1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Liposomenzusammensetzung und
ein Verfahren, insbesondere für die Verwendung bei
Konzentrationstherapeutika an Stellen von Gewebeinfektionen, wie sie z. B. durch das
Eindringen von Bakterien hervorgerufen werden.
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3. Hintergrund der Erfindung
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Gegenwärtig verfügbare Behandlungspläne für die Behandlung von
infizierten Geweben oder Bereichen schreiben die systemische Verabreichung
von antimikrobiellen Verbindungen vor, wenn derartige Gewebe nicht ohne
weiteres einer topischen Verabreichung zugänglich sind. Es wäre
wünschenswert, therapeutische Verbindungen selektiv auf derartige infizierte
Bereiche über den Blutstrom zu richten, um toxische Nebenwirkungen zu
verringern und die Arzneistoffdosis, die in sicherer Weise an einen
infizierten Bereich abgegeben werden kann, zu erhöhen, während andere
Körperbereiche von einer Exposition gegenüber derartigen Verbindungen
ausgespart werden.
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Es ist vorgeschlagen worden, Liposomen als Arzneistoffträger für
intravenös (IV) verabreichte Verbindungen unter Einschluß bildgebender und
therapeutischer Verbindungen zu verwenden. Die Verwendung von Liposomen
für die zielgerichtete Verabreichung über den Blutstrom wird jedoch durch
die rasche Clearance der Liposomen durch Zellen des retikubendothelialen
Systems (RES) stark beschränkt. Typischerweise entfernt das RES 80 bis
95% einer Dosis von IV injizierten Liposomen innerhalb von 1 Stunde,
wobei es in Konkurrenz mit der gewählten Zielstelle um die Aufnahme der
Liposomen diese wirksam übertrifft. Die liposomale Behandlung von
Infektionen ist daher größtenteils auf die Behandlung des retikubendothelialen
Systems beschränkt (Fierer).
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Es berichtet worden, daß die RES-Aufnahme von Liposomen von einer
Reihe von Faktoren beeinflußt wird (z. B.: Gregoriadis, 1974; Jonah;
Gregoriadis, 1972, Juliano; Allen, 1983; Kimelberg, 1976; Richardson; Lopez-
Berestein; Allen, 1981; Scherphof; Gregoriadis, 1980; Hwang; Patel, 1983;
Senior, 1985; Allen, 1983; Ellens; Senior, 1982; Hwang; Ashwell;
Hakomori; Karlsson; Schauer; Durocher; Greenberg; Woodruff; Czop; und Okada).
Kurz gesagt spielen die Liposomengröße, die Ladung, der Grad der
Lipidsättigung und Oberflächengruppen eine Rolle bei der Liposomen-Clearance
durch das RES. Kein einziger bis heute identifizierter Faktor sorgt
jedoch wirksam für eine lange Halbwertszeit im Blut und insbesondere für
einen relativ hohen Prozentsatz an Liposomen im Blutstrom 24 Stunden nach
der Injektion.
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Zusätzlich zu einer langen Halbwertszeit im Blut erfordert es die
wirksame Arzneistoffabgabe an eine infizierte Stelle über den Blutstrom
auch, daß die Liposomen imstande sind, in die kontinuierliche
endotheliale Zellschicht und die darunterliegende Basismembran, die die Gefäße,
die den Bereich mit Blut versorgen, umgibt, einzudringen. Eine lokale
Infektion ist von einem akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems
gegenüber Proteinen im Bereich der Infektion begleitet, woran sich eine
Wanderung der Neutrophilen aus dem Blutstrom in den infizierten Bereich
anschließt. Aufgrund keines dieser Ereignisse läßt sich jedoch die
Fähigkeit von Liposomen, durch epitheliale Zellbarrieren und benachbarte
Basismembranen zu treten, vorhersagen, da Proteine im allgemeinen
wesentlich kleiner als Liposomen sind und da die Neutrophilen spezifische
Bindungsstellen und aktive Mechanismen für das Eindringen in die Blutgefäße
aufweisen.
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In der Tat zeigen bisher vorgelegte Studien, daß selbst bei einer
Zunahme der Durchlässigkeit der Blutgefäße die Extravasation von
herkömmlichen Liposomen durch die Gefäße nicht signifikant ansteigt (Poste). Auf
der Basis dieser Befunde wurde geschlossen, daß zwar die Extravasation
von Liposomen aus Kapillaren, die von der Erkrankung erfaßt werden, in
einem begrenzten Maßstab unterhalb der Nachweisgrenze auftreten kann, daß
das therapeutische Potential jedoch minimal wäre (Poste).
4. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
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Eine allgemeine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine
Liposomenzusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, die wirksam für die
Behandlung einer Infektion, die an einer Stelle lokalisiert ist, die von
den fixierten Makrophagen, die sich in der Leber oder Milz befinden,
verschieden ist, durch Konzentration der Liposomen und damit einer
therapeutischen Verbindung im infizierten Bereich sind, ist.
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Die Erfindung umfaßt gemäß einem Aspekt ein Verfahren zur Behandlung
einer Stelle einer systemischen Infektion, die an einer Gewebestelle
lokalisiert ist, wie es vorstehend beschrieben wurde. Das Verfahren umfaßt
die parenterale Injektion einer Zusammensetzung von Liposomen, die (i)
aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt sind, welche ein
amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid umfassen, das mit einem hydrophilen,
biokompatiblen Polymeren von einer Größe und einem Molekülgewicht
derivatisiert ist, die wirksam sind, um die Zirkulationszeit im Blut mehrfach
gegenüber Liposomen, denen ein derartiges Lipid-derivatisiertes Polymeres
fehlt, zu verlängern, die (ii) einen gewählten mittleren
Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,20 µm aufweisen und die (iii) eine
therapeutische Verbindung, die gegen die Ursache einer Infektion wirksam ist,
in Form von Liposomeneinschlüssen enthalten. Die Injektion dieser
Zusammensetzung ist wirksam hinsichtlich der Konzentrierung der Liposomen im
infizierten Bereich, wobei die therapeutische Verbindung im infizierten
Gewebe konzentriert wird.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
hydrophilen Polymeren um Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht
zwischen etwa 300 und 5000 Dalton. Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist das hydrophile Polymere aus der Gruppe ausgewählt, die aus
Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), einem Copolymeren von PGA
und PLA und Polyvinylalkohol (PVA) besteht.
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In Liposomen eingeschlossene therapeutische Verbindungen sind
vorzugsweise antimikrobielle Mittel oder Mittel gegen Infektionen unter
Einschluß von antibiotischen, fungiziden, antiviralen, antihelminthischen
und antiparasitären Mitteln. Für die Verwendung bei einer bakteriellen
Infektion handelt es sich bei der therapeutischen Verbindung vorzugsweise
um ein Antibiotikum. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen
mindestens etwa 60% des antibiotischen Mittels in Form von
Liposomeneinschlüssen vor. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt
es sich bei dem antibiotischen Mittel um ein Aminoglycosid-Antibiotikum,
und es liegt eingeschlossen in den Liposomen in einer Konzentration von
mehr als 20 µg Verbindung/µMol Liposomenlipid vor.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur
Behandlung einer Klebsiella-Infektion der Lunge mit Gentamicin angewandt.
Das Behandlungsverfahren kann auch bei der Behandlung einer Aspergillus-
Infektion der Lunge mit einem Fungizid, wie Amphotericin B, der
Behandlung von Bacteroides-Infektionen, wie der Lunge, des Darms, des Hirns
oder des Beckens, mit Clindamycin, einem Penicillin, einem Cephalosporin,
Metronidazol oder Chloramphenicol, der Behandlung einer
Pseudomonas-Infektion der Prostata mit einem Breitband-Penicillin oder der Behandlung
von staphylococcaler Endocarditis oder Osteomyelitis mit Vancomycin,
einem Penicillin oder einem Cephalosporin angewandt werden. Außerdem
können erfindungsgemäß bestimmte virale dermale Infektionen, wie
Herpes-Infektionen, unter Anwendung der systemischen Verabreichung einer
liposomalen Zusammensetzung von Acyclovir behandelt werden. Die Behandlung von
Infektionen, die sich in Leber-Hepatocyten befinden, kann nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Speziell können Hepatitis B
oder C mit liposomalen Zusammensetzung eines DNA-Polymerase-Inhibitors,
wie Zidovudine, behandelt werden. Außerdem kann das Behandlungsverfahren
zur systemischen Behandlung bestimmter Infektionen des zentralen
Nervensystems angewandt werden, wenn die Blut-Hirn-Schranke durch eine
derartige Infektion durchlässig gemacht wird. Beispiele umfassen die
Behandlung von Meningitis aufgrund von Pneumococcus, Pseudomonas, Listeria
oder Meningococcus durch ein Penicillin, ein Cephalosporin, Erythromycin
oder Gentamicin, die Behandlung von Meningitis, die durch Cryptococcus
hervorgerufen wird, durch Amphotericin oder Fluconazol und die Behandlung
von Meningitis aufgrund von Hemophilus influenzae oder Streptococcus
pneumoniae durch Penicilline, Cephalosporine oder Chloramphenicol.
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Gemäß einem damit in Verbindung stehenden Aspekt umfaßt die
Erfindung auch eine injizierbare Liposomenzusammensetzung für die Verwendung
bei einem Verfahren zur Behandlung einer Stelle einer systemischen
Infektion, die an einer Gewebestelle lokalisiert ist, die von den fixierten
Makrophagenzellen der Leber oder der Milz verschieden ist. Die
Zusammensetzung umfaßt Liposomen, die aus Vesikel-bildenden Lipiden
zusammengesetzt
sind, welche ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid umfassen,
das mit einem hydrophilen, biokompatiblen Polymeren derivatisiert ist,
wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Liposomen der Zusammensetzung
weisen auch einen ausgewählten mittleren Teilchendurchmesser von weniger
als etwa 0,20 µm auf und enthalten in Form von Liposomeneinschlüssen eine
therapeutische Verbindung, die gegen die Ursache der Infektion wirksam
ist. Derartige Liposomen reichem sich selektiv im infizierten Gewebe an,
so daß die therapeutische Verbindung an der Infektionsstelle konzentriert
wird.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
hydrophilen Polymeren der Zusammensetzung um ein Polyethylenglycol mit
einem Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 5000 Dalton. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hydrophile Polymere der
Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt, die aus PGA, PLA, einem
Copolymeren aus PGA und PLA sowie PVA besteht. Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein
Aminoglycosid-Antibiotikum. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfaßt die Zusammensetzung Gentamicin und wird für die Behandlung einer
Infektion der Lunge verwendet.
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Gemäß einem damit im Zusammenhang stehenden Aspekt umfaßt die
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels gegen Infektionen oder
eines antimikrobiellen Mittels für die Lokalisierung in einem infizierten
Bereich des Gewebes durch intravenöse Injektion. Das Verfahren umfaßt das
Einschließen des Mittels in einer Liposomenzusammensetzung, wie es
vorstehend beschrieben wurde.
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Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung
sind vollständiger ersichtlich, wenn die nachstehende ausführliche
Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit der beigefügten Zeichnung
betrachtet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Fig. 1 erläutert ein allgemeines Reaktionsschema für die
Derivatisierung eines Vesikel-bildenden Lipidamins mit einem Polyalkylether;
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Fig. 2 ist ein Reaktionsschema für die Herstellung von
Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol über ein Cyanurchlorid-
Verknüpfungsmittel derivatisiert wird;
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Fig. 3 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von
Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol mittels eines
Diimidazol-Aktivierungsreagenzes derivatisiert wird;
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Fig. 4 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von
Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglycol mittels eines
Trifluormethansulfonat-Reagenzes derivatisiert wird,
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Fig. 5 erläutert ein Vesikel-bildendes Lipid, das mit
Polyethylenglycol über eine Peptidverknüpfung (5A), eine Esterverknüpfung (5B) und
eine Disulfidverknüpfung (5C) derivatisiert wird;
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Fig. 6 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von
Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure
(PGA) und Copolymeren dieser beiden derivatisiert wird;
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Fig. 7 ist ein Diagramm der Liposomenverweilzeiten im Blut,
ausgedrückt als Prozent der injizierten Dosis als Funktion der Stunden nach
der IV-Injektion, und zwar für PEG-PE-Liposomen mit einem Gehalt an 4,7
(Dreiecke) oder 14 (Kreise) Mol-% Phosphatidylglycerin;
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Fig. 8A ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die
Blutverweilzeit von Liposomen zeigt, die vorwiegend aus ungesättigten
Phospholipidkomponenten zusammengesetzt sind;
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Fig. 8B ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die
Blutverweilzeiten von PEG-beschichteten Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) und
herkömmlichen unbeschichteten Liposomen (ausgefüllte Kreise) zeigt;
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Fig. 9 ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die
Blutverweilzeiten von Liposomen zeigt, die mit PEG mit einem Molekulargewicht von
750 (ausgefüllte Dreiecke) und PEG mit einem Molekulargewicht von 350
(leere Dreiecke) formuliert wurde;
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Fig. 10A ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die
Blutverweilzeit von Polymuchsäure- oder Polyglycolsäure-beschichteten Liposomen
(obere Linie) und herkömmlichen unbeschichteten Liposomen (untere Linie)
zeigt;
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Fig. 10B ist ein Diagramm ähnlich dem von Fig. 7, das die
Blutverweilzeit von Polymilchsäure- oder Polyglycolsäure-beschichteten Liposomen
(obere Linie) und Polyvinylalkohol-beschichteten Liposomen (untere Linie)
zeigt;
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Fig. 11 zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Verteilung
von PEG enthaltenden Liposomen in Blut (ausgefüllte Kreise), Leber
(ausgefüllte Dreiecke) und Milz (ausgefüllte Quadrate) bei nicht infizierten
Ratten;
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Fig. 12 zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Anreicherung
von PEG enthaltenden Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 90 nm
in nicht infizierten rechten Lungen (ausgefüllte Dreiecke), infizierten
linken Lungen (ausgefüllte Kreise) und Blut (ausgefüllte Quadrate) bei
Ratten (n=4), die lokal in der linken Lunge mit K. pneumoniae infiziert
wurden;
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Fig. 13 zeigt ein Diagramm der Erholung zu verschiedenen Zeiten
(Stunden) nach der Injektion von PEG enthaltenden Liposomen mit mittleren
Durchmessern von 150 nm aus nicht infizierten rechten Lungen (leere
Quadrate), infizierten linken Lungen (leere Dreiecke) und Blut (leere
Kreise) bei Ratten (n=4), die lokal in der linken Lunge mit K. pneumoniae
infiziert wurden;
-
Fig. 14 zeigt einen Vergleich der Aufnahme von PEG enthaltenden
Liposomen, aufgetragen gegen das Lungengewicht, in infizierte (linke,
Kreise) und nicht infizierte (rechte, Dreiecke) Lungen;
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Fig. 15A zeigt die Beziehung zwischen dem Gewicht der infizierten
Lunge und der Aufnahme von ¹&sup9;&sup0;&sup0;PEG enthaltenden Liposomen (Kreise) und
der Aufnahme von Kontroll-Liposomen (PG:PC:chol; Dreiecke) 48 Stunden
nach der Injektion in Ratten, wobei die Aufnahme als µM liposomale
Lipidanreicherung ausgedrückt ist;
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Fig. 15B zeigt die Beziehung zwischen dem Gewicht der infizierten
Lunge und der Aufnahme von HPI enthaltenden Liposomen (Kreise) und der
Aufnahme von Kontroll-Liposomen (PG:PC:chol; Dreiecke) 48 Stunden nach
der Injektion in Ratten, wobei die Aufnahme als µM liposomale
Lipidanreicherung ausgedrückt ist;
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Figg. 16A und 16B sind Diagramme von Daten, die in Fig. 15A bzw.
Fig. 15B gezeigt sind, wobei die Aufnahme der Liposomen als Konzentration
an liposomalem Lipid pro Gramm Lungengewebe ausgedrückt ist;
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Fig. 17 zeigt ein chromatographisches Profil von
[¹²&sup5;I]-Gentamicinenthaltenden Liposomen, die aus einer Sephadex G-50-Größenausschlußsäule
eluiert wurden, wobei Radioaktivität (leere Kreise) und Trübung
(Lichtextinktion bei 600 nm; Rauten) aufgezeichnet wurden;
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Fig. 18A zeigt ein Diagramm des zeitlichen Verlaufs der Gentamicin-
Anreicherung (µg/Lunge) in Rattenlungen, die zum Zeitpunkt 0 mit K.
pneumoniae infiziert und zum Zeitpunkt 24 Stunden mit Gentamicinsulfat
(15 mg/kg; leere Kreise), Gentamicinsulfat-beladenen PEG enthaltenden
Liposomen mit einer Zusammensetzung PEG-DSPE:PC:Chol = 0,15:1,85:1 (1,9
mg Gentamicin/kg; ausgefüllte Kreise) oder Gentamicinsulfat-beladenen,
PEG enthaltenden, cholesterinfreien Liposomen mit einer Zusammensetzung
PEG-DSPE:PC = 0,15:2,85 (1,9 mg Gentamicin/kg; ausgefüllte Dreiecke)
behandelt wurden;
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Fig. 18B ist ein Diagramm ähnlich Fig. 18A, mit der Ausnahme, daß
die Anreicherung an Gentamicin als Prozent der injizierten Dosis
ausgedrückt ist; und
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Fig. 19 ist ein Diagramm der Bakterienzahlen (log CFU) in
Rattenlungen, die zum Zeitpunkt 0 mit K. pneumoniae infiziert und zum Zeitpunkt 24
Stunden mit freiem Gentamicinsulfat (15 mg/kg; leere Kreise) oder
Gentamicinsulfat-beladenen, PEG enthaltenden Liposomen (1,9 mg Gentamicin/kg;
ausgefüllte Kreise) behandelt wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
1. Herstellung von derivatisierten Lipiden
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Fig. 1 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema für die Herstellung
eines Vesikel-bildenden Lipids, das mit einem biokompatiblen, hydrophilen
Polymeren derivatisiert ist, wofür Polyethylenglycol (PEG),
Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und Polyvinylalkohol (PVA) Beispiele
sind. Diese Polymeren sind ohne weiteres wasserlöslich, können an
Vesikel-bildende Lipide gekuppelt werden und werden in vivo ohne toxische
Wirkungen vertragen. Das hydrophile Polymere, das eingesetzt wird, z. B.
PEG, ist vorzugsweise mit einer Methoxy-, Ethoxy- oder einer anderen
nicht reaktiven Gruppe an einem Ende versehen oder weist alternativ eine
chemische Gruppe auf, die an einem Ende stärker reaktiv ist als am
anderen. Das Polymere wird an einem seiner Enden durch Reaktion mit einem
geeigneten Aktivierungsmittel, das in der Figur als R* bezeichnet wird, wie
Cyanurchlorid, Diimidazol, Anhydridreagenz oder dergl., wie es
nachstehend beschrieben wird, aktiviert. Die aktivierte Verbindung wird dann mit
einem Vesikel-bildenden Lipid, wie Diacylglycerin unter Einschluß von
Diacylphosphoglycerinen, bei denen die beiden Kohlenwasserstoffketten
typischerweise eine Länge zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome aufweisen und
einen variierenden Grad der Sättigung haben, umgesetzt, um das
derivatisierte Lipid herzustellen. Phosphatidylethanolamin (PE) ist ein Beispiel
für ein Phospholipid, das für diesen Zweck bevorzugt ist, da es eine
reaktive Aminogruppe enthält, die für die Kupplung an die aktivierten
Polymeren zweckmäßig ist. Alternativ dazu kann die Lipidgruppe für die
Reaktion mit dem Polymeren aktiviert werden, oder die beiden Gruppen können
in einer konzertierten Kupplungsreaktion gemäß bekannten
Kupplungsverfahren verknüpft werden. An einem Ende mit einer Methoxy- oder Ethoxygruppe
versehenes PEG kann im Handel in einer Reihe von Polymergrößen, z. B. mit
Molekulargewichten von 500 bis 20 000 Dalton, erhalten werden.
-
Das Vesikel-bildende Lipid ist vorzugsweise ein Lipid mit 2
Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und einer polaren
Kopfgruppe. Zu dieser Klasse gehören die Phospholipide, wie
Phosphatidylcholin (PC), PE, Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinosit (PI) und
Sphingomyelin (SM), wobei die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine
Länge zwischen etwa 14 und 22 Kohlenstoffatomen aufweisen und variierende
Sättigungsgrade haben. Zu dieser Klasse gehören auch die Glycolipide, wie
Cerebroside und Ganglioside.
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Weitere Vesikel-bildende Lipide, die eingesetzt werden können, sind
Cholesterin und verwandte Sterole. Im allgemeinen kann Cholesterin
weniger fest in der Lipiddoppelschichtmembran verankert werden, insbesondere,
wenn es mit einem hochmolekularen Polymeren, wie Polyalkylether,
derivatisiert ist, und daher fördert es weniger wirksam, daß die Liposomen das
RES im Blutstrom umgehen.
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Allgemeiner und entsprechend der hier gegebenen Definition soll
"Vesikel-bildendes lipid" beliebige amphipathische Lipide mit hydrophoben
Anteilen und mit polaren Kopfgruppenanteilen einschließen, die (a) selbst
spontan Doppelschichtvesikel in Wasser bilden können, wofür Phospholipide
Beispiele sind, oder die (b) stabil in Lipiddoppelschichten in
Kombination mit Phospholipiden eingebaut werden können, wobei der hydrophobe
Anteil in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der
Doppelschichtmembran steht und der polare Kopfgruppenanteil nach außen zur polaren
Oberfläche der Membran orientiert ist. Beispiele für den letztgenannten Typ
von Vesikel-bildenden Lipiden sind Cholesterin und Cholesterinderivate,
wie Cholesterinsulfat und Cholesterinhemisuccinat.
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Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung kann das
Vesikel-bildende Lipid ein relativ fluides Lipid sein, was typischerweise bedeutet,
daß die Lipidphase eine relativ niedrige flüssige - flüssigkristalline
Schmelztemperatur aufweist, z. B. bei oder unterhalb Raumtemperatur, oder
ein relativ steifes Lipid, was bedeutet, daß das Lipid eine relativ hohe
Schmelztemperatur aufweist, z. B. bis zu 60ºC. In der Regel tragen die
steiferen, d. h. gesättigteren, Lipide zu einer stärkeren
Membransteifigkeit in einer Lipid-Doppelschichtstruktur bei, und sie tragen auch zu
einer größeren Doppelschichtstabilität im Serum bei. Es ist bekannt, daß
andere Lipidkomponenten, wie Cholesterin, ebenfalls zur
Membransteifigkeit und zur Stabilität in Lipid-Doppelschichtstrukturen beitragen. Wie
vorstehend erwähnt wurde, ist ein langkettiges (z. B. C-18) gesättigtes
Lipid plus Cholesterin eine bevorzugte Zusammensetzung für die Abgabe von
Therapeutika an infizierte Stellen, da diese Liposomen nicht dazu neigen,
den Arzneistoff in das Plasma abzugeben, wenn sie durch den Blutstrom
zirkulieren, und in den infizierten Bereich während der ersten 48 Stunden
nach der Injektion eintreten. Phospholipide, deren Acylketten
verschiedene Sättigungsgrade aufweisen, können im Handel erhalten oder nach
veröffentlichten Verfahren hergestellt werden.
