DE69133154T2

DE69133154T2 - Detergentzusammensetzung

Info

Publication number: DE69133154T2
Application number: DE69133154T
Authority: DE
Inventors: Katsutoshi Ara; Katsuhiko Deguchi; Kazuaki Igarashi; Katsuhisa Saeki; Taeko Sone; Masaki Tosaka
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1990-04-05
Filing date: 1991-04-04
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2011-04-05
Also published as: US5316691A; EP1050579A2; DE69133526D1; CA2039917A1; DE69133526T2; EP1050579A3; ES2187496T3; SG45199A1; US5429766A; DE69133154D1; EP0450627A3; EP1050579B1; EP0450627B1; EP0450627A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Detergenszusammensetzung, die alkalische Pullulanase enthält, die insbesondere gegen Stärkeschmutz eine hervorragende Reinigungskraft aufweist.

Beschreibung des Standes der Technik

Es ist bekannt, dass Enzyme Detergenszusammensetzungen beigemischt werden. Die Enzyme in der Waschzusammensetzung wirken als Waschhilfsmittel. Sie zersetzen oder denaturieren verschiedene Arten von Schmutz und Flecken, die an Kleidern anhaften, und Fette und Öle, Proteine, Stärke und dergleichen, die auf Geschirr verbleiben, um die Beschmutzung zu entfernen.
In der Vergangenheit wurde α-Amylase verwendet, um Stärkeschmutz zu entfernen. Die Reinigungswirkung gegen Stärkeschmutz wird verbessert, indem das Waschgut genügend lange in einer Waschlösung eingeweicht wird, die α-Amylase enthält.
Die Erfinder dieser Erfindung haben gefunden, dass ein bestimmter Typ Pullulanase effektiv auf Stärkeschmutz einwirkte, der fest an Tellern und Geweben anhaftete, und es so ermöglichte, die Reinigungswirkung merklich zu verbessern (japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 132192/1990).
Jedoch werden beinahe alle natürlich vorkommenden Pullulanasen in neutrale und saure Pullulanasen eingeteilt, die ihre maximale und stabile enzymatische Aktivität bei neutralem oder saurem pH zeigen. Sehr wenige Pullulanasen zeigen ihre maximale Aktivität oder Alkali- Resistenz im alkalischen pH-Bereich und sind somit für eine Detergenszusammensetzung für Geschirr und Kleider geeignet.
Eine alkalische Pullulanase ist erfindungsgemäß eine Pullulanase, die ihren optimalen pH im alkalischen Bereich hat. Gemäß dieser Erfindung ist eine Alkali-resistente Pullulanase eine Pullulanase, die ihr pH-Optimum im neutralen bis sauren Bereich aufweist und auch im alkalischen Bereich noch immer ein ausreichendes Maß an Aktivität hat im Vergleich zu ihrer Aktivität bei ihrem pH-Optimum und dennoch eine gute Stabilität aufweist. Die Bezeichnung "neutral" und "alkalisch" sind als die pH-Bereiche von 6 bis 8 bzw. nicht weniger als 8 definiert. Die einzige bislang bekannte alkalische Pullulanase ist in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 27786/1978 beschrieben. Diese alkalische Pullulanase ist ein Enzym mit ihrem pH-Optimum im alkalischen Bereich, und es weist eine breitere Substratspezifität auf als herkömmliche bekannte Pullulanasen. Da ihr pH-Optimum im schwach-alkalischen Bereich von 8 bis 9 liegt, kann sie nicht als Detergenskomponente verwendet werden. Ferner hat die obige Pullulanase den Nachteil, dass das Enzym instabil ist und eine geringe Produktivität hat. Daher ist diese Pullulanase nicht für die industrielle fermentative Herstellung geeignet.
In dieser Situation haben die Erfinder dieser Erfindung intensive Studien durchgeführt, um eine Pullulanase zu erhalten, die als Detergenskomponente geeignet ist. Im Ergebnis haben sie gefunden, dass eine Detergenszusammensetzung mit Reinigungswirkung gegen Stärkeschmutz erhalten wird, indem eine alkalische Pullulanase beigemischt wird, die ihr pH- Optimum in einem hohen pH-Bereich hat und durch oberflächenaktive Stoffe nicht deaktiviert wird. Dieser Befund vervollständigt diese Erfindung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Daher ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine neue Detergenszusammensetzung bereitzustellen, die eine alkalische Pullulanase mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich enthält und stabil gegen oberflächenaktive Stoffe ist.
Andere Aufgabe, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung deutlich werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Beziehung des pH-Wertes gegen die relative Aktivität der alkalischen Pullulanase A der Erfindung.
Fig. 2 zeigt die Beziehung des Behandlungs-pH gegen die verbleibende Aktivität der alkalischen Pullulanase A dieser Erfindung.
Fig. 3 zeigt die Beziehung der Reaktionstemperatur (bei pH 9,5) gegen die Restaktivität der alkalischen Pullulanase A dieser Erfindung.
Fig. 4 zeigt die Beziehung der Behandlungstemperatur (bei pH 9,5) gegen die Restaktivität der alkalischen Pullulanase A dieser Erfindung.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese der alkalische Pullulanase A dieser Erfindung.
Fig. 6 zeigt ein SDS-Elektrophorese-Profil der alkalischen Pullulanase A dieser Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN

Bezüglich der alkalischen Pullulanasen zur Verwendung in dieser Erfindung bestehen keine besonderen Beschränkungen, sofern sie ihr pH-Optimum im oberen alkalischen Bereich haben und von Detergentien nicht deaktiviert werden.
Dazu gehört eine alkalische Pullulanase A mit den folgenden Merkmalen:

Alkalische Pullulanase A

1) Wirkung

Zersetzt α-1,6-glycosidische Bindungen von Pullulan unter Bildung von Maltotriose. Hydrolysiert α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren teilweise Zersetzungsprodukte.

2) Substratspezifität

Hydrolysiert eine Verzweigungsstruktur mit einem Polymerisationsgrad, der nicht geringer ist als der Polymerisationsgrad von Maltose von Zuckern, die eine α-1,6-glucosidische Verzweigung aufweisen.

