 50 kann ebenfalls das gleiche System sein. Die Anordnung der Lichtquelle, des Photodetektors und des Filters ist jedoch unterschiedlich. Wenn der Abstand zwischen der Lichtquelle 42 und dem linken Fluidrand 62 zehnmal kleiner ist als der Abstand von diesem Rand zum Photodetektor 44, dann beträgt die optische Vergrößerung x10. Das heißt, daß ein Gasbeutel von 3 cm Höhe bei einer Druckänderung von 20 cm Wassersäule eine Verschiebung des Dunkel-Hell-Übergangs am Photodetektor um 6 mm erzeugt.
Fig. 3 zeigt eine Anordnung 70, die derjenigen in Fig. 2 sehr ähnlich ist. Sie weist ein Glasfläschchen 22 mit zwei Seitenwänden 24 und 26, einem Boden 28 und einer Öffnung 30 auf, die durch ein Septum 32 verschlossen ist. Das Fläschchen 22 enthält ein zusammengesetztes Medium/Blut-Gemisch 34 mit einem Kopfraum 36. Der Gasbeutel 38 ist unterhalb des oberen Füllstands 40 des Gemischs 34 angeordnet. Der Photodetektor 44 und das Filter 50 können ebenfalls die gleichen sein. Die Einzelfadenlichtquelle 42 ist jedoch durch eine Mehrfadenlichtquelle 72 ersetzt, um das System an unterschiedliche Blutvolumina anzupassen. Die Lichtquelle 72 weist horizontal ausgerichtete Glühfäden 74 auf, die parallel zueinander angeordnet sind und um etwa 1 bis 2 mm gegeneinander verschoben sind. Die Lichtquelle 72 ermöglicht den Betrieb des Füllstandsüberwachungssystems für unterschiedliche, in das Fläschchen 22 eingeimpfte Blutmengen. Im Betrieb aktiviert eine Gerätesteuereinrichtung 76, wie z. B. ein Computer, zuerst den obersten Glühfaden 74. Dies kann zu einem maximalen Photostrom-Ausgangssignal führen, wenn das Gemisch 34 nicht einen Teil des Lichts blockiert. In einem nächsten Schritt schaltet die Steuereinrichtung 76 den ersten Glühfaden aus und schaltet den nächstunteren Glühfaden ein. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis das Photostrom-Ausgangssignal des Photodetektors 44 einen Pegel erreicht, der annähernd 50% des maximalen Photostroms beträgt, d. h. den optimalen Arbeitszustand für das Füllstandsüberwachungssystem. Für die nächste Ablesung startet die Steuereinrichtung 76 mit dem vorher optimalen Glühfaden. Für ein typisches Fläschchen, wie z. B. ein BACTEC-Fläschchen, werden 5 ml Blut empfohlen. Wenn ein möglicher Bereich von 3 ml bis 7 ml angenommen wird, könnte der Fluidfüllstand in Fläschchen mit einem Innendurchmesser von 39 mm um 3,4 mm variieren. Das heißt, daß nur wenige Glühfaden 74 erforderlich wären. Lampen mit linienförmigen Glühfaden können ein intensives Licht emittieren. Die Absorption des Glasfläschchens 22 im grünen/blauen Spektralbereich ist ziemlich niedrig. Daher können relativ billige Photodetektoren, wie z. B. pn-Photodioden, verwendet werden, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
Neben einer Glühfadenlampe sind andere geeignete Lichtquellen diejenigen, die eine äußerst schmale aktive Emissionsfläche aufweisen. Dazu gehören Leuchtdioden-Chips und Diodenlaser. Diese letzteren Lichtquellen ergeben eine sehr scharfkantige Abbildung und folglich eine hohes Auflösungsvermögen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Nachweisvorrichtung 90, ist in Fig. 4 dargestellt. Sie weist ein Glasfläschchen 92 mit zwei Seitenwänden 94 und 96, einem Boden 98 und einer Öffnung 100 auf, die mit einem Septum 102 verschlossen ist. Das Fläschchen 92 enthält ein zusammengesetztes Medium/Blut-Gemisch 104 mit einem Kopfraum 106. Unterhalb des oberen Füllstands 110 des Gemischs 104 ist ein Gasbeutel 108 angeordnet. Eine Mehrfadenlichtquelle 72 und ein Photodetektor 44 sind gleichfalls dargestellt.
