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Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Messung der spektralen Absorption in streuenden Objekten, bspw. in
Suspensionen oder Pulvern, sowie im Besonderen auf ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Messung der Spektral-Absorptions-Eigenschaften eines Anteils, der in einer
bestimmten Richtung weitergeleitet wird, sofern ein Strahl aus einer bestimmten
Richtung auf eine Probe gerichtet wird.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren und eine
Vorrichtung zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung von
undurchsichtigen Proben, bspw. biologischen Proben, sowie im Besonderen auf ein
Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsver
teilung, wobei unnötig gestreutes Licht zur Verbesserung der Auflösung entfernt
wird, so daß es möglich ist, die Absorption innerhalb eines sehr kleinen Bereichs
der Probe exakt zu messen.
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Seit der Entdeckung von Röntgenstrahlen wurden auf dem Gebiet der Biologie,
insbesondere auf medizinischem Gebiet, in erheblichem Umfang Technologien
benötigt und entwickelt, mit denen das Innere eines lebenden Körpers (bspw.
eines menschlichen Körpers) beobachtet werden kann, ohne demselben Schaden
zuzufügen (d.h., unblutige oder zerstörungsfreie Untersuchungsverfahren). Diese
Technologien verwenden Gamma- und Röntgenstrahlen, welche unter den elek
tromagnetischen Wellen die kürzesten Wellenlängen aufweisen, sowie
Radiowellen, welche unter diesen die größten Wellenlängen besitzen. Die Technologie,
welche erstere Strahlen einsetzt, wurde dem praktischen Gebrauch bereits in
Form der Röntgen-CT zugeführt, und die Technologie, welche die letzteren
Wellen
nutzt, in Form der NMR-CT (Kernspintomographie, insbesondere
Kernspinresonanztomographie).
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Andererseits wurden weniger Versuche unternommen, bei in vivo-
Untersuchungen ein Spektroskopieverfahren anzuwenden, welches sich mit der
Messung und Untersuchung von ultravioletten, sichtbaren, nah-infraroten und
infraroten Spektren befaßt, und welches in den Forschungsgebieten der Physik und
der Chemie weit verbreitet ist. Dies liegt daran, daß biometrische
Untersuchungsverfahren, welche Licht verwenden, insbesondere derartige, welche den Vorgang
der Lichtabsorption oder Emission verwenden, im Hinblick auf eine "quantitative
Bestimmung" viele Probleme ungelöst gelassen haben, um den wichtigsten Punkt
anzusprechen. Dies hat zur Folge, daß die Reproduzierbarkeit ungenügend und
die Verläßlichkeit gering ist im Verhältnis zu den Absolutwerten, welche man bei
Untersuchungen erhält, welche gegenwärtig durchgeführt werden, bspw. unter
Verwendung einer Vorrichtung, welche Reflekionsspektren mit einem
Festkörperelement oder einer hochempfindlichen TV-Kamera mißt.
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Unter Verwendung einer Anordnung, bei der Licht auf ein streuendes Objekt wie
ein organisches Gewebe gerichtet wird, ist es möglich, diejenigen Lichtanteile,
welche sich geradlinig ausbreiten, in einem gewissen Ausmaß herauszufiltern,
wenn das Licht unter einem Winkel von 1800 empfangen wird. Jedoch ist das
räumliche Auflösungsvermögen beim gegenwärtigen Stand der Technik nicht sehr
groß.
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Der Unterschied in dem räumlichen Auflösungsvermögen zwischen
Röntgenstrahlen und Licht kann beim gegenwärtigen Stand der Technik nicht wieder
gutgemacht werden. Jedoch wird die Verwendung von Lichtstrahlen, insbesondere von
Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich, die Erminlung eines Bildes der
Sauerstoffkonzentration des Hämoglobins im Blut eines Gewebes erlauben. Diese
Lichtstrahlen werden Informationen liefern, welche sich von denjenigen
unterscheiden,
die mit anderen Technologien wie NMR-CT und Röntgen-CT erhalten
werden.
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Demzufolge ist es für relativ dünne Gewebe mit einer Dicke von 3 bis 5 cm
möglich, das hindurchgelassene Licht zu sensieren. Dies bedeutet, daß eine derartige
"Photo-Röntgenographie" zu Diagnosezwecken verwendet werden kann.
Weibliche Brüste haben ein relativ homogenes Gewebe und lassen Lichtstrahlen
demzufolge bereitwillig hindurch, und dank ihrer Gestalt ist es nicht schwierig, das von
diesen (Dicke: bis zu etwa 3 cm) weitergeleitete Licht zu sensieren. Aus diesem
Grund wurde ein "Photo-Röntgenographie"-Verfahren zur medizinischen
Untersuchung von Brustkrebs seit langer Zeit unter dem Namen "Diaphanoskopie"
(Lichtabtastung) eingesetzt.
