DE69233012T2

DE69233012T2 - Mit staphylococcus epidermidis assoziierte oberflächenantigene des typs i

Info

Publication number: DE69233012T2
Application number: DE69233012T
Authority: DE
Inventors: Ibrahim Fattom; W. Karakawa; Craig Wright
Original assignee: Univax Biologics Inc
Current assignee: Fattom Ali Ibrahim Rockville Md Us; Wright Dcraig Gaithersburg Md Us; Vaxart Inc
Priority date: 1991-11-22
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2012-11-21
Also published as: US5961975A; DE69233012D1; JP4353789B2; DK0648127T3; EP0648127A4; JP2004155789A; FI942359A0; AU681573B2; NO941877D0; FI942359A; FI111336B; WO1993009811A1; CA2123811A1; US5866140A; JPH07508498A; JP4087896B2; EP0648127B1; EP0648127A1; AU3074792A; CA2123811C

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft verschiedene Serotypen von Staphlyococcus epidermidis und ein Vakzin, das unter der Verwendung der Oberflächen-Antigene, die mit diesen Serotypen verbunden sind, hergestellt wird. Infektionen durch Koagulase-negative Staphylokokken sind die Hauptursache für Bakteriämie bei Krankenhaus-Patienten. Besonders von S. epidermidis, der offiziell nicht als ein Krankheitserreger erachtet wurde, wurde festgestellt, dass er einen bedeutsamen Faktor bei dieser Bakteriämie darstellt. Die Erkrankung und Sterblichkeit durch S. epidermidis-Infektionen ist besonders hoch unter den Patienten, die medizinische Prothesen benötigen. Es wird angenommen, dass dies auf dem von S. epidermidis produzierten Schleim beruht, der die Anheftung an und die Besiedelung von diesen medizinischen Beispielen, wie zum Beispiel Kathetern und Herzventilen, zulässt.
Weil man den Schleim für den für die Infektion durch S. epidermidis verantwortlichen Faktor hält, hat sich die Aufmerksamkeit auf diejenigen Aspekte der Oberfläche konzentriert, die die Anheftung an fremde Körper vermitteln. Ein extrazellulärer Schleim ist durch verschiedene Wissenschaftler identifiziert worden und es wurden Kultivierungsbedingungen verwendet, die die Produktion dieses Schleims fördern.
Zusätzlich zu dem Fokus auf den durch S. epidermidis produzierten Schleim ist die Wissenschaft bis heute im wesentlichen auf eine begrenzte Anzahl von bestimmten Bakterienstämmen, die isoliert wurden, ausgerichtet. Ichiman et al. haben drei S. - epidermidis- Stämme untersucht, die sie in Brain-Heart-Infusion (BHI)-Nährlösung kultiviert haben. Die Immunisierung von Mäusen mit Zelloberflächen-Polysacchariden dieser kultivierter Organismen war jedoch unwirksam bei der Vermittlung von Schutz gegen heterologe Stämme. Die Charakterisierung der isolierten Oberflächen-Polysaccharide ergab eine serologische Heterogenität. Ichiman et al., J. Appl. Bact. 51 : 229 : 241 (1981). Zelloberflächen-Antigene vom Typ I, II und III von den S. epidermidis-Stämmen ATCC31432, SE-360 und SE-10 sind in der früheren Fachliteratur beschrieben (Ichiman et al., J. Appl. Bact. 63 : 1987, 165-169; Ichiman et al., Can. J. Microbiol. 37/5, 05/1991, 404- 407, Ichiman et all, J Appl. Bact. 71 : 1991, 176-181 und US-A-4197290), genauso wie ein Adhäsin, das von dem S. epidermidis-Stamm RP-62A isoliert wurde (US-A-5055455).
Um gemäß Ichiman ein wirksames Vakzin für die klinische Anwendung zu sein, müsste jeder infektiöse Stamm isoliert und ein Vakzin gegen jeden Stamm entwickelt werden. Dies wäre vom praktischen Standpunkt gesehen unhaltbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein wirksames Vakzin gegen S. epidermidis- Infektionen für die klinische Anwendung bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Vakzin, das gegen die meisten klinisch pathogenen S. epidermidis-Stämme wirksam ist, bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, polyklonale Antiseren herzustellen, die spezifisch für die Oberflächen-Antigene sind, die mit klinischen S. epidermidis-Isolaten assoziiert sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, monoklonale Antikörper gegen die Oberflächen-Antigene bereitzustellen, die mit den vorherrschenden Serotypen der klinischen S. epidermidis-Stämme assoziiert werden, die für den Schutz vor oder für die Behandlung von S. epidermidis-Infektionen verwendet werden können.
Es ist eine weiter Aufgabe der Erfindung, hyperimmunes IVIG zum Schutz vor oder zur Behandlung von S. epidermidis-Infektionen bereitzustellen.
Diese und andere erfindungsgemäße Aufgaben werden durch eine Zusammensetzung erreicht, die im wesentlichen aus mindestens einem Oberflächen-Antigen vom Typ I von S. epidermidis besteht. Ein Vakzin, das diese Zusammensetzung enthält, und ein steriler, pharmazeutisch annehmbarer Träger werden ebenfalls bereitgestellt. Eine immunstimulatorische Menge dieses Vakzins kann einer Person verabreicht werden. Diese Person kann schon mit S. epidermidis infiziert sein, wenn das genannte Vakzin verabreicht wird. Als Alternative kann das Vakzin einer Plasma-gebenden Person verabreicht werden, wodurch die Person angeregt wird, ein Hyperimmunglobulin zu produzieren, das gegen S. epidermidis gerichtete Antikörper enthält. Eine immunstimulatorische Menge dieses Hyperimmunglobulins kann dann einer Person verabreicht werden.
Erfindungsgemäß wird auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, die im wesentlichen aus Antikörpern besteht, die Oberflächen-Antigene vom Typ I binden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Antikörper nicht durch ein Verfahren erhalten, das den Schritt der Bereitstellung einer biologischen Probe von einer mit S. epidermidis infizierten Person beinhaltet. Die erfindungsgemäße Antikörper-Zusammensetzung kann eine Zusammensetzung monoklonaler Antikörper sein. Immunstimulatorische Mengen von Antikörper- Zusammensetzungen, im besonderen von Zusammensetzungen monoklonaler Antikörper, können entsprechend der Erfindung einer Person verabreicht werden, um eine S. epidermidis- Infektion zu verhindern oder zu behandeln.
Andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden. Es sollte jedoch klar sein, dass die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, nur zur Illustration gegeben werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Umfangs der Erfindung Fachleuten aus dieser detaillierten Beschreibung ersichtlich werden werden.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass bei der Kultivierung von S. epidermidis unter Bedingungen, die die Schleimbildung minimieren und die Produktion von Kapsel-Polysacchariden erhöhen, eine begrenzte Anzahl von Serotypen identifiziert werden kann, die den meisten klinischen Fällen von S. epidermidis gemein sind. Im besonderen ist gefunden worden, dass mehr als 85% der klinischen Isolate einen oder zwei vorherrschende Serotypen zeigen, die mit Typ I bzw. Typ II bezeichnet wurden. Es wurde festgestellt, dass die Oberflächen-Antigene, die für die zwei Serotypen verantwortlich sind, saure Polysaccharide sind, die Aminouronsäuren und andere Aminozucker enthalten. Diese Polysaccharide sind negativ geladen und wandern in einer Gegenstrom-Immunelektrophorese zum positiven Pol. Sie sind auch Typ-spezifisch, das heißt, eine Immunpräzipitation ergibt nur mit dem Antiserum des homologen Typs eine einzelne Bande.
Die sauren Polysaccharid-Antigene, die mit jedem Serotyp verbunden sind, können in wiedergewinnbaren Mengen in im wesentlichen reiner Form von S. epidermidis-Isolaten erhalten werden, die entsprechend der hier beschriebenen Protokolle kultiviert, serotypisiert und gereinigt wurden. Im besonderen enthält das gereinigte Antigen weniger als 1% Protein und weniger als 1% Nukleinsäuren. Eine "wiedergewinnbare" Menge in dieser Hinsicht bedeutet, dass die isolierte Menge des sauren Polysaccharids durch eine Methodik, die weniger sensitiv als eine radioaktive Markierung ist, beispielsweise durch einen Immungssay, feststellbar ist und weiteren Manipulationen, was eine Überführung der sauren Polysaccharide per se in eine Lösung einbezieht, ausgesetzt werden kann.
Eine Zusammensetzung der sauren Polysaccharid-Antigene besteht im wesentlichen aus einem oder beiden der sauren Polysaccharid-Antigene vom Typ I bzw. Typ II. Das heißt, eine solche Zusammensetzung darf nicht irgendein Material enthalten, das die Erzeugung einer Immunantwort auf die Epitope der sauren Polysaccharide stört, wenn diese einer Person als Vakzin verabreicht werden.
Serotypen von S. epidermidis können in klinischen Isolaten identifiziert werden, die auf einem Medium gewachsen sind, das so gut wie möglich in vivo-Bedingungen nachstellt. Vor allem sollte dieses Medium eine Umgebung bereitstellen, in dem die Menge des verfügbaren Phosphats niedrig ist. Ein solches Medium minimiert die Schleimproduktion durch die Bakterien und erhöht die Produktion von Kapsel-Polysacchariden, besonders der erfindungsgemäßen sauren Polysaccharide. Dies ist in einem deutlichen Gegensatz zu BHI- Nahrlösung und "tryptic soy broth" (TSP), die Medien, die gewöhnlich bei Untersuchungen von S. epidermidis verwendet werden und die eine hohe Menge an verfügbarem Phosphat, etwa 2,5 mg Phosphat/ml, enthalten. Diese Medien erhöhen die Schleimproduktion. Wenn S. epidermidis auf einem Medium, das in vivo-Bedingungen simuliert, angezogen wurde, wird er Oberflächen-Antigene produzieren, die sich nicht an Glas oder Plastik anheften. Das erfindungsgemäß bevorzugte Medium ist eine modifizierte Columbia-Nährlösung (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), ein Medium, in dem die Menge an verfügbaren Phosphat 76 ug/ml beträgt. Ein solches Medium stellt die bei Menschen in vivo vorhandene Menge an verfügbarem Phosphat nach, die etwa 23-46 ug/ml beträgt. Es wird wenig oder kein Schleim produziert, wenn S. epidermidis in diesem Medium angezogen wird.
Polysaccharide können sowohl aus den Zellen, als auch aus dem Überstand der klinischen Isolate von S. epidermidis, die auf Columbia-Nährlösung angezogen wurden, extrahiert werden. In einem ersten Schritt werden die Kulturen zentrifugiert und die Zellen und die Überstände in Pools vereinigt.
Das Polysaccharid kann aus dem Überstand extrahiert werden, indem der Überstand konzentriert, mit Wasser gewaschen und dann der Reihe nach konzentriert wird. Der letztendliche Niederschlag wird in Wasser gelöst, dialysiert und lyophilisiert.
Um die Polysaccharide aus den Zellen zu extrahieren, werden sie zuerst mit Enzymen, Lysostaphin oder Lysozym, aufgebrochen und dann zentrifugiert. Der Überstand wird gefällt und dann zentrifugiert. Der Überstand wird der Reihe nach konzentriert, inkubiert und dann durch Zentrifugation sedimentiert. Der Niederschlag wird wieder in Wasser gelöst, dialysiert und lyophilisiert.
Als andere Möglichkeit wird das lyophilisierte Material mit Trichloracetat extrahiert und dann zentrifugiert. Die anschließende Fällung mit Ethanol wird gefolgt durch Lösung in destilliertem Wasser, Dialyse und Lyophilisierung.
Die Rohextrakte aus Zellen und Überständen werden weiter bearbeitet. In jedem Fall wird das lyophilisierte Material in Puffer gelöst und auf eine Trennsäule aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde. Die Säule wird mit Ladepuffer gewaschen und dann mit einem Salzgradienten eluiert. Die das Antigen enthaltenden Fraktionen werden in Pools vereinigt, konzentriert, dialysiert und lyophilisiert. Die Auftrennung kann wiederholt werden, um eine bessere Aufreinigung zu erhalten. Die Größe des gereinigten Polysaccharids kann auf einer geeigneten Säule bestimmt und die Fraktionen dann in Pools vereinigt, konzentriert, dialysiert und lyophilisiert werden.
Die vorherrschenden Serotypen von S. epidermidis werden anfänglich identifiziert, indem zwei Isolate aus einer Gruppe von fünf bis zehn S. epidemidis-Isolaten ausgewählt werden, die aus Krankenhäusern verschiedener geographischer Standorte erhalten wurden. Kaninchen- Antiseren werden mit jedem dieser zwei Isolate hergestellt, unter der Verwendung eines Immunisierungsprogramms wie demjenigen, das in McCarty und Lancefield beschrieben ist. J. Exp. Med. 102: 11-28 (1955). Die Antiseren werden mit Hilfe eines kapselfreien S. epidermidis-Stamm absorbiert. Nötigenfalls können zusätzliche Absorptionsschritte durchgeführt werden, um die Entfernung der Aktivitäten gegen andere Serotypen sicherzustellen.
