DE69230106T2 - Peptid-antigene bestehend aus multi-determinanten, die die t-helfer lymphozyten-antwort gegen hiv in einem weiten bereich von betroffenen menschen stimulieren - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von Peptiden, die sich für die Herstellung eines Vakzins bzw. von Vakzinen gegen Infektion mit HIV oder als Bestandteile eines therapeutischen Gemisches oder als Bestandteile eines Kits zur Diagnose von HIV-Serokonversion eignet bzw. eignen. Außerdem beschreibt die vorliegende Erfindung eine Reihe von nach diesem Verfahren ausgewählten Peptiden.
• Ganzvirusvakzine gegen HIV, entweder lebend und attenuiert oder abgetötet, gestatten die Stimulation von Immunität gegen die größte Gruppe antigener Determinanten des Virus. Sie können jedoch auch Strukturen enthalten, die von dem Virus zur Vermeidung des immunsystems entwickelt wurden, wie suppressive Epitope oder maskierende Kohlehydrate, oder Strukturen, die schädigende Wirkungen hervorrufen, wie fördernde Antikörper, die die Infektivität des Virus verstärken (Takeda, A. et al., Science 242: 580-583. (1988); Robinson, W. E. Jr. et at, Proc. Nati. Acad. Sct USA 86: 4710-4714 (1989); Robinson, W. E. Jr. et al.; Proc. Nati. Acad. Sct USA 87: 3185-3189 (1990); Halstead, S. B. Science 239: 476-481 (1988)) oder Antikörper oder T-Zellen, die bei HIV zum Immunmangel beitragen können (Weinhold, K. J. et al., J Immunol 142: 3091-3097 (1989); Siliciano, R-F. et al., Cell 54: 561-575 (1988); Mittler, R. S. und M. K. Hoffmann, Science 245: 1380-1382 (1989); Golding, H. et al., J. Clin. Invest. 83: 1430-1435 (1989)). Außerdem ist bei vielen als Empfänger in Frage kommenden Patienten bei einem Retrovirus wie HIV keine Akzeptanz gegeben, da Bedenken bezüglich der Sicherheit von Vakzinen mit lebenden attenuierten, jedoch auch abgetöteten, ganzen Viren bestehen. Bei gereinigten Spaltvakzinen ist das Sicherheitsrisiko geringer, es bestehen jedoch gegebenenfalls nach wie vor die restlichen Probleme, die im Zusammenhang mit Ganzvirusvakzinen auftreten. Da die Evolution des Virus nämlich auf Vermeidung des Immunsystems zielt, ist es möglich, daß die Evolutionsentwicklung von Virusproteinen gefördert wird, die als Impfstoffe nicht gerade optimal sind. Im Gegensatz zu den Enzymen, die von der Evolution optimiert wurden, um die besten Strukturen für die Katalyse ihrer Reaktionen aufzuweisen, geben Virusproteine der Wissenschaft beträchtliche Möglichkeiten, die Natur bezüglich der Entwicklung besserer Vakzine zu verbessern (Berzofsky, J. A., J Clin. Invest 82: 1811-1817 (1988)).
• Zur rationellen Entwicklung von komplizierten synthetischen oder rekombinanten Vakzinen gegen Viren muß beträchtliches Wissen darüber, wie das Immunsystem funktioniert, insbesondere über die Immunantwort auf vom Virus exprimierte Strukturen, vorhanden sein. Solch ein Ansatz wurde von den Erfindern des vorliegenden Patents dadurch in Angriff genommen, daß versucht wurde, antigene Determinanten zu identifizieren, die von den cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) (Takahashi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3105-3109 (1988); Takahashi, H. et al., Science 246: 118-121 (1989); Takahashi, H. et al., J. Exp. Med. 170: 2023-2035 (1989); Takahashi, H. et al., J. Exp. Med. 171: 571-576 (1990); Hosmalin, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2344-2348 (1990)) und von T-Helferzellen, die entweder für eine CTL- oder eine Antikörperantwort erforderlich wären, erkannt werden (Cease, K. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4249-4253 (1987); Berzofsky, J. A. et al. Nature 334: 706-708 (1988); Clerici, M. et al., Nature 339: 383- 385 (1989); Hale, P. M. et al., Internat. Immunol. 1: 409-415 (1989)). Ein mögliches Problem bei der Verwendung einer beliebigen einzelnen antigenen Determinante besteht jedoch darin, daß T-Zellen Antigene erkennen, die mit vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) des Hosts kodierten Molekülen assoziiert sind, und die MHC-Moleküle eines beliebigen Individuums binden und präsentieren nur eine Untergruppe von möglichen antigenen Determinanten, die von der Spezies insgesamt erkannt werden könnten (Benacerraf, B., J. Immunot 120: 1809-1812 (1978); Schwartz, R. H., Annu. Rev. Immunol. 3: 237-261 (1985); Berzofsky, J. A., in "The Antigens". S. 1-146, M. Sela, Herausgeber, c. 1987 Academic Press, New York). Dies trifft sowohl auf den Menschen als auch auf Mäuse zu (Siliciano, R-F. et al., Cell 54: 561-575 (1988); Schrier, R. D. et al., J Immunot 142: 1166-1176 (1989); Callahan, K. M. et al., J. Immunol. 144: 3341-3346 (1990); Martin, R. et al., J. Immunol. 145: 540-548 (1990); Martin, R. et al., J Exp. Med. 173: 19-24 (1991); Jaraquemada, D. et al., J. Immunot 145: 2880-2885 (1990)).
