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DE69304685T2 - Verfahren zur behandlung infizierter gewebe - Google Patents

Verfahren zur behandlung infizierter gewebe

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DE69304685T2
DE69304685T2 DE69304685T DE69304685T DE69304685T2 DE 69304685 T2 DE69304685 T2 DE 69304685T2 DE 69304685 T DE69304685 T DE 69304685T DE 69304685 T DE69304685 T DE 69304685T DE 69304685 T2 DE69304685 T2 DE 69304685T2
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DE
Germany
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liposomes
lipid
liposome
peg
gentamicin
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DE69304685T
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Irma A J M Bakker-Woudenberg
Francis J Martin
Martin C Woodle
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Alza Corp
Original Assignee
Sequus Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07FACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02Phosphorus compounds
    • C07F9/547Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/5537Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom the heteroring containing the structure -C(=O)-N-C(=O)- (both carbon atoms belong to the heteroring)

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Description

    1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Liposomenzusammensetzung und ein Verfahren, insbesondere für die Verwendung bei Konzentrationstherapeutika an Stellen von Gewebeinfektionen, wie sie z. B. durch das Eindringen von Bakterien hervorgerufen werden.
  • 2. Literaturverzeichnis
  • Allen, T. M. (1981), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 640, S. 385-397.
  • Allen, T. M., und Everest, J. (1983), J. Pharmacol. Exp. Therap., Bd. 226 , S. 539-544.
  • Altura, B. M. (1980), Adv. Microcirc., Bd. 9, S. 252-294.
  • Alving, C. R. (1984), Biochem. Soc. Trans., Bd. 12, S. 342-344.
  • Ashwell, G., und Morell, A. G. (1974), Adv. Enzymology, Bd. 41, S. 99-128.
  • Bakker-Woudenberg, I. J. M., et al. (1990), Liposomes in Drug Delivery: 21 Years on (Abstract).
  • Bartlett, G. R. (1959), J. Biol. Chem., Bd. 234, S. 466-468.
  • Czop, J. K. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, S. 3831.
  • Durocher, J. P., et al. (1975), Blood, Bd. 45, S. 11.
  • Ellens, H., et al. (1981), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 674, S. 10- 18.
  • Fierer, J., Hatlin, L., Lin, J.-P., Estrella, D., Mihalko, P., und Yau-Young, A. (1990), Antimicrob. Agents and Chemother., Bd. 34, S. 343- 348.
  • Gabizon, A., Goren, D., und Barenholz, Y. (1988), Israel J. Med. Sci., Bd. 24, S. 512-517.
  • Gabizon, A., Huberty, J., Straubinger, R. M., Price, D. C., und Papahadjopoulos, D. (1988-1989), J. Liposome Resh., Bd. 1, S. 123-135.
  • Gabizon, A., Shiota, R., und Papahadjopoulos, D. (1989), J. Natl. Cancer Inst., Bd. 81, S. 1484-1488.
  • Gilman, A. G., et al. (1990), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Aufl., Pergamon Press, NY.
  • Gregoriadis, G., und Ryman, B. E. (1972), Eur. J. Biochem., Bd. 24, S. 485-491.
  • Gregoriadis, G., und Neerunjun, D. (1974), Eur. J. Biochem., Bd. 47, S. 179-185.
  • Gregoriadis, G., und Senior, J. (1980), FEBS Lett., Bd. 119, S. 43- 46.
  • Greenberg, J. P., et al. (1979), Blood, Bd. 53, S. 916.
  • Hakomori, S. (1981), Ann. Rev. Biochem., Bd. 50, S. 733-764.
  • Heaton, W. A., Davis, H. H., Welch, M. J., Mathias, C. J., Jolst, J. H., Sherman, L. A., und Siegel, B. A. (1979), Br. J. Haematol., Bd. 42, S. 613-622.
  • Hong, K., Friend, D., Glabe, C., und Papahadjopoulos (1984), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 732, S. 320-323.
  • Hwang, K. J., et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, S. 4030.
  • Jain, K. J. (1989), J. Natl. Can. Inst., Bd. 81, S. 570-576.
  • Jonah, M. M., et al. (1975), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 401, S. 336-348.
  • Juliano, R. L., und Stamp, D. (1975), Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 63, S. 651-658.
  • Karlsson, K. A. (1982), In: Biological Membranes, Bd. 4, D. Chapman (Hrsg.), Academic Press, N.Y., S. 1-74.
  • Kimelberg, H. K., et al. (1976), Cancer Res., Bd. 36, S. 2949-2957.
  • Kirby, C. J., und Gregoriadis (1984), In: Liposome Technology, Bd. 3, G. Gregoriadis (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, FL., S. 19.
  • Lee, K. C., et al., J. Immunology (1980), Bd. 125, S. 86.
  • Lopez-Berestein, G., et al. (1984), Cancer Res., Bd. 44, S. 375-378.
  • Martin, F. J. (1990), In: Spezialiced Drug Delivery Systems - Manufacturing and Production Technology, P. Thyle (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, S. 267-316.
  • Okada, N. (1982), Nature, Bd. 299, S. 261.
  • Papahadjopoulos, D., et al., Sterically Stabilized Liposomes: Improvements in Pharmacokinetics and Anti-Tumor Therapeutic Efficacy, PNAS (1991), im Druck.
  • Poste, G., et al., in "Liposome Technology", Bd. 3, S. 1 (Gregoriadis, G., et al., Hrsg.), CRC Press, Boca Raton (1984).
  • Poznansky, M. J., und Juliano, R. L. (1984), Pharmacol. Rev., Bd. 36, S. 277-336.
  • Richardson, V. J., et al. (1979), Br. J. Cancer, Bd. 40, S. 3543. Saba, T. M. (1970), Arch. Intern. Med., Bd. 126, S. 1031-1052.
  • Schaver, R. (1982), Adv. Carbohydrate Chem. Biochem., Bd. 40, S. 131.
  • Scherphof, T., et al. (1978), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 542, S. 296-307.
  • Senior, J., und Gregoriadis, G. (1982), FEBS Lett., Bd. 145, S. 109- 114.
  • Senior, J., et al. (1985), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 839, S. 1-8.
  • Storm, G., Roerdintz, Steerenberg, P. A., de Jong, W. H., und Crommelin, D. J. A. (1987), Can. Res., Bd. 47, S. 3366-3372.
  • Szoka, F., Jr., et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, S. 4194.
  • Szoka, F., Jr., et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., Bd. 9, S. 467.
  • Tice, T. R., et al. (1984), Pharmaceutical Technology, November 1984, S. 26-35.
  • Weinstein, J. W., et al., Pharmac. Ther., Bd. 24, S. 207 (1984).
  • Weise, D. L., et al., In: Orug Carriers in Biology and Medicine, G. Gregoriadis (Hrsg.), Academic Press, New York, 1979, S. 237-270.
  • Woodle, M. C., et al. (1990). Improved long circulating (StealthR) Liposomes using synthetic liposomes. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., Bd. 17, S. 77.
  • Woodle, M. C., et al. (1991). In vivo Studies of Long Circulating (StealthR) Liposomes in Rats, Period Biol., Bd. 93, S. 349.
  • Woodle, M. C., et al. (1992), Pharm. Res., Bd. 9, S. 260-265.
  • Woodruff, J. J., et al. (1969), J. Exp. Med., Bd. 129, S. 551.
  • 3. Hintergrund der Erfindung
  • Gegenwärtig verfügbare Behandlungspläne für die Behandlung von infizierten Geweben oder Bereichen schreiben die systemische Verabreichung von antimikrobiellen Verbindungen vor, wenn derartige Gewebe nicht ohne weiteres einer topischen Verabreichung zugänglich sind. Es wäre wünschenswert, therapeutische Verbindungen selektiv auf derartige infizierte Bereiche über den Blutstrom zu richten, um toxische Nebenwirkungen zu verringern und die Arzneistoffdosis, die in sicherer Weise an einen infizierten Bereich abgegeben werden kann, zu erhöhen, während andere Körperbereiche von einer Exposition gegenüber derartigen Verbindungen ausgespart werden.
  • Es ist vorgeschlagen worden, Liposomen als Arzneistoffträger für intravenös (IV) verabreichte Verbindungen unter Einschluß bildgebender und therapeutischer Verbindungen zu verwenden. Die Verwendung von Liposomen für die zielgerichtete Verabreichung über den Blutstrom wird jedoch durch die rasche Clearance der Liposomen durch Zellen des retikubendothelialen Systems (RES) stark beschränkt. Typischerweise entfernt das RES 80 bis 95% einer Dosis von IV injizierten Liposomen innerhalb von 1 Stunde, wobei es in Konkurrenz mit der gewählten Zielstelle um die Aufnahme der Liposomen diese wirksam übertrifft. Die liposomale Behandlung von Infektionen ist daher größtenteils auf die Behandlung des retikubendothelialen Systems beschränkt (Fierer).
  • Es berichtet worden, daß die RES-Aufnahme von Liposomen von einer Reihe von Faktoren beeinflußt wird (z. B.: Gregoriadis, 1974; Jonah; Gregoriadis, 1972, Juliano; Allen, 1983; Kimelberg, 1976; Richardson; Lopez- Berestein; Allen, 1981; Scherphof; Gregoriadis, 1980; Hwang; Patel, 1983; Senior, 1985; Allen, 1983; Ellens; Senior, 1982; Hwang; Ashwell; Hakomori; Karlsson; Schauer; Durocher; Greenberg; Woodruff; Czop; und Okada). Kurz gesagt spielen die Liposomengröße, die Ladung, der Grad der Lipidsättigung und Oberflächengruppen eine Rolle bei der Liposomen-Clearance durch das RES. Kein einziger bis heute identifizierter Faktor sorgt jedoch wirksam für eine lange Halbwertszeit im Blut und insbesondere für einen relativ hohen Prozentsatz an Liposomen im Blutstrom 24 Stunden nach der Injektion.
  • Zusätzlich zu einer langen Halbwertszeit im Blut erfordert es die wirksame Arzneistoffabgabe an eine infizierte Stelle über den Blutstrom auch, daß die Liposomen imstande sind, in die kontinuierliche endotheliale Zellschicht und die darunterliegende Basismembran, die die Gefäße, die den Bereich mit Blut versorgen, umgibt, einzudringen. Eine lokale Infektion ist von einem akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems gegenüber Proteinen im Bereich der Infektion begleitet, woran sich eine Wanderung der Neutrophilen aus dem Blutstrom in den infizierten Bereich anschließt. Aufgrund keines dieser Ereignisse läßt sich jedoch die Fähigkeit von Liposomen, durch epitheliale Zellbarrieren und benachbarte Basismembranen zu treten, vorhersagen, da Proteine im allgemeinen wesentlich kleiner als Liposomen sind und da die Neutrophilen spezifische Bindungsstellen und aktive Mechanismen für das Eindringen in die Blutgefäße aufweisen.
  • In der Tat zeigen bisher vorgelegte Studien, daß selbst bei einer Zunahme der Durchlässigkeit der Blutgefäße die Extravasation von herkömmlichen Liposomen durch die Gefäße nicht signifikant ansteigt (Poste). Auf der Basis dieser Befunde wurde geschlossen, daß zwar die Extravasation von Liposomen aus Kapillaren, die von der Erkrankung erfaßt werden, in einem begrenzten Maßstab unterhalb der Nachweisgrenze auftreten kann, daß das therapeutische Potential jedoch minimal wäre (Poste).
  • 4. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Eine allgemeine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Liposomenzusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, die wirksam für die Behandlung einer Infektion, die an einer Stelle lokalisiert ist, die von den fixierten Makrophagen, die sich in der Leber oder Milz befinden, verschieden ist, durch Konzentration der Liposomen und damit einer therapeutischen Verbindung im infizierten Bereich sind, ist.
  • Die Erfindung umfaßt gemäß einem Aspekt ein Verfahren zur Behandlung einer Stelle einer systemischen Infektion, die an einer Gewebestelle lokalisiert ist, wie es vorstehend beschrieben wurde. Das Verfahren umfaßt die parenterale Injektion einer Zusammensetzung von Liposomen, die (i) aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt sind, welche ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid umfassen, das mit einem hydrophilen, biokompatiblen Polymeren von einer Größe und einem Molekülgewicht derivatisiert ist, die wirksam sind, um die Zirkulationszeit im Blut mehrfach gegenüber Liposomen, denen ein derartiges Lipid-derivatisiertes Polymeres fehlt, zu verlängern, die (ii) einen gewählten mittleren Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,20 µm aufweisen und die (iii) eine therapeutische Verbindung, die gegen die Ursache einer Infektion wirksam ist, in Form von Liposomeneinschlüssen enthalten. Die Injektion dieser Zusammensetzung ist wirksam hinsichtlich der Konzentrierung der Liposomen im infizierten Bereich, wobei die therapeutische Verbindung im infizierten Gewebe konzentriert wird.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem hydrophilen Polymeren um Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 5000 Dalton. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymere aus der Gruppe ausgewählt, die aus Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), einem Copolymeren von PGA und PLA und Polyvinylalkohol (PVA) besteht.
  • In Liposomen eingeschlossene therapeutische Verbindungen sind vorzugsweise antimikrobielle Mittel oder Mittel gegen Infektionen unter Einschluß von antibiotischen, fungiziden, antiviralen, antihelminthischen und antiparasitären Mitteln. Für die Verwendung bei einer bakteriellen Infektion handelt es sich bei der therapeutischen Verbindung vorzugsweise um ein Antibiotikum. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen mindestens etwa 60% des antibiotischen Mittels in Form von Liposomeneinschlüssen vor. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem antibiotischen Mittel um ein Aminoglycosid-Antibiotikum, und es liegt eingeschlossen in den Liposomen in einer Konzentration von mehr als 20 µg Verbindung/µMol Liposomenlipid vor.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Behandlung einer Klebsiella-Infektion der Lunge mit Gentamicin angewandt. Das Behandlungsverfahren kann auch bei der Behandlung einer Aspergillus- Infektion der Lunge mit einem Fungizid, wie Amphotericin B, der Behandlung von Bacteroides-Infektionen, wie der Lunge, des Darms, des Hirns oder des Beckens, mit Clindamycin, einem Penicillin, einem Cephalosporin, Metronidazol oder Chloramphenicol, der Behandlung einer Pseudomonas-Infektion der Prostata mit einem Breitband-Penicillin oder der Behandlung von staphylococcaler Endocarditis oder Osteomyelitis mit Vancomycin, einem Penicillin oder einem Cephalosporin angewandt werden. Außerdem können erfindungsgemäß bestimmte virale dermale Infektionen, wie Herpes-Infektionen, unter Anwendung der systemischen Verabreichung einer liposomalen Zusammensetzung von Acyclovir behandelt werden. Die Behandlung von Infektionen, die sich in Leber-Hepatocyten befinden, kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Speziell können Hepatitis B oder C mit liposomalen Zusammensetzung eines DNA-Polymerase-Inhibitors, wie Zidovudine, behandelt werden. Außerdem kann das Behandlungsverfahren zur systemischen Behandlung bestimmter Infektionen des zentralen Nervensystems angewandt werden, wenn die Blut-Hirn-Schranke durch eine derartige Infektion durchlässig gemacht wird. Beispiele umfassen die Behandlung von Meningitis aufgrund von Pneumococcus, Pseudomonas, Listeria oder Meningococcus durch ein Penicillin, ein Cephalosporin, Erythromycin oder Gentamicin, die Behandlung von Meningitis, die durch Cryptococcus hervorgerufen wird, durch Amphotericin oder Fluconazol und die Behandlung von Meningitis aufgrund von Hemophilus influenzae oder Streptococcus pneumoniae durch Penicilline, Cephalosporine oder Chloramphenicol.
  • Gemäß einem damit in Verbindung stehenden Aspekt umfaßt die Erfindung auch eine injizierbare Liposomenzusammensetzung für die Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung einer Stelle einer systemischen Infektion, die an einer Gewebestelle lokalisiert ist, die von den fixierten Makrophagenzellen der Leber oder der Milz verschieden ist. Die Zusammensetzung umfaßt Liposomen, die aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt sind, welche ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid umfassen, das mit einem hydrophilen, biokompatiblen Polymeren derivatisiert ist, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Liposomen der Zusammensetzung weisen auch einen ausgewählten mittleren Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,20 µm auf und enthalten in Form von Liposomeneinschlüssen eine therapeutische Verbindung, die gegen die Ursache der Infektion wirksam ist. Derartige Liposomen reichem sich selektiv im infizierten Gewebe an, so daß die therapeutische Verbindung an der Infektionsstelle konzentriert wird.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem hydrophilen Polymeren der Zusammensetzung um ein Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 5000 Dalton. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hydrophile Polymere der Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt, die aus PGA, PLA, einem Copolymeren aus PGA und PLA sowie PVA besteht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Aminoglycosid-Antibiotikum. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung Gentamicin und wird für die Behandlung einer Infektion der Lunge verwendet.
  • Gemäß einem damit im Zusammenhang stehenden Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels gegen Infektionen oder eines antimikrobiellen Mittels für die Lokalisierung in einem infizierten Bereich des Gewebes durch intravenöse Injektion. Das Verfahren umfaßt das Einschließen des Mittels in einer Liposomenzusammensetzung, wie es vorstehend beschrieben wurde.
  • Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung sind vollständiger ersichtlich, wenn die nachstehende ausführliche Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit der beigefügten Zeichnung betrachtet wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 erläutert ein allgemeines Reaktionsschema für die Derivatisierung eines Vesikel-bildenden Lipidamins mit einem Polyalkylether;
  • Fig. 2 ist ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol über ein Cyanurchlorid- Verknüpfungsmittel derivatisiert wird;
  • Fig. 3 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol mittels eines Diimidazol-Aktivierungsreagenzes derivatisiert wird;
  • Fig. 4 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol mittels eines Trifluormethansulfonat-Reagenzes derivatisiert wird,
  • Fig. 5 erläutert ein Vesikel-bildendes Lipid, das mit Polyethylenglycol über eine Peptidverknüpfung (5A), eine Esterverknüpfung (5B) und eine Disulfidverknüpfung (5C) derivatisiert wird;
  • Fig. 6 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und Copolymeren dieser beiden derivatisiert wird;
  • Fig. 7 ist ein Diagramm der Liposomenverweilzeiten im Blut, ausgedrückt als Prozent der injizierten Dosis als Funktion der Stunden nach der IV-Injektion, und zwar für PEG-PE-Liposomen mit einem Gehalt an 4,7 (Dreiecke) oder 14 (Kreise) Mol-% Phosphatidylglycerin;
  • Fig. 8A ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die Blutverweilzeit von Liposomen zeigt, die vorwiegend aus ungesättigten Phospholipidkomponenten zusammengesetzt sind;
  • Fig. 8B ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die Blutverweilzeiten von PEG-beschichteten Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) und herkömmlichen unbeschichteten Liposomen (ausgefüllte Kreise) zeigt;
  • Fig. 9 ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die Blutverweilzeiten von Liposomen zeigt, die mit PEG mit einem Molekulargewicht von 750 (ausgefüllte Dreiecke) und PEG mit einem Molekulargewicht von 350 (leere Dreiecke) formuliert wurde;
  • Fig. 10A ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die Blutverweilzeit von Polymuchsäure- oder Polyglycolsäure-beschichteten Liposomen (obere Linie) und herkömmlichen unbeschichteten Liposomen (untere Linie) zeigt;
  • Fig. 10B ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die Blutverweilzeit von Polymilchsäure- oder Polyglycolsäure-beschichteten Liposomen (obere Linie) und Polyvinylalkohol-beschichteten Liposomen (untere Linie) zeigt;
  • Fig. 11 zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Verteilung von PEG enthaltenden Liposomen in Blut (ausgefüllte Kreise), Leber (ausgefüllte Dreiecke) und Milz (ausgefüllte Quadrate) bei nicht infizierten Ratten;
  • Fig. 12 zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Anreicherung von PEG enthaltenden Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 90 nm in nicht infizierten rechten Lungen (ausgefüllte Dreiecke), infizierten linken Lungen (ausgefüllte Kreise) und Blut (ausgefüllte Quadrate) bei Ratten (n=4), die lokal in der linken Lunge mit K. pneumoniae infiziert wurden;
  • Fig. 13 zeigt ein Diagramm der Erholung zu verschiedenen Zeiten (Stunden) nach der Injektion von PEG enthaltenden Liposomen mit mittleren Durchmessern von 150 nm aus nicht infizierten rechten Lungen (leere Quadrate), infizierten linken Lungen (leere Dreiecke) und Blut (leere Kreise) bei Ratten (n=4), die lokal in der linken Lunge mit K. pneumoniae infiziert wurden;
  • Fig. 14 zeigt einen Vergleich der Aufnahme von PEG enthaltenden Liposomen, aufgetragen gegen das Lungengewicht, in infizierte (linke, Kreise) und nicht infizierte (rechte, Dreiecke) Lungen;
  • Fig. 15A zeigt die Beziehung zwischen dem Gewicht der infizierten Lunge und der Aufnahme von ¹&sup9;&sup0;&sup0;PEG enthaltenden Liposomen (Kreise) und der Aufnahme von Kontroll-Liposomen (PG:PC:chol; Dreiecke) 48 Stunden nach der Injektion in Ratten, wobei die Aufnahme als µM liposomale Lipidanreicherung ausgedrückt ist;
  • Fig. 15B zeigt die Beziehung zwischen dem Gewicht der infizierten Lunge und der Aufnahme von HPI enthaltenden Liposomen (Kreise) und der Aufnahme von Kontroll-Liposomen (PG:PC:chol; Dreiecke) 48 Stunden nach der Injektion in Ratten, wobei die Aufnahme als µM liposomale Lipidanreicherung ausgedrückt ist;
  • Figg. 16A und 16B sind Diagramme von Daten, die in Fig. 15A bzw. Fig. 15B gezeigt sind, wobei die Aufnahme der Liposomen als Konzentration an liposomalem Lipid pro Gramm Lungengewebe ausgedrückt ist;
  • Fig. 17 zeigt ein chromatographisches Profil von [¹²&sup5;I]-Gentamicinenthaltenden Liposomen, die aus einer Sephadex G-50-Größenausschlußsäule eluiert wurden, wobei Radioaktivität (leere Kreise) und Trübung (Lichtextinktion bei 600 nm; Rauten) aufgezeichnet wurden;
  • Fig. 18A zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Gentamicin- Anreicherung (µg/Lunge) in Rattenlungen, die zum Zeitpunkt 0 mit K. pneumoniae infiziert und zum Zeitpunkt 24 Stunden mit Gentamicinsulfat (15 mg/kg; leere Kreise), Gentamicinsulfat-beladenen PEG enthaltenden Liposomen mit einer Zusammensetzung PEG-DSPE:PC:Chol = 0,15:1,85:1 (1,9 mg Gentamicin/kg; ausgefüllte Kreise) oder Gentamicinsulfat-beladenen, PEG enthaltenden, cholesterinfreien Liposomen mit einer Zusammensetzung PEG-DSPE:PC = 0,15:2,85 (1,9 mg Gentamicin/kg; ausgefüllte Dreiecke) behandelt wurden;
  • Fig. 18B ist ein Diagramm ähnlich Fig. 18A, mit der Ausnahme, daß die Anreicherung an Gentamicin als Prozent der injizierten Dosis ausgedrückt ist; und
  • Fig. 19 ist ein Diagramm der Bakterienzahlen (log CFU) in Rattenlungen, die zum Zeitpunkt 0 mit K. pneumoniae infiziert und zum Zeitpunkt 24 Stunden mit freiem Gentamicinsulfat (15 mg/kg; leere Kreise) oder Gentamicinsulfat-beladenen, PEG enthaltenden Liposomen (1,9 mg Gentamicin/kg; ausgefüllte Kreise) behandelt wurden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung 1. Herstellung von derivatisierten Lipiden
  • Fig. 1 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema für die Herstellung eines Vesikel-bildenden Lipids, das mit einem biokompatiblen, hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, wofür Polyethylenglycol (PEG), Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und Polyvinylalkohol (PVA) Beispiele sind. Diese Polymeren sind ohne weiteres wasserlöslich, können an Vesikel-bildende Lipide gekuppelt werden und werden in vivo ohne toxische Wirkungen vertragen. Das hydrophile Polymere, das eingesetzt wird, z. B. PEG, ist vorzugsweise mit einer Methoxy-, Ethoxy- oder einer anderen nicht reaktiven Gruppe an einem Ende versehen oder weist alternativ eine chemische Gruppe auf, die an einem Ende stärker reaktiv ist als am anderen. Das Polymere wird an einem seiner Enden durch Reaktion mit einem geeigneten Aktivierungsmittel, das in der Figur als R* bezeichnet wird, wie Cyanurchlorid, Diimidazol, Anhydridreagenz oder dergl., wie es nachstehend beschrieben wird, aktiviert. Die aktivierte Verbindung wird dann mit einem Vesikel-bildenden Lipid, wie Diacylglycerin unter Einschluß von Diacylphosphoglycerinen, bei denen die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome aufweisen und einen variierenden Grad der Sättigung haben, umgesetzt, um das derivatisierte Lipid herzustellen. Phosphatidylethanolamin (PE) ist ein Beispiel für ein Phospholipid, das für diesen Zweck bevorzugt ist, da es eine reaktive Aminogruppe enthält, die für die Kupplung an die aktivierten Polymeren zweckmäßig ist. Alternativ dazu kann die Lipidgruppe für die Reaktion mit dem Polymeren aktiviert werden, oder die beiden Gruppen können in einer konzertierten Kupplungsreaktion gemäß bekannten Kupplungsverfahren verknüpft werden. An einem Ende mit einer Methoxy- oder Ethoxygruppe versehenes PEG kann im Handel in einer Reihe von Polymergrößen, z. B. mit Molekulargewichten von 500 bis 20 000 Dalton, erhalten werden.
