DE69217899T2

DE69217899T2 - Gerät zur Teilchenbildanalyse

Info

Publication number: DE69217899T2
Application number: DE69217899T
Authority: DE
Inventors: Tokihiro Kosaka; Shinichi Ogino
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1991-12-30
Filing date: 1992-12-30
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2012-12-31
Also published as: DE69217899D1; EP0551010B1; US5428441A; EP0551010A1; JP3102938B2; JPH05180751A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Analysieren von Teilchenbildem, indem man eine Probenflüssigkeit, die Blutpartikel, Zellen, Mikroorganismen oder andere Teilchen enthält, passieren läßt, die Zielteilchen ermittelt und Bilder davon erstellt.
Die folgenden Verfahren waren bisher auf dem Gebiet der Blutanalyse oder dem Gebiet der Mikroorganismenmessung für die Teilchenanalyse bekannt.
(1) Als Verfahren der Leukozytenmessung auf dem Gebiet der Blutanalyse das Verfahren der Messung der von gefärbten Zellen abgegebenen Fluoreszenz unter Verwendung eines Zellströmungsmeßgerätes.
(2) Auf dem Gebiet der Blutanalyse das Verfahren des Plazierens eines Probenabstrichs auf einem Objektträger unter einem Mikroskop, wobei man den Objekttisch automatisch in der X- und Y-Richtung bewegt und durch eine Videokamera oder ähnliches Fluoreszenzbilder und Weißlichtbilder aufnimmt.
(3) Auf dem Gebiet der Mikroorganismenmessung wird die Messung durch die Überwachung von Kulturen durchgeführt, wobei man verschiedene Kulturmedien benötigt, was bis zum Ende des Testes viele Tage brauchte. Vor einem solchen Hintergrund wurden verschiedene Verfahren entwickelt, einschließlich des ATP-Meßverfahrens (siehe Millon, O., Musson, L. et al., J. Clin. Microbiol., 18, 521, 1983), des Impedanzverfahrens (siehe Brown, D., Warner, M., Taylor, C, et al., J. Clin. Pathol., 37, 65 - 69, 1984), des Enzym- und Fluoreszenz-Aufspürverfahrens (siehe das offengelegte Japanische Patent Nr.58-116700) und des DEFT-Verfahrens, das das Membranfilterverfahren und das mikroskopische Fluoreszenzverfahren kombiniert (siehe G. L. Pattipher, et al., J. Appl. Bacteriol. 53, 323, 1982).
In neuerer Zeit wurde eine "Schnell-Meßvorrichtung für Mikroorganismen" in der Japanischen Offenlegungsschrift Hei. 3-29837 beschrieben, in welcher der Membranfilter und das Fluoreszenz-Mikroskop kombiniert sind, die durch einen Filter eingefangene Probe mit Fluoreszenz gefärbt wird, die Probe auf das Mikroskop gelegt wird, wobei der Probenobjekttisch sich automatisch in den X- und Y-Richtungen bewegt, und die Fluoreszenz ausstrahlenden Zellen gemessen werden.
Jedoch können in Verfahren (1) die auf einmal gemessenen Zellen nicht sichtbar wahrgenommen werden.
Bei Verfahren (2) ist die Anzahl der Zellen, die gemessen werden können, begrenzt, und die Vorbehandlung des Einfärbens und Abstriches ist kompliziert.
Verfahren (3) nimmt lange Zeit in Anspruch, die Präzision ist nicht ausreichend, und die Vorbehandlung ist kompliziert.
Die DE-A-3 705 876 beschreibt ein Strömungsmeßgerät, bei welchem ein Bild einer Zelle unter Verwendung einer Impulslaserquelle und einer CCD-Kamera erzeugt wird, zwischen denen die Zellen hindurchlaufen. Das Auslösesignal für die lmpulsquelle wird durch einen optischen Zell-Sensor geliefert, der sich aufstromwärts der lmpulsquelle befindet.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Analysieren von Teilchenbildern bereitgestellt, mit dem man
eine Teilchen enthaltende Probenllüssigkeit durch eine Strömungszelle führt, einen Teilchenabfühlbereich der Strömungszelle mit Fluoreszenzerregungslicht einer Wellenlänge zur Erzeugung von Fluoreszenz in Zielteilchen bestrahlt,
einen Detektor verwendet, um Fluoreszenz zu ermitteln, und dabei beurteilt, ob ein Zielteilchen ermitelt wurde, und
wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilchen ermittelt wurde, einen Bildaufnahmebereich der Strömungszelle mit Abbildungslicht bestrahlt, um ein Bild des Zielteilchens zu erzeugen, welches von einer Bildaufnahmeeinrichtung aufgenommen wird, und den optischen Weg zu dem Detektor verschließt, um zu verhindern, daß der Detektor das Abbildungslicht empfängt.