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Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung umfaßt das
Vesikel-bildende Lipid ein amphipathisches Vesikel-bildendes Lipid mit
einem derivatisierten hydrophilen biokompatiblen Polymeren. Bei Versuchen
zur Stützung der Erfindung gemäß der nachstehenden Ausführungen wurde
festgestellt, daß das Vorhandensein derartiger Polymerer, die an
Vesikelbildende Lipide in liposomalen Zusammensetzungen derivatisiert sind,
wirksam ist, um die Zirkulationszeit der Liposomen im Blut im Vergleich
mit Liposomen, die aus Lipiden in Abwesenheit derartiger derivatisierter
hydrophiler Polymerer gebildet werden, signifikant zu erhöhen.
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Es ist darauf hinzuweisen, daß die Polymer-derivatisierten Lipide
(a) sicher für die parenterale Verabreichung im Hinblick auf Toxizität,
biologische Abbaubarkeit und Gewebeverträglichkeit, (b) kompatibel mit
der Bildung und Struktur einer stabilen Lipid-Doppelschicht und (c)
geeignet für die Liposomenherstellungs- und Verarbeitungsstufen sein
müssen. Diese Anforderungen werden von PEG-Polymeren, die für die Verwendung
beim Menschen in den USA zugelassen sind, und auch von den
thermoplastischen Polyesterpolymeren Polymilchsäure und Polyglycolsäure (auch als
Polylactid und Polyglycolid bezeichnet), Copolymeren von Lactid und
Glycolid, wie Poly-(lactid-co-glycolid) und Polyvinylalkoholen erfüllt.
Insbesondere die Polyesterpolymere sind sicher zu verabreichen, da sie
biologisch abgebaut werden, indem sie einer statistischen,
nicht-enzymatischen, hydrolytischen Spaltung ihrer Esterverknüpfungen unter Bildung von
Milchsäure und Glycolsäure unterliegen, die normale
Stoffwechselverbindungen sind (Tice und Cowsar, und Weise et al.).
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Fig. 2 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung eines PE-PEG-
Lipids, bei dem PEG an PE durch eine Cyanurchloridgruppe derivatisiert
ist. Einzelheiten der Reaktion sind in Beispiel 1 angegeben. Kurz gesagt
wird das mit einer Methoxyendgruppe versehene PEG mit Cyanurchlorid in
Gegenwart von Natriumcarbonat unter Bedingungen aktiviert, die die in der
Figur gezeigte aktivierte PEG-Verbindung bilden. Dieses Material wird zur
Entfernung von nicht umgesetztem Cyanurchlorid gereinigt. Die aktivierte
PEG-Verbindung wird mit PE in Gegenwart von Triethylamin (TEA) unter
Bildung
der gewünschten, in der Figur gezeigten PE-PEG-Verbindung umgesetzt.
Die Ausbeute beträgt etwa 8 bis 10% im Hinblick auf die eingesetzten
Mengen an PEG.
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Das gerade beschriebene Verfahren kann auf eine Reihe von
Lipidaminen unter Einschluß von PE, Cholesterylamin und Glycolipiden mit Zucker-
Amin-Gruppen, angewandt werden.
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Ein zweites Verfahren für die Kupplung eines Polyalkylethers, wie
des mit einer Endgruppe versehenen PEG, an ein Lipidamin ist in Fig. 3
erläutert. Hier wird das mit der Endgruppe versehene PEG mit einem
Carbonyldiimidazol-Kupplungsreagenz (CDI) unter Bildung der in Fig. 3
gezeigten aktivierten Imidazolverbindung aktiviert. Die Reaktion mit einem
Lipidamin, wie PE, führt zur PEG-Kupplung an das Lipid durch eine
Amidverknüpfung, wie es in der in der Figur gezeigten PEG-PE-Verbindung
erläutert ist. Einzelheiten der Reaktion sind in Beispiel 2 angegeben.
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Ein drittes Reaktionsverfahren zur Kupplung eines mit einer
Endgruppe versehenen Polyalkylethers an ein Lipidamin ist in Fig. 4 gezeigt.
Hier wird das PEG zuerst an seinem OH-Ende durch eine
Trimethylsilangruppe geschützt. Die Reaktion zum Schützen des Endes ist in der Figur
gezeigt und beinhaltet die Umsetzung von Trimethylsilylchlorid mit PEG in
Gegenwart von Triethylamin (TEA). Das geschützte PEG wird dann mit dem
Anhydrid von Trifluormethylsulfonat unter Bildung der mit
Trifluormethylsulfonat aktivierten PEG-Verbindung umgesetzt. Die Reaktion der
aktivierten Verbindung mit einem Lipidamin, wie PE, in Gegenwart von Triethylamin
ergibt das gewünschte derivatisierte Lipidprodukt, wie die
PEG-PE-Verbindung, in der die Lipidamingruppe an den Polyether durch das endständige
Methylenkohlenstoffatom im Polyetherpolymeren gekuppelt ist. Die
Trimethylsilylschutzgruppe kann durch Säurebehandlung, wie es in der Figur
angegeben ist, oder alternativ durch Reaktion mit einem quaternären
Aminfluoridsalz, wie dem Fluoridsalz von Tetrabutylamin, freigesetzt werden.
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Es ist darauf hinzuweisen, daß eine Reihe von bekannten
Kupplungsreaktionen zusätzlich zu denen, die gerade beschrieben wurden, für die
Herstellung von Vesikel-bildenden Lipiden, die mit hydrophilen Polymeren,
wie PEG, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-
Copolymeren und Polyvinylalkohol derivatisiert sind, geeignet sind. Zum
Beispiel kann das in Fig. 4 erläuterte Sulfonatanhydrid-Kupplungsreagenz
eingesetzt werden, um einen aktivierten Polyalkylether mit der
Hydroxygruppe eines amphlpathischen Lipids, wie der 5'-OH-Gruppe von
Cholesterin, zu verknüpfen. Andere reaktive Lipidgruppen, wie eine Säure- oder
Esterlipidgruppe, können ebenfalls für die Kupplung nach bekannten
Verfahren herangezogen werden. Zum Beispiel kann die Säuregruppe von
Phosphatidsäure unter Bildung eines aktiven Lipidanhydrids durch Umsetzung
mit einem geeigneten Anhydrid, wie Essigsäureanhydrid, aktiviert werden,
und das reaktive Lipid kann dann mit einem geschützten Polyalkylamin
durch Umsetzung in Gegenwart eines Isothiocyanatreagenzes verknüpft
werden.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die derivatisierten
Lipidkomponenten so hergestellt, daß sie eine labile
Lipid-Polymer-Verknüpfung, wie eine Peptid-, Ester- oder Disulfid-Verknüpfung, enthalten, die
unter ausgewählten physiologischen Bedingungen gespalten werden kann, wie
in Gegenwart von Peptidase- oder Esteraseenzymen oder Reduktionsmitteln,
wie Glutathion, die im Blutstrom vorhanden sind. Fig. 5 zeigt
beispielhaft Lipide, die über (5A) Peptid, (5B) Ester und (5C) Disulfid
enthaltende Verknüpfungen verknüpft sind. Die Peptid-verknüpfte Verbindung kann
z. B. hergestellt werden, indem zuerst ein Polyalkylether mit dem
N-terminalen Amin des gezeigten Tripeptids z. B. über die in Fig. 3 gezeigte
Reaktion, gekuppelt wird. Die Peptidcarboxylgruppe kann dann mit einer
Lipidamingruppe durch ein Carbodi imid-Kupplungsreagenz auf herkömmliche
Weise gekuppelt werden. Die Ester-verknüpfte Verbindung kann z. B. durch
Kupplung einer Lipidsäure, wie Phosphatidsäure, mit der endständigen
Alkoholgruppe eines Polyalkylethers unter Verwendung von Alkohol über ein
Anhydrid-Kupplungsmittel hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein
kurzes Verknüpfungsfragment, das eine innere Esterbindung und geeignete
Endgruppen enthält, wie primäre Amingruppen, verwendet werden, um den
Polyalkylether an das amphipathische Lipid durch Amid- oder
Carbamatverknüpfungen zu kuppeln. Entsprechend kann das Verknüpfungsfragment eine
innere Disulfidverknüpfung zur Verwendung bei der Bildung der in Fig. 5C
gezeigten Verbindung enthalten. Polymere, die an Phospholipide über
reversible Verknüpfungen gekuppelt sind, sind geeignet, um für hohe
Blutspiegel an Liposomen, die sie enthalten, in den ersten Stunden nach der
Injektion zu sorgen. Nach dieser Zeitspanne spalten Plasmakomponenten die
reversiblen Bindungen unter Freisetzung der Polymeren, und die
"ungeschützten" Liposomen werden rasch durch das RES nach dem gleichen
Mechanismus wie herkömmliche Liposomen aufgenommen.
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Fig. 6 erläutert ein Verfahren zur Derivatisierung von
Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren mit
PE mit einer Amidverknüpfung. Die Polymilchsäure wird in Gegenwart von PE
mit Dicyclohexylcarboimid (DCCI) umgesetzt, wie es ausführlich in
Beispiel 2 angegeben wird. Entsprechend kann ein Vesikel-bildendes Lipid,
das mit Polyglycolsäure derivatisiert ist, durch Umsetzung von
Polyglycolsäure oder Glycolsäure mit PE in Gegenwart eines geeigneten
Kupplungsmittels, wie DCCI, gebildet werden, wie es ebenfalls ausführlich in
Beispiel 2 angegeben ist. Ähnliche Reaktionen können herangezogen werden, um
Lipidderivate von Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren zu bilden.
Polyvinylalkohol (PVA) wird entsprechend mit PE unter Bildung einer
Carbamatverknüpfung derivatisiert, wie es ausführlich in Beispiel 2
angegeben ist, indem zuerst PE mit Carbonyldiimidazol (CDI) umgesetzt wird,
woran sich die Zugabe einer niedermolekularen Fraktion von PVA in Gegenwart
von Triethylamin anschließt. Die Vesikel-bildenden Lipide, die mit
Polymilchsäure oder Polyglycolsäure und ihren Copolymeren oder mit
Polyvinylalkohol derivatisiert sind, bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden Liposomen, die
diese derivatisierten Lipide enthalten.
II. Herstellung von Liposomen
A. Lipidkomponenten
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Die bei der Bildung der erfindungsgemäßen Liposomen verwendeten
Lipidkomponenten können aus einer Reihe von Vesikel-bildenden Lipiden,
typischerweise unter Einschluß von Phospholipiden, Sphingolipiden und
Sterolen, ausgewählt werden. Wie gezeigt wird, ist eine Anforderung an die
erfindungsgemäßen Liposomen eine lange Zirkulationszeit im Blut. Es ist
daher nützlich, ein Standardmaß für die Lebenszeit im Blut einzuführen,
das zur Bewertung der Wirkung der Lipidkomponenten auf die
Bluthalbwertszeit herangezogen werden kann.
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Ein Verfahren, das für die Bewertung der Liposomen-Zirkulationszeit
in vivo herangezogen wird, besteht in der Messung der Verteilung von IV
injizierten Liposomen im Blutstrom und den primären Organen des RES zu
ausgewählten Zeiten nach der Injektion. Bei dem standardisierten Modell,
das hier herangezogen wird, wird die RES-Aufnahme durch das Verhältnis
der gesamten Liposornen im Blutstrom zu den gesamten Liposomen in Leber
und Milz, den hauptsächlichen Organen des RES, gemessen. Es ist darauf
hinzuweisen, daß zwar die Aufnahme in derartigen Geweben speziell in RES-
Zellen erfolgt, die fixierten Makrophagen der Leber und Milz, daß die
Bewertung der RES-Aufnahme herkömmlicherweise jedoch durch Messung der
Gesamtaufnahme durch die ganzen Gewebe durchgeführt wird. Wenn also hier
angegeben wird, daß die RES-Aufnahme in Leber und Milz gemessen wurde,
dann ist dies so zu verstehen, daß die Aufnahme hauptsächlich durch die
fixierten Makrophagen der Leber und Milz erfolgte. In der Praxis werden
hinsichtlich Alter und Geschlecht übereinstimmenden Ratten oder Mäusen IV
durch die Schwanzvene radioaktiv markierte Liposomenzusammensetzungen
injiziert, und zu jedem Zeitpunkt erfolgt die Bestimmung durch Messung der
radioaktiven Zähirate für das gesamte Blut und für die Kombination aus
Leber und Milz, wie es ausführlich in Beispiel 5 angegeben ist.
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Da Leber und Milz und speziell die fixierten Makrophagen in Leber
und Milz für nahezu 100% der anfänglichen Aufnahme von Liposomen durch
das RES verantwortlich sind, stellt das gerade beschriebene
Blut/RES-Verhältnis einen guten Näherungswert für das Ausmaß der Aufnahme aus dem
Blut in das RES in vivo dar. Zum Beispiel zeigt ein Verhältnis von etwa 1
oder mehr das Vorherrschen von injizierten Liposomen, die im Blutstrom
verbleiben, an, und ein Verhältnis unter etwa 1 zeigt das Vorherrschen
von Liposomen im RES an. Für die meisten Lipidzusamensetzungen von
Interesse wurden Blut/RES-Verhältnisse 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden nach der
Injektion berechnet.
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Die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen ein Vesikel-bildendes
Lipid, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, wie es in
Abschnitt 1 beschrieben ist. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wurde
festgestellt, daß die Halbwertszeiten der Zirkulation im Blut dieser Liposomen
zum großen Teil unabhängig vom Grad der Sättigung der
Phospholipidkomponenten, die die Liposomen bilden, sind. Dies bedeutet, daß die
Phospholipidkomponenten vorwiegend aus fluiden, relativ ungesättigten Acylketten
oder aus stärker gesättigten, versteifenden Acylkettenkomponenten
bestehen können. Dieses Merkmal der Erfindung ist in Beispiel 6 ersichtlich,
bei dem Blut/RES-Verhältnisse von Liposomen, die mit PEG-PE, Cholesterin
und PC mit variierenden Sättigungsgraden gebildet werden, untersucht
werden (Tabelle 4). Wie aus den Daten in Tabelle 5 in diesem Beispiel
ersichtlich ist, wurden hohe Blut/RES-Verhältnisse bei im wesentlichen
allen Liposomenformulierungen erzielt, und zwar unabhängig vom Ausmaß der
Lipidsättigung im PC-Phospholipid, und es wurde kein systematischer Trend
als eine Funktion des Grads der Lipidsättigung beobachtet.
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Dementsprechend können die Vesikel-bildenden Lipide gewählt werden,
um einen gewählten Grad der Fluidität oder Steifheit zu erzielen, um die
Stabilität der Liposomen im Serum zu steuern und um die Geschwindigkeit
der Freisetzung von eingeschlossenem Arzneistoff aus den Liposomen in den
Blutstrom und/oder infizierte Bereiche zu steuern. Die Vesikel-bildenden
Lipide können hinsichtlich der Lipidsättigungseigenschaften auch so
gewählt werden, daß günstige Liposomenherstellungseigenschaften erzielt
werden. Es ist im allgemeinen der Fall, daß z. B. stärker fluide Lipide
leichter zu formulieren und durch Extrusions- und
Homogenisierungsverfahren hinsichtlich der Größe zu verringern sind als steifere
Lipidzusammensetzungen.
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Entsprechend wurde festgestellt, daß der Prozentsatz an Cholesterin
in den Liposomen über einen weiten Bereich ohne signifikante Wirkung auf
die beobachteten Blut/RES-Verhältnisse variiert werden kann. Die in
Beispiel 7A vorgelegten Untersuchungen zeigen mit Bezug auf die dort
vorgelegte Tabelle 6 praktisch keine Änderung der Blut/RES-Verhältnisse im
Bereich von Cholesterin zwischen 0 bis 30 Mol-%. Andererseits kann der
Cholesteringehalt die Kinetik der Arzneistoffverteilung an das infizierte
Gewebe beeinflussen, wie es in den Figg. 18A und 18B erläutert wird.
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Bei Studien, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden,
wurde auch festgestellt, daß Blut/RES-Verhältnisse relativ unbeeinflußt
vom Vorhandensein von geladenen Lipidkomponenten, wie
Phosphatidylglycerin (PG), sind. Dies ist aus Fig. 7 ersichtlich, in der der prozentuale
Verlust von eingeschlossenem Marker für PET-PE-Liposomen, die 4,7 Mol-%
PG (Dreiecke) oder 14 Mol-% PG (Kreise) enthielten, graphisch auftragen
ist. Es wurde praktisch kein Unterschied in der Liposornenretention im
Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden beobachtet. Die
Möglichkeit, daß die Liposomen negative Ladung umfassen können, ohne daß die
RES-Aufnahme verstärkt wird, sorgt für eine Reihe möglicher Vorteile.
Liposomensuspensionen, die negative Ladung enthalten, sind weniger anfällig
für eine Aggregation in Puffern mit hoher lonenstärke, und daher ist die
physikalische Stabilität verstärkt. Außerdem kann die negative Ladung,
die in der Liposomenmembran vorhanden ist, als Formulierungswerkzeug zur
wirksamen Bindung großer Mengen an kationischen Arzneistoffen verwendet
werden.
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Das Vesikel-bildende Lipid, das mit einem biokompatiblen,
hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, ist auch in der liposomalen
Zusammensetzung vorhanden. Die Menge an derartigem derivatisiertem hydrophilem
Polymerem liegt vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 20 Mol-%, bezogen auf die
Molzahl an derivatisiertem Lipid als Prozentsatz der Gesamtmolzahl an
Vesikel-bildenden Lipiden. Diese bevorzugten Molverhältnisse sind
insbesondere auf Lipide anwendbar, die mit PEG mit Molekulargewichten zwischen
etwa 1000 bis 5000 Dalton derivatisiert sind. Es ist darauf hinzuweisen,
daß ein geringeres Molverhältnis, wie weniger als 1 Mol-%, für ein
Lipidderivat mit einem hochmolekularen Polymeren geeignet sein kann und daß
eine derartige Zusammensetzung wirksam hinsichtlich der Erzielung einer
signifikant erhöhten Zirkulationszeit der Liposomen im Blut sein kann,
wenn das hydrophile Polymere, z. B. PEG, ein vergleichsweise hohes
Molekulargewicht, z. B. größer als etwa 1000 bis 5000 Dalton, aufweist.
Umgekehrt ist ein höheres Molverhältnis für ein Lipidderivat mit einem
niedermolekularen Polymeren, wie einem PEG mit einem Molekulargewicht von
350 Dalton, wirksam. Eine derartige Zusammensetzung kann auch wirksam bei
der Erzielung einer signifikant erhöhten Zirkulationszeit von Liposomen
im Blut sein. Dies wird in Fig. 9 erläutert, die die Zirkulationszeit in
Blut für Liposomen zeigt, die aus PEG mit Molekulargewichten von 350 und
750 bei molaren Verhältnissen von 33% in Liposomenzusammensetzungen
gebildet wurden. Wie ersichtlich ist, zeigten beide Zusammensetzungen
verlängerte Blutzirkulationszeiten, die für die vorliegende Erfindung
charakteristisch sind. Speziell verlängern derartige Zusammensetzungen die
Blutzirkulationszeit, die 24 Stunden nach der Injektion der Liposomen
gemessen wird, um mindestens ein Mehrfaches gegenüber der, die mit
Liposomen erzielbar ist, denen derivatisierte hydrophile Polymere fehlen.
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Wie in Abschnitt I angegeben wurde, weist das hydrophile Polymere im
derivatisierten Lipid vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 200
und 20 000 Dalton und insbesondere zwischen etwa 300 und 5000 Dalton auf.
Beispiel 7B, bei dem die Wirkung von sehr kurzen Ethoxyethergruppen auf
Blut/RES-Verhältnisse untersucht wurde, zeigt, daß Polyethergruppen
größer als etwa 5 Kohlenstoffether erforderlich sind, um eine signifikante
Erhöhung der Blut/RES-Verhältnisse zu erzielen.
B. Herstellung der Liposomenzusammensetzung
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Die Liposomen können nach einer Reihe von Techniken hergestellt
werden, wie denen, die ausführlich von Szoka et al., 1980, angegeben werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von Arzneistoff enthaltenden Liposomen
besteht im Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, das von Szoka et al. und im
US-Patent 4 235 871 beschrieben wird. Die
Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (REVS) weisen typischerweise mittlere Größen zwischen etwa 2 und 4 µm
auf und sind vorwiegend oligolamellar, d. h. sie enthalten eine oder
einige Lipiddoppelschichtschalen. Das Verfahren wird ausführlich in
Beispiel 4A erläutert.
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Multilamellare Vesikel (MLVs) können durch einfache
Lipidfilm-Hydratisierungstechniken hergestellt werden. Bei diesen Verfahren wird ein
Gemisch von Liposomen-bildenden Lipiden der vorstehend ausführlich
angegebenen Art, das in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist,
in einem Gefäß unter Bildung eines dünnen Films eingedampft, der dann mit
einem wäßrigen Medium bedeckt wird, wie es ausführlich in Beispiel 4B
beschrieben wird. Der Lipidfilm wird unter Bildung von MLVs, typischerweise
mit Größen zwischen etwa 0,1 bis 10 µm, hydratisiert.
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Gemäß einem weiteren wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung
werden die Liposomen so hergestellt, daß sie im wesentlichen homogene
Größen von weniger als etwa 0,2 µm aufweisen. Insbesondere wurde
festgestellt, daß Liposomen in diesem Größenbereich ohne weiteres zu einer
Extravasation in infizierte Bereiche imstande sind, wie es im nachstehenden
Abschnitt III erläutert wird, daß sie gleichzeitig imstande sind, eine
erhebliche Arzneimittelmenge zu dem infizierten Bereich zu tragen, und
daß sie filtersterilisiert werden können. Kleine unilamellare Vesikel von
weniger als 0,07 µm sind zwar leicht zu einer Extravasation in infizierte
Bereiche imstande; ihr Arzneistoffbeladungsvermögen ist jedoch stark
beschränkt. Das obere Ende dieses bevorzugten Größenbereiches (0,1 µm) ist
nicht notwendigerweise die größte Größe von Liposomen, die zur
Extravasation imstande sind, sondern ist vielmehr die obere Grenze der Größe von
Liposomen, die herkömmlicherweise vor der Verabreichung
filtersterilisiert werden können. Es ist darauf hinzuweisen, daß bei Berücksichtigung
von Einstellungen bei pharmazeutischen Formulierungsverfahren liposomale
Zusammensetzungen oberhalb oder unterhalb dieses Größenbereiches wirksam
bei der Abgabe von Arzneistoffen an infizierte Bereiche sein können.