Die zwei Antiseren werden verwendet, um die anderen, nicht ausgewählten Isolate von S. epidermidis zu typisieren. Wenn die ersten zwei ausgewählten Isolate vom gleichen Typ sind, wie es durch identische Reaktionsmuster mit den anderen Isolaten bewiesen wird, wird ein zusätzliches Isolat aus der Gruppe von Isolaten ausgewählt, die nicht mit den ersten zwei ausgewählten Isolaten reagieren. Kaninchen-Antiseren werden gegen dieses Isolat hergestellt, welches dann auf die Reaktion mit den restlichen Isolaten gestestet wird. Diese Vorgehensweise wird fortgesetzt bis die vorherrschenden Serotypen von S. epidermidis identifiziert sind. Überraschenderweise ist festgestellt worden, dass etwa 85% der klinischen Fälle von S. epidermidis zu einem der zwei Serotypen gehören, dem, der mit Typ I bezeichnet ist.
Für nachfolgende Serotypisierung werden Typ-spezifische polyklonale Antikörper aus Kaninchen hergestellt, die mit einem Ganzzell-Vakzin, hergestellt aus einem identifizierten Isolat vom Typ I, immunisiert wurden. Repräsentative S. epidermidis-Organismen vom Typ I sind am 19. November 1991 in der American Type Culture Collection in Rockville, Md, deponiert worden und haben die Zugangsnummern 55254 bzw. 55253 erhalten. Die Klassifizierung von Isolaten in Serotypen kann unter der Verwendung von Antiseren von Isolaten vom Typ I mithilfe von bakteriellen Verklumpungstests durchgeführt werden, wie früher für S. aureus beschrieben. Nelles et al., Infect. Immun. 46 : 14-18 (1985).
Zur Serotypisierung werden die Zellen in Columbia-Nährlösung unter CO&sub2;-Druck angezogen. Die Zellen werden von den Platten in Phosphat-gepufferte Saline (PBS) entfernt. Protease wird zugegeben, um die vorliegende etwas klebrige Suspension aufzulösen, wodurch eine gleichmäßige Zell-Suspension entsteht.
Nach dem enzymatischen Zellaufschluss werden die Polysaccharid-Kapseln zur Vorbereitung der Verklumpungstests an der Zelloberfläche verankert. Die verankerten Zellen werden zentrifugiert und in frischem PBS resuspendiert. Dann werden die mit Antiseren gegen Typ I auf einer Mikrotiter-Platte oder in einem Verklumpungstest auf einem Glas-Objektträger serotypisiert. Jedes der Serotypen vom Typ I hat ein bestimmtes Oberflächen-Antigen, das mit ihm assoziiert ist. Das Oberflächen-Antigen wird durch die Kaninchen-Antiseren erkannt. Ein bestimmter Prozentsatz der Isolate ist nicht typisierbar in Bezug auf den Anteil der Antiseren, die gegen das Isolat vom Typ I hergestellt wurden. Die mit Typ I und Typ II assoziierten Oberflächen-Antigene sind in kapselfreien Isolaten nicht vorhanden, die stattdessen durch Teichonsäuren bedeckt sind. Sie können durch Autoklavieren entfernt oder beschädigt werden, was einen Verlust der Reaktivität mit den spezifischen Antiseren verursacht. Oberflächen-Antigene vom Typ I kreuzreagieren nicht mit Oberflächen-Antigenen vom Typ II und umgekehrt. In vitro-Phagozytosetests weisen darauf hin, dass Antikörper gegen jedes dieser Oberflächen-Antigene Schutz bieten gegen eine Infektion durch die Stämme von S. epidermidis mit den entsprechenden Serotypen. Ein auf diesen zwei Serotypen basierendes Vakzin kann verwendet werden, um gegen eine Infektion durch einen Großteil der klinischen S. epidermidis-Stämme zu schützen.
Polysaccharide selbst sind generell schwache T-Zell-unabhängige Immunogene in Menschen, besonders in Patienten mit reduzierter Resistenz. Daher ist es vorzuziehen, das Polysaccharid mit einem Immunträger, üblicherweise ein Polypeptid oder Protein, zu konjugieren, was für eine wirksame Interaktion zwischen T- und B-Zellen zur Induktion einer Immunantwort gegen ein schwaches Immunogen entscheidend ist. Ein Immunträger erhöht also die Immunogenität sowohl für eine aktive Immunisierung, als auch für die Herstellung von Antiseren mit hohem Titer in Freiwilligen zur passiven Immunisierung. Entsprechend der Erfindung besonders bevorzugte Immunträger umfassen Tetanus-Toxoid, Diphterie-Toxoid, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A oder seine Derivate, und andere Proteine, die gemeinhin als Immunträger verwendet werden. Oberflächen-Antigene sowohl vom Typ I, als auch vom Typ II können an den gleichen Immunträger gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Typ I-Serotyp entsprechenden Polysacchariden, um Antiseren oder monoklonale Antikörper (von Maus oder Mensch) herzustellen, die an Bakterien mit diesem Serotyp binden oder sie neutralisieren. Protokolle zur Herstellung dieser Antikörper sind beschrieben in Ausubel et al. (eds.), Kapitel 11; in METHODS OF HYBRIDMA FORMATION 257-71, Bartal und Hirshaut (eds.), Humana Press, Clifton, NJ (1988); in Vitetta et al., Immunol. Rev. 62 : 159-83 (1982), und in Raso, Immunol. Rev. 62: 93-117 (1982).
Impfmaterialien für die Produktion polyklonaler Antikörper werden typischerweise hergestellt, indem die Polysaccharid-Immunträger in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Saline oder anderen Hilfsmitteln, die für den Gebrauch in Menschen geeignet sind, aufgelöst werden, um eine wässrige Zusammensetzung zu erhalten. Eine immunstimulatorische Menge des Impfmaterials wird einem Säuger verabreicht und das inokulierte Säugetier wird für die Länge eines Zeitraums gehalten, die für die Polysaccharid-Oberflächen-Antikörper ausreichend ist, um schützende anti-Typ I-Antikörper zu induzieren.
Antikörper können Antiserum-Präparationen von einer Vielzahl gewöhnlich verwendeter Tiere umfassen, zum Beispiel von Ziegen, Primaten, Affen, Schweinen, Kaninchen, Pferden, Hühnern, Meerschweinchen, Ratten oder Mäusen, und sogar menschliche Antiseren nach der geeigneten Auswahl und Reinigung. Die Antiseren werden gewonnen, indem man die Tiere mit durch Formalin abgetöteten S. epidermidis vom Typ I durch herkömmliche Verfahren inokuliert, ausbluten lässt und das Serum zurückerlangt.
