DE69122103T2

DE69122103T2 - Antigerinnungspeptide

Info

Publication number: DE69122103T2
Application number: DE69122103T
Authority: DE
Inventors: John Krstenansky
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 1997-02-13
Anticipated expiration: 2011-06-29
Also published as: AU8221091A; NO930234D0; EP0540574A1; AU648096B2; WO1992001710A1; US5495000A; ATE142648T1; NO930234L; JPH05508850A; FI930265L; CA2086243A1; DK0540574T3; FI930265A7; EP0540574A4; FI930265A0; KR100195424B1; JP3111075B2; HU9300191D0; CA2086243C; GR3021660T3

Description

Diese Erfindung betrifft neue Peptide die als gerinnungshemmende Mittel und Thrombocytenaggregationshemmer nützlich sind.
Gerinnungshemmende Mittel sind nützliche therapeutische Mittel bei der pharmakologischen Behandlung von zum Beispiel akuter tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, akuter arterieller Embolie der Extremitäten, Myokardinfarkt und disseminierter intravaskulärer Koagulation. Man nimmt an, daß die prophylaktische Verabreichung von gerinnungshemmenden Mitteln ein Wiederauftreten der Embolie in Patienten mit einer rheumatischen oder arterioskierotischen Herzerkrankung verhindert und bestimmten thromboembolischen Komplikationen eines chirurgischen Eingriffs vorbeugt. Die Verabreichung von gerinnungshemmenden Mitteln wurde auch bei der Behandlung einer Erkrankung der Koronararterie und der Gehirngefäße angezeigt. Arterielle Thrombose, besonders in Arterien, die den Herzmuskel und das Gehirn versorgen, ist eine Haupttodesursache.
Hirullin P18 ist ein aus 61 Aminosäuren bestehendes, mit Hirudin verwandtes Protein mit einer wirksamen Antithrombinaktivität. Es enthält, ähnlich wie Hirudin, einen stark saueren C-Terminus, dessen Sequenz von jeder anderen bekannten Hirudinvariante signifikant verschieden ist.
Das C-terminale Fragment Acetyl-Hirullin-P18&sub4;&sub0;&submin;&sub6;&sub1; weist eine ähnliche Antithrombinwirksamkeit auf wie Acetyl-Desulfatohirudin&sub4;&sub5;&submin;&sub6;&sub5;. Während der Anmelder entdeckte, daß bestimmte Aminosäurereste der nativen Sequenz bei der Aufrechterhaltung der Antithrombinaktivität des Fragments entscheidend sind, wurde festgestellt, daß andere Reste weniger wichtig sind. Signifikante Unterschiede in den Sequenzen von Hirullin-P18&sub5;&sub4;&submin;&sub6;&sub1; und Hirudin&sub5;&sub9;&submin;&sub6;&sub5; legen eine unterschiedliche Form der Wechselwirkung mit Thrombin nahe. Nichtsdestoweniger scheint die durch Hirullin-P18&sub5;&sub0;&submin;&sub6;&sub1; dargestellte C-terminale funktionale Domane in Hinsicht auf dessen Bindung an Thrombin und dessen funktionale Rolle im Protein mit Hirudin&sub5;&sub5;&submin;&sub6;&sub5; vergleichbar zu sein.
Außerdem beschrieben mehrere Berichte die Fähigkeit des Oligopeptids Arg-Gly- Asp und der damit verwandten Peptide die Thrombocyten-abhängige Thrombusbildung zu hemmen. Cadroy Y. et al., J. Clin. Invest. 84 (1989), 939-944. Der Anmelder entdeckte. daß wenn dieses Oligopeptid an das Amino-terminale Ende der antithrombotischen Hirullinfragmente gebunden ist, die erhaltenen Peptidanaloge zusätzlich zur antithrombotischen Aktivität eine signifikante und nützliche thrombocytenaggregationshemmende Aktivität aufweisen. Diese neue Klasse von Verbindungen sollte wegen der doppelten Wirkungsweise eine nützliche Hilfstherapie bereitstellen.
Peptidderivate der Formel
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-A&sub1;&sub1;-A&sub1;&sub2;-Y,
worin X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, H&sub2;NC(=NH)- oder eine Succinylgruppe darstellt;
A&sub1; eine 5-Guanidopentanoyl-Gly-Gruppe,
oder eine Bindung bedeutet;
A&sub2; eine Bindung oder einen Rest der Formel
darstellt, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R&sub2;" ein Wasserstoffatom oder einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest bedeutet,
A&sub3; Phe, Tyr, Tyr(Me) oder Trp darstellt.
A&sub4; Glu oder Asp;
A&sub5; Glu oder Pro;
A&sub6; Phe oder Cha;
A&sub7; Pro oder Ser;
A&sub8; Leu;
A&sub9; Asp;
A&sub1;&sub0; Asp;
A&sub1;&sub1; Ile, Val oder Cha;
A&sub1;&sub2; eine Bindung, Glu, glu oder -Glu-Glu-;
Y eine OH- oder NH&sub2;-Gruppe bedeutet;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, sind als gerinnungshemmende Mittel nützlich.
Die folgenden üblichen Abkürzungen der Aminosäuren werden in dieser Beschreibung verwendet.
