DE69122472T2

DE69122472T2 - Neurotropische wachstumsfaktoren, die ein homeobox-peptid enthalten

Info

Publication number: DE69122472T2
Application number: DE69122472T
Authority: DE
Inventors: Alain Joliot; Alain Prochiantz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1990-06-05
Filing date: 1991-06-05
Publication date: 1997-04-17
Anticipated expiration: 2011-06-06
Also published as: FR2662698A1; PT97877A; FR2662698B1; JPH05502885A; ATE143691T1; EP0485578B1; WO1991018981A3; EP0485578A1; BR9105783A; DE69122472D1; IE911914A1; WO1991018981A2; JP3282130B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Homöobox-Peptiden oder von davon abgeleiteten Peptiden zum Erhalt von Medikamenten.
Unter der Bezeichnung Homöobox-Peptide wird eine Familie von verwandten Peptidsequenzen verstanden, die man bei verschiedenen Tierarten in den Genprodukten, die an der Embryogenese beteiligt sind, findet. Man kennt in der Tat Gene, die in verschiedenen embryonalen Entwicklungsstadien exprimiert werden und deren Expression die zellulären Migrations- und Differenzierungsphänomene, die an der Morphogenese des Organismus beteiligt sind, kontrolliert.
Diese Gene werden als homöotische Gene bezeichnet und ihre Translationsprodukte werden als Homöoproteine bezeichnet.
Eines dieser Gene, das ganz besonders untersucht worden ist, ist das Antennapedia-Gen von Drosophila. Die Analyse dieses Gens erlaubte den Nachweis einer DNA-Sequenz von etwa 180 pb, die als Homöobox-Sequenz bezeichnet wurde.
Diese Homöobox-Sequenz besitzt die Besonderheit, daß sie in hohem Maße in zahlreichen homöotischen Genen konserviert ist, und dies nicht nur bei Drosophila, sondern in gleicher Weise im Verlauf der Evolution bei verschiedenen Tierarten. Homöobox-Sequenzen, die denen von Drosophila homolog sind, wurden so bei allen Vertebraten einschließlich Säugetiere [Acampora et al., Nucleic Acid Res., 17, 10385 (1989)] gefunden.
Die Homöobox-Sequenz codiert eine Polypeptidsequenz von 60 Aminosäuren, die einer strukturell und funktionell konservierten Region, die in allen Homöoproteinen vorhanden ist, der Homöodomäne entspricht. Die Sequenz der Homöodomäne codiert die Homöobox-Sequenz des Antennapedia-Gens und ist nachstehend beispielhaft angegeben. (I)
Die Rolle und der Wirkmechanismus der Homöodomänen-Sequenz waren Gegenstand verschiedener Forschungen. Man weiß so gegenwärtig, daß diese Sequenz die Bindung der Homöoproteine an die DNA im Bereich der Konsensussequenzen einschließlich des ATTA-Motivs, die in den Promotoren oder Amplifikationssequenzen verschiedener Gene, einschließlich die Homöoboxgene als solche, vorhanden sind, erlaubt.
Müller et al. [EMBO J., 7, 4299 (1988)] clonierten die Homöobox-Sequenz von Antennapedia und reinigten das entsprechende Polypeptid oder Homöobox-Peptid (pAntp). In Gegenwart eines Reduktionsmittels erhielten sie das Polypeptid in Form eines Monomeren mit einem Sedimentationskoeffizienten von etwa 1 Sr und einem offensichtlichen Molekulargewicht von 9040 Da (theoretisches Molekulargewicht gemäß der Peptidsequenz = 8545 Da).
In Abwesenheit eines Reduktionsmittels enthält das Polypeptidpräparat einen beträchtlichen Teil an Dimeren, entsprechend den Homöodomänen, die untereinander durch Disulfidbrücken verknüpft sind.
Die gleichen Autoren haben auch gezeigt, daß das gereinigte Polypeptid in monomerer Form an die DNA an eine ANNNNCATTA- Sequenz bindet, die also die Konsensussequenz ATTA enthält.
Angesichts des sehr hohen Konservierungsgrads der Homöobox- Sequenzen von einer Art zur anderen wird in Betracht gezogen, daß die Eigenschaften des Peptids pAntp auf andere Homöobox-Peptide generalisiert werden können, die in ihrer Sequenz sich durch einige Aminosäuren unterscheiden können, aber die mit quasi identischen funktionellen Eigenschaften versehen sind. In den nachstehenden Ausführungen soll der Ausdruck "Homöobox-Peptid" ohne Unterscheidung sowohl das pAntp-Peptid als auch jedes andere Mitglied der Familie oder einer nahen Familie, beispielsweise der Familie "engrailed" bezeichnen.