Die auf diese Weise induzierten Antikörper können in dem erwünschten Umfang durch allgemein bekannte Techniken, wie zum Beispiel durch Immunaffinitäts-Chromatographie, geerntet und isoliert werden; d. h., indem das Antigen an eine chromatographische Säule gepackt wie SephadexTM gebunden wird, das Antiserum durch die Säule laufen gelassen wird, wobei die spezifischen Antikörper zurückgehalten und andere Immunglobuline und Verunreinigungen abgetrennt werden, und schließlich die gereinigten Antikörper durch eine Elution mit einem chaotropen Mittel zurückerhalten werden, gegebenenfalls gefolgt durch eine weitere Reinigung, zum Beispiel durch eine Passage durch eine Säule mit gebundenen Blutgruppen-Antigenen oder anderen nicht-pathogenen Spezies. Dieses Verfahren kann bevorzugt werden, wenn die gewünschten Antikörper aus dem Serum von Patienten isoliert werden, die Antikörper gegen das fragliche Pathogen entwickelt haben, was das Zurückhalten der Antikörper sicherstellt, die zur Bindung an das Oberflächen-Antigen befähigt sind. Sie können dann in Präparationen zur passiven Immunisierung gegen S. epidermidis verwendet werden.
Eine Zusammensetzung von monoklonalen Antikörpern enthält in feststellbaren Menge nur eine Spezies von Antikörpern, die eine Stelle aufweisen, die wirksam an die Polysaccharid- Oberflächen-Antigene vom Typ I binden kann. Geeignete Antikörper in monoklonaler Form können unter der Verwendung herkömmlicher Hybridom-Techologien hergestellt werden.
Um Hybridome zu bilden, aus denen eine erfindungsgemäße Zusammensetzung mit monoklonalen Antikörpern hergestellt wird, wird ein Myelom oder eine andere selbstaufrechterhaltende Zelllinie mit Lymphozyten fusioniert, die aus dem peripheren Blut, Lymphknoten oder der Milz eines Säugers erhalten werden, die mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid hyperimmunisiert wurde. Es ist bevorzugt, dass die Myelom-Zelllinie von der gleichen Spezies wie die Lymphozyten stammt. Milzzellen werden typischerweise mit Myelom-Zellen unter der Verwendung von Polyethylenglykol 1500 fusioniert. Fusionierte Hybride werden aufgrund ihrer Sensitivität gegen HAT ausgewählt. Hybridome, die die erfindungsgemäßen Antikörper-Moleküle sekretieren, können mit Hilfe eines ELISA identifiziert werden.
Eine Balb/C-Milz von Maus, menschliches peripheres Blut, Lymphknoten oder Milzzellen sind die bevorzugten Materialien für den Gebrauch bei der Herstellung von Hybridomen von Maus und Mensch. Geeignete Maus-Myelome zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensitiven (HAT) Zelllinien, wobei eine bevorzugte Zelllinie P3X63-Ag8.653 ist. Der bevorzugte Fusionspartner für die Herstellung menschlicher, monoklonaler Antikörper ist SHM-D33, ein Heteromyelom, das von ATCC, Rockville, Md. mit der Bezeichnung CRL 1668 erhältlich ist. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung von monoklonalen Antikörpern kann hergestellt werden, indem eine monoklonale Hybridom-Kultur angesetzt wird, die ein Nährmedium umfasst, das ein Hybridom enthält, das Antikörper-Moleküle der geeigneten Poylpeptid-Spezifität sekretiert. Die Kultur wird unter Bedingungen und für die Länge eines Zeitraums gehalten, die für die Hybridome ausreichend sind, um die Antikörper-Moleküle in das Medium zu sekretieren. Das die Antikörper enthaltende Medium wird dann gesammelt. Die Antikörper-Moleküle können dann durch allgemein bekannte Technologien weiter isoliert werden.
Medien, die für die Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind sowohl im Gebiet weit verbreitet, als auch kommerziell erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzucht-Mäusen und ähnliche. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbeccos minimal-erforderliches Medium, das mit 4,5 g/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20% Kälberfötenserum versetzt wird. Ein beispielhafter Inzucht-Mausstamm ist Balb/c.
Andere Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen mit monoklonalen Antikörpern, wie zum Beispiel Interspezies-Fusionen, werden auch in Betracht gezogen, da es in erster Linie die Spezifität der Antikörper für das Antigen ist, die sich auf ihre Verwendbarkeit in der vorliegenden Erfindung auswirkt. Menschliche Lymphozyten, die von infizierten Individuen erhalten wurden, können mit einer menschlichen Myelom-Zelllinie fusioniert werden, um Hybridome herzustellen, die auf die Produktion von Antikörpern untersucht werden können, die Oberflächen-Antigene vom Typ I erkennen. In dieser Hinsicht ist jedoch ein Verfahren mehr bevorzugt, das nicht den Gebrauch einer biologischen Probe von einem infizierten Menschen erforderlich macht. Zum Beispiel kann eine Person, die mit einem Vakzin, wie es hier beschrieben ist, immunisiert wurde, als eine Quelle fir Antikörper dienen, die in einer Antikörper-Zusammensetzung innerhalb der vorliegenden Erfindung geeignet verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden monoklonale Antikörper gegen Oberflächen-Antigene vom Typ I unter der Verwendung von Verfahren hergestellt, die ähnlich zu denen sind, die für Typ-spezifische monoklonale Antikörper von S. aureus beschrieben wurden. Die gereinigten Antikörper wurden durch bakterielle Verklumpungstests unter der Verwendung einer Sammlung klinischer Isolate charakterisiert.