Gly - Glycin
Ala - Alanin
Val - Valin
Leu - Leucin
Ile - Isoleucin
Cha - Cyclohexylalanin
Orn - Omithin
Pro - Prolin
Phe - Phenylalanin
Trp - Tryptophan
Met - Methionin
Ser - Serin
Thr - Threonin
Cys - Cystein
Tyr - Tyrosin
Asn - Asparagin
Gln - Glutamin
Asp - Asparaginsäure
Glu - Glutaminsäure
Lys - Lysin
Hly - Homolysin
Arg - Arginin
Har - Homoarginin
His - Histidin
Nle - Norleucin
Hyp - Hydroxyprolin
Glt - Glutarylgruppe
Mal - Maleylgruppe
Npa - β-(2-Naphtyl)alanin
3,4-Dehydropro - 3,4-Dehydroprolin
Tyr(SO&sub3;H) - Tyrosinsulfat
Pgl - Phenylglycin
NMePgl - N-Methyl-phenylglycin
Sar - Sarcosin (N-Methylglycin)
pSubPhe - para-substituiertes Phenylalanin
SubPhe - ortho-, meta- oder para-, mono- oder disubstituiertes Phenylalanin
DAla - D-Alanin
Ac - Acetylgruppe
Suc - Succinylgruppe
pClPhe - para-Chlor-phenylalanin
pNO&sub2;Phe - para-Nitro-phenylalanin
Tyr(Me) - O-Methyltyrosin
Ein Alkylrest und der Alkylanteil eines Alkoxyrests umfassen geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylreste, zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl- und tert.-Butylgruppen.
Die natürlichen Aminosäuren enthalten mit Ausnahme von Glycin ein chirales Kohlenstoffatom. Wenn nicht anders angegeben, befinden sich die optisch aktiven Aminosäuren auf die hier verwiesen wird in der L-Konfiguration. Beispielsweise kann jede der Aminosäuren der A&sub1;- oder A&sub1;&sub2;-Gruppe in der D- oder L-Konfiguration vorliegen. Die Struktur der hier aufgeführten Peptide wird wie üblich angegeben so daß sich das Aminoterminale Ende auf der linken Seite der Kette und das Carboxy-terminale Ende auf der rechten Seite der Kette befindet. Es ist auch üblich, wenn der aus drei Buchstaben bestehende Code für die Aminosäuren verwendet wird, daß ein aus drei Buchstaben bestehender Code, der mit einem Großbuchstaben beginnt, die L-Konfiguration angibt, und daß ein aus drei Buchstaben bestehender Code, der mit einem Kleinbuchstaben beginnt, die D-Konfiguration anzeigt.
Die Polypeptide der Formel 1 können mit einer beliebigen nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säure pharmazeutisch verträgliche Salze bilden. Veranschaulichende anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und sauere Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Veranschaulichende organische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Solche Säuren werden zum Beispiel durch Essig-, Glykol-, Milch-, Brenztraubensäure-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Apfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoe- und Sulfonsauren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure, veranschaulicht. Salze der Carboxy-terminalen Aminosäureeinheit umfassen die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, die mit allen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Diese Salze umfassen veranschaulichend jene von Alkalimetallen, zum Beispiel Natrium und Kalium; Erdalkalimetallen, zum Beispiel Calcium und Magnesium; Leichtmetallen der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium; und organischen, primären, sekundären und tertiären Ammen, wie zum Beispiel Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydrodiethylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin.
Während alle Verbindungen der Formel 1 eine gerinnungshemmende Aktivität aufweisen, besitzen bestimmte Verbindungen der Formel 1 zusätzlich eine signifikante thrombocytenaggregationsheninnende Wirkung. Insbesondere jene Verbindungen der Formel 1, wobei A&sub2; keine Bindung darstellt und A&sub1; ein Dipeptidfragment der Formel 5 oder 6
bedeutet, wobei q und r jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 5 bedeuten oder A&sub1; ein Peptidfragment mit 3 bis 11 Resten darstellt, wobei das Carboxy-terminale Ende des Peptidfragments ein Dipeptid der Formel 5 oder 6 ist, sind Inhibitoren der Thrombocytenaggregation.
Wie bei jeder allgemeinen Gruppe von chemischen Verbindungen werden bestimmte Gruppen bevorzugt. Unter den Verbindungen der Formel 1, die keine signifikante thrombocytenaggregationshemmende Aktivität besitzen, bevorzugen die Anmelder jene Peptidderivate, wobei X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, H&sub2;NC(=NH)- oder eine Succinylgruppe darstellt.
Ebenfalls bevorzugt werden jene Verbindungen der Formel 1, in denen
oder eine Bindung darstellt;