• Um sich für eine große, durch Kreuzung entfernter Verwandter entstandene Population zu eignen, wie z. B. für den Menschen, sollte ein Vakzin daher multiple Determinanten dieser Art enthalten. Bezüglich der Fragestellung, wie viele Determinanten dieser Art vorhanden sein sollten, existieren nur wenige Daten. Es wurde zwar die Befürchtung geäußert, daß die Anzahl praktisch nicht zu erreichen wäre, existieren doch einige Daten, die nahelegen, daß nur vier Determinanten dieser Art Reaktionen bei 85-90% von aus Kreuzung entfernter Verwandter hervorgegangenen Menschen hervorrufen könnten (Clerici, M. et al., Nature 339: 383-385 (1989)). Es wurden einige wenige antigene Peptide identifiziert, die sich, wenn mit vielen DR-Molekülen assoziiert, bezüglich ihrer Erkennung wirr verhalten (Sinigaglia, F. et al., Nature 336: 778-780 (1988); Panina- Bordignon, P. et al., Eur 1 Immunol. 19: 2237-2242 (1989)), möglicherweise, weil DR-Molekülen eine konservierte alpha-Kette gemeinsam ist, und bei der Maus wurde berichtet, daß einige Determinanten von drei unterschiedlichen I-A-Molekülen dargestellt werden, denen keine alpha-Kette gemeinsam ist (Brett, S. J. et al., 1 Immunol. 143: 771-779 (1989)), oder sogar durch MHC-Moleküle der Klasse 11 mit unterschiedlichen Isotypen, wie I-A und I-E (Guillet, J.-G. et al., Science 235: 865-870 (1987)). Die Häufigkeit, mit der solche Epitope mit wirren Verhalten vorkommen, ist jedoch nicht geklärt.
• Während wir die für die T-Zellen-Stimulation wesentlichsten Stellen der HIV-Hülle orteten, beobachteten wir, daß in der Sequenz Regionen existierten, die multiple überlappende Determinanten enthielten, die von Mäusen unterschiedlicher MHC-Haplotypen erkannt wurden (Haie, P. M. et al., Internat. Immunol 1: 409-415 (1989)). Obwohl die von den T- Zellen jedes Mäusestamms erkannten einzelnen Determinanten unterschiedlich waren, enthielt jede multideterminante Region Determinanten, die zur Stimulation der T-Zellen von Mäusen mit drei oder vier der vier geprüften MHC-Typen fähig waren. Wir kamen daher zu dem Schluß, daß Peptide, die solche multideterminanten Regionen umfassen, fähig sein könnten, die T-Zellen vieler oder der meisten Haplotypen bei der Maus und hoffentlich auch die T-Zellen von Menschen vieler HLA- Typen zu stimulieren. Solche multideterminanten Peptide könnten daher eine Möglichkeit darstellen, dieses Problem der MHC-Beschränkung bei der Entwicklung synthetischer Vakzine zu umgehen. Diese Hypothese wurde daher von den Anmeldern des vorliegenden Texts dadurch geprüft, daß sie sechs synthetische Peptide mit jeweils 20-33 Resten konstruierten, die den sechs multideterminanten Regionen des HIV-Hüllproteins in der Maus entsprechen (Hale, P. M. et al., Internat. Immunat 1: 409-415 (1989)), und sie prüften diese Peptide auf ihre Fähigkeit, die Reaktionen der T- Zellen in mit rekombinantem gp160 immunisierten Mäusen und in periphären Blutlymphocyten von mit HIV infizierten Menschen zu stimulieren. Obwohl nicht alle Peptide in dem erwarteten Ausmaß erkannt wurden, wurden mehrere solche Peptide identifiziert, die breit sowohl von Mäuse- als auch von Human-T-Zellen multipler H-2- und HLA-Typen erkannt wurden. Diese Peptide sind auch fähig, Mäuse auf Reaktionen der T-Zellen auf das intakte HIV-Hüllprotein zu immunisieren und eignen sich daher als wertvolle Bestandteile eines synthetischen Vakzins, und Reaktionen auf sie stellen nützliche diagnostische oder prognostische Marker dar.
• Aus EP-0273716 sind bestimmte Peptide bekannt, von denen behauptet wird, daß sie Zellimmunität gegen HIV und HIV-Proteine induzieren. WO- A-9000901 lehrt Verfahren zur Identifizierung von Epitopen der HIV-T- Zellen. Aus WO-A-9104045 ist ein Peptid mit einer Sequenz, das einer konservierten Domäne eines HIV-Proteins entspricht, zur Verwendung bei der Prophylaxe und Therapie von AIDS bekannt. Aus EP-A-0370458 ist ein von einem rekombinanten HIV-Antigen kodiertes relativ langes Polypeptid bekannt.
• WO89/02277 beschreibt synthetische Peptide zur Verwendung als Vakzine für die Prophylaxe und Therapie von AIDS. EP-A-00317804 befaßt sich mit synthetischen Peptiden, die verschiedene Sequenzen eines HIV-Hüllproteins wiedergeben. EP-A-0279688 betrifft die Verwendung von HIV-Hüllproteinen oder deren Fragmenten zur Behandlung von Immunentzündungen. EP-A-0328403 beschreibt mit einem HIV-Hüllprotein verwandte synthetische Peptide zum Nachweis von HIV-Antikörpern. Ein Verfahren zur Identifizierung von HIV-seropositiven Patienten wird von Klerici et al. Nature 339-383, 1988 beschrieben.
• Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Auswahl von synthetischen Peptiden aufzuzeigen, bei denen es sich um nützliche potentielle Vakzine gegen HIV handelt. Außerdem wird eine Gruppe von bestimmten Peptiden beschrieben, bei denen eine Wirksamkeit in dem oben genannten Verfahren nachgewiesen wurde. Schließlich läßt sich die Erfindung im diagnostischen und therapeutischen Umfeld anwenden.
• Fig. 1 zeigt die Proliferationsreaktion von T-Zellen aus gegen gp160 immunen Mäusen auf die sechs Cluster-Peptide.
• In Fig. 2 ist die Proliferationsreaktion auf rekombinantes gp160 von aus den Lymphknoten von mit Cluster-Peptiden immunisierten Mäusen isolierten T-Zellen dargestellt.
• Die Erfindung wird unten anhand mehrerer Beispiele beschrieben. Die Beispiele dienen zur Erläuterung und sind nicht als erfindungsbeschränkend aufzufassen.
Beispiel 1 Auswahl von Peptiden umfassend multideterminante HIV-Hüll-Cluster, die in vitro T-Zellen-Reaktionen in Mäusen mit multiplen MHC-Typen und einer Population von HIV-seropositiven Menschen induzieren.