Zusammensetzungen von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die der vorliegenden Beschreibung entsprechend hergestellt wurden, können verwendet werden, um eine Immunantwort zur Vorbeugung oder Behandlung von S. epidermidis-Infektionen vom Typ I zu induzieren. In dieser Hinsicht können die Antikörper-Präparate eine Zusammensetzung mit polyklonalen Antikörpern sein. Eine solche Zusammensetzung mit polyklonalen Antikörpern kann Antikörper umfassen, die sowohl an Typ I, als auch an Typ II binden, oder kann Antikörper umfassen, die nur an Typ I binden. Der Anteil, der aus polyklonalen Antikörpern besteht, kann ein vorzugsweise affinitätsgereinigtes, polyklonales Antiserum von einem Tier sein, das Oberflächen-Antigenen sowohl vom Typ I, als auch vom Typ II ausgesetzt war und daher zur Produktion von spezifischen Antikörpern gegen die Oberflächen-Antigene sowohl vom Typ, als auch vom Typ II angeregt wurde. Eine weitere Möglichkeit ist es, ein "konstruiertes polyklonales" Gemisch zu verwenden, welches ein Gemisch von monoklonalen Antikörpern gegen das Oberflächen-Antigen vom Typ I und von monoklonalen Antikörpern gegen das Oberflächen-Antigen vom Typ II ist.
Bei beiden Typen polyklonaler Gemische kann es von Vorteil sein, polyspezifische Antikörper untereinander chemisch zu verknüpfen, um ein einzelnes polyspezifisches Molekül zu erhalten, das jedes Oberflächen-Antigen binden kann. Ein Weg, eine solche Verknüpfung zu bewirken, ist es, bivalente F(ab')2-Hybridfragmente herzustellen, indem zwei verschiedene F(ab')2-Fragmente, die zum Beispiel durch einen Pepsin-Verdau von zwei verschiedenen Antikörpern entstanden sind, gemischt werden, und eine reduktive Spaltung durchgeführt wird, um ein Gemisch von Fab'-Fragmenten zu erhalten. Dies wird gefolgt durch eine oxidative Reformierung der Disulfid-Brückenbindungen, um ein Gemisch von F(ab')2- Fragmenten zu erhalten, die Hybridfragmente umfassen, die jeweils einen Fab'-Anteil enthalten, der für jedes der ursprünglichen Antigene spezifisch ist. Verfahren zur Herstellung solcher Hybridantikörperfragmente werden offenbart in Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE 321-23, McGraw-Hill Int'1 Book Co. (1978); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 93 : 470 (1961); und Hammerling et al., 1 Exp. Med. 128 : 1461 (1968); und in US-Patent Nr. 4331647.
Ein erfindungsgemäß hergestellter Antikörper-Anteil kann ganze Antikörper, Antikörper- Fragmente oder -Subfragmente umfassen. Antikörper können ganze Immunglobuline (IgG) jeder Klasse, beispielsweise IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, chimäre Antikörper oder Hybrid- Antikörper mit einer doppelten Oberflächen-Antigen-Spezifität sein, oder Fragmente, beispielsweise F(ab')&sub2;, Fab', Fab und ähnliche, einschließlich Hybrid-Fragmente, und umfasst zusätzlich jedes Immunglobulin oder jedes natürliche, synthetische oder genetisch konstruierte Protein, das wie ein Antikörper durch die Bindung an ein spezifisches Antigen agiert, um einen Komplex auszubilden. Besonders Fab-Moleküle können in einem genetisch transformierten Wirt wie E. coli exprimiert und zusammengesetzt werden. Ein Lambda-Vektorsystem ist erhältlich, um damit eine Fab-Population mit einer möglichen Diversität zu exprimieren, die gleich ist oder höher als bei der Person, die den Vorläufer-Antikörper generiert hat. Siehe Huse, W. D., Science 246: 1275-81 (1989).
Das saure Polysaccharid-Antigen, das mit dem Typ I verbunden ist, kann der aktive Bestandteil einer Zusammensetzung sein, die weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für den aktiven Bestandteil enthält, welches als ein Vakzin verwendet werden kann, um eine zelluläre Immunantwort und/oder die in vivo-Produktion von Antikörpern zu induzieren, die eine S. epidermidis-Infektion zu bekämpfen. In dieser Hinsicht ist ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ein Material, das als ein Vehikel zur Verabreichung eines Medikaments verwendet werden kann, weil das Material in dem Zusammenhang der Verabreichung des Vakzins inert oder ansonsten medizinisch annehmbar ist, und darüber hinaus verträglich mit dem aktiven Polypeptid. Zusätzlich zu einem geeigneten Lösungsmittelträger kann ein pharmazeutisch annehmbarer Träger herkömmliche Vakzin-Additive wie Verdünnungsmittel, Hilfsmittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel und lösende Mittel enthalten.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann ein solches Vakzin einer noch nicht mit S. epidermidis infizierten Person verabreicht werden, wobei eine (humorale oder zelluläre) Antwort auf die entsprechenden Serotypen der Bakterien in dieser Person induziert werden. Alternativ kann ein Vakzin einer Person erfindungsgemäß verabreicht werden, bei der die S. epidermidis-Infektion bereits stattgefunden hat, aber sich in einem ausreichend frühen Stadium befindet, dass die als Antwort auf das Vakzin hergestellten Antikörper die weitere Verbreitung der Infektion wirksam unterdrücken.
In einem anderen Ansatz kann das erfindungsgemäße Vakzin einer Person verabreicht werden, die daraufhin als Quelle für Globulin fungiert, das als Antwort auf die Herausforderung durch das spezifische Vakzin ("Hyperimmunglobulin"), das gegen S. epidermidis gerichtete Antikörper enthält, hergestellt wird. Eine auf diese Weise behandelte Person würde Plasma zur Verfügung stellen, aus welchem dann über eine herkömmliche Plasma-Fraktionierungs-Methodik Hyperimmunglobulin erhalten werden und einer anderen Person verabreicht werden würde, um eine Resistenz gegen eine S. epidermidis-Infektion zu vermitteln oder sie zu behandeln.
Die Induktion einer Bakteriämie in Säugern benötigt eine extrem hohe Anzahl an Organismen oder einige andere vorherige Vorfälle, um die Resistenz des Wirtes herabzusetzen. Jedoch kann in vio-o-Phagozytose untersucht werden, um sie mit einer schützenden Immunität in vivo in Beziehung zu setzen. In diesem Modell wird mit Hilfe von Phagozytose die Fähigkeit von Typ-spezifischen monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gemessen, S. epidermidis in vitro zu opsonieren, entsprechend des Verfahrens beschrieben in Kojima et al., J. Infect. Dis. 162: 435-551 (1990) und Fattom et al., Infect. Immun. 58: 2367- 2374 (1990). Durch Vakzine vom Typ I induzierte Antikörper erleichtern Typ-spezifische Phagozytose. Die vorliegende Erfindung ist weiter beschrieben durch die Erwähnung der folgenden veranschaulichenden Beispiele.

