DE69122457T2

DE69122457T2 - Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotides zur Verwendung bei Einzelprimeramplifikation

Info

Publication number: DE69122457T2
Application number: DE69122457T
Authority: DE
Inventors: Martin Becker; Samuel Rose; Edwin F Ullman; Linda M Western
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1990-07-19
Filing date: 1991-07-18
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2011-07-19
Also published as: JPH0584079A; ATE143697T1; US5595891A; DE69122457D1; EP0469755B1; ES2091876T3; EP0469755A1; CA2047342A1

Description

Die Nukleinsäurehybridisierung ist zur Identitätsaufklärung und zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren eingesetzt worden. Hybridisierung beruht auf komplementärer Basenpaarung. Wenn komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren miteinander inkubiert werden, paaren die komplementären Basensequenzen, um doppelsträngige Hybridmoleküle zu bilden. Das Vermögen von einzelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (SSDNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) zur Bildung einer Wasserstoff-gebundenen Struktur mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz ist als analytisches Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung eingesetzt worden. Die Verfügbarkeit von radioaktiven Nukleosidtriphosphaten hoher spezifischer Aktivität und die ³²P-Markierung von DNA mit T4-Kinase hat es möglich gemacht, verschiedene Nukleinsäuresequenzen von biologischem Interesse zu identifizieren, isolieren und charakterisieren. Die Nukleinsäurehybridisierung besitzt ein großes Potential bei der Diagnose von Krankheitszuständen, die mit einzigartigen Nukleinsäuresequenzen assoziiert sind. Diese einzigartigen Nukleinsäuresequenzen können resultieren aus genetischer oder umweltbedingter Veränderung in der DNA durch Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder durch den Erwerb fremder DNA oder RNA mittels Infektion durch Bakterien, Schleimpilze, Pilze und Viren. Die Nukleinsäurehybridisierung ist bisher hauptsächlich in molekularbiologischen Laboratorien der Hochschulen und Industrie eingesetzt worden. Die Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung als diagnostisches Werkzeug in der klinischen Medizin ist beschränkt aufgrund der häufig sehr geringen Konzentrationen an krankheitsbezogener DNA oder RNA, die in der Körperflüssigkeit eines Patienten vorhanden sind, und der mangelnden Verfügbarkeit eines ausreichend empfindlichen Verfahrens zur Nukleinsäurehybridisierungs-Analyse.
Gegenwärtige Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen beinhalten im allgemeinen die Immobilisierung der Target- Nukleinsäure auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran. Nach der Fixierung der Target-Nukleinsäure auf dem Träger wird der Träger mit einer geeignet markierten Sonden-Nukleinsäure etwa 2 bis 48 Stunden lang in Kontakt gebracht. Nach der obigen Zeitspanne wird der feste Träger mehrere Male bei kontrollierter Temperatur gewaschen, um die unhybridisierte Sonde zu entfernen. Der Träger wird dann getrocknet und das hybridisierte Material durch Autoradiographie oder spektrometrische Methoden nachgewiesen.
Wenn es erforderlich ist, sehr geringe Konzentrationen nachzuweisen, sind die gegenwärtigen Verfahren langsam und arbeitsaufwendig und nicht-isotopische Markierungen, die weniger leicht als radioaktive Markierungen nachgewiesen werden, sind häufig nicht verwendbar. Ein Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit, um die Verwendung einfacher, schneller, nicht-isotopischer, homogener oder heterogener Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen zu erlauben, ist deshalb wünschenswert.
Kürzlich wurde ein Verfahren für die enzymatische Amplifizierung von spezifischen DNA-Segmenten beschrieben, welches als das Polymerase- Kettenreaktions (PCR)-Verfahren bekannt ist. Dieses in vitro Amplifizierungsverfahren basiert auf wiederholten Zyklen von Denaturierung, Oligonukleotid-Primerverschmelzung und Primerverlängerung durch thermophile Polymerase, wodurch sich eine exponentielle Zunahme an Kopien der von den Primern flankierten Region ergibt. Die PCR-Primer, die mit entgegengesetzten Strängen der DNA verschmelzen, sind so lokalisiert, daß das Polymerasekatalysierte Verlängerungsprodukt eines Primers als Matrizenstrang für den anderen dienen kann, was zur Anhäufung eines diskreten Fragments führt, dessen Länge durch die Entfernung zwischen den 5'- Enden der Oligonukleotid-Primer definiert ist.
Ein Verfahren zum Amplifizieren, Nachweisen und/oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen ist in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 offenbart. Die Sequenzpolymerisation durch Polymerase- Kettenreaktion ist von Saiki et al., (1986) Science, 230: 1350- 1354 beschrieben worden. Ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0194545 A2 beschrieben. Die belgische Patentanmeldung Nr. BE 904402 offenbart einen Schleimpilz zur Herstellung von DNA-Nachweissonden. Die Genamplifizierung in eukaryotischen Zellen wird im US-Patent Nr. 4,656,134 offenbart.
Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1981) 78: 6633-6637 offenbaren die enzymatische Synthese von Biotin-markierten Polynukleotiden und den Einsatz dieser Materialien als neue Nukleinsäure Affinitätssonden. Der Nachweis von viralen Genomen in kultivierten Zellen und in Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten unter Verwendung von Biotin-markierten Hybridisierungssonden wird von Brigati et al., Virology, (1983) 126: 32-50 erörtert. Das US-Patent Nr. 4,486,539 offenbart den Nachweis von mikrobiellen Nukleinsäuren durch einen einstufigen Sandwich-Hybridisierungstest. Empfindliche Tests für maligne Krankheitszustände, die auf DNA-Nachweis beruhen, werden im US-Patent Nr. 4,490,472 beschrieben. Das US-Patent Nr. 4,480,040 offenbart die empfindliche und schnelle Diagnose von Pflanzenviroid- Krankheiten und Viren unter Einsatz von radioaktiv markierter DNA, welche komplementär zu dem Viroid oder der Nukleinsäure des zu diagnostizierenden Virus ist. Die europäische Patentanmeldung 83 106 112.2, veröffentlicht als EP-A-97 373 (Priorität der US- Patentanmeldung 391,440, eingereicht am 23. Juni 1982) lehrt modifizierte markierte Nukleotide und Polynukleotide und Verfahren zur Herstellung, Verwendung und zum Nachweis derselben. Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Bestimmung von zellulärer DNA sind im US-Patent Nr. 4,423,153 offenbart. Spezifische DNA- Sonden in der diagnostischen Mikrobiologie werden im US-Patent Nr. 4,358,535 erörtert. Ein Verfahren zum Nachweis von polymorphen Restriktionsstellen und Nukleinsäuresequenzen wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 164 054 A1 erörtert. Das US- Patent Nr. 4,663,283 beschreibt ein Verfahren zur Veränderung doppelsträngiger DNA.
Eine genomische Amplifizierung mit Transkript-Sequenzierung wird von Stoflet et al., Science (1988) 239:491 erötert. Eine Primer- gesteuerte enzymatische Amplifizierung von DNA mit einer thermostabilen DNA-Polymerase wird von Saiki et al., Science (1988) 239:487 beschrieben. Das US-Patent Nr. 4,724,202 offenbart die Verwendung von nicht hybridisierbaren Nukleinsäuren zum Nachweis von Nukleinsäurehybridisierung. Bugawan et al., Biotechnology (1988), 6: 943- 947, beschreiben den Einsatz nicht-radioaktiver Oligonukleotid- Sonden zur Analyse von enzymatisch amplifizierter DNA für die pränatale Diagnose und gerichtsmedizinische HLA-Typenbestimmung.
Der Nachweis und die Isolierung von homologen, wiederholten und amplifizierten Nukleinsäuresequenzen wird im US-Patent Nr. 4,675,283 offenbart. Eine einzelsträngige selbsthybridisierende Nukleinsäure- Sonde, die imstande ist, wiederholt mit sich selbst oder anderen Nukleinsäuren unter Bildung einer amplifizierten Einheit zu hybridisieren, wird in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 888,058, eingereicht am 22. Juli 1986 (veröffentlicht als US6888058) beschrieben. Die US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 offenbaren einen homogenen Polynukleotidverdrängungs-Assay mit Verdauung des verdrängten einzelsträngigen RNA-Polynukleotids aus dem Reagenz- Komplex und Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen durch Behandlung separater komplementärer Stränge der Nukleinsäure mit zwei Oligonukleotid-Primern. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0,200,362 beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren, Nachweisen oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen, das zur Diagnose von Krankheiten und zur Herstellung von Transformationsvektoren geeignet ist. Ein Verfahren zur einfachen Analyse von relativen Nukleinsäureniveaus in mehrfachen kleinen Proben durch cytoplasmatische "Dot"-Hybridisierung wird im US-Patent Nr. 4,677,054 beschrieben. Ein Hybridisierungsverfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen mit einer Sonde, die ein Thionukleotid enthält, wird im US-Patent Nr. 4,647,529 beschrieben.
Ein einfaches und effizientes enzymatisches Verfahren zur kovalenten Verknüpfung von DNA mit Cellulose und dessen Anwendung für die Hybridisierungs-Restriktionsanalyse und für die in vitro-Synthese von DNA-Sonden wird in Nucleic Acids Research (1986) 14: 9171-9191 beschrieben. Die Spaltung von einzelsträngigen Oligonukleotiden durch die Restriktionsendonuklease Eco RI wird in Nucleic Acids Research (1987) 15: 709-716 beschrieben.
Die exponentielle Amplifizierung von rekombinante-RNA-Hybridisierungs-Sonden wird von Lizardi et al., (1988) Bio/Technology 6:1197- 1202 beschrieben. Fahrlander et al., erörtern "Amplifying DNA Probe Signals: A Christmas Tree Approach" in Bio/Technology (1988) 6:1165- 1168.
Ein Nukleinsäurehybridisierungs-Assay unter Einsatz von Sonden, die mit Target-Sequenzen vernetzbar sind, wird im US-Patent Nr. 4,599,303 beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung eines spezifischen einzelsträngigen Ribonukleinsäure- oder Desoxyribonukleinsäure-Moleküls, in das ein bifunktionelles vernetzendes Molekül kovalent inkorporiert wurde. Die Inkorporierung ist derart, daß das vernetzende Molekül die Kapazität behält, eine zweite Reaktion mit der Nukleinsäure des bakteriellen, viralen oder Säuger-Genoms einzugehen, welche das Target für die Sonde ist, um eine kovalente Vernetzung zu bilden. Nach der Vernetzung wird die nicht vernetzte Sonde von kovalent vernetztem Sonden-Target-Komplex abgetrennt unter Anwendung eines von mehreren Verfahren, die zwischen einzelsträngiger Sonde und doppelsträngigem, kovalent verknüpftem Sonden- Target-Komplex unterscheiden.
Ein Hybridisierungsverfahren und eine Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen wird im US-Patent Nr. 4,908,307 beschrieben. Ein Assay mit amplifizierter Hybridisierung wird im US-Patent Nr. 4,882,269 beschrieben, worin eine Familie von signalerzeugenden sekundären Sonden an eine primäre Sonde bindet, welche mit der interessierenden Target-Sequenz hybridisiert.
Der Nachweis von Target-Sequenzen in Nukleinsäuren durch Hybridisierung unter Verwendung diagnostischer und angrenzender Sonden zur Diagnose von Krankheiten genetischer Anomalität, insbesondere in einem automatisierten Verfahren, wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 185 494 A2 beschrieben. In diesem Verfahren wird eine Probe mit einer Sonde, die komplementär zu einem diagnostischen Abschnitt der Target-Sequenz ist, (der diagnostischen Sonde) und mit einer Sonde, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die an den diagnostischen Abschnitt angrenzt, (der angrenzenden Sonde) unter Bedingungen hybridisiert, unter denen die diagnostische Sonde im wesentlichen nur an der Proben-Nukleinsäure gebunden bleibt, welche die Target-Sequenz enthält. Die diagnostische Sonde und angrenzende Sonde werden dann kovalent verknüpft, um eine Target-Sonde zu ergeben, welche komplementär zu der Target-Sequenz ist, und die nicht verknüpften Sonden werden entfernt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine der Sonden markiert, so daß die Anwesenheit oder Abwesenheit der Target-Sequenz durch Schmelzen des Proben- Nukleinsäure-Target-Sonden-Duplexes, Eluieren der dissoziierten Target-Sonde und Uberprüfung hinsichtlich der Markierung getestet werden kann.