• 1. Peptidsynthese. Die sechs Cluster-Peptide werden mit Hilfe der t-Boc-Chemie mit einem automatischen Peptid-Synthesizer Applied Biosystems 430A synthetisiert (Stewart, J. M. und J. D. Young. "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)). Die Peptide werden mit HF vom Harz abgespalten und anfänglich durch molekulare Ausschlußchromatographie (P4 biogel, BioRad) gereinigt. Zur Bestimmung des Reinheitsgrads sowie in denjenigen Fällen, bei denen weitergereinigt werden muß, bedient man sich der HPLC mit umgekehrter Phase. Die HPLC-Trennungen werden an Waters ubondapack analytischen und präparativen C18-Säulen mit umgekehrter Phase durchgeführt. Die Sequenzen der für den Versuch synthetisierten Peptide sind in Tabelle 1 unten angegeben: Tabelle 1: Sequenzen der Cluster-Peptide
• Die von den sechs Cluster-Peptiden umfaßten Peptide sind in Tabelle 2 unten dargestellt: Tabelle 2. Sequenzen der Clusterpeptide und der von ihnen umfaßten Peptide
• 2. Mausmaterial. Die Stämme B10.BR/SgSn und B10.D2/nSn stammen von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Die Stämme B10.S(9R) und B10A(5R) werden in unserer Kolonie von Zuchttieren, die von J. Stimpfling Laboratory bzw. The Jackson Laboratory stammen, gezüchtet.
• 3. Herstellung von gp160. Rekombinantes gp160 wird wie beschrieben aus Zellen hergestellt, die mit rekombinantem Baculovirus, das das gp160-Gen des HIV-1-Isolats HTLV-IIIB exprimiert, infiziert sind (Javaherian, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6768-6772 (1989)).
• 4. T-Zellen-Proliferationstest (Corradin, G., J. Immunol. 119: 1048) (1977)). Die Mäuse werden subkutan in den Schwanz mit 20-30 ug rekombinantem gp160, das im Verhältnis 1 : 1 in komplettem Freund'schem Adjuvans emulgiert ist, immunisiert. 8-11 Tage nach der Immunisierung werden die Mäuse getötet und ihre ableitenden inguinalen sowie die Aorta umgebenden Lymphknoten entnommen und in komplettem T-Zellen- Medium (Matis, L. A. et al., J Immunol. 130: 1527-1535 (1983)) zu Einzelzellsuspensionen präpariert. Aliquote Teile zu 4 · 105 Zellen werden in die Näpfchen von 96-Well-Flachboden-Kulturplatten gegeben, die die Clusterpeptide in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten (Endkonzentration 2, 0,66 bzw. 0,22 uM, drei Wiederholungen). Nach viertägiger Inkubation bei 37º in 5% CO&sub2; werden alle Näpfchen mit tritiummarkiertem Thymidin (1 mCi) versetzt. 24 Stunden später werden die Zellen mit einem automatischen Erntegerät (Skatron) geerntet und das in die DNA eingebaute Thymidin wird durch Szintillationszählung bestimmt. Der Stimulationsindex stellt das Verhältnis der in Gegenwart des Antigens eingebauten cpm zu den von Zellen, die nur mit Medium gezüchtet wurden, eingebauten cpm dar.
• Jedes Cluster-Peptid aus Tabelle 1 wurde wie oben beschrieben synthetisiert und gereinigt und auf die Fähigkeit, Proliferationsreaktionen in den T-Zellen von Mäusen, der beobachteten vier MHC-Typen, die mit rekombinantem gp160 immunisiert worden waren, zu stimulieren, untersucht. Es wurden congene BIO-Mäuse verwendet, die sich nur bezüglich ihres MHC-Typs unterscheiden, jedoch sonst genetisch identisch sind. Die beobachteten vier Maus-MHC-Typen werden deshalb gewählt, da sie vier unabhängige MHC-Haplotypen darstellen, die jeweils sowohl ein I-A-Molekül als auch ein I-E-Molekül exprimieren und sich voneinander in Hinsicht auf beide Moleküle unterscheiden. Zusammen exprimieren die vier Stämme daher acht unterschiedliche Maus-MHC- Moleküle der Klasse 11. Es sei anzumerken, daß den Maus-I-E-Molekülen, wie auch den menschlichen DR-Molekülen, zu denen sie homolog sind, allen eine konservierte alpha-Kette gemeinsam ist, daß sie sich jedoch bezüglich ihrer beta-Kette unterscheiden, was zu dem Polymorphismus insgesamt führt. Die unterschiedlichen I-E- und DR-Allele unterscheiden sich bezüglich ihrer Reaktion auf die meisten Antigene, was die wichtige Rolle der beta-Kette verdeutlicht, obwohl allen die alpha-Kette gemeinsam ist.
• Jedes Peptid wurde in vier unabhängigen Versuchen (bzw. im Fall von Cluster-Peptid 3, das als letztes synthetisiert wurde, drei unabhängigen Versuchen) untersucht, und die Ergebnisse wurden durch Bestimmung des geometrischen Mittels der Stimulationsindizes für eine bestimmte Peptidkonzentration in allen vier Versuchen kombiniert. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, in der der Stimulationsindex in Abhängigkeit von der Peptidkonzentration in der Kultur für 4 congene Mäusestämme, die 4 unterschiedliche MHC-Haplotypen darstellen, angegeben ist. Jeder Wert ist der geometrisch gemittelte Stimulationsindex von 4 (bzw. 3 im Fall des Cluster-Peptids 3) unabhängigen Versuchen. Obwohl die Ergebnisse der verschiedenen Versuche qualitativ ähnlich waren, unterschieden sich die absoluten Werte der Stimulationsindizes doch so stark, daß die Irrtumsbalken in diesen Kurven schlecht abzulesen sind. Stattdessen sind Werte, für die sich der mittlere Stimulationsindex aller Versuche vom Hintergrund (1,0) laut Student's t-Test (p < 0,05) statistisch signifikant unterscheidet, mit einem Sternchen versehen. Die Ergebnisse wurden nur dann als positiv bezeichnet, wenn dieser Wert signifikant war, und der mittlere Stimulationsindex aller Versuche betrug > 2. Nur Cluster-Peptide 3, 4 und 6 riefen bei Mäusen aller vier