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Ausgehend von diesen Tatsachen eindeckte der gegenwärtige Erfinder, daß eine
mit Streulicht vermischte, ebene Welle aus dem Gemisch zur Beobachtung
abgetrennt werden kann, indem ausschließlich das Spektrum 0. Ordnung
(entsprechend dem ersten dunklen Ring einer Airy'schen Scheibe) des
Fraunhofer-Beugungsbilds (Airy'sche Scheibe) der ebenen Welle ermittelt wird, und
hierbei kann der größte Anteil des gestreuten Lichts enifemt werden. Vgl. hierzu
bspw. die japanischen Patentanmeldungen Nr. 01-62898 (1989), 01-250034
(1989) sowie 02-77690 (1990). Wenn insbesondere nur das Muster 0. Ordnung
eines Fraunhofer-Beugungsbilds einer ebenen Welle als Lichtsignal ermittelt wird,
ist der Grad der Trennung des inkohärenten Streulichts von der ebenen Welle ge
geben durch
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(Streuintensität)/(Intensität der durchgelassenen ebenen Welle) = (λ/Dr)².
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Mit anderen Worten, je größer der Strahldurchmesser oder der Durchmesser Dr
der Eingangsöffnung eines in hohem Grade gerichteten Detektorsystems, bspw
eines lichtempfindlichen Überlagerungssystems, eines lichtempfindlichen
Michelson-Systems, eines in hohem Grade gerichteten optischen Systems, etc., im
Vergleich
mit der Wellenlänge λ ist, um so mehr verringert sich der Anteil des
Streulichts, und um so stärker kann das Streulicht von der ebenen Welle abgetrennt
werden. Der gegenwärtige Erfinder sah zur Durchführung einer derartigen
Beobachtung als hochgerichtetes, optisches System beispielhaft ein optisches System
mit zwei Mikroöffnungen P&sub1; und P&sub2; vor, welche voneinander beabstandet sind, wie
dies in Figur 7 dargestellt ist. Dieses optische System ist derart angeordnet, daß
Licht der 0. Ordnung mit einem Empfänger 23 durch die Mikroöffnung P&sub2; delektiert
wird. Der gegenwärtige Erfinder schlug darüber hinaus auch ein in hohem Grade
gerichtetes, optisches System mit einer hohlen, gerade gestreckten, langen und
dünnen Glasfaser 35 vor, wobei die innere Oberfläche des Mantels mit einem
lichtabsorbierenden Werkstoff, bspw. Kohlenstoff, beschichtet ist, wie dies in Figur
8 dargestellt ist. Weiterhin zog der gegenwärtige Erfinder verschiedene, in hohem
Grade gerichtete, optische Systeme in Erwägung, ähnlich den in den Figuren 9 bis
16 dargestellten: Ein hochgerichtetes optische System (Fig. 9), welches eine
Objektivlinse Ob aufweist, in deren Brennebene eine Mikroöffnung P angeordnet ist
damit ausschließlich das Muster 0. Ordnung eines durch die Objektivlinse Ob
gebildeten Fraunhofer-Beugungsbildes hindurchgelangen kann; ein hochgradig
gerichtetes, optisches System (Fig. 10) mit einer Linse GL, deren Brechungsindex
sich graduell ändert, und mit einer Mikroöffnung P (ähnlich der in Figur 9 gezeig
ten), welche in der Brennebene an einem Ende der Linse GL mit dem abgestuften
Brechungsindex angeordnet ist; ein hochgradig gerichtetes optisches System (Fig.
11 und 12), wobei die Mikroöffnung P durch eine optische Faser SM ersetzt ist,
welche dieselbe Funktion übernimmt wie die Mikroöffnung P; ein hochgradig
gerichtetes, optisches System (Fig. 13 und 15) mit einer Objektivlinse Ob2, welche
identisch mit einer Objektivlinse Ob1 an der Eingangsseite ist und an der
Ausgangsseite der Mikroöffnung P oder optischen Faser SM des oben
beschriebenen, hochgerichteten optischen Systems angeordnet ist; sowie ein hochgradig
gerichtetes optisches System (Fig. 14 und 16), wobei eine Linse GL2 mit einem
graduell variierenden Brechungsindex, welche identisch mit einer eingangsseitig
angeordneten Linse GL1 mit abgestuftem Brechungsindex ist, an der
Ausgangsseite der Mikroöffnung P oder der optischen Faser SM angeordnet ist.