Das obige Verfahren weist mindestens einen Nachteil auf, insofern als angrenzende Sequenzen erforderlich sind. Zur Durchführung des Verfahrens müssen die diagnostische Sequenz und die angrenzende Sequenz identifiziert werden und diagnostische und angrenzende Sonden, die zu den obigen Sequenzen komplementär sind, erzeugt werden. Werden die diagnostischen und angrenzenden Sequenzen nicht präzise identifiziert, könnten die diagnostischen und angrenzenden Sonden nicht ausreichend hybridisieren und die Spezifität und Empfindlichkeit des Assays kann verloren gehen oder wesentlich verringert werden.
In WO89/12695 wird eine DNA-Amplifizierungs- und Subtraktions- Technik beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Isolierung genomischer oder RNA-abgeleiteter Doppelstrangfragmente, die nur in einer von zwei Fragmentmischungen vorkommen. Die Fragmente in der positiven und negativen Ausgangsmischung werden separat mit End- Linkern versehen und jede Mischung durch aufeinanderfolgende Replikationen eines "geprimten" Stranges unter Verwendung eines einzigen Primers, der zu dem assoziierten Linker homolog ist, amplifiziert. Der Linker der zweiten Ausgangsmischung ist biotinyliert und die Fragmente dieser Mischung werden in molarem Überschuß mit den Fragmenten in der positiven Ausgangsmischung hybridisiert. DNA-Spezies, die mit der biotinylierten Spezies nicht hybridisiert sind, d.h., Spezies, die nur in der positiven Ausgangsmischung vorkommen, werden nach der Entfernung der hybridisierten Spezies durch Affinitätschromatographie isoliert. Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zur Amplifizierung einer Mischung von DNA-Fragmenten durch wiederholte Linker-Primer- Replikation.
Die US-Patentanmeldungen Serien-Nr. 07/299,282 und 07/399,795, eingereicht am 19. Januar 1989 bzw. am 29. August 1989 (europäische Patentanmeldung 90 300 528.8, Veröffentlichungs-Nr. 0379369, zitiert gemäß Artikel 54(3) EPÜ), beschreiben eine Nukleinsäure-Amplifizierung unter Verwendung eines einzigen Polynukleotid-Primers.
Die hier offenbarte Erfindung umfaßt Verfahren und Reagenzien zur Herstellung eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind. Das Verfahren findet insbesondere Anwendung bei Einzelstrangprimer-Amplifizierungs-Assays.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein einzelsträngiges Polydesoxynukleotid mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind, hergestellt. Das Herstellungsverfahren umfaßt die Schritte
(a) der Bereitstellung in Kombination eines Polynukleotids mit zwei nicht aneinander angrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist, und einer Verlängerungs-Sonde, die zwei Desoxynukleotidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 ist, und
(b) der Verlängerung der Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind. Das Verfahren umfaßt den Schritt der Bereitstellung in Kombination, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, von (1) einem Polynukleotid mit zwei nicht aneinander angrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist, (2) einer Verlängerungs- Sonde, die zwei Desoxynukleotidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Nukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu dem Polynukleotid ist, (3) einem Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mindestens an seinem 3'-Ende mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, (4) DNA-Polymerase, und (5) Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen, unter denen (a) die Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (b) die verlängerte Verlängerungs- Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (c) der Polydesoxynukleotid-Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen zweiten Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (d) der verlängerte Primer von dem zweiten Doppelstrang dissoziiert wird, und (e) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (d) und (e) wiederholt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Anwesenheit einer Target- Nukleotidsequenz in einem Medium nachgewiesen, von dem angenommen wird, daß es die Target-Nukleotidsequenz enthält. Die Target- Nukleotidsequenz weist zwei nicht aneinander angrenzende, nicht hybridisierbare Nukleotidsequenzen S1 und S2 auf, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
(a) der Bereitstellung in Kombination, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, des Mediums, einer Verlängerungs-Sonde mit zwei Desoxynukleotidsequenzen, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu der Target-Nukleotidsequenz ist, eines Polydesoxynukleotid- Primers, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, von DNA-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen, unter denen (1) die Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs- Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Verlängerungssonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (4) und (5) wiederholt werden, und
(b) der Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Polynukleotid-Analyten enthält. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
(a) der Behandlung eines Mediums, das die Probe enthält, um aus dem Polynukleotid-Analyten, falls vorhanden, eine einzelsträngige Target-Nukleotidsequenz zu bilden, wobei die Target-Nukleotidsequenz zwei nicht aneinandergrenzende, nicht-komplementäre Nukleotidsequenzen S1 und S2 aufweist, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens 10 Nukleotide lang ist,
(b) der Kombination des Mediums mit einer Verlängerungs- Sonde mit zwei Polydesoxynukleotidsequenzen, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu der Target-Sequenz ist, einem Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, Desoxynukleosid-Triphosphaten und DNA-Matrizen- abhängiger Polydesoxynukleotid-Polymerase unter Bedingungen, unter denen (1) die Verlängerungs-Sonde mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (4) und (5) wiederholt werden, wobei die Schritte (a) und (b) gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell durchgeführt werden, und
(c) der Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers.
Die Erfindung umfaßt Kits, welche in abgepackter Kombination umfassen (a) eine Polydesoxynukleotid-Verlängerungs-Sonde, die an ihrem 3'- Ende eine Sequenz aufweist, die mit einer ersten Sequenz in einer Target-Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, und eine Sequenz aufweist, die homolog zu einer zweiten Sequenz der Target-Nukleotidsequenz ist, wobei in der Target-Nukleotidsequenz diese zweite Sequenz 5' von der ersten Sequenz liegt und nicht daran angrenzt, und (b) einen Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer Sequenz zu hybridisieren, die zur zweiten Sequenz komplementär ist. Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden nur beispielhaft beschrieben.
Das vorliegende Verfahren erlaubt die Herstellung eines einzelsträngigen Polynukleotids mit einer intramolekular basengepaarten Struktur, d.h., zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und komplementär zueinander sind. Das Verfahren findet insbesondere Anwendung auf dem Gebiet der oben beschriebenen Einzelprimer- Amplifizierung, wobei eine Target-Sequenz in einer Probe amplifiziert wird, wenn eine solche Target-Sequenz eine intramolekular basengepaarte Struktur aufweist oder in eine solche Struktur überführt werden kann. Das vorliegende Verfahren stellt ein sehr bequemes Verfahren zur Überführung einer interessierenden Polynukleotidsequenz in eine Target-Sequenz mit einer intramolekular basengepaarten Struktur bereit.
Bevor mit einer Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, soll eine Anzahl von Begriffen definiert werden.
Polynukleotid-Analyt -- Eine zu bestimmende Verbindung oder Zusammensetzung, welche ein polymeres Nukleotid ist, das im intakten natürlichen Zustand etwa 20 bis 500.000 oder mehr Nukleotide aufweisen kann und im isolierten Zustand etwa 30 bis 50.000 oder mehr Nukleotide, gewöhnlich etwa 100 bis 20.000 Nukleotide, häufiger 500 bis 10.000 Nukleotide, aufweisen kann. Es ist somit ersichtlich, daß die Isolierung des Analyten aus dem natürlichen Zustand oft zu einer Fragmentierung führt. Die Polynukleotid-Analyten umfassen Nukleinsäuren beliebigen Ursprungs in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-DNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten- DNA und -RNA, DNA-RNA-Hybride oder Mischungen davon, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schleimpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen, und Fragmente davon und dgl. Der Polynukleotid-Analyt kann lediglich eine kleinere Fraktion einer komplexen Mischung wie einer biologischen Probe sein. Der Analyt kann aus verschiedenem biologischem Material durch auf diesem Gebiet wohlbekannte Verfahren erhalten werden.
Einige erläuternde und nicht beschränkende Beispiele solchen biologischen Materials sind in der folgenden Tabelle I offenbart. TABELLE I
Der Polynukleotid-Analyt kann, wenn dies angebracht ist, einer Behandlung zur Spaltung des Analyten unterworfen werden, um ein Fragment zu erhalten, welches eine Target-Polynukleotidsequenz enthält, z.B. durch Scherung oder Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease oder einem anderen stellenspezifischen chemischen Spaltungsverfahren. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß der Polynukleotid-Analyt in seinem isolierten Zustand ohne weitere Spaltung eingesetzt werden kann.
Für die Zwecke dieser Erfindung wird der Polynukleotid-Analyt oder ein aus dem Polynukleotid-Analyten erhaltenes gespaltenes Fragment gewöhnlich mindestens teilweise denaturiert oder einzelsträngig sein oder behandelt werden, um ihn bzw. es denaturiert oder einzelsträngig zu machen. Derartige Behandlungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen beispielsweise Wärme- oder Alkalibehandlung ein. Beispielsweise kann doppelsträngige DNA für eine Zeitspanne von etwa 1 bis etwa 10 Minuten auf 90 - 100ºC erwärmt werden, um denaturiertes Material zu erzeugen.
Target-Polynukleotidsequenz -- Eine Sequenz von zu identifizierenden Nukleotiden, deren Identität bis zu einem ausreichenden Grad bekannt ist, um die Herstellung eines Verlängerungs-Sonden-Polydesoxynukleotids zu erlauben, welches mindestens mit einem Abschnitt einer derartigen Target-Sequenz hybridisieren wird, gewöhnlich mit einem Segment von mindestens 10 Nukleotiden davon und vorzugsweise einem Segment von mindestens 15, häufig 20 bis 50, Nukleotiden davon. Die Target-Polynukleotidsequenz weist zwei nicht aneinandergrenzende, nicht komplementäre Nukleotidsequenzen S1 und S2 auf, von denen eine (S1) der oben erwähnte Abschnitt ist, der mit einem Verlängerungs- Sonden-Polydesoxynukleotid hybridisieren kann, wobei S2 5' von S1 liegt. Die Target-Polynukleotidsequenz wird gewöhnlich etwa 10 bis 5000 oder mehr Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 1000 Nukleotide enthalten. Die beiden nicht aneinandergrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2 enthalten vorzugsweise jeweils 10 bis 100 Nukleotide und sind durch mindestens 10 Basen, vorzugsweise mindestens 100, gewöhnlich 200 bis 5000 oder mehr getrennt. Eine Target-Polynukleotidsequenz ist häufig ein Teil des Polynukleotid-Analyten. Die Target-Polynukleotidsequenz wird gewöhnlich ein Bruchteil eines größeren Moleküls sein oder sie kann im wesentlichen das gesamte Molekül sein. Die minimale Anzahl der Nukleotide in der Target-Polynukleotidsequenz wird so gewählt werden, daß sichergestellt ist, daß die Anwesenheit der Target- Polynukleotidsequenz in einer Probe ein spezifischer Indikator der Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in einer Probe sein wird. Ganz grob wird die Sequenzlänge gewöhnlich länger als etwa 1,6 log L Nukleotide sein, wobei L die Anzahl der Basenpaare im Genom des biologischen Ursprungs der Probe ist. Die maximale Anzahl der Nukleotide in der Target-Sequenz wird normalerweise bestimmt durch die Länge des Polynukleotid-Analyten und dessen Tendenz, durch Scherung oder andere Prozesse während der Isolierung und anderer Verfahren, die zur Vorbereitung der Probe für den Assay erforderlich sind, aufgebrochen zu werden.
Einzelsträngiges Polydesoxynukleotid -- Eine Sequenz von Desoxynukleotiden, die als Ergebnis der vorliegenden Erfindung gebildet wird. Sie wird normalerweise mindestens zwei Segmente oder flankierende Sequenzen umfassen, die nicht aneinandergrenzen und zueinander komplementär sind. Sie kann auch eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die, wenn sie an ihre komplementären Sequenzen gebunden sind, spezifische Bindungsstellen für Rezeptoren wie Repressoren, Restriktionsenzyme und dgl. darstellen. Die ersten und zweiten Segmente oder flankierenden Sequenzen befinden sich am 3'- Ende bzw. 5'-Ende in dem einzelstrangigen Polynukleotid und umfassen jeweils mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, Desoxynukleotide und/oder Derivate davon.