MHC-Haplotypen eine positive Reaktion hervor. Das Cluster-Peptid 6 zeigte die stärkste Stimulationswirkung bei BIO.BR- und BIO. A(5R)-Mäusen und führte zu schwächeren, jedoch signifikant positiven und reproduzierbaren Reaktionen bei BIO.S(9R) und BIO.D2. Die Stimulationswirkung von Cluster-Peptid 4 war bei BIO.S(9R) am stärksten, war jedoch bei den anderen Stämmen ebenfalls signifikant und reproduzierbar positiv. Cluster-Peptid 3 wies bei B10.S(9R) eine sehr starke Stimulationswirkung auf und führte bei den übrigen drei Stämmen zu schwachen, jedoch statistisch signifikanten Reaktionen. Bei manchen Versuchen waren bei den übrigen Stämmen die Reaktionen stärker positiv, das geometrische Mittel wurde jedoch durch eine gewisse Variabilität bezüglich der Reaktionsstärke reduziert; ihre statistische Signifikanz blieb jedoch bestehen. Diese drei Peptide bestätigen daher die Hypothese (Haie, P. M. et al., Internat. Immunol. 1: 409-415 (1989)), daß, wenn ein erweitertes Peptid mit überlappenden antigenen Determinanten, die von Mäusen multipler Haplotypen erkannt werden, hergestellt wird, das entstehende Konstrukt von allen bzw. den meisten Haplotypen im wesentlichen erkannt würde.
• Die restlichen drei Peptide riefen bei weniger Mäusestämmen als erwartet Reaktionen hervor. Das Cluster-Peptid 2 war nur bei zwei Stämmen, nämlich B10.D2 und B10.BR stark positiv, obwohl in unserer früheren Untersuchung (Hale, P. M. et al., Internat. Immunol. 1: 409-415 (1989)) alle vier Stämme mindestens eine innerhalb dieser multideterminanten Region vorliegende Stelle erkannt hatten. Auf ähnliche Weise wurde Cluster-Peptid 1 von einem Stamm, nämlich B10.BR, stark erkannt und von einem anderen Stamm, nämlich B10.S(9R), nur leicht, obwohl alle vier Stämme Bestandteile dieser multideterminanten Region erkannt hatten. Die schlechtesten Ergebnisse brachte Cluster-Peptid 5, das bei drei Stämmen zu keiner signifikanten Reaktion und bei dem vierten Stamm, nämlich B10.BR, nur zu einer schwachen Reaktion führte. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß das größere Peptid nicht einfach die Gesamtheit seiner Teile ist, sondern eventuell bei Stämmen, die von einer kleineren Untereinheit stimuliert würden, zu keiner Stimulation führt, vielleicht weil Teile der größeren Struktur die Wechselwirkung mit dem MHC- oder T-Zellenrezeptor hindern, weil sie die Rückfaltung des Peptids verursachen (Brett, S. J. et al., J. Exp. Med. 168: 357-373 (1988); Gammon, G. et al., Immunol. Rev. 98: 53-73 (1987); Vacchio, M. S. et al., J Immunol. 143: 2814-2819 (1989); Berzofsky, J. A. et al., Immunol. Rev. 106: 5-31 (1988)) oder aufgrund unterschiedlicher Anforderungen beim Processing.
• 5. IL-2-Produktion von menschlichen PBL. Um die antigeninduzierte IL-2-Produktion durch humane periphäre Blut-T-Zellen zu prüfen, werden PBL von HIV-seropositiven symptomfreien Blutspendern auf Lymphocytentrennmedium (LSM, Organon Teknika Corp, Durham, NC) getrennt, zweimal gewaschen, gezählt und in einer Konzentration von 3 · 10&sup6;/ml in RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), das 50 U/ml Penicillin und 2 mM Glutamin enthält, suspendiert. In einer Dreifachbestimmung werden die Näpfchen einer 96-Well-Flachbodenmikrotiterplatte (Costar, Cambridge, MA) mit jeweils 0,1 ml PBL versetzt und ohne Stimulation oder unter Stimulation durch a) Influenza A/Bangkok RX73 (Endverdünnung 1 : 1000), b) PHA (Gibco) (Antigenverdünnung 1 : 100) bzw. c) Cluster-Peptide in einer Endkonzentration von 2,5 uM kultiviert. Jedes Näpfchen wird mit gepooltem AB+-Plasma versetzt (Endverdünnung 1 : 20). Um den IL-2-Konsum zu blockieren, wird jedes Näpfchen beim Anlegen der Kultur (Endkonzentration 5 uM) mit dem gegen den IL-2-Rezeptor gerichteten Antikörper anti-Tac (von Dr. T. A. Waldmann, NCI) versetzt. Die Zellkulturüberstände werden 7 Tage später geerntet und bei -20ºC gefroren. Die IL-2-Aktivität im Überstand wird aufgrund der Fähigkeit, die Proliferation der IL-2-abhängigen Zelllinie CTLL zu stimulieren, wie oben beschrieben (Clerici, M. et al., J. Clin. Invest. 84: 1892-1899 (1989)) beurteilt.
• Obwohl in früheren Publikationen gezeigt wurde, daß viele Peptide, die bei Maus-T-Zellen Reaktionen hervorrufen, auch bei menschlichen T-Zellen wirksam sind (Berzofsky, J. A. et al., Nature 334: 706-708 (1988); Clerici, M. et al., Nature 339: 383-385 (1989); Lamb, J. R. et al., Nature 300: 66-69 (1982); Hurwitz, J. L. et al., J. Immunot 133: 3371-3377 (1984); Good, M. F. et al., Science 235: 1059-1062 (1987); Good, M. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1199-1203 (1988); Dontfraid, F. et al., Mol. Biol. Med. 5: 185-196 (1988)) waren Daten bezüglich menschlicher T-Zellen und bestimmten Komponenten der Cluster-Peptide nicht bekannt. Die Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurden daher angelegt, um die Hypothese, daß Peptide, die bei Mäusen multipler MHC-Typen Reaktionen hervorriefen, wahrscheinlich auch bei Menschen multipler HLA-Typen Reaktionen hervorrufen würden, zu prüfen. Aus früheren Arbeiten war bekannt, daß das in Cluster-Peptid 1 vorliegende Peptid envT2 (Reste 112-124), das in Cluster-Peptid 3 vorliegende Peptid enyT1 (Reste 428-443) und das in Cluster-Peptid 6 vorliegende Peptid TH4.1 (Reste 834-848, auch unter der Bezeichnung HP53 bekannt) jeweils bei 50-67% HIV-infizierter menschlicher Probanden, die noch zu einer Reaktion auf als Positivkontrolle verwendete Gedächtnisantigene wie Influenza-A-Virus (flu) oder Tetanustoxoid (Clerici, M. et al., Nature 339: 383-385 (1989)) fähig waren, Reaktionen stimulierten. Zu Peptiden dieser anderen multideterminanten Regionen lagen beim Menschen jedoch keine Erfahrungen vor. Da die Proliferations- und IL-2-Produktionsreaktion auf lösliche Proteinantigene im Frühstadium der HIV-Infektion verlorengeht, und zwar häufig dann, wenn die Patienten noch symptomfrei sind (Clerici, M. et al., Nature 339: 383-385 (1989); Clerici, M. et al., J. Clin. Invest 84: 1892-1899 (1989); Lane, H. C. et al., New Engl. J. Med. 313: 79-84 (1985)) wurden die Reaktionen auf flu und auf Tetanus-Toxoid in diesen Versuchen als Positivkontrollen verwendet, um Spender, die auf keine dieser Gedächtnisproteinantigene eine Reaktion aufwiesen, auszuschließen.
• Alle sechs Cluster-Peptide wurden auf ihre Fähigkeit, die IL-2- Produktion der periphären Blut-T-Zellen aus einer Reihe HIV- seropositiver, jedoch symptomfreier Probanden sowie HIV-seronegativer Kontrollen zu stimulieren, geprüft. Alle 15 seronegativen Kontrollen reagierten auf das Kontroll-Gedächtnisantigen Influenzavirus (Flu), jedoch nur 42 der 59 HIV-seropositiven Spender reagierten auf Flu. Aufgrund unserer früheren Erfahrung, daß seropositive Spender, die auf Kontroll- Gedächtnisproteinantigene wie flu oder Tetanus-Toxoid nicht reagieren, auch auf HIV-Peptide nicht reagieren (Clerici, M. et al., Nature 339: 383- 385 (1989)), wurden die 17 Spender, die nicht auf flu reagierten, nicht in die folgenden Untersuchungen miteinbezogen. Da einige der Peptide zum Zeitpunkt, als einige Spender verfügbar waren, nicht gereinigt worden waren, wurden diese Peptide anhand von Zellen einer Spenderuntergruppe geprüft. Die Ergebnisse für die sechs Cluster-Peptide bei den 42 HIV-seropositiven Flu-positiven Spendern und 15 HIV- seronegativen Spendern als Kontrolle sind in Tabelle 3 angeführt und in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 3. IL2-Produktion durch T-Zellen von HIV-seropositiven und - seronegativen menschlichen Blutspendern
• Bei den angegebenen Werten handelt es sich um die Stimulationsindizes bei der Proliferation einer IL-2-abhängigen CTLL- Zellinie in Gegenwart einer 1 : 2-Verdünnung eines Kulturüberstands von dreifach wiederholten PBL-Kulturen des angegebenen Spenders mit einer 2,5-uM-Konzentration des angegebenen Peptids, wie oben beschrieben. Alle untersuchten seropositiven Spender und Kontrollen zeigten eine Reaktion auf das positive Kontroll-Gedächtnisproteinantigen Flu. Um als positiv zu gelten, mußte ein Wert gleichzeitig zwei Kriterien entsprechen: Die Wiederholungen mußten sich von den Kontrollwiederholungen für diesen Spender nach Student's t-Test statistisch signifikant unterscheiden (p < 0,05), und der Stimulationsindex mußte größer als der doppelte Wert der Mediumkontrolle sein. Sechs mit NS bezeichnete Fälle, bei denen die Stimulationsindizes > 2,0 betrugen, wurden nicht als positiv bewertet, da die Wiederholungen nicht statistisch signifikant waren. In mehreren Fällen, bei denen der SI einen Wert von < 2,0 aufwies, unterschieden sich die Wiederholungen signifikant vom Hintergrund, sie wurden jedoch aufgrund des niedrigen Stimulationsindex nicht als positiv gewertet. Die Tatsache, daß beide Kriterien erforderlich sind, führt daher zu einer konservativeren Schätzung als wenn nur eines der Kriterien verwendet wird. Tabelle 4. Zusammenfassung der IL-2-Reaktionen von humanen T-Zellen auf Cluster-Peptide
• Die Kriterien, welche die Versuchsglieder erfüllen müssen, um als positiv zu gelten, sind in der Legende für Tabelle 3 angegeben. Tabelle 5. HLA-Typbestimmung von HIV-seropositiven Spendern
• Bei über der Hälfte der HIV-seropositiven, Flu-positiven Spender stimulierten alle sechs Cluster-Peptide die IL-2-Produktion. Die Cluster-Peptide 1 und 3 wurden am stärksten allgemein erkannt und führten bei 64% bzw. 73% der Spender zu einer Reaktion. Die Cluster- Peptide 2, 5 und 6 lagen knapp an zweiter Stelle und waren bei 58, 59 bzw. 58% der Spender positiv. Cluster-Peptid 4 war das am schwächsten allgemein erkannte Cluster-Peptid, führte jedoch auch bei 52% aller Spender zu einer Stimulation. Im Gegensatz dazu reagierte keiner bzw. nur einer der als Kontrolle dienenden seronegativen Spender auf ein beliebiges Peptid, mit Ausnahme von Cluster-Peptid 2, das bei 2 der 15 Kontrollspendern zu einer Stimulation führte (13%). Keines der Peptide war daher unspezifisch mitogen. Bei den menschlichen Spendern handelte es sich um untereinander nicht verwandte Angehörige der Air Force, ursprünglich aus unterschiedlichen Teilen der Vereinigten Staaten, bei denen es sich um unterschiedliche HLA-Typen handelte. Aufgrund der beschränkten Verfügbarkeit von Blut konnte nur bei 13 der HIV+-Spender der HLA-Typ bestimmt werden und nur bei 8 konnte der DR- und DQ-Typ bestimmt werden, wobei bei dem letztgenannten Verfahren mehr Blut benötigt wird (Tabelle 5). In dieser Stichprobe beschränkten Umfangs konnte keine Korrelation zwischen Reaktion auf ein Peptid und HLA-Typ nachgewiesen werden. Wir folgern daraus, daß all diese Cluster-Peptide der Hypothese entsprechen, daß Peptide, die von Maus-T-Zellen im allgemeinen erkannt werden, wahrscheinlich auch von humanen T-Zellen allgemein erkannt werden. Tatsächlich wurden manche dieser Peptide, wie z. B. die Cluster-Peptide 1 und 5, bei Menschen unterschiedlicher HLA- Typen stärker allgemein erkannt als von unterschiedlichen Stämmen der ingezüchteten Mäuse, die geprüft wurden.