  • Das Vesikel-bildende Lipid ist vorzugsweise ein Lipid mit 2 Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und einer polaren Kopfgruppe. Zu dieser Klasse gehören die Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC), PE, Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinosit (PI) und Sphingomyelin (SM), wobei die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge zwischen etwa 14 und 22 Kohlenstoffatomen aufweisen und variierende Sättigungsgrade haben. Zu dieser Klasse gehören auch die Glycolipide, wie Cerebroside und Ganglioside.
  • Weitere Vesikel-bildende Lipide, die eingesetzt werden können, sind Cholesterin und verwandte Sterole. Im allgemeinen kann Cholesterin weniger fest in der Lipiddoppelschichtmembran verankert werden, insbesondere, wenn es mit einem hochmolekularen Polymeren, wie Polyalkylether, derivatisiert ist, und daher fördert es weniger wirksam, daß die Liposomen das RES im Blutstrom umgehen.
  • Allgemeiner und entsprechend der hier gegebenen Definition soll "Vesikel-bildendes lipid" beliebige amphipathische Lipide mit hydrophoben Anteilen und mit polaren Kopfgruppenanteilen einschließen, die (a) selbst spontan Doppelschichtvesikel in Wasser bilden können, wofür Phospholipide Beispiele sind, oder die (b) stabil in Lipiddoppelschichten in Kombination mit Phospholipiden eingebaut werden können, wobei der hydrophobe Anteil in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran steht und der polare Kopfgruppenanteil nach außen zur polaren Oberfläche der Membran orientiert ist. Beispiele für den letztgenannten Typ von Vesikel-bildenden Lipiden sind Cholesterin und Cholesterinderivate, wie Cholesterinsulfat und Cholesterinhemisuccinat.
  • Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung kann das Vesikel-bildende Lipid ein relativ fluides Lipid sein, was typischerweise bedeutet, daß die Lipidphase eine relativ niedrige flüssige - flüssigkristalline Schmelztemperatur aufweist, z. B. bei oder unterhalb Raumtemperatur, oder ein relativ steifes Lipid, was bedeutet, daß das Lipid eine relativ hohe Schmelztemperatur aufweist, z. B. bis zu 60ºC. In der Regel tragen die steiferen, d. h. gesättigteren, Lipide zu einer stärkeren Membransteifigkeit in einer Lipid-Doppelschichtstruktur bei, und sie tragen auch zu einer größeren Doppelschichtstabilität im Serum bei. Es ist bekannt, daß andere Lipidkomponenten, wie Cholesterin, ebenfalls zur Membransteifigkeit und zur Stabilität in Lipid-Doppelschichtstrukturen beitragen. Wie vorstehend erwähnt wurde, ist ein langkettiges (z. B. C-18) gesättigtes Lipid plus Cholesterin eine bevorzugte Zusammensetzung für die Abgabe von Therapeutika an infizierte Stellen, da diese Liposomen nicht dazu neigen, den Arzneistoff in das Plasma abzugeben, wenn sie durch den Blutstrom zirkulieren, und in den infizierten Bereich während der ersten 48 Stunden nach der Injektion eintreten. Phospholipide, deren Acylketten verschiedene Sättigungsgrade aufweisen, können im Handel erhalten oder nach veröffentlichten Verfahren hergestellt werden.
  • Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung umfaßt das Vesikel-bildende Lipid ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid mit einem derivatisierten hydrophilen biokompatiblen Polymeren. Bei Versuchen zur Stützung der Erfindung gemäß der nachstehenden Ausführungen wurde festgestellt, daß das Vorhandensein derartiger Polymerer, die an Vesikelbildende Lipide in liposomalen Zusammensetzungen derivatisiert sind, wirksam ist, um die Zirkulationszeit der Liposomen im Blut im Vergleich mit Liposomen, die aus Lipiden in Abwesenheit derartiger derivatisierter hydrophiler Polymerer gebildet werden, signifikant zu erhöhen.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß die Polymer-derivatisierten Lipide (a) sicher für die parenterale Verabreichung im Hinblick auf Toxizität, biologische Abbaubarkeit und Gewebeverträglichkeit, (b) kompatibel mit der Bildung und Struktur einer stabilen Lipid-Doppelschicht und (c) geeignet für die Liposomenherstellungs- und Verarbeitungsstufen sein müssen. Diese Anforderungen werden von PEG-Polymeren, die für die Verwendung beim Menschen in den USA zugelassen sind, und auch von den thermoplastischen Polyesterpolymeren Polymilchsäure und Polyglycolsäure (auch als Polylactid und Polyglycolid bezeichnet), Copolymeren von Lactid und Glycolid, wie Poly-(lactid-co-glycolid) und Polyvinylalkoholen erfüllt. Insbesondere die Polyesterpolymere sind sicher zu verabreichen, da sie biologisch abgebaut werden, indem sie einer statistischen, nicht-enzymatischen, hydrolytischen Spaltung ihrer Esterverknüpfungen unter Bildung von Milchsäure und Glycolsäure unterliegen, die normale Stoffwechselverbindungen sind (Tice und Cowsar, und Weise et al.).
  • Fig. 2 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung eines PE-PEG- Lipids, bei dem PEG an PE durch eine Cyanurchloridgruppe derivatisiert ist. Einzelheiten der Reaktion sind in Beispiel 1 angegeben. Kurz gesagt wird das mit einer Methoxyendgruppe versehene PEG mit Cyanurchlorid in Gegenwart von Natriumcarbonat unter Bedingungen aktiviert, die die in der Figur gezeigte aktivierte PEG-Verbindung bilden. Dieses Material wird zur Entfernung von nicht umgesetztem Cyanurchlorid gereinigt. Die aktivierte PEG-Verbindung wird mit PE in Gegenwart von Triethylamin (TEA) unter Bildung der gewünschten, in der Figur gezeigten PE-PEG-Verbindung umgesetzt. Die Ausbeute beträgt etwa 8 bis 10% im Hinblick auf die eingesetzten Mengen an PEG.
  • Das gerade beschriebene Verfahren kann auf eine Reihe von Lipidaminen unter Einschluß von PE, Cholesterylamin und Glycolipiden mit Zucker- Amin-Gruppen, angewandt werden.
  • Ein zweites Verfahren für die Kupplung eines Polyalkylethers, wie des mit einer Endgruppe versehenen PEG, an ein Lipidamin ist in Fig. 3 erläutert. Hier wird das mit der Endgruppe versehene PEG mit einem Carbonyldiimidazol-Kupplungsreagenz (CDI) unter Bildung der in Fig. 3 gezeigten aktivierten Imidazolverbindung aktiviert. Die Reaktion mit einem Lipidamin, wie PE, führt zur PEG-Kupplung an das Lipid durch eine Amidverknüpfung, wie es in der in der Figur gezeigten PEG-PE-Verbindung erläutert ist. Einzelheiten der Reaktion sind in Beispiel 2 angegeben.
  • Ein drittes Reaktionsverfahren zur Kupplung eines mit einer Endgruppe versehenen Polyalkylethers an ein Lipidamin ist in Fig. 4 gezeigt. Hier wird das PEG zuerst an seinem OH-Ende durch eine Trimethylsilangruppe geschützt. Die Reaktion zum Schützen des Endes ist in der Figur gezeigt und beinhaltet die Umsetzung von Trimethylsilylchlorid mit PEG in Gegenwart von Triethylamin (TEA). Das geschützte PEG wird dann mit dem Anhydrid von Trifluormethylsulfonat unter Bildung der mit Trifluormethylsulfonat aktivierten PEG-Verbindung umgesetzt. Die Reaktion der aktivierten Verbindung mit einem Lipidamin, wie PE, in Gegenwart von Triethylamin ergibt das gewünschte derivatisierte Lipidprodukt, wie die PEG-PE-Verbindung, in der die Lipidamingruppe an den Polyether durch das endständige Methylenkohlenstoffatom im Polyetherpolymeren gekuppelt ist. Die Trimethylsilylschutzgruppe kann durch Säurebehandlung, wie es in der Figur angegeben ist, oder alternativ durch Reaktion mit einem quaternären Aminfluoridsalz, wie dem Fluoridsalz von Tetrabutylamin, freigesetzt werden.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß eine Reihe von bekannten Kupplungsreaktionen zusätzlich zu denen, die gerade beschrieben wurden, für die Herstellung von Vesikel-bildenden Lipiden, die mit hydrophilen Polymeren, wie PEG, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure- Copolymeren und Polyvinylalkohol derivatisiert sind, geeignet sind. Zum Beispiel kann das in Fig. 4 erläuterte Sulfonatanhydrid-Kupplungsreagenz eingesetzt werden, um einen aktivierten Polyalkylether mit der Hydroxygruppe eines amphlpathischen Lipids, wie der 5'-OH-Gruppe von Cholesterin, zu verknüpfen. Andere reaktive Lipidgruppen, wie eine Säure- oder Esterlipidgruppe, können ebenfalls für die Kupplung nach bekannten Verfahren herangezogen werden. Zum Beispiel kann die Säuregruppe von Phosphatidsäure unter Bildung eines aktiven Lipidanhydrids durch Umsetzung mit einem geeigneten Anhydrid, wie Essigsäureanhydrid, aktiviert werden, und das reaktive Lipid kann dann mit einem geschützten Polyalkylamin durch Umsetzung in Gegenwart eines Isothiocyanatreagenzes verknüpft werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die derivatisierten Lipidkomponenten so hergestellt, daß sie eine labile Lipid-Polymer-Verknüpfung, wie eine Peptid-, Ester- oder Disulfid-Verknüpfung, enthalten, die unter ausgewählten physiologischen Bedingungen gespalten werden kann, wie in Gegenwart von Peptidase- oder Esteraseenzymen oder Reduktionsmitteln, wie Glutathion, die im Blutstrom vorhanden sind. Fig. 5 zeigt beispielhaft Lipide, die über (5A) Peptid, (5B) Ester und (5C) Disulfid enthaltende Verknüpfungen verknüpft sind. Die Peptid-verknüpfte Verbindung kann z. B. hergestellt werden, indem zuerst ein Polyalkylether mit dem N-terminalen Amin des gezeigten Tripeptids z. B. über die in Fig. 3 gezeigte Reaktion, gekuppelt wird. Die Peptidcarboxylgruppe kann dann mit einer Lipidamingruppe durch ein Carbodi imid-Kupplungsreagenz auf herkömmliche Weise gekuppelt werden. Die Ester-verknüpfte Verbindung kann z. B. durch Kupplung einer Lipidsäure, wie Phosphatidsäure, mit der endständigen Alkoholgruppe eines Polyalkylethers unter Verwendung von Alkohol über ein Anhydrid-Kupplungsmittel hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein kurzes Verknüpfungsfragment, das eine innere Esterbindung und geeignete Endgruppen enthält, wie primäre Amingruppen, verwendet werden, um den Polyalkylether an das amphipathische Lipid durch Amid- oder Carbamatverknüpfungen zu kuppeln. Entsprechend kann das Verknüpfungsfragment eine innere Disulfidverknüpfung zur Verwendung bei der Bildung der in Fig. 5C gezeigten Verbindung enthalten. Polymere, die an Phospholipide über reversible Verknüpfungen gekuppelt sind, sind geeignet, um für hohe Blutspiegel an Liposomen, die sie enthalten, in den ersten Stunden nach der Injektion zu sorgen. Nach dieser Zeitspanne spalten Plasmakomponenten die reversiblen Bindungen unter Freisetzung der Polymeren, und die "ungeschützten" Liposomen werden rasch durch das RES nach dem gleichen Mechanismus wie herkömmliche Liposomen aufgenommen.
  • Fig. 6 erläutert ein Verfahren zur Derivatisierung von Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren mit PE mit einer Amidverknüpfung. Die Polymilchsäure wird in Gegenwart von PE mit Dicyclohexylcarboimid (DCCI) umgesetzt, wie es ausführlich in Beispiel 2 angegeben wird. Entsprechend kann ein Vesikel-bildendes Lipid, das mit Polyglycolsäure derivatisiert ist, durch Umsetzung von Polyglycolsäure oder Glycolsäure mit PE in Gegenwart eines geeigneten Kupplungsmittels, wie DCCI, gebildet werden, wie es ebenfalls ausführlich in Beispiel 2 angegeben ist. Ähnliche Reaktionen können herangezogen werden, um Lipidderivate von Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren zu bilden. Polyvinylalkohol (PVA) wird entsprechend mit PE unter Bildung einer Carbamatverknüpfung derivatisiert, wie es ausführlich in Beispiel 2 angegeben ist, indem zuerst PE mit Carbonyldiimidazol (CDI) umgesetzt wird, woran sich die Zugabe einer niedermolekularen Fraktion von PVA in Gegenwart von Triethylamin anschließt. Die Vesikel-bildenden Lipide, die mit Polymilchsäure oder Polyglycolsäure und ihren Copolymeren oder mit Polyvinylalkohol derivatisiert sind, bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung. Ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden Liposomen, die diese derivatisierten Lipide enthalten.
  • II. Herstellung von Liposomen A. Lipidkomponenten
  • Die bei der Bildung der erfindungsgemäßen Liposomen verwendeten Lipidkomponenten können aus einer Reihe von Vesikel-bildenden Lipiden, typischerweise unter Einschluß von Phospholipiden, Sphingolipiden und Sterolen, ausgewählt werden. Wie gezeigt wird, ist eine Anforderung an die erfindungsgemäßen Liposomen eine lange Zirkulationszeit im Blut. Es ist daher nützlich, ein Standardmaß für die Lebenszeit im Blut einzuführen, das zur Bewertung der Wirkung der Lipidkomponenten auf die Bluthalbwertszeit herangezogen werden kann.
  • Ein Verfahren, das für die Bewertung der Liposomen-Zirkulationszeit in vivo herangezogen wird, besteht in der Messung der Verteilung von IV injizierten Liposomen im Blutstrom und den primären Organen des RES zu ausgewählten Zeiten nach der Injektion. Bei dem standardisierten Modell, das hier herangezogen wird, wird die RES-Aufnahme durch das Verhältnis der gesamten Liposornen im Blutstrom zu den gesamten Liposomen in Leber und Milz, den hauptsächlichen Organen des RES, gemessen. Es ist darauf hinzuweisen, daß zwar die Aufnahme in derartigen Geweben speziell in RES- Zellen erfolgt, die fixierten Makrophagen der Leber und Milz, daß die Bewertung der RES-Aufnahme herkömmlicherweise jedoch durch Messung der Gesamtaufnahme durch die ganzen Gewebe durchgeführt wird. Wenn also hier angegeben wird, daß die RES-Aufnahme in Leber und Milz gemessen wurde, dann ist dies so zu verstehen, daß die Aufnahme hauptsächlich durch die fixierten Makrophagen der Leber und Milz erfolgte. In der Praxis werden hinsichtlich Alter und Geschlecht übereinstimmenden Ratten oder Mäusen IV durch die Schwanzvene radioaktiv markierte Liposomenzusammensetzungen injiziert, und zu jedem Zeitpunkt erfolgt die Bestimmung durch Messung der radioaktiven Zähirate für das gesamte Blut und für die Kombination aus Leber und Milz, wie es ausführlich in Beispiel 5 angegeben ist.
  • Da Leber und Milz und speziell die fixierten Makrophagen in Leber und Milz für nahezu 100% der anfänglichen Aufnahme von Liposomen durch das RES verantwortlich sind, stellt das gerade beschriebene Blut/RES-Verhältnis einen guten Näherungswert für das Ausmaß der Aufnahme aus dem Blut in das RES in vivo dar. Zum Beispiel zeigt ein Verhältnis von etwa 1 oder mehr das Vorherrschen von injizierten Liposomen, die im Blutstrom verbleiben, an, und ein Verhältnis unter etwa 1 zeigt das Vorherrschen von Liposomen im RES an. Für die meisten Lipidzusamensetzungen von Interesse wurden Blut/RES-Verhältnisse 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden nach der Injektion berechnet.
  • Die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen ein Vesikel-bildendes Lipid, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, wie es in Abschnitt 1 beschrieben ist. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wurde festgestellt, daß die Halbwertszeiten der Zirkulation im Blut dieser Liposomen zum großen Teil unabhängig vom Grad der Sättigung der Phospholipidkomponenten, die die Liposomen bilden, sind. Dies bedeutet, daß die Phospholipidkomponenten vorwiegend aus fluiden, relativ ungesättigten Acylketten oder aus stärker gesättigten, versteifenden Acylkettenkomponenten bestehen können. Dieses Merkmal der Erfindung ist in Beispiel 6 ersichtlich, bei dem Blut/RES-Verhältnisse von Liposomen, die mit PEG-PE, Cholesterin und PC mit variierenden Sättigungsgraden gebildet werden, untersucht werden (Tabelle 4). Wie aus den Daten in Tabelle 5 in diesem Beispiel ersichtlich ist, wurden hohe Blut/RES-Verhältnisse bei im wesentlichen allen Liposomenformulierungen erzielt, und zwar unabhängig vom Ausmaß der Lipidsättigung im PC-Phospholipid, und es wurde kein systematischer Trend als eine Funktion des Grads der Lipidsättigung beobachtet.
  • Dementsprechend können die Vesikel-bildenden Lipide gewählt werden, um einen gewählten Grad der Fluidität oder Steifheit zu erzielen, um die Stabilität der Liposomen im Serum zu steuern und um die Geschwindigkeit der Freisetzung von eingeschlossenem Arzneistoff aus den Liposomen in den Blutstrom und/oder infizierte Bereiche zu steuern. Die Vesikel-bildenden Lipide können hinsichtlich der Lipidsättigungseigenschaften auch so gewählt werden, daß günstige Liposomenherstellungseigenschaften erzielt werden. Es ist im allgemeinen der Fall, daß z. B. stärker fluide Lipide leichter zu formulieren und durch Extrusions- und Homogenisierungsverfahren hinsichtlich der Größe zu verringern sind als steifere Lipidzusammensetzungen.
  • Entsprechend wurde festgestellt, daß der Prozentsatz an Cholesterin in den Liposomen über einen weiten Bereich ohne signifikante Wirkung auf die beobachteten Blut/RES-Verhältnisse variiert werden kann. Die in Beispiel 7A vorgelegten Untersuchungen zeigen mit Bezug auf die dort vorgelegte Tabelle 6 praktisch keine Änderung der Blut/RES-Verhältnisse im Bereich von Cholesterin zwischen 0 bis 30 Mol-%. Andererseits kann der Cholesteringehalt die Kinetik der Arzneistoffverteilung an das infizierte Gewebe beeinflussen, wie es in den Figg. 18A und 18B erläutert wird.
  • Bei Studien, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden, wurde auch festgestellt, daß Blut/RES-Verhältnisse relativ unbeeinflußt vom Vorhandensein von geladenen Lipidkomponenten, wie Phosphatidylglycerin (PG), sind. Dies ist aus Fig. 7 ersichtlich, in der der prozentuale Verlust von eingeschlossenem Marker für PET-PE-Liposomen, die 4,7 Mol-% PG (Dreiecke) oder 14 Mol-% PG (Kreise) enthielten, graphisch auftragen ist. Es wurde praktisch kein Unterschied in der Liposornenretention im Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden beobachtet. Die Möglichkeit, daß die Liposomen negative Ladung umfassen können, ohne daß die RES-Aufnahme verstärkt wird, sorgt für eine Reihe möglicher Vorteile. Liposomensuspensionen, die negative Ladung enthalten, sind weniger anfällig für eine Aggregation in Puffern mit hoher lonenstärke, und daher ist die physikalische Stabilität verstärkt. Außerdem kann die negative Ladung, die in der Liposomenmembran vorhanden ist, als Formulierungswerkzeug zur wirksamen Bindung großer Mengen an kationischen Arzneistoffen verwendet werden.
  • Das Vesikel-bildende Lipid, das mit einem biokompatiblen, hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, ist auch in der liposomalen Zusammensetzung vorhanden. Die Menge an derartigem derivatisiertem hydrophilem Polymerem liegt vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 20 Mol-%, bezogen auf die Molzahl an derivatisiertem Lipid als Prozentsatz der Gesamtmolzahl an Vesikel-bildenden Lipiden. Diese bevorzugten Molverhältnisse sind insbesondere auf Lipide anwendbar, die mit PEG mit Molekulargewichten zwischen etwa 1000 bis 5000 Dalton derivatisiert sind. Es ist darauf hinzuweisen, daß ein geringeres Molverhältnis, wie weniger als 1 Mol-%, für ein Lipidderivat mit einem hochmolekularen Polymeren geeignet sein kann und daß eine derartige Zusammensetzung wirksam hinsichtlich der Erzielung einer signifikant erhöhten Zirkulationszeit der Liposomen im Blut sein kann, wenn das hydrophile Polymere, z. B. PEG, ein vergleichsweise hohes Molekulargewicht, z. B. größer als etwa 1000 bis 5000 Dalton, aufweist. Umgekehrt ist ein höheres Molverhältnis für ein Lipidderivat mit einem niedermolekularen Polymeren, wie einem PEG mit einem Molekulargewicht von 350 Dalton, wirksam. Eine derartige Zusammensetzung kann auch wirksam bei der Erzielung einer signifikant erhöhten Zirkulationszeit von Liposomen im Blut sein. Dies wird in Fig. 9 erläutert, die die Zirkulationszeit in Blut für Liposomen zeigt, die aus PEG mit Molekulargewichten von 350 und 750 bei molaren Verhältnissen von 33% in Liposomenzusammensetzungen gebildet wurden. Wie ersichtlich ist, zeigten beide Zusammensetzungen verlängerte Blutzirkulationszeiten, die für die vorliegende Erfindung charakteristisch sind. Speziell verlängern derartige Zusammensetzungen die Blutzirkulationszeit, die 24 Stunden nach der Injektion der Liposomen gemessen wird, um mindestens ein Mehrfaches gegenüber der, die mit Liposomen erzielbar ist, denen derivatisierte hydrophile Polymere fehlen.
  • Wie in Abschnitt I angegeben wurde, weist das hydrophile Polymere im derivatisierten Lipid vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 200 und 20 000 Dalton und insbesondere zwischen etwa 300 und 5000 Dalton auf. Beispiel 7B, bei dem die Wirkung von sehr kurzen Ethoxyethergruppen auf Blut/RES-Verhältnisse untersucht wurde, zeigt, daß Polyethergruppen größer als etwa 5 Kohlenstoffether erforderlich sind, um eine signifikante Erhöhung der Blut/RES-Verhältnisse zu erzielen.