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Übrigens gibt es bekannte Verfahren zur Messung der Absorption in
undurchsichtigen Proben, bspw. das Milchglasverfahren, wobei ein geradliniger Anteil und
eine Transmissions- und Streukomponente einer Streuungen hervorrufenden Probe
gemeinsam von einem milchigen Glas gestreut werden, um ein Maß für die
Schwächung des Gesamtwerts der Transmission durch die Probe zu erhalten
[vgl. bspw. Kazuo Shibata "Photobiology Series: Introduction to Spectral
Measurement", Seiten 62 bis 82 (20. Juni 1976, Kyoritsu Shuppan K.K.)]. Heterogene
Systeme wie Suspensionen von Partikeln, bspw. Zellen, Körnchen, oder festes
Pulver absorbieren und streuen das Licht im allgemeinen. Dementsprechend ist
es schwierig, ausschließlich die Absorptions-Wellenlängen-Eigenschaften
derartiger heterogener Systeme zu bestimmen. Aus diesem Grund ist es eine übliche
Praxis, eine Größe zu bestimmen, mit der die tatsächlichen Absorptions-
Wellenlängen-Eigenschaften approximiert werden können. Insbesondere wird
eine Schwächung des Gesamtwerts der Transmission bestimmt, um die Absorption
zu ersetzen. Die Schwächung des Gesamtwerts der Transmission ist der
gemeinsame Logarithmus des Verhältnisses aus einem Bündel von Lichtstrahlen, welche
sowohl durch Absorption als auch durch Streuung vermindert sind, und aus den
einfallenden Lichtstrahlen, was sich im allgemeinen nicht mit den
Absorptionseigenschaften deckt. Damit die Schwächung des Gesamtwerts der Transmission so
weit als möglich an die tatsächlichen Absorptionseigenschaften angenähert
werden kann, werden die parallel durchlaufenden Strahlen und die gestreut hindurch
laufenden Strahlen von einem Detektor mit derselben Einfangrate detektiert, so
daß die Auswirkung der Streuung auf das Verhältnis der Lichtstrahlen gering wird
Als Verfahren wurde zu diesem Zweck die Milchglasmethode in der Praxis ange
wendet. Zusätzlich wurde das die Transmission integrierende Kugelverfahren, das
photoelektrische Oberflächenkontaktverfahren, etc. in der Praxis als Verfahren zur
Minimierung der Auswirkung der Streuung angewendet, indem die gesamten,
durchgehenden Strahlen, sowohl parallel hindurchlaufende Strahlen wie auch
gestreut hindurchlaufende Strahlen, eingefangen werden. Ein Verfahren, welches
sowohl das Kontaktverfahren wie auch Streuverfahren gemeinsam benutzt, wurde
ebenfalls eingesetzt als intermediäres Verfahren zwischen der Ermittlung parallel
hindurchlaufender Lichtstrahlen und gestreut hindurchlaufender Lichtstrahlen mit
derselben Einfangrate und der Ermittlung aller hindurchlaufender Lichtstrahlen.
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Unterdessen wurde bis jetzt zur Messung einer mikroskopischen
Absorptionsverteilung in einer Streuungen verursachenden Probe ein Meßverfahren
angewendet, welches in Figur 17 skizziert ist. Um dies deutlich auszuführen, das Licht
einer Lichtquelle, welche Lichstrahlung über einen weiten Spektralbereich emittiert,
läuft durch ein Interferometer zur Fourier-Spektroskopie, und wird sodann mittels
eines umschaltbaren Transmissions-/Reflexions-Spiegels entweder auf einen
optischen Transmissionspfad oder auf einen optischen Reflexionspfad gesandt.
Sofern der optische Transmissionspfad ausgewählt ist, wird das Beleuchtungslicht
durch ein unteres Cassegrain-System, welches als Kondensorlinse betrieben wird,
auf einen sehr kleinen Punkt einer auf einem Probentisch abgelegten Probe ge
sammelt. Licht, welches durch den Meßpunkt hindurchtritt, sowie dasjenige Licht,
welches an dem Meßpunkt nach vorne gestreut wird, wird durch ein oberes
Cassegrain-System, welches als Objektivlinse betrieben wird, auf eine Öffnung
fokussiert, und das Licht, welches durch diese Öffnung hindurchtritt, wird auf einen
Detektor gelenkt, um die Absorptionseigenschaften in dem Meßpunkt zu ermitteln.
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Solchermaßen ist es möglich, den Transmissionsanteil einer mikroskopischen
Absorptionsverteilung in der Probe zu messen, indem die obige Messung in
ähnlicher Form wiederholt wird, wobei der Probentisch in den Richtungen X und Y
gerastert verstellt wird. Wenn der verschwenkbare Spiegel in Richtung auf den opti
schen Reflexionspfad umgeklappt wird, so wird das Beleuchtungslicht durch das
obere Cassegrain-System in einem Punkt der Probe gesammelt, und dasjenige
Licht, welches von dem Meßpunkt reflektiert und zurückgestreut wird, wird durch
dasselbe, obere Cassegrain-System auf die Öffnung fokussiert. Solchermaßen
kann der Reflexionsanteil der mikroskopischen Absorptionsverteilung in der Probe
auf demselben Weg gemessen werden wie oben beschrieben.
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Figur 18 zeigt ein weiteres, übliches Mikrospektroskopieverfah ren, welches eine
Kombination aus einem optischen Mikroskop und einem Spektrophotometer
verwendet, um ein Absorptionsspektrum eines sehr kleinen Bereichs zu beobachten.
Licht einer Lichtquelle 1 wird durch ein Spektroskop m&sub0; in monochromatisches
Licht umgewandelt, um eine Blende (Mikroöffnung) p zu beleuchten. Betrachtet
man die Blende p als Lichtquelle eines Mikroskopsystems, so gelangt deren Licht
durch ein Beleuchtungsmikroskop m&sub1;. Folglich wird ein verkleinertes Bild der
Blende p auf einer Probenebene 5 erzeugt. Dieses Bild wird durch ein weiteres
Mikroskop m&sub2; vergrößert und zu einem Detektor d gelenkt. Sofern eine Probe an
der Position 5 abgelegt wird, wo das verkleinerte Bild der Blende erzeugt wird, ist
es möglich, die Absorption eines äußerst kleinen Bereichs der Probe zu messen.
