DE69232940T2

DE69232940T2 - Vesiculae in nichtpolaren Medien

Info

Publication number: DE69232940T2
Application number: DE69232940T
Authority: DE
Inventors: Tom De Vringer; Hinderikus Marius Mollee
Original assignee: Yamanouchi Europe BV
Current assignee: Astellas Pharma Europe BV
Priority date: 1991-06-26
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 2003-08-28
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: PT521562E; EP0521562B1; ATE233547T1; CA2089494C; DK0521562T3; WO1993000069A1; ES2193134T3; EP0521562A1; DE69232940D1; JPH06500735A; JP3609827B2; CA2089494A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Vesikel, ihre Herstellung und ihre Anwendungen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Verschiedene Vesikel auf der Grundlage grenzflächenaktiver Mittel sind bekannt. Beispiele sind Liposome, NIOSOMES und "paucilamellare Lipidvesikel". In der Tat sind NIOSOMES® und "paucilamellare Lipidvesikel" spezielle Typen von Liposomen.
Liposomen sind die bekanntesten Vesikel und wurden zum ersten Mal von Bangham 1994 (A. D. Bangham, R. W. Horne, J. Mol. Biol. 8, 660 (1964)] beschrieben. Liposome bestehen aus einem wässrigen Kern (AC, Fig. 1), eingekapselt von einem oder mehreren sphärisch geschlossenen lamellaren Filmen. Ihrerseits bestehen diese lamellaren Filme aus molekularen Doppelschichten (BL) grenzflächenaktiver Moleküle (SM). Wie der Kern von Liposomen, ist die externe Phase Wasser oder eine wässrige Lösung.
Die lipophilen Schwänze (LT) der grenzflächenaktiven Moleküle sind in der molekularen Doppelschicht auf solche Weise angeordnet, dass sie in engem Kontakt miteinander stehen, und dass der Kontakt zwischen diesen lipophilen Schwänzen und den wässrigen inneren und äußeren Phasen vermieden wird. Andererseits sind die hydrophilen Köpfe (HH) der grenzflächenaktiven Moleküle vollständig hydratisiert. Auf diese Weise erreichen die Systeme die günstigste thermodynamische Situation. Wenn die Liposome aus mehr als einer molekularen Doppelschicht bestehen, sind die aufeinanderfolgenden molekularen Doppelschichten (SB) durch wässrige Schichten getrennt. Im Falle multilamellarer Lipidvesikel (MLV's) alternieren hydrophile Domänen (LD) mit lipophilen Domänen.
Es können verschiedene Arten von Liposomen unterschieden werden. Die Klassifizierung beruht auf der Größe der Liposomen und der Zahl der molekularen Doppelschichten, die das Vesikel aufbauen. Ein kleines unilamellares Vesikel (SUV) ist relativ klein (beispielsweise 50 nm) und besteht nur aus einer molekularen Doppelschicht, die einen wässrigen Kern umhüllt. Große unilamellare Vesikel (LUV's) haben Größen bis zu mehreren Mikrometern. Die kritische Größe, welche bestimmt, ob das Vesikel als klein oder groß bezeichnet wird, ist in der Literatur nicht gut definiert.
Vesikel, die aus mehr als einer molekularen Doppelschicht bestehen, werden als multilamellare Lipidvesikel (MLV's) bezeichnet. Manchmal wird der Ausdruck "paucilamellare Lipidvesikel" für MLV's verwendet, die nur aus wenigen (2 bis 8) molekularen Doppelschichten bestehen [vergleiche: WO 88/06883]. Genauere Einzelheiten über die Klassifizierung können gefunden werden in: N. Weiner et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 15 (10) 1523-1554 (1989).
Die grenzflächenaktiven Mittel, die die molekularen Doppelschichten des Liposoms aufbauen, können ionisch (beispielsweise Phospholipide) und/oder nicht-ionisch (beispielsweise Polyoxyethylenalkylether) sein. Zuerst war der Name NIOSOMES® für nicht-ionische grenzflächenaktive Vesikel reserviert, die keine Moleküle eines ionischen grenzflächenaktiven Mittels enthielten [R. M. Handjani-Vila et al., Int. J. Cosm. Sci., 1, 303-314 (1979)]. Heute können ebenfalls ionische grenzflächenaktive Moleküle in die molekularen Doppelschichten von NIOSOMES eingearbeitet sein, um die Stabilität zu verbessern.
Wegen ihrer wässrigen Kerne können Liposome als Träger für wasserlösliche Substanzen verwendet werden. Ein gelöster Stoff, der in dem wässrigen Kern vorhanden ist, ist in dem Liposom während einer bestimmten Zeit eingehüllt. Die Freisetzung von dem Vesikel kann passiv durch Diffusion oder Auslaufen sein, oder sie kann mit einem Triggermechanismus aktiviert werden. Ein möglicher Triggermechanismus ist beispielsweise eine Erhöhung in der Temperatur, was einen Phasenübergang der lipophilen Ketten der grenzflächenaktiven Moleküle in die molekularen Doppelschichten ergibt.
Die Retention des gelösten Stoffes in Liposomen kann beispielsweise vorteilhafterweise genutzt werden, um den ersten Durchgangseffekt von den Arzneimitteln in der Leber zu verringern, um die Toxizität von Substanzen zu verringern, die Penetration einer Substanz in die Haut zu verstärken, eine anhaltende Freisetzung des gelösten Stoffs zu erreichen, für die Arzneimittel-Lenkung auf eine spezifische Stelle oder zur Erzeugung einer lokalen Umgebung, in der der gelöste Stoff von einer zweiten Substanz in der externen Phase abgschirmt ist, oder in der der gelöste Stoff (beispielsweise ein Enzym) mit einer anderen Substanz (beispielsweise einem Substrat) reagieren kann.
Es können verschiedene Verfahren zur Herstellung unterschiedlicher Arten von Liposomen verwendet werden. Für eine genaue Zusammenfassung der Herstellungsverfahren wird verwiesen auf: N. Weiner et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 15 (10) 1523-1554 (1989).
Ein Verfahren ist das "Filmverfahren". Gemäß diesem Verfahren werden die Komponenten, die die molekulare Doppelschicht bilden, in einer organischen Flüssigkeit (beispielsweise Chloroform, Diethylether, Methanol) oder einem Gemisch solcher Flüssigkeiten gelöst. Diese Lösung wird in einem Rundkolben, der in ein Thermostat-Wasserbad eingetaucht ist, bei verringertem Druck rotiert. Die organischen Lösungsmittel verdampfen, und ein Film aus grenzflächenaktiven Molekülen wird an der Glaswand des Inneren des Kolbens gebildet. Der trockene Film wird durch Zugabe eines Überschusses an Wasser unter Schütteln hydratissert. Auf diese Weise werden Liposome gebildet. Die wässrige Dispersion aus Liposomen kann zur Erreichung einer kleineren Größe und kleineren Größenverteilung beschallt werden.
Ein anderes Verfahren ist das "Reversed-phase-Verdampfungsverfahren". Gemäß diesem Verfahren werden die Komponenten, die die molekulare Doppelschicht bilden, in einem apolaren organischen Lösungsmittel (beispielsweise Chloroform, Diethylether, Isopropylether) oder einem Gemisch solcher Flüssigkeiten gelöst. Diese apolare organische Lösung wird mit Wasser (beispielsweise durch Beschallung) vermischt, wobei eine Emulsion des Wasser-in-Öl- Typs gebildet wird. In dieser Emulsion ist das grenzflächenaktive Mittel an der Öl-Wasser- Grenzfläche lokalisiert. Danach wird das überschüssige organische Lösungsmittel bei verringertem Druck entfernt, und das Verhältnis organisches Lösungsmittel/Wasser (welches typischerweise 3 oder sogar mehr zu Beginn beträgt) nimmt ab. In dieser Stufe werden die molekularen Doppelschichten durch eine Gelbildung des Gemisches gebildet. Eine weitere Entfernung des organischen Lösungsmittels ergibt einen Kollaps des Gels und die Bildung von Vesikeln (typischerweise LUV's). Das erhaltene Produkt ist eine wässrige Dispersion von Vesikeln mit wässrigen Kernen. Nach dem Herstellungsverfahren werden diese Vesikel als REV's (Reversedphase-Verdampfungsvesikel) bezeichnet.