Das einzelsträngige Polydesoxynukleotid wird gewöhnlich 30 bis 50.000 Desoxynukleotide, vorzugsweise 100 bis 2000 Desoxynukleotide, noch bevorzugter 500 bis 10.000 Desoxynukleotide, umfassen. Wird das einzelsträngige Polydesoxynukleotid mit einem komplementären Strang hybridisiert, wird es häufig "inverted repeats" bilden.
Polydesoxynukleotid-Primer -- Ein Polydesoxynukleotid, gewöhnlich ein synthetisches Desoxynukleotid, welches einzelsträngig ist und an seinem 3'-Ende eine Sequenz enthält, die mit einer zur Sequenz S2 der Polynukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz hybridisierbar ist und mindestens 90%, vorzugsweise 100%, derselben Basensequenz aufweist wie die zweite Nukleotidsequenz der Verlängerungs-Sonde. Sie ist deshalb auch mit einer Nukleotidsequenz hybridisierbar, die zu dem zweiten Segment oder der zweiten flankierenden Sequenz des einzelsträngigen Polydesoxynukleotids komplementär ist. Die Anzahl der Desoxynukleotide in der hybridisierbaren Sequenz des Polydesoxynukleotid-Primers sollte derart sein, daß die Stringenz-Bedingungen, welche zur Hybridisierung des Polydesoxynukleotid-Primers eingesetzt werden, eine übermäßige statistische nicht-spezifische Hybridisierung verhindern. Gewöhnlich wird die Anzahl der Desoxynukleotide in dem Polydesoxynukleotid- Primer mindestens so groß sein wie in der S2-Sequenz der Target- Polynukleotidsequenz, nämlich mindestens 10 Desoxynukleotide, vorzugsweise mindestens 15 Desoxynukleotide, und gewöhnlich etwa 10 bis 200, vorzugsweise 20 bis 50, Desoxynukleotide.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied") -- Eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Gebiet auf der Oberfläche oder in einer Cavität, welches spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Dies können Mitglieder eines immunologischen Paares wie Antigen- Antikörper sein, oder Operator-Repressor, Nuklease-Nukleotid, Biotin- Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-Doppelstränge, IgG- Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dgl.
Ligand -- Jede Verbindung, fur ein Rezeptor natürlicherweise existiert oder hergestellt werden kann.
Rezeptor ("Antiligand") -- Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die imstande ist, eine besondere räumliche oder polare Organisation eines Moleküls zu erkennen, z.B. ein Epitop oder eine Determinante. Beispielhafte Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Schutz-Enzyme, Protein A, Komplement-Komponente C1q, DNA-bindende Proteine oder Liganden und dgl. ein.
Kleines organisches Molekül -- Eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500, vorzugsweise 100 bis 1000, noch bevorzugter 300 bis 600, z.B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere Protein-bindende Moleküle und Haptene, etc. Das kleine organische Molekül kann ein Mittel zur Verknüpfung einer Nukleotidsequenz mit einer Markierung oder einem Träger bereitstellen.
Träger oder Oberfläche -- Ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder imstande, hydrophil gemacht zu werden, und umfaßt anorganische Pulver wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulose-Materialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, z.B. faserhaltige Papiere, beispielsweise Filterpapier, Chromatographiepapier, etc.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere, z.B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), etc.; entweder als solche oder in Verbindung mit anderen Materialien eingesetzt; Glas, erhältlich als Bioglas, Keramiken, Metalle und dgl. Natürliche oder synthetische Vereinigungen wie Liposome, Phospholipid-Vesikel und Zellen können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Bindung von sbp-Mitgliedern an den Träger oder die Oberfläche kann durch wohlbekannte Techniken, die allgemein in der Literatur zugänglich sind, erreicht werden. Siehe beispielsweise "Immmobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). Die Oberfläche kann jede beliebige Gestalt, z.B. Streifen, Stab, Teilchen, einschließlich Perle, und dgl, aufweisen.
Die Oberfläche wird gewöhnlich polyfunktionell sein oder imstande, polyfunktionalisiert zu werden, oder imstande sein, an ein Oligonukleotid oder ein sbp-Mitglied durch spezifische oder nicht spezifische kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen zu binden. Eine große Vielfalt funktioneller Gruppen stehen zur Verfügung oder können inkorporiert werden. Funktionelle Gruppe umfassen Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dgl. Die Art und Weise der Verknüpfung einer großen Vielfalt von Verbindungen mit Teilchen ist wohlbekannt und in der Literatur reichlich erläutert. Siehe beispielsweise Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge einer Verknüpfungsgruppe zu dem Oligonukleotid oder sbp- Mitglied kann in großem Umfang variieren, in Abhängigkeit von der Art der zu verknüpfenden Verbindung, der Wirkung der Entfernung zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und dem Teilchen auf die Hybridisierung der Sequenzen und dgl. Das Oligonukleotid oder sbp- Mitglied wird im wesentlichen an die äußere Oberfläche des Teilchens gebunden werden.
Als Oberfläche eingesetzte Teilchen können fluoreszieren, entweder direkt oder mit Hilfe fluoreszierender Verbindungen oder "Fluorescer", die an das Teilchen auf übliche Weise gebunden sind.
Die "Fluorescer" werden gewöhnlich in dem Teilchen gelöst oder kovalent oder nicht-kovalent an das Teilchen gebunden sein und werden häufig im wesentlichen gleichmäßig über das ganze Teilchen hinweg gebunden sein. Fluoresceinierte Latex-Teilchen werden im US-Patent Nr. 3,853,987 gelehrt.
Markierung oder "Reporter"-Gruppe oder "Reporter"-Molekül -- Ein Mitglied des signalerzeugenden Systems. Gewöhnlich ist die Markierung oder die Reporter-Gruppe oder das Reporter-Molekül mit einer Sonde oder einem Polydesoxynukleotid-Primer konjugiert oder wird daran gebunden, und ist imstande, direkt nachgewiesen zu werden, oder kann mit Hilfe einer spezifischen Bindungsreaktion ein nachweisbares Signal erzeugen. Markierungen umfassen einen Polynukleotid-Primer oder eine spezifische Polynukleotidsequenz, die eine Matrize zur Amplifizierung oder Ligierung bieten kann oder als Ligand, z.B. für ein Repressor-Protein, dienen kann. Vorzugsweise wird der Polydesoxynukleotid-Primer eine Markierung aufweisen oder imstande sein, eine solche aufzuweisen. Im allgemeinen kann jede nachweisbare Markierung eingesetzt werden. Die Markierung kann isotopisch oder nicht-isotopisch, gewöhnlich nicht-isotopisch, sein und kann ein Katalysator, z.B. ein Enzym, ein Polynukleotid, das für einen Katalysator kodiert, ein Promotor, Farbstoff, fluoreszierendes Molekül, eine chemolumineszierende Substanz, ein Coenzym, Enzym-Substrat, eine radioaktive Gruppe, ein kleines organisches Molekül, eine amplifizierbare Polynukleotidsequenz, ein Teilchen wie z.B. ein Latex- oder Kohlenstoff-Teilchen, ein Metall-Sol, Kristallit, Liposom, eine Zelle, etc. sein, welche (s,r) darüber hinaus mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe und dgl. markiert sein kann oder auch nicht. Die Markierung ist ein Mitglied des signalerzeugenden Systems und kann entweder allein oder zusammen mit anderen Mitgliedern des signalerzeugenden Systems ein nachweisbares Signal erzeugen. Die Markierung kann direkt an eine Nukleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden werden durch die Bindung an ein sbp-Mitglied, welches komplementär zu einem sbp-Mitglied ist, das an eine Nukleotidsequenz gebunden ist.
Signalerzeugendes System -- Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten besitzen, wobei mindestens eine Komponente die Markierung oder Reporter-Gruppe ist. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das in Beziehung steht zur Anwesenheit oder Menge der Target-Polynukleotidsequenz oder eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe. Das signalerzeugende System umfaßt alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind. Wenn die Markierung nicht mit einer Nukleotidsequenz konjugiert ist, so ist die Markierung normalerweise an ein sbp-Mitglied gebunden, welches komplementär zu einem sbp-Mitglied ist, das an eine Nukleotidsequenz gebunden oder Teil davon ist. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können in einer Entwickler-Lösung eingeschlossen sein und können Substrate, Verstärker, Aktivatoren, chemolumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfangreagenzien, Metallionen, spezifisch bindende Substanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, etc. umfassen. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Coenzyme, Substanzen, welche mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. sein. Das signalerzeugende System liefert ein Signal, das durch externe Mittel unter Verwendung elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist.
Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen, und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Vielzahl von Substraten einschließen, und kann eine Kombination von Enzymen einschließen, wobei das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems ist die Erzeugung eines Produkts, welches ein nachweisbares Signal liefert, das zur Menge des Polynukleotid-Analyten in der Probe in Beziehung steht.
Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen, die für ein signalerzeugendes System geeignet sind, sind im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23, und US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, angegeben. Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 4,275, 149, Spalten 23 bis 28, angegeben, welche Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
Von besonderem Interesse sind Enzyme, welche die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Besondere Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, z.B. Glucose- und Galactoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, z.B. Uricase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym, welches das Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers verwendet, d.h., eine Peroxidase wie z.B. Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Weitere Enzymkombinationen können in dem durch die Bezugnahme inkorporierten Material gefunden werden. Wird ein einzelnes Enzym als Markierung verwendet, können andere Enzyme wie Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen Verwendung finden, vorzugsweise Hydrolasen wie alkalische Phosphatase und β- Galactosidase. Alternativ können Luciferasen wie Glühwürmchenluciferase und bakterielle Luciferase verwendet werden.
Beispielhafte Coenzyme, die Verwendung finden, unmfassen NAD[H]; NADP[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H] etc., gewöhnlich Coenzyme, die cyclische Reaktionen beinhalten, siehe insbesondere US-Patent Nr. 4,318,980.
Das Produkt der Enzymreaktion wird gewöhnlich ein Farbstoff oder ein fluoreszierender Stoff ("Fluorescer") sein. Eine große Zahl von beispielhaften Fluorescern ist im US-Patent Nr. 4,725,149, Spalten 30 und 31, angegeben.
Das signalerzeugende System kann ein oder mehrere Teilchen umfassen, welche unlösliche Teilchen von mindestens etwa 50 nm und nicht mehr als etwa 50 µm, gewöhnlich mindestens etwa 100 nm und weniger als etwa 25 µM, vorzugsweise etwa 0,2 bis 5 µm Durchmesser, sind. Das Teilchen kann sein organisch oder anorganisch, porös oder nichtporös, vorzugsweise von einer ähnlichen Dichte wie Wasser, gewöhnlich von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g pro ml, und aus Material aufgebaut, das transparent, teilweise transparent oder opak sein kann.
Die organischen Teilchen werden normalerweise aus Polymeren, entweder Additions- oder Kondensationspolymere, bestehen, die ohne weiteres im Assay-Medium dispergierbar sind. Die Teilchenoberfläche wird adsorptionsfähig sein oder funktionalisierbar, um entweder direkt oder indirekt ein Oligonukleotid oder sbp-Mitglied zu binden. Die Art der Teilchen ist oben beschrieben.