Das Fläschchen 92 hat eine größere Höhe. Infolgedessen ist der Gasbeutel 108 größer, was zu einer besseren Auflösung der Druckänderung führt. Unter der Annahme einer Gasbeutelhöhe von 6 cm erhält man eine Verschiebung des Dunkel- Hell-Übergangs am Photodetektor von 12 mm für eine Druckänderung von 20 cm Wassersäule. Mit anderen Worten, Fläschchen mit größerer Höhe bieten eine Möglichkeit, die zum Nachweis von Bakterienwachstum notwendige Zeit zu verkürzen.
Es ist bekannt, daß an der Fluid-Gas-Grenzfläche Gasblasen auftreten, besonders wenn ein Fläschchen geschüttelt wird. Bestimmte Formen von Mikroorganismen erzeugen ebenfalls solche Gasblasen. Um mit solchen Blasen verbundene Probleme zu umgehen, weist das Nachweisgerät 90 einen scharfkantigen ringförmigen Schwimmer 112 auf, der über dem oberen Füllstand 110 des Gemischs 104 angeordnet ist. Wenn ein derartiger Schwimmer verwendet wird, dann wird die Schwimmerkante 114 auf den Photodetektor 44 abgebildet. Bei Verwendung eines Schwimmers ist kein im kurzwelligen Bereich durchlässiges Farbfilter notwendig. Stattdessen ist das Filter 116 ein Schmalbandfilter, welches das von der Lichtquelle 72 kommende Licht durchläßt. Ein solches Filter ist vorteilhaft, um zu verhindern, daß unerwünschte Hintergrundstrahlung den Photodetektor 44 erreicht. Ein Schmalbandfilter ist äußerst wirksam, wenn die Lichtquelle 72 schmalbandige Leuchtdioden-Chips oder Diodenlaser aufweist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist durch das Nachweisgerät 130 von Fig. 5 dargestellt. Diese Anordnung weist ein Fläschchen 132 mit einem Medium/Blut-Gemisch 133 auf, wobei das Fläschchen im Grunde ein Glasröhrchen 134 mit zwei Flanschen 136 und 138 ist. Der untere Flansch 136 ist mit einem Septum 140 verschlossen, das einen Gasbeutel 142 trägt. Der Gasbeutel 142 kann vor dem Verschließen des Fläschchens 132 an dem Septum 140 befestigt werden. Ein Septum 144 verschließt den oberen Flansch 138 und erzeugt einen Kopfraum 146. Diese Ausführungsform der Erfindung ist vorteilhaft im Hinblick auf ein einfaches Zusammensetzen des Blutfläschchens bei einer Massenproduktion. Das Füllstandserfassungssystem 148 ist identisch mit dem von Fig. 4, ebenso wie die Verwendung des Schwimmers 112.
Wie oben festgestellt, erzeugt jede Temperaturänderung, die im Kopfraum des Fläschchens auftritt, auch eine Druckänderung. Offensichtlich ist diese Druckänderung nicht mit einem Bakterienwachstum verbunden. Daher wäre eine zusätzliche Messung der Kopfraumtemperatur erforderlich, um zwischen Bakterienwachstumseffekten und Temperatureffekten zu unterscheiden. Die nichtinvasive Überwachung der Kopfraumtemperatur stellt jedoch ein äußerst schwieriges Problem dar und muß noch auf praktische Weise gelöst werden.
In einem erfindungsgemäßen Gerät ist jedoch tatsächlich keine Überwachung der Kopfraumtemperatur erforderlich. Gleichung (1) läßt sich wie folgt umformen:
In (4) ist p die Gasdichte innerhalb des Kopfraums. Für die temperaturbezogene Druckänderung erhält man aus Gleichung (4):
Gleichung (5) zeigt, daß die temperaturbezogene Druckänderung dp nicht von p oder V abhängig ist, sondern nur von der Gasdichte abhängt. Das heißt, daß für den Kopfraum und für den Gasbeutel die gleiche temperaturbezogene Druckänderung realisiert wird, wenn die Gasdichten gleich sind. Daher ändert sich der obere Fluidfüllstand in dem Blutkulturfläschchen nicht infolge von Gesamttemperaturänderungen innerhalb des Geräts, und es ist keine Temperaturüberwachung erforderlich.