  • B. Herstellung der Liposomenzusammensetzung
  • Die Liposomen können nach einer Reihe von Techniken hergestellt werden, wie denen, die ausführlich von Szoka et al., 1980, angegeben werden. Ein Verfahren zur Herstellung von Arzneistoff enthaltenden Liposomen besteht im Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, das von Szoka et al. und im US-Patent 4 235 871 beschrieben wird. Die Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (REVS) weisen typischerweise mittlere Größen zwischen etwa 2 und 4 µm auf und sind vorwiegend oligolamellar, d. h. sie enthalten eine oder einige Lipiddoppelschichtschalen. Das Verfahren wird ausführlich in Beispiel 4A erläutert.
  • Multilamellare Vesikel (MLVs) können durch einfache Lipidfilm-Hydratisierungstechniken hergestellt werden. Bei diesen Verfahren wird ein Gemisch von Liposomen-bildenden Lipiden der vorstehend ausführlich angegebenen Art, das in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist, in einem Gefäß unter Bildung eines dünnen Films eingedampft, der dann mit einem wäßrigen Medium bedeckt wird, wie es ausführlich in Beispiel 4B beschrieben wird. Der Lipidfilm wird unter Bildung von MLVs, typischerweise mit Größen zwischen etwa 0,1 bis 10 µm, hydratisiert.
  • Gemäß einem weiteren wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Liposomen so hergestellt, daß sie im wesentlichen homogene Größen von weniger als etwa 0,2 µm aufweisen. Insbesondere wurde festgestellt, daß Liposomen in diesem Größenbereich ohne weiteres zu einer Extravasation in infizierte Bereiche imstande sind, wie es im nachstehenden Abschnitt III erläutert wird, daß sie gleichzeitig imstande sind, eine erhebliche Arzneimittelmenge zu dem infizierten Bereich zu tragen, und daß sie filtersterilisiert werden können. Kleine unilamellare Vesikel von weniger als 0,07 µm sind zwar leicht zu einer Extravasation in infizierte Bereiche imstande; ihr Arzneistoffbeladungsvermögen ist jedoch stark beschränkt. Das obere Ende dieses bevorzugten Größenbereiches (0,1 µm) ist nicht notwendigerweise die größte Größe von Liposomen, die zur Extravasation imstande sind, sondern ist vielmehr die obere Grenze der Größe von Liposomen, die herkömmlicherweise vor der Verabreichung filtersterilisiert werden können. Es ist darauf hinzuweisen, daß bei Berücksichtigung von Einstellungen bei pharmazeutischen Formulierungsverfahren liposomale Zusammensetzungen oberhalb oder unterhalb dieses Größenbereiches wirksam bei der Abgabe von Arzneistoffen an infizierte Bereiche sein können.
  • Ein wirksames Verfahren zur Einstellung der Größe von REVs und MLVs beinhaltet das Extrudieren einer wäßrigen Suspension der Liposomen durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit einer ausgewählten gleichförmigen Porengröße im Bereich von 0,03 bis 0,2 µm und typischerweise 0,05, 0,08, 0,1 oder 0,2 µm. Die Porengröße der Membran entspricht grob der größten Größe der Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran hergestellt werden, insbesondere wenn das Präparat zweimal oder öfter durch die gleiche Membran extrudiert wird. Dieses Verfahren zur Größeneinstellung von Liposomen wird bei der Herstellung von REV- und MLV-Zusammensetzungen mit homogener Größe herangezogen, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden. Ein neueres Verfahren beinhaltet die Extrusion durch einen asymmetrischen keramischen Filter. Dieses Verfahren wird ausführlich im US-Patent 4 737 323 (Liposome Extrusion, erteilt am 12. April 1988) beschrieben. Homogenisierungsverfahren eignen sich auch für die Verringerung der Größe von Liposomen auf Größen von 100 nm oder weniger (Martin).
  • Weitere Verfahren zur Verringerung der Teilchengröße umfassen die Anwendung hoher Drucke auf die Liposomen, wie in einer French Press, und die Homogenisierung der Liposornen. In Versuchen, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde die Hochdruckextrusion allgemein zur Steuerung der Teilchengröße angewandt.
  • Homogenisierungstechniken können bis zu einem gewissen Grad durch das Vorhandensein von Schaum in der liposomalen Suspension beschränkt sein, wobei festgestellt wurde, daß die Bildung von Schaum in einem größeren Ausmaß bei den liposomalen Gentamicin-Präparaten als bei den Kontroll-Liposomen auftritt. In Versuchen, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde festgestellt, daß das Vorhandensein von großen Mengen an Schaum in der liposomalen Suspension zu einer liposomalen Gentamicin-Zusammensetzung führte, die durch Teilchen mit einem minimalen Durchmesser von etwa 200 nm charakterisiert war, die gegenüber einer Membranextrusion beständig waren.
  • C. Beladung mit Verbindungen
  • Das Einverleiben einer Verbindung in Liposomen kann nach einem oder mehreren einer Reihe von aktiven und passiven Verfahren erfolgen. Diese Verfahren und Charakteristiken der beispielhaften Verbindungen für die Verwendung bei diesen Verfahren sind ausführlich in der am 15. Januar 1991 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Seriennumer 642 231, die der gleichen Anmelderin gehört, beschrieben, die durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
  • Eine passive Beladung durch Einschließen wird für bestimmte antimikrobielle Mittel angewandt, insbesondere die, die therapeutisch aktiv bei relativ geringen Arzneistoffdosen sind und/oder die hochgradig löslich in wäßrigen Lösungen sind. Hier wird der Arzneistoff entweder in der wäßrigen Phase, die zur Hydratisierung des Lipids verwendet wird, gelöst oder mit den Lipiden beim Liposomen-Herstellungsverfahren eingeführt, und zwar abhängig von der Löslichkeit der Verbindung.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Beladung mit antibiotischen Mitteln, wie dem Aminoglycosid Gentamicin, durch passive Hydratisierung. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein "Kuchen"-Hydratisierungsverfahren, das in Beispiel 12 beschrieben ist, für das Einverleiben von relativ hohen Konzentrationen an Gentamicin in die erfindungsgemäßen Liposomen bevorzugt ist. Bei diesem Verfahren wird ein Lipid-"Kuchen" durch Lyophilisieren einer Lösung von Lipiden gebildet. Der Kuchen wird dann mit einer wäßrigen Lösung, die den Arzneistoff, der den Liposomen einverleibt werden soll, enthält, hydratisiert. Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden und bei denen das Kuchenhydratisierungsverfahren unter Verwendung von Gentamicinsulfat-Konzentrationen von 20 bis 100 mg/ml und Gesamtlipidkonzentrationen von 50 bis 300 µMol/ml getestet wurde, ergaben praktische Grenzen von ≤ 50 mg/ml für Gentamicin und ≤ 150 µMol/ml für Lipid. Oberhalb dieser Konzentrationen wurden nicht-liposomale Teilchen gebildet. Dieses Verfahren führte zur Einverleibung von 4 bis 50% Gentamicinsulfat vor der Entfernung des freien Arzneistoffs (Beispiel 12, Tabelle 8).
  • Entsprechend wurde gezeigt, daß die Hydratisierung eines Lipidkuchens, der durch Lyophilisierung gebildet wurde, mit wäßrigem Gentamicinchlorid zu liposomalen Gentamicin-Zusamensetzungen führte, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Liposomen, die nach diesem Verfahren gebildet wurden, waren durch eine offensichtliche Homogenität der Anfangsdispersion und eine einfache Extrusion charakterisiert. Das Einverleiben von Arzneistoff lag im Bereich von 6 bis 24% vor der Entfernung des freien Arzneistoffs aus den Proben (Beispiel 12, Tabelle 11). Ferner zeigten Untersuchungen zur Stützung der vorliegenden Erfindung, daß der Ersatz von Cholesterin durch Cholesterinsulfat in der Liposomenlipidzusammensetzung bei Verwendung von Gentamicinchlorid als Beladungsarzneistoff zu einem Anstieg der Arzneistoffbeladung vor der Entfernung von nicht einverleibtem Arzneistoff führte (vgl. Proben 42A, 42B, 42C in Tabelle 11). Bei ähnlichen Versuchen wurde festgestellt, daß das Weglassen von Cholesterin aus der Lipidzusammensetzung zu einer Gentamicinsulfat-Beladung von 70 µg/µMol Lipid bei einem Einschluß von 83% nach der Entfernung von freiem Arzneistoff führte.
  • Weitere Faktoren, die möglicherweise die Beladung mit einer Verbindung beeinflussen, wurden unter Einschluß des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses und der Teilchengröße in Versuchen, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, untersucht. Im allgemeinen führten eine Zunahme der Teilchengröße oder des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses während der Liposomenbildung zu einem Anstieg des schließlich erzielten Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses (Tabelle 10).
  • Nach der Liposomenbildung und der Größeneinstellung wird freier (ungebundener) Arzneistoff durch ionenaustausch- oder gelausschlußchromatographische Verfahren (beschrieben in Beispiel 12C) oder durch Dialyse oder Diaflitration entfernt. Für liposomale Gentamicin-Formulierungen zeigten Versuche zur Stützung der vorliegenden Erfindung, daß die Entfernung von freiem Arzneistoff am wirksamsten und vollständigsten unter Anwendung der Säulenchromatographie, z.B. über eine Sephadex G-50-Größeneinstellungssäule, und anschließende Einengung erfolgt. Fig. 17 zeigt ein Säulenprofil der Elution von [¹²&sup5;I]-Gentamicin enthaltenden Liposomen unter Anwendung dieses Verfahrens. Wie aus den Tabellen 12 und 13 ersichtlich ist, fällt nach der Entfernung von nicht eingeschlossenem Arzneistoff das Verhältnis von gebundenem Gentamicin zu Lipid in der liposomalen Zusammensetzung erheblich ab, und zwar typischerweise auf etwa 20 µg/µMol für Gentamicinsulfat (Tabelle 12) und etwa 50 bis 70 µg/µMol für Gentamicinchlorid (Tabelle 13). Die prozentuale Einverleibung von Arzneistoff in Liposomen nach der Entfernung von freiem Arzneistoff liegt im Bereich von 20 bis 98% für Gentamicinsulfat (Tabelle 12) und von 40 bis 85% für Gentamicinchlorid (Tabelle 13).
  • Antibiotische liposomale Zusammensetzungen sind stabil bei Lagerung bei gekühlten Temperaturen. Gentamicinsulfat enthaltende liposomale Zusammensetzungen, die hergestellt wurden, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurden bei 8ºC gelagert und auf den Gentamicin-Gehalt im Verlauf von 2 Wochen untersucht. Wie in Tabelle 15 gezeigt ist, wurde das nach Reinigung mit G-50 Sephadex erzielte Arzneistoff-zu-Lipid-Verhältnis über diese Zeitspanne im wesentlichen aufrechterhalten.
  • Zusammenfassend lauten bevorzugte Bedingungen für das Einschließen von Gentamicin in PEG enthaltende Liposomen wie folgt: Kuchen, die 1000 µMol Lipid enthalten, werden mit 2,5 ml Gentamicinsulfat (200 mg/ml) in Wasser durch Schütteln für 1 Stunde hydratisiert. Die Suspension wird auf 10 ml mit isotoner Kochsalzlösung auf eine Arbeitskonzentration von 50 mg/ml Gentamicinsulfat und 100 µMol Lipid/ml verdünnt. Die Dispersionen werden extrudiert, um einen gewünschten mittleren Teilchendurchmesser zu erzielen, der vorzugsweise weniger als etwa 200 nm beträgt. Nicht eingeschlossener Arzneistoff wird durch Gelchromatographie entfernt, und das Gesamtvolumen wird durch Zentrifugation in einer Centiprep-10-Konzentrationseinrichtung verringert.
  • Wenn die antibiotische Verbindung einen Peptid- oder Proteinarzneistoff, wie alpha-Interferon, umfaßt, dann werden die Liposomen vorzugsweise nach dem Umkehrphasenverfahren, durch ein Lösungsmittelinjektionssystem, wie es im US-Patent 4 752 425 beschrieben wird, oder durch Rehydratisierung eines gefriergetrockneten Gemisches aus dem Protein und einer Suspension von kleinen unilamellaren Vesikeln mit Wasser hergestellt (Kirby). Beide Verfahren kombinieren die passive Beladung mit einem vergleichsweise hohen Wirkungsgrad des Einschließens, z. B. einem Wirkungsgrad von bis zu 50%. Nicht eingeschlossenes Material kann ohne weiteres aus der Liposomensuspension, z. B. durch Dialyse, Diafiltration oder Ausschlußchromatographie, entfernt werden.
  • In einigen Fällen wurde festgestellt, daß es, um eine hohe Konzentration an Arzneistoffen in Liposornen einzuschließen, günstig ist, aktive Beladungsverfahren zu nutzen. Ein Verfahren zur aktiven Beladung mit amphipathischen Arzneistoffen wird in der am 28. September 1988 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 413 037, die der gleichen Anmelderin gehört, beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Liposomen in Gegenwart einer vergleichsweise hohen Konzentration an Ammonlumsulfat hergestellt. Nach der Einstellung der Liposomen auf die gewünschte Größe wird die Liposomensuspension behandelt, um einen von innen nach außen gerichteten Ammoniumionengradienten über die liposomalen Membranen zu erzeugen. Der Gradient kann durch Dialyse oder Diafiltration gegen ein Medium, das kein Amonium enthält, wie ein isotones Glucosemedium, oder durch Gelfiltration, z. B. fiber eine Sephadex G-50-Säule, die mit 0,15 M NaCl oder KCl äquilibriert ist, wobei das Ammoniumsulfat in der äußeren Phase in wirksamer Weise durch Natrium- oder Kahumionen oder eine Nicht- Elektrolyt-Spezies ersetzt wird, erzeugt werden. Alternativ dazu kann die Liposomensuspension mit einer kein Ammonium enthaltenden Lösung verdünnt werden, wobei die Konzentration an Ammoniumionen in der äußeren Phase verringert wird. Die Ammoniumsulfatkonzentration im Innern der Liposomen beträgt vorzugsweise mindestens das 10-fache und insbesondere mindestens das 100- bis 1000-fache der Konzentration in der in bezug auf die Liposomen äußeren Phase.
  • Der Ammoniumsulfatgradient über die Liposomen erzeugt wiederum einen chemischen Gradienten, was das Einfangen von nicht ionisierten Ammen, die durch die Membran treten, erlaubt, wenn Ammoniak über die Liposomenmembran freigesetzt wird, und die Arzneistoffe werden in der inneren wäßrigen Phase der Liposomen protoniert und eingeschlossen. Um die Liposomen mit dem gewählten Arzneistoff zu beladen, wird eine Suspension der Liposomen, z. B. etwa 20 bis 200 mg/ml Lipid, mit einer wäßrigen Lösung des Arzneistoffs gemischt, und man erlaubt eine Äquilibrierung des Gemisches über eine Zeitspanne, z. B. mehrere Stunden, bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 60ºC, und zwar abhängig von der Phasenübergangstemperatur der Lipide, die zur Bildung der Liposomen verwendet werden. Bei einem typischen Verfahren wird eine Suspension von Liposomen mit einer Lipidkonzentration von 50 µMol/ml mit einem gleichen Volumen an amphipathischem Arzneistoff in einer Konzentration von etwa 5 bis 8 mg/ml gemischt. Am Ende der Inkubationszeit wird die Suspension behandelt, um freien (ungebundenen) Arzneistoff zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Entfernung von Arzneistoff ist für Arzneistoffe das Leiten über ein Ionenaustauschharz, wie Dowex 50 WX-4, das zur Bindung des nicht eingeschlossenen Arzneistoffs, nicht jedoch zur Bindung der den Arzneistoff enthaltenden Liposomen imstande ist.
  • III. Liposomen-Lokalisierung in infizierten Bereichen A. Ausgedehnte Halbwertszeit im Blutstrom
  • Eine der Anforderungen für die erfindungsgemäße Liposomenlokalisierung in infizierten Zielgeweben ist eine verlängere Halbwertszeit der Liposomen im Blutstrorn nach der parenteralen Liposomenverabreichung. Ein Maß für die Lebensdauer von Liposomen im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, das zu einem ausgewählten Zeitpunkt nach der Liposomenverabreichung bestimmt wird, wie es vorstehend erörtert wurde. Blut/RES-Verhältnisse fur eine Reihe von Liposomenzusamensetzungen sind in Tabelle 3 von Beispiel 5 angegeben. In Abwesenheit von PEG-derivatisierten Lipiden betrugen die Blut/RES-Verhältnisse 0,03 oder weniger. In Gegenwart von PEG- derivatisierten Lipiden lagen die Blut/RES-Verhältnisse im Bereich von 0,2 für niedermolekulares PEG bis zwischen 1,7 und 4 für mehrere Formulierungen, wobei eine der Formulierungen kein Cholesterin enthielt und drei der Formulierungen kein zugegebenes geladenes Phospholipid (z. B. PG) enthielten.
  • Die in Tabelle 5 von Beispiel 6 vorgelegten Daten zeigen Blut/RES- Verhältnisse (unter Ausschluß von zwei Punkten mit einer geringen prozentualen Wiederfindung) zwischen etwa 1,26 und 3,27, was konsistent mit den in Tabelle 3 angegebenen Daten ist. Wie im vorstehenden Abschnitt II festgestellt wurde, sind die Halbwertszeiten im Blut im wesentlichen unabhängig vom Sättigungsgrad der Liposomenlipide, vom Vorhandensein von Cholesterin und vom Vorhandensein von geladenen Lipiden.
  • Die Blut/RES-Werte, über die vorstehend berichtet wurde, können mit Blut/RES-Werten verglichen werden, über die im US-Patent 4 920 016 der gleichen Inhaberin berichtet wird, wobei Blut/RES-Meßverfahren angewandt wurden, die denen ähnlich waren, die zur Erzeugung der in den Tabellen 3 und 5 vorgelegten Daten herangezogen wurden. Die besten Blut/RES-Verhältnisse über 24 Stunden, über die im vorstehend angegebenen Patent berichtet wird, betragen 0,9 für eine Formulierung, die aus GM&sub1;, gesättigtem PC und Cholesterin besteht. Die nächstbesten Formulierungen ergeben 24 Stunden-Blut/RES-Werte von etwa 0,5. Die typischen Blut/RES-Verhältnisse über 24 Stunden, die bei einer Anzahl der vorliegenden Formulierungen erzielt wurden, waren also mehr als zweimal so hoch wie bei den besten Formulierungen, über die bisher berichtet wurde. Ferner war die Möglichkeit, hohe Blut/RES-Werte mit GM&sub1;- oder HPI-Lipiden zu erzielen, davon abhängig, daß vorwiegend gesättigte Lipide und Cholesterin in den Liposomen vorhanden waren.
  • Die Plasma-Pharmakokinetik eines liposomalen Markers im Blutstrom ergibt ein weiteres Maß für die erhöhte Lebenszeit der Liposomen, die für die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen erzielt wird. Die vorstehend erläuterten Figg. 7 und 8A zeigen den langsamen Verlust an liposomalem Marker aus dem Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden bei typischen PEG-Liposomenformulierungen, und zwar im wesentlichen unabhängig davon, ob der Marker ein Lipid oder eine eingeschlossene wasserlösliche Verbindung ist (Fig. 8A). In beiden graphischen Darstellungen beträgt die Menge an liposomalem Marker, die 24 Stunden nach der Liposomeninjektion vorhanden ist, mehr als 10% des ursprünglich injizierten Materials.
  • Fig. 8B zeigt die Kinetik des Liposomenverlusts aus dem Blutstrom für eine typische PEG-Liposomenformulierung und die gleichen Liposomen in Abwesenheit eines PEG-derivatisierten Lipids. Nach 24 Stunden war der prozentuale Anteil an PEG-Liposomen, die im Blut verblieben, größer als etwa 20%, während die herkömmlichen Liposomen eine Retention von weniger als 5% im Blut nach 3 Stunden und praktisch keinen nachweisbaren Marker nach 24 Stunden zeigten. Fig. 9 zeigt die Kinetik des Liposomenverlusts aus dem Blutstrom für eine niedermolekulare PEG-Liposomenformulierung unter Verwendung von DSPE, derivatisiert an PEG mit einem Molekulargewicht von 350 (350 PEG, leere Dreiecke) oder 750 (750 PEG, ausgefüllte Dreiecke). Diese Formulierungen zeigten Blutretentionszeiten ähnlich denen, die für Liposomen beobachtet wurden, die unter Verwendung von höhermolekularem PEG (typischerweise 1000 bis 5000 Dalton) formuliert wurden.
  • Entsprechend zeigen Liposomen, die PLA- oder PGA-derivatisiertes PE oder PVA-derivatisiertes DSPE enthalten, eine Plasmakinetik, die herkömmlichen Liposomen, die aus PG, PC und Cholesterin bestehen, überlegen ist (Figg. 10A und 10B), da die Liposomen, die derivatisiertes PE oder DSPE enthalten, aus dem Blutstrom mit einer Geschwindigkeit entfernt werden, die um ein Mehrfaches geringer ist als bei Formulierungen ohne derivatisiertes PE oder DSPE.
  • Die in den Figg. 7 bis 10 dargestellten Ergebnisse sind konsistent mit den 24 Stunden-Blut-Liposomenwerten, die für eine Reihe von Liposomenformulierungen gemessen wurden und über die in den Tabellen 3 und 5 bis 7 der nachstehenden Beispiele 5 bis 8 berichtet wird. Wie aus Tabelle 3 von Beispiel 5 ersichtlich ist, betrug die nach 24 Stunden verbleibende Dosis weniger als 1% bei herkömmlichen Liposomen, gegenüber mindestens 5% bei PEG-Liposomen. Bei den besten Formulierungen wurden Werte zwischen etwa 20 bis 40% erzielt. Ähnlich lagen in Tabelle 5 von Beispiel 6 die Liposomenkonzentrationen im Blut nach 24 Stunden (erneut unter Vernachlässigung von zwei Einträgen mit geringen Wiederfindungswerten) zwischen 12 und etwa 25% der gesamten gegebenen Dosis. Über ähnliche Ergebnisse wird in den Tabellen 6 und 7 von Beispiel 7 berichtet.
  • Sowohl fur die Blut/RES-Werte als auch fur die Liposomenretentionszeit im Blutstrom können die aus einem Tiermodellsystem erhaltenen Daten vernünftig auf Menschen und Haustiere von Interesse übertragen werden. Dies hat seinen Grund darin, daß festgestellt wurde, daß die Aufnahme von Liposomen durch die fixierten Makrophagen von Leber und Milz mit ähnlichen Geschwindigkeiten bei mehreren Säugerspezies unter Einschluß von Maus, Ratte, Affe und Mensch auftritt (Gregoriadis, 1974; Jonah; Kimelberg, 1976; Juliano; Richardson; Lopez-Berestein). Dieses Ergebnis spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wider, daß die biochemischen Faktoren, die die größte Bedeutung für die Liposomenaufnahme durch das RES haben - unter Einschluß der Optimierung durch Serumlipoproteine, größenabhängige Aufnahmeeffekte und der Zellabschirmung durch Oberflächengruppen - gemeinsame Merkmale aller Säugerspezies sind, die untersucht wurden.
  • Ein Vergleich der erfindungsgemäßen PEG enthaltenden Liposomen mit herkömmlichen Liposomenpräparaten zeigt, daß ein wünschenswertes Merkmal der antimikrobiellen Therapie, nämlich die Verlängerung der Blutspiegel von Arzneistoff tragenden Liposomen auf zwei oder mehr Tage, um für eine erhöhte und andauernde Anreicherung an den Zielstellen zu sorgen, durch herkömmliche liposomale Präparate nicht erzielt wurde, jedoch mit den mit hydrophilen Polymeren derivatisierten liposomalen Formulierungen der Erfindung, wofür PEG-, PGA-, PLA- und PVA-derivatisierte liposomale Formulierungen Beispiele sind, erzielt wird (Figg. 8B, 9, 10A und 10B).