3) Arbeits-pH und Bereich des pH-Optimums

Der Arbeits-pH liegt im Bereich von 5 bis 11 mit dem pH-Optimum im Bereich von 9,5 bis 11.

4) pH-Stabilität

Ziemlich stabil im pH-Bereich von 8 bis 10 und weist sogar im pH-Bereich von 7 bis 10,5 eine relative Aktivität von nicht weniger als 50% auf (Behandlung: 45ºC, 10 Minuten).

5) Arbeitstemperatur und Temperaturoptimum

Wirkt in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einem Temperaturoptimum bei ungefähr 50ºC.

6) Thermische Stabilität

Ziemlich stabil bis zu 40ºC bei Behandlung für 30 Minuten in 10 mM Glycin-NaCl-NaOH-Puffer pH 9,5 behandelt wird.

7) Wirkung von Detergentien

Detergentien, wie lineare Alkylbenzolsulfonate, Natriumalkylsulfate, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natrium-α-olefinsulfonat, Natrium-α-sulfonierte Fettsäureester, Natriumalkylsulfonate, Natriumdodecylsulfat, Seifen und Softanol (Markenname), haben fast keine negative Wirkung auf die Aktivität.
Die alkalische Pullulanase A dieser Erfindung wird z. B. von Bacillus sp. KSM-AP 1876 (FERM BP-3049) produziert, der ein alkalophiler Mikroorganismus ist.
Die mykologischen Merkmale dieses Mikroorganismus werden im folgenden beschrieben. Die folgenden 21 Kulturmedien (Medien 1 bis 21) wurden für die Klassifizierung der Stämme verwendet. Sie alle enthalten 0,5 Gew.-% sterilisiertes Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;).

Zusammensetzungen der verwendeten Kulturmedien (in Gew.-%)

Medium 1: nutrient broth, 0,8; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 2: nutrient broth, 0,8
Medium 3: nutrient broth, 0,8; Gelatine 20,0; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 4: Bacto litmus-Milch, 10,5
Medium 5: nutrient broth, 0,8; KNO&sub3;, 0,1
Medium 6: Bactopepton, 0,7; NaCl, 0,5; Glucose, 0,5
Medium 7: SIM-Agar-Medium (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 8: TSI-Agar-Medium (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 9: Hefeextrakt, 0,5; Bactopepton, 1,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,02; lösliche Stärke 2,0; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 10: Kosers Medium (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 11: Christensens Medium (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 12: enthält die unten angegebenen Zusammensetzungen (1) und (2), denen Stickstoffquellen zugesetzt werden, die aus Natriumnitrat, Natriumnitrit, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat in Mengen von 0,25, 0,2025, 0,158 bzw. 0,195 Gew.-% bestehen.
(1) Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0
(2) Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,05; MnSO&sub4;·6H&sub2;O 0,01; FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,001; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
Medium 13: King-A-Medium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 14: King-B-Medium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge
Medium 15: Harnstoff-Medium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku Co.), angegebene Menge,
Medium 16: Cytochromoxidase-Testpapier (hergestellt von Nippon Pharmaceutical Co.)
Medium 17: 3% wässeriges Wasserstoffperoxid
Medium 18: Bactopepton 0,5; Hefeextrakt 0,5; K&sub2;HPO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
Medium 19: Bactopepton 2,7; NaCl 5,5; K&sub2;HPO&sub4; 0,3; Glucose 0,5; Bromthymol-Blau 0,06; Agar-Pulver (hergstellt von Wako Pure Chemical Co.) 1,5
Medium 20: (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; 0,1; KCl 0,02; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02; Hefeextrakt 0,05; Zucker 1,0
Medium 21: Casein 0,5; Hefeextrakt 0,5; Glucose 1,0; K&sub2;HPO&sub4; 0,1; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) 1,5

Mykologische Merkmale

a) Beobachtung unter dem Mikroskop

Die Zellen sind Stäbchen einer Größe von 1,0 bis 2,2 um · 2,2 bis 4,4 um mit einem elliptischen Endosporen (0,8 bis 1,0 um · 1,0 bis 1,8 um), der sich an ihren Subterminalien bildet. Sie haben Flagellen und sind beweglich. Die Gramfärbung ist unbestimmt. Die Säurebeständigkeit ist negativ.

b) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien

1) Agarplattenkultur (Medium 1)
Das Wachstum der Zellen ist gut. Kolonien haben eine runde Form mit glatter Oberfläche und glatter oder wellenförmiger Peripherie. Die Farbe der Kolonien ist milchig halbtransparent und glänzend.
2) Agar-Slant-Kultur (Medium 1)
Die Zellen können wachsen. Die Form der Kolonie ist cloth-spreading und die Farbe der Kolonie ist milchig semitransparent und glänzend.
3) Broth-Flüssigkultur (Medium 2)
Die Zellen können wachsen.
4) Stab-Kultur in Broth-Gelatine (Medium 3)
Das Wachstum der Zellen ist gut. Eine Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.
5) Lackmus-Milchmedium (Medium 4)
Es wird keine Koagulation und Peptonisierung der Milch beobachtet. Eine Lackmus- Entfärbung ist nicht bestimmbar, da das Medium alkalisch ist.