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Ein wirksames Verfahren zur Einstellung der Größe von REVs und MLVs
beinhaltet das Extrudieren einer wäßrigen Suspension der Liposomen durch
eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit einer ausgewählten
gleichförmigen Porengröße im Bereich von 0,03 bis 0,2 µm und typischerweise 0,05,
0,08, 0,1 oder 0,2 µm. Die Porengröße der Membran entspricht grob der
größten Größe der Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran
hergestellt werden, insbesondere wenn das Präparat zweimal oder öfter durch
die gleiche Membran extrudiert wird. Dieses Verfahren zur
Größeneinstellung von Liposomen wird bei der Herstellung von REV- und
MLV-Zusammensetzungen mit homogener Größe herangezogen, die in den nachstehenden
Beispielen beschrieben werden. Ein neueres Verfahren beinhaltet die
Extrusion durch einen asymmetrischen keramischen Filter. Dieses Verfahren wird
ausführlich im US-Patent 4 737 323 (Liposome Extrusion, erteilt am 12.
April 1988) beschrieben. Homogenisierungsverfahren eignen sich auch für
die Verringerung der Größe von Liposomen auf Größen von 100 nm oder
weniger (Martin).
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Weitere Verfahren zur Verringerung der Teilchengröße umfassen die
Anwendung hoher Drucke auf die Liposomen, wie in einer French Press, und
die Homogenisierung der Liposornen. In Versuchen, die zur Stützung der
vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde die Hochdruckextrusion
allgemein zur Steuerung der Teilchengröße angewandt.
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Homogenisierungstechniken können bis zu einem gewissen Grad durch
das Vorhandensein von Schaum in der liposomalen Suspension beschränkt
sein, wobei festgestellt wurde, daß die Bildung von Schaum in einem
größeren Ausmaß bei den liposomalen Gentamicin-Präparaten als bei den
Kontroll-Liposomen auftritt. In Versuchen, die zur Stützung der vorliegenden
Erfindung durchgeführt wurden, wurde festgestellt, daß das Vorhandensein
von großen Mengen an Schaum in der liposomalen Suspension zu einer
liposomalen Gentamicin-Zusammensetzung führte, die durch Teilchen mit einem
minimalen Durchmesser von etwa 200 nm charakterisiert war, die gegenüber
einer Membranextrusion beständig waren.
C. Beladung mit Verbindungen
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Das Einverleiben einer Verbindung in Liposomen kann nach einem oder
mehreren einer Reihe von aktiven und passiven Verfahren erfolgen. Diese
Verfahren und Charakteristiken der beispielhaften Verbindungen für die
Verwendung bei diesen Verfahren sind ausführlich in der am 15. Januar
1991 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Seriennumer 642 231, die
der gleichen Anmelderin gehört, beschrieben, die durch Verweis zum
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
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Eine passive Beladung durch Einschließen wird für bestimmte
antimikrobielle Mittel angewandt, insbesondere die, die therapeutisch aktiv bei
relativ geringen Arzneistoffdosen sind und/oder die hochgradig löslich in
wäßrigen Lösungen sind. Hier wird der Arzneistoff entweder in der
wäßrigen Phase, die zur Hydratisierung des Lipids verwendet wird, gelöst oder
mit den Lipiden beim Liposomen-Herstellungsverfahren eingeführt, und zwar
abhängig von der Löslichkeit der Verbindung.
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Beladung
mit antibiotischen Mitteln, wie dem Aminoglycosid Gentamicin, durch
passive Hydratisierung. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein
"Kuchen"-Hydratisierungsverfahren, das in Beispiel 12 beschrieben ist,
für das Einverleiben von relativ hohen Konzentrationen an Gentamicin in
die erfindungsgemäßen Liposomen bevorzugt ist. Bei diesem Verfahren wird
ein Lipid-"Kuchen" durch Lyophilisieren einer Lösung von Lipiden
gebildet. Der Kuchen wird dann mit einer wäßrigen Lösung, die den Arzneistoff,
der den Liposomen einverleibt werden soll, enthält, hydratisiert.
Versuche, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden und
bei denen das Kuchenhydratisierungsverfahren unter Verwendung von
Gentamicinsulfat-Konzentrationen von 20 bis 100 mg/ml und
Gesamtlipidkonzentrationen von 50 bis 300 µMol/ml getestet wurde, ergaben praktische
Grenzen von ≤ 50 mg/ml für Gentamicin und ≤ 150 µMol/ml für Lipid. Oberhalb
dieser Konzentrationen wurden nicht-liposomale Teilchen gebildet. Dieses
Verfahren führte zur Einverleibung von 4 bis 50% Gentamicinsulfat vor der
Entfernung des freien Arzneistoffs (Beispiel 12, Tabelle 8).
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Entsprechend wurde gezeigt, daß die Hydratisierung eines
Lipidkuchens, der durch Lyophilisierung gebildet wurde, mit wäßrigem
Gentamicinchlorid zu liposomalen Gentamicin-Zusamensetzungen führte, die für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Liposomen, die
nach diesem Verfahren gebildet wurden, waren durch eine offensichtliche
Homogenität der Anfangsdispersion und eine einfache Extrusion
charakterisiert. Das Einverleiben von Arzneistoff lag im Bereich von 6 bis 24% vor
der Entfernung des freien Arzneistoffs aus den Proben (Beispiel 12,
Tabelle 11). Ferner zeigten Untersuchungen zur Stützung der vorliegenden
Erfindung, daß der Ersatz von Cholesterin durch Cholesterinsulfat in der
Liposomenlipidzusammensetzung bei Verwendung von Gentamicinchlorid als
Beladungsarzneistoff zu einem Anstieg der Arzneistoffbeladung vor der
Entfernung von nicht einverleibtem Arzneistoff führte (vgl. Proben 42A,
42B, 42C in Tabelle 11). Bei ähnlichen Versuchen wurde festgestellt, daß
das Weglassen von Cholesterin aus der Lipidzusammensetzung zu einer
Gentamicinsulfat-Beladung von 70 µg/µMol Lipid bei einem Einschluß von 83%
nach der Entfernung von freiem Arzneistoff führte.
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Weitere Faktoren, die möglicherweise die Beladung mit einer
Verbindung beeinflussen, wurden unter Einschluß des
Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses und der Teilchengröße in Versuchen, die zur Stützung der
vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, untersucht. Im allgemeinen führten
eine Zunahme der Teilchengröße oder des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses
während der Liposomenbildung zu einem Anstieg des schließlich erzielten
Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses (Tabelle 10).
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Nach der Liposomenbildung und der Größeneinstellung wird freier
(ungebundener) Arzneistoff durch ionenaustausch- oder
gelausschlußchromatographische Verfahren (beschrieben in Beispiel 12C) oder durch Dialyse
oder Diaflitration entfernt. Für liposomale Gentamicin-Formulierungen
zeigten Versuche zur Stützung der vorliegenden Erfindung, daß die
Entfernung von freiem Arzneistoff am wirksamsten und vollständigsten unter
Anwendung der Säulenchromatographie, z.B. über eine Sephadex
G-50-Größeneinstellungssäule, und anschließende Einengung erfolgt. Fig. 17 zeigt ein
Säulenprofil der Elution von [¹²&sup5;I]-Gentamicin enthaltenden Liposomen
unter Anwendung dieses Verfahrens. Wie aus den Tabellen 12 und 13
ersichtlich ist, fällt nach der Entfernung von nicht eingeschlossenem
Arzneistoff das Verhältnis von gebundenem Gentamicin zu Lipid in der
liposomalen Zusammensetzung erheblich ab, und zwar typischerweise auf etwa 20
µg/µMol für Gentamicinsulfat (Tabelle 12) und etwa 50 bis 70 µg/µMol für
Gentamicinchlorid (Tabelle 13). Die prozentuale Einverleibung von
Arzneistoff in Liposomen nach der Entfernung von freiem Arzneistoff liegt im
Bereich von 20 bis 98% für Gentamicinsulfat (Tabelle 12) und von 40 bis
85% für Gentamicinchlorid (Tabelle 13).
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Antibiotische liposomale Zusammensetzungen sind stabil bei Lagerung
bei gekühlten Temperaturen. Gentamicinsulfat enthaltende liposomale
Zusammensetzungen, die hergestellt wurden, wie es vorstehend beschrieben
wurde, wurden bei 8ºC gelagert und auf den Gentamicin-Gehalt im Verlauf
von 2 Wochen untersucht. Wie in Tabelle 15 gezeigt ist, wurde das nach
Reinigung mit G-50 Sephadex erzielte Arzneistoff-zu-Lipid-Verhältnis über
diese Zeitspanne im wesentlichen aufrechterhalten.
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Zusammenfassend lauten bevorzugte Bedingungen für das Einschließen
von Gentamicin in PEG enthaltende Liposomen wie folgt: Kuchen, die 1000
µMol Lipid enthalten, werden mit 2,5 ml Gentamicinsulfat (200 mg/ml) in
Wasser durch Schütteln für 1 Stunde hydratisiert. Die Suspension wird auf
10 ml mit isotoner Kochsalzlösung auf eine Arbeitskonzentration von 50
mg/ml Gentamicinsulfat und 100 µMol Lipid/ml verdünnt. Die Dispersionen
werden extrudiert, um einen gewünschten mittleren Teilchendurchmesser zu
erzielen, der vorzugsweise weniger als etwa 200 nm beträgt. Nicht
eingeschlossener Arzneistoff wird durch Gelchromatographie entfernt, und das
Gesamtvolumen wird durch Zentrifugation in einer
Centiprep-10-Konzentrationseinrichtung verringert.
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Wenn die antibiotische Verbindung einen Peptid- oder
Proteinarzneistoff, wie alpha-Interferon, umfaßt, dann werden die Liposomen
vorzugsweise nach dem Umkehrphasenverfahren, durch ein
Lösungsmittelinjektionssystem, wie es im US-Patent 4 752 425 beschrieben wird, oder durch
Rehydratisierung eines gefriergetrockneten Gemisches aus dem Protein und
einer Suspension von kleinen unilamellaren Vesikeln mit Wasser
hergestellt (Kirby). Beide Verfahren kombinieren die passive Beladung mit
einem vergleichsweise hohen Wirkungsgrad des Einschließens, z. B. einem
Wirkungsgrad von bis zu 50%. Nicht eingeschlossenes Material kann ohne
weiteres aus der Liposomensuspension, z. B. durch Dialyse, Diafiltration
oder Ausschlußchromatographie, entfernt werden.
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In einigen Fällen wurde festgestellt, daß es, um eine hohe
Konzentration an Arzneistoffen in Liposornen einzuschließen, günstig ist, aktive
Beladungsverfahren zu nutzen. Ein Verfahren zur aktiven Beladung mit
amphipathischen Arzneistoffen wird in der am 28. September 1988
eingereichten US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 413 037, die der gleichen
Anmelderin gehört, beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Liposomen in
Gegenwart einer vergleichsweise hohen Konzentration an Ammonlumsulfat
hergestellt. Nach der Einstellung der Liposomen auf die gewünschte Größe
wird die Liposomensuspension behandelt, um einen von innen nach außen
gerichteten Ammoniumionengradienten über die liposomalen Membranen zu
erzeugen. Der Gradient kann durch Dialyse oder Diafiltration gegen ein
Medium, das kein Amonium enthält, wie ein isotones Glucosemedium, oder
durch Gelfiltration, z. B. fiber eine Sephadex G-50-Säule, die mit 0,15 M
NaCl oder KCl äquilibriert ist, wobei das Ammoniumsulfat in der äußeren
Phase in wirksamer Weise durch Natrium- oder Kahumionen oder eine Nicht-
Elektrolyt-Spezies ersetzt wird, erzeugt werden. Alternativ dazu kann die
Liposomensuspension mit einer kein Ammonium enthaltenden Lösung verdünnt
werden, wobei die Konzentration an Ammoniumionen in der äußeren Phase
verringert wird. Die Ammoniumsulfatkonzentration im Innern der Liposomen
beträgt vorzugsweise mindestens das 10-fache und insbesondere mindestens
das 100- bis 1000-fache der Konzentration in der in bezug auf die
Liposomen äußeren Phase.
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Der Ammoniumsulfatgradient über die Liposomen erzeugt wiederum einen
chemischen Gradienten, was das Einfangen von nicht ionisierten Ammen,
die durch die Membran treten, erlaubt, wenn Ammoniak über die
Liposomenmembran freigesetzt wird, und die Arzneistoffe werden in der inneren
wäßrigen Phase der Liposomen protoniert und eingeschlossen. Um die Liposomen
mit dem gewählten Arzneistoff zu beladen, wird eine Suspension der
Liposomen, z. B. etwa 20 bis 200 mg/ml Lipid, mit einer wäßrigen Lösung des
Arzneistoffs gemischt, und man erlaubt eine Äquilibrierung des Gemisches
über eine Zeitspanne, z. B. mehrere Stunden, bei Temperaturen im Bereich
von Raumtemperatur bis 60ºC, und zwar abhängig von der
Phasenübergangstemperatur
der Lipide, die zur Bildung der Liposomen verwendet werden.
Bei einem typischen Verfahren wird eine Suspension von Liposomen mit
einer Lipidkonzentration von 50 µMol/ml mit einem gleichen Volumen an
amphipathischem Arzneistoff in einer Konzentration von etwa 5 bis 8 mg/ml
gemischt. Am Ende der Inkubationszeit wird die Suspension behandelt, um
freien (ungebundenen) Arzneistoff zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren
zur Entfernung von Arzneistoff ist für Arzneistoffe das Leiten über ein
Ionenaustauschharz, wie Dowex 50 WX-4, das zur Bindung des nicht
eingeschlossenen Arzneistoffs, nicht jedoch zur Bindung der den Arzneistoff
enthaltenden Liposomen imstande ist.
III. Liposomen-Lokalisierung in infizierten Bereichen
A. Ausgedehnte Halbwertszeit im Blutstrom
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Eine der Anforderungen für die erfindungsgemäße
Liposomenlokalisierung in infizierten Zielgeweben ist eine verlängere Halbwertszeit der
Liposomen im Blutstrorn nach der parenteralen Liposomenverabreichung. Ein
Maß für die Lebensdauer von Liposomen im Blutstrom ist das
Blut/RES-Verhältnis, das zu einem ausgewählten Zeitpunkt nach der
Liposomenverabreichung bestimmt wird, wie es vorstehend erörtert wurde.
Blut/RES-Verhältnisse fur eine Reihe von Liposomenzusamensetzungen sind in Tabelle 3 von
Beispiel 5 angegeben. In Abwesenheit von PEG-derivatisierten Lipiden
betrugen die Blut/RES-Verhältnisse 0,03 oder weniger. In Gegenwart von PEG-
derivatisierten Lipiden lagen die Blut/RES-Verhältnisse im Bereich von
0,2 für niedermolekulares PEG bis zwischen 1,7 und 4 für mehrere
Formulierungen, wobei eine der Formulierungen kein Cholesterin enthielt und
drei der Formulierungen kein zugegebenes geladenes Phospholipid (z. B.
PG) enthielten.
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Die in Tabelle 5 von Beispiel 6 vorgelegten Daten zeigen Blut/RES-
Verhältnisse (unter Ausschluß von zwei Punkten mit einer geringen
prozentualen Wiederfindung) zwischen etwa 1,26 und 3,27, was konsistent mit den
in Tabelle 3 angegebenen Daten ist. Wie im vorstehenden Abschnitt II
festgestellt wurde, sind die Halbwertszeiten im Blut im wesentlichen
unabhängig vom Sättigungsgrad der Liposomenlipide, vom Vorhandensein von
Cholesterin und vom Vorhandensein von geladenen Lipiden.
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Die Blut/RES-Werte, über die vorstehend berichtet wurde, können mit
Blut/RES-Werten verglichen werden, über die im US-Patent 4 920 016 der
gleichen Inhaberin berichtet wird, wobei Blut/RES-Meßverfahren angewandt
wurden, die denen ähnlich waren, die zur Erzeugung der in den Tabellen 3
und 5 vorgelegten Daten herangezogen wurden. Die besten
Blut/RES-Verhältnisse
über 24 Stunden, über die im vorstehend angegebenen Patent
berichtet wird, betragen 0,9 für eine Formulierung, die aus GM&sub1;, gesättigtem PC
und Cholesterin besteht. Die nächstbesten Formulierungen ergeben 24
Stunden-Blut/RES-Werte von etwa 0,5. Die typischen Blut/RES-Verhältnisse über
24 Stunden, die bei einer Anzahl der vorliegenden Formulierungen erzielt
wurden, waren also mehr als zweimal so hoch wie bei den besten
Formulierungen, über die bisher berichtet wurde. Ferner war die Möglichkeit, hohe
Blut/RES-Werte mit GM&sub1;- oder HPI-Lipiden zu erzielen, davon abhängig, daß
vorwiegend gesättigte Lipide und Cholesterin in den Liposomen vorhanden
waren.
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Die Plasma-Pharmakokinetik eines liposomalen Markers im Blutstrom
ergibt ein weiteres Maß für die erhöhte Lebenszeit der Liposomen, die für
die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen erzielt wird. Die
vorstehend erläuterten Figg. 7 und 8A zeigen den langsamen Verlust an
liposomalem Marker aus dem Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden bei
typischen PEG-Liposomenformulierungen, und zwar im wesentlichen unabhängig
davon, ob der Marker ein Lipid oder eine eingeschlossene wasserlösliche
Verbindung ist (Fig. 8A). In beiden graphischen Darstellungen beträgt die
Menge an liposomalem Marker, die 24 Stunden nach der Liposomeninjektion
vorhanden ist, mehr als 10% des ursprünglich injizierten Materials.
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Fig. 8B zeigt die Kinetik des Liposomenverlusts aus dem Blutstrom
für eine typische PEG-Liposomenformulierung und die gleichen Liposomen in
Abwesenheit eines PEG-derivatisierten Lipids. Nach 24 Stunden war der
prozentuale Anteil an PEG-Liposomen, die im Blut verblieben, größer als
etwa 20%, während die herkömmlichen Liposomen eine Retention von weniger
als 5% im Blut nach 3 Stunden und praktisch keinen nachweisbaren Marker
nach 24 Stunden zeigten. Fig. 9 zeigt die Kinetik des Liposomenverlusts
aus dem Blutstrom für eine niedermolekulare PEG-Liposomenformulierung
unter Verwendung von DSPE, derivatisiert an PEG mit einem Molekulargewicht
von 350 (350 PEG, leere Dreiecke) oder 750 (750 PEG, ausgefüllte
Dreiecke). Diese Formulierungen zeigten Blutretentionszeiten ähnlich denen,
die für Liposomen beobachtet wurden, die unter Verwendung von
höhermolekularem PEG (typischerweise 1000 bis 5000 Dalton) formuliert wurden.
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Entsprechend zeigen Liposomen, die PLA- oder PGA-derivatisiertes PE
oder PVA-derivatisiertes DSPE enthalten, eine Plasmakinetik, die
herkömmlichen Liposomen, die aus PG, PC und Cholesterin bestehen, überlegen ist
(Figg. 10A und 10B), da die Liposomen, die derivatisiertes PE oder DSPE
enthalten, aus dem Blutstrom mit einer Geschwindigkeit entfernt werden,
die um ein Mehrfaches geringer ist als bei Formulierungen ohne
derivatisiertes PE oder DSPE.
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Die in den Figg. 7 bis 10 dargestellten Ergebnisse sind konsistent
mit den 24 Stunden-Blut-Liposomenwerten, die für eine Reihe von
Liposomenformulierungen gemessen wurden und über die in den Tabellen 3 und 5
bis 7 der nachstehenden Beispiele 5 bis 8 berichtet wird. Wie aus Tabelle
3 von Beispiel 5 ersichtlich ist, betrug die nach 24 Stunden verbleibende
Dosis weniger als 1% bei herkömmlichen Liposomen, gegenüber mindestens 5%
bei PEG-Liposomen. Bei den besten Formulierungen wurden Werte zwischen
etwa 20 bis 40% erzielt. Ähnlich lagen in Tabelle 5 von Beispiel 6 die
Liposomenkonzentrationen im Blut nach 24 Stunden (erneut unter
Vernachlässigung von zwei Einträgen mit geringen Wiederfindungswerten) zwischen
12 und etwa 25% der gesamten gegebenen Dosis. Über ähnliche Ergebnisse
wird in den Tabellen 6 und 7 von Beispiel 7 berichtet.
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Sowohl fur die Blut/RES-Werte als auch fur die
Liposomenretentionszeit im Blutstrom können die aus einem Tiermodellsystem erhaltenen Daten
vernünftig auf Menschen und Haustiere von Interesse übertragen werden.
Dies hat seinen Grund darin, daß festgestellt wurde, daß die Aufnahme von
Liposomen durch die fixierten Makrophagen von Leber und Milz mit
ähnlichen Geschwindigkeiten bei mehreren Säugerspezies unter Einschluß von
Maus, Ratte, Affe und Mensch auftritt (Gregoriadis, 1974; Jonah;
Kimelberg, 1976; Juliano; Richardson; Lopez-Berestein). Dieses Ergebnis
spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wider, daß die biochemischen Faktoren,
die die größte Bedeutung für die Liposomenaufnahme durch das RES
haben - unter Einschluß der Optimierung durch Serumlipoproteine, größenabhängige
Aufnahmeeffekte und der Zellabschirmung durch Oberflächengruppen -
gemeinsame Merkmale aller Säugerspezies sind, die untersucht wurden.
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Ein Vergleich der erfindungsgemäßen PEG enthaltenden Liposomen mit
herkömmlichen Liposomenpräparaten zeigt, daß ein wünschenswertes Merkmal
der antimikrobiellen Therapie, nämlich die Verlängerung der Blutspiegel
von Arzneistoff tragenden Liposomen auf zwei oder mehr Tage, um für eine
erhöhte und andauernde Anreicherung an den Zielstellen zu sorgen, durch
herkömmliche liposomale Präparate nicht erzielt wurde, jedoch mit den mit
hydrophilen Polymeren derivatisierten liposomalen Formulierungen der
Erfindung, wofür PEG-, PGA-, PLA- und PVA-derivatisierte liposomale
Formulierungen Beispiele sind, erzielt wird (Figg. 8B, 9, 10A und 10B).
B. Extravasation in infizierte Gewebe
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Ein weiteres erforderliches Merkmal für erfindungsgemäße hochaktive
Liposomen, die auf einen infizierten Bereich zielen, ist die
Liposomenextravasation in den Bereich durch die endotheliale Zellbarriere und die
darunter befindliche Basismembran, die eine Kapillare von den
Gewebezellen, die von der Kapillare versorgt werden, trennt. Liposomen mit Größen
von weniger als etwa 0,2 µm zeigen diese Fähigkeit zur Extravasation in
infizierte Bereiche. Es ist zwar zu erwarten, daß Liposomen mit einer
Größe von weniger als 0,07 µm ebenfalls eine Extravasation zeigen; das
begrenzte Arzneistofftragevermögen dieser kleinen Liposomen macht sie
jedoch weniger wirksam als Arzneistoffträger für das vorliegende System.
Entsprechend können auch Liposomen mit einer Größe von mehr als 0,2 µm
eine Extravasation in infizierte Bereiche zeigen; wie jedoch in Abschnitt
II angegeben wurde, können derartige Liposomen nicht ohne weiteres nach
der Hydratisierung bei der herkömmlichen pharmazeutischen Herstellung
filtersterilisiert werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist
der optimale Größenbereich der Liposomen ein Kompromiß zwischen der
Fähigkeit zur Extravasation, dem Arzneistofftragevermögen und der
Einfachheit der Sterilfiltration, was zu einem Durchmesser von weniger als etwa
0,2 µm führt.