Übrigens ist der Streueffekt groß, sofern dasselbe Meßverfahren, das bei
streuungsarmen Proben Verwendung findet, eingesetzt wird, um ein Absorptionsspek
trum einer Probe zu erhalten, welche Streuungen verursacht, so daß es unmög
lich ist, ein exaktes Absorptionsspektrum aufzunehmen. Zur Messung der
Absorption in undurchsichtigen Proben sind technische Verfahren bekannt, wobei die
Auslöschung des Gesamtwerts der Transmission unter Verwendung eines
Milchglases oder einer integrierenden Kugel gemessen wird, wie oben ausgeführt.
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Die oben beschriebenen, bekannten Verfahren leiden jedoch an den im folgenden
dargelegten Problemen: (1) Das Milchglasverfahren bringt den Nachteil mit sich,
daß die lichtstreuende Wirkung sich in Abhängigkeit von der Wellenlänge störend
verändert; (2) das Verfahren mit der Kugel zur Berücksichtigung der gesamten
Transmission leidet an dem Nachteil, daß ein weißes Reflexionsmaterial in der
lntegrationskugel bei einer kurzen Wellenlänge ein stark verschlechtertes
Reflexionsvermögen zeigt, insbesondere nahe dem ultravioletten Bereich, selbst bei
Verwendung von MgO-Pulver, welches als optimales Reflexionsmaterial bekannt
ist, so daß keine zuverlässigen Daten erhalten werden können; (3) das
photoelektrische Oberflächenkontaktverfahren, welches zwei Detektoren verwendet, bringt
Schwierigkeiten bei der Einhaltung gleichbleibender
Empfindlichkeitseigenschaften
in Abhängigkeit von der Wellenlänge mit sich, während das photoelektrische
Oberflächenkontaktverfahren mit nur einem Detektor Probleme bei der Einrichtung
einer Probe und einer Steuervorrichtung innerhalb eines begrenzten Raums
bereitet; und (4) das Verfahren, welches eine Verbindung aus dem Kontaktverfahren
und dem Streuverfahren einsetzt, leidet an der Begleiterscheinung, daß es
notwendig ist, die Größe einer Probe und Abstand und Größe des Detektors geeignet
auszuwählen, obwohl es den vorangehenden drei Verfahren überlegen ist.
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Zusätzlich beinhalten die vier üblichen Verfahren den gemeinsamen Nachteil, daß
es Fälle gibt, bei denen die gemessene Auslöschung der Gesamttransmission
nicht an die Absorptionswellenlänge von Schwebeteilchen approximiert werden
kann. Um dies genauer auszuführen, sobald die Intensität der reflektierten
Strahlen zunimmt, wird es unmöglich, eine Approximation durchzuführen. Wenn das
streuende Raummuster, welches von einer Probe gebildet wird, durch die
Wellenlänge beeinflußt wird, so wird die Wellenlängenänderung der gestreut
hindurchlaufenden Strahlen unterschiedlich gegenüber derjenigen der gestreut Reflektierten
Strahlen, so daß keine Approximation gemacht werden kann. Weiterhin ist es
schwierig, eine Absorptionsmessung durchzuführen, welche ein räumliches
Auflösungsvermögen bietet, bspw. zur Bestimmung eines Absorptionsortes. Obwohl
die bekannten Verfahren zur Absorptionsmessung in dünnen, heterogenen
Systemen wie verdünnten Suspensionen geeignet sind, können diese Verfahren
nicht zur Absorptionsmessung in dichten, durchscheinenden Objekten wie biologi
schen Proben herangezogen werden, wenn die Streuung so stark ist, daß die
Kubelta-Munk-Beziehung gültig ist.
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Bei dem mikrospektroskopischen Meßverfahren für den infraroten Bereich,
welches ein Fourier-Spektroskop verwendet, und bei dem mikrospektroskopischen
Meßverfahren für den sichtbaren Bereich, welches ein Beugungsgitter-
Spektroskop verwendet, bei diesen oben beschriebenen Verfahren sind keine
Maßnahmen getroffen, um undurchsichtige Proben zu messen, welche
Streuungen verursachen, und demzufolge ergeben sich bei derartigen Proben große
Meßfehler, so daß keine verläßlichen Daten erhalten werden. Mit anderen Worten,
da unnötig gestreutes Licht aus der Umgebung einschließlich der Vorder- und
Rückseite des Meßpunkts dazugemischt wird, ist es unmöglich, exakte
Absorptionseigenschaften zu messen. Da außerdem andere, Fraunhofer'sche Beugungs
muster neben dem Beugungsmuster 0. Ordnung in die Objektivlinse gelangen, ist
die Auflösung begrenzt. Das Meßverfahren, welches eine einfache Kombination
des Meßverfahrens mit dem Milchglas oder der Integrationskugel darstellt und als
Meßverfahren für die Absorption in undurchsichtigen Proben entwickelt wurde,
sowie das mikrospektroskopische Meßverfahren beinhalten das Problem, daß das
aufgenommene Lichtsignal schwach ist, wodurch es schwierig wird, eine Messung
durchzuführen, und demzufolge kann dieses Verfahren in der Praxis nicht
verwendet werden. Da das Verfahren mit dem Milchglas oder einer lntegrationskugel
kaum mehr als ein Integrationsverfahren darstellt, kann es nicht für Proben
verwendet werden, bei denen keine Approximation gemacht werden kann, weil die
Intensität reflektierter Strahlen hoch ist oder weil die Wellenlängenänderung
gestreut durchgelassener Strahlen mit derjenigen gestreut reflektierter Strahlen
identisch ist, so daß sich große Fehler ergeben; hier könnte selbst eine deutlich
erhöhte Aufnahmeempfindlichkeit keine Verbesserung bringen. Selbst wenn ein
derartiges Meßverfahren angewendet werden kann, ist das räumliche Auflösungs
vermögen herabgesetzt. Somit gibt es bis jetzt kein geeignetes Meßverfahren für
ein Absorptionsspektrum in einem sehr kleinen Bereich einer undurchsichtigen
Probe, welche Streuungen hervorruft.