Mit Ausfülirungsformen der Ertindung ist es möglich, Weißlicht- oder fluoreszierende Bilder von Zielteilcben zu erzeugen. Selbst wenn es nur eine geringe Anzahl an Teilchen gibt, wie etwa Leukozyten in Blut oder Mikroorganismen in Bier oder anderen Getränken, können wirksam ohne das Uberwachen von Teilchen die Bilder erzeugt werden. Es ist auch möglich, die Bilder von Zielteilchen selektiv aufzunehrnen und zu analysieren, wenn eine kleine Menge von Fluoreszenz ausstrahlenden Zielteilchen mit einer großen Menge von Nicht-Zielteilchen vermischt sind.
Vorzugsweise ist die Probenflüssigkeit in einem Hüllenfluß. Ein Hüllenfluß bezieht sich typischerweise auf einen Fluß einer Suspension von Teilchen, deren Umfang mit einer laminaren Hüllenflüssigkeit bedeckt ist, um die Teilchen in einer Reihe aufzureihen und sie entlang der Mitte des Flüssigkeitsstroms zu führen.
Bei den Ausführungsformen der Erfindung wird in dem Probenströmungsbereich ein Teilchen-Abfühlbereich gebildet, um den Fluß von Teilchen in dem Bildaufnahmebereich der Bildaufnahmeeinrichtung zu kreuzen. Das Fluoreszenzerregungslicht aus einer ersten Lichtquelle bestrahlt fortlaufend den Probenfluß. Wenn ein Fluoreszenz abgebendes Zielteilchen den Teilchen-Abfühlbereich durchläuft, wird dessen Fluoreszenz von einem Photodetektor wahrgenommen, und ein Lichtimpuls wird von einer zweiten Lichtquelle ausgestrahlt, um ein Teilchenbild zu erzeugen. Dem Tejichen-Abfühlbereich wird durch einen Schlitz und Überschneidungen über das Innere des Bildaufnahmebereichs hinweg eine kurze und breite Form gegeben. Wenn die zweite Lichtquelle Licht abgibt, ist das zuvor wahrgenommene Teilchensubjekt immernoch in dem Bildaufnahmebereich vorhanden, so daß ein Bild des Zielteilchens aufgenommen werden kann. Wenn das Teilchen ein Nicht-Zielteilchen ist, das keine Fluoreszenz ausstrahlt, wenn es den Abfühlbereich durchläuft, gibt die zweite Lichtquelle kein Licht ab und wird die Bildaufnahme nicht durchgeführt.
Zum Zeitpunkt der Teilchenbildaufnahme wird, da eine große Lichtmenge von der zweiten Lichtquelle abgegeben wird, der optische Weg zu dem Detektor zum Zeitpunkt der Bildaufnahme geschlossen (d.h. durch einen vor dem Detektor angeordneten Verschluß), um den Detektor zu schützen, indem sichergestellt wird, daß das Licht den Detektor nicht erreicht.
Es werden nun nichtbeschränkende Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichungen beschrieben, in denen
Figur 1 ein schematisches Schaubild einer erfindungsgemäßen Ausführungsform der Vorrichtung zum Analysieren von Teilchenbildern ist,
Figur 2 eine charakteristische Darstellung eines dichroitischen Spiegels von Figur 1 ist,
Figur 3 ein erläutemdes Schaubild ist, das die Beziehung zwischen dem Bildaufnahmebereich und einem Schlitz einer in Figur 1 gezeigten Strömungszelle zeigt,
Figur 4 ein schematisches Schaubild einer zweiten Ausführungsform der erfindungsge-
mäßen Vorrichtung ist, Figur 5 ein schematisches Schaubild einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, und
Figur 6 ein schematisches Schaubild einer vierten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist.
Figur 1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung. Es gibt zwei Lichtquellen. Eine erste Lichtquelle 10 für das Feststellen von Zellen (zum Beispiel eine Xenonlampe) und eine zweite Lichtquelle 12 für die Weißlicht-Bildaufnahme (zum Beispiel eine Lichtquelle mit Taktimpuls, wie etwa eine Xenonlampe mit Impulsausstrahlung). Die erste Lichtquelle 10 gibt ununterbrochen Licht ab.
Die Kollimatorlinsen 14, 16 regulieren das von den Lichtquellen 10, 12 abgegebene Licht, um so parallel Lichtstrahlen zu bilden. Ein Erregungslicht-Auswahlfilter 18 reagiert auf die Wellenlänge des Lichts oder stellt sie ein, welches zur Ermittlung der Zellen verwendet wird, so daß die Wellenlänge die geeignetste für die Zielteilchen und die fluoreszierende Färbelösung ist. Die ausgewählte Wellenlänge muß abhängig von dem Ziel gewechselt werden (wenn zum Beispiel das Proben-Färbemittel Fluorescein-diacetat ist, wird ein Filter, der 490 nm durchläßt (überträgt), verwendet). Der dichroitische Spiegel 20 ist dafür vorgesehen, das Licht der Ermittlungslichtquelle 10 und der Weißlicht-Bildaufnahmelichtquelle 12 auf die Strömungszelle 24 zu richten. Das Licht der Wellenlänge der Ermittlungslichtquelle 10 wird reflektiert, und das Licht der Weißlicht-Bildaufnahmelichtquelle 12 wird durchgelassen (übertragen) (siehe Figur 2).