Es können verschiedene andere Verfahren zur Herstellung kleiner Ansätze Lipidvesikel verwendet werden. Jedoch tritt beziehungsweise treten bei allen bekannten Herstellungsverfahren eine oder mehrere Schwierigkeiten auf, wenn es dazu kommt, das Verfahren in größerem Maßstab durchzuführen. Dies sind Schwierigkeiten unterschiedlichster Art, beispielsweise die Entfernung großer Mengen an explosiven und toxischen organischen Lösungsmitteln oder die Unmöglichkeit, große Ansätze zu beschallen.
Unabhängig von dem verwendeten Verfahren werden alle stabilen Lipidvesikel, die bis heute bekannt sind, durch Hydratisierung der grenzflächenaktiven Mittel gebildet, indem ein Überschuss an Wasser oder eine wässrige Lösung zu der Lipidphase, die das grenzflächenaktive Mittel und gegebenenfalls andere Lipid-lösliche Substanzen (beispielsweise Cholesterin) enthält, zugegeben wird. Die entstehenden Vesikel, unabhängig, ob sie Liposome, NIOSOMES®, SUV's, LUV's, REV's, MLV's oder "paucilamellare Lipidvesikel" sind, sind alle während des Herstellungsverfahrens in einer wässrigen polaren Phase dispergiert.
Bei der Herstellung der Liposome wird nur ein Teil der wässrigen Lösung, die beispielsweise ein wasserlösliches Arzneimittel enthalten kann, eingekapselt. Daher sind die wasserlöslichen Substanzen innerhalb der wässrigen inneren und äußeren Phasen verteilt.
Oft wird in die molekularen Doppelschichten Cholesterin zur Modifizierung der Eigenschaften davon eingearbeitet. In einigen Zusammensetzungen ist Cholesterin ein wesentlicher Bestandteil für die Bildung der Liposome.
Theoretisch können auch andere lipophile Verbindungen, beispielsweise Arzneimittel, in die lipophilen Domänen der molekularen Doppelschichten eingearbeitet werden. Natürlich können stärker lipophile Substanzen in MLV's als in SUV's oder LUV's eingearbeitet werden. Jedoch besitzen die molekularen Doppelschichten eine geordnete Struktur. Sehr wenige Substanzen zeigen ein gutes strukturelles Anpassen an diese molekularen Doppelschichten (Cholesterin zeigt es). Daher können in der Praxis sehr wenige Substanzen in signifikanten Mengen in die lipophilen Domänen der molekularen Doppelschichten eingearbeitet werden.
Weiterhin ist das Gesamtvolumen der lipophilen Domänen der molekularen Doppelschichten gering wegen der beschränkten Mengen des grenzflächenaktiven Mittels (typischerweise 30 umol pro Gramm der Dispersion), die zur Herstellung der Vesikel verwendet werden kann. Eine ungewöhnlich hohe Menge an grenzflächenaktivem Mittel, beispielsweise 200 umol pro Gramm, wird von H. Talsma et al., [Drug Dev. Ind. Pharm., 15 (2) 197-207 (1989)] verwendet.
Die Beschränkung der Mengen an grenzflächenaktivem Mittel beschränkt ihrerseits sehr stark die Menge an Substanzen, die in die lipophilen Domänen der molekularen Doppelschichten eingearbeitet werden kann. Daher sind die Vesikel, die bis heute bekannt sind, üblicherweise zur Einkapselung von lipophilen Verbindungen nicht geeignet. Weitere Einzelheiten über die Einkapselung von Substanzen vergleiche: L. D. Mayer et al., Chem. & Phys. Lipids, 40 (1986) 333-345.
Wegen ihrer wässrigen inneren Teile sind Liposomen geeigneter zur Einkapselung von wasserlöslichen Verbindungen, insbesondere SUV's und LUV's, wobei die Letzteren die besten Einkapselungswirksamkeiten zeigen. Unglücklicherweise zeigen SUV's und LUV's eine schlechtere Retention des eingeschlossenen gelösten Stoffes.
Bedingt durch die bis heute bekannten Herstellungsverfahren der Vesikel wird eine wesentliche Menge der wässrigen Phase nicht eingekapselt. Als Ergebnis wird ebenfalls eine wesentliche Menge der wasserlöslichen Substanzen nicht eingekapselt, wodurch die Einkapselungswirksamkeit in starkem Umfang verringert wird.
Verschiedene Nachteile beziehen sich auf diese niedrige Einkapselungswirksamkeit. Erstens muss bei den meisten Anwendungen der nicht-eingekapselte gelöste Stoff aus der externen Phase entfernt werden. Dies bedeutet, dass mindestens eine zusätzliche Manipulation durchgeführt werden muss. Für Mengen von Liposomendispersionen im Labormaßstab kann dies durch Dialyse erfolgen. Für Mengen in industriellem Maßstab ist dies ein wesentlicher Nachteil.
Zweitens geht eine wesentliche Menge der Verbindung für ihren Zweck verloren und kann nicht in geeigneter Weise wirken, was sie täte, wenn sie eingekapselt wäre. Insbesondere ist dies bei teuren Substanzen (beispielsweise Peptiden) ein wesentlicher Nachteil.
Wegen der Nachteile, die die niedrige Einkapselungseffizienz betreffen, wurde viel Forschungsarbeit auf dieses Problem verwendet. Obgleich Verbesserungen erfolgten, ist die Einkapselungseffizienz noch weit von dem Idealzustand entfernt. Die zusätzlichen Verfahren, die verwendet werden müssen, um die Einkapselungseffizienz zu verbessern (Dehydratisierung und Rehydratisierung der Liposome, Gefrier-Tau-Verfahren und für ionische gelöste Stoffe aktive Einfangverfahren) sind für industrielle Zwecke wegen der hohen Kosten oder wegen der Schwierigkeiten, sie in größerem Maßstab durchzuführen, nicht geeignet.
H. Kunieda et al. [J. Am. Chem. Soc. 113(3) 1051-1052 (1991)] beschreibt die Bildung von umgekehrten Vesikeln, die im Wesentlichen aus dem hydrophilen grenzflächenaktiven Mittel Tetraethylenglykoldodecylether in Dodecan bestehen. Es wurde gefunden, dass die Zugabe von 2,5 Wassermolekülen/Ethylenoxid-Einheit für die Bildung der Vesikel essentiel ist, von denen jedoch gefunden wurde, dass sie coaleszieren und sich in die lamellare flüssige kristalline Phase innerhalb einer Zeit von Stunden bis Tagen zurückverwandeln.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde jetzt gefunden, dass Dispersionen stabiler Vesikel in nicht-polarer Phase hergestellt werden können. Diese Vesikel, die eine nicht-polare Phase einkapseln, umfassen ein grenzflächenaktives Mittel oder ein Gemisch aus grenzflächenaktiven Mitteln. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharosefettsäureester(n), und bei Bedarf, abhängig von der Wahl des oder der grenzflächenaktiven Mittel und der nicht-polaren Phase, ebenfalls einen lipophilen Stabilisierungsfaktor und gegebenenfalls auch einen hydrophilen Stabilisierungsfaktor.
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Dispersionen von Vesikeln, wobei die Verfahren die Herstellung eines Gemisches aus einem oder mehreren grenzflächenaktiven Mittel(n), dem lipophilen Stabilisierungsfaktor, der nicht-polaren Phase und gegebenenfalls dem hydrophilen Stabilisierungsfaktor, gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur und/oder durch Verwendung von organischen Lösungsmitteln, die anschließend verdampft werden, umfassen. Beispiele davon sind ein Mischverfahren, ein Verdampfungsverfahren und ein Filmbildungsverfahren.
Die Dispersionen von Vesikeln können vorteilhafterweise in pharmazeutische, kosmetische, Nahrungsmittel-Zubereitungen und Pestizidpräparate und in Präparate für die Behandlung von Oberflächen allgemein eingearbeitet werden.

BESCHRIFTUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines multilamellaren Lipidvesikels und eines großen unilamellaren Vesikels.
MLV = Multilamellare Lipidvesikel
LUV = Großes unilamellares Vesikel
AC = Wässriger Kern des Liposoms
BL = molekulare Doppelschicht von grenzflächenaktiven Molekülen
SB = Aufeinanderfolgende molekularen Doppelschichten, getrennt durch eine wässrige Schicht
LD = Lipophile Domäne einer molekularen Doppelschicht, bestehend aus lipophilen Schwänzen von grenzflächenaktiven Molekülen
HD = Hydrophile Domäne einer molekularen Doppelschicht, bestehend aus einer wässrigen Schicht plus hydrophilen Köpfen von grenzflächenaktiven Molekülen
SM = Grenzflächenaktives Molekül
LT = Lipophiler Schwanz eines grenzflächenaktiven Moleküls
HH = Hydrophiler Kopf eines grenzflächenaktiven Moleküls
Fig. 2 ist eine Photographie der Vesikel in flüssigem Paraffin von Beispiel 1.1, erhalten durch Gefrierfraktur-Elektronenmikroskopie (FF-EM)-Verfahren.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Budesonidfreisetzung aus Cremezubereitungen 5.1 und 5.2 durch eine Cellulosemembran als Funktion der Quadratwurzel der Zeit.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Bleichbewertung der Cremezubereitungen 5.3, 5.4 und 5.5 als Funktion der Zeit nach dem Abwaschen der Präparate von den Armen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es wurde jetzt gefunden, dass stabile Vesikel in nicht-polarer Phase hergestellt werden können. Diese Vesikel, die eine nicht-polare Phase einkapseln, umfassend ein oder mehrere grenzflächenaktive Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharosefettsäureestern, und, sofern erforderlich, abhängig von der Wahl des oder der grenzflächenaktiven Mittel und der nicht-polaren Phase, einen lipophilen Stabilisierungsfaktor und gelegentlich ebenfalls einen hydrophilen Stabilisierungsfaktor.
Die Stabilität der erfindungsgemäßen Vesikel kann durch mikroskopischen Vergleich des Produktes kurz nach der Herstellung und nach irgendeiner Zeit, die mindestens eine Woche sein kann, aber bevorzugt mehrere Monate oder Jahre ist, bestimmt werden. Stabil bedeutet, dass keine Änderung im mikroskopischen Bild und/oder in der Strukturintegrität der Vesikel beobachtet werden können. Die Stabilität im Verlauf der Zeit wird bevorzugt durch Vergleich der Photographien der mikroskopischen Bilder, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, verfolgt. Die Verwendung einer QUANTIMET®-Messvorrichtung erscheint in diesem Zusammenhang am geeignetsten.
Die genannten Vesikel besitzen als Regel eine Größe zwischen 20 und 100.000 nm, bevorzugt zwischen 40 und 25.000 nm, bevorzugter zwischen 100 und 5.000 nm. Sie bestehen aus einem nicht-polaren Kern, eingekapselt von 1 bis 10.000, bevorzugt 5 bis 2500, bevorzugter 10 bis 500, sphärisch geschlossenen lamellaren Filmen. Ihrerseits bestehen diese lamellaren Filme aus molekularen Doppelschichten des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Moleküle, wobei die polaren Kopfgruppen davon den inneren Teil der molekularen Doppelschicht bilden, und die nicht-polaren Ketten des beziehungsweise der gleichen Moleküle in die nicht-polare Phase vorstoßen.
Der lipophile Stabilisierungsfaktor ist ein Molekül, das durch einen relativ massiven verlängerten nicht-polaren Teil und einen kleinen polaren Teil charakterisiert ist. Nach der Einarbeitung dieses Moleküls in das Vesikel wird es an der lipophilen Domäne der molekularen Doppelschichten, d. h. zwischen den nicht-polaren Ketten der grenzflächenaktiven Moleküle, lokalisiert, wodurch die Kohlenwasserstoff-Packungsbeanspruchung modifiziert wird. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass, wenn die Kohlenwasserstoff-Packungsbeanspruchung bei einem geeigneten Wert liegt, die Einarbeitung des lipophilen Stabilisierungsfaktors nicht erforderlich ist. Es wurde gezeigt, dass kein solcher Faktor beispielsweise für die Herstellung einer Dispersion aus stabilen Vesikeln erforderlich ist, die aus Saccharoseestern in nicht-polaren Vesikeln bestehen, wie flüssiges Paraffin und flüchtiges Silikonöl. Nichts desto trotz würden, wenn ein solcher Faktor vorhanden wäre, stabile Vesikel gemäß den Erfahrungen der Erfinder gebildet werden. Beispiele lipophiler Stabilisierungsfaktoren sind:
- Sterole, wie (teilweise) hydrierte 10,13-Dimethylcyclopentaphenanthrene, gegebenenfalls substituiert, beispielsweise durch Hydroxyl und Carbonsäure und deren Ester;
- Retinoide, wie Retinsäure;
- verzweigte Fettalkohole, wie 2-Hexyloctylethanol;
- geradkettige oder verzweigtkettige (Zahl der C-Atome: 4 oder darüber) gesättigte aliphatische Alkoholester von aliphatischen oder aromatischen Dicarbonsäuren (Zahl der C-Atome: 4 oder darüber), wie Dioctylphthalat;
- gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure; und
- geradkettige und verzweigtkettige Fettsäureester mit Polyhydroxyl-Verbindungen, wie Propylenglykol, Dipelargonat und Diglycerindiisostearostearat,
aber bevorzugt wird Cholesterin verwendet.
Der lipophile Stabilisierungsfaktor kann in einer Konzentration bis zu 200 Gew.-%, bevorzugt bis zu 100 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 10 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Menge an dem oder der grenzflächenaktiven Mittel verwendet werden.
Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass der polare Teil beziehungsweise die polaren Teile des oder der grenzflächenaktiven Mittel, die die Struktur des Vesikels bilden, mit den hydrophilen Domänen der molekularen Doppelschichten auf solche Weise wechselwirken kann, dass die Vesikel stabilisiert werden. Dies ist der Fall, wenn Saccharoseester verwendet werden. Abhängig von der Wahl des grenzflächenaktiven Mittels kann die Anwesenheit eines hydrophilen Stabilisierungsfaktors in dem Vesikel zur Herstellung stabiler Vesikel erforderlich sein.
Der hydrophile Stabilisierungsfaktor ist ein kleines polares Molekül (mit einem Molekulargewicht bis zu 150), das die Fähigkeit besitzt, Wasserstoffbrücken zu bilden. Nach der Einarbeitung in die Vesikel können solche Moleküle in den hydrophilen Domänen der molekularen Doppelschichten lokalisiert sein, so dass sie zur Stabilität der Vesikel beitragen. Diese Moleküle können Wasser oder eine Verbindung mit einem oder mehreren funktionellen Gruppen sein, die Wasserstoffbrücken bilden können, wie eine Hydroxyl-, eine (mono- oder disubstituierte) Amino- und eine Carbonsäuregruppe. Beispiele der letzterwähnten Verbindungen sind Ethanol und Ethanolamin.
Der hydrophile Stabilisierungsfaktor kann in einer Konzentration bis zu 50 Gew.-%, bevorzugt bis zu 35 Gew.-%, und am meisten bevorzugt bis zu 25 Gew.-%, bezogen auf die Menge des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Vesikel besitzen, verglichen mit Vesikeln in wässriger Phase, eine sehr hohe Einkapselungskapazität (die die Menge des eingekapselten aktiven Bestandteils pro Gramm Dispersion ist) für hydrophile wie auch für lipophile Verbindungen. Das Herstellungsverfahren erlaubt eine sehr hohe Einkapselungswirksamkeit (was die Menge an eingekapseltem aktiven Bestandteil, bezogen zu der Gesamtmenge an aktivem Bestandteil in der Dispersion ist) in den erfindungsgemäßen Vesikeln für hydrophile Substanzen, verglichen mit der Einkapselungseffizienz von Vesikeln in einer wässrigen Phase.
Die Vorteile des Einschlusses der hydrophilen wie auch der lipophilen Substanzen in die erfindungsgemäßen Vesikel sind allgemein gesagt die gleichen, wie sie nach dem Einschluss von gelösten Stoffen in beispielsweise Liposomen beobachtet werden:
- Verringerung der Wirkung des ersten Durchgangs von Arzneimitteln in der Leber;
- Verringerung der Toxizität von Substanzen;
- Verstärkung der Penetration einer Substanz in die Haut;
- Erreichung einer verzögerten Freigabe des gelösten Stoffes;
- Verstärkung der Menge an Arzneimittel, die an einer spezifischen Stelle freigesetzt wird;
- Erzeugung einer Sperrschicht gegenüber 2 physikalisch getrennten unverträglichen Substanzen, die in eine Dosisform eingearbeitet werden müssen.
Bedingt durch das Herstellungsverfahren und die Wahl der Komponenten zeigen die erfindungsgemäßen Vesikel zusätzliche Vorteile bei der Produktentwicklung, verglichen mit den unterschiedlichen Arten von Liposomen, wie oben angegeben:
- Die Konzentration an grenzflächenaktivem Mittel, die verwendet werden kann, ist wesentlich höher (beispielsweise bis zu 1400 umol pro Gramm Dispersion), als sie bei der Herstellung verschiedener Arten von Liposmen verwendet werden kann;
- dementsprechend kann die Menge an eingekapselter Substanz (hydrophiler und lipophiler) wesentlich höher sein;