A&sub2; vorzugsweise einen Rest der Formel
darstellt, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R&sub2;" ein Wasserstoffatom oder einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest bedeutet;
A&sub3; Phe, Tyr, Tyr(OCH&sub3;) oder Trp darstellt;
A&sub4; Glu oder Asp;
A&sub5; Glu oder Pro;
A&sub6; Phe oder Cha;
A&sub7; Ser oder Pro;
A&sub8; Leu;
A&sub9; Asp;
A&sub1;&sub0; Asp;
A&sub1;&sub1; Ile, Cha oder Val;
A&sub1;&sub2; eine Bindung, Glu, glu oder -Glu-Gln; und
Y eine OH- oder NH&sub2;-Gruppe bedeutet.
Besonders bevorzugt werden jene Peptidderivate der Formel 1, in denen entweder X eine Succinylgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine H&sub2;NC(=NH)-Gruppe darstellt und A&sub1; ein Dipeptidfragment bedeutet, das aus einer 5-Guanidopentanoyl-Gly-Gruppe oder -Arg-Gly-, -Har-Gly-, -Lys-Gly- und -Hly-Gly- ausgewahlt ist, sowie wobei
A&sub2; Asp darstellt;
A&sub3; Phe, Tyr, Tyr(Me) oder Trp;
A&sub4; Glu;
A&sub5; Glu oder Pro;
A&sub6; Phe oder Cha;
A&sub7; Ser;
A&sub8; Leu;
A&sub9; Asp;
A&sub1;&sub0; Asp;
A&sub1;&sub1; Ile oder Val;
A&sub1;&sub2; eine Bindung; und
Y eine OH- oder NH&sub2;-Gruppe bedeutet.
Unter jenen Verbindungen der Formel 1, die eine signifikante thrombocytenaggregationshemmende Aktivität aufweisen, bevorzugen die Anmelder jene Peptidderivate, in denen X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, H&sub2;NC(=NH)- oder eine Succinylgruppe darstellt.
Ebenfalls bevorzugt werden jene Verbindungen der Formel 1, in denen A&sub1; eine Bindung oder eine Verbindung der Formel 5 oder 6 darstellt,
A&sub2; vorzugsweise ein Rest der Formel
ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R"&sub2; ein Wasserstoffatom oder einen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkylrest bedeutet,
A&sub3; Phe, Tyr, Tyr(Me) oder Trp darstellt,
A&sub4; Glu oder Asp;
A&sub5; Glu oder Pro;
A&sub6; Phe oder Cha;
A&sub7; Ser;
A&sub8; Leu;
A&sub9; Asp;
A&sub1;&sub0; Asp;
A&sub1;&sub1; Ile, Cha oder Val;
A&sub1;&sub2; eine Bindung oder -Glu-Gln; und
Y eine OH- oder NH&sub2;-Gruppe bedeutet.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloge können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren umfassen die aufeinanderfolgende Festphasen-Synthese und die Festphasen-Blocksynthese die Genclonierung und Kombinationen dieser Verfahren. Das aufeinanderfolgende Festphasen-Verfahren kann unter Verwendung von etablierten automatischen Verfahren durchgeführt werden, wie durch die Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers. Bei diesem Verfahren wird eine α-Amino-geschützte Aminosäure an ein Trägerharz gebunden. Das verwendete Trägerharz kann jedes geeignete Harz sein, das üblicherweise auf dem Fachgebiet für die Festphasen- Herstellung von Polypeptiden verwendet wird, vorzugsweise Polystyrol, welches mit 0,5 bis etwa 3% Divinylbenzol vernetzt wurde, das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert wurde, um Stellen für die Esterbildung mit der zuerst eingeführten α-Amino-geschützten Aminosäure bereitzustellen.
Ein Beispiel eines Hydroxymethylharzes wird von Bodanszky et al. in Chem. Ind. (London) 38 (1966), 1597-1598, beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel erhältlich von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, und die Herstellung eines solchen Harzes wird von Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), Kapitel 1, 1-6, beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann durch das Verfahren von Gisin, Helv. Chem. Acta 56 (1973), 1476, an das Harz gebunden werden. Viele Harz-gebundene, geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel kann zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, worin das Carboxy-terminale Ende einen Thr-Rest darstellt, ein tert.-Butyloxycarbonyl-(Boc)-geschütztes Thr, gebunden an ein benzyliertes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethyl-Harz (PAM) verwendet werden, welches im Handel erhältlich ist.
Nach der Kupplung der α-Amino-geschützten Aminosäure an das Trägerharz wird die Schutzgruppe unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens entfernt, z.B. durch die Verwendung von Trifluoressigsaure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder von HCl in Dioxan. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur ausgeführt. Es können andere Standardspaltreagenzien und Bedingungen zur Entfernung von spezifischen α-Amino-Schutzgruppen verwendet werden. Nach der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die anderen Amino-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Aminosäuregruppen durch das Lösungsverfahren vor der Kupplung mit der Harz-getragenen Aminosäuresequenz gekuppelt werden.