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Daß eine Liposomenabgabe an den infizierten Bereich erforderlich
ist, um den Arzneistoff selektiv ans Ziel zu bringen, ist aus Versuchen
ersichtlich, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt
wurden und bei denen ungefähr 10&sup5; CFU Klebsiella pneumoniae in die linke
Lunge von Ratten durch Intubation verabreicht wurden, wie es ausführlich
in Beispiel 11 angegeben ist. Innerhalb von 3 bis 4 Tagen stieg die
Bakterienzahl in der linken Lunge auf bis zu 2×10¹&sup0;, und Bakterien waren im
Blutstrom vorhanden. Die Schwere der Infektion, die durch die
Bakterienzahl bewertet wurde, war begleitet von einem proportionalen Anstieg des
Gewichts der infizierten linken Lunge von 0,5 g bis auf 2 g und
makroskopischen Zeichen einer Infektion. Lungenläsionen waren durch Ödeme
(Flüssigkeitsanreicherung und Gewichtszunahme), eine große Anzahl an
gramnegativen Bacilli und einem zellulären Infiltrat, das aus
polymorphonuclearen Leukozyten und Makrophagen bestand, charakterisiert. Es wurden
zwar auch Bakterien in der rechten (nicht infizierten) Lunge in einer
Zahl im Bereich von 10 bis 10&sup9; pro Lunge festgestellt; ihr Vorhandensein
war jedoch nicht von einer ödematösen Massenzunahme oder den
histologischen Markern, die vorstehend beschrieben wurden, begleitet.
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Drei Tage nach der Inokulation mit den Bakterien wurden
PEG-derivatisierte Liposomen mit einem Zusammensetzungsverhältnis von PEG-DSPE:
HSPC:CHO = 0,15:1,85:1, die mit &sup6;&sup7;Ga beladen waren, wie es in Beispiel 4
beschrieben ist, den infizierten Ratten injiziert. Die Tiere wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Liposomeninjektion getötet, und die
Aufnahme der Liposomen durch die Lungen und andere Gewebe wurde durch
Messung der Menge der damit verbundenen Radioaktivität durch
gamma-Scintigraphie bestimmt. Bei nicht infizierten Tieren riefen PEG enthaltende
Liposomen die übliche verringerte MPS-Aufnahme (Leber und Milz) hervor
und verblieben für längere Zeiten im Blut, und zwar in Übereinstimmung
mit früheren Ergebnissen (Woodle et al., 1990 und 1991; Papahadjopulos et
al., 1991). Bei nicht infizierten Tieren war die verlängerte
Blutzirkulation nicht verändert, wie durch die graphische Darstellung, die in Fig.
11 gezeigt ist, veranschaulicht wird, in der ersichtlich ist, daß die
Liposomenanreicherung in Leber (ausgefüllte Dreiecke) und Milz (ausgefüllte
Quadrate) weniger als 20% bzw. 10% der injizierten Dosis über die
Beobachtungszeit (40 Stunden) betrug und daß diese Werte deutlich unterhalb
der Werte, die im Blut während des größten Teils der Beobachtungszeit und
insbesondere während der ersten 24 Stunden nach der Injektion
aufrechterhalten wurden, lagen.
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Fig. 12 zeigt die Aufnahrnekinetik von ¹&sup9;&sup0;&sup0;PEG-PE enthaltenden 90 nm-
Liposomen durch die linke (infizierte) und rechte (nicht infizierte)
Lunge von Ratten über eine Zeitspanne von 40 Stunden nach der Injektion
der Liposomen, wie es ausführlich in Beispiel 13 beschrieben wird.
Entsprechend zeigt Fig. 13 die Aufnahmekinetik von 150 nm-Liposomen.
Blutkonzentrationen der Liposomen sind in den Figuren ebenfalls graphisch
dargestellt. Die PEG enthaltenden 90 nm- und 150 nm-Liposomen
zirkulierten im Blutstrom für längere Zeitspannen, was Blutkonzentrationen von
über 20% der injizierten Dosis 24 Stunden nach der Injektion und
annähernd 10% der injizierten Dosis 40 Stunden nach der Injektion ergab.
Außerdem werden beide Größen von Liposomen selektiv im infizierten
Lungengewebe angereichert. Die Konzentration in der rechten Lunge von
infizierten Tieren ist typischerweise die Lungenanreicherung in nicht
infizierten Tieren. Die Anreicherung in der linken Lunge zeigt ein Maximum
nach 16 Stunden, das für mindestens weitere 16 Stunden aufrechterhalten
wird. Nach 48 Stunden wurden 6% der injizierten Dosis an 90 nm-Liposomen
in der infizierten Lunge gefunden, während nur weniger als 0,5% der
injizierten
Dosis in der nicht infizierten Lunge gefunden wurden (Fig. 12).
Ähnliche Trends wurden für die 150 nm-Liposomen beobachtet (Fig. 13).
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Eine Korrelation zwischen dem Lungengewicht (als Indikator für Ödeme
und für die Schwere der Infektion, was durch histologische Untersuchung
bestätigt wurde) und liposomaler Aufnahme wurde in dem vorstehend
beschriebenen Ratten-Infektionsmodell ebenfalls bestätigt. Fig. 14 zeigt
eine graphische Auftragung von Lungengewicht gegen liposomale
Lipidanreicherung pro Gewebevolurnen zum Zeitpunkt 48 Stunden für Gewebe der linken
(infizierten) und rechten (nicht infizierten) Lunge in einer großen
Anzahl von Ratten, denen &sup6;&sup7;Ga-markierte 90 nm-Liposomen injiziert wurden.
Ein Vergleich der Anreicherung in der infizierten linken Lunge im
Vergleich mit der Anreicherung in der nicht infizierten rechten Lunge zeigt
eine Korrelation der liposomalen Aufnahme an der Stelle der Infektion
(linke Lunge) mit dem Lungengewicht (Fig. 14; lineare Regression: r=0,92,
p(0,01). Bis zu 9% der Liposomenmarkierung wurde angereichert in der
infizierten Lunge gefunden. Bezogen auf das Lipid variierte die Menge der
Anreicherung von etwa 0,25 bis 1,3 µM Lipid/g Lunge (oder etwa 0,1 bis
1,4 µM Lipid/Lunge). Im Gegensatz zur infizierten linken Lunge wurde
keine Korrelation zwischen dem Lungengewicht und der
Liposomenanreicherung in der nicht infizierten rechten Lunge beobachtet (Fig. 14).
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Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß PEG-DSPE enthaltende
Liposomen selektiv in infizierten Lungen im Vergleich zu herkömmlichen PG-PC-
Cholesterin-Liposomenformulierungen angereichert werden. Es wird
beobachtet, daß diese selektive Anreicherung von PEG-DPSE enthaltenden Liposomen
etwa 20-fach höher ist als die, die bei herkömmlichen (PEG:PC:Chol)
Liposomen beobachtet wird (Fig. 15A). Im Unterschied dazu wurde eine HPI
enthaltende liposomale Formulierung, von der berichtet wurde, daß sie für
eine ausgedehnte Zirkulationszeit sorgt, auf die Fähigkeit zur selektiven
Anreicherung in infiziertem Lungengewebe untersucht. Wie in Fig. 15B
gezeigt ist, werden derartige Liposomen bis zu einer Konzentration von nur
etwa 2- bis 3-fach höher als der von herkömmlichen Liposomen
angereichert. In diesen Untersuchungen ist außerdem ersichtlich, daß, im
Vergleich mit den HPI enthaltenden Liposomen, die Verabreichung von
erfindungsgemäßen PEG-DSPE enthaltenden Liposomen zu einer ungefähr 10-fach
höheren Konzentration der Lipidanreicherung in der infizierten Lunge
führt (Figg. 15A und 15B, wobei die Einheiten auf der Ordinate zu
beachten sind). Werden diese Daten als Aufnahme pro Gramm Lungengewebe
ausgedrückt, wie es in den Figg. 16A und 16B gezeigt ist, so erlaubt dies die
Feststellung, ob die Anreicherung, die auftritt, einfach eine feste
Konzentration in der Lunge ist, die aufgrund der Vergrößerung der Lunge
(Ödem) ansteigt, oder ob es einen Nettoanstieg der Anreicherung pro Gramm
Lungengewebe gibt. Diese Analyse zeigt, daß die Konzentration an PEG
enthaltenden Liposomen, die pro Gramm Lungengewebe angereichert werden, von
grob 0,25 auf mindestens 0,75 µM/g steigt, wenn die Schwere der
Infektion, die durch den Grad des Ödems bestimmt wird, ansteigt (Fig. 16A). Im
Gegensatz dazu reicherte sich die liposomale Formulierung, die HPI
anstelle der mit dem hydrophilen Polymeren derivatisierten Lipide enthält,
im infizierten Gewebe bis zu einer maximalen mittleren Konzentration von
etwa 0,075 µM/g an.
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Figg. 18A und 18B zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen, bei
denen liposomales und nicht-liposomales Gentamicinsulfat getrennt an
Ratten, die zuvor einer pulmonaren Infektion mit K. pneumoniae unterzogen
wurden, verabreicht wurden. Die Anreicherung von Gentamicin in der
infizierten Lunge wurde gemessen, wie in Beispiel 15 beschrieben ist. Die
verabreichte Dosis von nicht-liposomalem Gentamicin (15 mg/kg) war etwa
8-fach höher als die Dosis des verabreichten liposomalen Gentamicins (1,9
mg/kg). Dennoch war, wie aus Fig. 18A ersichtlich ist, die Anreicherung
von Gentamicin in den Lungen von Tieren, denen die liposomalen
Formulierungen gegeben wurden, im allgemeinen äquivalent oder höher als die
Anreicherung von Gentamicin in den Lungen von Tieren, denen die höhere
Dosis der nicht-liposomalen Formulierung über den größten Teil der
überwachten Zeit gegeben wurde. Die gleichen Daten, ausgedrückt als
Prozentsatz der injizierten Dosis, sind in Fig. 18B gezeigt, aus der ersichtlich
ist, daß die liposornale Formulierung einen höheren Prozentsatz der
injizierten Verbindung an der Stelle der Infektion abgibt.
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Die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen liposomalen
Zusammensetzungen wurde in Versuchen, die ausführliche in Beispiel 16
beschrieben sind, gezeigt. Hier wurden Ratten in der Lunge mit K.
pneumoniae infiziert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. 24 Stunden später
wurden den Ratten liposomale und nicht-liposomale Zusammensetzungen von
Gentamicinsulfat, die radioaktiv markiertes Gentamicin als Marker
enthielten, verabreicht. Proben wurden aus den Rattenlungen zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Injektion entnommen, wie es angegeben ist, und auf
bakteriellen Platten unter Anwendung von Standardverfahren kultiviert.
Tabelle 16 faßt die Ergebnisse der Kulturen zusammen, wobei die Daten als
log-Werte der koloniebildenden Einheiten (CFU), die für die Proben
infizierter
Lungen erhalten wurden, ausgedrückt sind. Im Vergleich mit der
Verabreichung einer vergleichbaren Dosis (1,9 mg/kg) an freiem Gentamicin
(ganz rechte Spalte) führte die Verabreichung einer liposomalen
Zusammensetzung (PEG:PC:CH) von Gentamicinsulfat zu einer 3-log-Verringerung
(1000-fach) des CFU-Werts (Fig. 19).
IV. Verfahren zur Lokalisierung von liposomalen antimikrobiellen
Formulierungen in infizierten Bereichen
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Wie vorstehend ausführliche beschrieben wurde, sind die
erfindungsgemäßen Liposomen wirksam bei der Lokalisierung und Konzentration eines
eingeschlossenen antimikrobiellen Arzneistoffs oder eines Arzneistoffs
gegen Infektionen speziell in einem infizierten Bereich. Die
Liposomenzusammensetzungen weisen vorzugsweise ein relativ hohes
Arzneistofftragevermögen und einen minimalen Verlust an eingeschlossenem Arzneistoff
während der Zeit, die erforderlich ist, damit die Liposomen sich verteilen
und in den infizierten Bereich eindringen (die ersten 24 bis 48 Stunden
nach der Injektion), auf. Die Liposomen sorgen also für ein wirksames
Verfahren zur Konzentration einer in Liposomen eingeschlossenen
therapeutischen Verbindung in einem infizierten Bereich. Erfindungsgemäß wird die
antimikrobielle Verbindung in derartigen Liposornen eingeschlossen, und
die liposomale Formulierung wird parenteral an ein Individuum,
vorzugsweise direkt in den Blutstrom, verabreicht.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine infizierte
Stelle oder ein infizierter Bereich als eine Stelle oder ein Bereich
definiert, der anatomisch an einer Stelle außerhalb des Blutstroms
vorhanden ist, jedoch zu einem Kapillarbett benachbart und davon aus zugänglich
ist. Infizierte Bereiche, die einer Behandlung nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren am besten zugänglich sind, sind durch einen akuten Anstieg der
Durchlässigkeit des Gefäßsystems im Bereich der Infektion, gefolgt von
einer Wanderung von Neutrophilen aus dem Blutstrom in den infizierten
Bereich, charakterisiert. In diesem Fall muß eine IV-injizierte
Liposomenantimikrobielle Zusammensetzung, damit sie die infizierte Stelle
erreicht, den Blutstrom verlassen und in den infizierten Bereich eintreten.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße
Verfahren zur Behandlung einer Infektion durch Lokalisierung eines
antimikrobiellen Mittels selektiv in dem infizierten Bereich angewandt. Bei
Untersuchungen, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden, wurde
Gentamicinsulfat in erfindungsgemäße, PEG enthaltende Liposomen geladen,
wie es ausführlich in Beispiel 12 angegeben ist. Das antimikrobielle
Mittel,
das einen Teil der erfindungsgemäßen liposomalen Zusammensetzung
bildet, ist eine beliebige Verbindung unter Einschluß der nachstehend
angegebenen Verbindungen, die stabil in Liposomen bei einem geeigneten
Beladungsfaktor eingeschlossen werden kann und die dadurch verabreicht
werden kann, so daß eine therapeutisch wirksame Konzentration im infizierten
Bereich erzielt wird.
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Die Dosis der injizierten Liposomen, die erforderlich ist, um für
eine therapeutisch wirksame Konzentration des Mittels an der Stelle der
Infektion zu sorgen, kann recht genau durch Messung der prozentualen
Anreicherung derartiger Liposomen in dem relevanten infizierten Bereich in
einem geeigneten Tiermodell, wie es vorstehend beschrieben wurde, der
Menge an Arzneistoff, die in die liposornale Zusammensetzung geladen
wurde, und der minimalen Konzentration der Verbindung, die wirksam zur
Hemmung oder Auslöschung des fraglichen infektiösen Agens ist (minimale
Hemmkonzentration, MIC), bestimmt werden. Zum Beispiel ist im Fall der
Gentamicin-Behandlung einer Klebsiella-Infektion, die vorstehend
erläutert wurde, ein MIC-Wert von Gentamicin von etwa 1 µg/ml an der
Lungenstelle für eine Behandlung einer mäßig infizierten Rattenlunge
erforderlich. Die Dosis an Liposomen, die erforderlich ist, um für eine derartige
Konzentration in der Lunge zu sorgen, kann auf der Basis der bekannten
Menge an eingeschlossenem Arzneistoff pro Masse an liposomalem Lipid und
den vorstehend erwähnten Liposomen/Arzneistoff-Verteilungsstudien
berechnet werden. Auf der Basis von empirischen sowie veröffentlichten Daten
für Standard-Antibiotikabehandlungen können ähnliche Berechnungen unter
Verwendung von veröffentlichten Referenzstandarddosierungen für eine
Reihe von antimikrobiellen therapeutischen Verbindungen durchgeführt
werden (Gilman).
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Allgemeine Klassen von antimikrobiellen Mitteln, die zur Behandlung
von inneren mikrobiellen Infektionen verwendet werden, umfassen
antibakterielle, antivirale und fungizide Mittel. Zusätzlich wird in Betracht
gezogen, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Abgabe einer
antiparasitären Verbindung, die sich für die Behandlung bestimmter Protozoen- und
Helmintheninfektionen eignet, angewandt werden kann, wenn derartige
Infektionen in einem Anstieg der Kapillarenpermeabilität im infizierten
Bereich begleitet sind.
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Antibakterielle Mittel, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können, umfassen Penicillin-Antibiotika, Cephalosporin-
Antibiotika, Aminoglycosid-Antibiotika, Tetracycl in-Antibiotika,
Sulfonamid-Antibiotika,
Sulfon-Antibiotika, Macrolid-Antibiotika, Chinolon-
Antibiotika, Imipenem, Isoniazid, Ethambutol, Aztreonam, Chloramphenicol,
Erythromycin, Clindamycin, Spectinomycin, Vancomycin, Rifampin,
Clofazimin, Bacitracin, Methenamin und Nitrofurantoin. Antivirale Mittel
umfassen Nucleosidanaloga (Zidovudine, Acyclovir, Gangcyclovir, Vidarabin,
Idoxuridin, Trifluridin, Ribavirin), Foscarnet, Amantadin und Rimantadin.
Die Liposomen können auch antimikrobielle therapeutische oder
imunmodulierende Peptid- und Proteinarzneistoffe, wie α-Interferone, die sich für
eine ergänzende antivirale Therapie eignen, enthalten. Derartige Mittel
können in den Liposomen allein oder in Kombination mit weiteren Mitteln
vorhanden sein. Fungizide Mittel umfassen Amphotericin B, Flucytosin,
Imidazole und Triazole sowie Griseofulvin. Liposomale Formulierungen, die
geeignete Kombinationen derartiger antirnikrobieller Mittel enthalten,
werden ebenfalls in Betracht gezogen, um Infektionen zu behandeln, bei
denen üblicherweise eine Kombinationstherapie verschrieben wird.
-
Eine verringerte Toxizität kann zwar zu einer erhöhten Wirksamkeit
des erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens beitragen; die selektive
Lokalisierung des Arzneistoffs durch liposomale Extravasation ist jedoch
ebenfalls wichtig für eine verbesserte Arzneistoffwirksamkeit. Indem also
die Verabreichung höherer Konzentrationen an Arzneistoff aufgrund der
verringerten Arzneistofftoxizität in Liposomen und der selektiven
Liposomenlokalisierung in der interzellulären Flüssigkeit des infizierten
Bereiches ermöglicht wird, sorgt das erfindungsgemäße
Arzneistoffabgabe- und Behandlungsverfahren für eine bessere Wirksamkeit.
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Es ist darauf hinzuweisen, daß die Fähigkeit, eine Verbindung
selektiv in einem infizierten Bereich durch Liposomenextravasation zu
lokalisieren, auch für die nicht-invasive Diagnose und Lokalisierung von
infizierenden Mitteln genutzt werden kann. Dabei wird ein
Mikrobenbindungsmittel, typischerweise ein markierter Antikörper, in Liposomen
eingeschlossen, die dann IV an das untersuchte Individuum verabreicht werden.
Nach einer gewählten Zeitspanne von typischerweise 24 bis 48 Stunden wird
das Individuum überwacht, z. B. durch gamma-Scintillationsradiographie im
Fall eines radioaktiv markierten Antikörpers oder durch kernmagnetische
Resonanz (NMR) im Fall eines paramagnetischen Mittels, um Bereiche der
lokalen Aufnahme des bildgebenden Mittels nachzuweisen.
V. Verfahren zur Behandlung von infizierten Bereichen
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Erfindungsgemäß werden Liposomen, die ein derivatisiertes
biokompatibles hydrophiles Polymeres enthalten, das wirksam hinsichtlich einer
Verlängerung der Zirkulationszeit im Blut ist, verwendet, um
therapeutische Mittel, die geeignet zur Behandlung einer Reihe von lokalisierten
Infektionen oder systemischen Infektionen mit lokalisierten Herden im
Körper sind, einzuschließen. Wie vorstehend beschrieben wurde, sind
infizierte Bereiche oder Stellen, die einer Behandlung mit den
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zugänglich sind, vorzugsweise zum kapillaren
Blutstrom benachbart oder darüber zugänglich, und bei ihnen Tritt eine
erhöhte kapillare Durchlässigkeit als Reaktion auf eine Infektion auf.
Geeignete therapeutische Mittel für das Einschließen in Liposomen und für
die Verwendung gegen eine Reihe von Erkrankungen können mit Bezug auf
einen oder mehrere medizinische Standardtexte, wie Gilman, bestimmt
werden.
-
Hier werden verschiedene Zustände zusammengefaßt, die beispielhaft
für Typen von Infektionen sind, die mit dem Verfahren und den liposomalen
Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können. Es ist darauf
hinzuweisen, daß derartige Zustände lediglich als Beispiele angegeben
werden und daß es nicht beabsichtigt ist, die Eignung des Verfahrens und
der Zusammensetzung der Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken. Es
ist darauf hinzuweisen, daß im allgemeinen das erfindungsgemäße
Behandlungsverfahren wirksam bei der Behandlung von Infektionen mikrobiellen
Ursprungs unter Einschluß von viralen Infektionen, Pilzinfektionen und
bakteriellen Infektionen sowie von Infektionen parasitären oder
helminthischen Ursprungs ist.
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Pulmonare Infektionen weisen eine Anzahl von Ätiologien und
Erscheinungsformen auf. Arninoglycosid-Antibiotika sind wirksame Therapeutika
gegen die virulenten gram-negativen Stämme von Bakterien, die die
hervorrufenden Agentien bei Pneumonien sind; aufgrund ihrer Toxizität wird die
Verwendung derartiger Mittel jedoch nur im Fall von lebensbedrohenden
Infektionen, wie solchen durch Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter,
Klebsiella, Serratia und andere Organismen, von denen festgestellt wird, daß
sie gegen weniger toxische Mittel resistent sind, vorgeschlagen. Die
Behandlung einer Klebsiella-Infektion der Lunge wird unter Anwendung des
Behandlungsverfahrens und der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
durch Verabreichung einer Dosis einer liposomalen Formulierung eines
Aminoglycosids, wie Gentamicin, an den Patienten durchgeführt. Eine
derartige Formulierung wird in einer wirksamen Dosis, um für eine
Konzentration des Aminoglycosids, die wirksam zur Hemmung oder Verringerung des
Wachstums des Mikroorganismus ist, zu sorgen, verabreicht. In der Praxis
ist eine Konzentration an Gentamicin in der Lunge von etwa 1 µg/ml
ausreichend, um für eine therapeutische Wirkung zu sorgen. Entsprechend
können Lungeninfektionen und insbesondere Lungenabszesse, die von dem
gramnegativen Bacterium Bacteroides hervorgerufen werden, in wirksamer Weise
durch Verabreichung einer liposomalen Zusammensetzung behandelt werden,
die Clindamicin oder ein Cephalosporin oder Penicillin enthält. Anaerobe
Bacteroides-Infektionen, die andere Bereiche des Körpers betreffen, wie
den Darm, das Becken oder das Gehirn, sind derartigen Behandlungen allein
oder in Kombination mit anderen antimikrobiellen Mitteln unter Einschluß
von Chloramphenicol und Metronidazol ebenfalls zugänglich.