Interessierende "Fluorescer" werden gewöhnlich Licht bei einer Wellenlänge oberhalb von 350 nm, gewöhnlich oberhalb 400 nm und vorzugsweise oberhalb 450 nm emittieren. Wünschenswerterweise haben die Fluorescer eine große Quanteneffizienz, eine große Stokes- Verschiebung und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Ausdruck "fluorescer" soll Substanzen einschließen, welche Licht nach Aktivierung durch elektromagnetische Strahlung oder chemische Aktivierung emittieren, und schließt fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Scintillatoren und chemolumineszierende Substanzen ein.
Interessierende Fluorescer fallen in eine Vielzahl von Kategorien mit bestimmten primären Funktionalitäten. Diese primären Funktionalitäten umfassen 1- und 2-Aminonaphthalen, p,p-Diaminostilbene, Pyrene, quarternäre Phenanthridin-Salze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminostilben-Imine, Anthracene, Oxacarboxyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2- Benzophenazin, Retinal, Bis-3-aminopyridinium-Salze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4,5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Seltene-Erden-Chelate, -Oxide und -Salze. Beispielhafte Fluorescer sind im US-Patent Nr. 4,318,707, Spalten 7 und 8, aufgezählt.
Darüber hinaus können energieabsorbierende oder "quenchende" Teilchen eingesetzt werden, welche feste unlösliche Teilchen von mindestens etwa 50 nm Durchmesser sind, die imstande sind, die Fluoreszenz des fluoreszierenden Teilchens zu löschen ("quenchen"), wenn sie sich innerhalb der Distanz befinden, die aus der Hybridisierung einer Sonde mit dem Polynukleotid-Analyten oder aus spezifischer Bindung zwischen Mitgliedern von spezifischen Bindungspaaren resultiert. Das quenchende Teilchen kann gleich oder verschieden, gewöhnlich verschieden, von dem fluoreszierenden Teilchen sein. Normalerweise wird das quenchende Teilchen eine substantielle Löschung in einer Entfernung von mehr als etwa 50 Å, vorzugsweise mehr als etwa 500 Å, noch bevorzugter mehr als 2000 Å, ergeben, wobei die Distanz von den Oberflächen der Teilchen gemessen wird.
Zur Modulierung der Lichtemission können viele verschiedene Arten von Teilchen eingesetzt werden. Von besonderem Interesse sind Kohlenstoffteilchen, z.B. Holzkohle, Rußschwarz, Graphit, kolloidaler Kohlenstoff und dgl. Außer Kohlenstoffteilchen können auch Metall- Sole, insbesondere der Edelmetalle Gold, Silber und Platin, Verwendung finden. Andere von Metall abgeleitete Teilchen können Metallsulfide umfassen, z.B. Blei-, Silber- oder Kupfersulfide oder Metalloxide wie Eisen- oder Kupferoxid.
Eine alternative Lichtquelle als nachweisbares Signal ist eine chemolumineszierende Quelle. Die chemolumineszierende Quelle beinhaltet eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und dann Licht emittieren kann, welches als das nachweisbare Signal dient oder Energie an einen Fluoreszenz- Akzeptor abgibt.
Von einer mannigfaltigen Reihe von Verbindungsfamilien wurde festgestellt, daß sie Chemolumineszenz unter einer Vielfalt von Bedingungen ergeben. Eine Verbindungsfamilie ist 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, welche das 5-Amino-Analogon der obigen Verbindung ist. Andere Mitglieder der Familie umfassen das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamin[ca]benz-Analogon. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit und Base zur Lumineszenz gebracht werden. Eine weitere Familie von Verbindungen sind die 2,4,5-Triphenylimidazole, mit Lophin als üblicher Name für das Stamm- Produkt. Chemolumineszierende Analoga umfassen para-Dimethylamino- und para-Methoxy-Substituenten. Chemolumineszenz kann auch durch Oxilate, gewöhnlich Oxalyl, aktive Ester, z.B. p-Nitrophenyl, und ein Peroxid, z.B. Wasserstoffperoxid, unter basischen Bedingungen erhalten werden. Alternativ können Luciferine in Verbindung mit Luciferase oder Lucigeninen eingesetzt werden.
Hilfsmaterialien -- In dem erfindungsgemäßen Assay werden häufig verschiedene Hilfsmaterialien verwendet werden. Beispielsweise werden gewöhnlich im Medium Puffer anwesend sein, ebenso wie Stabilisatoren für das Assay-Medium und die Assay-Komponenten. Häufig können neben diesen Zusätzen Proteine, z.B. Albumine, organische Lösungsmittel wie Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen wie Dextransulfat, Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglykole, oder dgl. eingeschlossen sein.
Desoxynukleosid-Triphosphate -- Ein Desoxynukleosid mit einem 5'- Triphosphat-Substituenten. Die Desoxynukleoside sind Pentose- Zucker-Derivate von stickstoffhaltigen Basen, die sich entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten und kovalent an den 1'-Kohlenstoff des Pentose-Zuckers gebunden sind. Die Purinbasen umfassen Adenin (A), Guanin (G), Inosin und Derivate und Analoga davon. Die Pyrimidinbasen umfassen Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) und Derivate und Analoga davon.
Die Derivate und Analoga sind beispielsweise solche, die auf ähnliche Weise erkannt und polymerisiert werden wie die underivatisierten Nukleosid-Triphosphate. Beispiele solcher Derivate oder Analoga, als Erläuterung und nicht als Beschränkung, sind solche, die mit einer "Reporter" -Gruppe modifiziert sind, biotinylierte, Amin-modifizierte, radioaktiv markierte, alkylierte und dgl. und schließen auch Thiophosphat, Phosphit, Ringatom-modifizierte Derivate und dgl. ein. Die Reporter-Gruppe kann eine fluoreszierende Gruppe wie Fluorescein, eine chemolumineszierende Gruppe wie Luminol, ein Terbium-Chelator wie N-(Hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, der durch verzögerte Fluoreszenz nachgewiesen werden kann, und dgl. sein.
Polydesoxynukleotid-Polymerase -- Ein Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, zur Bildung einer Verlängerung des Polydesoxynukleotid- Primers entlang einer DNA-Matrize, die das einzelsträngige Polydesoxynukleotid einschließt, zu dem die Verlängerung komplementär ist. Die Polydesoxynukleotid-Polymerase ist eine Matrizen-abhängige Polydesoxynukleotid-Polymerase und verwendet die Desoxynukleosid- Triphosphate als Bausteine zur Verlängerung des 3-Endes des Polydesoxynukleotid-Primers, um eine Sequenz zu liefern, die komplementär zu dem einzelsträngigen Polydesoxynukleotid ist. Gewöhnlich sind die Katalysatoren Enzyme, solche DNA-Polymerasen wie z.B. prokaryotische DNA-Polymerase (I, II oder III), T4-DNA- Polymerase, T7-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, und dgl., die aus beliebiger Quelle wie Zellen, Bakterien, z.B. E. coli, Pflanzen, Tieren, Viren, thermophilen Bakterien, etc. stammen. Ist die Polynukleotid- oder Target-Polynukleotidsequenz RNA, so würde reverse Transkriptase eingeschlossen sein, um die Verlängerung der Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids oder der Target- Polynukleotidsequenz zu fördern.
Ganz oder teilweise sequentiell -- Wenn die Probe und die verschiedenen Agentien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf andere Weise als alle gemeinsam (gleichzeitig) kombiniert werden, können eines oder mehrere mit einem oder mehreren der verbleibenden Agentien kombiniert werden, um eine Unterkombination zu bilden. Jede Unterkombination kann dann einem oder mehreren Schritt(en) des vorliegenden Verfahren unterworfen werden. Auf diese Weise kann jede der Unterkombinationen unter Bedingungen inkubiert werden, bei denen eines oder mehrere der gewünschten Ergebnisse erreicht werden.
Hybridisierung (Hybridisieren) und Bindung -- Im Zusammenhang mit Nukleotidsequenzen werden diese Begriffe hier austauschbar verwendet. Die Fähigkeit von zwei Nukleotidsequenzen, miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Grad der Komplementärität der beiden Nukleotidsequenzen, welche wiederum auf dem Anteil der übereinstimmenden komplementären Nukleotidpaaren beruht. Je mehr Nukleotide in einer gegebenen Sequenz komplementär zu einer anderen Sequenz sind, desto größer ist der Grad der Hybridisierung miteinander. Der Grad der Hybridisierung hängt auch von den Viskositätsbedingungen oder der Stringenz ab, welche Temperatur, Lösungsmittelverhältnisse, Salzkonzentrationen und dgl. einschließt.
Homolog -- Zwei Sequenzen sind homolog, wenn die Sequenzen jeweils mindestens 90%, vorzugsweise 100%, derselben oder analogen Basensequenz aufweisen, wobei Thymidin (T) und Uracil (U) als gleich betrachtet werden. So werden die Ribonukleotide A, U, C und G als analog zu den Desoxynukleotiden dA, dT, dC und dG betrachtet. Homologe Sequenzen können beide DNA sein oder es kann eine DNA und die andere RNA sein.
Verlängerungs-Sonde -- Umfaßt einen Einzelstrang von zwei Desoxynukleotidsequenzen, der an seinem 3'-Ende eine derartige Sequenz (EP1), vorzugsweise mindestens zehn aufeinanderfolgende Desoxynukleotide davon, aufweist und imstande ist, mit einer ersten Polynukleotidsequenz (S1) eines Polynukleotids zu hybridisieren, welches eine Target-Polynukleotidsequenz mit zwei nicht aneinandergrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen umfaßt, wobei S1 3' von der zweiten dieser Sequenzen liegt. Das Hybridisierungsvermögen ergibt sich aus der teilweisen oder vollständigen, gewöhnlich vollständigen, Komplementärität zur ersten Polynukleotidsequenz, so daß die erste Polynukleotidsequenz an EP1 gebunden werden wird. Gewöhnlich ist die Verlängerungs-Sonde ein synthetisches Oligonukleotid.
Die Hauptkriterien für die Auswahl von EP1 sind: (1) Die Sequenz sollte verläßlich sein, d.h. sie sollte annähernd oder genau komplementär zu S1 sein und eine ausreichende Länge aufweisen, um eine stabile und spezifische Bindung zu ergeben. (2) Das 3'-Ende muß eine freie 3'-Hydroxylgruppe bilden oder imstande sein, diese zu bilden. Die minimale Bindungssequenz wird gewöhnlich mindestens 10, normalerweise mindestens 15, vorzugsweise 20-50, Desoxynukleotide lang sein. Im allgemeinen wird EP1 etwa 10 bis 100, z.B. 30 bis 100, Desoxynukleotide aufweisen. Die vereinigte Länge der ersten und zweiten Polydesoxynukleotidsequenzen der Verlängerungs-Sonde ist eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 40 bis 200 Nukleotiden.
Die zweite Polydesoxynukleotidsequenz der Verlängerungs-Sonde (EP2) ist eine Sequenz von Desoxynukleotiden, die homolog ist zu einer zweiten Polynukleotidsequenz (S2) eines Target-Polynukleotids mit zwei nicht aneinandergrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen, wobei S2 5' von S1 liegt. EP2 besitzt eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden, gewöhnlich mindestens 15, vorzugsweise 20-50 Desoxynukleotiden. Im allgemeinen wird EP2 etwa 10 bis 100, z.B. 30 bis 100, Desoxynukleotide aufweisen.
Die Verlängerungs-Sonde kann weitere Rezeptorbindungs- oder "Spacer"- Sequenzen oder andere Sequenzen enthalten, die zwischen EP1 und EP2 oder am Ende von EP2 lokalisiert sind.
Nicht aneinandergrenzend -- Sequenzen sind nicht aneinandergrenzend, wenn mindestens ein, gewöhnlich mindestens 10, Desoxynukleotid(e) in der Target-Polydesoxynukleotidsequenz zwischen den beiden Segmenten oder zwischen den beiden Sequenzen S1 und S2 eines Polynukleotids liegt bzw. liegen.
Aneinandergrenzend -- Sequenzen werden als aneinandergrenzend betrachtet, wenn keine Desoxynukleotide zwischen zwei Segmenten oder zwischen zwei Sequenzen eines Polynukleotids liegen.
Kopie -- Bedeutet eine Sequenz, die eine direkte Kopie einer einzelsträngigen Polydesoxynukleotidsequenz ist, im Unterschied zu einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz eines derartigen einzelsträngigen Polynukleotids ist. Bei der Einzelprimer- Amplifizierung, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, wird zunächst eine komplementäre Sequenz eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids als Ergebnis der Verlängerung des Polydesoxynukleotid-Primers erzeugt und eine Sequenz, die eine direkte Kopie des einzelsträngigen Polydesoxynukleotids ist, wird anschlie-ßend aus der vorgenannten komplementären Sequenz erhalten.
Mittel zur Verlängerung einer Verlängerungs-Sonde -- Eine Verlängerungs-Sonde mit einem verlängerbaren 3'-Ende kann verlängert werden durch Kombination der Verlängerungs-Sonde, die mit einem Polynukleotid hybridisiert ist, z.B. einer Target-Polynukleotidsequenz, die zwei Segmente wie oben beschrieben aufweist, mit einer Polydesoxynukleotid-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen zur Verlängerung der Verlängerungs-Sonde. Auf diese Weise wird die Verlängerungs-Sonde entlang des einzelsträngigen Polynukleotids verlängert, um einen Doppelstrang zu bilden, der die verlängerte Verlängerungs-Sonde umfaßt. Eine Verlängerung in dieser Weise ergibt die erforderliche Übereinstimmung der beiden Stränge, so daß die nachfolgende Amplifizierung der verlängerten Verlängerungs-Sonde oder des verlängerten Polydesoxynukleotid-Primers einen genauen Nachweis des interessierenden Targets liefert.