Die bei einer jeden in die Polypeptidsequenz eingeführten Aminosäure verwendete α-Amino-Schutzgruppe kann eine beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Schutzgruppe sein. Unter den Klassen der α-Amino-Schutzgruppen werden berücksichtigt (1) Schutzgruppen vom Acyl-Typ, wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und α-Chlorbutyrylgruppen; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ, wie Benzyloxycarbonylgruppen und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, z.B. p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylearbonyl-, p-Bronnbenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenyl- yl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppen; (3) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppen; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethan-Typ, wie Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonylgruppen; (5) Schutzgruppen vom Thiourethan-Typ, wie Phenylthiocarbonylgruppen; (6) Schutzgruppen vom Alkyl-Typ, wie Triphenylmethyl- (Trityl-) und Benzylgruppen; und (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan. Die bevorzugte α-Amino-Schutzgruppe ist die tert.-Butyloxycarbonylgruppe.
Die Auswahl eines geeigneten Kupplungsreagenz ist dem Fachmann bekannt. Ein besonders geeignetes Kupplungsreagenz, wenn die hinzuzufügende Aminosäure Gln, Asn oder Arg ist, ist N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die Verwendung dieser Reagenzien beugt der Nitril- und Lactambildung vor. Andere Kupplungsreagenzien sind (1) Carbodiimide (z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid); (2) Cyanamide (z.B. N,N-Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) Isoxazohumsalze (z.B. N-Ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat); (5) monocyclische, ein Stickstoffatom enthaltende heterocyclische Amide mit aromatischem Charakter, die ein bis vier Stickstoffatome im Ring enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide; nützliche spezifische heterocyclische Amide umfassen N,N'-Carbonyldiimidazol und N,N- Carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxyliertes Acetylen (z.B. Ethoxyacetylen); (7) Reagenzien, die mit der Carboxyleinheit der Aminosäure ein gemischtes Anhydrid bilden (z.B. Ethylchiorformiat und Isobutylchlorformiat), oder das symmetrische Anhydrid der zu kuppelnden Aminosäure (z.B. Boc-Ala-O-Ala-Boc); und (8) ein Stickstoffatom enthaltende heterocyclische Verbindungen mit einer Hydroxygruppe an einem Stickstoffatom des Ringes (z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol). Ändere aktivierende Reagenzien und deren Anwendung bei der Peptidkupplung werden beschrieben von Kapoor, J. Pharm. Sci. 59 (1970), 1-27. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung des symmetrischen Anhydrids als Kupplungsreagenz für alle Aminosäuren mit Ausnahme von Arg, Asn und Gln.
Eine jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasen- Reaktor in einem etwa vierfachen Überschuß eingeführt und die Kupplung wird in einem Dimethylformamid:Methylenchlorid-Medium (1:1) oder in Dimethylformamid allein oder vorzugsweise in Methylenchlorid allein ausgeführt. In Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung auftritt, wird das Kupplungsverfahren vor der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe vor der Kupplung der nächsten Aminosäure im Festphasen-Reaktor wiederholt. Der Erfolg der Kupplungsreaktion in jedem Stadium der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion überwacht, wie von Kaiser E. et al. in Analyt. Biochem. 34 (1970), 595, beschrieben.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten wurde, wird das Peptid von dem Harz entfernt. Dies kann durch Hydrolyse bewirkt werden, z.B. durch die Behandlung des Harz-gebundenen Polypeptids mit einer Lösung von Dimethylsulfid, p-Cresol und Thiocresol in verdünnter wäßriger Fluorwasserstoffsäure