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Wie vorstehend beschrieben wurde, sind die Zellen der Leber und der
Milz, die normalerweise (in Abwesenheit einer Infektion) Liposomen
anreichern, die fixierten Makrophagen, die einen Teil des lymphoretikularen
Systems oder RES bilden. Die Anreicherung von Liposomen in diesen Zellen
erlaubt nicht notwendigerweise die Voraussage der Abgabe von Arzneistoff
an benachbarte Gewebezellen, wie Hepatocyten im Leberparenchym.
Andererseits können derartige Zellen lokalisierte Stellen bestimmter
Infektionen, wie viraler Hepatitis, sein. Es wird angenommen, daß beim
Vorhandensein einer derartigen Infektion Hepatocyten selektiv erfindungsgemäße
liposomale Arzneistoffzusammensetzungen anreichern. In Liposomen
eingeschlossene DNA-Polymeraseinhibitoren, wie Zidovudin, können bei der
Behandlung derartiger Infektionen nützlich sein.
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Das zentrale Nervensystem unter Einschluß des Gehirns, des
Rückenmarks und der Meningen ist ebenfalls anfällig für eine Infektion durch
eine Anzahl von verursachenden Agentien. Der Arzneistoffdurchtritt vom
Blut in die Gewebe des zentralen Nervensystems wird zwar im allgemeinen
durch die "Blut-Hirn-Schranke" behindert; es ist jedoch bekannt, daß
diese Schranke in erheblichem Maße während Himhautinfektionen
zusammenbricht, was derartige Stellen der Infektion besser zugänglich für die
erfindungsgemäßen liposomalen Präparate macht. Es wird daher angenommen,
daß eine Anzahl schwerer Infektionen des zentralen Nervensystems
ebenfalls einer Behandlung durch in Liposomen eingeschlossene antimikrobielle
Zusammensetzungen zugänglich ist. Beispiele für derartige Infektionen und
in Liposomen eingeschlossene Arzneistoffe, die sich für die Behandlung
eignen, umfassen die Behandlung bei Cryptococcus durch Amphotericin oder
Fluconazol, bei Pneurnococcus, Pseudomonas, Listeria und Meningococcus
durch Penicilline, Erythromycin, Gentamicin oder Cephalosporine.
Zusätzlich ist die bakterielle Meningitis aufgrund von Hernophilus influenzae
oder Streptococcus pneumoniae in einigen Fällen mit Penicillinen oder
Cephalosporinen behandelbar; insbesondere bei Patienten, die Penicillin-
Allergien zeigen, bleibt jedoch Chloramphenicol der Arzneistoff der Wahl
für die Behandlung derartiger Infektionen, und zwar selbst angesichts
seiner schweren toxischen Nebenwirkungen unter Einschluß von
Blutdyscrasie. Es wird angenommen, daß der liposomale Einschluß von Chloramphenicol
die Dosis der Verbindung verringert, der nicht infizierte,
Arzneistoffempfindliche Gewebe unter Einschluß des Knochenmarks ausgesetzt sind.
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Zahlreiche Hautinfektionen sprechen zwar auf eine topische
Behandlung an; bestimmte chronische Infektionen der Dermis oder Epidermis
können jedoch eine systemische Arzneistoffbehandlung für wirksame
therapeutische Ergebnisse erfordern. Eine derartige dermale Infektion wird durch
Herpes-Viren hervorgerufen. Die Behandlung mit in Liposomen
eingeschlossenem Acyclovir ist bei derartigen Infektionen geeignet.
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Aspergillus ist ein Pilz, der als infektises Agens bei praktisch
jedem Organ des Körpers in Betracht kommt. Er wird häufig als
hervorrufendes Agens bei pervasiven Lungeninfektionen, insbesondere bei Patienten
mit beeinträchtigtem Immunsystem, gefunden. Die Behandlung der Wahl für
diese Art von Infektion ist Amphotericin B. Bei der Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird einem Patienten in Liposomen
eingeschlossenes Amphotericin B in einer wirksamen Dosis, um für eine Konzentration
im infizierten Gewebe von etwa 2 µg/ml zu sorgen, verabreicht.
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Eine Anzahl von weiteren Stellen im Körper sind besonders zugänglich
für das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren, und zwar unter Einschluß
von Sekundärinfektionen nach der Implantation einer Prothese oder einer
medizinischen Vorrichtungen, wie einer Herzklappe oder eines
innenliegenden Katheters. Derartige Infektionen sind durch das Vorhandensein eines
Biofilms charakterisiert, der sie relativ resistent gegenüber
Standarddosen von antibiotischen Mitteln macht. Ein Bereich, der häufig als Folge
des Vorhandenseins eines innenliegenden Katheters infiziert ist, ist die
Prostata, bei der eine Infektion durch Pseudomonas besonders
schwerwiegend ist. In derartigen Fällen ist die Behandlung mit hohen
Konzentrationen an Penicillin- oder Cephalosporin-Antibiotika wünschenswert.
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Entsprechend kann eine Endocarditis sekundär nach einer Implantation
einer Herzklappe auftreten. Staphylococcus ist ein häufiges
verursachendes Agens derartiger Infektionen. Das erfindungsgemäße
Behandlungsverfahren wird zur Abgabe ausreichend hoher Konzentrationen an Vancomycin an
das Endocardium verwendet, um eine derartige Infektion zu beseitigen. Bei
Verabreichung in nicht-liposomaler Form ist Vancomycin mit mehreren
möglicherweise schwächenden toxischen Eigenschaften verbunden, die seine
Verwendung in wirksamen Konzentrationen begrenzen.
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Entsprechend ist Vancomycin nützlich bei der Behandlung von
staphylococcaler Osteomyelitis, die häufig als Komplikation einer
Knochenmarkstransplantation oder bei der Gelenkersatzchirurgie auftritt.
Cephalosporine und Penicilline sind ebenfalls wirksam gegen bestimmte Formen von
Osteomyelitis, und es wird in Betracht gezogen, daß liposomale
Formulierungen dieser Verbindungen sich für die Behandlung dieses Zustands
eignen.
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Die nachstehenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung von
liposomalen Formulierungen mit erhöhten Zirkulationszeiten, die selektiv
in infiziertem Gewebe angereichert werden, und Verfahren zur
Verabreichung derartiger liposomaler Formulierungen in Tiermodellen der
Infektion. Die Beispiele sollen die speziellen Liposomenzusammensetzungen und
Verfahren der Erfindung erläutern, sie sollen deren Schutzumfang jedoch
in keiner Weise beschränken.
Materialien
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Cholesterin (Chol) wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen.
Sphingomyelin (SM), Ei-Phosphatidylcholin (Lecithin oder PC), partiell
hydriertes PC mit der Zusammensetzung IV40, IV30, IV20, IV10 und IV1,
Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylethanolamin (PE),
Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dipalmitoyl-PC (DPPC), Dioleyl-PC (DOPC) und Distearoyl-
PC (DSPC) wurden von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) oder Austin
Chemical Company (Chicago, IL) bezogen. Distearylphosphatidylethanolamin
wurde von Calbiochem (La Jolla, CA) bezogen.
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[¹²&sup5;I]-Tyraminylinul in wurde gemäß veröffentlichter Verfahren
hergestellt. &sup6;&sup7;Gallium-citrat wurde von NEN Neoscan (Boston, MA) bezogen.
[¹²&sup5;I]-Gentamlcin wurde von NEN (Cambridge, MA) bezogen. Doxorubicin-HCl
und Epirubicin-HCl wurden von Adria Laboratories (Columbus, OH) oder
Farmitalia Carlo Erba (Mailand, Italien) bezogen.
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Polyvinylalkohol (PVA), Glycolsäure und Milchsäure wurden von
Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Polymilchsäure wurde von ICN (Cleveland,
OH) bezogen.
Beispiel 1
Herstellung von PEG-PE, verknüpft durch Cyanurchlorid
A. Herstellung von aktiviertem PEG
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2-O-Methoxypolyethylenglycol-1900-4,6-dichlor-1,3,5-triazin, das
bereits als aktiviertes PEG bezeichnet wurde, wurde hergestellt, wie es in
J. Biol. Chem., Bd. 252 (1977), S. 3582 beschrieben ist, und zwar mit den
folgenden Modifizierungen.
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Cyanurchlorid (5,5 g; 0,03 Mol) wurde in 400 ml wasserfreiem Benzol
mit einem Gehalt an 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst, und PEG-
1900 (19 g; 0,01 Mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde filtriert, und 600 ml
Petrolether (Siedebereich 35 bis 60º) wurde langsam unter Rühren zugegeben. Der
feinverteilte Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und erneut in
400 ml Benzol gelöst. Das Verfahren aus Ausfällen und Filtration wurde
mehrere Male wiederholt, bis der Petrolether frei von restlichem
Cyanurchlorid war, was durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie über eine
Säule (250 × 3,2 mm) mit 5-m "LiChrosorb" (E. Merck) bei Entwicklung mit
Hexan und Nachweis mit einem Ultraviolettdetektor bestimmt wurde. Die
Titration von aktiviertem PEG-1900 mit Silbernitrat nach einer Hydrolyse
über Nacht in einem wäßrigen Puffer bei pH-Wert 10,0 und Raumtemperatur
ergab einen Wert von 1,7 Mol freigesetztes Chlorid/Mol PEG.
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Eine TLC-Analyse des Produkts wurde mit Umkehrphasen-TLC-Platten
durchgeführt, die von Baker erhalten wurden, und zwar unter Verwendung
von Methanol/Wasser 4:1 (Vol./Vol.) als Entwickler und Behandlung mit
Ioddampf zur Visualisierung. Unter diesen Bedingungen erschien das als
Ausgangsmaterial eingesetzte Methoxypolyglycol-1900 bei Rf = 0,54 bis
0,60. Das aktivierte PEG erschien bei Rf = 0,41. Nicht umgesetztes
Cyanurchlorid erschien bei Rf = 0,88 und wurde entfernt.
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Das aktivierte PEG wurde auf Stickstoff analysiert, und eine
geeignete Korrektur wurde bei der Bestimmung der Menge an Reaktanten, die
in den weiteren Synthesestufen verwendet wurde, angewandt. Wenn also das
Produkt nur 20 % der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann
wurde die Menge an Material, die in der nächsten Synthesestufe verwendet
wurde, um 100/20 oder das 5-fache erhöht. Wenn das Produkt 50 % der
theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann war nur eine Erhöhung von
100/50 oder eine zweifache Erhöhung erforderlich.
B. Herstellung von
N-(4-Chlor-polyethylenglycol-1900)-1,3,5-triazinyl-ei-phosphatidylethanolamin
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In einem Teströhrchen mit Schraubverschluß wurden 0,74 ml einer 100
mg/ml (0,100 mMol) Stammlösung von Ei-Phosphatidylethanolamin in
Chloroform unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt und dann zu dem
Rückstand des aktivierten PEG, das in Abschnitt A beschrieben wurde, in
einer solchen Menge gegeben, daß 205 mg (0,100 mMol) bereitgestellt
wurden. Zu diesem Gemisch wurden 5 ml wasserfreies Dimethylformamid gegeben.
27 µl (0,200 mmol) Triethylamin wurden zu dem Gemisch gegeben, und die
Luft wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gemisch wurde über Nacht in
einem Sandbad erwärmt, das bei 110ºC gehalten wurde.
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Das Gemisch wurde dann unter Vakuum zur Trockene eingeengt, und es
wurde eine pastenartige Masse aus kristallinem Feststoff erhalten. Dieser
Feststoff wurde in 5 ml eines Gemisches auf 4 Volumenteilen Aceton und 1
Volumenteil Essigsäure gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde auf eine
chromatographische Absorptionssäule von 21 mm × 240 mm, die mit
Siliciumdioxidgel (Merck Kieselgel 60, 70 bis 230 mesh) gepackt war und zuerst mit
einem Lösungsmittel, das aus Aceton:Essigsäure 80:20 (Vol./Vol.) bestand,
befeuchtet worden war, aufgegeben.
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Die Säulenchromatographie wurde mit dem gleichen
Lösungsmittelgemisch entwickelt, und getrennte Anteile von 20 bis 50 ml ausströmendes
Medium wurden gesammelt. Jede Portion an ausströmendem Medium wurde durch
TLC auf Siliciumdioxidgel-beschichteten Platten unter Verwendung von 2-
Butanon:Essigsäure:Wasser 40:25:5 (Vol./Vol./Vol.) als Entwickler und
einer Ioddampfbehandlung zur Visual isierung untersucht. Fraktionen, die
nur Material mit einem Rf-Wert von etwa 0,79 enthielten, wurden vereinigt
und unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Ein Trocknen bis zu konstantem
Gewicht unter Hochvakuum ergab 86 mg (31,2 µMol) an nahezu farblosem,
festem
N-(4-Chlor-polyglycol-1900)-1,3,5-triazinyl-ei-phosphatidylethanolamin mit einem Gehalt an Phosphor.
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Die feste Verbindung wurde in 24 ml Ethanol/Chloroform; 50/50
Chloroform aufgenommen und zur Entfernung von unlöslichem Material
zentrifugiert Einengen der geklärten Lösung zur Trockene unter Vakuum ergab 21
mg (7,62 µMol) eines farblosen Feststoffs.
Beispiel 2
Herstellung von Carbamat- und "Eid-verknüpften
hydrophilen Polymeren mit PE
A. Herstellung des Imidazolcarbamts von
Polyethylenglycolmethylether-1900
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9,5 g (5 mMol) Polyethylenglycolmethylether-1900 (bezogen von
Aldrich Chemical Co.) wurden in 45 ml Benzol gelöst, das über
Molekularsieben getrocknet worden war. 0,89 g (5,5 mMol) reines Carbonyldiimidazol
wurden zugegeben. Die Reinheit wurde durch ein Infrarotspektrum
überprüft. Die Luft im Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das
Gefäß wurde geschlossen und in einem Sandbad 16 Stunden auf 75ºC erwärmt.
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Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und bei Raumtemperatur bildete
sich eine klare Lösung. Die Lösung wurde mit 50,0 ml trockenem Benzol
verdünnt und in einem Kühlschrank als Stammlösung mit 100 µMol/ml
Imidazolcarbamat von PEG-Ether-1900 gelagert.
B. Herstellung des Phosphatidylethanolamincarbamats von
Polyethylenglycolmethylether-1900
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10,0 ml (1 mMol) der Stammlösung von 100 mmol/ml des
Imidazolcarbamats von Polyethylenglycolmethylether-1900 wurden in einen 10 ml
fassenden birnenförmigen Kolben pipettiert. Das Lösungsmittel wurde unter
Vakuum entfernt. 3,7 ml einer Lösung mit 100 mg/ml
Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform (0,5 mMol) wurde zugegeben. Das Lösungsmittel wurde
unter Vakuum verdampft. 2 ml 1,1,2,2-Tetrachlorethylen und 139 µl (1,0
mMol) Triethylamin VI wurden zugegeben. Das Gefäß wurde geschlossen und 6
Stunden in einem bei 95ºC gehaltenen Sandbad erwärmt. Nach dieser Zeit
wurde eine Dünnschichtchromatographie mit Fraktionen des vorstehenden
Gemisches durchgeführt, um das Ausmaß der Konjugation auf
SiO&sub2;-beschichteten TLC-Platten zu bestimmen, wobei Butanon/Essigsäure/Wasser 40/5/5
(Vol./Vol./Vol.) als Entwickler verwendet wurde. Die Visualisierung mit
Ioddampf ergab, daß der größte Teil des freien Phosphatidylethanolamins
bei Rf = 0,68 reagiert hatte und durch ein phosphorhaltiges Lipid bei Rf
= 0,78 bis 0,80 ersetzt worden war.
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Das Lösungsmittel aus dem restlichen Reaktionsgemisch wurde unter
Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid
aufgenommen und auf eine chromatographische Absorptionssäule von 21 mm × 270 mm,
die mit Merck-Kieselgel 60 (Siliciumdioxidgel mit 70 bis 230 mesh)
gepackt war, das zunächst mit Methylenchlorid gespült worden war, gegeben.
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Das Gemisch wurde durch die Säule geleitet, wobei der Reihe nach die
folgenden Lösungsmittel verwendet wurden:
Tabelle 1
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Portionen von 50 ml des ausströmenden Mediums wurden gesammelt, und
jede Portion wurde durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter
Anwendung der I&sub2;-Dampfabsorption zur Visualisierung nach der Entwicklung mit
Chloroform/Methanol/Wasser/konzentriertem Ammoniumhydroxid 130/70/8/0,5 %
(Vol./Vol./Vol./Vol.) untersucht. Der größte Teil der Phosphate wurde in
den Fraktionen 11, 12, 13 und 14 gefunden.
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Diese Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum zur Trockene
eingeengt und im Hochvakuum bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Sie
ergaben 669 mg eines farblosen Wachses aus Phosphatidylethanolamincarbamat
von Polyethylenglycolmethylether. Dies entspricht 263 µMol und einer
Ausbeute von 52,6 %, bezogen auf das Phosphatidylethanolamin.
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Ein NMR-Spektrum des Produkts, gelöst in Deuterochloroform, zeigte
Peaks, die dem Spektrum für Ei-PE entsprachen, und zwar zusammen mit
einem starken Singulett aufgrund der Methylengruppen der Ethylenoxidkette
bei δ = 3,4 ppm. Das Verhältnis von Methylenprotonen aus dem Ethylenoxid
zu den endständigen Methylprotonen aus den PE-Acylgruppen war groß genug,
um ein Molekulargewicht von etwa 2000 für den Polyethylenoxidanteil des
Moleküls des als Produkt gewünschten Polyethylenglycol-konjugierten
Phosphatidylethanolamincarbamats (Molekulargewicht: 2654) zu bestätigen.
C. Herstellung des Polymilchsäureamids von Phosphatidylethanolamin
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200 mg (0,1 mMol) Poly-(milchsäure), Molekulargewicht: 2000 (ICN,
Cleveland, Ohio) wurden in 2,0 ml Dimethylsulfoxid unter Erwärmen gelöst,
während gerührt wurde, um das Material vollständig zu lösen. Anschließend
wurde die Lösung sofort auf 65ºC gekühlt und in ein Gemisch aus 75 mg
(0,1 mMol) Distearylphosphatidylethanolamin (Cal. Biochem, La Jolla) und
41 mg (0,2 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid gegossen. Anschließend wurden 28
ml (0,2 mmol) Triethylamin zugegeben, und die Luft wurde aus dem Röhrchen
durch Stickstoffgas verdrängt. Das Röhrchen wurde verschlossen und 48
Stunden auf 65ºC erwärmt.
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Nach dieser Zeit wurde das Röhrchen auf Raumtemperatur gekühlt, und
6 ml Chloroform wurden zugegeben. Die Chloroformlösung wurde dreimal
nacheinander mit Volumina von 6 ml Wasser gewaschen und nach jedem
Waschgang zentrifugiert. Die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt.
Die zurückbleibende Chloroformphase wurde mit Unterdruck filtriert, um
suspendiertes Distearoylphosphatidylethanolamin zu entfernen. Das Filtrat
wurde unter Vakuum getrocknet, wobei man 212 rng halbkristallinen
Feststoff erhielt.
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Dieser Feststoff wurde in 15 ml eines Gemisches aus 4 Volumenteilen
Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser gelöst, durch ein Bett mit einer Tiefe
von 50 mm und einem Durchmesser von 21 mm aus H&spplus;-Dowex
50-Kationenaustauschharz geleitet und mit 100 ml des gleichen Lösungsmittels gewaschen.
Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt, wobei man 131 mg farbloses
Wachs erhielt.
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291 rng eines derartigen Wachses wurden in 2,5 ml Chloroform gelöst
und auf eine Säule von 21 mm × 280 mm, die mit Silicagel, das mit
Chloroform benetzt worden war, gepackt war, aufgetragen. Das Chromatogramm
wurde entwickelt, indem durch die Säule nacheinander jeweils 100 ml an:
-
100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
-
Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden
aufbewahrt und durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Verwendung von
CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als Entwickler und
I&sub2;-Dampfabsorption zur Visualisierung untersucht.
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Die Portionen von 275 bis 325 ml des aus der Säule ausströmenden
Mediums enthielten ein einziges Material, PO&sub4; +, mit einem Rf-Wert von
0,89. Nach Vereinigen und Einengen zur Trockene ergaben diese Portionen
319 mg farbloses Wachs. Die Phosphatanalyse bestätigte ein
Molekulargewicht von etwa 115 000. Dieses Material wurde zur Herstellung von
Polymilchsäure-PE enthaltenden Liposomen verwendet, die in den in Fig. 10A
zusammengefaßten Versuchen verwendet wurden.
-
Bei diesem Herstellungsverfahren trat die Polymerisierung der
Poly(milchsäure) offensichtlich mit einer vergleichbaren Geschwindigkeit zu
der, mit der sie mit Phosphatidylethanolamin reagierte, auf. Diese
Nebenreaktion könnte wahrscheinlich minimiert werden, indem mit stärker
verdünnten Lösungen der Reaktanten gearbeitet wird.
D. Herstellung des Poly-glycolsiure-amids von DSPE
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Ein Gemisch aus 266 mg (3,50 mMol) Glycolsäure, 745 mg (3,60 mMol)
Dicyclohexylcarbodiimid, 75 mg (0,10 mMol)
Distearoylphosphatidylethanolamin, 32 µl (0,23 mMol) Triethylamin und 5,0 ml trockenem
Dimethylsulfoxid wurde auf 75ºC unter einer Stickstoffatmosphäre erwärmt, auf
Raumtemperatur gekühlt, anschließend mit einem gleichen Volumen an Chloroform
verdünnt und dann dreimal nacheinander mit gleichen Volumina an Wasser
gewaschen, um das Dimethylsulfoxid zu entfernen. Es wurde jedesmal
zentrifugiert, und die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt.
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Die Chloroformphase wurde unter Unterdruck futriert, um eine kleine
Menge an suspendiertem Material zu entfernen. Das Filtrat wurde dann
unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 572 mg eines blaß
bernsteinfarbenen Wachses erhielt. Dieses Material wurde erneut in 2,5 ml
Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 mm × 270 mm mit Siliciumdioxidgel
(Merck Kieselgel 60), das zuvor mit Chloroform benetzt worden war,
aufgetragen.
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Das Chromatogramm wurde entwickelt, indem durch die Säule
nacheinander jeweils 100 ml an
-
100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
-
70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
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Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden
gesammelt und jeweils durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter
Verwendung von CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als
Entwickler untersucht. Fast das gesamte PO&sub4;-positive Material befand sich in
der Portion von 275 bis 300 ml des ausströmenden Mediums. Einengen dieser
Portion zur Trockene unter Vakuum, gefolgt von Trocknen im Hochvakuum,
ergab 281 mg farbloses Wachs. Die Phosphatanalyse bestätigte ein
Molekulargewicht von 924 000. Dieses Material wurde zur Herstellung von
Polyglycolsäure-PE enthaltenden Liposomen verwendet, die in den in Fig. 10A
zusammengefaßten Versuchen verwendet wurden.
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Die Veränderung des Lösungsmittelvolumens während der Reaktion und
der molaren Verhältnisse von Glycolsäure und Dicyclohexylcarbodiimid
führt wahrscheinlich zu Molekülen anderer Größe.