c) Physiologische Merkmale

1) Nitrat-Reduktion und -Denitrifizierung (Medium 5)
Die Nitrat-Reduktion ist positiv. Denitrifikation ist negativ.
2) MR-Test (Medium 6)
Nicht bestimmbar, da das Medium alkalisch ist.
3) VP-Test (Medium 6)
negativ.
4) Bildung von Indol (Medium 7)
negativ.
5) Produktion von Schwefelwasserstoff (Medium 8)
negativ.
6) Hydrolyse von Stärke (Medium 9)
positiv
7) Verwendung von Zitronensäure
negativ im Kosers-Medium (Medium 10) und im Christensens Medium (Medium 11) nicht bestimmbar.
8) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 12)
Nitrat, Ammoniumsalze und Nitrit werden alle verwertet.
9) Entfärbung (Medium 13, Medium 14)
negativ.
10) Urease (Medium 15)
negativ.
11) Oxidase (Meduim 16)
Nicht zwischen positiv und negativ unterscheidbar.
12) Katalase (Medium 17)
positiv.
13) Wachstumsbereich (Medium 18)
Wachstumstemperatur: 20 bis 40ºC
Optimale Wachstumstemperatur: 30 bis 35ºC
Wachstums-pH-Bereich: 7 bis 10,5
pH-Optimum des Wachstums: 10
14) Verhalten gegenüber Sauerstoff
aerob
15) O-F-Test (Medium 19)
Entfärbung ist unbestimmbar, weil das Medium alkalisch ist. Die Zellen können nur unter aeroben Bedingungen wachsen.
16) Zuckerverwertung (Medium 20)
L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, D-Sorbitol, D-Mannitol, Glycerin, Stärke, Salicin, D- Ribose und Dextrin werden verwertet.
17) Wachstum in einem Medium mit Natriumsalz (Modifizierung von Medium 1)
Die Zellen können in der Gegenwart von 5% NaCl, nicht jedoch in der Gegenwart von 7% Natriumchlorid wachsen.
18) Hydrolyse von Casein (Medium 21)
positiv.
Auf der Grundlage der obigen mykologischen Merkmale wurde der Stamm dieser Erfindung unter Bezugnahme auf Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 8. Ausg., und "The Genus Bacillus", Ruth, E. Gordon, Agriculture Handbook, 427, Agricultural Research Service, US-Department of Agriculture Washington D. C. (1973), untersucht und als ein Asporogenasstäbchenförmiger Mikroorganismus der Gattung Bacillus bestimmt. Der Stamm wuchs nicht im neutralen pH-Bereich, jedoch hauptsächlich im hochalkalischen Bereich. Daher wurde der Stamm dieser Erfindung als alkalophiler Mikroorganismus klassifiziert, wie von Horikoshi und Akiba demonstriert [Alkalophilic Microorganism, Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982]. Der Stamm dieser Erfindung unterscheidet sich daher von der Gruppe von Mikroorganismen der Gattung Bacillus, die im neutralen pH-Bereich wachsen.
Der Stamm dieser Erfindung unterscheidet sich mykologisch von jedem herkömmlichen "alkalophilen Bacillus". Demgemäß wurde der Stamm dieser Erfindung als neuer Stamm bestimmt und Bacillus Sp. KSM-AP 1876 genannt, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology als PERM BP-3049 hinterlegt wurde.
Die Produktion einer alkalischen Pullulanase A dieser Erfindung kann durch Inokulation des obigen Mikroorganismus nach herkömmlichen Kulturmethoden erreicht werden. Es ist wünschenswert, eine geeignete Menge Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zuzugeben, die der Mikroorganismus in dem Medium verwerten kann. Bezüglich der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bestehen keine Beschränkungen. Beispiele für organische Stickstoffquelien sind u. a. Maisglutenmehl (Schrot), Sojabohnenmehl, Maissaft (corn steep liquor), Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharma-Medien (pharma media), Fleischextrakt, Trypton, Soyton, Hypro, Ajipower, Sojabohnenschrot, Baumwollsamenschrot, Kultivator, Ajipron, Zitrusschalen. Zu den anorganischen Stickstoffquellen gehören u. a. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Natriumnitrat, Ammoniumacetat. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind u. a. lösliche Stärke, unlöslische Stärke, Amylopektin, Glykogen, Pullulan und verzweigte Oligomere, die durch dessen teilweise Zersetzung erhalten werden, Glucose, Maltose, Arabinose, Xylose, Ribose, Mannose, Fructose, Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, Mannitol, Sorbitol, Glycerin, verwertbare organische Säuren, wie Zitronensäure, Essigsäure und dergleichen. Zusätzlich zu den obigen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können dem Kulturmedium anorganische Ionen wie Phosphat, Magnesium, Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Natrium, Kalium und dergleichen, und andere organische und anorganische Substanzen für die Ernährung zugesetzt werden.
Die alkalische Pullulanase A kann nach herkömmlichen Methoden angereichert und gereinigt werden. Insbesondere können die Zellen aus der Kultur mittels herkömmlicher Fest-Flüssig- Trennmethoden wie Zentrifugation, Filtration oder dergleichen getrennt werden, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Die rohe Enzymlösung kann so verwendet werden, oder durch Trennmethoden wie Aussalzen, Ausfällen, Ultrafiltration und dergleichen kann rohes Enzym erhalten werden, das nach herkömmlichen Methoden weiter gereinigt und kristallisiert werden kann.
Eine bevorzugte Methode zur Reinigung der alkalischen Pullulanase A ist unten beschrieben. Stämme eines alkalischen Mikroorganismus der Gattung Bacillus KSM-AP1876 werden aerob in Schüttelkultur gezogen in einem Medium, das 1% Pullulan, 0,2% Trypton, 0,1% Hefeextrakt, 0,03% KH&sub2;PO&sub4;, 0,02% CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 0,1% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,001% FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,0001% MnCl&sub2;· 4H&sub2;O, 0,02% MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 0,5% Natriumcarbonat enthält, bei 30ºC für 3 Tage. Die Zellen werden aus der Kultur entfernt, um den Überstand zu erhalten. DEAE-Cellulosepulver wird zu dem Überstand gegeben, damit die Pullulanase A vollständig an DEAE-Cellulose adsorbiert. Nach dem Waschen des Harzes mit einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) wird das Enzym mit der gleichen Pufferlösung enthaltend 0,6 M NaCl eluiert.
Nach der Dialyse und Konzentration gegen eine 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) wird das Enzym auf DEAE-Cellulose DE52 adsorbiert, die mit der Pufferlösung equilibriert war. Das Enzym wird dann mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M NaCl der genannten Pufferlösung eluiert, um aktive Fraktionen zu sammeln. Nach der Konzentration mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran, deren Ausschluss-Molekulargewicht 10.000 ist, wird das Enzym gegen den Puffer, der 0,1 M NaCl enthält, über Nacht dialysiert. Das erhaltene Enzym ist konzentriert und dialysiert. Dann wird das Enzym auf eine Sephacryl-S-200-Säule (Markenname) geladen, die mit der Pufferlösung mit 0,1 M NaCl equilibriert war, und das Enzym wird mit der Pufferlösung, enthaltend 0,1 M NaCl, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und auf eine DEAE-Toyopearl 650 S-Säule (Markenname) geladen. Das adsorbierte Enzym wird mit einem Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 1 M NaCl in einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8) eluiert, und die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die gesammelten aktiven Fraktionen werden mit einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert, auf eine Butyl-Toyopearl-650 S-Säule (Markenname) geladen, die mit der Pufferlösung, enthaltend 2 M Ammoniumsulfat, equilibriert war. Die aktiven Fraktionen werden über einen Konzentrationsgradienten von 2 bis 0 M Ammoniumsulfat in einer 10 mM Tris-HCl- Pufferlösung (pH 8) eluiert und fraktioniert. Nach Aufkonzentrieren mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran werden die aktiven Fraktionen über Nacht dialysiert. So erhaltenes gereinigtes Enzym ergab eine einzige Bande bei der Elektrophorese mit einem Polyacrylamidgel (Gelkonzentration 15%) mit Natriumdodecylsulfat (SDS). Die aktive Ausbeute betrug 4%.
Die enzymologischen Merkmale der alkalischen Pullulanase A werden im folgenden beschrieben.
Die enzymatischen Aktivitäten wurden unter Verwendung der folgenden Pufferlösungen (je 10 mM) nach dem unten beschriebenen Verfahren bestimmt.
pH 4 bis 6: Acetat Puffer
pH 6 bis 8: Phosphatpuffer
pH 8 bis 11: Glycin-NaCl-NaOH-Puffer
pH 11 bis 12: KCl-NaOH-Puffer