Beispiel 1: Sammlung von S. epidermidis-Stämmen

Klinische S. epidermidis-Isolate wurden aus Krankenhäusern an verschiedenen geographischen Standorten erhalten. Alle Isolate waren Isolate aus Blut. Die Identifizierung der Isolate als S. epidermidis wurde bestätigt. In den meisten Fällen stellte das Krankenhaus eine Zusammenfassung des Infektionsverlaufs und des Ergebnisses der Behandlung zur Verfügung, als auch die Resultate der biochemischen Identifikation und die Bestimmungen der antimikrobiellen Sensitivität.

Beispiel 2: Anzucht von S. epidermidis-Stämmen

Die Isolate wurden auf Platten mit Columbia-Agar (Difco), versetzt mit 4% NaCl, bei 37ºC unter CO&sub2;-Druck angezogen. Eine isolierte Kolonie wurde in eine 500 ml-Flasche mit Columbia-Nährlösung (Difco), versetzt mit 4% NaCl gegeben. Nach der Anzucht für drei bis fünf Stunden wurde jede von sechs 2-Liter-Fernbach-Flaschen, die 1, 2 Liter Columbia-Salz- Nährlösung enthalten, mit je 50 ml der Start-Kultur beimpft. Die Fernbach-Flaschen wurden auf einem Brunswick-Schüttler über Nacht bei 37ºC angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 10000 g für 30 Minuten geerntet und die Überstände und Zellen in Pools vereinigt.

Beispiel 3: Identifizierung der vorherrschenden Serotypen von S. epidermidis

Fünf bis zehn S. epidermidis-Isolate werden von verschiedenen Krankenhäusern erhalten, in Columbia-Nährlösung wachsengelassen und wie in Beispiel 2 geerntet. Zellen von zwei dieser Isolate werden in 1% Formalin fixiert. Das Immunisierungsprogramm von McCarty und Lancefield, siehe oben, wird verwendet, um Kaninchen-Antiseren, die spezifisch gegen jedes der ausgewählten Isolate sind, herzustellen. Die Antiseren werden mit einem kapselfreien S. epidermidis-Stamm absorbiert. Nötigenfalls werden weitere Absorptionen durchgeführt, um das Entfernen der Aktivität gegen andere Serotypen sicherzustellen.
Die zwei Antiseren werden verwendet, um die anderen, nicht ausgewählten Isolate von S. epidermidis zu typisieren. Wenn die ersten zwei ausgewählten Isolate vom gleichen Typ sind, wie es durch identische Reaktionsmuster mit den anderen Isolaten bewiesen wird, wird ein zusätzliches Isolat aus der Gruppe von Isolaten ausgewählt, die nicht mit den ersten zwei ausgewählten Isolaten reagieren. Kaninchen-Antiseren werden gegen dieses Isolat hergestellt, welches dann auf die Reaktion mit den restlichen Isolaten gestestet wird. Diese Vorgehensweise wird fortgesetzt bis die zwei vorherrschenden Serotypen von S. epidermidis identifiziert sind. Diese zwei Serotypen sind für etwa 85% der klinischen Isolate verantwortlich. (Siehe Tabelle 1 in Beispiel 7).

Beispiel 4: Herstellung von Typ I- und Typ II-spezifischen Kaninchen-Antiseren

Gereinigte saure Polysaccharid-Antigene von S. epidermidis, entweder als Typ I oder als Typ II identifiziert, wurden erhalten, in Columbia-Nährlösung angezogen und wie in Beispiel 2 geerntet. Die Zellen werden mit 1% Formalin fixiert. Das Immunisierungsprogramm von McCarty und Lancefield, siehe oben, wurde verwendet, um Kaninchen-Antiseren, die spezifisch gegen Typ I und Typ II sind, herzustellen. Die Antiseren wurden mit einem kapselfreien S. epidermidis-Stamm absorbiert.