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Im Stand der Technik, vgl. GB-A 2191855, ist eine Vorrichtung und ein Verfahren
mit den Merkmalen des Oberbegriffs der Ansprüche 1 und 4 bekannt. Mit der
dortigen Anordnung wird beabsichtigt, die bekannten Eigenschaften eines
Michelsonlnterferometers hilfsweise zu verwenden, um die Reflexionsorte in einem
integrierten, optischen Cip aufzuspüren. Die Anordnung befaßt sich jedoch nicht mit dem
Problem der Bestimmung spektraler Absorptionseigenschaften einer
undurchsichtigen, Licht aussendenden Probe.
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Somit ist es ein erstes Anliegen der gegenwärtigen Erfindung, ein Verfahren und
eine Vorrichtung zur Messung spektraler Absorptionseigenschaften zu schaffen,
wobei gestreute Lichtstrahlen eines streuenden Objekts, bspw. von einer
Suspension oder von organischem Gewebe, so weit als möglich enifemt und parallele
Strahlen einer in einer bestimmten Richtung weitergeleiteten Komponente
(insbesondere geradlinig durchlaufende Komponentenstrahlen) aufgefangen
werden.
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Eine weitere Absicht der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine
Vorrichtung zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung vorzuschlagen,
wobei unnötig gestreutes Licht enifemt wird, um die Auflösung zu verbessern, so
daß es möglich ist, die Absorption in einem sehr kleinen Bereich einer
undurchsichtigen Probe, bspw. eines organischen Gewebes, exakt zu messen.
Diese Ziele lassen sich mit den kennzeichnenden Merkmalen der Ansprüche 1
und 4 erreichen.
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Weitere günstige Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der
folgenden Beschreibung und den nachgeordneten Ansprüchen sowie anhand der
beigefügten Zeichnung. Hierbei zeigt:
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Fig. 1 eine Ansicht, um die Anordnung und Betriebsart eines
lichtempfangenden System vom Michelson-Typ als hochgerichtetem Aufnahme
system zu erklären, welches in der gegenwärtigen Erfindung
verwendet wird;
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Fig. 2 eine Anordnung eines Spektral-Absorptions-Meßgeräts gem. der
vorliegenden Erfindung mit einem lichtempfangenden System vom
Michelson-Typ, welches auf eine durchlässige Probe angewendet
wird;
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Fig. 3 ein spezielles Beispiel eines Geräts zur Messung spektraler
Absorptionseigenschaften in einem großen Bereich einer Probe;
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Fig. 4 eine Ansicht zur Erklärung der Struktur und Betriebsart eines
hochauflösenden Aufnahmesystems mit einem lichtempfindlichen
System vom Michelson-Typ, welches gem. der vorliegenden
Erfindung im Rahmen eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur
Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung in einer undurch
sichtigen Probe eingesetzt wird;
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Fig. 5 die Anordnung einer erfindungsgemäßen Ausführungsform des
Gerätes zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung
unter Verwendung eines lichtempfänglichen Systems vom Michelson-
Typ, welches auf eine durchlässige Probe angewendet wird;
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Fig. 6 ein spezielles Beispiel eines erfindungsgemäßen Geräts zur
Messung der mikroskopischen Absorptionsverteilungseigenschaften
einer Probe;
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Fig. 7 - 16 Strukturen hochgerichteter optischer Systeme, welche von dem
Erfinder vor dieser Anmeldung vorgeschlagen worden sind;
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Fig. 17 die Anordnung eines herkömmlichen Geräts zur Messung der mikro
skopischen Absorptionsverteilung, welches ein Fourierspektroskop
verwendet; sowie
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Fig. 18 die Anordnung eines herkömmlichen Geräts zur Messung der
mikroskopischen Absorptionsverteilung in einer sehr kleinen Probe,
welches ein Spektruskop vom Beugungsgittertyp verwendet.