Verfahren zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten (Pullulanase-Aktivitäten)

0,1 ml Enzymlösung wurden zu 0,9 ml einer Substratlösung gegeben, die aus einer Pufferlösung und Pullulan bestand (Endkonzentration in dem Reaktionssystem 0,25%), und die Mischung reagierte bei 40ºC 30 Minuten. Nach der Reaktion wurde reduzierender Zucker quantitativ mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS) bestimmt.
1,0 ml DNS-Reagenz wurde zu 1,0 ml der Reaktionsmischung gegeben, und die Mischung wurde zur Farbentwicklung 5 Minuten auf 100ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung durch Zugabe von 4,0 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Diese Lösung wurde kolorimetrisch quantitativ bei einer Wellenlänge von 535 nm untersucht. Eine Einheit (1 U) Enzymaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die 1 umol reduzierenden Zucker (wie Glucose) pro Minute freisetzt.

Enzymologische Merkmale

1) Wirkung

Zersetzt die α-1,6-glycosidischen Bindungen von Pullulan unter Bildung von Maltotriose. Hydrolysiert die α-1,6-glycosidischen Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren teilweise Zersetzungsprodukte.

2) Substratspezifität

Hydrolysiert eine verzweigte Struktur mit einem Polymerisationsgrad, der nicht geringer ist als der Polymerisationsgrad von Maltose von Zuckern, die eine Verzweigung an einer α-1,6- glycosidischen Bindung haben (Tabelle 1). Tabelle 1

3) Arbeitsbereich des pH und Bereich des pH-Optimums

Der Arbeits-pH liegt im Bereich von 5 bis 11 mit dem pH-Optimum im Bereich von 9,5 bis 11. Pullulanase-Aktivitäten bei verschiedenen pH Werten wurden unter Verwendung von Reaktionssystemen gemessen, die aus 0,25% Pullulan und einem der folgenden Puffer bestanden: 10 mM Acetatpuffer (pH 4 bis 6), Phosphatpuffer (pH 6 bis 8,5), Glycin-NaCl- NaOH-Puffer (pH 8,5 bis 11) und einem KCl-NaOH-Puffer (pH 11 bis 12). Jede Reaktion wurde bei 40ºC über 30 Minuten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

4) pH-Stabilität

Ziemlich stabil im pH-Bereich von 8 bis 10 und weist eine relative Aktivität von nicht weniger als 50% im pH-Bereich von 7 bis 10,5 auf.
Pullulanase-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden in Reaktionssystemen gemessen, das aus 0,25% Pullulan und einem der folgenden Puffer bestanden: 10 mM Acetatpuffer (pH 4 bis 6), Phosphatpuffer (pH 6 bis 8,5), Glycin-NaCl-NaOH-Puffer (pH 8,5 bis 11) und einem KCl-NaOH-Puffer (pH 11 bis 12). Jede Reaktion wurde bei 45ºC für 10 Minuten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

5) Arbeitstemperatur und Temperaturoptimum

Wirkt in einem weiten Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einem Temperaturoptimum von 50ºC (Fig. 3).

6) Thermische Stabilität

Die Temperatur, bei der das vorliegende Enzym seine Aktivität verliert, wurde bestimmt, indem es einer Hitzebehandlung bei verschiedenen Temperaturen bei pH 9,5, 30 Minuten lang ausgesetzt wurde. Es ergab sich, dass das Enzym bis zu 40ºC stabil war und auch bei 50ºC eine Restaktivität von nicht weniger als 50% aufwies (Fig. 4).

7) Molekulargewicht

Ungefähr 120.000 ± 5.000, bestimmt durch SDS-Elektrophorese (Gelkonzentration: 7,5%) (Fig. 6).

8) Wirkung von Metallionen

Die Pullulanase-Aktivität wurde von 1 mM Hg²&spplus;, Cd²&spplus; und Mn²&spplus; stark und von 1 mM von Pb²&spplus; leicht beeinträchtigt.

9) Wirkungen von Detergentien

Detergentien wie lineare Alkylbenzolsulfonate, Natriumalkylsulfate, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfate, Natrium-α-olefinsulfonate, Natrium-α-sulfonierte Fettsäureester, Natriumalkylsulfonate, Natriumdodecylsulfat, Seifen und Softanol (Markenname) beeinträchtigten das Enzym kaum, wenn es mit einer 0,05%igen Lösung jedes der Detergentien bei 40ºC 15 Minuten behandelt wurde.