Andere Arbeiten [Otting et al., Embo J., 2, 4305 (1988)] haben festgestellt, daß die Homöodomäne eine spezielle Struktur (Helix/β-Turn/Helix) besitzt, die an der Bindung an die DNA beteiligt ist. Die Bindung Homöobox-Peptid/DNA ist das Ergebnis:
- einer hochaffinen Bindung (KD 10&supmin;&sup9;-10-10M), an der die Konsensussequenz ATTA beteiligt ist, und
- einer Bindung mit geringer Affinität (KD 10&supmin;&sup6;-10-7M), an der die große Rinne der großen DNA-Doppelhelix beteiligt ist. Eine Publikation von Kissinger et al. [Cell, 63, 579-590 (1990)] beschreibt eine kristallographisch durchgeführte Untersuchung über einen Komplex "Homöodomäne engrailed/DNA". Diese Untersuchung zeigt, daß der C-terminale Teil der Homöodomäne, umfassend insbesondere die als Helix 3 bezeichnete Struktur (Aminosäuren 42-58 der Homöodomäne engrailed), sich an die große Rinne der DNA bindet. Die Bindung wird im wesentlichen durch hydrophile Wechselwirkungen gewährleistet. Diese Bindung ist unabhängig von der Anwesenheit der Konsensussequenz.
Obwohl man mittlerweile zahlreiche Daten über die Bindung Homöobox-Peptide/DNA besitzt, die in vitro und am azellulären System erhalten wurden, weiß man bis heute nicht, welche Folgen sich für die zellulären Funktionen ergeben. Man weiß nicht einmal, ob die Homöobox-Peptide eine eigene Aktivität besitzen können oder ob sich ihre Rolle einfach auf die Bereitstellung der Bindung Homöoprotein/DNA beschränkt.
Bei der Untersuchung der Wirkung von synthetischen Homöobox- Peptiden an Zellkulturen haben die Erfinder überraschende Eigenschaften dieser Peptide entdeckt, Eigenschaften, die bisher niemals vermutet wurden. Sie haben in der Tat festgestellt, daß die synthetischen Homöobox-Peptide, wenn sie in Kultur befindlichen Nervenzellen zugesetzt werden, in alle Zellen der Kultur eindringen und daß der Eintritt der Peptide in die Neuronen von einer Anhäufung in dem Zellkern gefolgt ist. Diese Anhäufung wird nicht nur durch Vorinkubation mit einem Oligonucleotid, das die Konsensussequenz ATTA enthält, sondern auch durch Vorinkubation mit doppelsträngigen, nicht-spezifischen DNA-Fragmenten (d.h. solchen, die die Konsensussequenz nicht enthalten) blockiert. Die Erfinder haben bei der Untersuchung des Eindringungsprozesses die Bedeutung der Region entsprechend der Helix 3 + 4 (die 27 letzten Aminosäuren des Homöobox-Peptids) dabei gezeigt.
Sie haben auch das Eindringen der Polypeptide, die dieses Homöobox-Peptid umfassen, beobachtet. Sie haben dieses Phänomen, wenn auch in einem geringeren Ausmaß, auch an anderen Zellkulturen als Nervenzellen beobachtet.
Die Erfinder haben weiterhin gezeigt, daß die Anhäufung von Homöobox-Peptiden in dem Zellkern von einem intensiven Wachstum und einer intensiven Differenzierung der Zelle begleitet ist.
Diese Eigenschaften der Homöobox-Peptide, die von den Erfindern gezeigt wurden, erlauben ihre Verwendung zum Erhalt von neuen Medikamenten sowie ihre in-vitro-Verwendung als Wirkstoff an Zellkulturen. In der Tat, aus den Arbeiten der Erfinder geht hervor, daß die Homöobox-Peptide oder Fragmente davon sogar neue Wachstumsfaktoren, insbesondere Neurotrope, und/oder neue Vektoren für den Transport durch die Membran und in die Zellen von aktiven Molekülen mit Zellfunktionen, insbesondere von Peptiden und Oligonucleotiden, liefern können.
Jede dieser Anwendungen entspricht tatsächlichen Bedürfnissen. Sie sind der Gegenstand verschiedener Arbeiten, die nachstehend kurz zusammengefaßt sind.