- die Vesikel sind für die Einarbeitung von Substanzen geeignet, die in Anwesenheit von Wasser oder Sauerstoff unter dem Einfluss von Licht oder bei bestimmten pH-Bedingungen der polaren Phase nicht stabil sind, da die erfindungsgemäßen Vesikel ohne Verwendung von Wasser hergestellt werden können;
- und wenn kein Wasser verwendet wird, können die Vesikel mit leicht hydrolysierbaren grenzflächenaktiven Estermitteln hergestellt werden, die für die Herstellung von stabilen Liposomen nicht verwendet werden können. Nach Verabreichung dieser grenzflächenaktiven Estermittel werden sie beim Kontakt mit Wasser hydrolysieren. Ein weiterer Vorteil der biologisch abbaubaren Ester ist der, dass sie weniger toxisch sind.
Die grenzflächenaktiven Mittel, die erfindungsgemäße verwendet werden, sind Saccharosefettsäureester und ihre Gemische (beispielsweise WASAG ESTER 7® und WASAG ESTER 15®).
Die Konzentration an dem oder den grenzflächenaktiven Mittel wird entsprechend dem oder den grenzflächenaktiven Mitteln und dem oder den nicht-polaren Exzipientien, die verwendet werden, und der beabsichtigten Anwendung variieren.
Die Konzentration der gesamten grenzflächenaktiven Mittel liegt, ausgedrückt durch das Gewicht, bezogen auf das Gewicht der Vesikel-enthaltenden Dispersion, als Regel zwischen 0,5 und 70%, bevorzugt zwischen 5 und 40%, bevorzugter zwischen 10 und 30%.
Die nicht-polare Phase kann aus nicht-polaren Exzipientien, die bei Raumtemperatur entweder fest oder flüssig sind, gebildet sein. Es können auch vorteilhafter Weise Gemische solcher nicht-polarer Exzipientien verwendet werden.
Das erfindungsgemäße nicht-polare Exzipienz ist mit Wasser in allen Verhältnissen bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 100ºC bei atmosphärischem oder verringertem Druck nicht mischbar oder es hat einen Wert für die dielektrische Konstante (&epsi;) von weniger als 20,0, bei 25ºC und Atmosphärendruck.
Wenn die nicht-polare Phase aus einem Gemisch von nicht-polaren Exzipientien gebildet wurde, sollte das Gemisch mit Wasser in allen Verhältnissen bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 100ºC bei atmosphärischem oder verringertem Druck nicht mischbar sein oder mindestens eine der Komponenten des Gemisches besitzt einen Wert für die dielektrische Konstante (&epsi;) von weniger als 20,0, bei 25ºC und Atmosphärendruck.
Geeignete nicht-polare Exzipientien sind beispielsweise:
- geradkettige aliphatische Alkohole mit einer Kohlenstoffatomzahl von 3 oder darüber;
- Wachse, wie Jojoba-Öl und Carnaubawachs;
- Kohlenwasserstoffe, wie flüssiges Paraffin, weiches Weißparaffin, harte Paraffine, Squalen und Isoparaffine;
- Ketone, wie 5-Methylhexan-2-on;
- synthetische Ester, wie Cetylpalmitat;
- Glycerintriester höherer gesättigter und ungesättigter Fettsäuren mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen, wie Glyceryltrilaurat und hydriertes Rizinusöl;
- Pflanzenöle, wie Kokosnussöl und Erdnussöl;
- Silikonöle, wie flüchtige Silikonöle (beispielsweise Octamethylcyclotetrasiloxan (ABIL K4®), Decamethylcyclopentasiloxan, Dodecamethylcyclohexasiloxan).
Bevorzugt werden nicht-polare Exzipientien aus der Gruppe der Kohlenwasserstoffe und aus der Gruppe der flüchtigen Silikonöle verwendet. Bevorzugter werden Mineralöl ( = flüssiges Paraffin) und Octamethylcyclotetrasiloxan verwendet.
Die Wahl des oder der grenzflächenaktiven Mittel, wie auch des/der nicht-polaren Exzipiens/Exzipientien, hängt nicht nur von den Substanzen per se ab, sondern sie hängt ebenfalls von der beabsichtigen Anwendung und dem bevorzugten Herstellungsverfahren ab.
Die erfindungsgemäßen Vesikel können gemäß Verfahren, wie sie üblicherweise auf diesem Gebiet bekannt sind, charakterisiert werden. Beispiele dieser Verfahren sind: Die Gefrierfraktur-Elektronenmikroskopie (FF-EM), Lichtstreuverfahren, wie dynamische Lichtstreuung (DLS), insbesondere für kleine Vesikel, und Röntgenbeugungs- und Neutronenbeugungsverfahren. Die in den folgenden Beispielen beschriebenen Vesikel werden mittels FF-EM und mittels Mikroskopie mit polarisiertem Licht charakterisiert. Dieses zuletzt erwähnte Verfahren ist zum Nachweis von Kristallen der aktiven Substanzen sehr nützlich, die in den Beispielen verwendet werden. Ein Beispiel einer Photographie, erhalten gemäß einem FF-EM-Verfahren, ist in Fig. 2 dargestellt.
Die Dispersion der erfindungsgemäßen Vesikel kann nach Verfahren hergestellt werden, die umfassen: Die Herstellung eines homogenen Gemisches aus dem oder den oberflächenaktiven Mittel(n), dem lipophilen Stabilisierungsfaktor, der nicht-polaren Phase und gegebenenfalls dem hydrophilen Stabilisierungsfaktor, gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur und/oder unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln, die anschließend verdampft werden. Beispiele hierfür sind ein Mischverfahren, ein Verdampfungsverfahren und ein Filmverfahren, die im Folgenden diskutiert werden. Die beiden zuletzt erwähnten Verfahren stehen im Zusammenhang mit dem Verfahren zur Herstellung unterschiedlicher Typen von Vesikeln in wässrigen Vesikeln, wie sie gemäß dem Stand der Technik bekannt sind: Das Reversed-phase- Verdampfungsverfahren beziehungsweise das Filmverfahren.
Das Mischverfahren umfasst die Stufen:
- Vermischen, ohne dass ein hohes Scheren erforderlich ist, aller Komponenten (die beziehungsweise das grenzflächenaktive Mittel und das beziehungsweise die nicht-polaren Exzipientien und ebenfalls der lipophile Stabilisierungsfaktor und der hydrophile Stabilisierungsfaktor sind) bei einer Temperatur bei oder über der, bei der alle Bestandteile geschmolzen oder gelöst sind, und;
- sofern erforderlich, das Abkühlen auf Raumtempertur unter Rühren.
Das Kühlen kann aktiv gemäß an sich bekannten Verfahren erfolgen. Aktive Substanzen, wie Arzneimittel und Farbstoffe, können in die Vesikel eingearbeitet werden, indem sie zu der nicht-polaren Phase vor dem Mischen und Erhitzen, sofern erforderlich, zugegeben werden.
Das Verdampfungsverfahren umfasst die Stufen:
- Auflösung des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel, des lipophilen Stabilisierungsfaktors und, sofern vorhanden, des hydrophilen Stabilisierungsfaktors in einem (Gemisch aus einem oder mehreren) polaren organischen Lösungsmittel(n), sofern erforderlich bei erhöhter Temperatur;
- Die Zugabe der klaren Lösung aus grenzflächenaktivem Mittel beziehungsweise Mitteln zu der nicht-polaren Phase bei einer Temperatur bei oder über der Temperatur der Lösung aus grenzflächenaktivem Mittel;
- bevorzugt Rühren der entstehenden Masse und Verdampfen des beziehungsweise der organischen Lösungsmittel, sofern erforderlich bei verringertem Druck; und
- sofern erforderlich, Kühlen auf Raumtemperatur, bevorzugt unter Rühren.
Wenn das Verdampfungsverfahren verwendet wird, ist die Wahl eines polaren Lösungsmittels oder eines Gemisches von polaren Lösungsmitteln wesentlich. Es ist wichtig, ein solches Lösungsmittel oder ein Gemisch aus Lösungsmitteln zu verwenden, das die Auflösung des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel und des Stabilisierungsfaktors beziehungsweise der Stabilisierungsfaktoren bei geeigneter Temperatur möglich ist. Eine weitere Forderung, die erfüllt werden muss, ist die Nichtmischbarkeit des Lösungsmittels beziehungsweise des Gemisches aus Lösungsmitteln mit der nicht-polaren Phase. Bevorzugte polare Lösungsmittel sind Ethanol und Aceton.
Nach Herstellung der klaren Lösung aus dem beziehungsweise den grenzflächenaktiven Mittel(n) und des Stabilisierungsfaktors bzw. der Stabilisierungsfaktoren wird dieses zu der nicht-polaren Phase zugegeben. Damit eine Verzögerung bei dem Herstellungsverfahren vermieden wird, ist die Temperatur der nicht-polaren Phase vorzugsweise gleich der der Lösung. Während des darauffolgenden Mischens der beiden Phasen kann die polare Phase verdampfen. Dieses Verfahren kann beschleunigt werden, indem der Druck verringert wird.
Wenn die polare Phase vollständig verdampft ist, wird die nicht-polare Phase auf Umgebungstemperatur, sofern erforderlich, abgekühlt. Dieses Kühlen kann aktiv nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Bevorzugte aktive Substanzen, wie Arzneimittel, die in die Vesikel eingearbeitet werden, werden in der polaren Phase gelöst, es sei denn, die Löslichkeit in der nicht-polaren Phase wäre wesentlich besser. Das Gleiche gilt für den lipophilen Stabilisierungsfaktor und den hydrophilen Stabilisierungsfaktor.
Das Filmverfahren umfasst die Stufen:
- Auflösen des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel, des lipophilen Stabilisierungsfaktors und, sofern vorhanden, des hydrophilen Stabilisierungsfaktors in einem organischen Lösungsmittel (einem Gemisch organischer Lösungsmittel);
- Entfernung des organischen Lösungsmittels unter Verwendung eines Rotationsverdampfungsverfahrens;
- Solvatisierung des Rückstands in der nicht-polaren Phase, sofern erforderlich, bei einer Temperatur über dem Schmelzpunkt des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel(s); und
- sofern erforderlich, Kühlen auf Raumtemperatur.
Wenn das Filmverfahren verwendet wird, werden das grenzflächenaktive Mittel beziehungsweise das Gemisch aus grenzflächenaktiven Mitteln und der beziehungsweise die Stabilisierungsfaktor(en) in einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln, das beziehungsweise die leicht durch Verdampfen zu entfernen sind, gelöst. Bevorzugte organische Lösungsmittel sind Dichlormethan, Chloroform und Methanol. Die Lösung, die das beziehungsweise die grenzflächenaktiven Mittel und den beziehungsweise die Stabilisierungsfaktor(en) enthält, wird in einen Rundkolben überführt. Nach der vollständigen Verdampfung des beziehungsweise der Lösungsmittel gemäß einem Rotationsverdampfungsverfahren wird der Film, der sich am Inneren des Kolbens gebildet hat, mit der nicht-polaren Phase bei einer Temperatur über dem Schmelzpunkt des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel solvatisiert. Nach Beendigung des Solvatisierungsverfahrens wird die Vesikeldispersion in dem nicht-polaren Medium auf Umgebungstemperatur, sofern erforderlich, gekühlt. Das Kühlen kann aktiv gemäß an sich bekannter Verfahren durchgeführt werden.
Bevorzugt werden die aktiven Substanzen, wie die Arzneimittel und Farbstoffe, die in die Vesikel eingearbeitet werden sollen, zu der Lösung zugegeben, die das beziehungsweise die grenzflächenaktiven Mittel enthält, sofern die Löslichkeit dieser Substanzen in der nicht-polaren Phase wesentlich besser wäre als in der Lösung des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel(s). Dasselbe gilt für den lipophilen Stabilisierungsfaktor und den hydrophilen Stabilisierungsfaktor.
Es ist offensichtlich, dass die Wahl des Verfahrens durch die Komponenten der Vesikel, die Ansatzgröße, die erreicht werden soll, und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des beziehungsweise der grenzflächenaktiven Mittel, des beziehungsweise der (biologisch) aktiven Verbindung(en), der Additive und des beziehungsweise der nicht-polaren Exzipientien, wie Schmelzpunkt, Löslichkeit in unterschiedlichen Medien, Flüchtigkeit, Verhalten bei erhöhter Temperatur, usw., bestimmt wird.
Nach der Herstellung einer Dispersion von Vesikeln gemäß einem der oben erwähnten Verfahren, umfassen die zusätzlichen Herstellungsstufen:
- die Verringerung der Größe der Vesikel nach an sich bekannten Verfahren (Beschallung, Extrudieren, Mikrofluidisierung);
- Polymerisation der Vesikel im Falle, dass ein polymerisierbares grenzflächenaktives Mittel verwendet wird, nach an sich bekannten Verfahren,
- Entfernung des nicht-polaren Exzipiens bzw. der nicht-polaren Exzipientien unter Bildung eines Instantpräparats;
- Zugabe zu den Vesikeln in nicht-polarem Medium einer geeigneten wässrigen oder nicht- wässrigen polaren Flüssigkeit, eines Gels auf der Grundlage solcher Flüssigkeiten, eines flüssigen oder semifesten Lipids oder eines Gemisches aus irgendwelchen der obigen Stoffe unter Bildung einer Lösung, eines Gels, einer Wasser-in-Öl-Emulsion, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Salbe;
- die Einarbeitung hydrophiler oder lipophiler Substanzen, wie Arzneimittel und Farbstoffe, in die Vehikel, die eine Dispersion der erfindungsgemäßen Vesikel enthalten.
Wässrige oder nicht-wässrige polare Flüssigkeiten können zu den Dispersionen der erfindungsgemäßen Vesikel zugegeben werden, ohne die Struktur der Vesikel zu stören. Jedoch könnte, bedingt durch den polaren Charakter des Vehikels, das zugegeben wird, die Außenschicht der Vesikel verloren gehen. Dementsprechend ist es für diese Art der Präparate eine Voraussetzung, dass Dispersionen verwendet werden, die multilamellare Vesikel enthalten.
Flüssige oder semifeste Lipide können mit den erfindungsgemäßen Vesikeln vermischt werden, als solche oder in einer W/Ö- oder Ö/W-Emulsion. Wenn eine W/Ö- oder eine Ö/W- Emulsion verwendet wird, die mit den erfindungsgemäßen Vesikeln vermischt wird, wird sie ebenfalls ein geeignetes W/Ö- oder Ö/W-Emulgiermittel, wie es auf dem Gebiet der Herstellung der W/Ö- oder Ö/W-Emulsionen bekannt ist, enthalten. Solche Emulgiermittel müssen sorgfältig ausgewählt werden, um eine Zerstörung der Vesikel zu vermeiden.
Die Dispersion aus erfindungsgemäßen Vesikeln und/oder Vehikeln, die die Dispersionen enthalten, können ebenfalls Puffer, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Feuchtigkeitsmittel, Penetrationsverstärker, UV-Absorptionsmittel, Farbstoffe, Duft- beziehungsweise Aromastoffe, Geschmacksstoffe, Süßstoffe, Pestizide, Insektenabwehrmittel. usw., enthalten.
Wie bereits erwähnt, werden Arzneimittel vorteilhafterweise in die Vesikel und/oder in die Vehikel, die die Dispersion von erfindungsgemäßen Vesikeln enthalten, eingearbeitet. Es scheint keine Beschränkung hinsichtlich des Verabreichungswegs für die erwähnten Präparate zu geben, eine Vielzahl von Arzneimitteln kann darin eingearbeitet werden, wie beispielsweise Steroidverbindungen, Dithranol, Nikotinsäure und die Derivate davon, Retinoide, Peptide, anti- inflammatorische Mittel, Anti-Proliferationsmittel, anti-mikrobielle Mittel und Vitamine. Die Liste an Arzneimitteln soll nicht als beschränkende Aufstellung gelten. Aus praktischen Gründen gibt es keine Bevorzugung für aktive Bestandteile in niedriger Dosis, die in die Vesikel eingearbeitet werden. Die erfindungsgemäßen Vesikel in nicht-polarer Phase scheinen besonders für die Einarbeitung von Arzneimitteln geeignet, die strukturell einem der Komponenten der Vesikel ähneln, wie Steroidverbindungen und Vitamin-A-Säure oder die Derivate davon.
Die Bevorzugung für die organischen Lösungsmittel, die verwendet werden, wird zu großen Teilen durch die beabsichtigte Anwendung bestimmt. Bei bestimmten Kategorien der Produkte, insbesondere auf dem pharmazeutischen, kosmetischen, Nahrungsmittel- und Pestizidverarbeitungsgebiet, sind keine signifikanten Mengen an bestimmten organischen Lösungsmitteln in den Endprodukten erlaubt.
Insbesondere sollten, wenn die Dispersionen der erfindungsgemäßen Vesikel für die Herstellung pharmazeutischer Dosisformen verwendet werden, die Komponenten davon hohe Standards hinsichtlich der Reinheit erfüllen. Die Wahl dieses beziehungsweise dieser grenzflächenaktiven Mittel und des nicht-polaren Exzipiens beziehungsweise der nicht-polaren Exzipientien hängt weiter davon ab, ob die pharmazeutischen Präparate, die die Dispersion von erfindungsgemäßen Vesikeln enthalten, auf oralem, topischem, nasalem, rektalem, pulmonalem oder parenteralem (d. h. intravenösem, intramuskularem oder subcutanem) Weg verabreicht werden.
Jedoch ist die Anwendung der Dispersion von den erfindungsgemäßen Vesikeln nicht auf pharmazeutische Zwecke beschränkt. Die Einarbeitung der Dispersion von Vesikeln in beispielsweise Kosmetika, Nahrungsmittel und Beschichtungspräparate für die Behandlung von Oberflächen allgemein, wird als von großem Wert angesehen.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Vesikel kann auf den folgenden Konzepten beruhen:
- leere Vesikel in einem Vehikel ohne zusätzlichen aktiven Bestandteil;
- leere Vesikel in einem Vehikel, zu dem ein aktiver Bestandteil gegeben wurde;
- beladene Vesikel in einem Vehikel ohne zusätzlichen aktiven Bestandteil;
- und beladene Vesikel in einem Vehikel, zu dem ein aktiver Bestandteil zugegeben wurde.
Beispiele für Produkte, die auf den erfindungsgemäßen Vesikeln beruhen, sind
- ein Reinigungsprodukt für die Entfernung von Fett und Schmutz;
- ein Entgiftungsprodukt für die Entfernung unerwünschter toxischer Substanzen aus dem Körper;
- ein Produkt, in das zwei unverträgliche Verbindungen eingearbeitet wurden, beispielsweise eine Creme, die Salicylsäure und Vesikel, beladen mit einem Corticosteroid, enthält;
- ein Produkt, in dem eine schnelle und eine verzögerte Freisetzung des aktiven Bestandteils kombiniert sind;
- die Einkapselung von wasserlöslichen Feuchtigkeitsmitteln in kosmetischen Präparaten;
- die Einkapselung von Vitamin C in Fruchtsäfte;
- die Einkapselung von Nikotin in Kaugummi; und
- ein Produkt, das leere Vesikel, aufgebaut aus essentiellen Fettsäuren, und ein Corticosteroid enthält.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