• Aus den Ergebnissen in Tabelle 3 geht hervor, daß 31 (86%) der 36 auf das positive Kontrollantigen flu reagierenden Spender, die mit mindestens drei Peptiden geprüft wurden, auf mindestens eines dieser Peptide reagierten. Um zu näheren Auskünften über das Ausmaß der Population, die zu einer Reaktion fähig sein könnte, zu gelangen, wurden weitere 13 HIV-seropositive Spender, die auf flu reagierten, die sich jedoch nicht mit den in Tabelle 3 genannten Spendern überschnitten, auf ihre Reaktion auf eine Mischung der sechs Cluster-Peptide, jeweils in einer Konzentration von 2,5 uM, untersucht. Von diesen 13 wurde bei zehn, d. h. 77%, eine Reaktion festgestellt, während keiner der vier seronegativen Spender auf die Peptidmischung reagierte, obwohl alle vier eine Reaktion auf flu aufwiesen. Obwohl es möglich ist, daß die Peptide in der Mischung miteinander bezüglich der Bindung an einige MHC-Moleküle konkurrieren, liegt im Hinblick auf den kleinen Stichprobenumfang bei den zwei untersuchten Gruppen vermutlich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen denjenigen, die auf mindestens ein Peptid in der ersten Gruppe reagieren und denjenigen, die auf die Mischung in der zweiten Gruppe reagieren, vor. Jedenfalls folgte daraus, daß ein Großteil Menschen zu einer T-Zell-Reaktion auf diese Peptide fähig ist.
6. Immunisierung mit Peptiden zur Induktion von T Zellen, die in vitro auf intaktes gp 160 reagieren.
• Sollen sich die mittels der oben beschriebenen zwei Screening- Techniken identifizierten Peptide als brauchbare Bestandteile eines Vakzins eignen, so ist es wichtig, daß sie nicht nur von T-Zellen, die gegen das HIV-Hüllprotein gp160 immun sind, erkannt werden, sondern auch, daß sie immunogen sind und T-Zellen, die zur Reaktion auf gp160 fähig sind, in vivo aktivieren. Die Immunisierungen können natürlich noch nicht an der klinisch relevanten Spezies, nämlich (nichtinfizierten) Menschen, durchgeführt werden, es soll jedoch sichergestellt werden, daß bei den Mausstämmen, bei denen oben gezeigt wurde, daß sie über T- Zellen verfügen, die auf diese Peptide reagieren, die Mäuse in vivo mit den Peptiden immunisiert werden können und T-Zellen aktivieren, die in vitro auf intaktes gp160 reagieren. Jedes Peptid wird dadurch geprüft, daß man Mäuse desjenigen Stamms, der aufgrund der in Fig. 1 angegebenen Werte am besten auf dieses Peptid reagiert, immunisiert. Mäuse der angegebenen vier Stämme werden subkutan in dem Schwanz mit 8-10 nmol des angegebenen Cluster-Peptids in einer 1 : 1-Emulsion mit CFA immunisiert, wobei das Endvolumen pro Maus 50 ul beträgt, mit Ausnahme von Cluster-Peptid 2, das in 75 ul vorlag. Zwölf Tage später wurden die ableitenden Lymphknoten von 2 Mäusen jeder Gruppe (Kombination aus Stamm und Peptid) entnommen und wie oben beschrieben in einem Assay untersucht. Die Ergebnisse sind in Form von Stimulationsindizes angegeben, nämlich als Verhältnis der Versuchs-cpm zu den durch Stimulation mit dem Medium allein erzielten cpm, welche sich für die unterschiedlichen Gruppen im Bereich von 3000-7000 cpm bewegten.
• Alle B10.BR-Mäuse, die mit dem Cluster-Peptid 1, Cluster- Peptid 5 bzw. Cluster-Peptid 6 immunisiert worden waren, produzierten T- Zellen, die sich mit rekombinantem gp160 in vitro stimulieren ließen (Fig. 2, Teil A). Als Kontrolle für eine mögliche Mitogenität des rekombinanten gp160 wiesen T-Zellen von B10.BR-Mäusen, die nur mit vollständigem Freund'schem Adjuvans immunisiert worden waren, in vitro keine signifikante Reaktion auf gp160 auf (Fig. 2, Teil A). Die in-vitro-Antwort war daher ein Ergebnis einer Immunisierung mit den Peptiden. Auf ähnliche Weise wiesen T-Zellen von B10.S(9R)-Mäusen, die entweder mit dem Cluster-Peptid 3 oder dem Cluster-Peptid 4 immunisiert worden waren, eine Reaktion auf rekombinantes gp160 in vitro auf, während ähnliche Mäuse, die mit dem Adjuvans allein immunisiert worden waren, nur bei der höchsten Konzentration eine schwache (mitogene) Reaktion aufwiesen (Fig. 2, Teil B). Ebenso produzierten B10.A(5R)-Mäuse, die mit dem Cluster-Peptid 6 immunisiert worden waren, und B10.D2-Mäuse, die mit dem Cluster-Peptid 2 immunisiert worden waren, T-Zellen, die auf gp160 in vitro eine Reaktion aufwiesen (Fig. 2, Teil C und D). Bei all diesen Reaktionen wurde bei hohen Dosen eine für die T-Zell- Proliferationsreaktion typische Hemmung beobachtet, im vorliegenden Fall läßt sich die verringerte Reaktion bei 30 ug/ml eventuell aber auch auf eine gewisse Toxizität der rekombinanten gp160-Präparation, die in 8 M Harnstoff und Natriumdodecylsulfat solubilisiert worden war, zurückführen. Obwohl das gp160 vor der Verwendung dialysiert wurde, ist es möglich, daß Tensidreste, die schwer zu entfernen sind, bei der höchsten Dosis toxisch waren. Trotzdem geht aus der eindeutigen Reaktion bei 10 ug/ml in allen Fällen hervor, daß alle sechs Cluster-Peptide in vivo T-Zellen aktivieren, die zur Reaktion mit gp160 fähig sind.
