DE69133208T2 - Vier-aminosäurenepitop mit schutzwirkung gegen plasmodium vivax malaria - Google Patents
Vier-aminosäurenepitop mit schutzwirkung gegen plasmodium vivax malariaInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein synthetisches Peptid des Malaria Humanparasiten Plasmodium vivax und sie betrifft insbesondere ein synthetisches oder der Rekombination zugängliches Peptid mit der Sequenz AGDR, die ein Schutzepitop darstellt, das im Hüllprotein des Sporozoiten (CS) des Malaria Humanplasmodium vivax vorkommt. Wenn ein monoklonaler Antikörper mit der Spezifität für die aus 4 Aminosäuren aufgebaute Sequenz an das CS Protein des P. vivax Sporozoiten in vivo anbindet, kommt es nicht zur Infektion.
- Von den vier Malariatypen des Menschen sind P. vivax und P. falciparum am weitesten verbreitet und verursachen weltweit die meisten Malaria induzierten Erkrankungen. Gelänge es eine Infektion durch diese Parasiten des Menschen zu verhindern, würde eines der größten Gesundheitsrisiken in tropischen und subtropischen Gebieten unserer Erde gemildert werden. Die beste Methode Malaria unter Kontrolle zu bringen verspricht die Entwicklung und der Einsatz von Impfstoffen. Ein Ansatz zur Entwicklung von Malaria- Impfstoffen beruht auf der Anwendung des CS-Proteins als ein Impfstoff-Antigen. Dieses Protein umhüllt die Oberfläche des Sporozoiten. Der Sporozoit ist das Lebenssatdium des Parasiten, der auf den Menschen durch den Stich der damit befallenen weiblichen Anopheles Mücke übertragen wird. Sowohl bei der Malaria von Maus als auch Mensch konnte nachgewiesen werden, dass Antikörper gegen das CS-Protein Schutz gegen eine in vivo Infektion durch Spörozoiten (Chroenvit et. al.; Infect. Immunity 55: 604, 1987; Charoenvit et al. in der Presse J. Immunol. 1991; Charoenvit et al. in der Presse Science 1990) bieten.
- 1985 ermittelten McCutchen und Kollegen die Sequenz des Gens für das CS Protein in P.vivax und klärten die Aminsäuresequenz aus diesem Gen auf (McCutchan et al., Science 230: 1381, 1985). 1987 beschrieben McCutchan und Wistar im US-Patent 4.693.994 Wiederholungen einer aus neun Aminosäuren bestehenden Sequenz innerhalb des CS- Proteins als ein immundominantes synthetisches Peptid. Die sich wiederholende Sequenz ist Gly-Asp-Arg-Ala-Asp- Gly-Gln-Pro-Alä. Im Patent '994 und in anderen Veröffentlichungen vertreten McCutchan/Wistar die Ansicht, dass die Sequenz aus neun Aminosäuren die Bildung von Antikörpern auslösen kann, die gegen Malaria P.vivax schützen. Experimentell konnte nachgewiesen werden, dass die McCutchan/Wistar Sequenz zwar die Entwicklung von Anti-CS Antikörpern beim Menschen anregt, aber nicht zur Bildung immunologisch schützender Antikörper führt. In einem in Am. J. Trop. Med. Hyg. 40 (5), S. 455-464 (1989) veröffentlichten Artikel beschreiben Collins et al. Tests, in denen Saimiri Affen (Saimiri sciureus boliviensis), die gegenüber dem Malaria Humanparasiten vivax anfällig sind, mit zwei unterschiedlichen Zubereitungen (VIVAX-1 und NS1&sub8;&sub1;V20) immunisiert wurden. Beide Zubereitungen enthalten das Peptid nach McCutchan/Wistar (Gly-Asp-Arg-Ala-Asg-Gly-Gln-Pro-Ala). Diese Affen zeigten nach Impfung mit 10&sup4; P.vivax Sporozoiten keinen statistisch relevanten Schutz.