E. Herstellung des Polyglycolsiure/Polymilchsäureamids von PE
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Der gleiche synthetische Ansatz, der vorstehend ausführlich
angegeben wurde, kann auf die Herstellung von statistischen Polymilchsäure/
Polyglycolsäure-Copolymeren, die chemisch mit PE über eine Amidbindung
verknüpft sind, angewandt werden. In diesem Fall werden äquimolare Mengen
an Distearoylphosphatidylethanolamin und einem 1-zu-1-Gemisch von
Polyglycolsäure und Polymilchsäure mit einem dreifachen molaren Überschuß an
Dicyclohexylcarbodiimid und einem zweifachen molaren Überschuß an
Triethylamin in einem ausreichenden Volumen an Dimethylsulfoxid, um alle
Komponenten zu lösen, bei 75ºC gemischt. Man läßt die Reaktion 48 Stunden
unter einer inerten Atmosphäre ablaufen. Das Produkt wird durch
Säulenchromatographie, wie es vorstehend für die Polymilchsäure- und
Polyglycolsäureamide von PE beschrieben wurde, gereinigt.
F. Herstellung des Polyvinylalkoholcarbamats von PE
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10 g Polyvinylalkohol (PVA) mit einem Molekulargewicht von 50 000
wurden in 200 ml Wasser unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde auf 45ºC
gekühlt und filtriert. Die Lösung wurde dann mit einem gleichen Volumen
an Aceton gemischt, und der erhaltene feste Niederschlag wurde durch
Filtration (Whatman Nr. 1) entfernt. Eine PVA-Fraktion mit niedrigem
Molekulargewicht (MW) wurde aus dem Filtrat durch Verdampfen des Lösungsmittels
gewonnen. Man erhielt eine Ausbeute von 920 mg.
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PE wurde mit Carbonyldiimidazol (CDI) in Gegenwart von Triethylamin
(TEA) in einem molaren Verhältnis von 1:1,1:1 (PE:CDI:TEA) in Benzol bei
75ºC für 4 Stunden umgesetzt. Eine niedermolekulare Fraktion von PVA, die
hergestellt wurde, wie es vorstehend ausführlich angegeben wurde, wurde
dann zugegeben (0,1 µ pro Mol PE), und die Reaktion wurde bei 75ºC für 24
Stunden fortgesetzt. Das resultierende PVA-PE wurde verwendet, um
Liposomen herzustellen, die in den in Fig. 10B zusammengefaßten Versuchen
verwendet wurden.
Beispiel 3
Herstellung von Ethylen-verknüpftem PEG-PE
A. Herstellung von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol
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Die Herstellung von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol wird im
Reaktionsschema, das in Fig. 3 gezeigt ist, erläutert.
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15,0 g (10 inmol) Polyethylenglycol (Molekulargewicht: 1500; Aldrich
Chemical) wurden in 80 ml Benzol gelöst. 1,40 ml (11 mMol)
Chlortrimethylsilan (Aldrich Chemical Co.) und 1,53 ml (1 mMol) Triethylamin wurden
zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden unter einer
inerten Atmosphäre gerührt.
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Das Gemisch wurde mit Unterdruck filtriert, um Kristalle von
Triethylamrnoniumchlorid abzutrennen, und die Kristalle wurden mit 5 ml
Benzol gewaschen. Filtrat und Benzolwaschflüssigkeit wurden vereinigt. Diese
Lösung wurde unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 15,83 g
farbloses Öl erhielt, das sich beim Stehen verfestigte.
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TLC des Produkts auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten unter Verwendung
eines Gemisches aus 4 Volumenteilen Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser als
Entwickler und Ioddampfvisualisierung zeigte, daß das gesamte Polyglycol-
1500 (Rf = 0,93) verbraucht und durch ein Material mit Rf = 0,82 ersetzt
worden war. Ein Infrarotspektrum zeigte Absorptionsmaxima, die nur für
Polyglycole charakteristisch sind.
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Die Ausbeute an I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol
(Molekulargewicht: 1500) war nahezu quantitativ.
B. Herstellung des Trifluormethansulfonylesters von
I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol
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15,74 g (10 mMol) kristallines
I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol, das vorstehend erhalten worden war, wurden in 40 ml wasserfreiem
Benzol gelöst und in einem Bad von zerstoßenem Eis gekühlt. 1,53 ml (11
mMol) Triethylamin und 1,85 ml (11 mMol)
Trifluormethansulfonsäureanhydrid, das von Aldrich Chemical Co. bezogen wurde, wurden zugegeben, und
das Gemisch wurde über Nacht unter einer inerten Atmosphäre gerührt, bis
das Reaktionsgemisch seine Farbe nach braun änderte.
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Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck verdampft, und
die zurückbleibende sirupartige Paste wurde mit Methylenchlorid auf 100,0
ml verdünnt. Aufgrund der großen Reaktivität von
Trifluormethansulfonsäureestern wurde keine weitere Reinigung des
Trifluormethansulfonsäureesters von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol unternommen.
C. Herstellung von N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE
-
10 ml der Methylenchlorid-Stammlösung des
Trifluormethansulfonylesters von 1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol wurden unter Vakuum zur
Trockene eingeengt, wobei man etwa 1,2 g Rückstand (ungefähr 0,7 mMol)
erhielt. Zu diesem Rückstand wurden 3,72 ml einer Chloroformlösung, die
372 mg (0,5 Inmol) Ei-PE enthielt, gegeben. Zu der erhaltenen Lösung
wurden
139 µl (1,0 mMol) Triethylamin gegeben, und das Lösungsmittel wurde
unter Vakuum verdampft. Zu dem erhaltenen Rückstand wurden 5 ml trockenes
Dimethylformamid und 70 µl (0,50 mmol) Triethylamin (VI) gegeben. Die
Luft aus dem Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das Gefäß
wurde verschlossen und in einem Sandbad 22 Stunden auf 110 C erwärmt. Das
Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft, wobei man 1,58 g eines
bräunlich gefärbten Öls erhielt.
-
Eine chromatographische Absorptionssäule von 21 × 260 mm, die mit
Kieselgel 60-Siliciumdioxid von 70 bis 230 mesh gefüllt war, wurde
vorbereitet und mit einem Lösungsmittel gespült, das aus 40 Volumenteilen
Butanon, 25 Volumenteilen Essigsäure und 5 Volumenteilen Wasser bestand.
Das Rohprodukt wurde in 3 ml des gleichen Lösungsmittels gelöst und auf
die chromatographische Säule übertragen. Das Chromatogramm wurde mit dem
gleichen Lösungsmittel entwickelt, und aufeinanderfolgende Portionen von
30 ml des ausströmenden Mediums wurden jeweils durch TLC untersucht.
-
Bei dem TLC-Assaysystem wurden Siliciumdioxidgel-beschichtete
Glasplatten mit der Lösungsmittelkombination Butanon/Essigsäure/Wasser
40/25/5 (Vol./Vol./Vol.) verwendet. Eine Ioddampfabsorpt ion diente der
Visualisierung. In diesem Lösungsrnittelsystem erschien das
N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE bei einem Rf-Wert von 0,78.
Unverändertes PE erschien bei Rf = 0,68.
-
Das gewünschte N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol 1500-PE war
der Hauptbestandteil der Portionen von 170 bis 300 ml des aus der Säule
ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur Trockene unter Vakuum ergaben
diese Portionen 111 mg eines blaßgelben Öls der Verbindung.
D. Herstellung von N-Polyethylenglycol 1500: Entfernung der
Schutzgruppe von Phosphatidylethanolamin mit Essigsäure
-
Nach der Chromatographie wurde die PE-Verbindung in 2 ml
Tetrahydrofuran gelöst. Dazu wurden 6 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gegeben. Die
erhaltene Lösung wurde 3 Tage bei 23ºC stehengelassen. Das Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand
wurde bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, wobei man 75 mg eines
blaßgelben Wachses erhielt. TLC auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten, die mit
einem Gemisch aus 4 Volumenteilen Ethanol und 1 Volumenteil Wasser
entwickelt wurden, zeigte, daß eine gewisse Menge an freiem PE und eine
gewisse Menge an Polyglycol-ähnlichem Material sich während der Hydrolyse
gebildet hatten. Der Rückstand wurde in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und
mit 3 ml einer Lösung aus Ethanol:Wasser 80:20 (Vol./Vol.) verdünnt. Das
Gemisch wurde auf eine chromatographische Absorptionssäule von 10 mm ×
250 mm aufgetragen, die mit Siliciumdioxidgel mit Octadecyl-gebundener
Phase gepackt worden war, und die Säule wurde mit Ethanol:Wasser 80:20
(Vol.-%) entwickelt, wobei aufeinanderfolgende Portionen von 20 ml des
ausströmenden Mediums gesammelt wurden. Das ausströmende Medium wurde
durch Umkehrphasen-TLC untersucht. Fraktionen, die nur Produkt mit Rf =
0,08 bis 0,15 enthielten, wurden vereinigt. Dies waren typischerweise die
Portionen von 20 bis 100 ml des ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur
Trockene unter Vakuum ergaben diese Portionen 33 mg farbloses Wachs PEG-
PE, was einer Ausbeute von nur 3 %, bezogen auf das als Ausgangsmaterial
verwendete Phosphatidylethanolamin, entspricht.
-
Die NMR-Analyse zeigte, daß dem Produkt sowohl PE-Reste als auch
Polyethylenglycol-Reste einverleibt waren, daß jedoch ungeachtet der
günstig erscheinenden Elementaranalyse die Kettenlänge der Polyglycolkette
auf etwa 3 bis 4 Ethylenoxidreste verringert worden war. Das hergestellte
Produkt wurde zur Herstellung von PEG-PE-Liposomen verwendet.
E. Herstellung von N-Polyethylenglycol 1500-P.E. durch Entfernung
der Schutzgruppe mit Fluorid
-
500 mg rohes N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglycol-PE wurden in 5
ml Tetrahydrofuran gelöst, und 189 mg (0,600 inmol)
Tetrabutylammoniumfluorid wurden zugegeben, und es wurde gerührt, bis sich das Material
gelöst hatte. Die Reaktanten wurden über Nacht bei Raumtemperatur (20ºC)
stehengelassen.
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Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft, und der
Rückstand wurde in 10 ml Chloroform gelöst, zweimal nacheinander mit
Portionen von 10 ml Wasser gewaschen und zentrifugiert, um die
Chloroformphase und die Wasserphase zu trennen. Die Chloroformphase wurde unter
verringertem Druck eingeengt, wobei man 390 mg eines orangebraunen
Wachses erhielt, von dem festgestellt wurde, daß es sich um eine unreine N-
Polyethylenglycol 1500-PE-Verbindung handelte.
-
Dieses Wachs wurde erneut in 5 ml Chloroform gelöst und auf eine
Säule von 21 × 270 mm mit Siliciumdioxidgel, das mit Chloroform
befeuchtet worden war, aufgetragen. Die Säule wurde entwickelt, indem 100 ml
Lösungsmittel durch die Säule geleitet wurden. Die Lösungsmittel aus
Tabelle 2 wurden nacheinander verwendet:
Tabelle 2
-
Getrennte Fraktionen von 50 ml des aus der Säule ausströmenden
Mediums wurden aufbewahrt. Die Fraktionen der Säule wurden durch TLC auf
Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten getrennt. Die TLC-Platten wurden mit 4
Volumenteilen Ethanol, gemischt mit 1 Volumenteil Wasser, entwickelt. Die
Visualisierung erfolgte durch Behandlung mit Ioddampf.
-
Nur diejenigen Fraktionen, die Iod absorbierendes Lipid mit einem
Rf-Wert von etwa 0,20 enthielten, wurden vereinigt, unter Vakuum zur
Trockene eingeengt und unter Hochvakuum bis zu einem konstanten Gewicht
getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 94 mg wachsartigen kristallinen
Feststoff mit einem Molekulargewicht von 2226. Ein Protonen-NMR-Spektrum
dieses Materials, gelöst in Deuterochloroform, zeigte die erwarteten
Peaks aufgrund des Phosphatidylethanolaminanteils des Moleküls zusammen
mit wenigen Methylenprotonen, die Polyethylenglycol zugeschrieben werden
können (δ = 3,7).
Beispiel 4
Herstellung von REVs und MLVs
A. REVs mit eingestellter Größe
-
Insgesamt 15 µMol der ausgewählten Lipidkomponenten in den in den
nachstehenden Beispielen angegebenen Molverhältnissen wurden in
Chloroform gelöst und als dünner Film durch Rotationsverdampfung getrocknet.
Dieser Lipidfilm wurde in 1 ml mit destilliertem Wasser gewaschenem
Diethylether gelöst. Zu dieser Lipidlösung wurden 0,34 ml einer wäßrigen
Pufferltsung mit einem Gehalt an 5 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH-
Wert: 7,4, gegeben, und das Gemisch wurde durch Beschallung für 1 Minute
emulgiert, wobei die Temperatur der Lösung bei oder unterhalb
Raumtemperatur gehalten wurde. Wenn die Liposomen so hergestellt wurden, daß sie
eingeschlossenes [¹²&sup5;IJ-Tyraminyl-inulin enthielten, dann wurde diese
Substanz dem Phosphatpuffer in einer Konzentration von etwa 4 µCi/ml
Puffer einverleibt.
-
Das Etherlösungsmittel wurde unter verringertem Druck bei
Raumtemperatur entfernt, und das erhaltene Gel wurde in 0,1 ml des vorstehenden
Puffers aufgenommen und anschließend kräftig geschüttelt. Die erhaltene
REV-Suspension wies Teilchengrößen, die durch mikroskopische Untersuchung
bestimmt wurden, zwischen etwa 0,1 bis 20 µm auf und bestand vorwiegend
aus relativ großen Vesikeln (größer als 1 µm) mit nur einer oder nur
wenigen Doppelschicht-Lamellen.
-
Die Liposomen wurden zweimal durch einen Polycarbonatfilter (Szoka,
1978) mit einer ausgewählten Porengröße von 0,4 µm oder 0,2 µm
extrudiert. Die Liposomen, die durch den Filter mit 0,4 um extrudiert worden
waren, wiesen im Mittel Durchmesser von 0,17 ± (0,05) µm auf, und die,
die durch den Filter mit 0,2 µm extrudiert worden waren, wiesen im Mittel
Durchmesser von 0,16 ± (0,05) µm auf. Nicht eingeschlossenes
(¹²&sup5;I]-Tyraminyl-inulin wurde entfernt, indem die extrudierten Liposomen durch
Sephadex G-50 (Pharmacia) geleitet wurden.
B. Hinsichtlich der Größe eingestellte MLVs
-
Multilamellare Vesikel-Liposomen (MLV-Liposomen) wurden gemäß
Standardverfahren hergestellt, indem ein Gemisch der Lipide in einem
organischen Lösungsmittel, das vorwiegend CHCl&sub3; enthielt, gelöst wurde und
die Lipide als dünner Film durch Rotation unter verringertem Druck
getrocknet wurden. In einigen Fällen wurde eine radioaktive Markierung für
die Lipidphase zu der Lipidlösung vor dem Trocknen gegeben. Der Lipidfilm
wurde durch Zugabe der gewünschten wäßrigen Phase und von Glaskügelchen
von 3 mm, gefolgt von einem Bewegen mit einer Vortex-Vorrichtung und
Schütteln oberhalb der Phasenübergangstemperatur der
Phospholipidkomponente für mindestens 1 Stunde, hydratisiert. In einigen Fällen wurde dem
Puffer eine radioaktive Markierung für die wäßrige Phase einverleibt. In
einigen Fällen wurde das hydratisierte Lipid wiederholt dreimal gefroren
und aufgetaut, um die nachfolgende Extrusionsstufe zu erleichtern.
-
Für die Verwendung bei den Lungenlokalisierungsversuchen wurden MLVs
nach einem von zwei speziellen Verfahren, die nachstehend beschrieben
werden, hergestellt.
-
MLV-Verfahren 1: Multilamellare Vesikel wurden durch Hydratisierung
einer von zwei Formen eines festen Lipidgemisches hergestellt: Dünnfilm
oder lyophilisierte tert.-Butanollösung. Lipidgemische wurden mit einem
oder mehreren der folgenden Bestandteile hergestellt: Partiell hydriertes
Ei-Phosphatidylcholin (PHEPC) mit einer Iodzahl von 40 (Asahi Chemical,
Japan), hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) (Avanti Polar
Liposomes, Birmingham, AL), Cholesterin (C) in USP-Qualität (Croda),
N-Carbamyl-poly-(ethylenglycolmethylether)-1,2-distearyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin, Natriumsalz (MPEG-1900-DSPE) (Chemsyn, Lenexa, Kansas).
Dünnfilme von Lipiden wurden durch Schütteln mit den Komponenten
hydratisiert. Die erhaltenen Liposomendispersionen wurden vor der
Weiterverarbeitung dreimal eingefroren und aufgetaut. Lyophilisierte Lipidgemische
wurden durch Schütteln mit der wäßrigen Phase wie vorstehend
hydratisiert. Die Extrusion erfolgte unter hohem Druck in eine Zelle aus
rostfreiem Stahl (MICO, Middleton, WI) durch Filter mit aufeinanderfolgend
kleiner definierten Poren, bis die Porengröße einen Durchmesser von 0,05
µm erreichte (Nucleopore, Pleasanton, CA) oder ein mittlerer
Teilchendurchmesser von weniger oder gleich 100 nm erreicht wurde. Diese
Teilchengrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (Coulter N4SD)
bestimmt. Phospholipidkonzentrationen wurden durch Phosphorbestimmung
gemessen (Barlett, 1959). In einigen Fällen wurden die Lipide durch
langsames Eingießen von Ethanol-Lipid-Llsungen in eine waßrige Lösung oberhalb
der Phasenübergangstemperatur der Phospholipidkomponente und Schütteln
für 60 min hydratisiert. Diese Dispersionen wurden mit einem Rannie
Minilab-8 (St. Paul, Minnesota) oberhalb der Phasenübergangstemperatur der
Phospholipidkomponente bei ausreichenden Drucken, um einen mittleren
Teilchendurchmesser von weniger oder gleich 100 nm zu erzielen,
homogenisiert. In einem Fall wurde der Homogenisierungsdruck verringert, um eine
Probe mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 nm zu erhalten.
-
In den hier beschriebenen Versuchen hatten PEG enthaltende Liposomen
typischerweise eine Zusammensetzung, die PEG-DSPE:HSPC:Cho = 0,15:1,85:1
umfaßte, was einen PEG-DSPE-Gehalt von 5 Mol-% darstellt, sofern nichts
anderes angegeben ist.
-
MIV-Verfahren 2: Hydriertes Sojabohnen-Phosphat idyl inosit (HPI),
hydriertes Sojabohnen-Phosphatidylcholin (HPC), Ei-Phosphatidylglycerin
(PG) und Ei-Phosphatidylcholin (PC) wurden von Avanti Polar Lipids Inc.
(Alabaster, AL) bezogen. Cholesterin (Chol) wurde von Sigma Chemical (St.
Louis, MO) bezogen. &sup6;&sup7;Ga-citrat und ¹¹¹In-chlorid wurden von Frosst
(Quebec, Kanada) bezogen. Deferoxaminmesylat (DF) wurde von Ciba-Geigy
(Basel, Schweiz) bezogen. Die Acetatform des AG1X2-Harzes (Acetatform,
200 bis 400 mesh) wurde von Bio-Rad (Richmond, CA) bezogen.
-
Es wurden Liposomen hergestellt, die entweder aus HPI-HPC-Chol oder
PG-PC-Chol, jeweils in einem molaren Verhältnis 1:10:5, bestanden. Eine
Lösung in Chloroform/Methanol (9/1, Vol./Vol.) des Lipidgemisches wurde
in einem Rundkolben zur Trockne eingeengt. Die Lipide wurden in 2 ml
Cyclohexan erneut gelöst und lyophilisiert. Multilamellare Vesikel, die
Desferoxamin (DF) enthielten, wurden durch Vortex-Mischen des Lipidfilms
in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 10 mM Hepes, 150 mM NaCl und 25
mM DF (pH-Wert: 7,4) gebildet. Die Lipidkonzentration betrug 100 µMol/ml.
Das Vortex-Mischen wurde für 12 Zeitspannen von 20 Sekunden bei
Raumtemperatur oder im Fall der HPI-HPC-Chol-Liposomen bei 42ºC durchgeführt.
Die Liposomen wurden 10 mal durch Polycarbonatfilter mit Poren von 0,05
µm (Nucleopore Corp.; Pleasanton, CA) unter Verwendung einer
Extrusionsvorrichtung von Lipex Biomembranes (Vancouver, Kanada) extrudiert. Zur
Größeneinstellung der HPI-HPC-Chol-Liposomen wurde die
Extrusionsvorrichtung auf 62ºC vorgeheizt. Die Liposomen wurden von nicht eingeschlossenem
DF durch Gelfiltration über eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia, Uppsala,
Schweden) mit 10 mM Hepes und 150 mM NaCl (pH-Wert: 7,4) als
Elutionspuffer getrennt. Die Phospholipidkonzentration wurde durch
Phosphatbestimmung gemessen. Die mittlere Teilchengriße wurde durch dynamische
Lichtstreuung (Malvern 4700 System, Malvern, UK) bestimmt. Als ein Maß für die
Teilchengrößenverteilung der Dispersion gibt das System einen
Polydispersitätsindex an. Dieser Index liegt Im Bereich von 0,0 für eine
monodisperse Probe bis zu 1,0 für eine vollständig polydisperse Probe. Die
mittlere Teilchengröße der verwendeten Liposomen betrug 100 ± 4 mit einem
Polydispersitätsindex von 0,13 ± 0,02 (Mittelwert ± Standardabweichung
von 9 Präparaten) für die HPI-HPC-Chol-Liposomen und 110 ± 9 nm mit einem
Polydispersitätsindex von 0,21 ± 0,07 (Mittelwert ± Standardabweichung
für 3 Präparate) für die PG-PC-Chol-Liposomen. Die maximale Lagerzeit der
Liposomen betrug 24 h bei 4ºC unter Stickstoff. Die Liposomen wurden dann
radioaktiv mit &sup6;&sup7;Ga-Deferoxamin (&sup6;&sup7;Ga-DF) gemäß der nachstehenden
Beschreibung markiert.
-
Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde die Größe der
Liposomenproben durch Extrusion durch Polycarbonatfilter mit definierten Poren unter
Verwendung von unter Druck stehendem Stickstoffgas eingestellt. Bei einem
Verfahren wurden die Liposomen einmal durch einen Filter mit Poren von
0,4 µm und dann zehnmal durch einen Filter mit Poren von 0,1 µm
extrudiert. Bei einem anderen Verfahren wurden die Liposomen dreimal durch
einen Filter mit Poren von 0,2 µm extrudiert, gefolgt von einer
wiederholten
Extrusion mit Poren von 0,05 µm, bis der mittlere Durchmesser der
Teilchen unter 100 nm gemäß Bestimmung durch DLS lag. Nicht
eingeschlossene wäßrige Komponenten wurden entfernt, indem die extrudierte Probe
durch eine Gelpermeationssäule zur Trennung der Liposomen im
Hohlraumvolumen von den kleineren Molekülen im eingeschlossenen Volumen geleitet
wurde.