Mittel zur Verlängerung eines Primers -- Ein Polydesoxynukleotid- Primer mit einer verlängerbaren 3'-Ende kann verlängert werden durch Kombination des Primers, der mit der verlängerten Verlängerungs- Sonde oder dem verlängerten Primer hybridisiert ist, mit einer Polydesoxynukleotid-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen zur Verlängerung des Primers. Auf diese Weise wird der Primer entlang der verlängerten Verlängerungs-Sonde oder des verlängerten Primers verlängert, um einen Doppelstrang zu bilden, welcher den verlängerten Primer umfaßt. Eine Verlängerung in dieser Weise ergibt die erforderliche Übereinstimmung zwischen dem verlängerten Primer und dem Polynukleotid, so daß ein genauer Nachweis von Target-Analyten erzielt werden kann.
Das Verfahren ist schematisch im Schema 1 wie folgt dargestellt: Schema 1 Verlängerungs-Sonde Target
EP1 der Verlängerungs-Sonde hybridisiert mit S1 des Polynukleotids. EP2 ist mit S2 homolog. Die Verlängerungs-Sonde wird entlang A verlängert, um eine verlängerte Verlängerungs-Sonde B zu erzeugen, welche die zu S2 komplementäre Sequenz S'2 enthält. B enthält nun EP2 und S'2, welche miteinander hybridisierbar sind.
Das Verfahren findet bei der Einzelprimer-Amplifizierung Verwendung. Dafür wird eine Kombination bereitgestellt, welche einen Polydesoxynukleotid-Primer umfaßt, der imstande ist, mindestens an seinem 3'-Ende mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz unter Bedingungen zu hybridisieren, unter denen (1) die verlängerte Verlängerungs-Sonde einzelsträngig gemacht wird, (2) der Polydesoxynukleotid-Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang, der verlängerten Primer umfaßt, zu bilden, (3) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (4) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt. Die Schritte (3) und (4) werden wiederholt. Vorzugsweise ist die Konzentration der Verlängerungs- Sonde wesentlich geringer als diejenige des Polydesoxynukleotid- Primers. "Wesentlich geringer" bedeutet, daß die Konzentration der Verlängerungs-Sonde im Verhältnis zum Primer derart ist, daß eher eine Einzelprimer-Amplifizierung wie hier beschrieben als eine PCR- Amplifizierung geschieht. Vorzugsweise beträgt die Konzentration der Verlängerungs-Sonde weniger als 1% derjenigen des Polydesoxynukleotid-Primers.
Der Einsatz des vorliegenden Verfahrens bei der Einzelprimer- Amplifizierung ist im Schema 2 wie folgt dargestellt: Schema 2 Primer P verlängerte Verlängerungs-Sonde
Der Polydesoxynukleotid-Primer P weist an seinem 3'-Ende eine Sequenz (PS) auf, die mit S'2, welche komplementär zu S2 ist, hybridisiert. P kann auch eine Markierung W umfassen. P wird mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde B (welche von ihrem Doppelstrang dissoziiert wurde) hybridisiert und daran entlang verlängert, um verlängerten Primer C zu bilden, der die Sequenzen S"2 und S'2 umfaßt. B und C werden dissoziiert und P hybridisiert mit S'2 von C und S'2 von B und P wird entlang B und C verlängert, um C bzw. C' zu ergeben. C' weist die Sequenzen S'2 und S"2 auf. Die Doppelstränge werden dissoziiert und P wird mit C' und C hybridisiert und daran entlang verlängert, um C' und C' zu ergeben. Ferner resultiert die Wiederholung in mehrfachen Kopien von C', welche aufgrund der Anwesenheit der Markierung W nachgewiesen werden können. Die Kopien von B und C werden aufgrund der wesentlich geringeren Konzentration der Verlängerungs-Sonde gegenüber derjenigen des Polydesoxynukleotid- Primers minimiert. Als Ergebnis geschieht eher eine Einzelprimer- Amplifizierung statt einer PCR-Amplifizierung. Es wird das Produkt der Einzelprimer-Amplifizierung nachgewiesen, nicht das Produkt der PCR-Amplifizierung.
Werden die Verlängerungs-Sonde und der Primer beide mit hohen Konzentrationen eingesetzt, so besteht die Möglichkeit, eine PCR- Amplifizierung des Targets zu erzeugen, das PCR-Produkt wird sich jedoch gewöhnlich von dem Einzelprimer-Amplifizierungsprodukt unterscheiden und seine Bildung wird die Menge des Einzelprimer- Amplifizierungsprodukts reduzieren. Ferner ergibt die Einzelprimer-Amplifizierung durch die Reduktion der Zahl der Primer, welche verunreinigende DNA statistisch "primen" können, eine selektivere Amplifizierung des Targets als PCR. Dies wurde nachgewiesen durch direkten Vergleich amplifizierter DNA-Produkte der Einzelprimer-Amplifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung und PCR über denselben Bereich von Target-DNA. Unter identischen Reaktionsbedingungen ergab PCR ein höheres Verhältnis irrelevanter Amplifizierungsprodukte zu amplifizierter Target-DNA als bei der Einzelprimer-Amplifizierung der vorliegenden Erfindung erhalten wurde. Der Einsatz einer wesentlich geringeren Konzentration an Verlängerungs-Sonde ergibt auch Materialersparnis und verringerte Kosten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind. Es wird eine Kombination bereitgestellt, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, welche umfaßt ein Polynukleotid mit zwei nicht aneinander angrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens 10 Nukleotide lang ist, eine Verlängerungs-Sonde, die zwei Desoxynukleotidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs- Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Nukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu dem Polynukleotid ist, einen Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mindestens an seinem 3'-Ende mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, DNA-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphate. Die Kombination wird bereitgestellt unter Bedingungen, unter denen (a) die Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (b) die verlängerte Verlängerungs- Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (c) der Polydesoxynukleotid-Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen zweiten Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (d) der verlängerte Primer von dem zweiten Doppelstrang dissoziiert wird, und (e) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (d) und (e) mindestens dreimal wiederholt werden. Die Konzentration der Verlängerungs- Sonde beträgt weniger als 1% derjenigen des Polynukleotid-Primers. Vorzugsweise hybridisiert eine Sequenz von mindestens 15 Nukleotiden der Verlängerungs-Sonde mit S1. Geeigneterweise enthält der Polydesoxynukleotid-Primer auch eine Sequenz von 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise eine Sequenz von mindestens 15 Desoxynukleotiden, die imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Sequenz zu hybridisieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Target-Nukleotidsequenz in einem Medium, von dem angenommen wird, daß es die Target-Nukleotidsequenz enthält. Die Target-Nukleotidsequenz weist zwei nicht aneinander angrenzende, nicht komplementäre Nukleotidsequenzen S1 und S2 auf. S2 liegt 5' von S1 und ist mindestens 10 Nukleotide lang. Eine Kombination wird bereitgestellt, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, welche umfaßt das Medium, eine Verlängerungs- Sonde mit zwei Desoxynukleotidsequenzen, wobei die Sequenz am 3'- Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zur Target-Nukleotidsequenz ist, einen Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, DNA-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphate. Es werden Bedingungen gewählt, unter denen (1) die Verlängerungs- Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt. Die Schritte (4) und (5) werden wiederholt, und es wird eine Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers durchgeführt. Die Anwesenheit des verlängerten Primers zeigt die Anwesenheit der Target-Nukleotidsequenz an.
Vorzugsweise enthalten S1 und S2 jeweils 10 bis 100 Nukleotide. Die Methode ist anwendbar, wenn die Target-Nukleotidsequenz DNA oder RNA ist. In einem Aspekt wird der Polydesoxynukleotid-Primer mit einem Reporter-Molekül markiert. Der Polydesoxynukleotid-Primer kann eine andere Nukleotidsequenz enthalten als die Sequenz, welche mit der zu S2 komplementären Sequenz hybridisiert. Der verlängerte Primer kann nachgewiesen werden durch Prüfung auf ein Reporter-Molekül, das kovalent an eine Nukleotidsequenz gebunden ist, welche komplementär zu einem anderen Teil der Target-Nukleotidsequenz ist als S1 oder S2.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Polynukleotid-Analyten enthält. Ein Medium, das die Probe enthält, wird wie oben beschrieben behandelt, um aus dem Polynukleotid-Analyten, falls vorhanden, eine einzelsträngige Target-Nukleotidsequenz zu erzeugen. Die Target- Nukleotidsequenz weist zwei nicht aneinander angrenzende, nicht komplementäre Nukleotidsequenzen S1 und S2 auf, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist. Das Medium wird mit einer Verlängerungs-Sonde kombiniert, die zwei Desoxynukleotidsequenzen aufweist. Die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde ist mit S1 hybridisierbar. Die andere Desoxynukleotidsequenz ist homolog zu S2 und zur Target-Sequenz nicht komplementär. Ein Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, sowie Desoxynukleotid- Triphosphate und DNA-Matrizen-abhängige Polydesoxynukleotid- Polymerase werden ebenfalls kombiniert. Die Bedingungen werden so gewählt, daß (1) die Verlängerungs-Sonde mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Sequenz hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen zweiten Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt. Die Schritte (4) und (5) werden wiederholt und die Schritte (a) und (b) gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell durchgeführt. Dann wird eine Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers vorgenommen, dessen Anwesenheit die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten anzeigt. Die Schritte (4) und (5) werden mindestens dreimal wiederholt, vorzugsweise mindestens zehnmal; gewöhnlich ist es vorzuziehen, daß die Anzahl der Wiederholungen weniger als 30 beträgt. Im allgemeinen werden die Schritte (4) und (5) ausreichend oft wiederholt, um einen genauen Nachweis des Polynukleotid-Analyten zu ermöglichen. Ist der Polynukleotid-Analyt RNA, umfaßt das Medium auch reverse Transkriptase.
Bei der Durchführung des Verfahrens zur Bildung des einzelsträngigen Polydesoxynukleotids und der Amplifizierung wird ein wäßriges Medium eingesetzt werden. Es können auch andere polare Cosolventien eingesetzt werden, gewöhnlich sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1-6, häufiger 1-4, Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkohole, Ether und dgl. Gewöhnlich werden diese Cosolventien in weniger als etwa 70 Gew.-%, häufiger in weniger als etwa 30 Gew.-%, vorhanden sein.
Der pH-Wert des Mediums wird gewöhnlich im Bereich von etwa 4,5 bis 9,5, gewöhnlicher im Bereich von etwa 5,5-8,5, und vorzugsweise im Bereich von etwa 6-8 liegen. pH und Temperatur werden je nach Fall gewählt und variiert, um entweder eine gleichzeitige oder sequentielle Dissoziierung etwaiger intern hybridisierter Sequenzen, Hybridisierung der Verlängerungs-Sonde und des Polynukleotids und des Polydesoxynukleotid-Primers mit verlängerter Verlängerungs- Sonde oder verlängertem Primer, Verlängerung der Verlängerungs- Sonde und des Primers, Dissoziierung der verlängerten Sonde und des Primers, Hybridisierung des verlängerten Primers mit Primer, Verlängerung des so hybridisierten Primers und Dissoziierung des verlängerten Primers und Wiederholung der letzteren Schritte zu ermöglichen. In einigen Fällen wird ein Kompromiß zwischen diesen Gesichtspunkten gemacht werden, je nach dem ob die obigen Schritte sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Aufrechterhaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer eingesetzt werden.
Beispielhafte Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. Der speziell eingesetzte Puffer ist nicht kritisch in dieser Erfindung, es kann jedoch bei einzelnen Verfahren ein Puffer gegenüber anderen bevorzugt sein.
Normalerweise werden zur Durchführung des Verfahrens mäßige Temperaturen eingesetzt. Normalerweise wird bei der Durchführung des Verfahrens das Medium zyklisch zwischen zwei oder drei Temperaturen geführt. Die Temperaturen für das Verfahren werden gewöhnlich im Bereich von etwa 10 bis 100ºC, gewöhnlicher etwa 40 bis 98ºC, vorzugsweise 50 bis 97ºC, liegen. Die exakten Temperaturen können in Abhängigkeit von der Salzkonzentration, dem pH, den verwendeten Lösungsmitteln, Kettenlänge und Zusammensetzung der Target-Polynukleotidsequenz und des Primers variiert werden. Für die Verlängerungsschritte können relativ niedrige Temperaturen von etwa bis 65ºC eingesetzt werden, während Denaturierung und Hybridisierung bei einer Temperatur von etwa 50 bis 100ºC durchgeführt werden können.