- Nussenzweig et al. beschreiben im US-Patent 4.826.957 und in der internationalen Patentanmeldung WO 88/07546 ein immunogenes rekombinantes Hefexepressionsprodukt, das eine lange Sequenz unter Einschluss eines Fragments von P. vivax CS aufweist. Die Sequenz enthält eine Vielzahl von Wiederholungseinheiten der Sequenz Gly- Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala als Teil eines Polypeptidkomplexes. Der Impfstoff führt zur Bildung von Antikörpern gegen Gly-ASp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro- Ala, bietet aber keinen hinreichenden Schutz gegen den Befall mit Malaria Sporozoiten. Gebraucht wird eine einfache Substanz, mit der ein Impfstoff gegen P. vivax hergestellt werden kann. Im US-Patent 4.957.689 (Nussenzweig et. al) ist aufgezeigt, dass das synthetische Peptid H (Asp-Arg-Ala-X-Gly-Gln-Pro-Ala- Gly)&sub2;, in dem X Asp oder Ala darstellt, von monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein von P. vivax erkannt wird und die. Bindung von gekennzeichneten monoklonalen Anti-CS an immobilisierte P. vivax- Extrakte hemmen kann. Im Europ. J. Immunol. 18: 1119- 1122 (1988), zeigen Nardin et al. auf, dass dieses Peptid die Bildung von Antikörpern gegen P.vivax Sporozoiten in vivo in H-2k und H-2a Mäusen des Haplotyps induzieren kann, wie indirekte Immunofluoreszenz Assays belegen. Keine dieser Referenzen offenbart oder legt jedoch nahe, dass ein Polypeptid mit der Tetrapeptidfolge Ala-Gly-Asp-Arg (AGDR) eine schützende Immunantwört gegen Malaria erzeugen könnte.
- Dementsprechend wird durch die Erfindung ein synthetisches Peptid mit der Aminosäuresequnez AGDR geschaffen. Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung besteht ein synthetisches Peptid aus einer geraden Kette der sich wiederholenden Aminosäuresequenz ADGR, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz GDRADGQPA nicht enthält.
- Nach einem dritten Merkmal der Erfindung wird ein synthetisches Peptid geschaffen, das aus einer verzweigten Kette von (AGDR)&sub3; und (AGDR&sub3;) plus einer bekannten T-Helferzellen-Bindungsstelle besteht.
- Gemäß einem vierten Merkmal der Erfindung wird ein Impfstoff geschaffen, der das synthetische Peptide nach dem ersten Merkmal der Erfindung enthält und die Bildung von schützenden Antikörpern gegen Malariainfektion durch den Humanparasiten Plasmodium vivax Sporozoiten ermöglicht.
- Nach einem fünften Merkmal der Erfindung wird ein synthetisches Peptid oder ein Impfstoff nach einem der Merkmale eins bis vier geschaffen, der eine Infektion mit Pladmodium vivax verhindert oder deren Behandlung erlaubt.
- Nach einem sechsten Merkmal der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein erfindungsgemäßer Impfstoff gemäß einem der vorstehenden Merkmal für die Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung einer Infektion durch Plasmodium vivax oder deren Behandlung eingesetzt.
- Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung in allen ihren Ausgestaltungen sind nachstehend beschrieben oder in den Unteransprüchen definiert.
- Der von McCutchan und Kollegen (McCutchan et als, Science 230: 1381, 1985) ursprünglich verwendete monoklonale Antikörper zur Isolierung des Proteins und der Nucleotidsequenz, der später zum Gegenstand des US- Patentes 4.693.994 führte, wurde ursprünglich von Charoenvit & Beaudoin vom Infectious Diseases Department, Naval Medical Research Intitute (NMRI) entwickelt und als ein passives Immunisierungsmittel eingesetzt. Saimiri-Affen wurden durch intravenöse Infusion von 2 mg des monoklonalen Antikörpers (NVS3 genannt) pro Tier immunisiert. Danach wurden ihnen 10&sub4; P. vivax Sporozoiten intravenös gespritzt. Vier von sechs Tieren erhielten vollen Schutz und bei den übrigen zwei stellte sich die Erkrankung merklich verzögert ein. Diese Erkenntnisse sind Gegenstand einer zeitgleich eingereichten Anmeldung für Chroenvit et al. mit dem Titel NVS3 als Mittel zur passiven Impfung gegen P. vivax." Die Analyse dieses schützenden Antikörpers durch Epitop-Charakterisierungstechnologie ergab, dass NVS3 als spezifisches Epitop die Aminisäuresequenz Alanin-Glycin-Aspartatsäure-Arginin (Ala-Gly-Asp-Arg, sonst AGDR abgekürzt) aufweist. Bei nachfolgenden Arbeiten fand man überraschenderweise heraus, dass zirkulierende Antikörper gegen das Epitop AGDR gegen Infektion durch P.vivax Sporozoiten schützen und AGDR daher ein Immunogen ist.