10) Wirkungen komplexierender Mittel

Komplexbildner, wie EDTA (10 mM), EGTA (10 mM), Zitronensäure (0,05 Gew.-%) beinträchtigten die Pullulanase-Aktivität kaum.

11) Resistenz gegen Protease

Das Enzym zeigte starke Resistenz gegen jede alkalische Protease, wie API-21 (hergestellt von Showa Denko Co.), Maxatase (hergestellt von IBIS Co.), Sabinase (hergestellt von Novo Co.), Alkalase (von Novo Co.), Espelase (von Novo Co.) oder dergleichen bei Messung in deren Gegenwart (0,2 AU/I).
Die alkalische Pullulanase A wird allgemein in eine Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-% inkorporiert. Diese alkalische Pullulanase kann entweder in gereinigter Form oder als rohes Enzym als Kulturmedium selbst verwendet werden.
Andere konventionelle Detergenskomponenten können der Detergenszusammensetzung dieser Erfindung beigemischt werden je nach ihrer Verwendung und der Zweckbestimmung. Solche Komponenten sind im folgenden illustriert.
1) Die Menge des Detergens ist nicht beschränkt, beträgt jedoch vorzugsweise 0,5 bis 60 Gew.-%. Beispiele für Detergentien zur Verwendung in der Detergenszusammensetzung dieser Erfindung sind u. a. ionische Detergentien, wie Alkylbenzolsulfonat, Alkyl- oder Alkenylethersulfat, Alkyl- oder Alkenylsulfat, Olefinsulfonat, Alkansulfonat, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuresalze, Alkyl- oder Alkenylethercarbonsäuresalze, α-Sulfofettsäuresalze oder -ester, Detergentien vom Aminosäure-Typ, Detergentien vom N-Acylaminosäure-Typ, Alkyl- oder Alkenylsäurephosphat, Alkyl- oder Alkenylphosphat oder dessen Salz; amphotere Detergentien, wie Detergentien vom Carboxyl- oder Sulfobetain-Typ; nichtionische Detergentien, wie Polyoxyalkylenalkyl- oder -alkenylether, Polyoxyethylenalkylphenylether, höhere Fettsäurealkanolamide oder deren Alkylenoxid-Addukte, Sucrose-Fettsäureester, Fettsäure-Glycerinmonoester, Alkylaminoxid, Alkylglycosid; und kationische Detergentien, wie quaternäre Ammoniumsalze.
Wenn die Detergenszusammensetzung dieser Erfindung für das automatische Geschirrspülen verwendet wird, sind wenig oder nicht-schäumende nichtionische Detergentien bevorzugt. Beispiele für diese Art von Detergentien sind alkoxylierte nichtionische Detergentien (die Alkoxylgruppe wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenoxid, Propylenoxid und deren Mischungen). Beispiele sind "Plurafac LF 403" und "Plurafac LF 1300" (beides Markennamen von BASF Japan Co.), "Softanol EP 7045" (Markenname, hergestellt von Nippon Shokubai Kagaku Kogyo K. K.). Wenn die Detergenszusammensetzung für eine automatische Spülmaschine verwendet wird, werden vorzugsweise 0,5 bis 30 Gew.-% der Detergentien der Zusammensetzung beigefügt.
2) Alkalische Mittel wie Carbonat, Hydrogencarbonat, Silikat, Borat und Alkanolamin und anorganische Elektrolyte, wie Sulfat, werden der Zusammensetzung üblicherweise in einer Menge von 0 bis 90 Gew.-% beigefügt.
3) Die folgenden Stoffe werden üblicherweise der Zusammensetzung in einer Menge von 0 bis 50 Gew.-% beigefügt: Phosphate, wie Tri-polyphosphat, Pyrophosphat, Orthophosphat; Phosphonate, wie Ethan-1,1-diphosphonat; Phosphoncarboxylate, wie 2-Phosphonobutan- 1,2-dicarboxylat; Aminosäuresalze, wie Aspartat, Glutamat; Aminopolyacetate, wie Nitrilotriacetat, Ethylendiamintetracetat; polymere Komplexbildner, wie Polyacrylat, Polyaconitat; organische Säuresalze, wie Oxalat, Citrat; Fänger von divalenten Metallionen, wie Alumosilikate.
4) Bleichmittel, wie Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumhypochlorid, Dichlorisosialinsäure, werden üblicherweise der Zusammensetzung in einer Menge von 0 bis 85 Gew.-% beigemischt.
5) Andere Komponenten geringer Menge, die nach Bedarf beigemischt werden können, können sein: Antirekontaminationsmittel, wie Polyethylenglykol, Carboxymethylcellulose; Enzyme, wie Protease, Lipase, α-Amylase, Cellulase; Anti-Enzymquencher, wie Sulfit; Fluoreszenz-Farbstoffe; Bläuungsmittel; Färbemittel; Anti-Backmittel (anti-caking agents); Solubilisierungsmittel; Aktivierungsstoffe für Enzyme oder Bleichstoffe; Antikorrosionsmittel für Metalle.
Beispiele für Proteasen für die Verwendung in dieser Erfindung sind u. a. Subtilisine, die aus spezifischen Stämmen, wie Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis gewonnen werden können. Beispiele sind "Maxatase" (Markenname, Gist-Brocades), "Alkalase", "Esperase" und "Sabinase" (Markennamen, Novo Industry Co.).
Die α-Amylase zur Verwendung in dieser Erfindung kann z. B. aus Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis gewonnen werden. Kommerziell erhältliche Beispiele sind "Termamyl" (Markenname, Novo Industry Co.) und "Maxamyl" (Markenname, Gist-Brocades).
Wenn die Detergenszusammensetzung für eine automatische Spülmaschine verwendet wird, werden vorzugsweise anorganische alkalische Mittel als Füllstoffe verwendet. Solche anorganischen alkalischen Mittel sind u. a. Natriumpyrolat, Natriumorthophosphat, Natriumtripolyphosphat, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Natriumsesquicarbonat, Borax, Natriumsilikat und dergleichen. Da Natriumsilikat als Antikorrosionsmittel für Metalle wirkt, wird es vorzugsweise zusammen mit anderen alkalischen Mitteln verwendet. Am bevorzugtesten wird das Natriumsilikat (SiO&sub2;/Na&sub2;O = 1/1 bis 4/1, vorzugsweise 2/1 bis 2,5/1) (Konzentration: 2 bis 15 Gew.-%) und die anderen alkalischen Mittel (Konzentration: 35 bis 85 Gew.-%) zusammen verwendet. Die Menge der anorganischen alkalischen Stoffe werden kontrolliert, so dass der pH einer Detergenslösung (Konzentration: 0,05 bis 1 Gew.-%) in den Bereich von 9,0 bis 11,0 fällt. Wenn die Detergenszusammensetzung flüssig ist, ist der Füllstoff Wasser.
Fettsäuren, deren Kohlenwasserstoffkette eine Länge von 8 bis 18 aufweist, Benzotriazol und dergleichen werden der Detergenszusammensetzung für eine automatische Spülmaschine als Antikorrosionsmittel für Kupfer zugefügt.
Vor einiger Zeit wurden Umweltprobleme infolge phosphathaltiger Waschmittel ein kontroverses Thema. Dementsprechend ist es wichtig, dass die Detergentien keinen Phosphor enthalten und gleichzeitig eine gute Waschkraft gegen eine Vielzahl von Kontaminationen haben.
Wenn kein Phosphor verwendet wird, werden Hydroxycarbonsäuren mit mehreren Hydroxygruppen oder deren wasserlösliche Salze gemäß Formel (I) vorzugsweise als Fänger divalenter Metallionen verwendet.
wobei X für -H, -CH&sub3;, -CH&sub2;COOH oder -CH(OH)COOH und Y für -H oder -OH steht.
Unter diesen Verbindungen wird vorzugsweise Zitronensäure, Apfelsäure, Weinsäure oder deren wasserlösliche Salze verwendet. Als Salze können die Salze von Natrium, Kalium, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin und dergleichen verwendet werden. Diese Komponenten werden der Detergenszusammensetzung dieser Erfindung vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 30 Gew.-% zugefügt.
Ferner werden vorzugsweise polymere Komplexbildner in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% als Fänger von divalenten Metallen verwendet. Beispiele für polymere Komplexbildner sind unter anderen die in der japanischen offengelegten Patentanmeldung (Kokai) Nr. 145199/1982 oder Polymere der Acryl- oder Methacrylsäure, Acrylsäure-Methacrylsäure- Copolymere, deren wasserlösliche Salze und dergleichen. Ihr durchschnittliches Molekulargewicht beträgt 1.500 bis 100.000, vorzugsweise 3.000 bis 20.000.
Die Detergenszusammensetzungen dieser Erfindung werden vorzugsweise als Detergentien für Kleider, Geschirr, Haushalt und dergleichen in Form von Pulver, Granulat oder als Flüssigkeit verwendet, indem die oben genannten Komponenten nach herkömmlichen Methoden gemischt werden.
Weitere Merkmale der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele beschrieben.