- Das Interesse an bzw. die Bedeutung der intrazellulären Transportvektoren für Peptide oder Oligonucleotide ergibt sich folglich aus dem Nachweis, daß bestimmte Peptide und Oligonucleotide dadurch, daß sie sich spezifisch an bestimmte DNA-Regionen binden, auf die Zellfunktionen einwirken können (beispielsweise Proteine, die die Expression eines Gens aktivieren oder reprimieren, Anti-Sens-Oligonucleotide, etc.).
Jedenfalls bedingt eine effektive Erforschung der Eigenschaften dieser Moleküle, insbesondere mit therapeutischer Zielrichtung, daß man sie an die Basis gelangen läßt, indem man sie zahlreiche Barrieren überschreiten läßt, die das extrazelluläre Medium von der DNA trennen, und insbesondere die Zytoplasmamembran. Sehr oft können diese Moleküle wegen ihrer Ladung und ihres erhöhten Molekulargewichts als solche diese Barriere nicht durchdringen. Verschiedene Lösungen für dieses Problem wurden vorgeschlagen. Einige davon betreffen Oligonucleotid-Sequenzen und sind beispielsweise in der Einleitung der Publikation von Lemaitre et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652 (1987)] zitiert. Diese Autoren schlagen ihrerseits eine Variante vor, die darin besteht, daß man kovalent eine einer RNA-Sequenz des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) komplementäre Oligonucleotid-Sequenz an ein L-Lysin-Polymeres bindet. Das so erhaltene Konjugat dringt in die Zellen ein und hemmt spezifisch die Synthese der VSV-Proteine in infizierten Zellen.
Diese Ergebnisse zeigen das Interesse der Assoziation eines aktiven Makromoleküls mit einem Transportvektor für dieses Makromolekül. Es ist somit besonders wünschenswert, neue Vektoren zu suchen.
- Was die aktiven Wachstumsfaktoren für das Überleben und die Differenzierung der Neuronen betrifft, kennt man gegenwärtig nur eine kleine Anzahl. Der erste, der nachgewiesen wurde, ist der Nervenwachstumsfaktor (NGF). Die Wirkung von NGF vollzieht sich im wesentlichen auf die sensorischen Neuronen und die Neuronen des sympathischen Nervensystems. Eine Wirkung auf bestimmte Zellen des zentralen Nervensystems und des Immunsystems wurde ebenfalls nachgewiesen. Die neurotrope Aktivität von NGF ist auf einer Untereinheit (Untereinheit β) aus 118 Aminosäuren lokalisiert.
Andere Substanzen mit neurotroper Wirkung wurden ebenfalls beschrieben. Dies sind beispielsweise der neurotrope Ciliarfaktor (CNTF) [Lin et al., Science, 246, 1023-1026 (1989); Stockli et al. Nature, 342, 920-923 (1989)], der neurotrope Gehirnfaktor (BDNF) [Leibrock et al., Nature, 341, 149-152 (1989)] , das von den Gliazellen abgeleitete Nexin (GDN), Bestandteil der extrazellulären Matrix [Gloor et al., Cell, 47, 687-693 (1986)].
Die häufiger vorkommenden Wachstumsfaktoren, wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) [Park et Hollenberg, Dev. Biol., 134, 201-205 (1989)] oder der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) [Morrison et al., Science, 238, 72-74 (1987)], besitzen auch eine neurotrope Wirkung.
Der Wirkmechanismus dieser Faktoren ist in der Tat schlecht bekannt. Es wurde gezeigt, daß der NGF in die Neuronen über einen spezifischen Rezeptor, der ein phosphoryliertes Glykoprotein [Chao et al., Science, 232, 518 (1986)] ist, eindringt. Im Inneren der Nervenzelle stimuliert der NGF die RNA-Synthese über einen Second Messenger. Zahlreiche Versuche zeigen das potentielle therapeutische Interesse an neurotropen Wachstumsfaktoren.
Die Verwendung von NGF wurde beispielsweise für die Alzheimer-Krankheit vorgeschlagen. Es wurde in der Tat gezeigt, daß NGF die Aktivität der Cholinacetyltransferase der cholinergen Neuronen erhöhen kann und ihr Degenerieren verhindern kann [Mobley et al., Science, 229, 284 (1984)], [Kromer, Science, 225, 214 (1987)]. Es ist auch bekannt, daß die Alzheimer-Krankheit mit einer Degeneration der cholinergen Neuronen und einer Verminderung der Aktivität der Cholinacetyltransferase verbunden ist.