  • B. Extravasation in infizierte Gewebe
  • Ein weiteres erforderliches Merkmal für erfindungsgemäße hochaktive Liposomen, die auf einen infizierten Bereich zielen, ist die Liposomenextravasation in den Bereich durch die endotheliale Zellbarriere und die darunter befindliche Basismembran, die eine Kapillare von den Gewebezellen, die von der Kapillare versorgt werden, trennt. Liposomen mit Größen von weniger als etwa 0,2 µm zeigen diese Fähigkeit zur Extravasation in infizierte Bereiche. Es ist zwar zu erwarten, daß Liposomen mit einer Größe von weniger als 0,07 µm ebenfalls eine Extravasation zeigen; das begrenzte Arzneistofftragevermögen dieser kleinen Liposomen macht sie jedoch weniger wirksam als Arzneistoffträger für das vorliegende System. Entsprechend können auch Liposomen mit einer Größe von mehr als 0,2 µm eine Extravasation in infizierte Bereiche zeigen; wie jedoch in Abschnitt II angegeben wurde, können derartige Liposomen nicht ohne weiteres nach der Hydratisierung bei der herkömmlichen pharmazeutischen Herstellung filtersterilisiert werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist der optimale Größenbereich der Liposomen ein Kompromiß zwischen der Fähigkeit zur Extravasation, dem Arzneistofftragevermögen und der Einfachheit der Sterilfiltration, was zu einem Durchmesser von weniger als etwa 0,2 µm führt.
  • Daß eine Liposomenabgabe an den infizierten Bereich erforderlich ist, um den Arzneistoff selektiv ans Ziel zu bringen, ist aus Versuchen ersichtlich, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden und bei denen ungefähr 10&sup5; CFU Klebsiella pneumoniae in die linke Lunge von Ratten durch Intubation verabreicht wurden, wie es ausführlich in Beispiel 11 angegeben ist. Innerhalb von 3 bis 4 Tagen stieg die Bakterienzahl in der linken Lunge auf bis zu 2×10¹&sup0;, und Bakterien waren im Blutstrom vorhanden. Die Schwere der Infektion, die durch die Bakterienzahl bewertet wurde, war begleitet von einem proportionalen Anstieg des Gewichts der infizierten linken Lunge von 0,5 g bis auf 2 g und makroskopischen Zeichen einer Infektion. Lungenläsionen waren durch Ödeme (Flüssigkeitsanreicherung und Gewichtszunahme), eine große Anzahl an gramnegativen Bacilli und einem zellulären Infiltrat, das aus polymorphonuclearen Leukozyten und Makrophagen bestand, charakterisiert. Es wurden zwar auch Bakterien in der rechten (nicht infizierten) Lunge in einer Zahl im Bereich von 10 bis 10&sup9; pro Lunge festgestellt; ihr Vorhandensein war jedoch nicht von einer ödematösen Massenzunahme oder den histologischen Markern, die vorstehend beschrieben wurden, begleitet.
  • Drei Tage nach der Inokulation mit den Bakterien wurden PEG-derivatisierte Liposomen mit einem Zusammensetzungsverhältnis von PEG-DSPE: HSPC:CHO = 0,15:1,85:1, die mit &sup6;&sup7;Ga beladen waren, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, den infizierten Ratten injiziert. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Liposomeninjektion getötet, und die Aufnahme der Liposomen durch die Lungen und andere Gewebe wurde durch Messung der Menge der damit verbundenen Radioaktivität durch gamma-Scintigraphie bestimmt. Bei nicht infizierten Tieren riefen PEG enthaltende Liposomen die übliche verringerte MPS-Aufnahme (Leber und Milz) hervor und verblieben für längere Zeiten im Blut, und zwar in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (Woodle et al., 1990 und 1991; Papahadjopulos et al., 1991). Bei nicht infizierten Tieren war die verlängerte Blutzirkulation nicht verändert, wie durch die graphische Darstellung, die in Fig. 11 gezeigt ist, veranschaulicht wird, in der ersichtlich ist, daß die Liposomenanreicherung in Leber (ausgefüllte Dreiecke) und Milz (ausgefüllte Quadrate) weniger als 20% bzw. 10% der injizierten Dosis über die Beobachtungszeit (40 Stunden) betrug und daß diese Werte deutlich unterhalb der Werte, die im Blut während des größten Teils der Beobachtungszeit und insbesondere während der ersten 24 Stunden nach der Injektion aufrechterhalten wurden, lagen.
  • Fig. 12 zeigt die Aufnahrnekinetik von ¹&sup9;&sup0;&sup0;PEG-PE enthaltenden 90 nm- Liposomen durch die linke (infizierte) und rechte (nicht infizierte) Lunge von Ratten über eine Zeitspanne von 40 Stunden nach der Injektion der Liposomen, wie es ausführlich in Beispiel 13 beschrieben wird. Entsprechend zeigt Fig. 13 die Aufnahmekinetik von 150 nm-Liposomen. Blutkonzentrationen der Liposomen sind in den Figuren ebenfalls graphisch dargestellt. Die PEG enthaltenden 90 nm- und 150 nm-Liposomen zirkulierten im Blutstrom für längere Zeitspannen, was Blutkonzentrationen von über 20% der injizierten Dosis 24 Stunden nach der Injektion und annähernd 10% der injizierten Dosis 40 Stunden nach der Injektion ergab. Außerdem werden beide Größen von Liposomen selektiv im infizierten Lungengewebe angereichert. Die Konzentration in der rechten Lunge von infizierten Tieren ist typischerweise die Lungenanreicherung in nicht infizierten Tieren. Die Anreicherung in der linken Lunge zeigt ein Maximum nach 16 Stunden, das für mindestens weitere 16 Stunden aufrechterhalten wird. Nach 48 Stunden wurden 6% der injizierten Dosis an 90 nm-Liposomen in der infizierten Lunge gefunden, während nur weniger als 0,5% der injizierten Dosis in der nicht infizierten Lunge gefunden wurden (Fig. 12). Ähnliche Trends wurden für die 150 nm-Liposomen beobachtet (Fig. 13).
  • Eine Korrelation zwischen dem Lungengewicht (als Indikator für Ödeme und für die Schwere der Infektion, was durch histologische Untersuchung bestätigt wurde) und liposomaler Aufnahme wurde in dem vorstehend beschriebenen Ratten-Infektionsmodell ebenfalls bestätigt. Fig. 14 zeigt eine graphische Auftragung von Lungengewicht gegen liposomale Lipidanreicherung pro Gewebevolurnen zum Zeitpunkt 48 Stunden für Gewebe der linken (infizierten) und rechten (nicht infizierten) Lunge in einer großen Anzahl von Ratten, denen &sup6;&sup7;Ga-markierte 90 nm-Liposomen injiziert wurden. Ein Vergleich der Anreicherung in der infizierten linken Lunge im Vergleich mit der Anreicherung in der nicht infizierten rechten Lunge zeigt eine Korrelation der liposomalen Aufnahme an der Stelle der Infektion (linke Lunge) mit dem Lungengewicht (Fig. 14; lineare Regression: r=0,92, p(0,01). Bis zu 9% der Liposomenmarkierung wurde angereichert in der infizierten Lunge gefunden. Bezogen auf das Lipid variierte die Menge der Anreicherung von etwa 0,25 bis 1,3 µM Lipid/g Lunge (oder etwa 0,1 bis 1,4 µM Lipid/Lunge). Im Gegensatz zur infizierten linken Lunge wurde keine Korrelation zwischen dem Lungengewicht und der Liposomenanreicherung in der nicht infizierten rechten Lunge beobachtet (Fig. 14).
  • Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß PEG-DSPE enthaltende Liposomen selektiv in infizierten Lungen im Vergleich zu herkömmlichen PG-PC- Cholesterin-Liposomenformulierungen angereichert werden. Es wird beobachtet, daß diese selektive Anreicherung von PEG-DPSE enthaltenden Liposomen etwa 20-fach höher ist als die, die bei herkömmlichen (PEG:PC:Chol) Liposomen beobachtet wird (Fig. 15A). Im Unterschied dazu wurde eine HPI enthaltende liposomale Formulierung, von der berichtet wurde, daß sie für eine ausgedehnte Zirkulationszeit sorgt, auf die Fähigkeit zur selektiven Anreicherung in infiziertem Lungengewebe untersucht. Wie in Fig. 15B gezeigt ist, werden derartige Liposomen bis zu einer Konzentration von nur etwa 2- bis 3-fach höher als der von herkömmlichen Liposomen angereichert. In diesen Untersuchungen ist außerdem ersichtlich, daß, im Vergleich mit den HPI enthaltenden Liposomen, die Verabreichung von erfindungsgemäßen PEG-DSPE enthaltenden Liposomen zu einer ungefähr 10-fach höheren Konzentration der Lipidanreicherung in der infizierten Lunge führt (Figg. 15A und 15B, wobei die Einheiten auf der Ordinate zu beachten sind). Werden diese Daten als Aufnahme pro Gramm Lungengewebe ausgedrückt, wie es in den Figg. 16A und 16B gezeigt ist, so erlaubt dies die Feststellung, ob die Anreicherung, die auftritt, einfach eine feste Konzentration in der Lunge ist, die aufgrund der Vergrößerung der Lunge (Ödem) ansteigt, oder ob es einen Nettoanstieg der Anreicherung pro Gramm Lungengewebe gibt. Diese Analyse zeigt, daß die Konzentration an PEG enthaltenden Liposomen, die pro Gramm Lungengewebe angereichert werden, von grob 0,25 auf mindestens 0,75 µM/g steigt, wenn die Schwere der Infektion, die durch den Grad des Ödems bestimmt wird, ansteigt (Fig. 16A). Im Gegensatz dazu reicherte sich die liposomale Formulierung, die HPI anstelle der mit dem hydrophilen Polymeren derivatisierten Lipide enthält, im infizierten Gewebe bis zu einer maximalen mittleren Konzentration von etwa 0,075 µM/g an.
  • Figg. 18A und 18B zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen, bei denen liposomales und nicht-liposomales Gentamicinsulfat getrennt an Ratten, die zuvor einer pulmonaren Infektion mit K. pneumoniae unterzogen wurden, verabreicht wurden. Die Anreicherung von Gentamicin in der infizierten Lunge wurde gemessen, wie in Beispiel 15 beschrieben ist. Die verabreichte Dosis von nicht-liposomalem Gentamicin (15 mg/kg) war etwa 8-fach höher als die Dosis des verabreichten liposomalen Gentamicins (1,9 mg/kg). Dennoch war, wie aus Fig. 18A ersichtlich ist, die Anreicherung von Gentamicin in den Lungen von Tieren, denen die liposomalen Formulierungen gegeben wurden, im allgemeinen äquivalent oder höher als die Anreicherung von Gentamicin in den Lungen von Tieren, denen die höhere Dosis der nicht-liposomalen Formulierung über den größten Teil der überwachten Zeit gegeben wurde. Die gleichen Daten, ausgedrückt als Prozentsatz der injizierten Dosis, sind in Fig. 18B gezeigt, aus der ersichtlich ist, daß die liposornale Formulierung einen höheren Prozentsatz der injizierten Verbindung an der Stelle der Infektion abgibt.
  • Die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen liposomalen Zusammensetzungen wurde in Versuchen, die ausführliche in Beispiel 16 beschrieben sind, gezeigt. Hier wurden Ratten in der Lunge mit K. pneumoniae infiziert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. 24 Stunden später wurden den Ratten liposomale und nicht-liposomale Zusammensetzungen von Gentamicinsulfat, die radioaktiv markiertes Gentamicin als Marker enthielten, verabreicht. Proben wurden aus den Rattenlungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion entnommen, wie es angegeben ist, und auf bakteriellen Platten unter Anwendung von Standardverfahren kultiviert. Tabelle 16 faßt die Ergebnisse der Kulturen zusammen, wobei die Daten als log-Werte der koloniebildenden Einheiten (CFU), die für die Proben infizierter Lungen erhalten wurden, ausgedrückt sind. Im Vergleich mit der Verabreichung einer vergleichbaren Dosis (1,9 mg/kg) an freiem Gentamicin (ganz rechte Spalte) führte die Verabreichung einer liposomalen Zusammensetzung (PEG:PC:CH) von Gentamicinsulfat zu einer 3-log-Verringerung (1000-fach) des CFU-Werts (Fig. 19).
  • IV. Verfahren zur Lokalisierung von liposomalen antimikrobiellen Formulierungen in infizierten Bereichen
  • Wie vorstehend ausführliche beschrieben wurde, sind die erfindungsgemäßen Liposomen wirksam bei der Lokalisierung und Konzentration eines eingeschlossenen antimikrobiellen Arzneistoffs oder eines Arzneistoffs gegen Infektionen speziell in einem infizierten Bereich. Die Liposomenzusammensetzungen weisen vorzugsweise ein relativ hohes Arzneistofftragevermögen und einen minimalen Verlust an eingeschlossenem Arzneistoff während der Zeit, die erforderlich ist, damit die Liposomen sich verteilen und in den infizierten Bereich eindringen (die ersten 24 bis 48 Stunden nach der Injektion), auf. Die Liposomen sorgen also für ein wirksames Verfahren zur Konzentration einer in Liposomen eingeschlossenen therapeutischen Verbindung in einem infizierten Bereich. Erfindungsgemäß wird die antimikrobielle Verbindung in derartigen Liposornen eingeschlossen, und die liposomale Formulierung wird parenteral an ein Individuum, vorzugsweise direkt in den Blutstrom, verabreicht.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine infizierte Stelle oder ein infizierter Bereich als eine Stelle oder ein Bereich definiert, der anatomisch an einer Stelle außerhalb des Blutstroms vorhanden ist, jedoch zu einem Kapillarbett benachbart und davon aus zugänglich ist. Infizierte Bereiche, die einer Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren am besten zugänglich sind, sind durch einen akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems im Bereich der Infektion, gefolgt von einer Wanderung von Neutrophilen aus dem Blutstrom in den infizierten Bereich, charakterisiert. In diesem Fall muß eine IV-injizierte Liposomenantimikrobielle Zusammensetzung, damit sie die infizierte Stelle erreicht, den Blutstrom verlassen und in den infizierten Bereich eintreten.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Infektion durch Lokalisierung eines antimikrobiellen Mittels selektiv in dem infizierten Bereich angewandt. Bei Untersuchungen, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden, wurde Gentamicinsulfat in erfindungsgemäße, PEG enthaltende Liposomen geladen, wie es ausführlich in Beispiel 12 angegeben ist. Das antimikrobielle Mittel, das einen Teil der erfindungsgemäßen liposomalen Zusammensetzung bildet, ist eine beliebige Verbindung unter Einschluß der nachstehend angegebenen Verbindungen, die stabil in Liposomen bei einem geeigneten Beladungsfaktor eingeschlossen werden kann und die dadurch verabreicht werden kann, so daß eine therapeutisch wirksame Konzentration im infizierten Bereich erzielt wird.
  • Die Dosis der injizierten Liposomen, die erforderlich ist, um für eine therapeutisch wirksame Konzentration des Mittels an der Stelle der Infektion zu sorgen, kann recht genau durch Messung der prozentualen Anreicherung derartiger Liposomen in dem relevanten infizierten Bereich in einem geeigneten Tiermodell, wie es vorstehend beschrieben wurde, der Menge an Arzneistoff, die in die liposornale Zusammensetzung geladen wurde, und der minimalen Konzentration der Verbindung, die wirksam zur Hemmung oder Auslöschung des fraglichen infektiösen Agens ist (minimale Hemmkonzentration, MIC), bestimmt werden. Zum Beispiel ist im Fall der Gentamicin-Behandlung einer Klebsiella-Infektion, die vorstehend erläutert wurde, ein MIC-Wert von Gentamicin von etwa 1 µg/ml an der Lungenstelle für eine Behandlung einer mäßig infizierten Rattenlunge erforderlich. Die Dosis an Liposomen, die erforderlich ist, um für eine derartige Konzentration in der Lunge zu sorgen, kann auf der Basis der bekannten Menge an eingeschlossenem Arzneistoff pro Masse an liposomalem Lipid und den vorstehend erwähnten Liposomen/Arzneistoff-Verteilungsstudien berechnet werden. Auf der Basis von empirischen sowie veröffentlichten Daten für Standard-Antibiotikabehandlungen können ähnliche Berechnungen unter Verwendung von veröffentlichten Referenzstandarddosierungen für eine Reihe von antimikrobiellen therapeutischen Verbindungen durchgeführt werden (Gilman).
  • Allgemeine Klassen von antimikrobiellen Mitteln, die zur Behandlung von inneren mikrobiellen Infektionen verwendet werden, umfassen antibakterielle, antivirale und fungizide Mittel. Zusätzlich wird in Betracht gezogen, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Abgabe einer antiparasitären Verbindung, die sich für die Behandlung bestimmter Protozoen- und Helmintheninfektionen eignet, angewandt werden kann, wenn derartige Infektionen in einem Anstieg der Kapillarenpermeabilität im infizierten Bereich begleitet sind.
  • Antibakterielle Mittel, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen Penicillin-Antibiotika, Cephalosporin- Antibiotika, Aminoglycosid-Antibiotika, Tetracycl in-Antibiotika, Sulfonamid-Antibiotika, Sulfon-Antibiotika, Macrolid-Antibiotika, Chinolon- Antibiotika, Imipenem, Isoniazid, Ethambutol, Aztreonam, Chloramphenicol, Erythromycin, Clindamycin, Spectinomycin, Vancomycin, Rifampin, Clofazimin, Bacitracin, Methenamin und Nitrofurantoin. Antivirale Mittel umfassen Nucleosidanaloga (Zidovudine, Acyclovir, Gangcyclovir, Vidarabin, Idoxuridin, Trifluridin, Ribavirin), Foscarnet, Amantadin und Rimantadin. Die Liposomen können auch antimikrobielle therapeutische oder imunmodulierende Peptid- und Proteinarzneistoffe, wie α-Interferone, die sich für eine ergänzende antivirale Therapie eignen, enthalten. Derartige Mittel können in den Liposomen allein oder in Kombination mit weiteren Mitteln vorhanden sein. Fungizide Mittel umfassen Amphotericin B, Flucytosin, Imidazole und Triazole sowie Griseofulvin. Liposomale Formulierungen, die geeignete Kombinationen derartiger antirnikrobieller Mittel enthalten, werden ebenfalls in Betracht gezogen, um Infektionen zu behandeln, bei denen üblicherweise eine Kombinationstherapie verschrieben wird.
  • Eine verringerte Toxizität kann zwar zu einer erhöhten Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens beitragen; die selektive Lokalisierung des Arzneistoffs durch liposomale Extravasation ist jedoch ebenfalls wichtig für eine verbesserte Arzneistoffwirksamkeit. Indem also die Verabreichung höherer Konzentrationen an Arzneistoff aufgrund der verringerten Arzneistofftoxizität in Liposomen und der selektiven Liposomenlokalisierung in der interzellulären Flüssigkeit des infizierten Bereiches ermöglicht wird, sorgt das erfindungsgemäße Arzneistoffabgabe- und Behandlungsverfahren für eine bessere Wirksamkeit.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß die Fähigkeit, eine Verbindung selektiv in einem infizierten Bereich durch Liposomenextravasation zu lokalisieren, auch für die nicht-invasive Diagnose und Lokalisierung von infizierenden Mitteln genutzt werden kann. Dabei wird ein Mikrobenbindungsmittel, typischerweise ein markierter Antikörper, in Liposomen eingeschlossen, die dann IV an das untersuchte Individuum verabreicht werden. Nach einer gewählten Zeitspanne von typischerweise 24 bis 48 Stunden wird das Individuum überwacht, z. B. durch gamma-Scintillationsradiographie im Fall eines radioaktiv markierten Antikörpers oder durch kernmagnetische Resonanz (NMR) im Fall eines paramagnetischen Mittels, um Bereiche der lokalen Aufnahme des bildgebenden Mittels nachzuweisen.
  • V. Verfahren zur Behandlung von infizierten Bereichen
  • Erfindungsgemäß werden Liposomen, die ein derivatisiertes biokompatibles hydrophiles Polymeres enthalten, das wirksam hinsichtlich einer Verlängerung der Zirkulationszeit im Blut ist, verwendet, um therapeutische Mittel, die geeignet zur Behandlung einer Reihe von lokalisierten Infektionen oder systemischen Infektionen mit lokalisierten Herden im Körper sind, einzuschließen. Wie vorstehend beschrieben wurde, sind infizierte Bereiche oder Stellen, die einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zugänglich sind, vorzugsweise zum kapillaren Blutstrom benachbart oder darüber zugänglich, und bei ihnen Tritt eine erhöhte kapillare Durchlässigkeit als Reaktion auf eine Infektion auf. Geeignete therapeutische Mittel für das Einschließen in Liposomen und für die Verwendung gegen eine Reihe von Erkrankungen können mit Bezug auf einen oder mehrere medizinische Standardtexte, wie Gilman, bestimmt werden.
  • Hier werden verschiedene Zustände zusammengefaßt, die beispielhaft für Typen von Infektionen sind, die mit dem Verfahren und den liposomalen Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können. Es ist darauf hinzuweisen, daß derartige Zustände lediglich als Beispiele angegeben werden und daß es nicht beabsichtigt ist, die Eignung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken. Es ist darauf hinzuweisen, daß im allgemeinen das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren wirksam bei der Behandlung von Infektionen mikrobiellen Ursprungs unter Einschluß von viralen Infektionen, Pilzinfektionen und bakteriellen Infektionen sowie von Infektionen parasitären oder helminthischen Ursprungs ist.
  • Pulmonare Infektionen weisen eine Anzahl von Ätiologien und Erscheinungsformen auf. Arninoglycosid-Antibiotika sind wirksame Therapeutika gegen die virulenten gram-negativen Stämme von Bakterien, die die hervorrufenden Agentien bei Pneumonien sind; aufgrund ihrer Toxizität wird die Verwendung derartiger Mittel jedoch nur im Fall von lebensbedrohenden Infektionen, wie solchen durch Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter, Klebsiella, Serratia und andere Organismen, von denen festgestellt wird, daß sie gegen weniger toxische Mittel resistent sind, vorgeschlagen. Die Behandlung einer Klebsiella-Infektion der Lunge wird unter Anwendung des Behandlungsverfahrens und der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch Verabreichung einer Dosis einer liposomalen Formulierung eines Aminoglycosids, wie Gentamicin, an den Patienten durchgeführt. Eine derartige Formulierung wird in einer wirksamen Dosis, um für eine Konzentration des Aminoglycosids, die wirksam zur Hemmung oder Verringerung des Wachstums des Mikroorganismus ist, zu sorgen, verabreicht. In der Praxis ist eine Konzentration an Gentamicin in der Lunge von etwa 1 µg/ml ausreichend, um für eine therapeutische Wirkung zu sorgen. Entsprechend können Lungeninfektionen und insbesondere Lungenabszesse, die von dem gramnegativen Bacterium Bacteroides hervorgerufen werden, in wirksamer Weise durch Verabreichung einer liposomalen Zusammensetzung behandelt werden, die Clindamicin oder ein Cephalosporin oder Penicillin enthält. Anaerobe Bacteroides-Infektionen, die andere Bereiche des Körpers betreffen, wie den Darm, das Becken oder das Gehirn, sind derartigen Behandlungen allein oder in Kombination mit anderen antimikrobiellen Mitteln unter Einschluß von Chloramphenicol und Metronidazol ebenfalls zugänglich.
  • Wie vorstehend beschrieben wurde, sind die Zellen der Leber und der Milz, die normalerweise (in Abwesenheit einer Infektion) Liposomen anreichern, die fixierten Makrophagen, die einen Teil des lymphoretikularen Systems oder RES bilden. Die Anreicherung von Liposomen in diesen Zellen erlaubt nicht notwendigerweise die Voraussage der Abgabe von Arzneistoff an benachbarte Gewebezellen, wie Hepatocyten im Leberparenchym. Andererseits können derartige Zellen lokalisierte Stellen bestimmter Infektionen, wie viraler Hepatitis, sein. Es wird angenommen, daß beim Vorhandensein einer derartigen Infektion Hepatocyten selektiv erfindungsgemäße liposomale Arzneistoffzusammensetzungen anreichern. In Liposomen eingeschlossene DNA-Polymeraseinhibitoren, wie Zidovudin, können bei der Behandlung derartiger Infektionen nützlich sein.