Beispiel 2 Verwendung von Cluster-Peptiden in einem Diagnostik-Assay für Infektion von Patienten mit HIV-1
• Die in Tabelle 1 oben beschriebenen Cluster-Peptide lassen sich zur Diagnose einer HIV-1-positiven Serokonversion bei Patienten verwenden. Der Nachweis von HIV-1-gp160-spezifischen Reaktionen von T-Zellen auf diese Peptide läßt sich nach den Standardtechniken der T- Zell-Proliferation und Produktion von IL-2 oder anderen Lymphokinen wie oben in Beispiel 1, Punkt 4 und 5 beschrieben, nach dem von Clerici et al., Nature, Band 339, S. 383-385 (1989) für den Menschen beschriebenen Verfahren durchführen.
• Der Diagnostiktest kann jedoch auch wie von Berzofsky et al. WO-A-89071 für das Peptid env-K&sub1; beschrieben auf dem Cytotoxizitätsprinzip beruhen. Der Vorteil dieses Prinzips ist, daß man infizierte Individuen nachweisen kann, die noch nicht Antikörper gegen HIV produzieren.
Beispiel 3 Chemische Modifikation der Cluster-Peptide zur Förderung ihrer pharmakologischen Eigenschaften
• Kleine Peptide, die im Blut zirkulieren, werden proteolytisch abgebaut und über die Nieren entfernt. Trotzdem finden sich einige natürlich vorkommende Peptide im Kreislauf, zum Beispiel die Enkephaline. Es wird häufig beobachtet, daß diese kleinen Peptide durch Amidierung des Carboxy-Terminus modifiziert sind (Kitamura, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 169: 1164-71(1990); Dickson, Cl. und Yamada, T., J. Biol. Chem. 266: 334-338 (1991)). Es kann daher von Vorteil sein, chemisch modifizierte Varianten der Cluster-Peptide für therapeutische Verwendungszwecke herzustellen. Die enzymatische Carboxy-terminale Amidation eines synthetischen Peptids ist bereits beschrieben worden (Suzuki, K. et al., EMBO J. 9: 4259-4265 (1990); Katopodis, G. A. et al., Biochemistry 30: 6189-6194 (1991)). Außerdem kann es sich als vorteilhaft erweisen, die Peptide mit Resten für die Vernetzung der Peptide mit Trägerproteinen für Immunisationszwecke oder mit festen Trägern für Immungssayzwecke oder für die Reinigung von Antikörpern zu versehen. In der Fachwelt sind viele chemische Modifikationen von Peptiden gut bekannt.
• Die Peptide der vorliegenden Erfindung könnten auch an Peptide, die an neutralisierende Antikörper gegen HIV oder für HIV spezifische cytotoxische T-Zellen binden bzw. deren Produktion induzieren, gekoppelt werden oder mit diesen cosynthetisiert werden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung dienen als HIV-1-spezifische Träger in solchen Konstrukten, was in T-Zellen auf vorteilhafte Weise eine Gedächtnisreaktion induziert, was bei Kontakt mit HIV eine Gedächtnis- Helfer-T-Zellenreaktion verursachen würde, was im Gegensatz zu nicht mit HIV verwandten Trägern steht, die bei Kontakt mit dem Virus nicht eine solche Gedächtnisreaktion hervorrufen würden. Günstige HIV-1-spezifische Träger sind zum Beispiel die bei Good, M. F. et al., Science, Band 235, S. 1059-1062 (1987); in dem an Good et al. ausgegebenen US-Patent Nr. 4 886 782 und bei Palker, T. J. et al., J. of Immunology, Band 142, S. 3612-3619 (1989) beschriebenen Träger.
Beispiel 4 Verabreichung von Cluster-Peptiden als Vakzin gegen HIV-1
• Das Ziel vieler Forscher in der Biomedizin besteht in der Herstellung eines Vakzins, das Menschen einen Schutz gegen Infektion mit HIV-1 oder einen therapeutischen Vorteil bei der Behandlung von AIDS bieten würde. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Bestimmung von Peptiden, die sich als Vakzine dieser Art eignen könnten, und für die Beschreibung von sechs möglichen bestimmten Peptiden, die auf der Hervorrufung einer T-Zell-Reaktion auf das Zielprotein, von dem sich die Peptide ableiten, in mit dem Peptid immunisierten Mäusen bereit. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, darunter ein Vakzin nach der vorliegenden Erfindung, umfaßt eine antigen oder therapeutisch wirksame Menge mindestens eines der Cluster-Peptide sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger wie eine physiologische Kochsalzlösung, einen nichttoxischen sterilen Puffer usw. Natürlich könnte die pharmazeutische Zusammensetzung zur Erhaltung oder Erhöhung der Wirksamkeit des Präparats auch die dem Durchschnittsfachmann bekannten Zusatzstoffe wie Konservierungsmittel, Sterilisationsmittel, Hilfsstoffe und dergleichen enthalten.
• Außerdem wird vorgeschlagen, daß Peptide nach der vorliegenden Erfindung ähnlich wie bei der Verabreichung eines synthetischen Peptidvakzins gegen Hepatitis B an Primaten wie bei Itoh beschrieben (Itoh, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9174-9178 (1986)) verabreicht werden kann. Bei einem weiteren Verfahren zur Herstellung von Vakzinen werden mit Protein A beschichtete Mikroperlen verwendet, die Immunkomplexe eines Antikörpers und des immunisierenden Antigens an ihrer äußeren Oberfläche binden, wie dies zum Beispiel bei Platt et al., US-Patent Nr. 4 493 825 beschrieben ist. Außerdem könnten die erfindungsgemäßen Cluster-Peptide mit Peptiden, die binden oder induzieren, gekoppelt oder konjugiert werden.