Versuche, die an adulten Ratten durchgeführt wurden, bei denen der cholinerge Weg, der den Hippocampus und das Septum verbindet, zuvor zerstört worden war (was mit einer Degeneration der Septumneuronen verbunden ist), zeigten, daß die intraventrikuläre Injektion von NGF das Überleben von Septumneuronen sowie die Wiederherstellung einer normalen Cholinacetyltransferaseaktivität erlaubt [Will et Hefti, Behav. Brain Res., 17, 17 (1985)]. Die Verwendung von neurotropen Wachstumsfaktoren wurde auch im Falle der Parkinson-Erkrankung, die mit einer Degeneration der dopaminergen Neuronen verbunden ist, in Betracht gezogen.
Eine weitere Behandlungsvariante von mit einer neuronalen Degeneration assoziierten Krankheiten wurde jüngst vorgeschlagen und scheint in naher Zukunft eine bedeutende Entwicklung zu versprechen. Es handelt sich um intrazerebrale Zelltransplantationen, die defekte neuronale Funktionen wieder bereitstellen können. Die Verwendung von fötalen Neuronen [Lindvall et al., Science, 241, 574-577 (1990)] oder von transformierten Zellinien [Horellou et al., Eur. J. Neurosci., 2, 116-119 (1990)] wurde dafür vorgeschlagen.
Jüngst wurden transformierte Zellen, die rekombinanten NGF produzieren, in das Gehirn von Ratten gleichzeitig mit cholinergen Neuronen fötalen Ursprungs implantiert. Es wurde festgestellt, daß unter diesen Bedingungen das Überleben des Neuronentransplantats sowie die Neogenese von Nervenfasern beachtlich erhöht waren [Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4756 (1989)].
Diese Arbeiten zeigen somit, daß die neurotropen Wachstumsfaktoren besonders wichtige Anwendungen bei der Behandlung von Störungen als Folge von Läsionen oder Degeneration von Neuronen finden können.
Eine Beschränkung auf die Verwendung von neurotropen Wachstumsfaktoren ist jedoch durch die geringe Anzahl gegenwärtig bekannter Wachstumsfaktoren sowie durch ihre relativ enge Wirkspezifität, die auf bestimmte Typen von Neuronen beschränkt ist, gegeben. Außerdem können die meisten dieser Wachstumsfaktoren gegenwärtig nicht in ausreichender Menge für eine therapeutische Verwendung erhalten werden.
Es wäre somit besonders wünschenswert, neurotrope Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu haben, die nicht die vorstehend genannten Nachteile zeigen.
Die vorliegende Erfindung schlägt durch Nachweis der überraschenden Eigenschaften der Homöobox-Peptide eine neue Antwort auf beide vorstehend dargelegten Probleme vor. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Homöobox-Peptiden und Peptiden, die der Helix 3 davon entsprechende Sequenz umfaßt, zur Verwendung als Medikament. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter Homöobox-Peptid jedes Peptid, das der vorstehend definierten Familie angehört, und insbesondere jede Aminosäuresequenz, die mit dem pAntp-Peptid von Drosophila eine Homologie besitzt, die die Bindung dieses Peptids an eine DNA-Doppelhelix erlaubt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Homöobox-Peptid das pAntp-Peptid. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Homöobox-Peptid oder dessen Fragment, wie vorstehend definiert, an eine andere Peptidsequenz gebunden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Homöobox-Peptid oder dessen Fragment an eine Nucleotidsequenz gebunden.
Die Homöobox-Peptide oder Fragmente davon sowie ihre Fusionsprodukte mit einer anderen Polypeptidsequenz können leicht nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Peptidsynthese oder auch gentechnisch. Die Fusionsprodukte aus einem Homöobox-Peptid und einer Oligonucleotid-Sequenz können beispielsweise durch die von Lemaitre et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 648-652 (1987)] beschriebene Technik erhalten werden.