Damit diese Annahme äußerst genau ist, sollte sich der Gasbeutel in Flächenkontakt mit dem inneren Umfang der Seitenwände des Fläschchens befinden. Auf diese Weise beeinflussen Temperaturänderungen, die sich auf den Kopfraum auswirken, in gleichem Maße die Gase innerhalb des Gasbeutels. Ungenaue Ergebnisse sind möglich, wenn sich ein Teil des Medium/Blut-Gemischs zwischen dem Gasbeutel und den Seitenwänden des Fläschchens befindet, da die momentane Temperatur unter Umständen nicht die gleiche ist. In der Praxis lag die Dichte der atmosphärischen Luft innerhalb des Gasbeutels im allgemeinen ausreichend nahe bei der Dichte der Gase im Kopfraum, so daß kein spezielles Gasgemisch für den Gasbeutel erforderlich war. Ein solches spezielles Gemisch kann jedoch leicht hergestellt und in dem Gasbeutel verwendet werden.
Fig. 6 zeigt eine Photodetektoranordnung 160, die verwendet werden kann, um die Genauigkeit des optischen Füllstandsüberwachungssystems zu erhöhen. Ein großflächiger Photodetektor 162 ist in zwei vertikale Segmente 164 und 166 aufgeteilt. Die Segmente 164 und 166 sind mit Durchstrahlungsmasken 168 und 170 abgedeckt, die eine Vielzahl von gleichmäßig beabstandeten, gitterartigen horizontalen Elementen 172 und 174 enthalten. Die Gitter 172 und 174 sind gegeneinander um eine halbe Gitterkonstante verschoben, wobei die Gitterkonstante gleich dem Abstand zwischen zwei benachbarten horizontalen Gitterelementen ist. Außerdem weisen die Masken 168 und 170 eine leicht unterschiedliche Gesamtdurchlässigkeit auf. Die beiden Photodetektorausgänge 176 und 178 sind mit Eingängen eines Differenzverstärkers 180 verbunden, der ein Ausgangssignal 182 aufweist. An die Photodetektoreingänge 186 und 188 wird eine Vorspannung 184 angelegt.
Wenn sich der Füllstand 190 des Mediums 192 bewegt, weist das Ausgangssignal 182 Schwingungen auf, die der Gitterkonstante der Maske entsprechen. Die Überwachung der Ausgangssignalschwingungen ermöglicht eine hohe Druckauflösung. Auf diese Weise wird die Linearität des Füllstandsüberwachungssystems durch die Masken 168 und 170 bestimmt und ist sehr hoch. Zusätzlich zu dem Schwingungsverhalten zeigt das Ausgangssignal einen Trend, der die Gleichstromkomponente des Ausgangssignals betrifft. Dieser Trend zeigt an, ob der Füllstand 190 steigt oder fällt, d. h. ob der Druck abnimmt oder zunimmt.
Die Lichtdurchlässigkeit der beiden gitterartigen Masken 168 und 170 läßt sich durch die folgende Gleichung annähern:
T&sub1;(h) = A [1 + R sin(kh-θ)] (6)
und
T&sub2;(h) = B [1 + S sin(kh)] (7)
wobei A und B die mittlere Durchlässigkeit, R und S die Modulation der Maskendurchlässigkeit bedeuten, k für 2π/M steht, wobei M die Gitterkonstante ist, und h den Füllstand bezeichnet. Die relative Verschiebung der Maske wird durch θ bezeichnet und ist auf π festgesetzt. θ stellt die Phasenverschiebung zwischen den Sensoren dar. Durch Positionieren der horizontalen Gitterelemente 172 und 174, wie oben erörtert, beträgt die Phasenverschiebung zwischen ihnen π Radian oder 180º. Auf diese Weise wird die Differenz zwischen den beiden Photoströmen von den Masken 168 bzw. 170 für sehr geringe Änderungen des Fluidfüllstandes maximiert.
Der vom Fluidfüllstand abhängige Photostrom I(h) ist durch die folgende Gleichung gegeben:
In(h) = &sub0;hJ&sub0;Tn(h')dh' (8)
wobei J&sub0; die Systemkonfiguration einschließlich der Lichtausgangsleistung der Lichtquelle, der Geometriefaktoren, der optischen Filter und der Ansprechempfindlichkeit des Photodetektors charakterisiert. Der Index n kann entweder 1 oder 2 sein und bezieht sich auf die beiden Detektorsegmente. Die durch den Differenzverstärker gemessene Photostromdifferenz ΔI ist durch die folgende Gleichung gegeben:
Fig. 7 zeigt die nach Gleichung (9) berechnete Photostromdifferenz für spezifische Durchlässigkeits- und Modulationswerte. In dem dargestellten Diagramm ist die mittlere Lichtdurchlässigkeit A der Maske 168 gleich 0,500, und die Maske 170 weist eine mittlere Durchlässigkeit B von 0,485 auf. Daher unterscheiden sich die Masken in ihrer Durchlässigkeit um 3%. Die Durchlässigkeitsmodulation R und S für beide Masken wird mit 0,900 angenommen. Die Gitterkonstante M beträgt 0,2 mm. Fig. 7 läßt darauf schließen, daß durch Einführen der Masken 168 und 170 Änderungen des Fluidfüllstandes von weniger als 0,2 mm mühelos erfaßt werden können. Durch Verwendung von Computeranalyseverfahren können ein hohes Auflösungsvermögen, eine gute Linearität und ein großer dynamischer Bereich erreicht werden. Die sinusförmigen Wellen erzeugen eine Einhüllende. Aus ihren Spitzenwerten läßt sich ermitteln, um wieviel sich der Fluidfüllstand geändert hat. Gleichzeitig kann durch Messung des mittleren ΔI der mittlere Druck berechnet werden. Der mittlere Druck kann Auskunft über den Bakterientyp geben.
Die Masken können in Massenproduktion mit der erforderlichen Genauigkeit und zu niedrigen Kosten unter Anwendung bekannter photographischer Techniken hergestellt werden. Es ist auch möglich, anstelle eines großflächigen analogen Photodetektors eine lineare Photodetektormatrix zu verwenden.
Fig. 8 zeigt ein Diagramm des Photodetektor-Ausgangssignals in Abhängigkeit von der Zeit, das von einem Nachweisgerät 60 gemäß Fig. 2 gewonnen wurde. Es wurden periodische Druckänderungen von 8 cm Wassersäule eingeführt.
Fig. 9 zeigt die Registrierkurve von einem Nachweisgerät 60 gemäß Fig. 2 in Form einer Druckänderung in Abhängigkeit von der Zeit. Das Fläschchen 22 wurde starken, aber kurzen äußeren mechanischen Stößen ausgesetzt.
Fig. 10 zeigt das Ausgangssignal von einem Nachweisgerät 60 gemäß Fig. 2. Es wurden Druckschritte von 1 cm Wassersäule innerhalb des Bereichs von -5 cm bis +26 cm, bezogen auf Atmosphärendruck, eingeführt.
Ein Nachweisgerät 200, das die Grundgedanken und Vorstellungen der vorliegenden Erfindung durch ein anderes Meßverfahren realisiert, ist schematisch in Fig. 11 abgebildet. Das Gerät weist ein Glasfläschchen 202 auf, das mit einem Gummiseptum 204 verschlossen ist und einen Rahmen 206 enthält, der einen unvollständig aufgeblasenen Gasbeutel 208 aufnimmt. Das Fläschchen 202 nimmt ein Medium/Blut-Gemisch 210 auf, das den Rahmen 206 durchdringt, so daß der Gasbeutel 208 vollständig von Fluid umgeben ist. Der Kopfraum 212 des Fläschchens erstreckt sich über die gesamte Strecke vom Gummiseptum 204 bis zum Boden 214 des Fläschchens 202.
Das Fläschchen 202 ist innerhalb einer Buchse 216 montiert und wird durch eine Blattfeder 218 in Position gehalten. Die Buchse 216 ist über ein Kipplager 222 mit einem Lagerbock 220 verbunden, und der Lagerbock 220 ist auf eine Grundplatte 224 montiert. Der Taststift 226 eines Kraftsensors 230 geht durch eine Öffnung 228 in der Grundplatte 224 hindurch und dient zur Überwachung des Drehmoments des Fläschchens.
Wie oben in Gleichung (2) gezeigt, ist die druckbezogene Volumenänderung dV proportional zum Volumen U des Gasbeutels. Es ist zu erwarten, daß Bakterien typischerweise einen Druckanstieg von +20 cm Wassersäule erzeugen. Daher wird für einen Gasbeutel von 36 ml Volumen eine Volumenänderung von 0,72 ml erwartet, wenn man für das Gas im Gasbeutel einen Druck p = 1000 cm Wassersäule annimmt, der annähernd gleich dem Atmosphärendruck ist. Eine Fluidmenge mit einem Volumen dV/2 bewegt sich von einer Seite des Fläschchens 202 zur anderen Seite und erzeugt eine Drehmomentänderung des Fläschchens. Auf diese Weise wird auch der Fluidfüllstand zumindest indirekt geändert.