Beispiel S. Extraktion von Typ I- und Typ II-Polysacchariden von S. epidermidis

Aus dem Überstand:
Der Überstand wurde konzentriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und nachfolgend mit 25% Ethylalkohol, der mit 5-10 mM CaCl&sub2; versetzt wurde, bei 4ºC für sechs Stunden gefällt. Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand mit 75% Ethylalkohol, versetzt mit 5- 10 mM CaCl&sub2;, gefällt. Der 75%-Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, gegen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert und dann lyophilisiert.
Aus den Zellen:
Die Zellen wurden mit Enzymen, Lysostaphin oder Lysozym, aufgeschlossen oder mit 5% Trichloressigsäure bei 4ºC für zwei oder drei Tage extrahiert. Die Zellen wurden dann bei 10000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 25% Ethylalkohol, der mit 5- 10 mM CaCl&sub2; versetzt wurde, bei 4ºC über Nacht gefällt. Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand mit 75% Ethylalkohol, versetzt mit 5-10 n'iM CaCl&sub2;, gefällt. Nach einer Inkubation bei 4ºC über Nacht wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 10000 g für 30 Minuten sedimentiert, in destilliertem Wasser gelöst, gegen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert und dann lyophilisiert.

Beispiel 6: Reinigung von Typ I- und Typ 11-Antigenen von S. epidermidis

Die lyophilisierten Rohextrakte von Beispiel 5 wurden in 0,05 Natriumacetat-Puffer bei pH 6,0 in einer Endkonzentration von 50-100 mg/ml gelöst. Wenn der Rohextrakt in hohem Maße durch Nukleinsäuren und/oder Proteine verunreinigt ist, kann er vor dem weiteren Vorgehen mit RNAse, DNAse und/oder Protease vorbehandelt werden. Der gelöste Rohextrakt wurde auf eine DEAE-Sepharose-Säule, die in dem gleichen Puffer equilibriert wurde, in einer Menge von etwa 10 mg/ml Gel aufgebracht. Nachdem die Säule mit Ladepuffer gewaschen wurde, bis keine Absorption bei 206 nm mehr beobachtet wurde, wurde die Säule mit einem NaCl-Gradienten von 0-0,3 M in 0,05 M Natriumacetat-Puffer bei pH 6,0 eluiert. Eine Immunpräzipitation unter der Verwendung Typ-spezifischer Antiseren, die entsprechend Beispiel 4 hergestellt wurden, wurde verwendet, um Antigen-enthaltende Fraktionen zu identifizieren. Typ I- und Typ II-Antigene eluieren bei der gleichen Molarität wie bekannte Aminouronsäure-Polymere von Siaphylococcus. Eine saure Hydrolyse von gereinigten Typ I- und Typ II-Antigenen weist ebenfalls darauf hin, dass sie Aminouronsäuren enthalten.
Die Antigen enthaltenden Fraktionen wurden in Pools vereinigt, auf einer Amicon- Ultrafiltrationsmembran konzentriert, vier mal gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Dieses Vorgehen wurde wiederholt, wenn eine bessere Reinigung des Antigens benötigt wurde. Die Größe des gereinigten Polysaccharids wurde auf einer Gelfiltrationssäule, beispielsweise eine Sepharose 6B-Säule oder eine Sephacryl S-300-Säule, bestimmt. Das Antigen eluiert an der gleichen Position das Kapsel-Antigen vom Typ 5 und Typ 8-Antigene von S. aureus. Die Polysaccharid-Fraktionen wurden in Pools vereinigt, auf einer Amicon- Ultrafiltrationsmembran konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das Ergebnis dieser Reinigung ist ein Typ I- oder Typ II-Antigen in im wesentlichen reiner Form.
Eine Analyse der gereinigten Typ I- und Typ II-Antigene auf Proteine oder Nukleinsäuren ließ erkennen, dass sie weder Proteine noch Nukleinsäuren enthielten. Eine Trypsin-Hydrolyse ließ erkennen, dass die Typ I- und Typ II-Antigene resistent gegen Trypsin sind. Wenn die Zellen für 30 Minuten bei 100ºC hitzebehandelt wurden, wurden selektiv die Oberflächen-Antigene entfernt, d. h. Teichonsäure wurde nicht entfernt. Vor der Hitzebehandlung haben die Zellen nicht mit einem Antiserum gegen Teichonsäuren reagiert, wohingegen sie es nach der Hitzebehandlung taten.

Beispiel 7: Serotypisierung klinischer Isolate

Klinische Isolate, die wie in Beispiel 2 beschrieben in Columbia-Nährlösung oder aus Columbia-Agarplatten angezogen wurden, wurden mit 1% Formalin fixiert. Wenn die Isolate auf Agarplatten angezogen wurden, wurden die Zellen zunächst von den Platten abgekratzt, in PBS suspendiert und mit 20-50 ug/ml Protease versetzt. Die Zellen wurden in PBS auf eine optische Dichte von 0,5 eingestellt. Das Gemisch wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert und dann mit 1% Formalin bei Raumtemperatur über Nacht fixiert. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und Objektträger-Verklumpung wurde mit der Suspension Formalin-fixierter Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten oder auf einem Glasobjektträger durchgeführt. Gleiche Volumen von Zellen und von entsprechend Beispiel 4 hergestelltem Antiserum wurden gemischt und ließ man in Mikrotiterplatten verklumpen. Alternativ wurden die Zellen und das entsprechend Beispiel 4 hergestellte Antiserum in gleichen Volumen auf einem Glasobjektträger gemischt und für einige Minuten rotiert. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Verklumpung wurde ermittelt. Die Ergebnisse der Serotypisierung von bestätigten bakterlämischen Isolaten aus verschiedenen geographischen Standorten in den Vereinigten Staaten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein bestimmter Prozentsatz der Isolate sind nicht typisierbar (NT). Tabelle I

Beispiel 8: Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen S. epidermidis

BALB/c-Mäuse werden mit Formalin-fixierten Bakterien immunisiert. Seren werden erhalten und in einem bakteriellen Verklumpungstest auf eine Typ-spezifische Antwort getestet, wie in Beispiel 7 beschrieben. Nach dem Auftreten einer Hyperimmun-Antwort werden die Mäuse drei Tage vor der Fusion immunisiert. Milzzellen aus den Immunmäusen werden mit Zellen der AG653- oder der SHM D33-Zelllinie (beide erhältlich vom ATCC, Rockville, Md.) fusioniert, oder mit einem Klon oder Subklon einer dieser Zelilinien, unter Verwendung des bei Fuller et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, New York: J. Wiley und Söhne (1989), Kapitel 11.3.2-11.11.4, beschriebenen Verfahrens. Hybridome werden auf Typ-spezifische Antikörper durch bakteriellen Verklumpungstest und ELISA getestet, wobei Mikrotiterplatten verwendet werden, mit entweder Formalin-fixierten, ganzen Bakterien oder gereinigten Zelloberflächen-Bestandteilen überzogen sind. Zellen aus positiven Löchern werden durch eingeschränkte Verdünnung kloniert. Milligramm-Mengen von Antikörper werden in Aszites-Flüssigkeiten hergestellt und durch Protein A-, Protein G- oder DEAE-Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt.