C. Beladung von Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga-DF
-
Die Versuchsanleitung für die Herstellung von &sup6;&sup7;Ga-DF-markierten
Liposomen wurde auf der Grundlage bekannter Verfahren (Gabizon, 1988-1989)
angepaßt. Kurz gesagt wurden REV- oder MLV-Liposomen hergestellt, wie es
vorstehend beschrieben wurde. Der lonenchelator Desferalmesylat (DF)
wurde in die innere wäßrige Phase der Liposomen eingeschlossen und zum
irreversiblen Einfangen von &sup6;&sup7;Ga-DF in den Liposomen verwendet.
-
&sup6;&sup7;Ga-Citrat für die Injektion (Neoscan, NEN Cambridge Mass.) wurde
als eine Lösung mit 2 mCi/ml bezogen. Die Umwandlung des Citratchelats in
ein durch die Doppelschicht tretendes Oxidchelat (Hydroxychinolin)
erfolgte durch Verdünnen der Ga-Citrat-Stammlösung im Verhältnis 1:10 mit 5
mg/ml Hydroxychinolinsulfat (Sigma Chemical Co.) in 0,9% Kochsalzlösung
für die Injektion und Erwärmen auf 50ºC für 1 h. Die Erwärmungsstufe
wurde für 1 bis 2 ml Lösung in einem verschlossenen und abgedichteten, 15
ml fassenden konischen Teströhrchen in einem Bleitransportbehälter, der
auf eine Heizplatte gestellt und mit etwa 2 ml Wasser gefüllt wurde,
durchgeführt. Nach Erwärmen ließ man die Ga-Oxid-Stammlösung sich
abkühlen und lagerte sie bei Raumtemperatur in einem Bleitransportbehälter.
-
Zur &sup6;&sup7;Ga-DF-Beladung von Liposomen wurden Proben mit 5 mM
Desferoxaminmesylat (DF, Sigma Chemical, St. Louis, Mo) in 0,9%
Kochsalzlösung für die Injektion bei 100 µM Phospholipid/ml hydratisiert und
homogenisiert. Nicht eingeschlossenes DF wurde durch Dialyse oder
Gelpermeationschromatographie durch ein Anionenaustauschharz (AG1X2) entfernt. Die
Dialyse erfolgte gegen 0,9% Kochsalzlösung für die Injektion. Die
Gelpermeationschromatographie erfolgte über Säulen, die mit 0,9% Kochsalzlösung
für die Injektion voräquilibriert worden waren. Anschließend wurden die
Proben im Verhältnis 10:1 mit der Ga-Oxidlösung gemischt und dann
verschlossen, gemischt und bei 4ºC inkubiert. Die Beladung mit 0,1-3 µCi/µM
Lipid ergab gute Ergebnisse. Nicht eingeschlossene Ga-Markierung wurde
durch Dialyse oder Gelchromatographie entfernt.
D. Bestiming der Teilchengrößenverteilung der Liposomen durch
dynamische Lichtstreuung
-
Die Messungen der Teilchengrößenverteilung der Liposomen wurden
mittels DLS unter Verwendung einer Vorrichtung NICOMP Modell 200 mit einem
angeschlossenen Brookhaven Instruments BI-2030AT Autokorrelator oder
gemäß der vorstehenden Beschreibung erhalten. Die Instrumente wurden gemäß
den Anleitungen des Herstellers betrieben. Die NICOMP-Ergebnisse werden
als mittlerer Durchmesser und Standardabweichung einer Gaußschen
Verteilung der Vesikel nach dem relativen Volumen ausgedrückt.
Beispiel 5
Messung der Lebenszeit von Liposomen im Blut
A. Messung der Blutzirkulationszeit und der Blut/RES-Verhältnisse
-
Untersuchungen von Liposomen in vivo wurden in zwei verschiedenen
Tiermodellen durchgeführt: Swiss-Webster-Mäuse von jeweils 25 g und
Laborratten von jeweils 200 bis 300 g. Die Untersuchungen an Mäusen
beinhalteten die Injektion von Liposomenproben in die Schwanzvene bei 1 µM
Phospholipid/Maus, gefolgt vom Töten des Tiers nach einer festgelegten
Zeitspanne und Entfernung von Gewebe zur quantitativen Bestimmung der
Markierung in einem Szintillationszähler. Das Gewicht und der Prozentsatz
der injizierten Dosis in jedem Gewebe wurden bestimmt. Die Untersuchungen
an Ratten beinhalteten die Einführung eines permanenten Katheters in eine
Oberschenkelvene zur Entnahme von Blutproben zu definierten Zeitpunkten
nach der Injektion von Liposomenproben in einen Katheter in der anderen
Oberflächenartene bei 3 bis 4 µM Phospholipid/Ratte. Im allgemeinen
wurden die Untersuchungen an Ratten unter Verwendung von mit &sup6;&sup7;Gga-DF
beladenen Liposomen durchgeführt, und die Radioaktivität wurde unter
Verwendung eines Gammazählers gemessen. Der Prozentsatz der injizierten
Dosis, die im Blut zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 24 Stunden und in
ausgewählten Geweben nach 24 Stunden verblieb, wurde bestimmt.
B. Zeitlicher Verlauf der Liposomenretention im Blutstrom
-
PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und
1-Palmitoyl-2-oleyl-PE (POPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2
hergestellt. Das PEG-POPE-Lipid wurde mit partiell hydriertem Ei-PC (PHEPC)
bei einem molaren Verhältnis Lipid:Lipid von etwa 0,1:2 kombiniert, und
das Lipidgemisch wurde hydratisiert und durch eine 0,1
µm-Polycarbonatmembran extrudiert, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, um MLVs mit
einer mittleren Größe von etwa 0,1 um herzustellen. Die MLV-Lipide
umfaßten eine kleine Menge an radioaktiv markiertem Lipidmarker
¹&sup4;C-Cholesteryloleat
und den eingeschlossenen Marker ³H-Inulin oder &sup6;&sup7;Ga-DF, wie
es in Beispiel 4 beschrieben ist.
-
Die Liposomenzusammensetzung wurde injiziert, und der Prozentsatz
der anfänglich injizierten Dosis bei Mäusen wurde 1, 2, 3, 4 und 24
Stunden nach der Injektion bestimmt, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
Der zeitliche Verlauf des Verlustes an radioaktiv markiertem Material ist
aus Fig. 7 ersichtlich, die eine graphische Auftragung des Prozentsatzes
der injizierten Dosis für eingeschlossenes Inulin (ausgefüllte Kreise),
Inulinmarker mit Korrektur auf den Anfangsinjektionspunkt von 100% (leere
Kreise) und Lipidmarker (ausgefüllte Dreiecke) über einen Zeitraum von 24
Stunden nach der Injektion ist. Wie ersichtlich ist, zeigten sowohl Lipid
als auch eingeschlossener Marker mehr als 10% der ursprünglich
injizierten Dosis nach 24 Stunden.
C. Liposomenspiegel im Blut nach 24 Stunden
-
Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten
Dosis im Blut und der Blut/RES-Verhältnisse von liposomalern Marker 24
Stunden nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es
vorstehend beschrieben wurde. Liposomenformulierungen mit den auf der
linken Seite der nachstehenden Tabelle 3 angegebenen Zusammensetzungen
wurden hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Sofern nichts
anderes angegeben ist, handelte es sich bei dem Lipid-derivatisierten PEG
um PEG-1900, und die Liposomengröße betrug 0,1 µm. Der Prozentsatz der
Dosis, die im Blut 24 Stunden nach der intravenösen Verabreichung
verblieb, und die Blut/RES-Verhältnisse nach 24 Stunden, die gemessen
wurden, sind in der mittleren bzw. rechten Spalte der Tabelle gezeigt.
Tabelle 3
-
*Alle Formulierungen enthielten 33% Cholesterin und 7,5% geladene
Komponenten und wiesen einen mittleren Durchmesser von 100 nm auf, sofern
nichts anderes angegeben ist. PEG-DSPE bestand aus PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0;, sofern nichts
anderes angegeben ist. Die Liposomenverteilung und die Kinetik wurden
unter Verwendung von eingeschlossenem &sup6;&sup7;Ga-DF als Markierung verfolgt. Die
Injektion erfolgte IV bei Ratten, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
-
Wie ersichtlich ist, lag der Prozentsatz der Dosis, die im Blut 24
Stunden nach der Injektion verblieb, im Bereich zwischen 5 bis 40% für
Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide enthielten. Im Gegensatz dazu
blieb bei beiden Liposomenformulierungen, denen PEG-derivatisierte Lipide
fehlten, weniger als 1% Liposomenmarker nach 24 Stunden zurück. Wie
ebenfalls aus Tabelle 3 ersichtlich ist, stiegen die Blut/RES-Verhältnisse
von 0,01 bis 0,03 bei Kontroll-Liposomen auf mindestens 0,2 und auf einen
recht hohen Wert von 4,0 bei Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide
enthielten.
D. Messungen der Lebenszeit im Blut mit
Polymilchsiure-derivatisiertem PE
-
Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten
Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen
Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische
Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenforrnulierung mit der
Zusammensetzung Polymilchsäure-PE:HSPC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 oder
1:3,5:1 (Gew.-%) sind in Fig. 10A (ausgefüllte Quadrate) gezeigt. Der
Prozentsatz der zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 Minuten, ist über
24 Stunden gezeigt.
-
Diese Daten zeigen, daß die Clearance der mit Polymilchsäure
beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher
Formulierungen ohne mit Polymilchsäure derivatisiertes PE.
E. Messungen der Lebenszeit im Blut von
Polyglycolsäure-derivatisiertem PE
-
Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten
Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen
Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische
Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenformulierung mit der
Zusammensetzung Polyglycolsäure-PE:HSPC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 (Gew.-%)
sind in Fig. 10A (leere Dreiecke) gezeigt. Der Prozentsatz der
zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 min, ist jiber 24 Stunden gezeigt.
-
Diese Daten zeigen, daß die Clearance der mit Polyglycolsäure
beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher
Formulierungen ohne mit Polyglycolsäure derivatisiertes PE.
F. Messungen der Lebenszeit im Blut mit Polyvinylalkohol-PE
-
Untersuchungen zur Bestimmung des Prozentsatzes der injizierten
Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen
Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Typische
Ergebnisse mit einer extrudierten MLV-Liposomenformulierung mit der
Zusammensetzung Polyvinylalkohol-HSPE:PC:Chol im Verhältnis 2:3,5:1 oder
1:3,5:1 (Gew.-%) sind in Fig. 10B im Vergleich mit Ergebnissen von mit
Polymilchsäure und Polyglycolsäure derivatisierten Liposomen, die in den
vorstehenden Abschnitten D und E beschrieben wurden, gezeigt. Der
Prozentsatz der zurückbleibenden Dosis, normiert bei 15 min, ist über 24
Stunden gezeigt. Die Ergebnisse für die Blutverweilzeit von
Polyvinylalkohol-derivatisierten Liposomen sind ähnlich den Ergebnissen, die für
Polymilchsäure- und Polyglycolsäure-derivatisierte Spezies, wie sie
vorstehend beschrieben wurden, erzielt wurden. Diese Daten zeigen, daß die
Clearance der mit Polyvinylalkohol beschichteten Liposomen um ein
Mehrfaches langsamer ist als die von ähnlichen Formulierungen ohne mit
Polyvinylalkohol derivatisiertes PE.
Beispiel 6
Einfluß der Sättigung der Phospholipid-Acyl-Ketten auf die Blut/RES-
Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen
-
PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und
Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Die
PEG-PE-Lipide wurden mit Lipiden, die unter Sphingomyelin (SM),
vollständig hydriertem Soja-PC (PC), Cholesterin (Chol), partiell hydriertem
Soja-PC (PHSPC) und partiell hydrierten PC-Lipiden, die in Tabelle 4 als
PC IV1, IV10, IV20, IV30 und IV40 bezeichnet werden, ausgewählt waren,
formuliert. Die Lipidkomponenten wurden in den molaren Verhältnissen, die
links in Tabelle 5 gezeigt sind, gemischt und zur Bildung von MLVS, deren
Größe auf 0,1 um eingestellt wurde, wie es in Beispiel 4 beschrieben
wurde, verwendet.
Tabelle 4
Tabelle 5a
-
a Gruppen von mindestens 3 Mäusen wurden pro Versuch verwendet, sofern
nichts anderes angegeben ist, und &sup6;&sup7;Ga-DF wurde zur Verfolgung der
Liposomen verwendet.
-
b Werte mit niedriger Wiederfindung (d.h. < 40%) werden als unzuverlässig
angesehen.
-
24 Stunden nach der Injektion wurde der Prozentsatz des injizierten
Materials (gemessen als Prozentsatz an &sup6;&sup7;Ga-DF), der im Blut, in der
Leber (L) und in der Milz (S) verblieb, bestimmt, und diese Werte sind in
den beiden Datenspalten auf der linken Seite in Tabelle 5 gezeigt. Die
Werte für Blut und L+S (RES) wurden herangezogen, um den Wert Blut/RES
für jede Zusammensetzung zu berechnen. Die Spalte auf der rechten Seite
in Tabelle 5 zeigt die Gesamtmenge an wiedergefundener Radioaktivität.
Die beiden Werte mit geringer Gesarntwiederfindung in der Tabelle zeigen
eine anomale Clearance.
-
Die Ergebnisse aus der Tabelle zeigen, daß die Blut/RES-Verhältnisse
weitgehend unabhängig von der Fluidität oder dem Sättigungsgrad der
Phospholipid-Komponenten, die die Liposomen bilden, sind. Insbesondere wurde
keine systematische Änderung der Blut/RES-Verhältnisse bei Liposomen, die
größtenteils gesättigte PC-Komponenten (z.B. IV1- und IV10-PC),
größtenteils ungesättigte PC-Komponenten (IV40) und Komponenten mit dazwischen
liegendem Sättigungsgrad (z.B. IV20) enthielten, beobachtet.
-
Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der Blut/RES-Verhältnisse, die
unter Verwendung der vergleichsweise stark gesättigten
PEG-DSPE-Verbindung und der vergleichsweise stark ungesättigten PEG-POPE-Verbindung
(Beispiel 5) erhalten wurden, daß der Sättigungsgrad des derivatisierten
Lipids selbst nicht kritisch für die Fähigkeit von Liposomen ist, der
Aufnahme durch das RES zu entgehen.
Beispiel 7
Einfluß von Cholesterin und ethoxyliertem Cholesterin auf die
Blut/RES-Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen
A. Einfluß von zugegebenem Cholesterin
-
Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 wurde mit DSPE
derivatisiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die PEG-PE-Lipide wurden
mit unter Sphingomyelin (SM), vollständig hydriertem Soja-PC (PC) und
Cholesterin (Chol) ausgewählten Lipiden formuliert, wie es in der linken
Spalte der nachstehenden Tabelle 5 angegeben ist. Die drei
Formulierungen, die in der Tabelle gezeigt sind, enthalten etwa 30, 15 und 0 Mol-%
Cholesterin. Es wurden sowohl REVS (mit einer Größe von 0,3 um) als auch
MLVs (mit einer Größe von 0,1 um) hergestellt, und zwar im wesentlichen
wie in Beispiel 4 (mit eingeschlossenem Tritium-markiertem Inulin).
-
Der Prozentsatz von eingeschlossenem Inulin, das im Blut 2 und 24
Stunden nach der Verabreichung verblieb, ist auf der rechten Seite der
nachstehenden Tabelle 6 angegeben und zeigt keinen meßbaren Einfluß von
Cholesterin im Bereich von 0 bis 30 Mol-%.
Tabelle 6
B. Einfluß von ethoxyliertem Cholesterin
-
Methoxyethoxycholesterin wurde durch Kupplung von Methoxyethanol an
Cholesterin nach dem Trifluorsulfonat-Kupplungsverfahren, das in
Abschnitt I beschrieben wurde, hergestellt. PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit
einem Molekulargewicht von 1900 bestand, wurde mit DSPE derivatisiert,
wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide wurden mit
unter Distearyl-PC (DSPC), partiell hydriertem Soja-PC (HSPC), Cholesterin
und ethoxyliertem Cholesterin ausgewählten Lipiden, wie es auf der linken
Seite in Tabelle 7 angegeben ist, formuliert. Die Daten zeigen, daß (a)
ethoxyliertes Cholesterin in Kombination mit PEG-PE ungefähr den gleichen
Grad der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen im Blut wie PEG-PE allein
ergibt. Das ethoxylierte Cholesterin selbst sorgt für einen mäßigen Grad
der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen, der jedoch erheblich geringer
als der ist, für den PEG-PE sorgt.
Tabelle 1
Beispiel 8
Wirkung von geladenen Lipidkomponenten auf die Blut/RES-Verhältnisse
bei PEG-PE-Liposomen
-
Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 wurde mit DSPE
derivatisiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide,
wurden mit Lipiden, die unter Ei-PG (PG), partiell hydriertem Ei-PC
(PHEPC) und Cholesterin (Chol) ausgewählt wurden, formuliert, zu MLVs
verarbeitet und wie in Beispiel 4 auf eine Größe von 0,1 um eingestellt.
Die beiden Formulierungen wurden bei Versuchen verwendet, die in Fig. 7
zusammengefaßt sind, wobei Liposomen, die etwa 4,7 Mol-% (Dreiecke) oder
14 Mol-% (Kreise) enthielten, verglichen wurden.
-
Der Prozentsatz der injizierten Liposomen-Dosis, der 0,25, 1, 2, 4
und 24 Stunden nach der Injektion vorhanden war, ist graphisch für beide
Formulierungen in Fig. 7 aufgetragen. Wie ersichtlich ist, hatte der
Prozentsatz an PG in der Zusammensetzung einen geringen oder keinen
Einfluß auf die Liposomenretention im Blutstrom. Die Geschwindigkeit des
Verlusts von eingeschlossenem Marker, die festgestellt wird, ist
ebenfalls ähnlich zu der, die für Liposomen beobachtet wird, die auf ähnliche
Weise hergestellt wurden und kein PG enthalten.
Beispiel 9
Plasmakinetik von PEG-beschichteten und unbeschichteten Liposomen
-
Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE
(DSPE) wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit
PHEPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,15:1,85:1 formuliert.
Ein zweites Lipidgemisch enthielt die gleichen Lipide, jedoch ohne PEG-
PE. Liposomen wurden aus den beiden Lipidgemischen hergestellt, wie es in
Beispiel 5 beschrieben wurde, und zwar durch Lipidhydratisierung in
Gegenwart von Desferalmesylat, gefolgt von einer Größeneinstellung auf 0,1
µm und der Entfernung von nicht eingeschlossenem Desferal durch
Gelfiltration mit anschließender Beladung der Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga-Oxid. Das
nicht eingeschlossene &sup6;&sup7;Ga wurde während des Durchtritts durch eine
Sephadex G-50-Gelausschlußsäule entfernt. Beide Zusammensetzungen
enthielten 10 µMol/ml in 0,15 M NaCl, 0,5 mM Desferal.
-
Die beiden Liposomen-Zusammensetzungen (0,4 ml) wurden IV Tieren
injiziert, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist. Zu Zeitpunkten 0,25, 1, 3
oder 5 und 24 Stunden nach der Injektion wurden Blutproben entnommen und
auf die Menge an Inulin, die im Blut verblieb, ausgedrückt als
Prozentsatz der Menge, die unmittelbar nach der Injektion gemessen wurde,
untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 88 gezeigt. Wie ersichtlich ist,
weisen PEG-beschichtete Liposomen eine Halbwertszeit im Blut von etwa 11
Stunden auf, und nahezu 30 % des injizierten Materials ist im Blut nach
24 Stunden vorhanden. Im Gegensatz dazu zeigten unbeschichtete Liposomen
eine Halbwertszeit im Blut von weniger als 1 Stunde. Nach 24 Stunden war
die Menge an injiziertem Material nicht mehr nachweisbar (Fig. 8B).
Beispiel 10
Kultur von infektiösen Mikroorganismen
A. Klebsiella pneumoniae
-
Kulturen von K. pneumoniae (ATCC 43816, kapsularer Serotyp 2) wurden
durch Inkubation von Zellen für 16 Stunden bei 37º in Iso-Sensitest-Brühe
(Oxoid Ltd., London, Großbritannien) erhalten. Nach Verdünnen und
erneuter Inkubation für 2 h wurden Suspensionen von logarithmisch wachsenden
Bakterien für die Injektion in Tiere hergestellt.
Beispiel 11
Infektion von Ratten mit bakteriellem Pathogen
-
Weibliche Albino-Ratten Stamm R (spezifisch pathogenfrei, 14 bis 18
Wochen alt; 185 bis 215 g; Quelle: ITRI-TNO, Rkjswijk, Niederlande). Die
Ratten wurden mit Fluoanison (HypnormR, Duphar B. V., Amsterdam,
Niederlande) und Pentobarbital (Abbott Laboratories, North Chicago, IL)
anästhesiert. Der linke Hauptstamm-Bronchus wurde intubiert, und die linke
Lunge wurde mit 0,02 ml Kochsalzlösung-Suspension mit einem Gehalt an 10&sup5;
CFU K. pneumoniae inokuliert. Nach der Infektion wurde Nalorphinbromid
(Onderlinge Pharmaceutische Groothandel, Ütrecht), ein Opiat-Antagonist,
den Tieren durch Injektion gegeben.
-
Um die Schwere der Infektion zu messen, wurden Tiere getötet, und
die linken und rechten Lungen wurden getrennt entnommen, gewogen und in
20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 30 Sekunden bei 10 000
U/min in einem VirTis-Homogenisator (The VirTis Co., Gardiner, NY)
homogenisiert. Es wurde eine 10-fache Verdünnungsreihe der Hornogenisate
hergestellt. Volumina von 0,2 ml jeder Verdünnung sowie 1 ml Volumen des
unverdünnten Lungenhomogenisats wurden auf Blutagarplatten zur
quantitativen Bestimmung der Bakterien ausgestrichen. Die quantitative Bestimmung
der Anzahl der Bakterien in der linken (infizierten) und rechten (nicht
infizierten) Lunge von behandelten Ratten sowie der Anstieg des Gewichts
des infizierten Lungengewebes wurden herangezogen, um die Schwere der
Infektion zu bewerten.
Beispiel 12
Herstellung von Liposomen-Arzneistoff-Formulierungen
A. Beladung einer liposomalen Zubereitung mit Gentamicinsulfat
-
Liposomen wurden durch Dünnfilmhydratisierung hergestellt, wie es in
Beispiel 4 beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung von
Gentamicinsulfat-Konzentrationen von 20 bis 100 mg/ml und
Gesamtlipidkonzentrationen von 50 bis 300 µMol/ml. Versuche, bei denen diese Liposomen getestet
wurden, ergaben praktische Grenzen von ≤ 50 mg/ml für Gentamicin und ≤
150 µMol/ml für Lipid. Oberhalb dieser Konzentrationen wurden
nicht-liposomale Teilchen gebildet. Weitere Untersuchungen zeigten, daß die
Hydratisierung eines Lipidkuchens, der durch Lyophilisieren aus tert.-Butanol
mit wäßrigem Gentamicinsulfat erhalten wurde, bevorzugt im Hinblick auf
die offensichtliche Homogenität der anfänglichen Dispersion und die
Einfachheit der anschließenden Verringerung der Größe durch Extrusion war.