Um die erwartete, mit dem Bakterienwachstum verbundene Drehmomentänderung abzuschätzen, wird ein stabförmiger Gasbeutel mit der Länge L und der Querschnittsfläche A angenommen, der sich von dem Kipplager 222 bis zum Boden 214 des Fläschchens 202 erstreckt. Außerdem wird angenommen, daß die Volumenänderung dV des Gasbeutels zu einer konstanten Querschnittsänderung dA führt, die von dem Abstand l vom Kipplager 222 unabhängig ist. Gestützt auf diese Annahmen, wird die Drehmomentänderung dM des Fläschchens wie folgt berechnet:
dM = ½ &sub0;Lρg dA l dl = ¼ρg dV L (10)
wobei ρ die Dichte des Fluids und g die Schwerebeschleunigung von 9,81 m/s² ist. In Gleichung (10) ergibt sich der Faktor 1/2 vor dem Integral aus der Tatsache, daß nur die Hälfte des sich bewegenden Fluids das Kipplager überquert.
Die Kraftänderung dF, gemessen durch den Kraftsensor 230 in einem Abstand l vom Kipplager 222, ist durch die folgende Gleichung gegeben:
Gleichung (11) zeigt, daß für L/l = 4 die erwartete Kraftänderung dF gleich dem Gewicht eines Fluids mit dem Volumen dV = 0,720 ml ist. Gleichung (11) zeigt außerdem, daß dF von L/l abhängt, aber vom Absolutwert von L unabhängig ist. Daher benötigt ein erfindungsgemäßes Gerät nicht unbedingt Fläschchen von größerer Länge.
Auch bei dieser Ausführungsform ergibt sich die gleiche temperaturbezogene Druckänderung für den Kopfraum 212 und den Gasbeutel 208, wenn die Gasdichten einander gleich sind. Bei gleichen Gasdichten bewegt sich aufgrund von Änderungen der Gesamttemperatur in der Detektorvorrichtung 200 kein Fluid über das Kipplager 222, und es ist keine Temperaturüberwachung erforderlich.
Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung würde die Notwendigkeit einer Vorrichtung zum Messen des Drehmoments beseitigen. Das Fläschchen 202 kann bezüglich des Lagers 222 so eingestellt werden, daß ein exakter Gleichgewichtszustand erreicht wird. Ausgehend von diesem Gleichgewichtszustand wird eine sehr feine Verstimmung so ausgeführt, daß die Seite des Fläschchens, die den Gasbeutel nicht enthält, soweit abgesenkt wird, bis sie in Kontakt mit einer Grundplatte kommt. Die Grundplatte 224 kann so aufgestellt werden, daß nur ein relativ kleiner Neigungswinkel erreicht wird. In diesem Zustand führt ein mit Bakterienwachstum verbundener Druckanstieg dazu, daß sich das Fluid zur angehobenen Seite des Fläschchens hin bewegt. Sobald diese Seite schwerer wird als die ursprünglich gekippte Seite, kippt sie statt dessen nach unten.
Auf diese Weise ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Gerät zu konstruieren, das ganz ohne Elektrizität eingesetzt werden kann.
Somit sind zwar die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben worden, um einen Fachmann in die Lage zu versetzen, die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung in die Praxis umzusetzen; es versteht sich aber, daß Abänderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geltungsbereich und der Absicht der vorliegenden Erfindung abzuweichen, wie in den nachstehenden Ansprüchen definiert. Dementsprechend ist die vorliegende Beschreibung als Angabe von Beispielen gedacht und sollte nicht zur Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung verwendet werden. Der Schutzumfang und die Erfindung sind nur durch Bezugnahme auf die nachstehenden Ansprüche festzulegen.