Claims (17)

1. Verfahren zur Bestimmung von Peptiden, die sich für Spaltvakzine gegen HIV eignen, mit den folgenden Schritten:

(i) Herstellung von potentiellen Vakzinpeptiden, deren Aminosäuresequenzen Fragmente oder Mimetopen eines größeren Zielproteins darstellen, auf chemisch-synthetischem Weg oder mittels DNA-Rekombinationstechnik;

(ii) Immunisierung von congenen Mäusen, die sich bezüglich des MHC-Haplotyps unterscheiden, mit dem vollständigen Zielprotein des Peptidvakzins;

(iii) Herstellung von Lymphknotensuspensionen von den immunisierten Mäusen und Prüfung von deren T-Zell-Proliferationsreaktion auf Provokation mit dem potentiellen Vakzinpeptid;

(iv) Isolation von peripheren Blutlymphocyten (PBL) aus einer HIV- seropositiven humanen Spenderpopulation, die groß genug ist, um statistisch ausgewertet werden zu können;

(v) Prüfung dieser PBL auf Produktion von Interleukin-2 als Antwort auf ein Kontroll-Gedächtnisantigen, und Prüfung auf Interleukin-2- Produktion der PBL als Antwort auf Provokation mit dem potentiellen Vakzinpeptid;

(vi) Auswahl derjenigen Peptide, die sowohl im Schritt (iii) als auch im Schritt (v) eine beträchtliche Antwort hervorrufen, um Mäuse zu immunisieren;

(vii) Prüfung der Proliferationsantwort von aus den in Schritt (v) immunisierten Mäusen isolierten T-Zellen auf Provokation mit dem vollständigen Zielprotein; sowie

(viii) Festlegung von Peptiden, die in Schritt (vii) statistisch signifikante Positivantworten hervorriefen, als potentielle Vakzine.

2. Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz EQMHEDIISLWDQSLKPCVK.

3. Peptid umfassend die Aminosäuresequenz FVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIDSKL.

4. Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIR.

5. Peptid umfassend die Aminosäuresequenz RDNWRSELYKYKWKIEPLGVAPT.

6. Peptid umfassend die Aminosäuresequenz RIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVS.

7. Peptid umfassend die Aminosäuresequenz AVAEGTDRVIEWQGAYRAIRHIPRRIRQGLER.

8. Peptidvakzin gegen HIV umfassend mindestens ein Peptid aus der Gruppe

PCLUS1 (109-128) EQMHEDIISLWDQSLKPCVK (SEQ ID 1)

PCLUS2 (324-356) FVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQID-SKL (SEQ ID 2)

PCLUS3 (428-451) KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIR (SEQ ID 3)

PCLUS4 (483-506) RDNWRSELYKYKWKIEPLGVAPT (SEQ ID 4)

PCLUSS (787-820) RIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVS (SEQ ID 5)

PCLUS6 (828-860) AVAEGTDRVIEWQGAYRAIRHIPRRIRQGLER (SEQ ID 6).

9. Peptid nach Anspruch 8, das durch Derivatisierung mit einem kleinen Molekülteil zwecks Erzielung besserer pharmakologischer Eigenschaften als beim nichtderivatisierten Peptid kovalent modifiziert wurde, oder weitere kleinere Modifikationen, die die Aktivität dieses Peptids nicht zweckwidrig ändern.

10. Vakzin nach Anspruch 8, das einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger beinhaltet.

11. Vakzin gegen HIV nach Anspruch 10, umfassend ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Peptide und einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger.

12. Kit für die Diagnose oder Prognose von HIV, das mindestens eines der in Anspruch 8 definierten Peptide umfaßt.

13. Verfahren zur Diagnose oder Prognose von HIV, bei dem mindestens eines der in Anspruch 8 definierten Peptide in einem Assay verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei in diesem Assay die T-Zell- Proliferation oder die Produktion von IL-2 oder anderen Lymphokinen gemessen wird.

15. Verwendung eines Vakzins nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer HIV-Infektion bei einem HIV-seropositiven Patienten.

16. Konstrukt, das mindestens eines mit einem zweiten Peptid, das ein T- oder B-Zellepitop enthält, chemisch gekoppeltes oder cosynthetisiertes Peptid wie in Anspruch 2-7 und 10 genannt umfaßt.

17. Verwendung eines Vakzins nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz gegen Infektion mit HIV.