BEISPIELE

Herstellungsbeispiel 1

Ein Löffel Erde (ungefähr 0,5 g) aus Yokohama-City, Kanagawa-Präfektur, Japan, wurde in sterilisierter Saline suspendiert, und die Mischung wurde bei 80ºC 15 Minuten hitzebehandelt. Der Überstand der hitzebehandelten Mischung wurde geeignet verdünnt, auf ein Agar-Medium (Medium A) zur Abtrennung aufgetragen und bei 30ºC 3 Tage kultiviert zum Wachstum von Kolonien. Kolonien, die infolge Pullulan-Auflösung in ihrer Peripherie transparente Zonen bildeten, wurden isoliert, um Stämme zu erhalten, die Pullulanase A produzieren. Diese Stämme wurden in das Flüssigmedium (Medium B) inokuliert und in Schüttelkultur bei 30ºC für 3 Tage kultiviert.
Nach der Kultur wurde das Kulturmedium zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Die Pullulanase-Aktivitäten wurden bei pH 10 gemessen, um Stämme auszusuchen, die alkalische Pullulanase A produzieren. Bacillus sp. KSM-AP 1876 (FERM BP-3049), ein Mikroorganismus, der alkalische Pullulanase A produzieren kann, wurde so erhalten.

Medium A

Pullulan 0,8%
Gefärbtes Pullulan 0,2
Polypepton 0,2
Hefeextrakt 0,1
KH&sub2;PO&sub4; 0,03
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,1
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,02
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,001
MnCl&sub2;·4H&sub2;O 0,0001
Agar 1,5
Na&sub2;CO&sub3; 0,5
pH 10,0

Medium B

Pullulan 1,0%
Trypton 0,2
Hefeextrakt 0,1
KH&sub2;PO&sub4; 0,03
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,1
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,02
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,001
MnCl&sub2;·4H&sub2;O 0,0001
Na&sub2;CO&sub3; 0,5
pH 10,0
2) Die Stämme von Bacillus sp. KSM-AP 1876, die alkalische Pullulanase A produzieren, wurden in das flüssige Medium B inokuliert und in Schüttelkultur bei 30ºC 3 Tage kultiviert. Nach der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, um eine rohe Pullulanase- Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde nach herkömmlicher Methode behandelt, um ein Ethanol-getrocknetes Pulver zu erhalten. Die rohen Enzym-Proben von Tabelle 5 wurden erhalten. Die enzymatischen Aktivitäten wurden bei pH 9 gemessen. Tabelle 5
3) Die rohe Enzymlösung von 2) wurde gemäß den folgenden Schritten 1 bis 5 behandelt.
1. DEAE-Cellulose-Adsorption
2. DEAE-Cellulose (hergestellt von Wattman Co.)-Chromatographie
3. Sephacryl (hergestellt von Pharmacia Co.)-Chromatographie
4. DEAE-Toyopearl (hergestellt von Toyo Soda Co.)-Chromatographie
5. Butyl-Toyopearl (hergestellt von Toyo Soda Co.)-Chromatographie
So wurde das rohe Enzym gereinigt, um eine alkalische Pullulanase A zu erhalten. Die erhaltene Pullulanase A wurde der Elektrophorese unterworfen nach der Methode von Davis [Davis D. J., Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404 (1964)] und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt, um zu bestätigen, dass sie eine einzige Bande ergab (Fig. 5).
4) Die alkalische Pullulanase A von 3) wurde der Natriumdodecylsulfat(SDS)-Elektrophorese nach einem herkömmlichen Verfahren unterworfen, um zu bestätigen, dass das Enzym ein Molekulargewicht von 120.000 ± 5.000 hat.