BEISPIELE

Beispiel I

Herstellung von Dispersionen der Vesikel in einem nicht-polaren Medium

1.1. Vesikel in flüssigem Paraffin werden wie folgt hergestellt:
6 g WASAG ESTER 15® und 600 mg Cholesterin werden in 200 ml Aceton gelöst. Zu der entstehenden Lösung werden 300 g flüssiges Paraffin gegeben, und dieses Gemisch wird heftig bei 70ºC unter Verwendung einer TURRAX®-Homogenisierungsvorrichtung zur Entfernung des Lösungsmittels Aceton durch Verdampfen gerührt. Die entstehende Dispersion wird auf Raumtemperatur unter Rühren abgekühlt. Das polarisierte Lichtmikroskopbild der entstehenden Dispersion zeigt die Anwesenheit einer Vielzahl von Malteser-Kreuzen, was als Maß für die Menge der Vesikel betrachtet werden kann. Die entstehenden multilamellaren Vesikel bestehen aus mehr als 200 molekularen Doppelschichten (geschlossen aus den FF-EM- Photographien, siehe Fig. 2) und hatten einen mittleren Durchmesser von 800 nm (berechnet aus den FF-EM-Photographien).
1.2. Ein weiterer Ansatz von Vesikeln in flüssigem Paraffin wurde wie folgt hergestellt:
70 g flüssiges Paraffin wurden auf 80ºC erhitzt und entgast. 30 g WASAG ESTER 15º und 3 g Cholesterin wurden in 80 g Ethanol bei 70ºC gelöst. Die klare Ethanollösung wurde mit dem flüssigen Paraffin unter Verwendung eines Rührers bei 150 UpM vermischt. Das Ethanol wurde bei verringertem Druck bei 80ºC entfernt. Es wurde angenommen, dass alles Ethanol entfernt war, wenn das Schäumen der Dispersion verschwand. Die entstehende Dispersion von Vesikeln wurde bei verringertem Druck auf 22ºC gekühlt. Die entstehenden multilamellaren Vesikel bestanden aus mehr als 20 molekularen Doppelschichten (geschlossen aus den FF-EM- Photographien) und hatten einen mittleren Durchmesser von 800 nm (berechnet aus diesen FF- EM-Photographien).
Die Vesikel waren während mindestens einem Jahr stabil.
1.3. Ein weiterer Ansatz von Vesikeln wurde auf gleiche Weise und unter Verwendung der gleichen Bestandteile wie bei 1.2. mit den folgenden Mengen hergestellt:
50 g WASAG ESTER 15® und 5 g Cholesterin, gelöst in Ethanol bei 70ºC, und 250 g flüssigem Paraffin.
1.4. Ein weiterer Ansatz von Vesikeln in flüchtigem Silikonöl wurde wie folgt hergestellt:
70 g ABIL K4® Silikonöl, 30 g WASAG ESTER 15® und 3 g Cholesterin wurden bei 80ºC unter Verwendung eines Rührers bei 150 UpM vermischt. Nach 45 Minuten wurde das Gemisch auf 22ºC abgekühlt. Die entstehenden Vesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um.
1.5. Andere Lipidvesikel werden in flüchtigem Silikonöl wie folgt hergestellt:
30 g ABIL K4® Silikonöl, 3 g WASAG ESTER 15® und 0,3 g Palmitinsäure werden bei 85ºC unter Verwendung eines Rührers mit 300 UpM vermischt. Nach 10 Minuten wird das Gemisch auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die entstehenden Lipidvesikel haben einen mittleren Durchmesser von 1 um. Wenn Palmitinsäure nicht zugegeben wird, zeigte die Probe eine große Menge an aggregierten Lipidvesikeln und nicht-vesikulärem Material.
1.6. Andere Lipidvesikel wurden in flüchtigem Silikonöl wie folgt hergestellt:
20 g ABIL K4® Silikonöl, 1 g WASAG ESTER 15® und 0, 1 g Retinsäure wurden bei 85ºC unter Verwendung eines Rührers mit 300 UpM vermischt. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die entstehenden Lipidvesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um. Wenn Retinsäure nicht zugegeben wurde, zeigte die Probe eine große Menge an aggregierten Lipidvesikeln und nicht-vesikulärem Material.
1.7. Andere Lipidvesikel wurden in flüchtigem Silikonöl wie folgt hergestellt:
20 g ABIL K4® Silikonöl, 1 g WASAG ESTER IS® und 0,1 g Propylenglykoldipelargonat wurden bei 85ºC unter Verwendung eines Rührers mit 300 UpM gerührt. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch auf Umgebungstemperatur während der Beschallung abgekühlt.
Die entstehenden Lipidvesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um. Wenn anstelle von Propylenglykoldipelargonat 0,1 g Diglyceryl-di-isostearostearat verwendet wurde, wurde die gleiche Menge an Vesikeln erhalten. Wenn der WASAG ESTER 15® alleine verwendet wurde, zeigte die Probe eine große Menge an aggregierten Lipidvesikeln und nicht- vesikulärem Material.
1.8. Andere Lipidvesikel wurden in flüchtigem Silikonöl wie folgt hergestellt:
10 g ABIL K4® Silikonöl, 1 g WASAG ESTER 15® und 0,33 g 2-Hexyloctylethanol wurden bei 90ºC unter Verwendung eines Rührers mit 300 UpM vermischt. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch auf Umgebungstemperatur während der Beschallung abgekühlt.
Die entstehenden Lipidvesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um. Wenn anstelle von 2-Hexyloctylethanol 0,33 g Dioctylphthalat verwendet wurden, wurde die gleiche Menge an Vesikeln erreicht. Wenn WASAG ESTER 15® alleine verwendet wurde, zeigte die Probe eine große Menge an aggregierten Lipidvesikeln und nicht-vesikulärem Material.

Beispiel 2

Herstellung von Dispersionen von beladenen Vesikeln in einem nicht-polaren Medium