Ein Zellen enthaltender Probenfluß wird in eine Strömungszelle 24 geführt, der aus einem transparenten Körper, wie etwa Glas oder Kunststoff besteht, und ein Hüllenflüssigkeit wird angeliefert, um so den Umfang des Probenflusses zu bedecken, wodurch ein Hüllenfluß gebildet wird.
Das Wahrnehmungslicht und das Weißlicht werden durch die Kollektivlinse 22 fokussiert und auf die in der Strömungszelle 24 fließenden Zellen gerichtet. Die Fluoreszenz oder das übertragene Licht, das von den Zielzellen abgegeben wird, wird durch eine Objektivlinse 26 eines Mikroskops fokussiert. Aus dem durch die Objektivlinse 26 fokussierten Licht wird das Licht, das die Erregungswellenlänge hat, durch einen Blockadefilter für Erregungslicht 28 entfernt, und die Fluoreszenzwellenlänge und die Wellenlängen, die für die Aufnahme des Weißlichtbildes verwendet werden, werden in eine sich anschließende Photoermittlungseinheit eingespeist.
Ein Teil des durch den Filter 28 durchgelassenen (übertragenen) Lichts wird durch den Halbspiegel 30 reflektiert und wird in einen Photodetektor 38 (zum Beispiel eine Photo-Vervielfältigungsröhre) für die Ermittlung von Fluoreszenz eingeführt.
Ein vor dem Photodetektor 38 angeordneter elektronischer Verschluß 34 ist dafür vorgesehen, den zu dem Photodetektor 38 führenden optischen Weg abzuschneiden, wenn die Lichtquelle mit Taktimpuls Licht abgibt, weil das Detektorelement kaputt geht, wenn Taktimpulslicht in den Photodetektor 38 während der Weißlicht-Bildaufnahrne hineingerät. Anstatt des elektronischen Verschlusses 34 kann ein Photodetektor, der eine Torschaltung aufweist (zum Beispiel der C1392 von Hamamatsu Photonics) verwendet werden, um die Funktion des elektronischen Verschlusses zu übernehmen.
Der Schlitz 36 vor dem Photodetektor 38 ist, wie in Figur 3 gezeigt, dafür vorgesehen, den Fluoreszenzermittlungsbereich in der Strömungszelle auf den engen durch den schattierten Bereich dargestellten Abfühlbereich 42 zu begrenzen, und seine Größe (d.h. die Breite in der horizontalen Richtung in Figur 3) sollte vorzugsweise mit der Breite des Bildaufnahmebereichs (Betrachtungsfeldes) 44 der Bildaufnahmeeinrichtung (Videokamera) 32 übereinstimmen, während die Länge (in der vertikalen Richtung in Figur 3) vorzugsweise auf circa 20 µm in der Strömungszelle übereinstimmen sollte. Die Bezugsziffer 43 ist eine Zelle. Entsprechend sollte zum Beispiel, wenn man als Objektivlinse 26 eine Linse mit der Vergrößerungsstärke 10 verwendet, die Größe 0,2 x 1,5 mm oder, im Falle einer Linse mit der Vergrößerungsstärke 40, 0,8 x 6 mm sein. Im allgemeinen könnte das Zellbild, obwohl ein Teilchen ermittelt wurde, verpaßt werden, wenn der Teilchenermittlungsbereich größer als die Breite des Betrachtungsfeldbereichs der Videokamera ist.
Die Beurteilungstorschaltung für die Teilchenermittlung 40 ist eine taktimpuiskontrollierte Steuerschaltung und beinhaltet eine Beurteilungsschaltung für die Zellenermittlung und eine taktimpulsausgelöste Auslöseschaltung. In der Beurteilungsschaltung für die Zellenermittlung wird auf der Basis des von dem Photodetektor 38 erzeugten fluoreszierenden Signais entschieden, ob die durchlaufende Zelle eine Zielzelle ist oder nicht. Wenn entschieden wird, daß es sich um eine Zielzelle handelt, wird unmittelbar ein Auslösesignal mit stroboskopischer Ausstrahlung (leuchtend) durch die stroboskopische Auslöseschaltung (zum Beispiel innerhalb 100 µs im Falle einer Hüllenflußgeschwindigkeit von 1 mis) abgegeben, und die zweite Lichtquelle (stroboskopische Lichtquelle) 12 emittiert stroboskopisches Licht, und das Zellenbild wird durch die Bildaufnahmeeinrichtung (Videokamera) 32 aufgenommen.
Der Betrieb (die Funktionsweise) ist wie folgt. Das Zellermittlungslicht hat eine durch den Erregungslicht-Auswahlfilter 18 ausgewählte Wellenlänge und bestrahlt ständig die Probe in der Strömungszelle 24 über den dichroitischen Spiegel 20 und die Kollektivlinse 22. Wenn keine Zielzelle vorhanden ist, wird das durch den Abfühlbereich 42 in der Strömungszelle, der mit dem Schlitzbereich vor dem Photodetektor 38 übereinstimmt, durch den Erregungslicht-Blockierungsfilter 28 hinter der Objektivlinse 26 abgeschnitten und gerät nicht in den Photodetektor 38 hinein.