Beispiel 1

Detergens für automatische Spülmaschine

Die Waschbedingungen, die Detergens-Tests und die Ergebnisse waren wie folgt.

1) Waschbedingungen

Verwendete Waschmaschine: Automatische Spülmaschine (NP-600, hergestellt von Matsushita Electrical Industry Co.). Bei dieser Maschine wird eine Detergenslösung von einer rotierenden Düse gesprüht, und die Detergenslösung wäscht das Geschirr, das über den Düsenkarussel angeordnet ist.
Waschtemperatur: Die Temperatur wurde langsam von 5ºC auf 55ºC erhöht.
Waschwasser: Wasserhärte = 3,5º DH
Detergenskonzentration: 0,2%
Waschdauer: Waschen: 20 Minuten
Spülen: 20 Minuten
Menge des während dem Waschen zirkulierenden Wassers: 2,5 l

2) Bewertung der Waschkraft

Bewertungsmethode von mit Stärke kontaminiertem Geschirr

Kontaminiertes Geschirr

Reismehl und gekochte Reiskörner wurden gemischt (9 : 1) und mit einem Mixer nach Zugabe derselben Menge Leitungswasser gemischt. Dieser Schmutz (4 g) wurde einheitlich auf Porzellantellern mit einem Durchmesser von 22 cm gegeben und 1 Tag und 1 Nacht an der Luft getrocknet.
3 Teller wurden dem Detergens-Test unterworfen.

Bewertungsmethode der Detergenswirkung gegen Stärke-Beschmutzung

Verbliebene Stärke auf den Tellern wurde photographiert, um den Anteil der blauen Fläche (P1) infolge der Iod-Farbreaktion zu bestimmen. Dann wurde die Waschkraft aus P1 und der anfänglich kontaminierten Fläche (So) aus der folgenden Gleichung erhalten.
Waschkraft = [(So - P&sub1;)/So] · 100

3) Waschmittelzusammensetzung

Softanol EP 7045 2 Gew.-%
(hergestellt von Nippon Shokubai Kagaku Industry Co.)
Natriumcitrat 20
Nr. 1 Natriumsilikat 5
Enzym siehe Tabelle 7
Natriumcarbonat als Füllstoff
(Anm.) Die Werte für die Enzyme geben Aktivitäten in der Detergenszusammensetzung an.

4) Ergebnisse des Detergens-Tests

Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
(Anm.) Die alkalische Pullulanase A wurde in Herstellungsbeispiel 1 erhalten. Promozym ist eine von Novo Co. hergestellte Pullulanase. Termamyl 60 T ist eine von Novo Co. hergestellte α-Amylase.
Die Enzym-Aktivitäten von Tabelle 7 wurden wie folgt bestimmt. 0,1 ml Enzymlösung wurden zu 0,9 ml Substratlösung bestehend aus 10 mM Glycin-NaCl- NaOH-Pufferlösung (pH 9,0) und Pullulan (Endkonzentration in dem Reaktionssystem 0,25%) gegeben, um bei 40ºC 30 Minuten zu reagieren. Für Termamyl 60 T wurden 0,1 ml Enzymlösung zu 0,9 ml Substratlösung bestehend aus 10 mM Glycin-NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,0) und löslicher Stärke (Endkonzentration in dem Reaktionssytem 0,25%) gegeben, um bei 50ºC 15 Minuten zu reagieren. Nach der Reaktion wurde der reduzierende Zucker quantitativ bestimmt mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS). 1,0 ml des DNS-Reagenz wurde zu 1,0 ml Reaktionsmischung gegeben, und die Mischung wurde 5 Minuten auf 100ºC zur Farbentwicklung erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit 4,0 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Diese Lösung wurde kolorimetrisch quantitativ bei einer Wellenlänge von 535 nm untersucht. Eine Unit (1 U) Enzym-Aktivität ist als die Enzymmenge definiert, die pro Minuten 1 umol reduzierenden Zucker (als Glucose) freisetzt.

Beispiel 2

Detergens für Kleider

Die Waschbedingungen, die Detergens-Tests und die Ergebnisse waren wie folgt.

1) Künstlich beschmutzte Kleider (Testmaterial)

Reismehl und gekochte Reiskörner wurden im Verhältnis 9 : 1 gemischt und nach Zugabe derselben Menge Leitungswasser mit einem Mischer weiter gemischt. Die erhaltene Lösung wurde auf ein 10 cm · 10 cm-Baumwolltuch in einer Menge von 2,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Tuches, aufgetragen und bei 20ºC 24 Stunden getrocknet.

2) Waschbedingungen und Waschverfahren

Eine Detergenszusammensetzung wurde in hartem Wasser von 4º DH gelöst, um eine 0,665%ige Detergenslösung zu erhalten. Fünf Stücke künstlich beschmutzte Baumwolltücher wurden in die Detergenslösung getaucht. Nach 1-stündigem Stehen bei 40ºC wurden sie in eine rostfreie Trommel überführt, um bei 100 U/min. 20ºC, 10 Minuten mit einem Terg-O- Tometer zu waschen. Nach Spülen unter fließendem Wasser wurden die Tücher bei 20ºC 24 Stunden getrocknet, und der quantitativen Bewertung unterzogen.

3) Auswertung der Waschkraft

Die Gewichte der ursprünglichen Tücher und der kontaminierten Tücher vor und nach dem Waschen wurden gemessen. Die Waschkraft (%) wurde nach der folgenden Formel berechnet.
Die Werte zur Waschkraft in Tabelle 8 sind Durchschnittswerte von 5 Stücken.