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Ein lichtempfängliches System vom Michelson-Typ ist als Mittel bekannt,
welches in der Lage ist, eine sehr kleine Anderung im Brechungsindex od. dgl.
festzustellen. Bei einem lichtempfänglichen System 4 vom Michelson-Typ, wie
es in Figur 1 dargestellt ist, wird das Licht eines Lasers 1 von einem
Strahlenteiler BS in zwei Lichtstrahlen aufgespalten, von denen einer von den Spiegeln
M1 und M2 reflektiert wird, um durch eine Probe S hindurchzutreten, welche in
den Pfad des reflektierenden Lichts eingefügt ist, und das hindurchfallende
Licht wird mit einem (später beschriebenen) geradlinigen Lichtstrahl mittels
eines halbdurchlässigen Spiegeis HM zusammengefaßt. Der geradlinige
Lichtstrahl (welcher im folgenden als "Referenzlicht" bezeichnet wird) läuft nach dem
Durchtritt durch den Strahlteiler BS durch den halbdurchlässigen Spiegel HM
und fällt auf einen beweglichen Spiegel M, der in Richtung des in der Figur
wiedergegebenen, mit zwei Spitzen versehenen Pfeils bewegt wird. Das Licht wird
in die entgegengesetzte Richtung reflektiert und von dem halbdurchlässigen
Spiegel HM mit dem durch die Probe S hindurchlaufenden Lichtstrahl vereinigt,
und das dabei entstehende, zusammengesetzte Licht wird in einem Detektor 2
photoelektrisch umgesetzt. Der Detektor 2 erzeugt ein Ausgangssignal, dem
ein lnterferenzsignal überlagert ist, welches mit der Geschwindigkeit der
Bewegung des Spiegels M korrespondiert. Die Intensität des Wechselanteus des
Ausgangssignals ist proportional zur Durchlässigkeit der Probe S, und die
Phase des Signals hängt von der Dicke oder dem Brechungsindex der Probe S ab.
Das lichtempfängliche System 4 vom Michelson-Typ ist somit in der Lage, eine
sehr kleine Änderung in dem Brechungsindex o.ä. zu erkennen.
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Da die von der Probe S in eine bestimmte Richtung gestreute Komponente,
welche von der Richtung des Referenzlichts abweicht, sich nicht mit dem
Referenzlicht auf der Detektoroberfläche des Detektors 2 überlappt, wird von dieser
kein Schwebungssignal erzeugt, und das gestreute Licht wird näherungsweise
als Konstantkomponente erkannt. Somit übernimmt das lichtempfängliche
System 4 vom Michelson-Typ auch die Funktion eines hochgerichteten
Empfangssystems, welches in der Lage ist, eine derartige Streukomponente auf
einfachem Weg zu entfernen und ausschließlich eine Lichtkomponente zu
erfassen, welche sich in derselben Richtung ausbreitet wie das Referenzucht, und
außerdem kann auch ein sehr schwaches Signal erkannt werden, wie oben
beschrieben. Dementsprechend verwendet die vorliegende Erfindung die Struktur
eines lichtempfänglichen Systems 4 vom Michelson-Typ als hochgerichtetes
Erfassungssystem.
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Übrigens erfaßt das lichtempfängliche System 4 vom Michelson-Typ die
Intensität des von der Probe S durchgelassenen oder gestreuten Lichts auf der Basis
eines Prinzips, welches im folgenden kurz erläutert werden soll. Angenommen,
daß das Referenzucht, welches zur Kombination herangezogen werden soll, als
V&sub2; bezeichnet wird, und das von der Probe S durchgelassene oder gestreute
Licht (im folgenden gegebenenfalls als "Probenlicht" angesprochen) sei V&sub1;, so
können diese beiden Lichtquellen wie folgt ausgedrückt werden:
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V&sub1;=A&sub1;exp [-i (ω&sub1;t+φ&sub1;)]
-
V&sub2;=A&sub2;exp [-i (ω&sub2;t+φ&sub2;)]
-
Wenn diese zwei Lichtwellen V&sub1; und V&sub2; in einem überlagerten Zustand
beobachtet (erfaßt) werden, ist das empfangene Signal S gegeben durch
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S= V&sub1;+V&sub2; ²=V&sub1; V&sub1;*V&sub2; V&sub2;*+V&sub1; V&sub2;*+V&sub1;* V&sub2;
-
Weil
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V&sub1; V&sub1;*=A&sub1;², V&sub2; V&sub2;*=A&sub2;²
-
und
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V&sub1; V&sub2;*=A&sub1; A&sub2;exp[-i(ω&sub1;-a)&sub2;)t-i(φ&sub1;-φ&sub2;)
-
V&sub1;* V&sub2;=A&sub1; A&sub2;exp[+i(ω&sub1;-ω&sub2;)t+i(φ&sub1;-φ&sub2;)
-
V&sub1; V&sub2;*+V&sub1;* V&sub2;=2A&sub1; A&sub2;cos[(ω&sub1;-ω&sub2;)t+(φ&sub1;-φ&sub2;)]
-
ist das empfangene Signal S gegeben durch
-
S=A&sub1;²+A&sub2;²+2A&sub1; A&sub2;cos[(ω&sub1;-ω&sub2;)t+(φ&sub1;-φ&sub2;)]
-
Da in einem lichtempfänglichen System 4 vom Michelson-Typ die Beziehungen
ω&sub1;=ω&sub2; and φ&sub2;=φ&sub1;+kt gelten, ist das empfangene Signal
gegeben durch
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S=A&sub1;²+A&sub2;²+2A&sub1; A&sub2;coskt
-
Solchermaßen ist es möglich, die Amplitude A&sub1; des Probenlichts V&sub1; aus der
Größe des Wechselanteils des empfangenen Signals zu erhalten.