Die Eigenschaften der Homöobox-Peptide und ihrer Fragmente, in die Zelle eindringen zu können, erlauben ihre Verwendung zur Einschleusung von auf die Zeilfunktion einwirkenden Molekülen in die Zellen, insbesondere von anderen Peptiden oder Nucleotidsequenzen mit pharmakologischen Eigenschaften.
Man kann ein Homöobox-Peptid oder ein Fragment eines Homöobox-Peptids, das die Helix 3 enthält, das unabhängig von der Sequenz die Struktur des DNA-Moleküls (große Furche) erkennt, verwenden. Die Bindung an eine spezifische DNA oder RNA-Sequenz wird somit durch das Peptid oder Oligonucleotid, das an das Homöobox-Peptid oder das Fragment des Homöobox- Peptids gebunden ist, gewährleistet.
Erfindungsgemäß können die Polypeptide, die ein Homöobox- Peptid oder ein Fragment davon umfassen, auch als Wachstumsfaktoren, insbesondere als neurotrope Wachstumsfaktoren, sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden.
Im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten neurotropen Wachstumsfaktoren wirken die Homöobox-Peptide auf eine große Anzahl von Neuronentypen. Die Erfinder haben insbesondere die Aktivität von pAntp auf Nervenzellen, die aus verschiedenen Regionen des embryonalen Zentralnervensystems präpariert wurden, insbesondere das Rückenmark, das Rautenhirn, das zentrale Mittelhirn, das Tectum und den Cortex, beobachtet. Die Aktivität auf die corticalen Zellen ist besonders überraschend, da bis zu diesem Tag keine Homöoproteinexpression in diese Gehirnregion beobachtet wurde.
Das große Wirkspektrum der Homöobox-Peptide verleiht diesen pharmakologischen Medien ein großes Interesse, insbesondere bei der Behandlung von Lasionen oder Degenerationen von Neuronen. Sie können auch auf dem Gebiet der intrazerebralen Neuronentransplantate verwendet werden, die sich entwickeln werden und für die das Überleben sowie die möglichst rasche Entwicklung und das größtmögliche Volumen des zellulären Transplantats unverzichtbar sind. Dies kann beispielsweise durch Vorinkubieren der zu transplantierenden Neuronen mit einem erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor oder auch durch Durchführen eines gemeinsamen Transplantats von embryonalen Zellen mit transformierten Zellen, die die Homöobox-Peptide synthetisieren und sezernieren können, oder mit Fusionspeptiden, die eine Homöobox-Sequenz enthalten, durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur in-vitro-Behandlung von zu transplantierenden Neuronen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Neuronen in Gegenwart mindestens eines Homöobox-Peptids, ggf. in Bindung an eine andere Peptid- oder Oligonucleotidsequenz, inkubiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine zelluläre Zusammensetzung, die bei den Transplantationstechniken von Neuronen verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Assoziation von Neuronen, die transplantiert werden sollen, und transformierten Zellen mit der Eignung, ein Homöobox-Peptid zu synthetisieren und zu sezernieren, enthält.
Die Erfinder haben auch die Wirkung der Homöobox-Peptide nicht nur in Zellkultur, sondern auch an vielzähligen Organismen untersucht. Sie haben auch festgestellt daß dank der raschen Durchdringung der Homöobox-Peptide diese lokal in die der Injektionsstelle benachbarten Zellen eindrangen. Diese Eigenschaft bietet den Vorteil, daß bei der Verwendung an einem lebenden Organismus eine sehr präzise lokalisierte Behandlung an einer Zellgruppe, sofern gewünscht, durchgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beschreibungsergänzung, die sich auf Beispiele, die die Aktivität der Homöobox-Peptide zeigen, bezieht, besser verstanden. Es versteht sich jedoch von selbst, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.