Auf der anderen Seite wird die von der Zelle emittierte Fluoreszenz durch die Objektivlinse 26 fokussiert und verläuft durch den Erregungslicht-Blockierungsfilter 28 und wird durch den Halbspiegel 30 reflektiert, um in den Photodetektor 38 hineinzugelangen. Das Signal von dem Photodetektor 38 wird in der Beurteilungsschaltung für Teilchenermittlung 40 verarbeitet. In dieser Schaltung wird eine Zielzelle als vorhanden beurteilt, wenn die Intensität des Eingabesignals größer als ein bestimmter Wert ist oder die Impulsdauer über einem bestimmten Wert liegt oder wenn beides zutrifft, und ein Auslösesignal für die zweite Lichtquelle 12 wird abgegeben, wodurch die zweite Lichtquelle 12 aktiviert wird.
Das stroboskopische Licht verläuft durch den dichroitischen Spiegel 20 und die Kollektivlinse 22 und bestrahlt die Zelle in der Strömungszelle 24. Das durch die Zelle übertragene Licht verläuft durch die Objektivlinse 26 und den Filter 28 und wird nach Passieren des Halbspiegels 30 an der Bildaufnahmeeinrichtung 32 fokussiert, so daß das Zellbild erstellt wird. Was hier angemerkt werden sollte ist, daß ein Teil des durch die Objektivlinse 26 verlaufenden Lichtes zum Zeitpunkt der stroboskopischen Emission durch den Halbspiegel 30 reflektiert und auf den Photodetektor 38 gerichtet wird. Wenn das Licht in den Photodetektor 38 hineingelangt, zerstört es dieses Bauteil, weil die Lichtintensität hoch ist. Um dies zu verhindern, befindet sich ein elektronischer Verschluß 34 vor dem Photodetektor 38, und das Licht wird, durch Schließen des Verschlusses während der Dauer der stroboskopischen Emission, davon abgehalten, in den Photodetektor 38 hineinzugelangen. Anstatt des elektronischen Verschlusses 34 kann man eine Photovervielfätigungsröhre mit Torflinktion verwenden. Damit das Zeilbiid nicht verwackelt wird, wenn das Standbild der Zelle aufgenommen wird, muß die Zellbewegung während der Dauer der stroboskopischen Emission weniger als 1 µm betragen. Wenn zum Beispiel die Emissionszeit des stroboskopischen Lichtes 1 µs beträgt, muß die Fließgeschwindigkeit des Hüllenflusses ungefähr 1000 mm/s betragen.
Angenommen, der Durchmesser des Probenflusses in dem Hüllenfluß liegt beispielsweise bei 10 µm, können nur 0,08 µl/s der Probe pro Zeiteinheit analysiert werden. Daher kann die pro-Zeiteinheit analysierte Probenmenge auf 1,18 µl/s erhöht werden, indem man die Probe als einen flachen Fluß formt, wenn es der Probe gestattet wird, die gesamte Breite des Betrachtungsfeldes (zum Beispiel 150 µm) der Bildaufnahmeeinrichtung (Videokamera) in Anspruch zu nehmen. Der vorliegende Anmelder hat bereits Patentanmeldungen eingereicht, die die Bildung eines flachen Probenflusses betreffen (Japanische Patentanmeldungen Hei. 3-210053, Hei. 3-210054).
Wenn zum Beispiel eine Leukozytenzelle das Ziel ist, enthält durch das zehnfache Verdünnen einer Probe aus 5000 Leukozyten/µl eine Meßprobe 500 Leukozyten/µl. Wenn der Probenflußdurchmesser 10 µm beträgt, ist das Probenvolumen, das den Bildaufnahmebereich in einem Zeitraum eines geradzahligen Bereiches (zum Beispiel 1/60 Sek.) passiert, π x (5 x 10&supmin;³)² x 16,7 = 1,3 x 10&supmin;³ µl. Die durchschnittliche Anzahl an Zellen, die durch den Bildaufnahmebereich im Zeitraum eines geradzahligen Bereichs hindurchläuft, beträgt also 500 x 1,3 x 10&supmin;³ = 0,65 Zellen/Bereich.
Im allgemeinen stimmt die Verteilung von Teilchen, die in einem Hüllenfluß fließen, mit der Poisson-Verteilungswahrscheinlichkeit überein, und die Wahrscheinlichkeit des Abbildens einer Zelle in einem willkürlichen geradzahligen Zeitfeld wird in der folgenden Formel durch die Verwendung des Durchschnittsintervalles von Teilchen ausgedrückt, welches sehr stark mit den experimentellen Daten übereinstimmt. Bei der Gleichung ist t das Teilchenintervall.
fβ (t) = β e-βt
Insbesondere wenn der Durchschnitt der durch den Bildaufnahmebereich hindurchlaufenden Zellen 0,65/Feld ist, beträgt die Wahrscheinlichkeit des Abbildens einer Zelle 48,0 %, und es werden, bei einer angenommenen Meßzeit von 45 Sekunden, 648 Zellbilder erreicht.