  • Das zentrale Nervensystem unter Einschluß des Gehirns, des Rückenmarks und der Meningen ist ebenfalls anfällig für eine Infektion durch eine Anzahl von verursachenden Agentien. Der Arzneistoffdurchtritt vom Blut in die Gewebe des zentralen Nervensystems wird zwar im allgemeinen durch die "Blut-Hirn-Schranke" behindert; es ist jedoch bekannt, daß diese Schranke in erheblichem Maße während Himhautinfektionen zusammenbricht, was derartige Stellen der Infektion besser zugänglich für die erfindungsgemäßen liposomalen Präparate macht. Es wird daher angenommen, daß eine Anzahl schwerer Infektionen des zentralen Nervensystems ebenfalls einer Behandlung durch in Liposomen eingeschlossene antimikrobielle Zusammensetzungen zugänglich ist. Beispiele für derartige Infektionen und in Liposomen eingeschlossene Arzneistoffe, die sich für die Behandlung eignen, umfassen die Behandlung bei Cryptococcus durch Amphotericin oder Fluconazol, bei Pneurnococcus, Pseudomonas, Listeria und Meningococcus durch Penicilline, Erythromycin, Gentamicin oder Cephalosporine. Zusätzlich ist die bakterielle Meningitis aufgrund von Hernophilus influenzae oder Streptococcus pneumoniae in einigen Fällen mit Penicillinen oder Cephalosporinen behandelbar; insbesondere bei Patienten, die Penicillin- Allergien zeigen, bleibt jedoch Chloramphenicol der Arzneistoff der Wahl für die Behandlung derartiger Infektionen, und zwar selbst angesichts seiner schweren toxischen Nebenwirkungen unter Einschluß von Blutdyscrasie. Es wird angenommen, daß der liposomale Einschluß von Chloramphenicol die Dosis der Verbindung verringert, der nicht infizierte, Arzneistoffempfindliche Gewebe unter Einschluß des Knochenmarks ausgesetzt sind.
  • Zahlreiche Hautinfektionen sprechen zwar auf eine topische Behandlung an; bestimmte chronische Infektionen der Dermis oder Epidermis können jedoch eine systemische Arzneistoffbehandlung für wirksame therapeutische Ergebnisse erfordern. Eine derartige dermale Infektion wird durch Herpes-Viren hervorgerufen. Die Behandlung mit in Liposomen eingeschlossenem Acyclovir ist bei derartigen Infektionen geeignet.
  • Aspergillus ist ein Pilz, der als infektises Agens bei praktisch jedem Organ des Körpers in Betracht kommt. Er wird häufig als hervorrufendes Agens bei pervasiven Lungeninfektionen, insbesondere bei Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem, gefunden. Die Behandlung der Wahl für diese Art von Infektion ist Amphotericin B. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird einem Patienten in Liposomen eingeschlossenes Amphotericin B in einer wirksamen Dosis, um für eine Konzentration im infizierten Gewebe von etwa 2 µg/ml zu sorgen, verabreicht.
  • Eine Anzahl von weiteren Stellen im Körper sind besonders zugänglich für das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren, und zwar unter Einschluß von Sekundärinfektionen nach der Implantation einer Prothese oder einer medizinischen Vorrichtungen, wie einer Herzklappe oder eines innenliegenden Katheters. Derartige Infektionen sind durch das Vorhandensein eines Biofilms charakterisiert, der sie relativ resistent gegenüber Standarddosen von antibiotischen Mitteln macht. Ein Bereich, der häufig als Folge des Vorhandenseins eines innenliegenden Katheters infiziert ist, ist die Prostata, bei der eine Infektion durch Pseudomonas besonders schwerwiegend ist. In derartigen Fällen ist die Behandlung mit hohen Konzentrationen an Penicillin- oder Cephalosporin-Antibiotika wünschenswert.
  • Entsprechend kann eine Endocarditis sekundär nach einer Implantation einer Herzklappe auftreten. Staphylococcus ist ein häufiges verursachendes Agens derartiger Infektionen. Das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren wird zur Abgabe ausreichend hoher Konzentrationen an Vancomycin an das Endocardium verwendet, um eine derartige Infektion zu beseitigen. Bei Verabreichung in nicht-liposomaler Form ist Vancomycin mit mehreren möglicherweise schwächenden toxischen Eigenschaften verbunden, die seine Verwendung in wirksamen Konzentrationen begrenzen.
  • Entsprechend ist Vancomycin nützlich bei der Behandlung von staphylococcaler Osteomyelitis, die häufig als Komplikation einer Knochenmarkstransplantation oder bei der Gelenkersatzchirurgie auftritt. Cephalosporine und Penicilline sind ebenfalls wirksam gegen bestimmte Formen von Osteomyelitis, und es wird in Betracht gezogen, daß liposomale Formulierungen dieser Verbindungen sich für die Behandlung dieses Zustands eignen.
  • Die nachstehenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung von liposomalen Formulierungen mit erhöhten Zirkulationszeiten, die selektiv in infiziertem Gewebe angereichert werden, und Verfahren zur Verabreichung derartiger liposomaler Formulierungen in Tiermodellen der Infektion. Die Beispiele sollen die speziellen Liposomenzusammensetzungen und Verfahren der Erfindung erläutern, sie sollen deren Schutzumfang jedoch in keiner Weise beschränken.
  • Materialien
  • Cholesterin (Chol) wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Sphingomyelin (SM), Ei-Phosphatidylcholin (Lecithin oder PC), partiell hydriertes PC mit der Zusammensetzung IV40, IV30, IV20, IV10 und IV1, Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylethanolamin (PE), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dipalmitoyl-PC (DPPC), Dioleyl-PC (DOPC) und Distearoyl- PC (DSPC) wurden von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) oder Austin Chemical Company (Chicago, IL) bezogen. Distearylphosphatidylethanolamin wurde von Calbiochem (La Jolla, CA) bezogen.
  • [¹²&sup5;I]-Tyraminylinul in wurde gemäß veröffentlichter Verfahren hergestellt. &sup6;&sup7;Gallium-citrat wurde von NEN Neoscan (Boston, MA) bezogen. [¹²&sup5;I]-Gentamlcin wurde von NEN (Cambridge, MA) bezogen. Doxorubicin-HCl und Epirubicin-HCl wurden von Adria Laboratories (Columbus, OH) oder Farmitalia Carlo Erba (Mailand, Italien) bezogen.
  • Polyvinylalkohol (PVA), Glycolsäure und Milchsäure wurden von Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Polymilchsäure wurde von ICN (Cleveland, OH) bezogen.
  • Beispiel 1 Herstellung von PEG-PE, verknüpft durch Cyanurchlorid A. Herstellung von aktiviertem PEG
  • 2-O-Methoxypolyethylenglycol-1900-4,6-dichlor-1,3,5-triazin, das bereits als aktiviertes PEG bezeichnet wurde, wurde hergestellt, wie es in J. Biol. Chem., Bd. 252 (1977), S. 3582 beschrieben ist, und zwar mit den folgenden Modifizierungen.
  • Cyanurchlorid (5,5 g; 0,03 Mol) wurde in 400 ml wasserfreiem Benzol mit einem Gehalt an 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst, und PEG- 1900 (19 g; 0,01 Mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde filtriert, und 600 ml Petrolether (Siedebereich 35 bis 60º) wurde langsam unter Rühren zugegeben. Der feinverteilte Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und erneut in 400 ml Benzol gelöst. Das Verfahren aus Ausfällen und Filtration wurde mehrere Male wiederholt, bis der Petrolether frei von restlichem Cyanurchlorid war, was durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie über eine Säule (250 × 3,2 mm) mit 5-m "LiChrosorb" (E. Merck) bei Entwicklung mit Hexan und Nachweis mit einem Ultraviolettdetektor bestimmt wurde. Die Titration von aktiviertem PEG-1900 mit Silbernitrat nach einer Hydrolyse über Nacht in einem wäßrigen Puffer bei pH-Wert 10,0 und Raumtemperatur ergab einen Wert von 1,7 Mol freigesetztes Chlorid/Mol PEG.
  • Eine TLC-Analyse des Produkts wurde mit Umkehrphasen-TLC-Platten durchgeführt, die von Baker erhalten wurden, und zwar unter Verwendung von Methanol/Wasser 4:1 (Vol./Vol.) als Entwickler und Behandlung mit Ioddampf zur Visualisierung. Unter diesen Bedingungen erschien das als Ausgangsmaterial eingesetzte Methoxypolyglycol-1900 bei Rf = 0,54 bis 0,60. Das aktivierte PEG erschien bei Rf = 0,41. Nicht umgesetztes Cyanurchlorid erschien bei Rf = 0,88 und wurde entfernt.
  • Das aktivierte PEG wurde auf Stickstoff analysiert, und eine geeignete Korrektur wurde bei der Bestimmung der Menge an Reaktanten, die in den weiteren Synthesestufen verwendet wurde, angewandt. Wenn also das Produkt nur 20 % der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann wurde die Menge an Material, die in der nächsten Synthesestufe verwendet wurde, um 100/20 oder das 5-fache erhöht. Wenn das Produkt 50 % der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann war nur eine Erhöhung von 100/50 oder eine zweifache Erhöhung erforderlich.
  • B. Herstellung von N-(4-Chlor-polyethylenglycol-1900)-1,3,5-triazinyl-ei-phosphatidylethanolamin
  • In einem Teströhrchen mit Schraubverschluß wurden 0,74 ml einer 100 mg/ml (0,100 mMol) Stammlösung von Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt und dann zu dem Rückstand des aktivierten PEG, das in Abschnitt A beschrieben wurde, in einer solchen Menge gegeben, daß 205 mg (0,100 mMol) bereitgestellt wurden. Zu diesem Gemisch wurden 5 ml wasserfreies Dimethylformamid gegeben. 27 µl (0,200 mmol) Triethylamin wurden zu dem Gemisch gegeben, und die Luft wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gemisch wurde über Nacht in einem Sandbad erwärmt, das bei 110ºC gehalten wurde.
  • Das Gemisch wurde dann unter Vakuum zur Trockene eingeengt, und es wurde eine pastenartige Masse aus kristallinem Feststoff erhalten. Dieser Feststoff wurde in 5 ml eines Gemisches auf 4 Volumenteilen Aceton und 1 Volumenteil Essigsäure gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde auf eine chromatographische Absorptionssäule von 21 mm × 240 mm, die mit Siliciumdioxidgel (Merck Kieselgel 60, 70 bis 230 mesh) gepackt war und zuerst mit einem Lösungsmittel, das aus Aceton:Essigsäure 80:20 (Vol./Vol.) bestand, befeuchtet worden war, aufgegeben.
  • Die Säulenchromatographie wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt, und getrennte Anteile von 20 bis 50 ml ausströmendes Medium wurden gesammelt. Jede Portion an ausströmendem Medium wurde durch TLC auf Siliciumdioxidgel-beschichteten Platten unter Verwendung von 2- Butanon:Essigsäure:Wasser 40:25:5 (Vol./Vol./Vol.) als Entwickler und einer Ioddampfbehandlung zur Visual isierung untersucht. Fraktionen, die nur Material mit einem Rf-Wert von etwa 0,79 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Ein Trocknen bis zu konstantem Gewicht unter Hochvakuum ergab 86 mg (31,2 µMol) an nahezu farblosem, festem N-(4-Chlor-polyglycol-1900)-1,3,5-triazinyl-ei-phosphatidylethanolamin mit einem Gehalt an Phosphor.
  • Die feste Verbindung wurde in 24 ml Ethanol/Chloroform; 50/50 Chloroform aufgenommen und zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert Einengen der geklärten Lösung zur Trockene unter Vakuum ergab 21 mg (7,62 µMol) eines farblosen Feststoffs.
  • Beispiel 2 Herstellung von Carbamat- und "Eid-verknüpften hydrophilen Polymeren mit PE A. Herstellung des Imidazolcarbamts von Polyethylenglycolmethylether-1900
  • 9,5 g (5 mMol) Polyethylenglycolmethylether-1900 (bezogen von Aldrich Chemical Co.) wurden in 45 ml Benzol gelöst, das über Molekularsieben getrocknet worden war. 0,89 g (5,5 mMol) reines Carbonyldiimidazol wurden zugegeben. Die Reinheit wurde durch ein Infrarotspektrum überprüft. Die Luft im Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das Gefäß wurde geschlossen und in einem Sandbad 16 Stunden auf 75ºC erwärmt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und bei Raumtemperatur bildete sich eine klare Lösung. Die Lösung wurde mit 50,0 ml trockenem Benzol verdünnt und in einem Kühlschrank als Stammlösung mit 100 µMol/ml Imidazolcarbamat von PEG-Ether-1900 gelagert.
  • B. Herstellung des Phosphatidylethanolamincarbamats von Polyethylenglycolmethylether-1900
  • 10,0 ml (1 mMol) der Stammlösung von 100 mmol/ml des Imidazolcarbamats von Polyethylenglycolmethylether-1900 wurden in einen 10 ml fassenden birnenförmigen Kolben pipettiert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. 3,7 ml einer Lösung mit 100 mg/ml Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform (0,5 mMol) wurde zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. 2 ml 1,1,2,2-Tetrachlorethylen und 139 µl (1,0 mMol) Triethylamin VI wurden zugegeben. Das Gefäß wurde geschlossen und 6 Stunden in einem bei 95ºC gehaltenen Sandbad erwärmt. Nach dieser Zeit wurde eine Dünnschichtchromatographie mit Fraktionen des vorstehenden Gemisches durchgeführt, um das Ausmaß der Konjugation auf SiO&sub2;-beschichteten TLC-Platten zu bestimmen, wobei Butanon/Essigsäure/Wasser 40/5/5 (Vol./Vol./Vol.) als Entwickler verwendet wurde. Die Visualisierung mit Ioddampf ergab, daß der größte Teil des freien Phosphatidylethanolamins bei Rf = 0,68 reagiert hatte und durch ein phosphorhaltiges Lipid bei Rf = 0,78 bis 0,80 ersetzt worden war.
  • Das Lösungsmittel aus dem restlichen Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid aufgenommen und auf eine chromatographische Absorptionssäule von 21 mm × 270 mm, die mit Merck-Kieselgel 60 (Siliciumdioxidgel mit 70 bis 230 mesh) gepackt war, das zunächst mit Methylenchlorid gespült worden war, gegeben.
  • Das Gemisch wurde durch die Säule geleitet, wobei der Reihe nach die folgenden Lösungsmittel verwendet wurden: Tabelle 1
  • Portionen von 50 ml des ausströmenden Mediums wurden gesammelt, und jede Portion wurde durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Anwendung der I&sub2;-Dampfabsorption zur Visualisierung nach der Entwicklung mit Chloroform/Methanol/Wasser/konzentriertem Ammoniumhydroxid 130/70/8/0,5 % (Vol./Vol./Vol./Vol.) untersucht. Der größte Teil der Phosphate wurde in den Fraktionen 11, 12, 13 und 14 gefunden.
  • Diese Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum zur Trockene eingeengt und im Hochvakuum bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Sie ergaben 669 mg eines farblosen Wachses aus Phosphatidylethanolamincarbamat von Polyethylenglycolmethylether. Dies entspricht 263 µMol und einer Ausbeute von 52,6 %, bezogen auf das Phosphatidylethanolamin.
  • Ein NMR-Spektrum des Produkts, gelöst in Deuterochloroform, zeigte Peaks, die dem Spektrum für Ei-PE entsprachen, und zwar zusammen mit einem starken Singulett aufgrund der Methylengruppen der Ethylenoxidkette bei δ = 3,4 ppm. Das Verhältnis von Methylenprotonen aus dem Ethylenoxid zu den endständigen Methylprotonen aus den PE-Acylgruppen war groß genug, um ein Molekulargewicht von etwa 2000 für den Polyethylenoxidanteil des Moleküls des als Produkt gewünschten Polyethylenglycol-konjugierten Phosphatidylethanolamincarbamats (Molekulargewicht: 2654) zu bestätigen.
  • C. Herstellung des Polymilchsäureamids von Phosphatidylethanolamin
  • 200 mg (0,1 mMol) Poly-(milchsäure), Molekulargewicht: 2000 (ICN, Cleveland, Ohio) wurden in 2,0 ml Dimethylsulfoxid unter Erwärmen gelöst, während gerührt wurde, um das Material vollständig zu lösen. Anschließend wurde die Lösung sofort auf 65ºC gekühlt und in ein Gemisch aus 75 mg (0,1 mMol) Distearylphosphatidylethanolamin (Cal. Biochem, La Jolla) und 41 mg (0,2 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid gegossen. Anschließend wurden 28 ml (0,2 mmol) Triethylamin zugegeben, und die Luft wurde aus dem Röhrchen durch Stickstoffgas verdrängt. Das Röhrchen wurde verschlossen und 48 Stunden auf 65ºC erwärmt.
  • Nach dieser Zeit wurde das Röhrchen auf Raumtemperatur gekühlt, und 6 ml Chloroform wurden zugegeben. Die Chloroformlösung wurde dreimal nacheinander mit Volumina von 6 ml Wasser gewaschen und nach jedem Waschgang zentrifugiert. Die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt. Die zurückbleibende Chloroformphase wurde mit Unterdruck filtriert, um suspendiertes Distearoylphosphatidylethanolamin zu entfernen. Das Filtrat wurde unter Vakuum getrocknet, wobei man 212 rng halbkristallinen Feststoff erhielt.
  • Dieser Feststoff wurde in 15 ml eines Gemisches aus 4 Volumenteilen Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser gelöst, durch ein Bett mit einer Tiefe von 50 mm und einem Durchmesser von 21 mm aus H&spplus;-Dowex 50-Kationenaustauschharz geleitet und mit 100 ml des gleichen Lösungsmittels gewaschen. Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt, wobei man 131 mg farbloses Wachs erhielt.
  • 291 rng eines derartigen Wachses wurden in 2,5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 mm × 280 mm, die mit Silicagel, das mit Chloroform benetzt worden war, gepackt war, aufgetragen. Das Chromatogramm wurde entwickelt, indem durch die Säule nacheinander jeweils 100 ml an:
  • 100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
  • Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden aufbewahrt und durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Verwendung von CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als Entwickler und I&sub2;-Dampfabsorption zur Visualisierung untersucht.
  • Die Portionen von 275 bis 325 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums enthielten ein einziges Material, PO&sub4; +, mit einem Rf-Wert von 0,89. Nach Vereinigen und Einengen zur Trockene ergaben diese Portionen 319 mg farbloses Wachs. Die Phosphatanalyse bestätigte ein Molekulargewicht von etwa 115 000. Dieses Material wurde zur Herstellung von Polymilchsäure-PE enthaltenden Liposomen verwendet, die in den in Fig. 10A zusammengefaßten Versuchen verwendet wurden.
  • Bei diesem Herstellungsverfahren trat die Polymerisierung der Poly(milchsäure) offensichtlich mit einer vergleichbaren Geschwindigkeit zu der, mit der sie mit Phosphatidylethanolamin reagierte, auf. Diese Nebenreaktion könnte wahrscheinlich minimiert werden, indem mit stärker verdünnten Lösungen der Reaktanten gearbeitet wird.
  • D. Herstellung des Poly-glycolsiure-amids von DSPE
  • Ein Gemisch aus 266 mg (3,50 mMol) Glycolsäure, 745 mg (3,60 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, 75 mg (0,10 mMol) Distearoylphosphatidylethanolamin, 32 µl (0,23 mMol) Triethylamin und 5,0 ml trockenem Dimethylsulfoxid wurde auf 75ºC unter einer Stickstoffatmosphäre erwärmt, auf Raumtemperatur gekühlt, anschließend mit einem gleichen Volumen an Chloroform verdünnt und dann dreimal nacheinander mit gleichen Volumina an Wasser gewaschen, um das Dimethylsulfoxid zu entfernen. Es wurde jedesmal zentrifugiert, und die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt.
  • Die Chloroformphase wurde unter Unterdruck futriert, um eine kleine Menge an suspendiertem Material zu entfernen. Das Filtrat wurde dann unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 572 mg eines blaß bernsteinfarbenen Wachses erhielt. Dieses Material wurde erneut in 2,5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 mm × 270 mm mit Siliciumdioxidgel (Merck Kieselgel 60), das zuvor mit Chloroform benetzt worden war, aufgetragen.
  • Das Chromatogramm wurde entwickelt, indem durch die Säule nacheinander jeweils 100 ml an
  • 100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
  • 70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
  • Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden gesammelt und jeweils durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Verwendung von CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als Entwickler untersucht. Fast das gesamte PO&sub4;-positive Material befand sich in der Portion von 275 bis 300 ml des ausströmenden Mediums. Einengen dieser Portion zur Trockene unter Vakuum, gefolgt von Trocknen im Hochvakuum, ergab 281 mg farbloses Wachs. Die Phosphatanalyse bestätigte ein Molekulargewicht von 924 000. Dieses Material wurde zur Herstellung von Polyglycolsäure-PE enthaltenden Liposomen verwendet, die in den in Fig. 10A zusammengefaßten Versuchen verwendet wurden.
  • Die Veränderung des Lösungsmittelvolumens während der Reaktion und der molaren Verhältnisse von Glycolsäure und Dicyclohexylcarbodiimid führt wahrscheinlich zu Molekülen anderer Größe.
  • E. Herstellung des Polyglycolsiure/Polymilchsäureamids von PE
  • Der gleiche synthetische Ansatz, der vorstehend ausführlich angegeben wurde, kann auf die Herstellung von statistischen Polymilchsäure/ Polyglycolsäure-Copolymeren, die chemisch mit PE über eine Amidbindung verknüpft sind, angewandt werden. In diesem Fall werden äquimolare Mengen an Distearoylphosphatidylethanolamin und einem 1-zu-1-Gemisch von Polyglycolsäure und Polymilchsäure mit einem dreifachen molaren Überschuß an Dicyclohexylcarbodiimid und einem zweifachen molaren Überschuß an Triethylamin in einem ausreichenden Volumen an Dimethylsulfoxid, um alle Komponenten zu lösen, bei 75ºC gemischt. Man läßt die Reaktion 48 Stunden unter einer inerten Atmosphäre ablaufen. Das Produkt wird durch Säulenchromatographie, wie es vorstehend für die Polymilchsäure- und Polyglycolsäureamide von PE beschrieben wurde, gereinigt.
  • F. Herstellung des Polyvinylalkoholcarbamats von PE
  • 10 g Polyvinylalkohol (PVA) mit einem Molekulargewicht von 50 000 wurden in 200 ml Wasser unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde auf 45ºC gekühlt und filtriert. Die Lösung wurde dann mit einem gleichen Volumen an Aceton gemischt, und der erhaltene feste Niederschlag wurde durch Filtration (Whatman Nr. 1) entfernt. Eine PVA-Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht (MW) wurde aus dem Filtrat durch Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen. Man erhielt eine Ausbeute von 920 mg.
  • PE wurde mit Carbonyldiimidazol (CDI) in Gegenwart von Triethylamin (TEA) in einem molaren Verhältnis von 1:1,1:1 (PE:CDI:TEA) in Benzol bei 75ºC für 4 Stunden umgesetzt. Eine niedermolekulare Fraktion von PVA, die hergestellt wurde, wie es vorstehend ausführlich angegeben wurde, wurde dann zugegeben (0,1 µ pro Mol PE), und die Reaktion wurde bei 75ºC für 24 Stunden fortgesetzt. Das resultierende PVA-PE wurde verwendet, um Liposomen herzustellen, die in den in Fig. 10B zusammengefaßten Versuchen verwendet wurden.
  • Beispiel 3 Herstellung von Ethylen-verknüpftem PEG-PE A. Herstellung von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol
  • Die Herstellung von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol wird im Reaktionsschema, das in Fig. 3 gezeigt ist, erläutert.
  • 15,0 g (10 inmol) Polyethylenglycol (Molekulargewicht: 1500; Aldrich Chemical) wurden in 80 ml Benzol gelöst. 1,40 ml (11 mMol) Chlortrimethylsilan (Aldrich Chemical Co.) und 1,53 ml (1 mMol) Triethylamin wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden unter einer inerten Atmosphäre gerührt.
  • Das Gemisch wurde mit Unterdruck filtriert, um Kristalle von Triethylamrnoniumchlorid abzutrennen, und die Kristalle wurden mit 5 ml Benzol gewaschen. Filtrat und Benzolwaschflüssigkeit wurden vereinigt. Diese Lösung wurde unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 15,83 g farbloses Öl erhielt, das sich beim Stehen verfestigte.