I) ERHALT VON ERFINDUNGSGEMÄSSEN WACHSTUMSFAKTOREN

BEISPIEL 1: Erhalt eines pAntp-Peptids

Die Sequenz, die die Homöodomäne des Antennapedia-Gens von Drosophila codiert, wurde unter Verwendung der PCR-Technik aus dem Plasmid p903G synthetisiert, das zwischen seinen BamH1- und PVUII-Spaltstellen ein 600bp-Fragment cDNA von Antp (Garber et al., 1983) enthält. Die zwei Startersequenzen, deren Sequenz nachstehend angegeben ist, wurden verwendet. Die erste Startersequenz
enthält eine NdeI-Restriktionsspaltstelle stromaufwärts des Startcodons, und die zweite Startersequenz
enthält ein Stopcodon, gefolgt von einer BamH1-Spaltstelle. Ein Plasmid mit der Bezeichnung pAH1 wurde durch Ligierung des NdeI-BamH1-Fragments zu 220 bp erhalten durch PCR, an das Plasmid pET3a (Rosenberg et al., 1987) gebildet. Das Polypeptid wurde anschließend in E. coli BL 21 (Lys S) exprimiert. Die transformierten Zellen wurden bei 37ºC in einem LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin und Chloramphenicol (jeweils 100 µg) bis zu einer optischen Dichte OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,2 gezüchtet. Nach einer fünfstündigen Induktion in Gegenwart von 1 mM IPTG wurden die Zellen durch Zentrifugation (16.000 g, 15 min) gewonnen, dreimal mit einem 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT (Puffer A) gewaschen und dann beschallt.
Nach der Zentrifugation (16.000 g, 15 min) wurde der Überstand mit Streptomycinsulfat (20 mg/ml) unter sanftem 15minütigem Rühren bei Raumtemperatur präzipitiert, anschließend zentrifugiert (16.000 g, 15 min). Der Überstand wurde direkt auf eine S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) Säule, die zuvor mit dem Puffer A äquilibriert worden war, gegeben. Die Säule wurde anschließend mit einer großen Menge 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M NaCl gewaschen und das Peptid pAntp wurde durch Anlegen eines NaCl-Gradienten (0,5 bis 1 M) eluiert. Das eluierte Peptid (3 mg/l Kultur) wurde anschließend 24 Stunden lang gegen 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert.
Die Sequenzen des amplifizierten DNA-Segments und des Peptids wurden bestimmt (Applied Biosystem 477), und es wurde festgestellt, daß sie denjenigen der Homöobox von Antennapedia entsprachen. Die Analyse des Peptids durch Gelelektrophorese in Gegenwart von SDS zeigte die Anwesenheit einer einzigen Bande mit einem dem Homöopeptid von Antennapedia entsprechenden Molekulargewicht. Die Sequenz des erhaltenen Peptids lautet wie folgt: (I)
Es wurde weiterhin durch Verzögerung auf dem Gel des mit einer Oligonucleotid-Duplex, die der Bindungsstelle eines Homöoboxproteins vom Typ Antennapedia entsprach, und aus dem Promotor Hox1.3 [Hox1.3p, (Odenwald et al., GENES AND DM., 3, 158, 1989)] erhalten worden war,
bestätigt, daß das Peptid in vitro die Konsensussequenz für die Bindung von Proteinen vom Typ Antennapedia erkannte.