Angenommen, der Probenfluß ist 150 µm x 10 µm, ist ähnlich die Wahrscheinlichkeit des Abbildens einer Zelle circa 100 %, und es werden circa 1350 Zellbilder erreicht.
Wenn man Mikroorganismen mißt, kann man, da die Anzahl der Zellen etwa so gering wie 100 Zellen/ml ist, die Probe nicht direkt messen, aber durch die 5000-fache Konzentration der Probe mittels Verarbeitens der Probe in einer Zentrifugalmaschine oder Einfangens an einem Membranfilter und Verdünnens werden ähnliche Ergebnisse wie für Leukozyten-Proben erreicht werden.
Als nächstes wird der Grund für die Begrenzung des Fluoreszenzermittlungsbereichs mit dem Schlitz 36 erklärt.
Das Problem, wieviele in einem Hüllenfluß fließende Teilchen sich in einem bestimmten Bereich befinden (zum Beispiel dem mit dem Schlitz in Verbindung stehenden Bereich), wird durch die Poisson-Verteilungswahrscheinlichkeit beantwortet. Wenn die Teilchenkonzentration gering ist, ist die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von zwei oder mehr Teilchen gering, steigt aber an, wenn die Konzentration höher wird. Diese Wahrscheinlichkeit nimmt auch zu, wenn die Fläche des Bereiches breiter wird. Wenn sich zwei oder mehr Teilchen in dem Bereich befinden (dies wird gleichzeitiges Passieren genannt), gelangt die gleichzeitig von den Teilchen emittierte Fluoreszenz in den Photodetektor hinein, und die Summe der von den Teilchen emittierten Fluoreszenz wird als die Signalintensität ermittelt, und es ist möglich, daß etwas anderes als die Zielzelle als eine Zielzelle beurteilt wird. Auch kombinieren sich die einzelnen Signale zur Bildung eines breiteren Signals, welches als das Signal einer Zielzelle mißverstanden werden kann, wenn zwei oder mehr Fluoreszenz abgebende Teilchen in schneller Aufeinanderfolge hindurchlaufen.
Von diesem Standpunkt aus betrachtet, sollte die kürzere Seite eines rechteckigen Schlitzes so kurz wie möglich sein. Je kürzer die Länge, desto weniger von den Teilchen abgegebene Fluoreszenz gelangt jedoch in den Photodetektor 38 hinein, und das bedeutet, daß die Zellermittlung schwierig ist. Die sich widersprechenden Erfordernisse müssen also beide befriedigt werden. Wenn zum Beispiel die Konzentration von Fluoreszenz abgebenden Teilchen 5000 Zellen/µl und der mit dem Schlitz in der Strtmungszelle entsprechende Bereich 20 µm x 150 µm groß ist, beträgt die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von zwei oder mehr Teilchen in dem Schlitzbereich etwa 1 %, wie von der Poisson-Verteilungswahrscheinlichkeit geschätzt, und bei niedrigerer Konzentration ist die Wahrscheinlichkeit eines gleichzeitigen Passierens fast gleich Null. Wenn der dem Scmitz entsprechende Bereich 50 µm x 150 µm groß ist, ist die Wahrscheinlichkeit des gleichzeitigen Passierens von zwei oder mehr Teilchen etwa 5 %. Es ist bekannt, daß das Passieren in rascher Aufeinanderfolge schwerlich auftritt, wenn man einen 20 µm x 150 µm großen Schlitz verwendet.
Die in den Photodetektor hineingelangende Fluoreszenz kann also durch das Begrenzen des Schlitzes auf etwa 20 µm x 150 µm als von einem Teilchen erzeugt betrachtet werden, so daß alle durch den Ermittlungsbereich hindurchlaufenden Zielteilchen ermittelt werden.
Figur 4 zeigt eine zweite Ausführungsform der Erfindung. Wie bei der ersten in Figur 1 gezeigten Ausführungsform wird die in den Photodetektor und die Videokamera hineingelangende Lichtmenge gesenkt, weil das Lichtaufnahmesystem für die Zellermittlung und das Lichtaufnahmesystem für die Bildaufnahme auf der gleichen optischen Achse angeordnet sind und so der Halbspiegel 30 in das System eingeschlossen werden muß. Um dieses Problem zu überwinden, ist bei der zweiten Ausführungsform das optische System für die Zellermittlung (wobei das System die Objektivlinse 27, den optischen Filter oder den Erregungslicht-Blockierfilter 29, den Verschluß 34, den Schlitz 36 und den Photodetektor 38 einschließt) optisch von dem Bildaufnahmesystem getrennt. Auf diese Weise wird der Halbspiegel 30 nicht benötigt.