Wie auf dem Fachgebiet der Festphasen-Peptidsynthese bekannt ist, benotigen viele der Funktionalitäten tragenden Aminosäuren während der Kettenherstellung einen Schutz. Die Verwendung und Auswahl der geeigneten Schutzgruppe liegt im Ermessen des Fachmanns und hängt von der zu schützenden Aminosäure und der Gegenwart von anderen geschützten Aminosäureresten im Peptid ab. Die Auswahl einer solchen Seitenketten-Schutzgruppe ist kritisch, da es eine Gruppe sein muß, die während der Abspaltung der Schutzgruppe der α-Aminoeinheit nicht durch Spaltung entfernt wird. Beispielsweise sind geeignete Seitenketten-Schutzgruppen für Lysin Benzyloxycarbonylgruppen und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, wobei der Substituent aus Halogenatomen (z.B. Chlor, Brom, Fluor) und Nitrogruppen (z.B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl), Tosyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl- und Diisopropylmethoxycarbonylgruppen ausgewählt ist. Die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin kann mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.
Diese Gruppen können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren entfernt werden. Üblicherweise wird die Schutzgruppe entfernt, nachdem die Peptidkettensynthese beendet ist, jedoch können die Schutzgruppen zu jedem anderen geeigneten Zeitpunkt entfernt werden.
Die gerinnungshemmende und thrombocytenaggregationshemmende Dosis eines erfindungsgemäßen Peptidanalogen beträgt 0,2 mg/kg bis 250 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, abhängig vom Patient, der Schwere des zu behandelnden thrombotischen Zustandes und des gewählten Peptidanalogen. Die geeignete Dosis für einen einzelnen Patienten kann leicht bestimmt werden. Vorzugsweise werden 1 bis 4 Tagesdosen mit üblicherweise 5 mg bis 100 mg Wirkstoff pro Dosis verabreicht.
Die Antigerinnungstherapie ist zur Behandlung von und zur Vorbeugung vor einer Vielzahl von thrombotischen Zuständen angezeigt, besonders für eine Erkrankung der Koronararterie und der Gehirngefäße, sowie zur Behandlung von zum Beispiel des Koronarverschlusses durch Auflösen der bestehenden Gerinnsel. Die thrombocytenaggregationshemmende Therapie ist für die Vorbeugung vor dem erneuten Auftreten eines Herzinfarktes und eines Schlaganfalls angezeigt. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt ohne weiteres die Umstände der erforderlichen Antigerinnungstherapie und der thrombocytenaggregationshemmenden Therapie. Der hier verwendete Begriff "Patient" verweist auf Sänger, wie Primaten, umfassend Mensch, Schaf, Pferd, Vieh, Schwein, Hund, Katze, Ratte und Maus.
Obwohl einige der Peptidderivate den Durchgang durch den Darm nach der oralen Verabreichung überstehen, bevorzugen die Anmelder die nicht-orale Verabreichung, zum Beispiel subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal; die Verabreichung durch eine Depot-Injektion; durch ein Implantatpräparat; oder durch die Anwendung auf Schleimhäute, wie der Nase, der Kehle und der Bronchien, zum Beispiel in einem Aerosol, das ein erfindungsgemäßes Peptidderivat in einer Spray- oder Trockenpulverform enthalten kann.
Zur parenteralen Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosierungen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, der eine sterile Flüssigkeit darstellen kann, wie Wasser und Öle, mit oder ohne dem Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels und anderen pharmazeutisch verträglichen Adjuvantien. Veranschaulichende Öle, die in diesen Präparationen verwendet werden können, sind jene, die von Petroleum Tieren oder Pflanzen stammen oder synthetischen Ursprungs sind, zum Beispiel Erdnußöl, Sojabohnenöl und Mineralöl. Im allgemeinen sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glykole, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, bevorzugte flüssige Träger, besonders für injizierbare Lösungen.
Die Verbindungen können in Form einer Depot-Injektion oder eines Implantatpräparats verabreicht werden, die bzw. das in einer solchen Weise formuliert werden kann, daß eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs ermöglicht wird. Der Wirkstoff kann in Kügelchen oder kleine Zylinder komprimiert werden und subkutan oder intramuskulär als Depot-Injektionen oder -Implantate implantiert werden. Die Implantate können inerte Materialien verwenden, wie biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, zum Beispiel Silastic, ein von der Dow-Corning Corporation hergestellter Silikongummi.