Beispiel 9: In vitro-Phagozytosetest

Polymorphnukleäre Neutrophile (PMNs) und Monozyten werden aus peripherem, menschlichen Blut hergestellt. Die PMNs und Monozyten werden in RPMI (Gibco) resuspendiert oder in einem ähnlichen Zellkultur-Medium mit 5% hitzeinaktiviertem Kälberfötenserum. S. epidermidis-Zellen, die in Columbia-Nährlösung angezogen wurden, werden gewaschen und zu entweder PMNs oder Monozyten gemeinsam mit dem Testantikörper gegeben werden. Nach der Inkubation bei 37ºC bei sanfter Rotation werden die Proben nach einer Zeit von 0, 60 und 120 Minuten nach der Inkubation entnommen und auf Columbia-Salz-Agarplatten verteilt. Nach eine Inkubation über Nacht bei 37ºC wird die Anzahl der Kolonien ermittelt.

Claims

1. Vakzin umfassend einen sterilen, pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus einem Polysaccharid-Antigen besteht, das durch ein Verfahren gewinnbar ist, das die Schritte umfasst:

Wachsenlassen von Zellen eines Isolats des Typ I von S. epidermidis, das Antiseren gegen ATCC 55254 agglutiniert;

Extraktion des Polysaccharid-Antigens aus den Zellen zur Herstellung eines Rohextrakts eines Polysaccharid-Antigens des Typ I;

Aufbringen des unbearbeiteten Antigens auf eine Trennsäule und Elution des gleichen mit einem Salzgradienten; und

Identifizierung der Fraktionen, die das Polysaccharid- Antigen des Typ I enthalten, unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für ein Isolat des Typ I von S. epidermidis sind, das Antiseren gegen ATCC 55254 agglutiniert.

2. Vakzin gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen in Columbia- Nährbrühe wachsen gelassen werden.

3. Vakzin gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung zusätzlich einen Schritt zum Präzipitieren des Rohextraktes mit Ethylalkohol umfasst.

4. Vakzin gemäß Anspruch 3, wobei die Präzipitation durch eine aufeinander folgende Präzipitation mit Ethylalkohol durchgeführt wird.

5. Vakzin gemäß Anspruch 4, wobei die aufeinander folgende Präzipitation durch Präzipitieren mit 25% und 75% Ethylalkohol durchgeführt wird.

6. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Schritt des Extrahierens des Polysaccharid-Antigens beim Herstellungsverfahren der Zusammensetzung eine Behandlung mit Enzymen umfasst.

7. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Schritt des Extrahierens des Polysaccharid-Antigens beim Herstellungsverfahren der Zusammensetzung eine Behandlung mit Lysostaphin oder Lysozym umfasst.

8. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Schritt des Extrahierens des Polysaccharid-Antigens beim Herstellungsverfahren der Zusammensetzung eine Behandlung mit Trichloressigsäure umfasst.

9. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt des Extrahierens des Polysaccharid-Antigens beim Herstellungsverfahren der Zusammensetzung eine Behandlung mit 5% Trichloressigsäure bei 4ºC umfasst.

10. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, das zusätzlich einen Schritt der Behandlung des Rohextraktes mit Protease umfasst.

11. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Salzgradient ein NaCl-Gradient von 0 bis 0,3 M ist.

12. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Schritt der Identifizierung der Fraktionen, die das Polysaccharid-Antigen enthalten, beim Herstellungsverfahren der Zusammensetzung eine Immunpräzipitation umfasst.

13. Vakzin gemäß Anspruch 12, wobei die Identifizierung das Auswählen und das Poolen der Fraktionen umfasst, die eine einzelne Bande nach der Immunpräzipitation mit Antiseren des Typ I erzeugen.

14. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Herstellungsverfahren der Zusammensetzung zusätzlich einen Schritt zur Aufreinigung des Rohextraktes umfasst, um aufgereinigtes Antigen, das weniger als 1% Protein enthält, zu erzeugen.

15. Vakzin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Polysaccharid im Vakzin mit einem Immunträger konjugiert ist.

16. Isoliertes Hyperimmunglobulin, das Antikörper enthält, die gegen ein Polysaccharid-Antigen, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert worden ist, gerichtet sind.

17. Isoliertes Hyperimmunglobulin, das Antikörper enthält, die gegen ein Polysaccharid-Antigen, wie es in Anspruch 15 definiert worden ist, gerichtet sind.

18. Verwendung einer immunstimulatorischen Menge eines Polysaccharid-Antigens, das durch ein Verfahren gewinnbar ist, das die Schritte umfasst:

Extraktion des Polysaccharid-Antigens aus den Zellen zur Herstellung eines Rohextrakts eines Polysaccharid- Antigens des Typ I;

Identifizierung der Fraktionen, die das Polysaccharid- Antigen des Typ I enthalten, unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für ein Isolat des Typ I von S. epidermidis sind, das Antiseren gegen ATCC 55254 agglutiniert

für die Herstellung eines Vakzins.

19. Verwendung einer immunstimulatorischen Menge eines Polysaccharid-Antigens, das durch ein Verfahren gewinnbar ist, das die Schritte umfasst:

für die Herstellung eines Hyperimmunglobulins.

20. Verwendung einer immunstimulatorischen Menge eines Polysaccharid-Antigens, das durch ein Verfahren gewinnbar ist, das die Schritte umfasst:

für die Herstellung eines Hyperimmunglobulins zur Verabreichung an einem Versuchssubjekt, das mit S. epidermidis infiziert ist.