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Als undurchsichtige Proben, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung
einer Spektralabsorptionsmessung unterzogen werden können, werden keine
Proben verwendet, welche einfallendes Licht vollständig abblocken und dieses
überhaupt nicht in Vorwärtsrichtung hindurchlassen, sondern dünne,
heterogene Systeme wie verdünnte Suspension, bspw. biologische Proben, und auch
Prüflinge wie dichte, durchscheinende biologische Proben, durch welche so gut
wie kein Licht direkt hindurchtreten kann, ohne gestreut zu werden, bei denen
jedoch Licht austritt, welches an feinen Streupartikeln innerhalb der Probe
mehrfach nach vorne gestreut worden ist. Natürlich kann auch eine Probe als
Meßobjekt verwendet werden, welche Licht auf direktem Wege hindurchtreten
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Im folgenden wird eine erfindungsgemäße Ausführungsform eines Verfahrens
und einer Vorrichtung zur Messung der Spektralabsorptionseigenschaften einer
undurchsichtigen Probe beschrieben.
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Figur 2 zeigt eine Vorrichtung, welche ein lichtempfängliches System 4 vom
Michelson-Typ verwendet, um die Spektralabsorptionseigenschaften einer
durchlässigen Probe 20 zu bestimmen. Bei dieser Anordnung wird ein Lichtstrahl,
welcher von einem Laser 10 mit einstellbarer Wellenlänge ausgesendet wird,
mittels eines Strahlumsetzers 11 in ein Bündel von parallelen Strahlen mit
geeignetem Durchmesser umgewandelt und sodann von einem Strahlteiler BS in
zwei Lichtstrahlen aufgeteilt, d.h., in einen geradlinig weiterlaufenden
Lichtstrahl und in einen reflektierten Lichtstrahl. Eine durchlässige Probe 20 wird in
den Pfad des reflektierten Lichtstrahls, welcher über Spiegel M1 und M2
weitergeleitet wird, eingefügt, und das Licht, welches durch die Probe 20
hindurchfällt und dabei gestreut wird, wird mit dem Referenzucht mittels eines
halbdurchlässigen Spiegeis HM vereinigt. Das Referenzlicht, welches durch den
Strahlteiler BS hindurchtritt, wird weiter durch den halbdurchlässigen Spiegel HM
hindurchgeschickt, um auf einen beweglichen Spiegel M zu fallen, der in Richtung
des in der Figur wiedergegebenen, mit zwei Spitzen versehenen Pfeils bewegt
wird. Das Referenzlicht, welches von dem Spiegel M in die umgekehrte
Richtung zurückgeworfen wird, wird durch den halbdurchlässigen Spiegel HM mit
dem Probenlicht zusammengeführt, und das resultierende, zusammengesetzte
Licht wird in einem Detektor 2 photoelektrisch umgewandelt. Dieser liefert ein
Ausgangssignal, welchem ein Interferenzsignal überlagert ist, wobei die
Frequenz des Interferenzsignals mit der Geschwindigkeit des bewegten Spiegels
M korrespondiert. Da die Intensität der Wechselkomponente des
Ausgangssignals
des Detektors 2 proportional zur Intensität des in der durchlässigen
Probe 20 gestreuten Lichts ist, können die Spektralabsorptionseigenschaften
an der Intensität der Wechselkomponente abgelesen werden, wenn die
Wellenlänge des Lasers 10 von verstellbarer Wellenlänge durchgestimmt wird.
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Figur 3 zeigt eine Vorrichtung, welche das in Figur 2 wiedergegebene
lichtempfindliche System 4 vom Michelson-Typ verwendet. Da dieses Gerät insofern
modifiziert wurde, als einfach die entsprechende, in Figur 2 wiedergegebene
Anordnung in eine vertikale Form gebracht wurde, ist eine detaillierte Erklärung
nicht notwendig. Es sollte festgehalten werden, daß in Figur 3 ein
Antriebssystem 14 vorgesehen ist, um den beweglichen Spiegel M entlang seiner
optischen Achse zu verschieben.
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Im folgenden werden erfindungsgemäße Ausführungsformen des Verfahrens
und der Vorrichtung zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung
in einer undurchsichtigen Probe beschrieben.
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Die in den Figuren 2 und 3 dargestellte Beziehung zwischen der Probe S und
dem Bündel paralleler Strahlen innerhalb des hochgerichteten optischen
Systems 4 wird in das hochauflösende Erfassungssystem 40 geändert, dessen
Anordnung Figur 4 zeigt, wobei einfallendes Licht auf einen sehr kleinen,
punkiförmigen Bereich gerichtet wird, welcher mit der Beugungskomponente 0.