  • TLC des Produkts auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten unter Verwendung eines Gemisches aus 4 Volumenteilen Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser als Entwickler und Ioddampfvisualisierung zeigte, daß das gesamte Polyglycol- 1500 (Rf = 0,93) verbraucht und durch ein Material mit Rf = 0,82 ersetzt worden war. Ein Infrarotspektrum zeigte Absorptionsmaxima, die nur für Polyglycole charakteristisch sind.
  • Die Ausbeute an I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol (Molekulargewicht: 1500) war nahezu quantitativ.
  • B. Herstellung des Trifluormethansulfonylesters von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol
  • 15,74 g (10 mMol) kristallines I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol, das vorstehend erhalten worden war, wurden in 40 ml wasserfreiem Benzol gelöst und in einem Bad von zerstoßenem Eis gekühlt. 1,53 ml (11 mMol) Triethylamin und 1,85 ml (11 mMol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid, das von Aldrich Chemical Co. bezogen wurde, wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht unter einer inerten Atmosphäre gerührt, bis das Reaktionsgemisch seine Farbe nach braun änderte.
  • Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck verdampft, und die zurückbleibende sirupartige Paste wurde mit Methylenchlorid auf 100,0 ml verdünnt. Aufgrund der großen Reaktivität von Trifluormethansulfonsäureestern wurde keine weitere Reinigung des Trifluormethansulfonsäureesters von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol unternommen.
  • C. Herstellung von N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE
  • 10 ml der Methylenchlorid-Stammlösung des Trifluormethansulfonylesters von 1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol wurden unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man etwa 1,2 g Rückstand (ungefähr 0,7 mMol) erhielt. Zu diesem Rückstand wurden 3,72 ml einer Chloroformlösung, die 372 mg (0,5 Inmol) Ei-PE enthielt, gegeben. Zu der erhaltenen Lösung wurden 139 µl (1,0 mMol) Triethylamin gegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. Zu dem erhaltenen Rückstand wurden 5 ml trockenes Dimethylformamid und 70 µl (0,50 mmol) Triethylamin (VI) gegeben. Die Luft aus dem Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das Gefäß wurde verschlossen und in einem Sandbad 22 Stunden auf 110 C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft, wobei man 1,58 g eines bräunlich gefärbten Öls erhielt.
  • Eine chromatographische Absorptionssäule von 21 × 260 mm, die mit Kieselgel 60-Siliciumdioxid von 70 bis 230 mesh gefüllt war, wurde vorbereitet und mit einem Lösungsmittel gespült, das aus 40 Volumenteilen Butanon, 25 Volumenteilen Essigsäure und 5 Volumenteilen Wasser bestand. Das Rohprodukt wurde in 3 ml des gleichen Lösungsmittels gelöst und auf die chromatographische Säule übertragen. Das Chromatogramm wurde mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt, und aufeinanderfolgende Portionen von 30 ml des ausströmenden Mediums wurden jeweils durch TLC untersucht.
  • Bei dem TLC-Assaysystem wurden Siliciumdioxidgel-beschichtete Glasplatten mit der Lösungsmittelkombination Butanon/Essigsäure/Wasser 40/25/5 (Vol./Vol./Vol.) verwendet. Eine Ioddampfabsorpt ion diente der Visualisierung. In diesem Lösungsrnittelsystem erschien das N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE bei einem Rf-Wert von 0,78. Unverändertes PE erschien bei Rf = 0,68.
  • Das gewünschte N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE war der Hauptbestandteil der Portionen von 170 bis 300 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur Trockene unter Vakuum ergaben diese Portionen 111 mg eines blaßgelben Öls der Verbindung.
  • D. Herstellung von N-Polyethylenglycol 1500: Entfernung der Schutzgruppe von Phosphatidylethanolamin mit Essigsäure
  • Nach der Chromatographie wurde die PE-Verbindung in 2 ml Tetrahydrofuran gelöst. Dazu wurden 6 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 3 Tage bei 23ºC stehengelassen. Das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, wobei man 75 mg eines blaßgelben Wachses erhielt. TLC auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten, die mit einem Gemisch aus 4 Volumenteilen Ethanol und 1 Volumenteil Wasser entwickelt wurden, zeigte, daß eine gewisse Menge an freiem PE und eine gewisse Menge an Polyglycol-ähnlichem Material sich während der Hydrolyse gebildet hatten. Der Rückstand wurde in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 3 ml einer Lösung aus Ethanol:Wasser 80:20 (Vol./Vol.) verdünnt. Das Gemisch wurde auf eine chromatographische Absorptionssäule von 10 mm × 250 mm aufgetragen, die mit Siliciumdioxidgel mit Octadecyl-gebundener Phase gepackt worden war, und die Säule wurde mit Ethanol:Wasser 80:20 (Vol.-%) entwickelt, wobei aufeinanderfolgende Portionen von 20 ml des ausströmenden Mediums gesammelt wurden. Das ausströmende Medium wurde durch Umkehrphasen-TLC untersucht. Fraktionen, die nur Produkt mit Rf = 0,08 bis 0,15 enthielten, wurden vereinigt. Dies waren typischerweise die Portionen von 20 bis 100 ml des ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur Trockene unter Vakuum ergaben diese Portionen 33 mg farbloses Wachs PEG- PE, was einer Ausbeute von nur 3 %, bezogen auf das als Ausgangsmaterial verwendete Phosphatidylethanolamin, entspricht.
  • Die NMR-Analyse zeigte, daß dem Produkt sowohl PE-Reste als auch Polyethylenglycol-Reste einverleibt waren, daß jedoch ungeachtet der günstig erscheinenden Elementaranalyse die Kettenlänge der Polyglycolkette auf etwa 3 bis 4 Ethylenoxidreste verringert worden war. Das hergestellte Produkt wurde zur Herstellung von PEG-PE-Liposomen verwendet.
  • E. Herstellung von N-Polyethylenglycol 1500-P.E. durch Entfernung der Schutzgruppe mit Fluorid
  • 500 mg rohes N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol-PE wurden in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 189 mg (0,600 inmol) Tetrabutylammoniumfluorid wurden zugegeben, und es wurde gerührt, bis sich das Material gelöst hatte. Die Reaktanten wurden über Nacht bei Raumtemperatur (20ºC) stehengelassen.
  • Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde in 10 ml Chloroform gelöst, zweimal nacheinander mit Portionen von 10 ml Wasser gewaschen und zentrifugiert, um die Chloroformphase und die Wasserphase zu trennen. Die Chloroformphase wurde unter verringertem Druck eingeengt, wobei man 390 mg eines orangebraunen Wachses erhielt, von dem festgestellt wurde, daß es sich um eine unreine N- Polyethylenglycol 1500-PE-Verbindung handelte.
  • Dieses Wachs wurde erneut in 5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 × 270 mm mit Siliciumdioxidgel, das mit Chloroform befeuchtet worden war, aufgetragen. Die Säule wurde entwickelt, indem 100 ml Lösungsmittel durch die Säule geleitet wurden. Die Lösungsmittel aus Tabelle 2 wurden nacheinander verwendet: Tabelle 2
  • Getrennte Fraktionen von 50 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums wurden aufbewahrt. Die Fraktionen der Säule wurden durch TLC auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten getrennt. Die TLC-Platten wurden mit 4 Volumenteilen Ethanol, gemischt mit 1 Volumenteil Wasser, entwickelt. Die Visualisierung erfolgte durch Behandlung mit Ioddampf.
  • Nur diejenigen Fraktionen, die Iod absorbierendes Lipid mit einem Rf-Wert von etwa 0,20 enthielten, wurden vereinigt, unter Vakuum zur Trockene eingeengt und unter Hochvakuum bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 94 mg wachsartigen kristallinen Feststoff mit einem Molekulargewicht von 2226. Ein Protonen-NMR-Spektrum dieses Materials, gelöst in Deuterochloroform, zeigte die erwarteten Peaks aufgrund des Phosphatidylethanolaminanteils des Moleküls zusammen mit wenigen Methylenprotonen, die Polyethylenglycol zugeschrieben werden können (δ = 3,7).
  • Beispiel 4 Herstellung von REVs und MLVs A. REVs mit eingestellter Größe
  • Insgesamt 15 µMol der ausgewählten Lipidkomponenten in den in den nachstehenden Beispielen angegebenen Molverhältnissen wurden in Chloroform gelöst und als dünner Film durch Rotationsverdampfung getrocknet. Dieser Lipidfilm wurde in 1 ml mit destilliertem Wasser gewaschenem Diethylether gelöst. Zu dieser Lipidlösung wurden 0,34 ml einer wäßrigen Pufferltsung mit einem Gehalt an 5 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH- Wert: 7,4, gegeben, und das Gemisch wurde durch Beschallung für 1 Minute emulgiert, wobei die Temperatur der Lösung bei oder unterhalb Raumtemperatur gehalten wurde. Wenn die Liposomen so hergestellt wurden, daß sie eingeschlossenes [¹²&sup5;IJ-Tyraminyl-inulin enthielten, dann wurde diese Substanz dem Phosphatpuffer in einer Konzentration von etwa 4 µCi/ml Puffer einverleibt.
  • Das Etherlösungsmittel wurde unter verringertem Druck bei Raumtemperatur entfernt, und das erhaltene Gel wurde in 0,1 ml des vorstehenden Puffers aufgenommen und anschließend kräftig geschüttelt. Die erhaltene REV-Suspension wies Teilchengrößen, die durch mikroskopische Untersuchung bestimmt wurden, zwischen etwa 0,1 bis 20 µm auf und bestand vorwiegend aus relativ großen Vesikeln (größer als 1 µm) mit nur einer oder nur wenigen Doppelschicht-Lamellen.
  • Die Liposomen wurden zweimal durch einen Polycarbonatfilter (Szoka, 1978) mit einer ausgewählten Porengröße von 0,4 µm oder 0,2 µm extrudiert. Die Liposomen, die durch den Filter mit 0,4 um extrudiert worden waren, wiesen im Mittel Durchmesser von 0,17 ± (0,05) µm auf, und die, die durch den Filter mit 0,2 µm extrudiert worden waren, wiesen im Mittel Durchmesser von 0,16 ± (0,05) µm auf. Nicht eingeschlossenes (¹²&sup5;I]-Tyraminyl-inulin wurde entfernt, indem die extrudierten Liposomen durch Sephadex G-50 (Pharmacia) geleitet wurden.
  • B. Hinsichtlich der Größe eingestellte MLVs
  • Multilamellare Vesikel-Liposomen (MLV-Liposomen) wurden gemäß Standardverfahren hergestellt, indem ein Gemisch der Lipide in einem organischen Lösungsmittel, das vorwiegend CHCl&sub3; enthielt, gelöst wurde und die Lipide als dünner Film durch Rotation unter verringertem Druck getrocknet wurden. In einigen Fällen wurde eine radioaktive Markierung für die Lipidphase zu der Lipidlösung vor dem Trocknen gegeben. Der Lipidfilm wurde durch Zugabe der gewünschten wäßrigen Phase und von Glaskügelchen von 3 mm, gefolgt von einem Bewegen mit einer Vortex-Vorrichtung und Schütteln oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Phospholipidkomponente für mindestens 1 Stunde, hydratisiert. In einigen Fällen wurde dem Puffer eine radioaktive Markierung für die wäßrige Phase einverleibt. In einigen Fällen wurde das hydratisierte Lipid wiederholt dreimal gefroren und aufgetaut, um die nachfolgende Extrusionsstufe zu erleichtern.
  • Für die Verwendung bei den Lungenlokalisierungsversuchen wurden MLVs nach einem von zwei speziellen Verfahren, die nachstehend beschrieben werden, hergestellt.
  • MLV-Verfahren 1: Multilamellare Vesikel wurden durch Hydratisierung einer von zwei Formen eines festen Lipidgemisches hergestellt: Dünnfilm oder lyophilisierte tert.-Butanollösung. Lipidgemische wurden mit einem oder mehreren der folgenden Bestandteile hergestellt: Partiell hydriertes Ei-Phosphatidylcholin (PHEPC) mit einer Iodzahl von 40 (Asahi Chemical, Japan), hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) (Avanti Polar Liposomes, Birmingham, AL), Cholesterin (C) in USP-Qualität (Croda), N-Carbamyl-poly-(ethylenglycolmethylether)-1,2-distearyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin, Natriumsalz (MPEG-1900-DSPE) (Chemsyn, Lenexa, Kansas). Dünnfilme von Lipiden wurden durch Schütteln mit den Komponenten hydratisiert. Die erhaltenen Liposomendispersionen wurden vor der Weiterverarbeitung dreimal eingefroren und aufgetaut. Lyophilisierte Lipidgemische wurden durch Schütteln mit der wäßrigen Phase wie vorstehend hydratisiert. Die Extrusion erfolgte unter hohem Druck in eine Zelle aus rostfreiem Stahl (MICO, Middleton, WI) durch Filter mit aufeinanderfolgend kleiner definierten Poren, bis die Porengröße einen Durchmesser von 0,05 µm erreichte (Nucleopore, Pleasanton, CA) oder ein mittlerer Teilchendurchmesser von weniger oder gleich 100 nm erreicht wurde. Diese Teilchengrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (Coulter N4SD) bestimmt. Phospholipidkonzentrationen wurden durch Phosphorbestimmung gemessen (Barlett, 1959). In einigen Fällen wurden die Lipide durch langsames Eingießen von Ethanol-Lipid-Llsungen in eine waßrige Lösung oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Phospholipidkomponente und Schütteln für 60 min hydratisiert. Diese Dispersionen wurden mit einem Rannie Minilab-8 (St. Paul, Minnesota) oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Phospholipidkomponente bei ausreichenden Drucken, um einen mittleren Teilchendurchmesser von weniger oder gleich 100 nm zu erzielen, homogenisiert. In einem Fall wurde der Homogenisierungsdruck verringert, um eine Probe mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 nm zu erhalten.
  • In den hier beschriebenen Versuchen hatten PEG enthaltende Liposomen typischerweise eine Zusammensetzung, die PEG-DSPE:HSPC:Cho = 0,15:1,85:1 umfaßte, was einen PEG-DSPE-Gehalt von 5 Mol-% darstellt, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • MIV-Verfahren 2: Hydriertes Sojabohnen-Phosphat idyl inosit (HPI), hydriertes Sojabohnen-Phosphatidylcholin (HPC), Ei-Phosphatidylglycerin (PG) und Ei-Phosphatidylcholin (PC) wurden von Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) bezogen. Cholesterin (Chol) wurde von Sigma Chemical (St. Louis, MO) bezogen. &sup6;&sup7;Ga-citrat und ¹¹¹In-chlorid wurden von Frosst (Quebec, Kanada) bezogen. Deferoxaminmesylat (DF) wurde von Ciba-Geigy (Basel, Schweiz) bezogen. Die Acetatform des AG1X2-Harzes (Acetatform, 200 bis 400 mesh) wurde von Bio-Rad (Richmond, CA) bezogen.
  • Es wurden Liposomen hergestellt, die entweder aus HPI-HPC-Chol oder PG-PC-Chol, jeweils in einem molaren Verhältnis 1:10:5, bestanden. Eine Lösung in Chloroform/Methanol (9/1, Vol./Vol.) des Lipidgemisches wurde in einem Rundkolben zur Trockne eingeengt. Die Lipide wurden in 2 ml Cyclohexan erneut gelöst und lyophilisiert. Multilamellare Vesikel, die Desferoxamin (DF) enthielten, wurden durch Vortex-Mischen des Lipidfilms in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 10 mM Hepes, 150 mM NaCl und 25 mM DF (pH-Wert: 7,4) gebildet. Die Lipidkonzentration betrug 100 µMol/ml. Das Vortex-Mischen wurde für 12 Zeitspannen von 20 Sekunden bei Raumtemperatur oder im Fall der HPI-HPC-Chol-Liposomen bei 42ºC durchgeführt. Die Liposomen wurden 10 mal durch Polycarbonatfilter mit Poren von 0,05 µm (Nucleopore Corp.; Pleasanton, CA) unter Verwendung einer Extrusionsvorrichtung von Lipex Biomembranes (Vancouver, Kanada) extrudiert. Zur Größeneinstellung der HPI-HPC-Chol-Liposomen wurde die Extrusionsvorrichtung auf 62ºC vorgeheizt. Die Liposomen wurden von nicht eingeschlossenem DF durch Gelfiltration über eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit 10 mM Hepes und 150 mM NaCl (pH-Wert: 7,4) als Elutionspuffer getrennt. Die Phospholipidkonzentration wurde durch Phosphatbestimmung gemessen. Die mittlere Teilchengriße wurde durch dynamische Lichtstreuung (Malvern 4700 System, Malvern, UK) bestimmt. Als ein Maß für die Teilchengrößenverteilung der Dispersion gibt das System einen Polydispersitätsindex an. Dieser Index liegt Im Bereich von 0,0 für eine monodisperse Probe bis zu 1,0 für eine vollständig polydisperse Probe. Die mittlere Teilchengröße der verwendeten Liposomen betrug 100 ± 4 mit einem Polydispersitätsindex von 0,13 ± 0,02 (Mittelwert ± Standardabweichung von 9 Präparaten) für die HPI-HPC-Chol-Liposomen und 110 ± 9 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,21 ± 0,07 (Mittelwert ± Standardabweichung für 3 Präparate) für die PG-PC-Chol-Liposomen. Die maximale Lagerzeit der Liposomen betrug 24 h bei 4ºC unter Stickstoff. Die Liposomen wurden dann radioaktiv mit &sup6;&sup7;Ga-Deferoxamin (&sup6;&sup7;Ga-DF) gemäß der nachstehenden Beschreibung markiert.
  • Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde die Größe der Liposomenproben durch Extrusion durch Polycarbonatfilter mit definierten Poren unter Verwendung von unter Druck stehendem Stickstoffgas eingestellt. Bei einem Verfahren wurden die Liposomen einmal durch einen Filter mit Poren von 0,4 µm und dann zehnmal durch einen Filter mit Poren von 0,1 µm extrudiert. Bei einem anderen Verfahren wurden die Liposomen dreimal durch einen Filter mit Poren von 0,2 µm extrudiert, gefolgt von einer wiederholten Extrusion mit Poren von 0,05 µm, bis der mittlere Durchmesser der Teilchen unter 100 nm gemäß Bestimmung durch DLS lag. Nicht eingeschlossene wäßrige Komponenten wurden entfernt, indem die extrudierte Probe durch eine Gelpermeationssäule zur Trennung der Liposomen im Hohlraumvolumen von den kleineren Molekülen im eingeschlossenen Volumen geleitet wurde.
  • C. Beladung von Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga-DF
  • Die Versuchsanleitung für die Herstellung von &sup6;&sup7;Ga-DF-markierten Liposomen wurde auf der Grundlage bekannter Verfahren (Gabizon, 1988-1989) angepaßt. Kurz gesagt wurden REV- oder MLV-Liposomen hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Der lonenchelator Desferalmesylat (DF) wurde in die innere wäßrige Phase der Liposomen eingeschlossen und zum irreversiblen Einfangen von &sup6;&sup7;Ga-DF in den Liposomen verwendet.
  • &sup6;&sup7;Ga-Citrat für die Injektion (Neoscan, NEN Cambridge Mass.) wurde als eine Lösung mit 2 mCi/ml bezogen. Die Umwandlung des Citratchelats in ein durch die Doppelschicht tretendes Oxidchelat (Hydroxychinolin) erfolgte durch Verdünnen der Ga-Citrat-Stammlösung im Verhältnis 1:10 mit 5 mg/ml Hydroxychinolinsulfat (Sigma Chemical Co.) in 0,9% Kochsalzlösung für die Injektion und Erwärmen auf 50ºC für 1 h. Die Erwärmungsstufe wurde für 1 bis 2 ml Lösung in einem verschlossenen und abgedichteten, 15 ml fassenden konischen Teströhrchen in einem Bleitransportbehälter, der auf eine Heizplatte gestellt und mit etwa 2 ml Wasser gefüllt wurde, durchgeführt. Nach Erwärmen ließ man die Ga-Oxid-Stammlösung sich abkühlen und lagerte sie bei Raumtemperatur in einem Bleitransportbehälter.
  • Zur &sup6;&sup7;Ga-DF-Beladung von Liposomen wurden Proben mit 5 mM Desferoxaminmesylat (DF, Sigma Chemical, St. Louis, Mo) in 0,9% Kochsalzlösung für die Injektion bei 100 µM Phospholipid/ml hydratisiert und homogenisiert. Nicht eingeschlossenes DF wurde durch Dialyse oder Gelpermeationschromatographie durch ein Anionenaustauschharz (AG1X2) entfernt. Die Dialyse erfolgte gegen 0,9% Kochsalzlösung für die Injektion. Die Gelpermeationschromatographie erfolgte über Säulen, die mit 0,9% Kochsalzlösung für die Injektion voräquilibriert worden waren. Anschließend wurden die Proben im Verhältnis 10:1 mit der Ga-Oxidlösung gemischt und dann verschlossen, gemischt und bei 4ºC inkubiert. Die Beladung mit 0,1-3 µCi/µM Lipid ergab gute Ergebnisse. Nicht eingeschlossene Ga-Markierung wurde durch Dialyse oder Gelchromatographie entfernt.
  • D. Bestiming der Teilchengrößenverteilung der Liposomen durch dynamische Lichtstreuung
  • Die Messungen der Teilchengrößenverteilung der Liposomen wurden mittels DLS unter Verwendung einer Vorrichtung NICOMP Modell 200 mit einem angeschlossenen Brookhaven Instruments BI-2030AT Autokorrelator oder gemäß der vorstehenden Beschreibung erhalten. Die Instrumente wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers betrieben. Die NICOMP-Ergebnisse werden als mittlerer Durchmesser und Standardabweichung einer Gaußschen Verteilung der Vesikel nach dem relativen Volumen ausgedrückt.
  • Beispiel 5 Messung der Lebenszeit von Liposomen im Blut A. Messung der Blutzirkulationszeit und der Blut/RES-Verhältnisse
  • Untersuchungen von Liposomen in vivo wurden in zwei verschiedenen Tiermodellen durchgeführt: Swiss-Webster-Mäuse von jeweils 25 g und Laborratten von jeweils 200 bis 300 g. Die Untersuchungen an Mäusen beinhalteten die Injektion von Liposomenproben in die Schwanzvene bei 1 µM Phospholipid/Maus, gefolgt vom Töten des Tiers nach einer festgelegten Zeitspanne und Entfernung von Gewebe zur quantitativen Bestimmung der Markierung in einem Szintillationszähler. Das Gewicht und der Prozentsatz der injizierten Dosis in jedem Gewebe wurden bestimmt. Die Untersuchungen an Ratten beinhalteten die Einführung eines permanenten Katheters in eine Oberschenkelvene zur Entnahme von Blutproben zu definierten Zeitpunkten nach der Injektion von Liposomenproben in einen Katheter in der anderen Oberflächenartene bei 3 bis 4 µM Phospholipid/Ratte. Im allgemeinen wurden die Untersuchungen an Ratten unter Verwendung von mit &sup6;&sup7;Gga-DF beladenen Liposomen durchgeführt, und die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gammazählers gemessen. Der Prozentsatz der injizierten Dosis, die im Blut zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 24 Stunden und in ausgewählten Geweben nach 24 Stunden verblieb, wurde bestimmt.
  • B. Zeitlicher Verlauf der Liposomenretention im Blutstrom
  • PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und 1-Palmitoyl-2-oleyl-PE (POPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Das PEG-POPE-Lipid wurde mit partiell hydriertem Ei-PC (PHEPC) bei einem molaren Verhältnis Lipid:Lipid von etwa 0,1:2 kombiniert, und das Lipidgemisch wurde hydratisiert und durch eine 0,1 µm-Polycarbonatmembran extrudiert, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, um MLVs mit einer mittleren Größe von etwa 0,1 um herzustellen. Die MLV-Lipide umfaßten eine kleine Menge an radioaktiv markiertem Lipidmarker ¹&sup4;C-Cholesteryloleat und den eingeschlossenen Marker ³H-Inulin oder &sup6;&sup7;Ga-DF, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
  • Die Liposomenzusammensetzung wurde injiziert, und der Prozentsatz der anfänglich injizierten Dosis bei Mäusen wurde 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden nach der Injektion bestimmt, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist. Der zeitliche Verlauf des Verlustes an radioaktiv markiertem Material ist aus Fig. 7 ersichtlich, die eine graphische Auftragung des Prozentsatzes der injizierten Dosis für eingeschlossenes Inulin (ausgefüllte Kreise), Inulinmarker mit Korrektur auf den Anfangsinjektionspunkt von 100% (leere Kreise) und Lipidmarker (ausgefüllte Dreiecke) über einen Zeitraum von 24 Stunden nach der Injektion ist. Wie ersichtlich ist, zeigten sowohl Lipid als auch eingeschlossener Marker mehr als 10% der ursprünglich injizierten Dosis nach 24 Stunden.