- Die Analyse von Serumproben von Menschen und Saimiri- Affen, die mit einem Impfstoff NS1&sub8;&sub1;V20 geimpft worden waren, der die McCutchan/Wistar Sequenz (Gly-ASp-Arg- A1a-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala, abgekürzt auch GDRADGQPA) mit den Aminosäuren Alanin,Glycin, Aspartatsäure und Arginin enthält, zeigte auf, dass sowohl die Menschen als auch die Affen Antikörper bildeten, die sich an P. vivax Sporozoiten binden und an die Sequenz nach McCutchän/Wistar, doch konnten keine Antikörper gegen das Schutzepitop AGDR festgestellt werden. Nach den Ausführungen von Collins et al. produzierte dieser Impfstoff keinen signifikanten Schutz gegen Malaria P. vivax. Das Ausbleiben des Schutzes ist überraschend, weil Alanin die letzte Säure in der Sequenz nach McCutchan/Wistar ist und Glycin, Aspartätsäure und Ar min die ersten Säuren in der Abfolge dieser Sequenz sind. Demnach enthält die McCutchan/Wistar Sequenz die AGDR-Sequenz dann, wenn mehr als eine Wiederholung vorkommt und im Impfstoff NS1&sub8;&sub1;V20 war einer Vielzahl der AGDR-Sequenz kopiert.
- Die Erfindung beruht auf der Entdeckung einer Aminosäuresequenz im CS-Protein, die das Epitop von monklonalen Antikörper ist, die gegen durch Sporozoiten hervorgerufene P.vivax Malaria schützen. Aufgrund der Kenntnis, dass diese Aminosäuresequenz das Epitop eines Antikörpers ist, der eine Infektion mit P. vivax Malaria verhindert, sind als Impfstoff geeignete synthetische oder rekombinante Proteine auf der Basis dieser Aminosäuresequenz planbar.
- Dass Impfstoffe, die bereits das Schutzepitop AGDR enthalten, keine schützende Antikörper-Reaktion auslösen, deutet darauf hin, dass die Präsentation von auf AGDR basierenden Impfstoffen ausschlaggebend ist. Diese Impfstoffe sollten nicht die zugehörigen Aminosäuren aus der McCutchan/Wistar Sequenz enthalten. Die einfachste Ausführung der AGDR-Sequenz ist das Peptid AGDR. In einer weiteren Ausführung besteht die AGDR-Sequenz aus einer einfachen Kette sich wiederholender AGDR Sequenzen. Die genaue Anzahl der Wiederholungen ist nicht von Bedeutung. Bevorzugt werden bis etwa dreißig Wiederholungen. In weiterer Ausgestaltung besteht das Peptid für den Impfstoff aus einfachen Ketten der AGDR-Sequenzen, die durch Spacergruppen getrennt sind. Auch hier ist die Anzahl der Wiederholungen unkritisch, sofern darauf geachtet wird, dass die Hinderungen, die bei der Sequenz nach McCutchan/Wistar vorhanden sein müssen, vermieden werden. Die Spacer können einzelne oder mehrere Wiederholungen der AGDR-Sequenz trennen. MAPS (mulitple antigenic peptide systems) können durch Konjugation multipler AGDR enthaltender Ketten auf eine zentrale Region gebildet werden. Diese MAPS sind von Tam et al. PNAS USA 86: 9084, 1989 beschrieben worden. Kombinationen dieser einzelnen Formen sind Teil der Erfindung.
- Bei Verwendung als Impfstoff können diese Peptide auf AGDR-Basis mit einem Carrier Protein verknüpft werden, das ggf. ein T-Zellen Epitop enthält und auf Malaria zurückgeht oder nicht. Diese Peptid/Carrier-Kombination kann dann in Verbindung mit Transportsystemen und Adjuvantien transportiert werden, die u. a. Aluminiumhydroxid, Liposome, Monophosphoryllipid A und Mykobakterien-Bestandteile enthalten.
- Für alle technischen Begriffen und. Formulierungen in diesem Test, die nicht speziell definiert sind, gilt die Begrifflichkeit, die sie auf dem einschlägigen Fachgebiet haben. Der Begriff synthetisch" soll hier angeben, dass das CS-Protein aus P. vivax in seiner natürlich vorkommenden Form bei dieser Erfindung ausdrücklich ausgenommen ist. Synthetisch" soll hier die Herstellung von Impfstoffen auf der Basis von AGDR durch biologische Methoden, beispielsweise chemische Synthese und DNA Rekombinationstechniken nicht ausschließen.
- Nach der Beschreibung der Erfindung folgen nunmehr Beispiele für spezielle Anwendungen der Erfindung sowie der derzeit bekannte bestmögliche Weg ihrer Realisierung. Die spezifischen Beispiele schränken den Schutzumfang der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung nicht ein.