Claims

1. Gerät zum Nachweis von Mikroorganismen in Fluidproben, welches aufweist:

mindestens einen hermetisch verschließbaren Behälter mit einem fluiden Medium und einem gasförmigen Kopfraum über einer Fluid-Gas-Grenzfläche, wobei der Behälter zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Mikroorganismen eingerichtet ist;

mindestens eine in das Medium eingetauchte kompressible Einrichtung;

eine Meßeinrichtung zur Bestimmung der Stärke der Fluidbewegung, die aus den mit dem Wachstum von Mikroorganismen verbundenen Druckänderungen innerhalb des Kopfraums resultiert.

2. Gerät nach Anspruch 1, wobei die Meßeinrichtung zur Bestimmung der Änderung des Fluidfüllstands verwendet wird.

3. Gerät nach Anspruch 1, wobei die kompressible Einrichtung einen mindestens teilweise gefüllten Gasbeutel aufweist.

4. Gerät nach Anspruch 3, wobei der Behälter eine Glasröhre mit einem unteren und einem oberen Flansch aufweist, wobei der untere Flansch hermetisch mit einem ersten Septum verschlossen ist, an dem der Gasbeutel befestigt ist, und wobei der obere Flansch hermetisch mit einem zweiten Septum verschlossen ist.

5. Gerät nach Anspruch 1, wobei die Dichte der kompressiblen Einrichtung gleich der Dichte des gasförmigen Kopfraums ist.

6. Gerät nach Anspruch 2, wobei die Meßeinrichtung ein optisches Füllstandüberwachungssystem aufweist, das eine Lichtquelle und einen Photodetektor mit einer Fläche zum Empfang des von der Lichtquelle erzeugten Lichts einschließt, wobei der Behälter, die Lichtquelle und der Photodetektor so angeordnet sind, daß sich bei einer Füllstandsänderung des Mediums der prozentuale Anteil des Lichts von der Lichtquelle, der auf die Fläche des Photodetektors abgebildet wird, gleichfalls ändert und ein Ausgangssignal des Photodetektors beeinflußt.

7. Gerät nach Anspruch 6, wobei an der Fluid-Gas-Grenzfläche ein Schwimmer angebracht ist, wobei die Lichtquelle und der Photodetektor so angeordnet sind, daß das Licht von der Lichtquelle eine Schwimmerkante schneidet.

8. Gerät nach Anspruch 6, wobei die Lichtquelle mehrere horizontal ausgerichtete, voneinander beabstandete Fäden aufweist, wobei eine Gerätesteuereinrichtung verwendet wird, um die Fäden selektiv zu aktivieren, bis einer der Fäden bewirkt, daß das Ausgangssignal des Photodetektors annähernd seinen halben Maximalwert annimmt.

9. Gerät nach Anspruch 6, wobei der Photodetektor zwei vertikale Segmente aufweist, wobei jedes der Segmente mit einer Durchstrahlungsmaske abgedeckt ist und mehrere gitterartige Elemente aufweist, wobei die Elemente eines der Segmente relativ zu den Elementen des anderen Segments verschoben sind.

10. Gerät nach Anspruch 9, wobei die Elemente gleichmäßig voneinander beabstandet sind, und wobei die Elemente des einen Segments relativ zu den Elementen der anderen Struktur um eine halbe Gitterkonstante verschoben sind.