II) NACHWEIS DER AKTIVITÄT DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN WACHSTUMS FAKTOREN

Beispiel 2: Nachweis der biologischen Wirkung des Peptids pAntp auf Neuronen in Kultur

Die verschiedenen Gehirnregionen entnommenen Neuronen (Mittelhirn, Wirbelsäule, Cortex) von Rattenembryonen (E14 bis E16) wurden in einem definierten Medium in Kultur gegeben (Chamak und Prochiantz, Development, 106, 483, 1989), das das ausschließliche Überleben der neuronalen Zellen erlaubte (CDM-Medium).
Das Peptid pAntp wurde durch eine zehnminütige Inkubation bei 60ºC in Gegenwart von Dithiothreit (0,1 mM) und Magnesium (10 mM) in einem isotonen Phosphatpuffer, pH 7,2, der 33 mM D-Glucose enthielt, renaturiert. Das Peptid wurde den Nervenzellen in einer Konzentration von 9 µg/ml (entspricht 1,3 µM) zugesetzt.
Die nach der Zugabe des Peptids beobachteten Wirkungen sind in der Figur 1 (A + B) dargestellt. Die Figur 1A zeigt die Ansicht der 24 Stunden lang gezüchteten Kontrollzellen in Abwesenheit des Peptids. Die Figur 1B zeigt die Ansicht der 24 Stunden lang in Gegenwart des Peptids gezüchteten Zellen. Beginnend 24 Stunden nach der Zugabe wurde eine beträchtliche Vermehrung des Neuritenwachstums in den in Gegenwart des pAntp-Peptids gezüchteten Zellen beobachtet.
Die gleichen Ergebnisse auf das zelluläre Wachstum wurden weiterhin bei Versuchen beobachtet, in denen die Zellen mit dem Peptid pAntp vorinkubiert und anschließend 24 Stunden lang in Kultur in einem CDM-Medium ohne Peptid gegeben wurden. Eine 30minütige Inkubation in Gegenwart von pAntp erlaubt bereits die Beobachtung der vorstehend beschriebenen Wirkungen. Diese Wirkungen sind nach einer zweistündigen Inkubation maximal und werden durch eine Verlängerung der Vorinkubationszeit nicht verstärkt.
Die Vorinkubation des Homöobox-Peptids mit der Konsensussequenz zur Bindung, das aus dem Hox1.3-Promotor erhalten wurde, oder auch mit einem Gemisch aus Fragmenten (mit Zufallssequenz) aus doppelsträngiger DNA blockiert dessen biologische Wirkung.
Es wurde weiterhin gezeigt, daß bei Verwendung eines mit Fluorescein markierten Peptids das Homöobox-Peptid rasch (weniger als zwei Stunden) von allen Neuronen eingefangen wird, anschließend in den Zellkern transportiert wird (Figur 2A) und daß dieser Transport durch Vorinkubation mit dem Konsensus-Oligonucleotid, das aus dem Promotor Hox1.3 erhalten wurde, oder auch mit einem Gemisch von Fragmenten (mit Zufallssequenz) aus doppelsträngiger DNA blockiert wird (Figur 2B).
Ein Vergleich zwischen dem Eintritt und der intrazellulären Verteilung des Peptids pAntp und von Polyornithin wurde ebenfalls durchgeführt.
Die Zellen wurden eine Stunde lang in Gegenwart von pAntp oder Polyornithin, markiert mit Fluorescein, inkubiert. Die Ergebnisse sind in der Figur 3 erläutert, die zeigt, daß das markierte pAntp (3A) sich prinzipiell im Nucleoplasma wiederfindet, im Gegensatz zu Polyornithin, das im Soma und in den Nucleolen vorhanden ist (3B).