2.1. Vesikel, beladen mit Dinatriumfluorescin, wurden auf gleiche Weise wie in 1.1. unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:
65 mg Dinatriumfluorescin, 20 g WASAG ESTER 15® und 2 g Cholesterin, gelöst in 80 g Ethanol bei 70ºC und 100 g flüssigem Paraffin.
Die entstehenden Vesikel hatten einen Durchmesser von 1 um und zeigten eine helle Fluoreszenz, typisch für Dinatriumfluorescin. Keine Kristalle aus Dinatriumfluorescin wurden in dieser Dispersion festgestellt (geprüft mit einem Polarisationsmikroskop). Wegen der extrem niedrigen Löslichkeit des Dinatriumfluorescin in flüssigem Paraffin wurde geschlossen, dass alles Dinatriumfluorescin innerhalb der Vesikel eingekapselt war.
2.2. Ein weiterer Ansatz an Vesikeln, beladen mit mit dem Corticosteroid Budesonid wurde auf gleiche Weise, wie in 1.1 beschrieben, hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet wurden:
381 mg Budesonid, 50 g WASAG ESTER 15® und 5 g Cholesterin, gelöst in 100 ml Ethanol bei 70ºC und 250 g flüssigem Paraffin bei 80ºC.
Die entstehenden Vesikel hatten einen Durchmesser von 1 um. In der Probe konnten keine Kristalle aus Budesonid gesehen werden. Wegen der extrem niedrigen Löslichkeit des dBudesonids in flüssigem Paraffin wurde geschlossen, dass das gesamte Budesonid innerhalb der Vesikel eingekapselt war.
2.3. Ein weiterer Ansatz an Vesikeln, beladen mit Gramicidin D wurde auf gleiche Weise wie bei 1.1 hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet wurden:
100,6 mg Gramicidin D, 20 g WASAG ESTER 15® und 2 g Cholesterin, gelöst in 100 ml Ethanol bei 70ºC und 100 g flüssigem Paraffin bei 80ºC.
Die entstehenden Vesikel hatten einen Durchmesser von 1 um. Keine Kristalle von Gramicidin D konnten in der Probe gesehen werden. Wegen der extrem niedrigen Löslichkeit von Gramicidin in flüssigem Paraffin wurde geschlossen, dass alles Gramicidin D innerhalb der Vesikel eingekapselt war.
2.4. Ein anderer Ansatz an Vesikeln, beladen mit dem Corticosteroid Hydrocortison- 17-butyrat, wurde auf gleiche Weise wie in 1.1 hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet wurden:
250 mg Hydrocortison-17-butyrat, 30,1 g WASAG ESTER 15® und 3 g Cholesterin, gelöst in 50 ml Ethanol bei 70ºC und 70 g flüssigem Paraffin bei 80ºC.
Die entstehenden Vesikel hatten einen Durchmesser von 1 um. Es konnten keine Kristalle von Hydrocortison-17-butyrat in der Probe gesehen werden. Wegen der extrem niedrigen Löslichkeit des Hydrocortison-17-butyrat in flüssigem Paraffin wurde geschlossen, dass alles Hydrocortison-17-butyrat innerhalb der Vesikel eingekapselt war.
2.5. Ein weiterer Ansatz aus Vesikeln, beladen mit Hydrocortison-17-butyrat, wurde auf gleiche Weise, wie in 1.3 beschrieben, hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet wurden:
70 g ABIL K4®, 30 g WASAG ESTER 15®, 3 g Cholesterin und 0,25 g Hydrocortison- 17-butyrat.
Die entstehenden Vesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um. Es konnten keine Kristalle von Hydrocortison-17-butyrat in der Probe gesehen werden. Wegen der extrem niedrigen Löslichkeit des Hydrocortison-17-butyrats in ABIL K4® wurde geschlossen, dass alles Hydrocortison-17-butyrat innerhalb der Vesikel eingekapselt war.
2.6. Vesikel, beladen mit Methyl-p-hydroxybenzoat (NIPAGIN M®) wurden auf gleiche Weise wie in 1.1. hergestellt, wobei die folgenden Bestandteile verwendet wurden:
400 mg NIPA M®, 20 g WASAG ESTER 15® und 2 g Cholesterin, gelöst in 80 g Ethanol bei 70ºC und 177,6 g flüssigem Paraffin.
Die entstehenden Vesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 1 um. Es waren keine Kristalle von NIPA M® in der Probe vorhanden (geprüft mit einem Polarisationsmikroskop).
1 g der Probe wurde bei 3000 UpM für 10 Minuten unter Verwendung einer HERAEUS CHRIST MINIFUGE 2-Zentrifuge zur Abtrennung der Vesikel von der externen Paraffinphase zentrifugiert.
50 ul der klaren externen Phase wurden mit 2 ml 75%igem Propylenglykol/Wasser- Gemisch extrahiert. Die UV-Absorption des Extraktes bei 274,8 nm, wurde unter Verwendung eines SHIMADZU UV-160-Spektrophotometers gemessen. Die Menge an NIPA M wurde unter Verwendung einer Eichkurve für 6 Eichlösungen berechnet. Es wurde gefunden, dass die Konzentration von NIPA M in der externen Phase 46,8 pg/ml (N = 2) betrug, die gemessene Sättigungskonzentration von NIPA M in flüssigem Paraffin betrug 55 ul/ml.
Es wurde berechnet, dass 97,3% (N = 2) der Gesamtmenge an NIPA M in der Probe innerhalb der Vesikel eingekapselt waren.

Beispiel 3

Herstellung einer üblichen Creme und einer Creme, enthaltend eine Dispersion von leeren Vesikeln

3.1. Eine übliche Creme wurde wie folgt hergestellt:
3000 g weißes weiches Paraffin, 1200 g flüssiges Paraffin, 1440 g Cetylstearylalkohol und 40 g Methyl-p-hydroxybenzoat (NIPAGIN M®) wurden zusammen bei 70ºC erhitzt. 360 g CETOMACROGOL 1000®, 84 g wasserfreie Zitronensäure und 56 g wasserfreies Trinatriumcitrat wurden in 13820 g Wasser bei 70ºC gelöst. Beide Phasen wurden zusammen vermischt, wobei gleichzeitig ein Rührer mit 200 UpM und eine TURRAX®-Homogenisierungsvorrichtung mit 2000 UpM verwendet wurden. Die Dispersion wurde bei verringertem Druck auf 22ºC gekühlt.
3.2. Eine Creme, enthaltend Vesikel, wurde wie folgt hergestellt:
50 g Dispersion gemäß 1.2 wurden mit 200 g Creme gemäß 3.1 während 30 Minuten bei 20ºC unter Rühren mit 50 UpM vermischt. Nach 3 Monaten waren die Vesikel noch homogen innerhalb der Creme verteilt (beobachtet mit einem Polarisationsmikroskop).

Beispiel 4

Herstellung eines üblichen Gels und eines Gels, das eine Dispersion von leeren Vesikeln enthält

4.1. Ein übliches Gel wurde durch Disperison von 10 g CARBOPOL 934® in 990 g Wasser hergestellt. Der pH der entstehenden Suspension wurde auf pH 4,0 mit Triethanolamin eingestellt.
Ein Gel, enthaltend Vesikel, wurde durch Handvermischen von 0,8 g Dispersion gemäß 1.2 mit 3,2 g Gel gemäß 4.1 in einem Mörser hergestellt.
Das entstehende Gel hatte ein cremiges Aussehen. Die Vesikel waren homogen im Gel verteilt (beobachtet mit einem Polarisationsmikroskop). Die Vesikel waren während mindestens einem Jahr stabil.

Beispiel 5

Herstellung von Cremes, die eine Dispersion von Vesikeln und ein Medikament (frei oder eingekapselt in den Vesikeln), oder ein Medikament allein erhalten

5.1. Eine Creme, die Budesonid eingekapselt in Vesikeln enthielt, wurde durch Mischen (mit einem Rührer bei 50 UpM) während einer halben Stunde von 50 g Dispersion gemäß 2.2 mit 200 g Creme gemäß 3.3 hergestellt.
5.2. Eine Creme, enthaltend freies Budesonid und Vesikel, wurde durch Vermischen (mit einem Rührer bei 50 UpM) während 30 Minuten von 50 g Creme gemäß 3.2. und 12,5 g Budesonid hergestellt.
5.3. Eine Creme, die Hydrocortison-17-butyrat eingekapselt in Vesikeln enthielt, wurde durch Handvermischen in einem Mörser von 4 g der Dispersion gemäß 2.4 mit 6 g Creme gemäß 3.1. hergestellt.
5.4. Eine Creme, die Hydrocortison-17-butyrat eingekapselt in Vesikeln enthielt, wurde durch Handvermischen in einem Mörser von 4 g der Dispersion gemäß 2.5 mit 6 g Creme gemäß 3.1 hergestellt.
5.5. Eine Creme, die Hydrocortison-17-butyrat ohne Vesikeln enthielt, wurde durch Handvermischen in einem Mörser von 10 mg Hydrocortison-17-butyrat mit 10 g Creme gemäß 3.1 hergestellt.

Beispiel 6

Herstellung von Gelen, die eine Dispersion von Vesikeln und Dinatriumfluorescein (frei oder eingekapselt innerhalb der Vesikel) oder Dinatriumfluorescein allein enthalten

6.1. Ein Gel, das eingekapseltes Dinatriumfluorescein in Vesikeln enthielt, wurde durch Handvermischen in einem Mörser von 0,8 g Dispersion gemäß 2.1 mit 3,2 g Gel gemäß 4.1 hergestellt. Nach 6 Monaten waren die Vesikel noch homogen im Gel verteilt.
6.2. Ein Gel, das freies Dinatriumfluorescein und Vesikel enthielt, wurde durch Auflösen von 1 mg Dinatriumfluorescein in 10 g Gel gemäß 2.4 hergestellt. Nach 6 Monaten waren die Vesikel noch homogen im Gel verteilt.
6.3. Ein Gel, das Dinatriumfluorescein allein enthielt, wurde durch Auflösen von 1 mg Dinatriumfluorescein in 10 g Gel gemäß 4.1 hergestellt.