  • C. Liposomenspiegel im Blut nach 24 Stunden
  • Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten Dosis im Blut und der Blut/RES-Verhältnisse von liposomalern Marker 24 Stunden nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Liposomenformulierungen mit den auf der linken Seite der nachstehenden Tabelle 3 angegebenen Zusammensetzungen wurden hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Sofern nichts anderes angegeben ist, handelte es sich bei dem Lipid-derivatisierten PEG um PEG-1900, und die Liposomengröße betrug 0,1 µm. Der Prozentsatz der Dosis, die im Blut 24 Stunden nach der intravenösen Verabreichung verblieb, und die Blut/RES-Verhältnisse nach 24 Stunden, die gemessen wurden, sind in der mittleren bzw. rechten Spalte der Tabelle gezeigt. Tabelle 3
  • *Alle Formulierungen enthielten 33% Cholesterin und 7,5% geladene Komponenten und wiesen einen mittleren Durchmesser von 100 nm auf, sofern nichts anderes angegeben ist. PEG-DSPE bestand aus PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0;, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Liposomenverteilung und die Kinetik wurden unter Verwendung von eingeschlossenem &sup6;&sup7;Ga-DF als Markierung verfolgt. Die Injektion erfolgte IV bei Ratten, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
  • Wie ersichtlich ist, lag der Prozentsatz der Dosis, die im Blut 24 Stunden nach der Injektion verblieb, im Bereich zwischen 5 bis 40% für Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide enthielten. Im Gegensatz dazu blieb bei beiden Liposomenformulierungen, denen PEG-derivatisierte Lipide fehlten, weniger als 1% Liposomenmarker nach 24 Stunden zurück. Wie ebenfalls aus Tabelle 3 ersichtlich ist, stiegen die Blut/RES-Verhältnisse von 0,01 bis 0,03 bei Kontroll-Liposomen auf mindestens 0,2 und auf einen recht hohen Wert von 4,0 bei Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide enthielten.
  • D. Messungen der Lebenszeit im Blut mit Polymilchsiure-derivatisiertem PE
  • Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenforrnulierung mit der Zusammensetzung Polymilchsäure-PE:HSPC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 oder 1:3,5:1 (Gew.-%) sind in Fig. 10A (ausgefüllte Quadrate) gezeigt. Der Prozentsatz der zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 Minuten, ist über 24 Stunden gezeigt.
  • Diese Daten zeigen, daß die Clearance der mit Polymilchsäure beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher Formulierungen ohne mit Polymilchsäure derivatisiertes PE.
  • E. Messungen der Lebenszeit im Blut von Polyglycolsäure-derivatisiertem PE
  • Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenformulierung mit der Zusammensetzung Polyglycolsäure-PE:HSPC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 (Gew.-%) sind in Fig. 10A (leere Dreiecke) gezeigt. Der Prozentsatz der zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 min, ist jiber 24 Stunden gezeigt.
  • Diese Daten zeigen, daß die Clearance der mit Polyglycolsäure beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher Formulierungen ohne mit Polyglycolsäure derivatisiertes PE.
  • F. Messungen der Lebenszeit im Blut mit Polyvinylalkohol-PE
  • Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenformulierung mit der Zusammensetzung Polyvinylalkohol-HSPE:PC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 oder 1:3,5:1 (Gew.-%) sind in Fig. 10B im Vergleich mit Ergebnissen von mit Polymilchsäure und Polyglycolsäure derivatisierten Liposomen, die in den vorstehenden Abschnitten D und E beschrieben wurden, gezeigt. Der Prozentsatz der zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 min, ist über 24 Stunden gezeigt. Die Ergebnisse für die Blutverweilzeit von Polyvinylalkohol-derivatisierten Liposomen sind ähnlich den Ergebnissen, die für Polymilchsäure- und Polyglycolsäure-derivatisierte Spezies, wie sie vorstehend beschrieben wurden, erzielt wurden. Diese Daten zeigen, daß die Clearance der mit Polyvinylalkohol beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die von ähnlichen Formulierungen ohne mit Polyvinylalkohol derivatisiertes PE.
  • Beispiel 6 Einfluß der Sättigung der Phospholipid-Acyl-Ketten auf die Blut/RES- Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen
  • PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit Lipiden, die unter Sphingomyelin (SM), vollständig hydriertem Soja-PC (PC), Cholesterin (Chol), partiell hydriertem Soja-PC (PHSPC) und partiell hydrierten PC-Lipiden, die in Tabelle 4 als PC IV1, IV10, IV20, IV30 und IV40 bezeichnet werden, ausgewählt waren, formuliert. Die Lipidkomponenten wurden in den molaren Verhältnissen, die links in Tabelle 5 gezeigt sind, gemischt und zur Bildung von MLVS, deren Größe auf 0,1 um eingestellt wurde, wie es in Beispiel 4 beschrieben wurde, verwendet. Tabelle 4 Tabelle 5a
  • a Gruppen von mindestens 3 Mäusen wurden pro Versuch verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist, und &sup6;&sup7;Ga-DF wurde zur Verfolgung der Liposomen verwendet.
  • b Werte mit niedriger Wiederfindung (d.h. < 40%) werden als unzuverlässig angesehen.
  • 24 Stunden nach der Injektion wurde der Prozentsatz des injizierten Materials (gemessen als Prozentsatz an &sup6;&sup7;Ga-DF), der im Blut, in der Leber (L) und in der Milz (S) verblieb, bestimmt, und diese Werte sind in den beiden Datenspalten auf der linken Seite in Tabelle 5 gezeigt. Die Werte für Blut und L+S (RES) wurden herangezogen, um den Wert Blut/RES für jede Zusammensetzung zu berechnen. Die Spalte auf der rechten Seite in Tabelle 5 zeigt die Gesamtmenge an wiedergefundener Radioaktivität. Die beiden Werte mit geringer Gesarntwiederfindung in der Tabelle zeigen eine anomale Clearance.
  • Die Ergebnisse aus der Tabelle zeigen, daß die Blut/RES-Verhältnisse weitgehend unabhängig von der Fluidität oder dem Sättigungsgrad der Phospholipid-Komponenten, die die Liposomen bilden, sind. Insbesondere wurde keine systematische Änderung der Blut/RES-Verhältnisse bei Liposomen, die größtenteils gesättigte PC-Komponenten (z.B. IV1- und IV10-PC), größtenteils ungesättigte PC-Komponenten (IV40) und Komponenten mit dazwischen liegendem Sättigungsgrad (z.B. IV20) enthielten, beobachtet.
  • Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der Blut/RES-Verhältnisse, die unter Verwendung der vergleichsweise stark gesättigten PEG-DSPE-Verbindung und der vergleichsweise stark ungesättigten PEG-POPE-Verbindung (Beispiel 5) erhalten wurden, daß der Sättigungsgrad des derivatisierten Lipids selbst nicht kritisch für die Fähigkeit von Liposomen ist, der Aufnahme durch das RES zu entgehen.
  • Beispiel 7 Einfluß von Cholesterin und ethoxyliertem Cholesterin auf die Blut/RES-Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen A. Einfluß von zugegebenem Cholesterin
  • Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 wurde mit DSPE derivatisiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die PEG-PE-Lipide wurden mit unter Sphingomyelin (SM), vollständig hydriertem Soja-PC (PC) und Cholesterin (Chol) ausgewählten Lipiden formuliert, wie es in der linken Spalte der nachstehenden Tabelle 5 angegeben ist. Die drei Formulierungen, die in der Tabelle gezeigt sind, enthalten etwa 30, 15 und 0 Mol-% Cholesterin. Es wurden sowohl REVS (mit einer Größe von 0,3 um) als auch MLVs (mit einer Größe von 0,1 um) hergestellt, und zwar im wesentlichen wie in Beispiel 4 (mit eingeschlossenem Tritium-markiertem Inulin).
  • Der Prozentsatz von eingeschlossenem Inulin, das im Blut 2 und 24 Stunden nach der Verabreichung verblieb, ist auf der rechten Seite der nachstehenden Tabelle 6 angegeben und zeigt keinen meßbaren Einfluß von Cholesterin im Bereich von 0 bis 30 Mol-%. Tabelle 6
  • B. Einfluß von ethoxyliertem Cholesterin
  • Methoxyethoxycholesterin wurde durch Kupplung von Methoxyethanol an Cholesterin nach dem Trifluorsulfonat-Kupplungsverfahren, das in Abschnitt I beschrieben wurde, hergestellt. PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 bestand, wurde mit DSPE derivatisiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide wurden mit unter Distearyl-PC (DSPC), partiell hydriertem Soja-PC (HSPC), Cholesterin und ethoxyliertem Cholesterin ausgewählten Lipiden, wie es auf der linken Seite in Tabelle 7 angegeben ist, formuliert. Die Daten zeigen, daß (a) ethoxyliertes Cholesterin in Kombination mit PEG-PE ungefähr den gleichen Grad der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen im Blut wie PEG-PE allein ergibt. Das ethoxylierte Cholesterin selbst sorgt für einen mäßigen Grad der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen, der jedoch erheblich geringer als der ist, für den PEG-PE sorgt. Tabelle 1
  • Beispiel 8 Wirkung von geladenen Lipidkomponenten auf die Blut/RES-Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen
  • Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 wurde mit DSPE derivatisiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide, wurden mit Lipiden, die unter Ei-PG (PG), partiell hydriertem Ei-PC (PHEPC) und Cholesterin (Chol) ausgewählt wurden, formuliert, zu MLVs verarbeitet und wie in Beispiel 4 auf eine Größe von 0,1 um eingestellt. Die beiden Formulierungen wurden bei Versuchen verwendet, die in Fig. 7 zusammengefaßt sind, wobei Liposomen, die etwa 4,7 Mol-% (Dreiecke) oder 14 Mol-% (Kreise) enthielten, verglichen wurden.
  • Der Prozentsatz der injizierten Liposomen-Dosis, der 0,25, 1, 2, 4 und 24 Stunden nach der Injektion vorhanden war, ist graphisch für beide Formulierungen in Fig. 7 aufgetragen. Wie ersichtlich ist, hatte der Prozentsatz an PG in der Zusammensetzung einen geringen oder keinen Einfluß auf die Liposomenretention im Blutstrom. Die Geschwindigkeit des Verlusts von eingeschlossenem Marker, die festgestellt wird, ist ebenfalls ähnlich zu der, die für Liposomen beobachtet wird, die auf ähnliche Weise hergestellt wurden und kein PG enthalten.
  • Beispiel 9 Plasmakinetik von PEG-beschichteten und unbeschichteten Liposomen
  • Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit PHEPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,15:1,85:1 formuliert. Ein zweites Lipidgemisch enthielt die gleichen Lipide, jedoch ohne PEG- PE. Liposomen wurden aus den beiden Lipidgemischen hergestellt, wie es in Beispiel 5 beschrieben wurde, und zwar durch Lipidhydratisierung in Gegenwart von Desferalmesylat, gefolgt von einer Größeneinstellung auf 0,1 µm und der Entfernung von nicht eingeschlossenem Desferal durch Gelfiltration mit anschließender Beladung der Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga-Oxid. Das nicht eingeschlossene &sup6;&sup7;Ga wurde während des Durchtritts durch eine Sephadex G-50-Gelausschlußsäule entfernt. Beide Zusammensetzungen enthielten 10 µMol/ml in 0,15 M NaCl, 0,5 mM Desferal.
  • Die beiden Liposomen-Zusammensetzungen (0,4 ml) wurden IV Tieren injiziert, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist. Zu Zeitpunkten 0,25, 1, 3 oder 5 und 24 Stunden nach der Injektion wurden Blutproben entnommen und auf die Menge an Inulin, die im Blut verblieb, ausgedrückt als Prozentsatz der Menge, die unmittelbar nach der Injektion gemessen wurde, untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 88 gezeigt. Wie ersichtlich ist, weisen PEG-beschichtete Liposomen eine Halbwertszeit im Blut von etwa 11 Stunden auf, und nahezu 30 % des injizierten Materials ist im Blut nach 24 Stunden vorhanden. Im Gegensatz dazu zeigten unbeschichtete Liposomen eine Halbwertszeit im Blut von weniger als 1 Stunde. Nach 24 Stunden war die Menge an injiziertem Material nicht mehr nachweisbar (Fig. 8B).
  • Beispiel 10 Kultur von infektiösen Mikroorganismen A. Klebsiella pneumoniae
  • Kulturen von K. pneumoniae (ATCC 43816, kapsularer Serotyp 2) wurden durch Inkubation von Zellen für 16 Stunden bei 37º in Iso-Sensitest-Brühe (Oxoid Ltd., London, Großbritannien) erhalten. Nach Verdünnen und erneuter Inkubation für 2 h wurden Suspensionen von logarithmisch wachsenden Bakterien für die Injektion in Tiere hergestellt.
  • Beispiel 11 Infektion von Ratten mit bakteriellem Pathogen
  • Weibliche Albino-Ratten Stamm R (spezifisch pathogenfrei, 14 bis 18 Wochen alt; 185 bis 215 g; Quelle: ITRI-TNO, Rkjswijk, Niederlande). Die Ratten wurden mit Fluoanison (HypnormR, Duphar B. V., Amsterdam, Niederlande) und Pentobarbital (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) anästhesiert. Der linke Hauptstamm-Bronchus wurde intubiert, und die linke Lunge wurde mit 0,02 ml Kochsalzlösung-Suspension mit einem Gehalt an 10&sup5; CFU K. pneumoniae inokuliert. Nach der Infektion wurde Nalorphinbromid (Onderlinge Pharmaceutische Groothandel, Ütrecht), ein Opiat-Antagonist, den Tieren durch Injektion gegeben.
  • Um die Schwere der Infektion zu messen, wurden Tiere getötet, und die linken und rechten Lungen wurden getrennt entnommen, gewogen und in 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 30 Sekunden bei 10 000 U/min in einem VirTis-Homogenisator (The VirTis Co., Gardiner, NY) homogenisiert. Es wurde eine 10-fache Verdünnungsreihe der Hornogenisate hergestellt. Volumina von 0,2 ml jeder Verdünnung sowie 1 ml Volumen des unverdünnten Lungenhomogenisats wurden auf Blutagarplatten zur quantitativen Bestimmung der Bakterien ausgestrichen. Die quantitative Bestimmung der Anzahl der Bakterien in der linken (infizierten) und rechten (nicht infizierten) Lunge von behandelten Ratten sowie der Anstieg des Gewichts des infizierten Lungengewebes wurden herangezogen, um die Schwere der Infektion zu bewerten.
  • Beispiel 12 Herstellung von Liposomen-Arzneistoff-Formulierungen A. Beladung einer liposomalen Zubereitung mit Gentamicinsulfat
  • Liposomen wurden durch Dünnfilmhydratisierung hergestellt, wie es in Beispiel 4 beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung von Gentamicinsulfat-Konzentrationen von 20 bis 100 mg/ml und Gesamtlipidkonzentrationen von 50 bis 300 µMol/ml. Versuche, bei denen diese Liposomen getestet wurden, ergaben praktische Grenzen von &le; 50 mg/ml für Gentamicin und &le; 150 µMol/ml für Lipid. Oberhalb dieser Konzentrationen wurden nicht-liposomale Teilchen gebildet. Weitere Untersuchungen zeigten, daß die Hydratisierung eines Lipidkuchens, der durch Lyophilisieren aus tert.-Butanol mit wäßrigem Gentamicinsulfat erhalten wurde, bevorzugt im Hinblick auf die offensichtliche Homogenität der anfänglichen Dispersion und die Einfachheit der anschließenden Verringerung der Größe durch Extrusion war. Lyophilisierter Lipidkuchen wurde weiter unter Verwendung von 1000 µMol Lipid getestet. Diese Menge an Lipid wurde in einem Endvolumen von 10 ml hydratisiert, was 50 mg/ml Gentamicin und 100 µMol Lipid/ml ergab.
  • Das Ausmaß der Gentamicinsulfat-Beladung unter Verwendung von Liposomen, die nach dem Lipidkuchen-Hydratisierungsverfahren gebildet wurden, wurde nach Gelchromatographie durch G-25 in einer Spritze oder durch eine A15M-Säule bestimmt. Diese Ergebnisse (Tabelle 8) stellen die Beladung der Liposomen vor der Entfernung von nicht eingeschlossenem Arzneistoff dar. In dem gezeigten Versuch wurde die Hydratisierung der Liposomen durch Zugabe von 10 ml isotoner Gentamicin-Lösung und 100 µMol Lipid/ml durchgeführt. Die Hydratisierung wurde unter Verwendung von Gentamicin in Wasser, gefolgt von einer Verdünnung mit Kochsalzlösung vor dem zweistufigen Verfahren, durchgeführt. Tabelle 8 Charakterisierung von Gentamicinsulfat-Proben vor der Entfernung von freiem Arznelstoff Tabelle 8 (Fortsetzung)
  • ¹standardbedingungen: 50 mg/ml Gentamicin, 100 µMol/ml Lipid, isotone Kochsalziösung, 1000 µMol Lipid, 10 ml.
  • ²(D) = Dialyse; (G-25) = Verfahren mit kleiner Spritze, ansonsten Biogel A15M; (N) = Nennwert.
  • ³-: Entweder überstieg der für die Extrusion erforderliche Druck 900 psi, oder es trat eine sehr starke Schaumbildung auf.
  • ³(N): Nennwert, auf der Basis des eingesetzten Verhältnisses der Komponenten; alle anderen Werte basieren auf Bestimmungen, die für die Endprodukte durchgeführt wurden.
  • Die Ergebnisse der Variationen in der Lipidzusammensetzung sind in Tabelle 9 angegeben. Wie gezeigt ist, wurden nur kleine Unterschiede in der Menge an Arzneistoff, die mit den Liposomen assoziiert Ist, unter Verwendung der angegebenen Variationen der Lipidzusammensetzung beobachtet. Bei einem eingesetzten Verhältnis von 500 µg/µMol Arzneistoff/Lipid lag die Menge an Arzneistoff, die gebunden oder mit dem Lipid assoziiert war, üblicherweise nah oder über dem Minimum, das als akzeptabel angesehen wird, nämlich 50 µg/µMol Lipid, was einen Wirkungsgrad von etwa 10% anzeigt. Tabelle 9 Einfluß der Lipidzusammensetzung auf die Beladung mit S-Gentamicinsulfat
  • ¹Standardbedingungen: 50 mg/ml Gentamicin, 100 µMol/ml Lipid, isotone Kochsalziösung, 1000 µMol Lipid, 10 ml.
  • ²(D) = Dialyse; (G-25) Verfahren mit kleiner Spritze, ansonsten Biogel A15M; (N) = Nennwert.
  • ³-: Entweder überstieg der für die Extrusion erforderliche Druck 900 psi, oder es trat eine sehr starke Schaumbildung auf.
  • Tabelle 10 zeigt Ergebnisse von Versuchen, bei denen der Einfluß der Variation der Teilchengröße auf die Arzneistoffbeladung untersucht wurde. Eine zunehmende Teilchengröße ergab nur einen kleinen Anstieg der Menge an gebundenem Arzneistoff (Tabelle 10). Eine Erhöhung des Arzneistoff/ Lipid-Verhältnisses, das während der Liposomenbildung vorhanden war, um einen Faktor von 2 erhöhte die Konzentration an gebundenem Arzneistoff nicht proportional, wofür Probe 16B ein Beispiel ist. Eine Verringerung des Verhältnisses Arzneistoff/Lipid um einen Faktor von 5 erhöhte den Wirkungsgrad in einem gewissen Maß und ergab ein erheblich verringertes Verhältnis gebundener Arzneistoff/Lipid. Alle diese Ergebnisse wurden bei einer Lipid-Nennkonzentration von 100 µMol/ml erhalten. Tabelle 10 Einfluß der Teilchengröße auf die Beladung Eit S-Gentamicinsulfat
  • *(D) = Dialyse, andernfalls Biogel A15M
  • (N) = Nennwert
  • B. Beladung von Liposomen mit Gentamicinchlorid
  • Gentamicinchlorid wurde durch Fällung des Sulfats aus einer Gentamicinsulfat-Formulierung durch Zugabe von BaCl&sub2; hergestellt. Es wurde eine Ausbeute von 90% an Gentamicin erzielt. Liposomale Gentamicin-Präparate wurden durch Hydratisierung von lyophilisierten Kuchen aus Lipid unter Verwendung von Gentamicinchlorid-Lösungen hergestellt, wie es in Tabelle 11 zusammengefaßt ist. Die Hydratisierung mit 25 mg/ml Gentamicinchlorid von 100 µMol/ml Lipid ergab eine Beladung von 18% vor der Entfernung von freiem Arzneistoff. Der Ersatz von freiem Cholesterin durch Cholesterinsulfat ergab eine Beladung von 24% (Probe 43C). Eine Erhöhung der Teilchengröße ergab einen geringfügigen Anstieg der Beladung vor der Reinigung. Tabelle 11 Charakterisierung von S-Gentamicinchlorid-Proben vor der Entfernung von freiem Arzneistoff
  • ¹Das Standardverfahren bestand in folgendem: 50 mg/ml Gentamicin-Cl, hergestellt in isotoner Glucose bei einem pH-Wert von 5; 100 µMol/ml Gesamtlipid, PEG-DSPE:PHEPC:C; einstufige Hydratisierung des lyophilisierten Lipidkuchens bei Raumtemperatur. NaCSO&sub4; wurde anstelle eines Teils oder der Gesamtmenge an C in diesen Proben eingesetzt. "Groß" bedeutet, daß die Extrusion bis zu einer Teilchengröße &le;100 nicht möglich war und die Ergebnisse für eine Probe mit einer Teilchengröße -150 nm angegeben sind.
  • ²Durch A-15M-Gelsäule in Kochsalzlösung.
  • C. PEG-DSPE enthaltende Liposomen
  • MLV-Liposomen-Gentamicin-Formulierungen wurden durch Hydratisierung eines Kuchens von Lipiden, der durch Lyophilisieren aus tert.-Butanol erhalten wurde, mit einer wäßrigen Lösung von Gentamicin mit einem Gehalt an Spurenmengen ¹²&sup5;I-Gentamicin hergestellt. Die Molverhältnisse des Lipidgemisches, das zur Bildung der Liposomen verwendet wurde, waren wie folgt: MPEG-1900-DSPE:PHEPC:Cho 5:62:33 (entsprechend 5 Mol-% PEG-derivatisiertes DSPE). Die Endkonzentration an Gentamicin und Lipid vor der Extrusion betrug typischerweise 50 mg/ml bzw. 100 µMol Gesamtlipid/ml. Variationen in diesen Parametern sind mit den erhaltenen Ergebnissen angegeben. Die hydratisierte Liposomendispersion wurde wiederholt durch Filter mit definierten Poren (Nucleopore) extrudiert.
  • D. Entfernung von nicht gebundenem Gentamicin
  • Nach der Hydratisierung und Bildung der liposomalen Suspensionen wurde nicht gebundener Arzneistoff entfernt. Eine Dialyse gegen keinen Arzneistoff enthaltende Lösung, wie sterile Kochsalzlösung, wurde in einigen Fällen durchgeführt. Es wurde jedoch festgestellt, daß für Gentamicin-Lösungen die Entfernung von Gentamicin selbst nach einer Dialysezeit von 48 Stunden unvollständig war (Tabelle 12 - Probe 665-6).
  • Das Ionenaustauschharz Dowex AG50v wurde verwendet, um absatzweise oder in einer Säule die Entfernung von freiem Arzneistoff unter Anwendung von Standardverfahren zu erreichen. Um den freien Arzneistoff unter Anwendung des absatzweisen Verfahrens zu entfernen, waren im allgemeinen zwei Behandlungen mit AG50v erforderlich.