Bei dieser Ausführungsform kann, verglichen mit der ersten Ausführungstörm in Figur 1, ein Nadelloch mit einer runden Öffnung (zum Beispiel mit einem 150 µm-Durchmesser) als der Schlitz 36 verwendet werden.
Figur 5 zeigt eine dritte Ausführungsform der Erfindung. Bei dieser Ausführungsform ist das System für das Ausstranen des Zellermittlungslichtes an der Lichtempfangsseite angeordnet, um das sogenannte Spot-Beleuchtungssystem zu bilden. In diesem Fall wird der Erregungslicht- Blockierungsfilter 28 der ersten Ausführungsform von Figur 1 nicht benötigt, und die Konstruktion ist einfacher.
Bei der in Figur 5 gezeigten Ausführungsform verläuft das Licht von der Ermittlungslichtquelle 10 durch die Strömungszelle 24 hindurch, und die zu der Bildaufnahmeeinrichtung 32 zurückreflektierte Menge ist gering. Wenn der dichroitische Spiegel 21 die in Figur 2 gezeigte Charakteristik aufweist, wird jegliches Licht von der ersten Lichtquelle (der Ermittlungslichtquelle) 10, das durch die Strömungszelle 24 oder eine Zelle in dem Hüllenfluß reflektiert wird, durch den dichroitischen Spiegel 21 reflektiert und gelangt daher nicht in die Bildaufnahmeeinrichtung (Videokamera) 32 hinein. Das heißt, der Spiegel 21 dient als der Erregungslicht- Blockierungsfilter, und daher ist es nicht notwendig, einen Blockierungsfilter an der Seite der Bildaufnahmeeinrichtung zu plazieren.
Figur 6 zeigt eine vierte Ausführungsform der Erfindung. Diese Ausführungsform ist so angelegt, daß das von der Ermittlungslichtquelle 10 abgegebene Erregungslicht nicht in die Bildaufnahrneeinrichtung (Videokamera) 32 hineingelangt. Das Bestrahlungssystem und das Lichtaufnahmesystem für die Teilchenermittlung sind beide von dem Bestrahlungssystem und dem Aufnahmesystem für das Aufliehmen der Tejichenbilder getrennt. Auf diese Weise sind der dichroitische und der Halbspiegel nicht erforderlich. Es hat also die folgenden Auswirkungen:
(1) Es ist nicht notwendig, einen optischen Filter (einen Erregungslicht-Blockierungsfilter) 28 in dem Weißlicht-Bildaufnahmesystem zu verwenden.
(2) Selbst wenn die Wellenlänge des Erregungslichtes in dem Wellenlängenbereich der Weißlichtquelle 12 liegt, hat dies keine Auswirkungen auf das Weißlichtbild. Als ein Ergebnis wird der Grad an Wahlfteiheit hinsichtlich der Wellenlänge des Erregungslichtes verbessert.
(3) Die Zellermittlung erfolgt von der Seite des flachen Probenflusses, und der Schlitz 36 braucht also, verglichen mit der Ausführungsform von Figur 1, kein rechteckiger Schlitz zu sein. Stattdessen kann man ein Nadelloch mit einem Durchmesser von etwa 150 µm verwenden.
Die Ausführungsformen der Erfindung haben die folgenden Eigenschaften:
(1) Es wird ein einfacher Aufbau verwendet, um Zielteilchen, die mit anderen Arten von Teilchen vermischt sind, zu ermitteln und dann die Zielteilchen abzubilden.Insbesondere bei einer Probe mit einer niedrigen Konzentration an Zielteilchen oder dann, wenn sich eine kleine Zahl Fluoreszenz ausstrahlender Teilchen (Zielteilchen) in einer großen Zahl von Teilchen befinden, können die Bilder der Zielteilchen selektiv aufgenommen werden.
(2) Durch das Anwenden der Technik des Flußabbildens wird eine hohe Verarbeitungskapazität erreicht, was mit der herkömmlichen Mikroskopmessung unöglich war.
(3) Bei dem Spotlight-System zur Erzeugung fluoreszierender Bilder ermöglicht es das Positionieren des dichroitischen Spiegeis dem Erregungslicht, gleichmäßig alle Zelle zu bestrahlen. Die Erregungslichtintensität beträgt etwa das Zweifache der Intensität, die erreicht wird, wenn die Bestrahlung von einer Seite erfolgt.
(4) Die Zielteilchen können durch die Signalverarbeitung des Beobachtungssystems für die Teilchenermittlung gezählt werden.
(5) Durch Ersetzen des optischen Filters kann die Wellenlänge des Erregungslichtes auf einen gewunschten Wert festgelegt werden, so daß breite und allgemeine Anwendungen verwirklicht werden können.
Nach der Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen versteht es sich, daß die Erfindung nicht auf diese genauen Ausführungsformen beschränkt ist und daß durch einen Fachmann verschiedene Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von der wie in den anhängenden Anspruchen definierten Erfindung abzuweichen.