Lyophilisierter Lipidkuchen wurde weiter unter Verwendung von 1000 µMol
Lipid getestet. Diese Menge an Lipid wurde in einem Endvolumen von 10 ml
hydratisiert, was 50 mg/ml Gentamicin und 100 µMol Lipid/ml ergab.
-
Das Ausmaß der Gentamicinsulfat-Beladung unter Verwendung von
Liposomen, die nach dem Lipidkuchen-Hydratisierungsverfahren gebildet wurden,
wurde nach Gelchromatographie durch G-25 in einer Spritze oder durch eine
A15M-Säule bestimmt. Diese Ergebnisse (Tabelle 8) stellen die Beladung
der Liposomen vor der Entfernung von nicht eingeschlossenem Arzneistoff
dar. In dem gezeigten Versuch wurde die Hydratisierung der Liposomen
durch Zugabe von 10 ml isotoner Gentamicin-Lösung und 100 µMol Lipid/ml
durchgeführt. Die Hydratisierung wurde unter Verwendung von Gentamicin in
Wasser, gefolgt von einer Verdünnung mit Kochsalzlösung vor dem
zweistufigen Verfahren, durchgeführt.
Tabelle 8
Charakterisierung von Gentamicinsulfat-Proben vor der Entfernung von
freiem Arznelstoff
Tabelle 8 (Fortsetzung)
-
¹standardbedingungen: 50 mg/ml Gentamicin, 100 µMol/ml Lipid, isotone
Kochsalziösung, 1000 µMol Lipid, 10 ml.
-
²(D) = Dialyse; (G-25) = Verfahren mit kleiner Spritze, ansonsten Biogel
A15M; (N) = Nennwert.
-
³-: Entweder überstieg der für die Extrusion erforderliche Druck 900 psi,
oder es trat eine sehr starke Schaumbildung auf.
-
³(N): Nennwert, auf der Basis des eingesetzten Verhältnisses der
Komponenten; alle anderen Werte basieren auf Bestimmungen, die für die
Endprodukte durchgeführt wurden.
-
Die Ergebnisse der Variationen in der Lipidzusammensetzung sind in
Tabelle 9 angegeben. Wie gezeigt ist, wurden nur kleine Unterschiede in
der Menge an Arzneistoff, die mit den Liposomen assoziiert Ist, unter
Verwendung der angegebenen Variationen der Lipidzusammensetzung
beobachtet. Bei einem eingesetzten Verhältnis von 500 µg/µMol Arzneistoff/Lipid
lag die Menge an Arzneistoff, die gebunden oder mit dem Lipid assoziiert
war, üblicherweise nah oder über dem Minimum, das als akzeptabel
angesehen wird, nämlich 50 µg/µMol Lipid, was einen Wirkungsgrad von etwa 10%
anzeigt.
Tabelle 9
Einfluß der Lipidzusammensetzung auf die Beladung mit S-Gentamicinsulfat
-
¹Standardbedingungen: 50 mg/ml Gentamicin, 100 µMol/ml Lipid, isotone
Kochsalziösung, 1000 µMol Lipid, 10 ml.
-
²(D) = Dialyse; (G-25) Verfahren mit kleiner Spritze, ansonsten Biogel
A15M; (N) = Nennwert.
-
³-: Entweder überstieg der für die Extrusion erforderliche Druck 900 psi,
oder es trat eine sehr starke Schaumbildung auf.
-
Tabelle 10 zeigt Ergebnisse von Versuchen, bei denen der Einfluß der
Variation der Teilchengröße auf die Arzneistoffbeladung untersucht wurde.
Eine zunehmende Teilchengröße ergab nur einen kleinen Anstieg der Menge
an gebundenem Arzneistoff (Tabelle 10). Eine Erhöhung des Arzneistoff/
Lipid-Verhältnisses, das während der Liposomenbildung vorhanden war, um
einen Faktor von 2 erhöhte die Konzentration an gebundenem Arzneistoff
nicht proportional, wofür Probe 16B ein Beispiel ist. Eine Verringerung
des Verhältnisses Arzneistoff/Lipid um einen Faktor von 5 erhöhte den
Wirkungsgrad in einem gewissen Maß und ergab ein erheblich verringertes
Verhältnis gebundener Arzneistoff/Lipid. Alle diese Ergebnisse wurden bei
einer Lipid-Nennkonzentration von 100 µMol/ml erhalten.
Tabelle 10
Einfluß der Teilchengröße auf die Beladung Eit S-Gentamicinsulfat
-
*(D) = Dialyse, andernfalls Biogel A15M
-
(N) = Nennwert
B. Beladung von Liposomen mit Gentamicinchlorid
-
Gentamicinchlorid wurde durch Fällung des Sulfats aus einer
Gentamicinsulfat-Formulierung durch Zugabe von BaCl&sub2; hergestellt. Es wurde eine
Ausbeute von 90% an Gentamicin erzielt. Liposomale Gentamicin-Präparate
wurden durch Hydratisierung von lyophilisierten Kuchen aus Lipid unter
Verwendung von Gentamicinchlorid-Lösungen hergestellt, wie es in Tabelle
11 zusammengefaßt ist. Die Hydratisierung mit 25 mg/ml Gentamicinchlorid
von 100 µMol/ml Lipid ergab eine Beladung von 18% vor der Entfernung von
freiem Arzneistoff. Der Ersatz von freiem Cholesterin durch
Cholesterinsulfat ergab eine Beladung von 24% (Probe 43C). Eine Erhöhung der
Teilchengröße ergab einen geringfügigen Anstieg der Beladung vor der
Reinigung.
Tabelle 11
Charakterisierung von S-Gentamicinchlorid-Proben vor der Entfernung
von freiem Arzneistoff
-
¹Das Standardverfahren bestand in folgendem: 50 mg/ml Gentamicin-Cl,
hergestellt in isotoner Glucose bei einem pH-Wert von 5; 100 µMol/ml
Gesamtlipid, PEG-DSPE:PHEPC:C; einstufige Hydratisierung des lyophilisierten
Lipidkuchens bei Raumtemperatur. NaCSO&sub4; wurde anstelle eines Teils oder
der Gesamtmenge an C in diesen Proben eingesetzt. "Groß" bedeutet, daß
die Extrusion bis zu einer Teilchengröße ≤100 nicht möglich war und die
Ergebnisse für eine Probe mit einer Teilchengröße -150 nm angegeben sind.
-
²Durch A-15M-Gelsäule in Kochsalzlösung.
C. PEG-DSPE enthaltende Liposomen
-
MLV-Liposomen-Gentamicin-Formulierungen wurden durch Hydratisierung
eines Kuchens von Lipiden, der durch Lyophilisieren aus tert.-Butanol
erhalten wurde, mit einer wäßrigen Lösung von Gentamicin mit einem Gehalt
an Spurenmengen ¹²&sup5;I-Gentamicin hergestellt. Die Molverhältnisse des
Lipidgemisches, das zur Bildung der Liposomen verwendet wurde, waren wie
folgt: MPEG-1900-DSPE:PHEPC:Cho 5:62:33 (entsprechend 5 Mol-%
PEG-derivatisiertes DSPE). Die Endkonzentration an Gentamicin und Lipid vor der
Extrusion betrug typischerweise 50 mg/ml bzw. 100 µMol Gesamtlipid/ml.
Variationen in diesen Parametern sind mit den erhaltenen Ergebnissen
angegeben. Die hydratisierte Liposomendispersion wurde wiederholt durch
Filter mit definierten Poren (Nucleopore) extrudiert.
D. Entfernung von nicht gebundenem Gentamicin
-
Nach der Hydratisierung und Bildung der liposomalen Suspensionen
wurde nicht gebundener Arzneistoff entfernt. Eine Dialyse gegen keinen
Arzneistoff enthaltende Lösung, wie sterile Kochsalzlösung, wurde in
einigen Fällen durchgeführt. Es wurde jedoch festgestellt, daß für
Gentamicin-Lösungen die Entfernung von Gentamicin selbst nach einer
Dialysezeit von 48 Stunden unvollständig war (Tabelle 12 - Probe 665-6).
-
Das Ionenaustauschharz Dowex AG50v wurde verwendet, um absatzweise
oder in einer Säule die Entfernung von freiem Arzneistoff unter Anwendung
von Standardverfahren zu erreichen. Um den freien Arzneistoff unter
Anwendung des absatzweisen Verfahrens zu entfernen, waren im allgemeinen
zwei Behandlungen mit AG50v erforderlich.
-
Die Gelpermeation wurde unter Verwendung von BioRad 10DG- oder
Sephadex G-50-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) bewertet, wobei BioRad
10DG-Säulen für vergleichsweise kleine Probenvolumina verwendet wurden.
Das G-50-Verfahren zur Entfernung von Arzneistoff bei anschließendem
Einengen zeigte eine hervorragende Auflösung (Fig. 17) und einen hohen
Prozentsatz an gebundenem Gentamicin. Dieses Verfahren ist ein
bevorzugtes Verfahren für die Entfernung von nicht gebundenem Gentamicin.
Tabelle 12
Charakterisierung von Gentamicinsulfat-Proben nach der Entfernung von
freiem Arzneistoff
-
*Daten nicht verfügbar
-
Tabelle 13 zeigt die Verhältnisse Arzneistoff zu Lipid, die mit
Gentamicinchlorid nach der Entfernung von nicht gebundenem Arzneistoff
erzielt wurden. Im allgemeinen zeigen die Ergebnisse etwa das 2-fache des
Verhältnisses Arzneistoff/Lipid, das mit Gentamicinsulfat erzielt wurde.
Unter mehreren Bedingungen wurden Konzentrationen von 50 bis 70 µg/µMol
erzielt. Das Weglassen von Cholesterin oder sein Ersatz durch
Cholesterinsulfat
verbesserte die Arzneistoffbeladung. Ein niedrigerer pH-Wert
hemmte die Beladung.
Tabelle 13
Charakterisierung von S-Gentamicinchlorid-Proben nach der Entfernung von
freiem Arzneistoff
-
Bei den meisten Versuchen wurde die Entfernung von nicht
eingeschlossenem Gentamicin durch Gelpermeationschromatographie mit Sephadex
G-50 in einer Säule von 2,5 × 45 cm oder 1,25 × 25 cm durchgeführt.
Proben bis zu 20 ml (1/3 des Hohlraumvolumens) wurden auf die größere Säule
aufgetragen, und Proben bis zu 5 ml auf die kleinere. Nicht
eingeschlossener Arzneistoff wurde vor der erneuten Verwendung der Säule eluiert.
Die Proben wurden durch wiederholte Zentrifugation in einer Centriprep
10-Zentrifuge (Aminco, Danvers, MA) bei 3000 U/min in einem Sorval T-60-
Rotor (1600×g) für 30 min bis 1 h eingeengt.
E. Arzneistoff-Liposomen-Formulierungen für Untersuchungen in vivo
-
Die liposornalen Gentamicin-Formulierungen wurden durch Messungen der
Teilchengröße, der Lipidkonzentration und des pH-Werts nach
Standardverfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, charakterisiert. Der
Einschluß von Gentamicin wurde durch Einschluß von ¹²&sup5;I-markiertem
Gentamicin (NEN, Cambridge, MA) als Markierungssubstanz oder durch Reaktion mit
Trinitrobenzolsulfonat (TNBS), wie sie nachstehend in Beispiel 13
beschrieben wird, bestimmt.
-
Die Menge an Gentamicin, die an Liposomen gebunden war, wurde durch
Gelpermeationschromatographie unter Verwendung des Biorad A-15M-Harzes
bestimmt. Proben von 200 bis 300 µl wurden auf eine Säule von 0,5 × 30 cm
aufgetragen, die mit Kochsalzlösung äquilibriert und eluiert wurde.
Fraktionen wurden gesammelt, und die Menge an Gentarnicin, die mit den
Liposomen im Hohlraumvolumen der Säule eluiert wurde, wurde durch die Menge an
vorhandenem ¹²&sup5;I bestimmt. Der Prozentsatz an liposomalem Gentamicin
wurde aus dem Verhältnis der Markierung, die im Hohlraumvolumen eluiert
wurde, zur Gesamtmenge an Markierung, die eluiert wurde, bestimmt.
Tabelle 14
Bestimung des prozentualen liposomalen Einschlusses von Gentamicin
Beispiel 13
Lokalisierung von Liposomen in infiziertem Gewebe
A. Lokalisierung von &sup6;&sup7;Ga enthaltenden Liposomen
-
PEG-derivatisierte MLV-Liposomen wurden hergestellt, wie es
ausführlich in Beispiel 4 angegeben ist, und zwar unter Verwendung eines
Verhältnisses PEG-DSPE:PHEPL-IV40:CHO von 0,15:1,85:1. Die bei den
Untersuchungen zur Lokalisierung von Liposomen verwendeten Liposomen wurden nach
einem von zwei Verfahren hergestellt. Beim ersten wurden die Lipide in
einer Lösung aus 50% Ethanol gelöst. Eine Kochsalzlösung, die 5 mM
Desferalmesylat enthielt, wurde zu dem Gemisch unter Rühren bei
Raumtemperatur gegeben. Das Gemisch wurde homogenisiert, um Liposomen mit einem
mittleren Durchmesser von 95 oder 147 nm herzustellen. Diese Liposomen
wurden vor der Injektion mit &sup6;&sup7;Ga beladen, wie es in Beispiel 4
beschrieben ist.
-
Das zweite angewandte Verfahren zur Herstellung von &sup6;&sup7;Ga-beladenen
MLV-Liposomen zur Verwendung bei der Lokalisierung in infizierten
Bereichen war ähnlich dem in Beispiel 4 als MLV-Verfahren 1 beschriebenen
Verfahren. Die Lipide wurden in Chloroform (CHCl&sub3;) gelöst und als Dünnfilm
auf der Oberfläche eines Rundkolbens in Gegenwart von 3 mm-Glaskügelchen
unter verringertem Druck getrocknet. Nach Entfernung des restlichen
Lösungsmittels wurden die Lipide durch Zugabe einer Lösung mit einem Gehalt
an 5 mM Desferal und 5% (Gew./Vol.) Glucose bei 60a hydratisiert, gefolgt
von einem Vortex-Mischen und einem Mischen auf einer Schüttelvorrichtung
("wrist shaker") für 45 min. Das Gemisch wurde dreimal abwechselnd
gefroren (Trockeneis/Ethanol) und aufgetaut, dann durch einen
Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm extrudiert, gefolgt von einer
Extrusion durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,08 µm. Die erhaltenen
Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von 79 nm auf. Die Liposomen
wurden vor der Injektion mit &sup6;&sup7;Ga beladen, wie es in Beispiel 4
beschrieben wird.
-
Ratten wurden mit K. pneumoniae infiziert, wie es in Beispiel 11
beschrieben wird. 48 Stunden später wurden den einzelnen Ratten 5, 10, 15,
20 oder 25 µMol &sup6;&sup7;Ga-Liposomen, die in einem Volumen von 0,9 ml enthalten
waren, injiziert, und Blutproben wurden durch retroorbitale Punktion
unter CO&sub2;-Anästhesie zur quantitativen Bestimmung der Konzentrationen an
zirkulierenden Liposomen entnommen. Die Zirkulationszeit der Liposomen im
Blut und der Liposomengehalt von Leber, Milz, linker Lunge (ein Lappen),
rechter Lunge (vier Lappen) und Leber wurden unter Verwendung des &sup6;&sup7;Ga-
Desferalkomplexes mit hoher Affinität als Marker bestimmt. Eine Korrektur
um den Blutgehalt der Gewebe wurde unter Verwendung von
¹¹¹In-Oxid-markierten syngenetischen Erythrozyten (Heaton), die intravenös 10 Minuten
vor dem Ausschneiden der Gewebe injiziert wurden, durchgeführt. Die
Radioaktivität wurde quantitativ in einem gamma-Zähler (Minaxy 5530,
Packard Instruments Co., Downers Grove, USA) bestimmt. Eingeschlossenes
&sup6;&sup7;Ga diente als Marker zur Bestimmung der Verteilung von intakten
Liposomen in verschiedenen Geweben. 40 Stunden nach der Injektion zirkulierten
ungefähr 10% der injizierten Liposomen im Blut. Die Lokalisierung von
Liposomen im Lungengewebe wurde in einer Gruppe von 31 Ratten mit
variierenden Infektionsgraden bestimmt (Bakterienzahlen für die infizierte
Lunge: 10&sup5; bis 2×10¹&sup0;; Gewicht der infizierten linken Lunge: 0,45 bis 2,2
g). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Figg. 12, 13, 14,
15A, 15B, 16A und 16B erläutert.
B. Lokalisierung von Gentamicin enthaltenden Liposomen in
infizierten Geweben
-
PEG enthaltende Liposomen wurden mit Gentamicinsulfat beladen, wie
es ausführlich in Beispiel 12 angegeben ist. Gentamicin-beladene
Liposomen wurden intravenös (15 µMol Lipid) Ratten injiziert, die mit
Klebsiella 48 Stunden zuvor durch Intubation und Instillation des Inokulums
in eine Lunge infiziert worden waren, wie es ausführlich in Beispiel 11
angegeben ist. Die Blutkonzentrationen und die Anreicherung des
Arzneistoffs im infizierten Gewebe wurden durch Untersuchung der Gewebe auf den
Gentamicin-Gehalt gemessen, wie es vorstehend in Beispiel 13 beschrieben
ist. Alternativ dazu wurde die Anreicherung von Gentamicin durch
Bestimmung des Gehalts an Radioaktivität der infizierten Lunge gemessen, wenn
die liposomale Gentamicin-Formulierung Spurenmengen an radioaktiv
markierten Gentamicin enthielt. Die Ergebnisse der Untersuchungen, bei denen
die Anreicherung von Gentamicin in infiziertem Lungengewebe gemessen
wurde, sind in den Figg. 18A und 18B gezeigt.
Beispiel 14
Stabilität von PEG-derivatisierten Gentamicin-Liposomen
-
Mehrere Ansätze von PEG-derivatisierten Liposomen, die
Gentamicinsulfat enthielten, wurden nach dem Kuchenhydratisierungsverfahren, das
vorstehend ausführlich erläutert wurde, gemäß der folgenden
Zusammenfassung hergestellt: 1000 µMol Lipidkuchen wurden mit 2,5 ml
Gentamicinsulfat bei 200 mg/ml in Wasser durch Schütteln für 1 Stunde hydratisiert und
dann auf 10 ml mit isotoner Kochsalzlösung verdünnt, was 50 mg/ml
Gentamicinsulfat und 100 µMol Lipid/ml ergab. Die Dispersionen wurden
extrudiert, um eine mittleren Teilchengröße von weniger als 100 nm zu
erhalten. Der nicht eingeschlossene Arzneistoff wurde durch Gelchromatographie
entfernt, und das Gesamtvolumen wurde durch Zentrifugation in einer
Centriprep-10-Konzentrationseinrichtung verringert. Diese Zusammensetzungen
wurden bei 8ºC gelagert und im Verlauf von 2 Wochen (Tabelle 15) auf mit
Liposomen assozuertes (eingeschlossenes) Gentamicin durch Pelletieren
der Liposomen bei 200 000 × g in 7 × 20 mm-Zentrifugenröhrchen für 60
min, gefolgt von einer Untersuchung auf Gentamicin, wie es in Beispiel 13
beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß das Verhältnis
Arzneistoff zu Lipid, das nach der Reinigung mit G-50-Sephadex erzielt
wird, selbst in reinen Proben aufrechterhalten werden kann (vgl. Proben
665-16H und 16G, Tabelle 15).
Tabelle 15
Stabilität von gereinigten Gentamicinsulfat-Liposomen
-
*Probe an Tag 0 geeinigt, jedoch nicht vor Tag 2 eingeengt
oder untersucht.
Beispiel 15
Kinetik und Gewebeverteilung von Gentamicin-beladenen, PEG
enthaltenden Liposomen
-
Fig. 18A zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen, bei denen Ratten
in der linken Lunge mit K. pneumoniae zum Zeitpunkt 0 infiziert wurden,
wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, und dann 24 Stunden später (Zeit =
24) eine Injektion einer intravenösen Dosis von 15 mg/kg Gentamicinsulfat
(leere Kreise), 1,9 mg/kg Gentamicinsulfat in PEG enthaltenden Liposomen
mit Cholesterin in der Formulierung (ausgefüllte Kreise) oder 1,9 mg/kg
Gentamicinsulfat in PEG enthaltenden Liposomen ohne Cholesterin
(ausgefüllte Dreiecke) erhielten. ¹²&sup5;I-Gentamicin war in den Gentamicin-
Formulierungen enthalten. Der Gentamicin-Gehalt der infizierten Lungen
wurde durch Messung der Radioaktivität, die im infizierten Gewebe zu den
angegebenen Zeitpunkten vorhanden war, bestimmt. Fig. 18B zeigt die
gleichen Daten, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten injizierten Dosis.
Beispiel 16
Therapeutische Aktivität von Gentamicin-beladenen, PEG enthaltenden
Liposomen
-
Tabelle 16 zeigt und faßt zusammen die Ergebnisse von Versuchen, bei
denen Ratten mit K. pneumoniae in der linken Lunge infiziert wurden, wie
es in Beispiel 11 beschrieben wurde, und dann 48 Stunden später eine
Injektion von 1,9 oder 15 mg/kg Gentamicinsulfat, wie es angegeben ist,
oder einem PEG enthaltenden liposomalen Präparat von Gentamicinsulfat
erhielten. Zwei verschiedene liposomale Zusammensetzungen wurden verwendet.
Eine Zusammensetzung (PEG:PC:CH) enthielt Cholesterin (CH), während die
andere Zusammensetzung (PEG:PC) kein Cholesterin enthielt. Die ersten
drei Spalten zu jedem Zeitpunkt, die in Tabelle 16 angegeben sind,
enthalten log-Werte der koloniebildenden Einheiten (CFU) von Bakterien, die
aus den infizierten Lungen von drei einzelnen Ratten zu jedem Zeitpunkt
isoliert wurden, wobei 48 Stunden der Zeitpunkt der Injektion von
Gentamicin ist. Die vierte Spalte zu jedem Zeitpunkt enthält den mittleren log
CFU-Wert ± eine Standardabweichung für drei Messungen.
Tabelle 16
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*nicht verfügbar
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Fig. 19 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, bei dem
Ratten zum Zeitpunkt 0 infiziert wurden und ihnen dann Gentamicin als freier
Arzneistoff (1,9 mg/kg, leere Kreise) oder als eine liposomale
Zusammensetzung (1,9 mg/kg) 24 Stunden später gegeben wurde.
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Die Erfindung wurde zwar im Hinblick auf spezielle derivatisierte
Lipidverbindungen, Liposomenzusammensetzungen und die Verwendung
beschrieben und erläutert; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß eine Reihe
von Modifikationen und Änderungen gemacht werden können, ohne von der
Erfindung abzuweichen.