- Die erfindungsgemäßen Moleküle auf der Basis von AGDR werden im Wege der chemischen Synthese über Peptid- Synthesemethoden nach Merrifield (Merrfield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149, 1963) hergestellt. In einem ersten Schritt erfolgt die Synthese gemäß der Erfindung, indem die erste Aminosäure auf eine feste Matrix durch eine Veresterungsreaktion zwischen der aktivierten Carboxylgruppe der Aminosäure und einem mit der festen Matrix verbundenen Linker kondensiert wird. Dieser Schritt erfolgt in einem aliphatischen Lösungsmittel, z. B. N,N-Dimethylformamid (DMF). Die α- Aminogruppen aller, bei dieser Synthese eingesetzten Aminosäuren sind geschützt, entweder durch tert- Butyloxycarbonyl (tBOC) oder Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Gruppen. Fmoc-Methode wird bevorzugt. Die Entfernung dieser Schutzgruppe im Falle der Fmoc- Methode erfolgt über die Behandlung mit einer 20%igen Peperidinlösung in DMF. Nach der Abspaltung der Schutzgruppe wird die nächste Aminosäure zugesetzt. Hierzu wird die zweite Aminosäure auf die erste durch eine Acylierungsreaktion zwischen der Schutzgruppe auf der 1. Aminosäure und der abgespaltenen α-Aminogruppe auf der 2. Aminosäure in einem inerten organischen Lösungsmittel, z. B. DMF, und in Gegenwart eines Katalysators, z. B. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) kondensiert. Die Reaktionen erfolgen bei Raumtemperatur. Jede Aminosäure kann in beliebiger Abfolge zugesetzt werden. Erfindungsgemäß werden die Aminosäuren so zugesetzt, dass das Peptid AGDR entsteht.
- Das fertige Peptid wird aus der Matrix mit bekannten Methoden der Säurehydrolyse entfernt, im Falle der Erfindung mit Hydrofluorsäure. Nach Entfernen von der Matrix durch Hydrolyse, wird die Matrix ausgefiltert, die Peptide werden mehrfach mit Wasser ausgewaschen und dann zur Trockne konzentriert, dann erneut in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Das Peptid wurde anschließend durch Lösen in Wasser gereinigt und Gelchromatographie über Sephadex-G 25 Harz unterzogen, das in 0,1 M CH&sub3;COOH eluiert war. Der Hauptausschlag wurde gesammelt und gefriergetrocknet.
- Viele Impfstoffe auf der Basis des Tetrapeptids AGDR können synthetisiert werden. Hierzu gehören, ohne einzuschränken, einzelne AGDR Moleküle, gerade Ketten sich wiederholender AGDR Sequenzen wie (AGDR)3 und (AGDR)6 sowie verzweigte Polyrnerketten, die aus (AGDR)3 und (AGDR)3 plus einer bekannten Bindungsstelle für T- Helferzellen bestehen. Das T-Helferzellen-Peptid kann die Sequenz EYLDKVRATVGTEWTPCSVT haben, ist darauf aber nicht beschränkt. Diese aus verzweigten Ketten bestehenden Impfstoffe sind unter der Bezeichnung MAPS bekannt (multiple antigen peptid systems). Die grundlegenden Peptidketten werden nach Beispiel 1 synthetisiert. Die Synthese verzweigter Ketten und die Kombination von Ketten mit zwei unterschiedlichen Epitopen erfolgt entsprechend den von Tam und Lu (Tam et al. PNAS, 86: 9084, 1989) beschriebenen Verfahren.
- Der erfindungsgemäße Impfstoff kann Subjekten injiziert oder auf andere bekannte Arten verabreicht werden. Einige dieser Methoden und Dosierungspläne sind in den US-Patenten 4.693.994 und 466.917 beschrieben. Für die Abgabe sind sie mit Carrier-Proteinen zu koppeln, wie beispielsweise Tetanus Toxoid und Choleratoxin. Die oben beschriebenen Moleküle können an Alum (Aluminiumhydroxid) absorbiert und parenteral in wässriger Lösung abgegeben werden. Sie können auch in anderen Adjuvantien wie beispielsweise Liposome, Aqualan und Monophosphoryl-Liped A gelöst werden und können außerdem Immunverstärker wie bakterielle Zellwand und Cytoskelett aufweisen.