Beispiel 7

In vitro-Budesonid-Freisetzung aus Cremes, die eine Dispersion von Vesikeln enthalten

Die Cremes gemäß 5.1 und 5.2 wurden im Folgenden bei in vitro-Diffusionstests verglichen.
Die in vitro-Budesonid-Freisetzungsexperimente wurden bei einer Temperatur von 35ºC unter Verwendung eines Perspex-Donor-Compartments, in dem die Cremeschicht 1,8 mm von der wässrigen Akzeptorphase (0,5% W/W CETOMACROGOL 1000®) durch eine Cellulosetriacetat-Membran (SM 14539, SARTORIUS®, Niederlande) mit einer Oberfläche von 52,8 cm² getrennt war, durchgeführt. 100 ml Akzeptorphase wurden durch die Akzeptorkammer in einer Rate von etwa 1,8 ml/min zirkuliert. Proben von 1 ml wurden mit 30 Minuten-Intervallen entnommen. Nach Einfüllen der Probe wurde die Akzeptorphase auf 100 ml mit 1 ml frischer Akzeptorphase aufgefüllt. Die Budesonid-Konzentrationen in den Proben wurden unter Verwendung von HPLC bestimmt. 50 ul-Proben wurden in das System mit Hilfe einer automatischen Injektionsvorrichtung (GILSON® MODEL 231) injiziert. Die Umkehrphasen-HPLC-Säule (CHROMSPHER® C18 100 · 3 mm, CHROMPACK®, Niederlande) wurde bei 22ºC mit einer mobilen Phase, bestehend aus Acetonitril/Wasser (35/65 Vol/Vol), mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min eluiert. Der Säulenausfluss wurde bei 242 nm (APPLIED BIOSYSTEMS® 757) gemessen. Die Retentionszeit des Budesonids betrug etwa 7 Minuten.
Beide Cremes wurden doppelt geprüft, die maximale Abweichung zwischen den Ergebnissen von einem Präparat beträgt 8%.
In Fig. 3 ist die Menge an Budesonid, die durch die Membran (wie oben beschrieben) penetriert, als Funktion der Quadratwurzel der Anwendungszeit angegeben.
Aus diesen Ergebnissen scheint es, dass die Einkapselung von Budesonid in Vesikeln innerhalb einer Creme signifikant die Freisetzung des Budesonids aus einer solchen Creme verzögert.

Beispiel 8

Der Einfluss der Einkapselung auf das Fluoreszenzverhalten von Dinatriumfluorescein

Das Fluoreszenzverhalten von Dinatriumfluorescein in Gelen gemäß 6.1, 6.2 und 6.3 wurde mit einem Reflektions-Fluoreszenzmikroskop mit reflektiertem Licht (RLFM) untersucht. Das RLFM-Mikroskop (OLYMPUS® BH&sub2;, Japan) mit Blaulicht-Anregung wurde zur Untersuchung des Fluoreszenzmusters von den Gelen gemäß 6.1, 6.2 und 6.3 verwendet. Die Bilder des Mikroskops wurden mit einer Videokamera (SONY® DXC-3000P) registriert und mit einem Videorekorder (SONY® VO 5800PS) aufgenommen.
Mit Hilfe der beschriebenen Vorrichtung war es möglich, die Zeit zu messen, nach der die Fluoreszenz innerhalb der Gele verschwand. Für die Gele 6.1, 6.2 und 6.3 betrug diese Zeit: 469, 53 Sekunden und weniger als 1 Sekunde.
Aus diesen Versuchen war klar, dass das stark wasserlösliche Dinatriumfluorescein noch in den Vesikeln eingekapselt war, nachdem sie in einem Gel dispergiert wurden.

Beispiel 9

In vivo-Corticosteroid-Freisetzung auf der humanen Haut

Die in vivo-Hautbleichwirkung der Corticosteroid-Cremes gemäß 5.3, 5.4 und 5.5 wurde in einem McKenzie-Stoughton-Test verglichen.
Der Test wurde mit einer Gruppe von nicht kranken Patienten, Freiwilligen (1 weibliche und 7 männliche Personen) durchgeführt. Stellen wurden auf dem Flexoraspekt beider Vorderarme durch Lichtindentation mit einem kreisförmigen Stempel mit einem Durchmesser von 15 mm markiert. Die Stellen waren mindestens 4 cm von dem Handgelenk und Ellbogen entfernt. Die vorcodierten Präparate wurden auf diese Stellen gemäß der Latin-Quadrat- Versuchsanordnung angewendet. Die Präparate wurden in Mengen von 10 ul pro Stelle aus einer Einwegpipette (Capilettor®) aufgetragen. Die Anwendungsstellen wurden dann bedeckt, aber nicht eingeschlossen mit einem Klebeband, welches an seinem Ort mit einem Ring von chirurgischem Band gehalten wurde (Durchmesser: außen 50/60 mm, innen 25 mm).
Die Verbände wurden 9 Stunden nach Anwendung der Zubereitungen entfernt, und die Arme wurden mit Seife und lauwaremem Wasser gewaschen. Dementsprechend wurde das Bleichen an den verschiedenen Stellen visuell auf einer integralen Skala von 0 bis 4 von zwei erfahrenen Prüfern bewertet, die unabhängig voneinander arbeiten. Dies erfolgte 1, 3, 6, 9, 25 und 32 Stunden nach Entfernung der Präparate. Die Versuche wurden als Doppel-Blindversuch durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 4 aufgeführt, wo die mittleren Bleichbewertungen als Funktion der Zeit angegeben sind.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die absolute Menge des Steroids, welche die Tiefhautschicht (wo die Bleichung stattfindet) erreicht, für die Cremes 5.1 und 5.2 niedriger war als für die bekannte Creme 5.3. Dies wurde durch die langsamere Freisetzung und die Retention des Hydrocortison-17-butyrat durch Einkapselung erreicht.
Die bekannte Creme hatte eine Spitzenbewertung nach 3 Stunden (2,64), und die Bewertung nahm stark auf 1,87 nach 9 Stunden ab. Beide Cremes mit Hydrocortison-17-butyrat, eingekapselt in multilamellaren Vesikeln, zeigten keine so schnelle Abnahme.
Aus diesen Ergebnissen folgt, dass Vesikel verwendet werden können, um eine verzögerte Freisetzung eines Arzneimittels aus dermatologischen Formulierungen und eine Retention in den oberen Hautbereichen zu erreichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Dispersion von Vesikeln, die eine nicht-polare Phase einkapseln, in einer nicht-polaren Phase, wobei die Vesikel ein grenzflächenaktives Mittel und ein Gemisch aus grenzflächenaktiven Mitteln umfassen, dadurch gekennzeichnet dass das grenzflächenaktive Mittel oder das Gemisch aus grenzflächenaktiven Mitteln ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Saccharosefettsäureestern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein lipophiler Stabilisierungsfaktor zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe der Sterole, wie (teilweise) hydrierte 10,13-Dimethylcyclopentaphenanthrene, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxyl und Carbonsäure und deren Ester, wie Cholesterin.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe aus Retinoiden, wie Retinsäure.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe der verzweigten Fettalkohole, wie 2-Hexyloctylethanol.

6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe geradkettiger oder verzweigtkettiger (Zahl der C-Atome: 4 oder darüber) gesättigter aliphatischer Alkoholester von aliphatischen oder aromatischen Dicarbonsäuren (Zahl der C- Atome: 4 oder darüber), wie Dioctylphthalat.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe gesättigter und ungesättigter Fettsäuren, wie Palmitinsäure.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der lipophile Stabilisierungsfaktor ausgewählt wird aus der Gruppe geradkettiger oder verzweigtkettiger Fettsäureester mit Polyhydroxylverbindungen, wie Propylenglykoldipelargonat und Diglycerindiisostearostearat.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein hydrophiler Stabilisierungsfaktor, der eine polare Flüssigkeit ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasser und Verbindungen mit einem Molekulargewicht von bis zu 150 und mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die Wasserstoffbrücken bilden können, wie eine Hydroxyl-, eine mono- oder disubstituierte Amino- und eine Carbonsäuregruppe, wie Ethanol und Ethanolamin, zugegeben wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als nicht-polare Phase ein flüssiges Paraffin oder ein flüchtiges Silikonöl verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere hydrophile (biologisch) aktive Mittel zu der nicht-polaren Phase zugegeben werden und/oder in den Vesikeln eingeschlossen sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere lipophile (biologisch) aktive Mittel zu der nicht- polaren Phase zugegeben werden und/oder in den Vesikeln eingeschlossen sind.