Claims

1.Vorrichtung zum Analysieren von Teilchenbildem mit:

einer Strömungszelle (24) für einen Hüllenfluß einer Teilchen enthaltenden Probenflüssigkeit,

einer ersten Lichtquelle (10),

einem ersten optischen Filter (18) zum Erhalten von Fluoreszenzerregungslicht einer speziellen Wellenlänge von dem von der ersten Lichtquelle (10) ausgesandten Licht,

einem Photodetektor (38) zur Feststellung von Fluoreszenz, die von einem mit dem Fluoreszenzerregungslicht bestrahlten Teilchen (43) ausgesandt wird,

einer zweiten Lichtquelle (12) zum Emittieren eines Lichtimpulses zur Erzeugung eines Bildes des Teilchens (43),

einer Bildaufnahmeeinrichtung (32) zur Aufnahme des durch die zweite Lichtquelle (12) erzeugten Bildes des Teilchens (43),

einer Beurteilungseinrichtung (40) für die Teilchenermittlung zur Verarbeitung eines fluoreszierenden Signales von dem Photodetektor (38), um zu beurteilen, ob ein Zielteilchen ermittelt wurde, und zur Abgabe eines Auslösesignals zur Aktivierung der zweiten Lichtquelle (12), wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilchen ermittelt wurde,

einem dichroitischen Spiegel (20), der so angeordnet ist, daß er die optischen Wege des Lichtes und der ersten und der zweiten Lichtquelle (10, 12) vereinigt, um einen Bereich der Strömungszelle (24) zu bestrahlen,

einem zweiten optischen Filter (28) zum Blocken des Fluoreszenzerregungs lichtes, das durch die Strömungszelle (24) übertragen wurde,

einem Halbspiegel (30) zur Teilung des durch das zweite optische Filter (28) übertragenen Lichtes in einen ersten und einen zweiten Teil und zur Lenkung des ersten Teils zu dem Photodetektor (38) und des zweiten Teils zu der Bildaufnahmeeinrichtung (32),

einem zwischen dem Halbspiegel (30) und dem Photodetektor (38) angeordneten Verschluß (34) zum Übertragen oder Blocken von Licht, wobei der Verschluß so angeordnet ist, daß er verschlossen ist, während die zweite Lichtquelle (12) Licht aussendet, und

einem zwischen dem Verschluß (34) und dem Photodetektor (38) so angeordneten Spalt (36), daß ein Abfühlbereich (42) über den Teilchenfluß in einem Bildaufnabmebereich (44) der Bildaufnahmeeinrichtung (32) in der Strömungszelle (24) gebildet wird.

2. Vorrichtung zum Analysieren von Teilchenbildern mit einer Strömungszelle (24) für einen Hüllenfluß einer Teilchen enthaltenden Probenflüssigkeit,

einer ersten Lichtquelle (10),

einem ersten optischen Filter (18) zum Erhalten von Fluoreszenzerregungs licht einer speziellen Wellenlänge von dem von der ersten Lichtquelle (10) ausgesandten Licht,

einem Photodetektor (38) zur Ermittlung von Fluoreszenz, die von einem Teilchen in eine von der Übertragungsrichtung des Fluoreszenzerregungslichtes durch die Strömungszelle (24) verschiedenen Richtung ausgesandt wird,

einer Bildaufnahmeeinrichtung (32) zur Aufnahme des Bildes des durch die zweite Lichtquelle (12) erzeugten Teilchens (43),

einer Beurteilungseinrichtung (40) für die Teilchenermittlung, um ein fluoreszierendes Signal von dem Photodetektor (38) zu verarbeiten, um zu beurteilen, ob ein Zielteilchen ermittelt wurde, und zur Abgabe eines Auslösungssignals zur Aktivierung der zweiten Lichtquelle (12), wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilchen ermittelt wurde,

einem dichroitischen Spiegel (20), der so angeordnet ist, daß er die optischen Wege des Lichtes von der ersten und zweiten Lichtquelle (10, 12) vereinigt, um einen Bereich der Strömungszelle (24) zu bestrahlen,

einem zwischen der Strömungszelle (24) und der Bildaufhahmeeinrichtung (32) angeordneten zweiten optischen Filter (28) zum Blocken des Fluoreszenzerregungslichtes, das durch die Strömungszelle (24) übertragen wurde,

einem zwischen der Strömungszelle (24) und dem Photodetektor (38) angeordneten dritten optischen Filter (29) zum Blocken des Fluoreszenzerregungslichtes,

einem zwischen dem dritten optischen Filter (29) und dem Photodetektor (38) angeordneten Verschluß (34) zum Übertragen oder Blocken von Licht, wobei der Verschluß derart angeordnet ist, daß er verschlossen ist, während die zweite Lichtquelle (12) Licht aussendet, und

einem zwischen dem Verschluß (34) und dem Photodetektor (38) derart angeordneten Spalt (36), daß ein Abfühlbereich (42) über den Teilchenfluß in einem Bildaufnähmebereich (44) der Bildaufnahmeeinrichtung (32) in der Strörnungszelle (24) gebildet wird.

3. Vorrichtung zum Analysieren von Teilchenbildern mit

einer ersten Lichtquelle (10),

einem optischen Filter (18) zum Erhalten von Fluoreszenzerregungslicht

einer speziellen Wellenlänge von dem von der ersten Lichtquelle (10) ausgesandten Licht,

einem Photodetektor (38) zur Ermittlung von Fluoreszenz, die von einem Teilchen (43) ausgesandt wird, welche mit dem Fluoreszenzerregungslicht bestrahlt wird,

einer Bildaufnahmeeinrichtung (32) zur Aufnahme des von der zweiten Lichtquelle (12) erzeugten Bildes des Teilchens (43),

einer Beurteilungseinrichtung (40) für die Teilchenermittlung zur Verarbeitung eines fluoreszierenden Signals von dem Photodetektor (38), um zu beurteilen, ob ein Zielteilchen ermittelt wurde, und zur Abgabe eines Auslösungsssignals zur Aktivierung der zweiten Lichtquelle (12), wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilehen ermittelt wurde,