Beispiele

Diese Erfindung wird durch die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Herstellung von Ser-Asn-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Das Peptid wurde durch Festphasen-Verfahren unter Verwendung von 0,1 mMol eines 0,66 mMol/g Boc-Gln-PAM-Harzes synthetisiert. Doppelte symmetrische Anhydrid- Kupplungen wurden mit 2,0 mMol Nα-Boc-Aminosäure (Peptides International) durchgeführt. Der verwendete Seitenkettenschutz war: Asp(CHx), Ser(Bzl), Glu(Bzl). Nach der Beendigung der Synthese wurde der Nα-Boc-Schutz mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Das Harz wurde dreimal mit Methylenchlorid gewaschen, durch drei Waschungen mit 10% Diisopropylenethylamin in Methylenchlorid neutralisiert, dreimal mit Methylenchlorid gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Von dem Peptid wurde die Schutzgruppe entfernt und es wurde von dem Harz mit 2% Anisol enthaltender HF bei 0ºC für 35 Minuten abgespalten. Die HF wurde unter vermindertem Druck bei 0ºC entfemt, das Peptid wurde mit Ethylether ausgefällt, aus dem Harz mit 30%iger wäßriger Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet.
Das Peptid wurde durch Entsalzen auf einer 92 x 2,6 cm großen Sephadex G-15- Säule in 5%iger wäßriger Essigsäure gereinigt und gefriergetrocknet. Eine präparative HPLC wurde auf einer C&sub1;&sub8;-Vydac-218TP1010-Säule (250 x 10 mm) mit 24% Acetonitril in 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäure bei 5 ml/min durchgeführt. Der Hauptpeak wurde gewonnen und gefriergetrocknet. Die Homogenität wurde durch HPLC und TLC bestimmt.
Die Peptide der Beispiele 2-8 wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise hergestellt.

Beispiel 2

Asp-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Beispiel 3

Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Beispiel 4

Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Beispiel 5

Suc-Phe-Glu-Pro-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Beispiel 6

Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Beispiel 7

Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Cha-Glu-Gln-OH

Beispiel 8

Arg-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH

Claims

1. Peptidanalog der Formel

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-A&sub1;&sub1;-A&sub1;&sub2;-Y

wobei X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl-, H&sub2;NC(= NH)- oder eine Succinylgruppe darstellt;

A&sub1; eine 5-Guanidopentanoyl-Gly-Gruppe,

oder eine Bindung bedeutet;

A&sub2; eine Bindung oder einen Rest der Formel

darstellt, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R&sub2;" ein Wasserstoffatom oder einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest bedeutet,

A&sub3; Phe, Tyr, Tyr(Me) oder Trp darstellt,

A&sub4; Glu oder Asp;

A&sub5; Glu oder Pro;

A&sub6; Phe oder Cha;

A&sub7; Pro oder Ser;

A&sub8; Leu;

A&sub9; Asp;

A&sub1;&sub0; Asp;

A&sub1;&sub1; Ile, Val oder Cha;

A&sub1;&sub2; eine Bindung, Glu, glu oder -Glu-Glu-;

Y eine OH- oder NH&sub2;-Gruppe bedeutet; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Ser-Asp-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

3. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Asp-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

4. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

5. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

6. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Suc-Phe-Glu-Pro-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

7. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln-OH.

8. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Suc-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Cha-Glu-Gln-OH.

9. Peptid nach Anspruch 1, umfassend Arg-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Phe-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Gln- OH.

10. Verfahren zur Herstellung des Peptidanalogs nach einem der Ansprtiche 1 bis 9, umfassend die Synthese des Peptidanalogs aus den entsprechenden Aminosäuren unter Verwendung der Festphasensequenz- oder Blocksynthese, Genclonierung oder einer Kombination dieser Techniken.