Die Zeitspanne zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gewöhnlich lange genug sein, um die gewünschte Anzahl von Kopien des verlängerten Primers oder einer dazu komplementären Sequenz zu zielen. Dies hängt wiederum von dem Zweck ab, zu dem die Amplifizierung durchgeführt wird, wie z.B. ein Assay für einen Polynukleotid-Analyten. Im allgemeinen wird die Zeitspanne zur Durchführung des Verfahrens etwa 1 bis 10 Minuten pro Zyklus betragen und es kann jede Anzahl von Zyklen von 1 bis zu 200 oder mehr, gewöhnlich 1 bis 80, häufig 20-80, eingesetzt werden. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird es gewöhnlich wünschenswert sein, die Zeitspanne und die Anzahl der Zyklen zu minimieren. Im allgemeinen kann die Zeitspanne für einen gegebenen Amplifizierungsgrad verkürzt werden, beispielsweise durch die Wahl von Konzentrationen an Nukleosid-Triphosphaten, welche ausreichen, um die Polynukleotid- Polymerase zu sättigen, und durch Erhöhung der Konzentrationen an Polynukleotid-Polymerase und Polynukleotid-Primer. Gewöhnlich wird die Zeitspanne zur Durchführung des Verfahrens etwa 5 bis 200 Minuten betragen. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird es gewöhnlich wünschenswert sein, die Zeitspanne zu minimieren.
Die obigen Bedingungen können auch zur Bildung einer Target-Polynukleotidsequenz aus einem Polynukleotid-Analyten gewählt werden.
Die Menge des zu kopierenden einzelsträngigen Polydesoxynukleotids oder der zu kopierenden Target-Polynukleotidsequenz kann nur ein bis zwei Moleküle in einer Probe tragen, wird jedoch gewöhnlich von etwa 10² bis 10¹&sup0;, noch üblicher von etwa 10³ bis 10&sup8;, Molekülen in einer Probe variieren. Die Menge des Polydesoxynukleotid-Primers wird gewöhnlich mindestens so groß wie die Anzahl der gewünschten Kopien sein, und wird gewöhnlich 10&supmin;¹³ bis 10&supmin;&sup8; Mol pro Probe betragen, wobei die Probe 10-1000 µl aufweist. Gewöhnlich wird der Primer mit mindestens 10&supmin;&sup9; M, vorzugsweise 10&supmin;&sup7; M, noch bevorzugter mit mindestens 10&supmin;&sup6; M anwesend sein. Vorzugsweise ist die Konzentration des Polynukleotid-Primers wesentlich größer, vorzugsweise mindestens 100 Mal größer, als die Konzentration des einzelsträngigen Polynukleotids.
Die Konzentration der Verlängerungs-Sonde sollte, wie oben erwähnt, wesentlich geringer sein als diejenige des Primers. Vorzugsweise beträgt die Konzentration der Verlängerungs-Sonde weniger als 1% derjenigen des Primers, noch bevorzugter weniger als 0,1% derjenigen des Primers, gewöhnlich wird die Konzentration der Verlängerungs- Sonde weniger als 1 nanomolar, häufig weniger als 0,1 nanomolar (nM) sein, während die Primer-Konzentration gewöhnlich größer als 10 nanomolar, gewöhnlich mindestens 100 nanomolar sein wird. Vorzugsweise ist die Konzentration am Primer größer als 100 nM, während diejenige der Verlängerungs-Sonde weniger als 1 nM beträgt.
Die Endkonzentration jedes der Reagenzien wird normalerweise empirisch bestimmt werden, um die Anzahl der Kopien des verlängerten Primers zu optimieren.
Die Konzentration der Desoxynukleosid-Triphosphate im Medium kann in großem Umfang variieren; vorzugsweise sind diese Reagenzien im Überschuß vorhanden. Die Desoxynukleosid-Triphosphate werden gewöhnlich mit 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;² M, vorzugsweise 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;³ M vorhanden sein.
Die Konzentration der Matrizen-abhängigen Polynukleotid-Polymerase wird gewöhnlich empirisch bestimmt werden. Vorzugsweise wird eine Konzentration eingesetzt, die genügt, daß eine weitere Erhöhung der Konzentration die Zeit für die Amplifizierung nicht mehr als um das 5-Fache, vorzugsweise 2-Fache, verringert. Der in erster Linie limitierende Faktor sind gewöhnlich die Kosten des Reagenzes.
Die Reihenfolge beim Kombinieren der verschiedenen Reagenzien zur Bildung der Kombination kann variieren. Gewöhnlich wird die Target- Nukleotidsequenz aus einer Probe erhalten, die eine derartige Sequenz oder einen Polynukleotid-Analyten enthält, der zur Gewinnung einer solchen Sequenz behandelt worden ist. Gewöhnlich werden die Target- Polynukleotid-Sequenz und die Verlängerungs-Sonde mit einer vorbereiteten Kombination von Polynukleotid-Primer, Desoxynukleosid- Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polydesoxynukleotid-Polymerase kombiniert. Jedoch kann sowohl eine gleichzeitige Zugabe aller obigen als auch eine stufenweise oder sequentielle Reihenfolge der Zugabe angewandt werden.
Die Konzentration und Zugabereihenfolge der Reagenzien und die Bedingungen für das Verfahren werden gewöhnlich durch den Wunsch bestimmt, die Kopienzahl des verlängerten Primers und die Geschwindigkeit, mit der solche Kopien gebildet werden, zu maximieren. Im allgemeinen ist es wünschenswert, die Kopienzahl des verlängerten Primers mindestens um einen Faktor von 10², vorzugsweise einen Faktor von 10&sup4;, noch bevorzugter 10&sup6; oder mehr, zu erhöhen.
Die Kombinationsreihenfolge der verschiedenen Reagenzien zur Bildung der oben angegebenen Kombinationen zur Bestimmung eines Polynukleotid-Analyten kann variieren und kann gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell sein. Im allgemeinen wird eine Probe, die einen Polynukleotid-Analyten enthält, erhalten und behandelt, um eine Target-Nukleotidsequenz zu ergeben. Die Target-Polydesoxynukleotidsequenz kann mit der Verlängerungs-Sonde kombiniert und die beiden hybridisiert werden. Als nächstes wird die Verlängerungs- Sonde entlang der Target-Nukleotidsequenz in Gegenwart von Desoxynukleotid-Triphosphaten und DNA-Polymerase verlängert. Eine vorbereitete Kombination von Desoxynukleosid-Triphosphaten und DNA- Polymerase kann verwendet werden. Die Kombination kann auch einen Polydesoxynukleotid-Primer einschließen. Es kann sowohl eine gleichzeitige Zugabe der obigen als auch eine stufenweise oder sequentielle Reihenfolge der Zugabe angewandt werden. Die Konzentration und Zugabereihenfolge von Reagenzien und die Bedingungen für das Verfahren werden allgemein durch die oben genannten Gesichtspunkte bestimmt. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Anwendung für den Nachweis eines Polynukleotid-Analyten, können die Überlegungen hinsichtlich Medien, pH, Temperatur und Zeiten wie oben beschrieben sein.
Die Konzentration des Target-Polynukleotid-Analyten kann so gering wie möglicherweise ein Molekül, vorzugsweise mindestens 10&supmin;²¹ M, in einer Probe sein, wird jedoch gewöhnlich von etwa 10&supmin;¹&sup0; M bis 10&supmin;¹&sup9; M, gewöhnlicher von etwa 10&supmin;¹&sup4; bis 10&supmin;¹&sup9; M, variieren.
Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Polynukleotid-Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den interessierenden Bereich hinweg zu optimieren. Die Konzentration der anderen Reagenzien in einem Assay wird gewöhnlich nach denselben Prinzipien bestimmt wie oben für das Amplifizierungsverfahren dargelegt. Die Hauptüberlegung ist, daß eine ausreichende Kopienzahl an verlängertem Primer im Verhältnis zur Polynukleotid-Analyten-Sequenz erzeugt wird, sodaß solche Kopien leicht nachgewiesen werden können und eine genaue Bestimmung des Polynukleotid-Analyten ergeben.
Die Kopien des verlängerten Primers können auf vielfache Weise nachgewiesen werden. Beispielsweise können im vorliegenden Verfahren die Moleküle des Polydesoxynukleotid-Primers mit einem Liganden W' markiert werden und W' kann dann nachgewiesen werden.
In einem weiteren Beispiel kann die Markierung ein kleines organisches Molekül, eine Polynukleotidsequenz, ein Protein oder dgl. sein. Nach der Amplifizierung wird eine Mischung von Doppelsträngen mit einer Markierung an einem Ende erhalten. Doppelstränge können nachgewiesen werden, indem das Molekül zur Bindung an eine Oberfläche veranlaßt wird, an die ein Rezeptor für den Liganden gebunden ist. Nach der Entfernung von ungebundenem Material wird der Träger auf die Anwesenheit einer nachweisbaren Markierung überprüft. Deren Anwesenheit zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in der Probe an.
Bei einer weiteren Vorgehensweise können Sequenzen selektioniert werden, da ein synthetischer oder natürlicher Rezeptor existiert, welcher an die hybridisierten Sequenzen bindet. Die Sequenzen können eingeführt werden, indem sie zwischen EP1 und EP2 der oben beschriebenen Verlängerungs-Sonde eingeschlossen werden. Alternativ können sie als Markierungen am 5'-Ende eines Abschnitts der Polydesoxynukleotid-Primer-Moleküle eingeführt werden. Der Tetracyclin- Repressor ist ein derartiger Rezeptor. Dieses Protein bindet an den Tetracyclin-Operator und die hybridisierten Sequenzen können ausgewählt werden, um einen Teil dieses Operators oder den ganzen Operator zu umfassen. Der Repressor wird an einen festen Träger gebunden und zur Absorption und Konzentration des Amplifizierungsprodukts aus der Amplifizierungsreaktionslösung eingesetzt. Das gebundene Produkt kann dann durch Hybridisierung einer Nukleinsäure- Sonde an die amplifizierte Target-Sequenz nachgewisen werden, wenn die Sonde an eine nachweisbare Markierung gebunden ist. Dann kann die Markierung durch Veränderungen in den physikalischen Eigenschaften des Adsorbens, z.B. elektrische Eigenschaften, optische Eigenschaften, akustische Wellenmodulation und dgl. nachgewiesen werden.
Es können andere Operator-Repressor-Paare eingesetzt werden, einschließlich z.B. der lac-Repressor und Operator, welche als Ligand und Rezeptor zum Einfangen von DNA-Doppelsträngen verwendet wurden, und der Tryptophan-Repressor und Operator.
Bei einer weiteren Vorgehensweise kann Bromdesoxyuridin in einen Teil der Polydesoxynukleotid-Primer-Moleküle inkorporiert werden und Antikörper gegen Bromdesoxyuridin eingesetzt werden. Der Nachweis der gebundenen Sequenz kann nach irgendeinem der obigen Verfahren durchgeführt werden.
Bei einem bevorzugten Weg zum Nachweis der Kopien des verlängerten Primers werden die Kopien gleichzeitig oder sequentiell denaturiert durch Erwärmen oder Verwendung denaturierender Lösungsmittel und gelöster Stoffe und dazu veranlaßt, an einen Träger z.B. mittels eines der obigen Verfahren zu binden. Der Träger wird dann mit einer Sonde in Kontakt gebracht, die eine Nukleinsäuresequenz und eine Markierung oder Rezeptor-Bindungsstelle umfaßt. Die Nukleinsäuresequenz ist mindestens zu dem Abschnitt der Kopien des verlängerten Primers komplementär. Die Anwesenheit der Kopie des verlängerten Primers wird dann durch die Anwesenheit der Markierung oder Rezeptor- Bindungsstelle auf dem Träger angezeigt.
Andere Assay-Formate und Nachweis-Formate sind offenbart in den US-Patentanmeldungen mit den Serien-Nrn. 07/229,282 und 07/399,795, eingereicht am 19. Januar 1989 bzw. 29. August 1989 (EP 0379369), welche hierin durch die Bezugnahme mit eingeschlossen sind.
Es kann jedes Standardverfahren zum spezifischen Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden.
Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von Nukleinsäure-Sonden. Dieses Verfahren beinhaltet allgemein die Immobilisierung der Target-Nukleinsäure auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran. Nachdem die Target-Nukleinsäure auf dem Träger fixiert ist, wird der Träger mit einer geeignet markierten Sonden-Nukleinsäure etwa 10 Minuten bis 48 Stunden lang in Kontakt gebracht. Nach der obigen Zeitspanne wird der feste Träger mehrmals gewaschen, um die ungebundene Sonde zu entfernen, und das hybridisierte Material durch Autoradiographie oder spektroskopische Verfahren nachgewiesen.