Beispiel 3: Eindringen des Peptids pAntp in Fibroblasten in Kultur

Die Fibroblasten wurden aus der Haut von Rattenembryonen erhalten, mechanisch zerrissen und mit Trypsin behandelt; die Zellen wurden in Glaskästen, die mit Poly-DL-Ornithin überzogen waren (Sigma, PM 40,000, 15 µg/ml), in einem DMEM-F12 (GIPCO-PRL)-Kulturmedium und in Gegenwart von 10 % fötalem Kälberserum gezüchtet. Nach 24 Stunden Kultur wurden die Zellen eine Stunde lang in Gegenwart des mit Fluorescein markierten Peptids pAntp inkubiert. Das markierte Peptid pAntp dringt in die Fibroblasten ein, aber ist in dem Zellkern in geringerer Menge als in den Nervenzellen vorhanden.

Beispiel 4: Eindringen des Peptids pAntp in embryonale Zellen in vivo

0,2 µl der Lösung (1 µg/ml) des mit Fluorescein markierten Peptids pAntp wurden in das Mittelhirn eines Wachtelembryos von zwei Tagen injiziert. Nach vierstündiger in-ovo-Inkubation wurde der Embryo aus dem Ei entnommen, und Mittelhirnschnitte wurden durchgeführt. Die Betrachtung dieser Schnitte im Mikroskop zeigt, daß die fluoreszierende Markung im Kern der in der unmittelbaren Nähe des Injektionspunkts gelegenen Zellen lokalisiert ist.
Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, daß die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf diese Ausführungsformen, die Durchführung und die Anwendung, die soeben ausführlicher beschrieben wurden, beschränkt ist. Sie umfaßt im Gegensatz dazu alle Varianten, die einem Fachmann auf dem Gebiet einfallen können, ohne vom Umfang oder Gehalt der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Homöobox-Peptiden und Peptiden, umfassend die Sequenz der Helix 3 eines Homöobox-Peptids zur Verwendung als Medikament.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Homöobox-Peptid das Peptid pAntp ist.

3. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine andere Polypeptidsequenz gebunden ist.

4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Oligonucleotid- Sequenz gebunden ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als zellulärer, insbesondere als neurotroper Wachstumsfaktor.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als intrazellurärer Transportvektor für Moleküle, die auf die Zellfunktionen einwirken.

7. Verwendung eines in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten Polypeptids als auf Zellen in Kultur einwirkendes Mittel.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid als Wachstumsfaktor verwendet wird.

9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid als intrazellulärer Transportvektor für auf die Zellfunktionen einwirkende Moleküle verwendet wird.

-10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in Kultur Neuronen sind.

11. Verfahren zur in vitro Behandlung von Neuronen für die Implantation, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuronen in Gegenwart von mindestens einem Homöobox-Peptid, gegebenenfalls in Bindung an eine andere Peptidsequenz, inkubiert werden.

12. Zelluläre Zusammensetzung zur Verwendung in den Techniken zur Implantation von Neuronen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Assoziation von zu implantierenden Neuronen und transformierten Zellen mit der Eignung zur Synthese und Sekretion eines Homöobox-Peptids oder eines eine Homöobox-Sequenz umfassenden Fusionspeptids enthält.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff mindestens ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, enthält.