4) Detergenszusammensetzung

Lineares Dodecylbenzolsulfonat-Natrium 15 Gew.-%
Natriumalkylethoxysulfat (C&sub1;&sub4;-C&sub1;&sub5;, = 3 mol) 5
4A-Typ Zeolith 15
Natriumsilikat 15
Natriumcarbonat 15
Natriumpolyacrylat (durchschnittl. Molekulargewicht = 8000) 1,5
Polyethylenglykol (durchschnittl. Molekulargewicht = 6000) 1,5
Enzyme Tabelle 8
Fluoreszenz-Farbstoff 0,5
Glauber-Salz Füllstoff
Wasser 5
(Anm.) Die Werte für die Enzyme sind Aktivitäten in der Detergenszusammensetzung.

5) Ergebnisse der Detergens-Tests

Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
Die Messungen der Enzym-Aktivitäten von Tabelle 8 wurden wie im Zusammenhang mit Tabelle 7 erklärt durchgeführt.

Beispiel 5

Waschmittelzusammensetzung für automatische Spülmaschine

Die folgende Detergenszusammensetzung wurde hergestellt.

Zusammensetzung

Softanol EP-70851) 4,5 Gew.-%
Trinatriumcitrat 20,0
Sokalan CP-5-Pulver2) 5,0
Lipase3) 1,0
Alkalische Pullulanase A4) 2504)
Natriumhydrogencarbonat 50,0
Natriumsulfat Füllstoff
(Anm.) 1) Softanol EP-7085: Additionsprodukt eines sekundären Alkohols mit 7 mol Ethylenoxid und 8,5 mol Propylenoxid, hergestellt von Nippon Shokubai Kagaku Kogyo K. K.
2) Sokalan CP-5-Pulver: Salz eines Copolymers aus Acrylsäure und Maleinsäureanhydrid, MW = ungefähr 70.000 (hergestellt von BASF)
3) Lipase AKG: hergestellt von Amano Seiyaku K. K.
4) Alkalische Pullulanase: hergestellt in Herstellungsbeispiel 1. Der angegebene Wert gibt die Aktivität (Unit/g Detergens) eines Gramms des Detergens an.
Die Detergenszusammensetzung von Beispiel 5 zeigte hervorragende Waschkraft nicht nur gegen Stärke-Beschmutzung, sondern auch gegen komplexe Beschmutzungen wie Stärke- Beschmutzung, Fette und Öle und Protein-Beschmutzungen.
Offensichtlich sind eine Vielzahl von Modifizierungen und Variationen dieser Erfindung im Rahmen der obigen Lehre möglich. Es versteht sich daher von selbst, dass diese Erfindung im Rahmen der Ansprüche auch anders ausgeführt werden kann als hier spezifisch beschrieben wurde.

Claims

1. Detergenszusammensetzung, die 0,1 bis 10 Gewichts-% einer alkalischen Pullulanase, die ein pH-Optimum im alkalischen Bereich hat und stabil gegenüber Tensiden ist, und 0,5 bis 60 Gewichts-% eines oder mehrerer Tenside enthält, wobei die alkalische Pullulanase enzymologisch wie folgt charakterisiert ist:

(i) Wirkung:

zersetzt α-1,6-glykosidische Bindungen von Pullulan unter Bildung von Maltotriose und hydrolysiert α-1,6-glykosidische Bindungen von Amylopektin, Stärke, Glycogen oder deren partielle Zersetzungsprodukte;

(ii) Substratspezifität:

hydrolysiert verzweigte Strukturen, die einen Polymerisationsgrad haben, der nicht geringer ist als der Polymerisationsgrad von Maltose, in Zuckern, die an einer α-1,6-glykosidischen Bindung verzweigt sind;

(iii) Arbeits-pH im Bereich von 5 bis 11 und pH-Optimum im Bereich von 9,5 bis 11;

(iv) pH-Stabilität:

gute Stabilität im pH-Bereich von 8 bis 10 und nicht weniger als 50% relativer Aktivität im pH-Bereich von 7 bis 10,5 (Behandlungsbedingungen: 45ºC, 10 Minuten);

(v) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur:

arbeitet im Temperaturbereich von 10 bis 60ºC und bei einer optimalen Temperatur von 50ºC;

(vi) Thermische Stabilität:

gute Stabilität bei bis zu 40ºC bei Behandlung in 10 mM Glycin-NaCl-NaOH Puffer (pH 9,5) während 30 Minuten;

(vii) Wirkung von Tensiden:

die Aktivität wird kaum von Tensiden wie linearen Alkylbenzolsulfonaten, Natriumalkylsulfat, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natrium-α-olefinsulfonat, Natriumsalzen α-sulfonierter Fettsäureester, Natriumalkylsulfonat, Natriumdodecylsulfat, Seifen und Softanol EPTM beeinträchtigt.

2. Detergenszusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die alkalische Pullulanase enzymologisch folgendermaßen charakterisiert ist:

(i) Wirkung:

(ii) Substratspezifität:

(iii) Arbeits-pH im Bereich von 5 bis 11 und pH-Optimum im Bereich von 9, 5 bis 11;

(iv) pH-Stabilität:

(v) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur:

(vi) Thermische Stabilität:

(vii) Molekulargewicht 120000 ± 5000 bestimmt durch Natriumdodecylsulfat (SDS) Elektrophorese;

(viii) Wirkung von Metallionen:

die Aktivität wird von Hg²&spplus;, Cd²&spplus;, Mn²&spplus;, Pb²&spplus; beeinträchtigt;

(ix) Wirkung von Tensiden:

die Aktivität wird kaum von Tensiden wie linearen Alkylbenzolsulfonaten, Natriumalkylsulfat, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natrium-α-olefinsulfonat, Natriumsalzen α-sulfonierter Fettsäureester, Natriumalkylsulfonat, Natriumdodecylsulfat, Seifen und Softanol EPTM beeinträchtigt;

(x) Wirkung von Komplexbildnern:

die Aktiviät wird von Komplexbildnern wie EDTA, EGTA, Citronensäure und Zeolithen kaum beeinträchtigt;

(xi) Resistenz gegenüber Proteasen:

starke Resistenz gegenüber alkalischer Protease.

3. Detergenszusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die alkalische Pullulanase aus einer Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus gereinigt wird.

4. Detergenszusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-AP 1876, hinterlegt als FERM BP-3049, ist.