Ein Verfahren unter Einsatz von Sonden ist in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 773,386, eingereicht am 6. September 1985, (europäische Patentanmeldung Nr. 86 306 860.7, Veröffentlichungs-Nr. 0 224 995) beschrieben, deren Offenbarung hier durch die Bezugnahme eingeschlossen ist. Das Verfahren umfaßt das Kombinieren der Probe und ersten und zweiten Polynukleotid- Reagenzien, die zu dem Nukleinsäurefragment komplementär sind, in einem Assay-Medium. Jedes der ersten und zweiten Reagenzien hybridisiert mit einem anderen Bereich des Nukleinsäurefragments. Das erste Reagenz enthält Mittel, um das erste Reagenz auf nicht kovalente Weise polymerisierbar zu machen. Das zweite Reagenz enthält Mittel, um das zweite Reagenz nachweisbar zu machen. Die Probe und die ersten und zweiten Reagenzien werden im Assay-Medium unter Bedingungen zur Poly-merisation des ersten Reagenzes inkubiert, wobei das zweite Reagenz an das polymerisierte erste Reagenz nur gebunden wird, wenn das DNA-Fragment in der Probe vorhanden ist. Dann wird eine Bestimmung durchgeführt, ob das zweite Reagenz an das polymerisierte erste Reagenz gebunden worden ist.
Zur Trennung der Kopien des verlängerten Primers von anderen Komponenten in einer Assay-Mischung, die eine Probe enthält, kann es wünschenswert sein, und in manchen Fällen in der Tat vorzuziehen, daß das Polynukleotid oder der Polydesoxynukleotid-Primer Mittel zur Immobilisierung der Sequenz aufweist oder imstande ist, diese aufzuweisen. Im allgemeinen beinhaltet dieses Mittel zur Immobilisierung einen Träger. Die fragliche Sequenz kann behandelt werden, um die Sequenz vor der Verwendung dieser Sequenz im erfindungsgemäßen Verfahren an einen Träger zu binden. Zur Bindung von Nukleotidsequenzen an feste Träger sind zahlreiche Verfahren bekannt. Siehe zum Beispiel T. Goldkorn et al., Nucleic Acids Research (1986) 14: 9171-9191 und die darin enthaltenen Referenzen. Im allgemeinen beinhalten die Verfahren zur Verknüpfung der Nukleotidsequenz mit Trägern chemische Modifizierungen einiger Nukleotide in der Sequenz, wodurch die Sequenz dann mit dem Träger verknüpft werden kann. Vorzugsweise wird die Bindung zwischen dem Träger und der Nukleotidsequenz kovalent sein, noch bevorzugter eine Verknüpfungsgruppe zwischen der Nukleotidsequenz und dem Träger beinhalten. Beispielsweise kann der Träger behandelt werden, um Maleimidgruppen einzuführen, und die Nukleotidsequenz kann behandelt werden, um eine Thiolgruppe einzuführen. Die Thiolgruppe kann mit dem aktivierten Olefin der Maleimidgruppe reagieren und auf solche Weise kann die Nukleotidsequenz kovalent an den Träger gebunden werden. Beispiele anderer derartiger Verknüpfungsgruppen sind Cellulose, derivatisiert mit Diazobenzyloxymethylgruppen, wie von Noyes, B. E. und Stark, G.R., Cell, 5, 301 (1975) und Alwine, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74, 5350 (1977) beschrieben, und mit o-Aminophenylthioether derivatisierte Cellulose, wie z.B. von Seed, B., Nucleic Acids Res., 10, 1799 (1982) beschrieben.
Ist die Nukleotidsequenz ursprünglich nicht an einen Träger gebunden, kann es wünschenswert sein, daß eine der beiden Sequenzen zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verfahrens der Erfindung, vorzugsweise vor dem Nachweis der Kopien des verlängerten Primers, an einen Träger gebunden wird. Dementsprechend müssen der Träger und eine der Nukleotidsequenzen reaktive Gruppen enthalten, welche eine Verknüpfung zwischen dem Träger und der Nukleotidsequenz ergeben können. Die Natur der reaktiven Gruppen wird derart sein, daß sie mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kompatibel ist.
Ein solches System ist das oben beschriebene, worin der Träger Maleimidgruppen enthalten und die Nukleotidsequenz eine Thiogruppe enthalten würde. In einer weiteren Ausführungsform können die Nukleotidsequenz und der Träger komplementäre spezifische Bindungspaar-Mitglieder wie Biotin-Avidin und dgl. enthalten. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Lösung durchgeführt und zur geeigneten Zeit der Träger eingeführt werden, an den die komplementären sbp-Mitglieder binden werden. Nachdem der Träger zur Entfernung von ungebundenem Material gewaschen worden ist, können weitere Reaktionen oder Bestimmungen durchgeführt werden.
Andere Beispiele solcher Systeme sind Repressor-Operator-Wechselwirkungen, wobei eine der Nukleotidsequenzen durch deren Sequenzspezifische Wechselwirkung mit einem spezifischen Repressor oder Modulator-Protein, der oder das an der festen Oberfläche immobilisiert ist, auf der festen Oberfläche eingefangen wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform der Einfangphase besteht darin, daß in einigen Fällen die Freisetzung der Operator-DNA aus dem Repressor durch Behandlung des Komplexes mit einem "Inducer"-Molekül erreicht werden kann. Beispielsweise kann der Tetracyclin-Repressor auf einer festen Oberfläche immobilisiert sein, so daß eine Operator-Sequenz, die auf der einen oder anderen der Nukleotidsequenzen vorhanden ist, spezifisch eingefangen und zurückgehalten wird, wenn die Lösung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird. Die Oberfläche kann dann zur Eliminierung etwaiger nicht-spezifischer Bindungen gewaschen werden und schließlich kann das Operator-enthaltende Nukleotid von der Oberfläche freigesetzt werden durch Kontaktieren des an die Oberfläche gebundenen Repressor-Operator-Komplexes mit einem Inducer- Molekül (Tetracyclin oder eines seiner aktiven Analoga in diesem Fall).
Das Inducer-Molekül kann der "natürliche Inducer" in dem Sinn sein, daß es strukturell identisch ist mit dem Molekül in der Natur, welches die Dissoziation des biologischen/regulatorischen Repressor- Operator-Komplexes verursacht, oder es kann ein synthetisches Analogon des natürlichen Inducers mit ähnlicher oder erhöhter Bindungs- und Komplex-Dissoziierungs-Aktivität sein. Beispiele des obigen umfassen die Tetracyclin-Repressor-Operator-Wechselwirkung und deren Dissoziation durch Tetracyclin wie von Hillen, W., et al., J. Mol. Biol., 169, 707-721 (1983) und Klock, G., et al., J. Bact., 161, 326-332 (1985) beschrieben.
Falls die Nukleotidsequenz kovalent mit dem Träger verknüpft ist, kann es wünschenswert sein, die verknüpfte Sequenz von dem Träger zu entfernen, beispielsweise, um die Sequenz zu amplifizieren oder zu klonieren. In dieser Situation ist es wünschenswert, eine spaltbare Gruppe zwischen der Nukleotidsequenz und dem Träger einzuführen. Beispiele solcher spaltbaren Gruppen sind Pyrophosphat- Verknüpfungen, Disulfid-Verknüpfungen und Restriktionsenzym- Spaltungsstellen.
Der Träger kann von dem Medium entfernt werden, von ungebundenem Material freigewaschen, und dann auf die Anwesenheit von Kopien des verlängerten Primers überprüft werden, beispielsweise durch den Nachweis der Anwesenheit einer Markierung oder einer Reporter- Gruppe. Im allgemeinen beinhaltet diese Prüfung das Kontaktieren des Trägers mit den verbleibenden Mitgliedern eines signalerzeugenden Systems, um ein Signal mit Bezug auf die Anwesenheit der Target- Nukleotidsequenz in der Probe zu erzeugen.
Der Nachweis des Signals wird von der Natur des eingesetzten signalerzeugenden Systems abhängen. Ist die Markierung oder Reporter- Gruppe ein Enzym, würden weitere Mitglieder des signalerzeugenden Systems Enzym-Substrate usw. einschließen. Der Produkt der Enzym- Reaktion ist vorzugsweise ein lumineszierendes Produkt oder ein fluoreszierender oder nicht-fluoreszierender Farbstoff, das oder der jeweils spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann, oder ein Produkt, das durch andere spektrometrische oder elektrometrische Mittel nachgewiesen werden kann. Ist die Markierung ein fluoreszierendes Molekül, kann das Medium bestrahlt und die Fluoreszenz bestimmt werden. Ist die Markierung eine radioaktive Gruppe, so kann das Medium gezählt werden, um die radioaktiven Impulse zu bestimmen.
Zur Herstellung eines Polydesoxynukleotid-Primers, einer Verlängerungs-Sonde oder eines anderen Polynukleotids können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Sie können durch biologische Synthese oder durch chemische Synthese erhalten werden. Für kurze Sequenzen (bis zu etwa 100 Nukleotiden) wird eine chemische Synthese im Vergleich zur biologischen Synthese häufig wirtschaftlicher sein. Über die Wirtschaftlichkeit hinaus bietet die chemische Synthese ein bequemes Mittel zur Inkorporierung von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und/oder modifizierten Basen während des Syntheseschritts. Ferner ist die chemische Synthese sehr flexibel hinsichtlich der Wahl der Länge und des Bereichs der Target-Polynukleotidbindenden Sequenz. Der Polydesoxynukleotid-Primer und die Verlängerungs-Sonde können nach Standardverfahren synthetisiert werden, wie z.B. diejenigen, welche in handelsüblichen automatisierten Nukleinsäure-Synthesizern angewandt werden. Die chemische Synthese von DNA auf einem geeignet modifizierten Glas oder Harz kann in DNA resultieren, die kovalent mit der Oberfläche verknüpft ist. Dies kann Vorteile beim Waschen und bei der Probenhandhabung bieten. Für längere Sequenzen können Standard-Replikationsverfahren, die in der Molekularbiologie eingesetzt werden, verwendet werden, so z.B. die Verwendung von M13 für einzelsträngige DNA, wie von J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101, 20-78, beschrieben.
Andere Verfahren der Oligonukleotid-Synthese umfassen Phosphortriester- und Phosphordiester-Verfahren (Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90) und Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1862) sowie die Phosphoramidat-Technik, Caruthers, M. H., et al., "Methods in Enzymology", Bd. 154, S. 287-314 (1988) und andere, die in "Synthesis and Applications of DNA and RNA," S.A. Narang, Hrsg., Academic Press, New York, 1987, und den darin enthaltenen Referenzen beschrieben werden.
In einigen Fällen wird das 3'-Ende eines Polynukleotids modifiziert werden, um die Reaktion mit Matrizen-abhängiger DNA-Polymerase zu verhindern oder um eine bindende Sequenz anzuhängen. Das 3'-Ende kann beispielsweise modifiziert werden durch Ligierung eines Didesoxynukleotids oder eines Ribonukleotids, gefolgt von Oxidation der Ribose mit Periodat, gefolgt von reduktiver Aminierung des resultierenden Dialdehyds mit Borhydrid und einem sperrigen Amin wie Aminodextran.
Der Polydesoxynukleotid-Primer, die Verlängerungs-Sonde oder andere Polynukleotide können nach automatisierten Standardverfahren hergestellt werden.
Aus Gründen der Bequemlichkeit können die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagenzien in einem Kit in abgepackter Kombination mit vorherbestimmten Mengen an Reagenzien zur Verwendung im vorliegenden Verfahren bereitgestellt werden. Bei dem Nachweis eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe kann ein für das vorliegende Verfahren geeigneter Kit in abgepackter Kombination mit anderen Reagenzien umfassen Reagenzien zur Bildung einer Target- Nukleotidsequenz aus einem Polynukleotid-Analyten, eine Verlängerungs-Sonde, die an ihrem 3'-Ende eine mit einer ersten Sequenz in einer Target-Nukleotidsequenz hybridisierbare Sequenz aufweist und eine Sequenz aufweist, die homolog zu einer zweiten Sequenz der Target-Nukleotidsequenz ist, wobei die zweite Sequenz 5' von der ersten Sequenz liegt und nicht daran angrenzt, und einen Polydesoxynukleotid-Primer, wobei der letztere markiert werden kann oder mit Gruppen versehen, um die Sequenz markiert oder an einen Träger gebunden zu machen.
Zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien wird der Kit einen Polydesoxynukleotid-Primer enthalten. Jeder der obigen Kits kann ferner in abgepackter Kombination Desoxynukleosid- Triphosphate wie Desoxyadenosin-Triphosphat (dATP), Desoxyguanosintriphosphat (dGTP), Desoxycytidin-Triphosphat (dCTP) und Desoxythymidin-Triphosphat (dTTP) umfassen. Der Kit kann ferner eine Polydesoxynukleotid-Polymerase und Mitglieder eines signalerzeugenden Systems umfassen und auch verschiedene gepufferte Medien, von denen einige eines oder mehrere der obigen Reagenzien enthalten können.
Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits können in großem Umfang variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien bereitzustellen, welche die Reaktionen, die während des vorliegenden Verfahrens ablaufen müssen, im wesentlichen zu optimieren und um ferner die Empfindlichkeit des Assays im wesentlichen zu optimieren. Unter geeigneten Bedingungen können eines oder mehrere der Reagenzien im Kit als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, einschließlich Trägerstoffe, bereitgestellt werden, welches nach Auflösung eine Reagenzlösung mit den geeigneten Konzentrationen zur Durchführung eines Verfahrens oder Assays gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt. Jedes Reagenz kann in separaten Behältern abgepackt sein oder einige Reagenzien können in einem Behälter kombiniert sein, wenn es Kreuzreaktivität und Lagerungsfähigkeit erlauben.