- Das 8-Aminosäuren-Peptid (AGDR)2 wird schrittweise nach der Merrifield-Synthese synthetisiert (Festphasen- Peptidsynthese). I. Synthese eines Tetrapeptids; J. Am. Chem Soc.: 85: 2149-2154; 1963. Die Synthese wird mit Pam-t-Boc-L-Arginin (Tos) Harz (0,5 nmol) gestartet. Das geschützte Peptid wird mit Wasserstoff-Fluorid/p- eresol (9 : 1, v/v eine Stunde lang bei 0ºC) deprotektiert.
- (1) ALLGEMEINES
- (i) Anmelder: Hoffman, Stephen L. Charoenvit, Yupin, Jones, Trevor R.
- (ii)Titel der Erfindung: Epitop aus vier schützenden Aminosäuren gegen Malaria Plasmodium vivax
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 1
- (iv) Ansprechpartner:
- (A) Anschrift: Naval Medical Res. & Dev. Cmd.
- (B) Straße: National Naval Medical Center
- (C) Ort: Bethesda
- (D) Bundesstaat: Maryland
- (E) Land: USA
- (F) ZIP; 20889-5044
- (v) Rechner lesbare Form
- (A) Mittel: Floppy disk
- (B) Rechner: IBM-kompatibler PC
- (C) Betriebssystem: PC-Dos/MS-DOS
- (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version 1.25
- (vi) Anmeldungsdaten
- (A) Anmeldungsnr.: US 07/609,551
- (B) Anmeldetag: 6. Nov. 1990
- (C) Klassifizierung
- (viii)Anwalt/Vertreter-Information:
- (A) Name: Spevack, A. David
- (B) Reg. Nr. 24,743
- (C) Aktenzeichen: N.C. 72.634
- (ix) Verbindungen
- (A) Telefon: (301) 295-6759
- (B) Fax-Nr. (301) 295-4033
- (2) DATEN ZUR SEQUENZ-IDENT. NR. 1
- (i) Sequenzdaten:
- (A) Länge: 4 Aminosäuren
- (B) Art: Aminosäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekülart: Peptid
- (iii) Hypothese: keine
- (iv) Anti-Sense (-) strang: keiner
- (v) Fragmentart: intern
- (vi) Ausgangsmaterial
- (A) Organismus: Plasmodium vivax
- (B) Strain: sal-1
- (C) Individual isolate: keine
- (D) Entwicklungsstadium: Sporozoit
- (xi) Beschreibung der Sequenz: Seq. Id. Nr. 1:
- Ala-Gly-Asp-Arg 1
Claims (12)
1. Synthetisches Peptid mit der Aminosäuresequenz
AGDR.
2. Synthetisches Peptid bestehend aus einer geraden
Kette der sich wiederholenden Aminosäuresequenz
AGDR, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die
Aminosäuresequenz Gly-Acp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gla-Pro-
Ala nicht enthält.
3. Synthetisches Peptid nach Anspruch 2,
gekennzeichnet durch bis zu etwa 30 Wiederholungen
der Aminosäuresequenz AGDR.
4. Synthetisches Peptid nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass die AGDR Sequenzen durch
Spacersequenzen voneinander getrennt sind.
5. Synthetisches Peptid nach Anspruch 2,
gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz (AGDR)2,
(AGDR) 3 oder (AGDR) 6.
6. Synthetisches Peptid bestehend aus einer
verzweigten Kette aus (AGDR)3 und (AGDR)3 plus einer
bekannten Bindungsstelle einer Helfer T-Zelle.
7. Synthetisches Peptid nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, dass das Peptide der Helfer T-
Zellen die Sequenz EYLDKVRATVGTEWTPCSVT hat.
8. Impfstoff aus einem synthetisches Peptid nach einem
der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass er
die Bildung von Antikörpern zum Schutz gegen
Malariainfektion anregt, die durch den
Humanparasiten Plasmodium vivax Sporozoiten
ausgelöst wird und eine pharmazeutisch akzeptablen
Träger enthält.
9. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das Peptid zu einem Carrier Protein konjugiert
wird.
10. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das Peptid mit einem pharmazeutisch
akzeptablen Adjuvans kombiniert ist.
11. Synthetisches Peptid oder ein Impfstoff nach einem
der Ansprüche 1-10 zur Vorbeugung oder Behandlung
von Infektionen durch Plasmodium vivax.
12. Verwendung eines Peptids oder eines Impfstoffes
nach einem der Ansprüche 1-11 zur Herstellung eines
Medikaments zur Vorbeugung gegen eine Infektion
durch Plasmodium vivax oder zur Behandlung eines
damit infizierten Menschen.
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