einem dichroitischen Spiegel (21), der so angeordnet ist, daß er von der Strömungszelle (24) Licht empfängt, das von der zweiten Lichtquelle (12) erzeugt wurde und durch die Strömungszelle übertragen wurde, und das Fluoreszenzerregungslicht zu der Strömungszelle lenkt,

einem Halbspiegel (30) zur Teilung des von der Strömungszelle (24) über den dichroitischen Spiegel (21) empfangenen Lichtes in einen ersten und einen zweiten Teil und zur Lenkung des ersten Teils zu dem Photodetektor (38) und des zweiten Teils zu der Bildaufhahmeeinrichtung (32),

einem zwischen dem Verschluß (34) und dem Photodetektor (38) derart angeordneten Spalt (36), daß ein Abfühlbereich (42) über den Teilchenfluß in einem Bildaufnahmebereich (44) der Bildaufnahmeeinrichtung (32) in der Strömungszelle (24) gebildet wird.

4. Vorrichtung zum Analysieren von Teilchenbildern mit einer Strömungszelle (24) für einen Hüllenfluß einer Teilchen enthaltenden Probenflüssigkeit,

einer ersten Lichtquelle (10),

einem Photodetektor (38) zur Ermittlung von Fluoreszenz, die von einem Teilchen (43) ausgesandt wird, welches mit dem Fluoreszenzerregungslicht bestrahlt wird,

einer Bildaufnahmeeinrichtung (32) zur Aufnahme des von der zweiten - Lichtquelle (12) erzeugten Bildes des Teilchens (43),

einer Beurteilungseinrichtung (40) für Teilchenermittlung zur Verarbeitung eines fluoreszierenden Signals von dem Photodetektor (38), um zu beurteilen, ob ein Zielteilchen ermittelt wurde, und zur Abgabe eines Auslösesignals zur Aktivierung der zweiten Lichtquelle (12), wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilchen ermittelt wurde,

einem zwischen der Strömungszelle (24) und dem Photodetektor (38) angeordneten zweiten optischen Filter (28) zum Blocken des Fluoreszenzerregungslichtes,

einem zwischen dem optischen Filter (28) und dem Photodetektor (38) angeordneten Verschluß (34) zum Übertragen oder Blocken von Licht, wobei der Verschluß so angeordnet ist, daß er verschlossen ist, während die zweite Lichtquelle (12) Licht aussendet, und

einem zwischen dem Verschluß (34) und dem Photodetektor (38) derart angeordneten Spalt (36), daß ein Abfühlbereich (42) über den Teilchenfluß in einem Bildaufnahmebereich (24) der Bildaufnahmeeinrichtung (32) in der Strömungszelle (24) gebildet wird,

wobei eine erste optische Achse, die von der ersten Lichtquelle (10) zu dem Photodetektor (38) verläuft, von einer zweiten optischen Achse getrennt ist, die von der zweiten Lichtquelle (12) zu der Bildaufnahmeeinrichtung (32) verläuft, und die erste und zweite optische Achse sich in der Strömungszelle (24) kreuzen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, bei der der Verschluß (34) weggelassen ist und stattdessen der Photodetektor eine Torflinktion hat, wobei das Tor so angeordnet ist, daß es geschlossen ist, während die zweite Lichtquelle (12) Licht aussendet.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, bei der die erste Lichtquelle (10) so angeordnet ist, daß sie kontinuierlich Licht aussendet, die zweite Lichtquelle (12) so angeordnet ist, daß sie einen Impuls von weißem Licht aussendet, und die Bildaufnahmeeinrichtung (32) so angeordnet ist, daß sie ein Stehbild des Teilchens (43) aufnimmt.

7. Verfahren zum Analysieren von Teilchenbildern, mit dem man eine Teilchen enthaltende Probenflüssigkeit durch eine Strömungszelle (24) führt,

einen Teilchenabfühlbereich (42) der Strömungszelle mit Fluoreszenzerregungslicht einer Wellenlänge zur Erzeugung von Fluoreszenz in Zielteilchen bestrahlt,

einen Detektor (38) verwendet, um Fluoreszenz zu ermitteln, und dabei beurteilt, ob ein Zielteilchen (43) ermittelt wurde, und

wenn beurteilt wird, daß ein Zielteilchen (43) ermittelt wurde, einen Bildaufnahmebereich (44) der Strömungszelle (24) mit Abbildungslicht bestrahlt, um ein Bild des Zielteilchens (43) zu erzeugen, welches von einer Bildaufnahmeeinrichtung (32) aufgenommen wird, und den optischen Weg zu dem Detektor (38) verschließt, um zu verhindern, daß der Detektor das Abbildungslicht empfängt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Teilchenabfühlbereich (42) in dem Bildaufnahmebereich (44) angeordnet ist und in der Fließrichtung der Teilchen kürzer als der Bildaufnahmebereich (44) ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die seitlichen Kanten des Bildabfühlbereiches (42) im wesentlichen mit den seitlichen Kanten des Bildaufnahmebereichs (44) zusammenfallen.

10. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, bei dem der Teilchenabfühlbereich (42) kontinuierlich mit dem Fluoreszenzerregungslicht bestrahlt wird und die Probenflüssigkeit durch die Strömungszelle (24) als ein Hüllenfluß geht.