BEISPIELE

Die Erfindung wird durch die folgenden erläuternden Beispiele weiter dargestellt. Die Temperaturen sind in Grad Celsius (ºC) und Teile und Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, soweit nicht anders angegeben.

BEISPIEL

Die Bildung und Amplifizierung eines "Stamm-Schleife"-Moleküls wurde durchgeführt unter Verwendung von 0,1 Picomol einzelsträngigem M13mp19 (Target-DNA, Bethesda Research Laboratories (BRL)) in einer 100 Mikroliter-Reaktion, enthaltend 10 mM Tris-Cl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine und 200 µM Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs). In Anwesenheit von 1 µm Einzelprimer-Amplifizierungs(SPA)- Primer 2 (Polydesoxynukleotid-Primer) und variierenden Mengen der Verlängerungs-Sonde 1 (1, 0,5, 0,1, 0,01, und 0,001 µM) wurde die obige Mischung 5 Minuten lang auf 95ºC erwärmt und 15 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Dies erlaubte der Verlängerungs- Sonde die Verschmelzung mit Target-DNA. Tag-Polymerase (Stratagene) wurde zugegeben (5 Einheiten) und die Temperatur wie folgt zyklisch geführt: 90ºC - 30 Sekunden, 55ºC - 60 Sekunden, 72ºC - 90 Sekunden. Dieses Temperaturprofil wurde 30 Mal wiederholt. Derselbe Abschnitt des Target-Moleküls (weniger als 135 Basen) wurde durch PCR unter identischen Bedingungen unter Verwendung einer Konzentration von 1,0 µm Primer 4 amplifiziert. Die Konzentrationen des Primers 3 waren identisch mit denjenigen der Verlängerungs-Sonde, um einen direkten Vergleich zu erlauben. Die erwartete Größe der Amplifizierungsprodukte für SPA und PCR betrugen 1015 bzw. 880 Basenpaare. Aliquots (5 Mikroliter), die nach 0, 10, 20 und 30 Zyklen sowohl aus den SPA- als auch den PCR-Reaktionsmischungen entnommen worden waren, wurden auf einem 1%-igen Agarosegel elektrophoresiert und mit Ethidiumbromid angefärbt. Auf der Basis der Mobilitäten von Molekulargewichtsstandards erschien eine einzelne Bande von etwa 1015 Basenpaaren nach 10, 20 und 30 Zyklen SPA bei jeder Konzentration der Verlängungs- Sonde. Die Prüfung des PCR-Produkts bzw. der PCR-Produkte zeigte eine Bande von etwa 880 Basenpaaren sowie die Bildung von zusätzlichen Fragmenten mit hohem Molekulargewicht bei fortgesetzter Zyklisierung. Bei der geringsten Konzentration des Primers 3 wurde ein PCR- Produkt nach 10 oder 20 Cyclen nicht nachgewiesen, siehe Tabelle II).
Die Target-Konzentration wurde auf 10 Attomol/100 Mikroliter- Reaktion verringert und unter Einsatz von SPA oder PCR amplifiziert. Individuelle Reaktionskomponenten sowie Zeit- und Temperatur- Zyklisierungsparameter, waren wie oben beschrieben. SPA-Primer 2 und PCR-Primer 4 blieben 1,0 µM in Gegenwart von 0,1, 0,01 oder 0,001 µm der Verlängerungs-Sonde 1 oder des PCR-Primers 3. Die Reaktionsansätze wurden 5 Minuten lang auf 95ºC erwärmt und 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Aliquots (5 Mikroliter), die nach 0, 15 und 13 Zyklen genommen worden waren, wurden auf einem 0,8%-igen Agarosegel elektrophoresiert und wie beschrieben angefärbt. Eine einzelne Bande von etwa 1015 Basenpaaren erschien nach 30 Zyklen SPA bei jeder Konzentration an Verlängerungs-Sonde. Die PCR-Reaktionen zeigten eine Bande von etwa 880 Basenpaaren nur bei der höchsten Konzentration an Primer 3 (0,1 µM) nach 30 Zyklen. Bei niedrigeren Konzentrationen an Primer 3 wurde nach 30 Temperatur-Zyklen kein PCR- Produkt nachgewiesen (siehe Tabelle III). TABELLE II Vergleich von SPA und PCR bei 0,1 Picomol Target
(*) zeigt mehr als eine Bande an und/oder einen Schmier.
(#) zeigt eine sehr schwache beobachtete Bande an. TABELLE III Vergleich von SPA und PCR bei 0,1 Attomol Target

1: Verlängerungs-Sonde (56 b):

Die 31 3'-Basen hybridisieren mit Position 1702 bis 1732 der Target-DNA. Die 25 5'-Basen hybridisieren nicht mit dem Target.

2: SPA-Primer (25 b):

Diese Sequenz ist identisch mit Position 744 bis 768 des Targets. Sie ist ebenfalls identisch mit den 25 5'-Basen der Verlängerungs-Sonde.

3: PCR-Primer (31 b):

Dieser Primer ist identisch mit den 31 3'- Basen der Verlängerungs-Sonde.

4: PCR-Primer (25 b):

Diese Sequenz ist identisch mit Position 852 bis 876 des Targets.
Die obige Erörterung umfaßt verschiedene Theorien bezüglich der bei der vorliegenden Erfindung beteiligten Mechanismen. Diese Theorien sind nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise anzusehen, da nachgewiesen wurde, daß die vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erreicht.
Die obige Beschreibung und die Beispiele offenbaren die Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen davon vollständig.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids mit zwei Segmenten, die nicht an aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind, wobei das Verfahren umfaßt die Schritte:

der Bereitstellung in Kombination eines Polynukleotids mit zwei nicht aneinandergrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist, und einer Verlängerungs-Sonde, die zwei Desoxynukleotidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 ist, und

der Verlängerung der Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids.

2. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter umfaßt die Bereitstellung eines Polydesoxynukleotid-Primers in dieser Kombination, der imstande ist, mindestens an seinem 3'-Ende mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, unter Bedingungen, unter denen (1) die verlängerte Verlängerungs-Sonde einzelsträngig gemacht wird, (2) der Polydesoxynukleotid-Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (3) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (4) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Schritte (3) und (4) wiederholt werden.

4. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Konzentration der Verlängerungs-Sonde wesentlich geringer als die des Polydesoxynukleotid-Primers ist.

5. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Konzentration der Verlängerungs-Sonde weniger als 1% derjenigen des Polydesoxynukleotid-Primers beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung mehrfacher Kopien eines einzelsträngigen Polydesoxynukleotids mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzen und zueinander komplementär sind, wobei das Verfahren umfaßt den Schritt:

der Bereitstellung in Kombination, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, eines Polynukleotids mit zwei nicht aneinandergrenzenden, nicht komplementären Nukleotidsequenzen S1 und S2, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist, einer Verlängerungs-Sonde, die zwei Desoxynukleotidsequenzen umfaßt, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Nukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu dem Polynukleotid ist, eines Polydesoxynukleotid- Primers, der imstande ist, mindestens an seinem 3'-Ende mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, von DNA-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen, unter denen (a) die Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (b) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (c) der Polydesoxynukleotid-Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen zweiten Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (d) der verlängerte Primer von dem zweiten Doppelstrang dissoziiert wird, und (e) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (d) und (e) wiederholt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Schritte (d) und (e) mindestens dreimal wiederholt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin mindestens eine Sequenz von 15 Desoxynukleotiden der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisiert.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin der Polydesoxynukleotid-Primer mindestens eine Sequenz von 15 Desoxynukleotiden enthält, die imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Sequenz zu hybridisieren.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 - 9, worin das Polynukleotid DNA ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis der Anwesenheit einer Target-Nukleotidsequenz in einem Medium, von dem angenommen wird, daß es die Target-Nukleotidsequenz enthält, wobei die Target-Nukleotidsequenz zwei nicht aneinandergrenzende, nicht komplementäre Nukleotidsequenzen S1 und S2 aufweist, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens zehn Nukleotide lang ist, welches Verfahren umfaßt die Schritte:

(a) der Bereitstellung in Kombination, entweder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell, des Mediums, einer Verlängerungs-Sonde mit zwei Desoxynukleotidsequenzen, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu der Target-Nukleotidsequenz ist, eines Polydesoxynukleotid-Primers, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren, von DNA-Polymerase und Desoxynukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen, unter denen (1) die Verlängerungs-Sonde entlang des Polynukleotids verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (4) und (5) wiederholt werden, und

(b) der Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin S1 und S2 jeweils 10 bis 100 Nukleotide enthalten.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin die Konzentration der Verlängerungs-Sonde weniger als 1nM beträgt und die Konzentration des Polydesoxynukleotid-Primers größer als 100nM ist.

14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 - 13, worin der Polydesoxynukleotid-Primer mit einem "Reporter"-Molekül markiert ist.

15. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 - 14, worin der Polydesoxynukleotid-Primer auch eine andere Nukleotidsequenz enthält als die Sequenz, welche mit der zu S2 komplementären Sequenz hybridisiert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Anwesenheit des verlängerten Primers nachgewiesen wird durch die Prüfung auf ein "Reporter"-Molekül, das kovalent an eine Nukleotidsequenz gebunden ist, die zu einem anderen Teil der Target-Nukleotidsequenz als S1 oder S2 komplementär ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Polynukleotid-Analyten enthält, welches Verfahren umfaßt die Schritte:

(a) der Behandlung eines Mediums, das die Probe enthält, um aus dem Polynukleotid-Analyten, falls vorhanden, eine einzelsträngige Target-Nukleotidsequenz zu bilden, wobei die Target-Nukleotidsequenz zwei nicht aneinandergrenzende, nicht-komplementäre Nukleotidsequen zen S1 und S2 aufweist, wobei S2 5' von S1 liegt und mindestens 10 Nukleotide lang ist,

(b) der Kombination des Mediums mit

einer Verlängerungs-Sonde mit zwei Desoxynukleotidsequenzen, wobei die Sequenz am 3'-Ende der Verlängerungs-Sonde mit S1 hybridisierbar ist und die andere Desoxynukleotidsequenz homolog zu S2 und nicht komplementär zu der Target-Sequenz ist,

einem Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer zu S2 komplementären Nukleotidsequenz zu hybridisieren,

Desoxynukleosid-Triphosphaten und

DNA-Matrizen-abhängiger Polydesoxynukleotid-Polymerase unter Bedingungen, unter denen (1) die Verlängerungs- Sonde mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, (2) die verlängerte Verlängerungs-Sonde von dem Doppelstrang dissoziiert wird, (3) der Primer mit der verlängerten Verlängerungs-Sonde hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, (4) der verlängerte Primer von dem Doppelstrang dissoziiert wird, und (5) der Primer mit dem verlängerten Primer hybridisiert und daran entlang verlängert wird, um einen Doppelstrang zu bilden, der verlängerten Primer umfaßt, und die Schritte (4) und (5) wiederholt werden, wobei die Schritte (a) und (b) gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell durchgeführt werden, und

(c) der Prüfung auf die Anwesenheit des verlängerten Primers.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Schritte (4) und (5) weniger als dreißigmal wiederholt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin der Polynukleotid-Analyt RNA ist und das Medium reverse Transkriptase einschließt.

20. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 - 19, worin die Desoxynukleosid-Triphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP sind.

21. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 - 20, worin die Schritte (4) und (5) derart wiederholt werden, daß die Anzahl der gebildeten Doppelstränge um mindestens einen Faktor 1000 erhöht wird.

22. Verfahren nach Anspruch 14, worin das "Reporter"-Molekül aus der Gruppe aus fluoreszierenden Stoffen, chemolumineszierenden Stoffen, Promotoren, Coenzymen, radioaktiven Substanzen, amplifizierbaren Polynukleotidsequenzen, kleinen organischen Molekülen, Katalysatoren und Polynukleotidsequenzen, die für Katalysatoren kodieren, ausgewählt ist.

23. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 - 22, worin der Polydesoxynukleotid-Primer mit einem Liganden markiert ist.

24. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 - 23, worin der Polydesoxynukleotid-Primer eine andere Nukleotidsequenz enthält als die Sequenz, die mit der zu S2 komplementären Sequenz hybridisiert.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Nukleotidsequenz des Polydesoxynukleotid-Primers eine Sequenz enthält, die wenn sie an ihre komplementäre Sequenz hybridisiert ist, spezifisch durch einen Rezeptor gebunden werden kann.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin der Rezeptor aus der Gruppe aus Repressoren, Aktivatoren und Nukleasen ausgewählt ist.

27. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Nukleotidsequenz des Polydesoxynukleotid-Primers eine Sequenz enthält, die wenn sie an ihre komplementäre Sequenz hybridisiert ist, spezifisch durch einen Rezeptor gebunden werden kann, und der verlängerte Primer durch Bindung des Rezeptors an den verlängerten Primer nachgewiesen wird.

28. Kit zur Ausführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 - 27, welcher in abgepackter Kombination umfaßt:

eine Verlängerungs-Sonde, die an ihrem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die mit einer ersten Sequenz in einer Target-Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, und eine Sequenz aufweist, die homolog zu einer zweiten Sequenz der Target-Nukleotidsequenz ist, wobei in der Target-Nukleotidsequenz diese zweite Sequenz 5' zur ersten Sequenz liegt und nicht daran angrenzt, und

einen Polydesoxynukleotid-Primer, der imstande ist, mit einer Sequenz zu hybridisieren, die zur zweiten Sequenz komplementär ist.

29. Kit nach Anspruch 28, welcher Matrizen-abhängige DNA- Polymerase umfaßt.

30. Kit nach Anspruch 28 oder 29, welcher Desoxynukleosid- Triphosphate umfaßt.