  • Die Gelpermeation wurde unter Verwendung von BioRad 10DG- oder Sephadex G-50-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) bewertet, wobei BioRad 10DG-Säulen für vergleichsweise kleine Probenvolumina verwendet wurden. Das G-50-Verfahren zur Entfernung von Arzneistoff bei anschließendem Einengen zeigte eine hervorragende Auflösung (Fig. 17) und einen hohen Prozentsatz an gebundenem Gentamicin. Dieses Verfahren ist ein bevorzugtes Verfahren für die Entfernung von nicht gebundenem Gentamicin. Tabelle 12 Charakterisierung von Gentamicinsulfat-Proben nach der Entfernung von freiem Arzneistoff
  • *Daten nicht verfügbar
  • Tabelle 13 zeigt die Verhältnisse Arzneistoff zu Lipid, die mit Gentamicinchlorid nach der Entfernung von nicht gebundenem Arzneistoff erzielt wurden. Im allgemeinen zeigen die Ergebnisse etwa das 2-fache des Verhältnisses Arzneistoff/Lipid, das mit Gentamicinsulfat erzielt wurde. Unter mehreren Bedingungen wurden Konzentrationen von 50 bis 70 µg/µMol erzielt. Das Weglassen von Cholesterin oder sein Ersatz durch Cholesterinsulfat verbesserte die Arzneistoffbeladung. Ein niedrigerer pH-Wert hemmte die Beladung. Tabelle 13 Charakterisierung von S-Gentamicinchlorid-Proben nach der Entfernung von freiem Arzneistoff
  • Bei den meisten Versuchen wurde die Entfernung von nicht eingeschlossenem Gentamicin durch Gelpermeationschromatographie mit Sephadex G-50 in einer Säule von 2,5 × 45 cm oder 1,25 × 25 cm durchgeführt. Proben bis zu 20 ml (1/3 des Hohlraumvolumens) wurden auf die größere Säule aufgetragen, und Proben bis zu 5 ml auf die kleinere. Nicht eingeschlossener Arzneistoff wurde vor der erneuten Verwendung der Säule eluiert. Die Proben wurden durch wiederholte Zentrifugation in einer Centriprep 10-Zentrifuge (Aminco, Danvers, MA) bei 3000 U/min in einem Sorval T-60- Rotor (1600×g) für 30 min bis 1 h eingeengt.
  • E. Arzneistoff-Liposomen-Formulierungen für Untersuchungen in vivo
  • Die liposornalen Gentamicin-Formulierungen wurden durch Messungen der Teilchengröße, der Lipidkonzentration und des pH-Werts nach Standardverfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, charakterisiert. Der Einschluß von Gentamicin wurde durch Einschluß von ¹²&sup5;I-markiertem Gentamicin (NEN, Cambridge, MA) als Markierungssubstanz oder durch Reaktion mit Trinitrobenzolsulfonat (TNBS), wie sie nachstehend in Beispiel 13 beschrieben wird, bestimmt.
  • Die Menge an Gentamicin, die an Liposomen gebunden war, wurde durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung des Biorad A-15M-Harzes bestimmt. Proben von 200 bis 300 µl wurden auf eine Säule von 0,5 × 30 cm aufgetragen, die mit Kochsalzlösung äquilibriert und eluiert wurde. Fraktionen wurden gesammelt, und die Menge an Gentarnicin, die mit den Liposomen im Hohlraumvolumen der Säule eluiert wurde, wurde durch die Menge an vorhandenem ¹²&sup5;I bestimmt. Der Prozentsatz an liposomalem Gentamicin wurde aus dem Verhältnis der Markierung, die im Hohlraumvolumen eluiert wurde, zur Gesamtmenge an Markierung, die eluiert wurde, bestimmt. Tabelle 14 Bestimung des prozentualen liposomalen Einschlusses von Gentamicin
  • Beispiel 13 Lokalisierung von Liposomen in infiziertem Gewebe A. Lokalisierung von &sup6;&sup7;Ga enthaltenden Liposomen
  • PEG-derivatisierte MLV-Liposomen wurden hergestellt, wie es ausführlich in Beispiel 4 angegeben ist, und zwar unter Verwendung eines Verhältnisses PEG-DSPE:PHEPL-IV40:CHO von 0,15:1,85:1. Die bei den Untersuchungen zur Lokalisierung von Liposomen verwendeten Liposomen wurden nach einem von zwei Verfahren hergestellt. Beim ersten wurden die Lipide in einer Lösung aus 50% Ethanol gelöst. Eine Kochsalzlösung, die 5 mM Desferalmesylat enthielt, wurde zu dem Gemisch unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben. Das Gemisch wurde homogenisiert, um Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 95 oder 147 nm herzustellen. Diese Liposomen wurden vor der Injektion mit &sup6;&sup7;Ga beladen, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
  • Das zweite angewandte Verfahren zur Herstellung von &sup6;&sup7;Ga-beladenen MLV-Liposomen zur Verwendung bei der Lokalisierung in infizierten Bereichen war ähnlich dem in Beispiel 4 als MLV-Verfahren 1 beschriebenen Verfahren. Die Lipide wurden in Chloroform (CHCl&sub3;) gelöst und als Dünnfilm auf der Oberfläche eines Rundkolbens in Gegenwart von 3 mm-Glaskügelchen unter verringertem Druck getrocknet. Nach Entfernung des restlichen Lösungsmittels wurden die Lipide durch Zugabe einer Lösung mit einem Gehalt an 5 mM Desferal und 5% (Gew./Vol.) Glucose bei 60a hydratisiert, gefolgt von einem Vortex-Mischen und einem Mischen auf einer Schüttelvorrichtung ("wrist shaker") für 45 min. Das Gemisch wurde dreimal abwechselnd gefroren (Trockeneis/Ethanol) und aufgetaut, dann durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm extrudiert, gefolgt von einer Extrusion durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,08 µm. Die erhaltenen Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von 79 nm auf. Die Liposomen wurden vor der Injektion mit &sup6;&sup7;Ga beladen, wie es in Beispiel 4 beschrieben wird.
  • Ratten wurden mit K. pneumoniae infiziert, wie es in Beispiel 11 beschrieben wird. 48 Stunden später wurden den einzelnen Ratten 5, 10, 15, 20 oder 25 µMol &sup6;&sup7;Ga-Liposomen, die in einem Volumen von 0,9 ml enthalten waren, injiziert, und Blutproben wurden durch retroorbitale Punktion unter CO&sub2;-Anästhesie zur quantitativen Bestimmung der Konzentrationen an zirkulierenden Liposomen entnommen. Die Zirkulationszeit der Liposomen im Blut und der Liposomengehalt von Leber, Milz, linker Lunge (ein Lappen), rechter Lunge (vier Lappen) und Leber wurden unter Verwendung des &sup6;&sup7;Ga- Desferalkomplexes mit hoher Affinität als Marker bestimmt. Eine Korrektur um den Blutgehalt der Gewebe wurde unter Verwendung von ¹¹¹In-Oxid-markierten syngenetischen Erythrozyten (Heaton), die intravenös 10 Minuten vor dem Ausschneiden der Gewebe injiziert wurden, durchgeführt. Die Radioaktivität wurde quantitativ in einem gamma-Zähler (Minaxy 5530, Packard Instruments Co., Downers Grove, USA) bestimmt. Eingeschlossenes &sup6;&sup7;Ga diente als Marker zur Bestimmung der Verteilung von intakten Liposomen in verschiedenen Geweben. 40 Stunden nach der Injektion zirkulierten ungefähr 10% der injizierten Liposomen im Blut. Die Lokalisierung von Liposomen im Lungengewebe wurde in einer Gruppe von 31 Ratten mit variierenden Infektionsgraden bestimmt (Bakterienzahlen für die infizierte Lunge: 10&sup5; bis 2×10¹&sup0;; Gewicht der infizierten linken Lunge: 0,45 bis 2,2 g). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Figg. 12, 13, 14, 15A, 15B, 16A und 16B erläutert.
  • B. Lokalisierung von Gentamicin enthaltenden Liposomen in infizierten Geweben
  • PEG enthaltende Liposomen wurden mit Gentamicinsulfat beladen, wie es ausführlich in Beispiel 12 angegeben ist. Gentamicin-beladene Liposomen wurden intravenös (15 µMol Lipid) Ratten injiziert, die mit Klebsiella 48 Stunden zuvor durch Intubation und Instillation des Inokulums in eine Lunge infiziert worden waren, wie es ausführlich in Beispiel 11 angegeben ist. Die Blutkonzentrationen und die Anreicherung des Arzneistoffs im infizierten Gewebe wurden durch Untersuchung der Gewebe auf den Gentamicin-Gehalt gemessen, wie es vorstehend in Beispiel 13 beschrieben ist. Alternativ dazu wurde die Anreicherung von Gentamicin durch Bestimmung des Gehalts an Radioaktivität der infizierten Lunge gemessen, wenn die liposomale Gentamicin-Formulierung Spurenmengen an radioaktiv markierten Gentamicin enthielt. Die Ergebnisse der Untersuchungen, bei denen die Anreicherung von Gentamicin in infiziertem Lungengewebe gemessen wurde, sind in den Figg. 18A und 18B gezeigt.
  • Beispiel 14 Stabilität von PEG-derivatisierten Gentamicin-Liposomen
  • Mehrere Ansätze von PEG-derivatisierten Liposomen, die Gentamicinsulfat enthielten, wurden nach dem Kuchenhydratisierungsverfahren, das vorstehend ausführlich erläutert wurde, gemäß der folgenden Zusammenfassung hergestellt: 1000 µMol Lipidkuchen wurden mit 2,5 ml Gentamicinsulfat bei 200 mg/ml in Wasser durch Schütteln für 1 Stunde hydratisiert und dann auf 10 ml mit isotoner Kochsalzlösung verdünnt, was 50 mg/ml Gentamicinsulfat und 100 µMol Lipid/ml ergab. Die Dispersionen wurden extrudiert, um eine mittleren Teilchengröße von weniger als 100 nm zu erhalten. Der nicht eingeschlossene Arzneistoff wurde durch Gelchromatographie entfernt, und das Gesamtvolumen wurde durch Zentrifugation in einer Centriprep-10-Konzentrationseinrichtung verringert. Diese Zusammensetzungen wurden bei 8ºC gelagert und im Verlauf von 2 Wochen (Tabelle 15) auf mit Liposomen assozuertes (eingeschlossenes) Gentamicin durch Pelletieren der Liposomen bei 200 000 × g in 7 × 20 mm-Zentrifugenröhrchen für 60 min, gefolgt von einer Untersuchung auf Gentamicin, wie es in Beispiel 13 beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß das Verhältnis Arzneistoff zu Lipid, das nach der Reinigung mit G-50-Sephadex erzielt wird, selbst in reinen Proben aufrechterhalten werden kann (vgl. Proben 665-16H und 16G, Tabelle 15). Tabelle 15 Stabilität von gereinigten Gentamicinsulfat-Liposomen
  • *Probe an Tag 0 geeinigt, jedoch nicht vor Tag 2 eingeengt oder untersucht.
  • Beispiel 15 Kinetik und Gewebeverteilung von Gentamicin-beladenen, PEG enthaltenden Liposomen
  • Fig. 18A zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen, bei denen Ratten in der linken Lunge mit K. pneumoniae zum Zeitpunkt 0 infiziert wurden, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, und dann 24 Stunden später (Zeit = 24) eine Injektion einer intravenösen Dosis von 15 mg/kg Gentamicinsulfat (leere Kreise), 1,9 mg/kg Gentamicinsulfat in PEG enthaltenden Liposomen mit Cholesterin in der Formulierung (ausgefüllte Kreise) oder 1,9 mg/kg Gentamicinsulfat in PEG enthaltenden Liposomen ohne Cholesterin (ausgefüllte Dreiecke) erhielten. ¹²&sup5;I-Gentamicin war in den Gentamicin- Formulierungen enthalten. Der Gentamicin-Gehalt der infizierten Lungen wurde durch Messung der Radioaktivität, die im infizierten Gewebe zu den angegebenen Zeitpunkten vorhanden war, bestimmt. Fig. 18B zeigt die gleichen Daten, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten injizierten Dosis.
  • Beispiel 16 Therapeutische Aktivität von Gentamicin-beladenen, PEG enthaltenden Liposomen
  • Tabelle 16 zeigt und faßt zusammen die Ergebnisse von Versuchen, bei denen Ratten mit K. pneumoniae in der linken Lunge infiziert wurden, wie es in Beispiel 11 beschrieben wurde, und dann 48 Stunden später eine Injektion von 1,9 oder 15 mg/kg Gentamicinsulfat, wie es angegeben ist, oder einem PEG enthaltenden liposomalen Präparat von Gentamicinsulfat erhielten. Zwei verschiedene liposomale Zusammensetzungen wurden verwendet. Eine Zusammensetzung (PEG:PC:CH) enthielt Cholesterin (CH), während die andere Zusammensetzung (PEG:PC) kein Cholesterin enthielt. Die ersten drei Spalten zu jedem Zeitpunkt, die in Tabelle 16 angegeben sind, enthalten log-Werte der koloniebildenden Einheiten (CFU) von Bakterien, die aus den infizierten Lungen von drei einzelnen Ratten zu jedem Zeitpunkt isoliert wurden, wobei 48 Stunden der Zeitpunkt der Injektion von Gentamicin ist. Die vierte Spalte zu jedem Zeitpunkt enthält den mittleren log CFU-Wert ± eine Standardabweichung für drei Messungen. Tabelle 16
  • *nicht verfügbar
  • Fig. 19 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, bei dem Ratten zum Zeitpunkt 0 infiziert wurden und ihnen dann Gentamicin als freier Arzneistoff (1,9 mg/kg, leere Kreise) oder als eine liposomale Zusammensetzung (1,9 mg/kg) 24 Stunden später gegeben wurde.
  • Die Erfindung wurde zwar im Hinblick auf spezielle derivatisierte Lipidverbindungen, Liposomenzusammensetzungen und die Verwendung beschrieben und erläutert; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß eine Reihe von Modifikationen und Änderungen gemacht werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims (7)

1. Verwendung einer Liposomenzusammensetzung, die (i) aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt ist, welche ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid umfassen, das mit einem hydrophilen, biokompatiblen Polymeren von einer Größe und in einer molaren Menge derivatisiert ist, die eine Verlängerung der Zirkulationszeit, die mehrfach höher ist als die in Abwesenheit des hydrophilen Polymeren erreichbare Zirkulationszeit, von Liposomen der Liposomenzusammensetzung im Blut bewirken, wobei die Zirkulationszeit 24 Stunden nach Injektion gemessen wird, die (ii) einen mittleren Teilchendurchmesser aufweist, der aus einem Größenbereich von weniger als 0,20 Micron ausgewählt ist, und die (iii) eine therapeutische Verbindung, die gegen die Ursache einer Infektion wirksam ist, in Form von Liposomeneinschlüssen enthält,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Behandlung einer Allgemeininfektion, die an einer anderen Stelle als die lokalisiert ist, an der die Makrophagen fixiert sind, die sich in der Leber oder in der Milz befinden.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das hydrophile, biokompatible Polymere unter Polyethylenglycol, Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), einem Copolymeren von PGA und PLA und Polyvinylalkohol ausgewählt ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das hydrophile, biokompatible Polymere Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 5000 Dalton ist.
4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Infektion bakteriellen Ursprungs ist und die therapeutische Verbindung ein Antibiotikum ist.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei mindestens etwa 60% des Antibiotikums in Form von Liposomeneinschlüssen vorliegen.
6. Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei das Antibiotikum ein Aminoglycosid ist, wobei die Konzentration des von den Liposomen eingeschlossenen Aminoglycosids größer als 20 µg Verbindung pro µmol Liposomenlipid ist.
7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Infektionsstelle in der Lunge ist, der Ursprung der Infektion Klebsiella ist und das therapeutische Mittel Gentamicin ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356633A (en) * 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US6465188B1 (en) * 1990-06-11 2002-10-15 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US20060084797A1 (en) * 1990-06-11 2006-04-20 Gilead Sciences, Inc. High affinity TGFbeta nucleic acid ligands and inhibitors
US6645463B1 (en) 1994-05-16 2003-11-11 The Board Of Regents Of The University Of Michigan Blood-pool selective carrier for lipophilic imaging agents
US5820873A (en) * 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) * 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
ATE246920T1 (de) * 1994-10-03 2003-08-15 Infectio Recherche Inc Liposomenzubereitungen zur behandlung von viruserkrankungen
US8071737B2 (en) * 1995-05-04 2011-12-06 Glead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6673364B1 (en) 1995-06-07 2004-01-06 The University Of British Columbia Liposome having an exchangeable component
US20060089751A1 (en) * 1997-01-27 2006-04-27 Ewa Herbst Electronic delivery systems and methods with feedback
US20110230857A1 (en) * 1997-01-27 2011-09-22 Ewa Herbst Electronic delivery systems and methods with feedback
US5827533A (en) * 1997-02-06 1998-10-27 Duke University Liposomes containing active agents aggregated with lipid surfactants
KR20010006195A (ko) * 1997-04-11 2001-01-26 로버트 엘로브 친지성 상형성제용 혈액-풀 캐리어
US6734171B1 (en) 1997-10-10 2004-05-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating nucleic acids in lipid bilayers
US20010003580A1 (en) * 1998-01-14 2001-06-14 Poh K. Hui Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
AU4196099A (en) * 1998-05-21 1999-12-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Long-circulating liposomal compositions
WO1999065461A2 (en) * 1998-06-19 1999-12-23 Genzyme Corporation Cationic amphiphile micellar complexes
US6613352B2 (en) 1999-04-13 2003-09-02 Universite De Montreal Low-rigidity liposomal formulation
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
US20030147944A1 (en) * 1999-12-10 2003-08-07 Mayer Lawrence D Lipid carrier compositions with protected surface reactive functions
WO2001085131A2 (en) * 2000-05-11 2001-11-15 Celator Technologies Inc. Lipid carrier compositions for improved drug retention
CA2449517A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Utah Ventures Ii, L.P. Tissue-specific endothelial membrane proteins
US20060029655A1 (en) * 2001-06-25 2006-02-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for preparation of vesicles loaded with biological material and different uses thereof
CA2467064C (en) * 2001-11-13 2011-02-08 Murray Webb Lipid carrier compositions with enhanced blood stability
JP2006502968A (ja) * 2002-02-21 2006-01-26 ユニヴエルシタ デリ スツディ ディ パヴィア 細菌性コラーゲン結合タンパク質に対して交差反応性のモノクロナール抗体
WO2003075889A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Transave, Inc. An inhalation system for prevention and treatment of intracellular infections
AR036316A1 (es) * 2002-08-29 2004-08-25 Monte Verde S A Una composicion farmaceutica de liposomas de tamano pequeno y metodo de preparacion
MXPA05004580A (es) * 2002-10-29 2005-07-26 Transave Inc Liberacion sostenida de anti - infecciosos.
US7718189B2 (en) 2002-10-29 2010-05-18 Transave, Inc. Sustained release of antiinfectives
US7879351B2 (en) * 2002-10-29 2011-02-01 Transave, Inc. High delivery rates for lipid based drug formulations, and methods of treatment thereof
GB0308731D0 (en) * 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
CA2581190A1 (en) * 2004-09-29 2006-04-13 Alza Corporation Microparticles and nanoparticles containing a lipopolymer
US20070105758A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 May Thomas B Vancomycin formulations having reduced amount of histamine
HUE029994T2 (en) 2005-12-08 2017-04-28 Insmed Inc Lipid-based preparations of antinfectants for the treatment of lung infections
PT2019683T (pt) 2006-04-25 2017-03-17 Univ California Administração de fatores de crescimento para o tratamento de distúrbios do snc
WO2007127839A2 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
JP5333970B2 (ja) * 2007-03-20 2013-11-06 国立大学法人大阪大学 心筋梗塞の予防および/または治療薬
WO2008137717A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Transave, Inc. Compositions of multicationic drugs for reducing interactions with polyanionic biomolecules and methods and uses thereof
US9119783B2 (en) 2007-05-07 2015-09-01 Insmed Incorporated Method of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
US9114081B2 (en) 2007-05-07 2015-08-25 Insmed Incorporated Methods of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
US9333214B2 (en) 2007-05-07 2016-05-10 Insmed Incorporated Method for treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
JP2010527618A (ja) 2007-05-24 2010-08-19 アメリカ合衆国 ヌクレオシドサルベージ経路を通しての核内タンパク質伝達
WO2011160110A1 (en) * 2010-06-19 2011-12-22 Western University Of Health Sciences Novel formulation of pegylated-liposome encapsulated glycopeptide antibiotics
PT2852391T (pt) 2012-05-21 2022-02-18 Insmed Inc Sistemas para tratamento de infeções pulmonares
US20140023696A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Frederick Timothy Guilford Treatment for idiopathic pulmonary fibrosis
AU2013352259B2 (en) 2012-11-29 2018-06-14 Insmed Incorporated Stabilized vancomycin formulations
US20140234397A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Lou Ann Brown Treatment of klebsiella pneumoniae with liposomally formulated glutathione
CN105209017A (zh) * 2013-03-13 2015-12-30 马林克罗特有限公司 用于癌症疗法的脂质体顺铂组合物
RS60827B1 (sr) 2014-05-15 2020-10-30 Insmed Inc Postupci lečenja plućnih netuberkuloznih mikobakterijskih infekcija
US20170281541A1 (en) * 2014-09-05 2017-10-05 The Johns Hopkins University Liposome-based mucus-penetrating particles for mucosal delivery
AU2015374286B2 (en) 2014-12-31 2021-11-18 Lantheus Medical Imaging, Inc. Lipid-encapsulated gas microsphere compositions and related methods
IL296876A (en) 2016-05-04 2022-12-01 Lantheus Medical Imaging Inc Methods and devices for preparing sharpness factors for ultrasound
US9789210B1 (en) 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
JP7079250B2 (ja) * 2016-08-18 2022-06-01 ブレマー,トロイ リポソーム構築物を用いた黄斑細胞及び網膜細胞への尿素の送達
WO2019133916A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Wayne State University Drug delivery systems for treatment of infections
US11571386B2 (en) 2018-03-30 2023-02-07 Insmed Incorporated Methods for continuous manufacture of liposomal drug products

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4534899A (en) * 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) * 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4501728A (en) * 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4981692A (en) * 1983-03-24 1991-01-01 The Liposome Company, Inc. Therapeutic treatment by intramammary infusion
US4885172A (en) * 1985-06-26 1989-12-05 The Liposome Company, Inc. Composition for targeting, storing and loading of liposomes
GB8601100D0 (en) * 1986-01-17 1986-02-19 Cosmas Damian Ltd Drug delivery system
JPS6376862A (ja) * 1986-09-17 1988-04-07 Nippon Denso Co Ltd 表面硬化層を有するアルミニウム部材
IL97538A (en) * 1986-12-23 1995-03-15 Liposome Co Inc Multilayer liposomes containing guanidino aminoglycosides and their preparation
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) * 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JP2666345B2 (ja) * 1987-04-16 1997-10-22 武田薬品工業株式会社 リポソーム製剤およびその製造法
JPH04234841A (ja) * 1988-07-08 1992-08-24 Mitsubishi Rayon Co Ltd 光学活性化合物及び液晶組成物
GB8824593D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5153000A (en) * 1988-11-22 1992-10-06 Kao Corporation Phosphate, liposome comprising the phosphate as membrane constituent, and cosmetic and liposome preparation comprising the liposome
US4906476A (en) * 1988-12-14 1990-03-06 Liposome Technology, Inc. Novel liposome composition for sustained release of steroidal drugs in lungs
US5079234A (en) * 1989-03-23 1992-01-07 Bristol-Myers Squibb Co. Inhibitors of aminoglycoside nephrotoxicity
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time

Also Published As

Publication number Publication date
US5843473A (en) 1998-12-01
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DE69304685D1 (de) 1996-10-17
ATE142483T1 (de) 1996-09-15
WO1993019738A1 (en) 1993-10-14
DK0632719T3 (da) 1997-09-15

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