Ordnung eines durch eine Linse erzeugten Fraunhoferschen Beugungsbildes
korrespondiert, wodurch es möglich wird, das ausschließlich von diesem sehr
kleinen Punkt gestreute Licht zu erfassen. Um dies genauer auszuführen, eine
Kondensorlinse L1 mit einer relativ großen numerischen Apertur (NA) ist auf
der Lichteinfalseite der Probe S zwischengeschaltet, so daß der rückwärtige
Brennpunkt der Linse L1 mit einem Meßpunkt auf der Probe S zusammenfällt,
und eine Objektivlinse L2 mit einer relativ großen numerischen Apertur (NA) ist
derart zwischengeschalten, daß der vordere Brennpunkt der Linse L2 mit dem
rückwärtigen Brennpunkt der Kondensorlinse L1 zusammenfällt. Mit dieser
Anordnung
wird Licht von einem Laser 1 durch die Kondensorlinse L1 auf einen
sehr kleinen Punkt der Probe S gerichtet, und das von diesem sehr kleinen
Punkt ausgehende Licht wird durch die Objektivlinse L2 in parallele Strahlen
umgelenkt, welche in eine vorgegebene Richtung laufen. Solchermaßen wird
aufgrund des Prinzips des hochgerichteten Detektorsystems 4 ausschließlich
dasjenige Licht von dem Detektor 2 aufgefangen, welches sich in dieser
Richtung ausbreitet. Auf diesem Weg ist es möglich, ausschließlich von einem sehr
kleinen Bereich gestreutes Licht zu untersuchen, welches der 0.
Beugungskomponente eines von einer Linse erzeugten Fraunhoferschen Beugungsbildes
der Probe S entspricht. Demgemäß erlaubt die Verwendung des oben
beschriebenen, hochauflösenden Detektorsystems 40 die Vermeidung einer
Vermischung unnötig gestreuten Lichts aus der Umgebung einschließlich der
Vorder- und Rückseite des Meßpunkts, und darüber hinaus können die
Absorptionseigenschaften der Probe S mit extrem hoher Auflösung gemessen
werden.
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Figur 5 zeigt eine Vorrichtung, welche das in Figur 4 wiedergegebene, mit
einem lichtempfänglichen System vom Michelson-Typ ausgerüstete,
hochauflösende Detektorsystem 40 verwendet, um eine mikroskopische
Absorptionsverteilung in einer durchlässigen Probe 20 zu messen. In dieser Vorrichtung wird
Licht, welches von einem Laser 10 mit einstellbarer Wellenlänge ausgesendet
wird, von einem Strahlumsetzer 11 in ein Bündel paralleler Strahlen von
geeignetem Durchmesser zerlegt und sodann vermittels eines Strahlteilers BS in
zwei Lichtstrahlen aufgespalten, d.h., in einen als Referenzlichtstrahl
dienenden, geradlinig weiterlaufenden Lichtstrahl, und in einen reflektierten
Lichtstrahl. Eine Kondensorlinse L1 und eine Objektivlinse L2 sind in dem Pfad des
reflektierten Lichts, welches über Spiegel M1 und M2 umgelenkt wird, derart
angeordnet, daß ihre Brennpunkte zusammenfallen, und eine durchlässige
Probe 20 ist in dem gemeinsamen Brennpunkt eingefügt. Das Licht, welches
durch die Probe 20 hindurchtritt und dabei gestreut wird, wird mit dem
Referenzlichtstrahl in einem halbdurchlässigen Spiegel HM vereinigt. Der
Referenzlichtstrahl,
welcher sich aus dem Licht zusammensetzt, welches durch den
Strahlteiler BS hindurchfällt, wird durch den halbdurchlässigen Spiegel HM
hindurchgeleitet und fällt auf einen beweglichen Spiegel M, der in Richtung des in
der Figur dargestellten, mit zwei Spitzen versehenen Pfeils bewegt wird. Das
Referenzlicht, welches von dem bewegten Spiegel M in die entgegensetzte
Richtung reflektiert wird, wird durch einen halbdurchlässigen Spiegel HM mit
dem Probenlicht zusammengefaßt, und das resultierende, zusammengesetzte
Licht wird in einem Detektor 2 photoelektrisch umgewandelt. Der Detektor 2
erzeugt ein Ausgangssignal, welchem ein lnterferenzsignal überlagert ist, dessen
Frequenz mit der Geschwindigkeit des bewegten Spiegels M korrespondiert.
Da die Intensität der Wechselkomponente des Ausgangssignals proportional
zur Intensität des von der durchlässigen Probe 20 gestreuten Lichts ist, kann
eine Absorptionsverteilung in der Probe 20 gemessen werden, indem die
Größe des Wechselanteils an jedem Meßpunkt festgestellt wird, während die Probe
20 von einem x-y-Scannergerät XY gerastert verfahren wird. Es ist ebenfalls
möglich, eine spektrale Absorptionsverteilung zu messen, indem während der
Aufnahme der Absorptionsverteilung die Wellenlänge des Lasers 10 mit
variabler Wellenlänge durchgestimmt wird.
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Figur 6 zeigt eine Vorrichtung, welche ein hochauflösendes Detektorsytem 40
verwendet, das über ein in Figur 4 dargestelltes, lichtempfängliches System
vom Michelson-Typ verfügt. Da dieses Gerät eine Modifikation darstellt, welche
dadurch entstanden ist, daß einfach die entsprechende Anordnung gemäß
Figur 4 in eine vertikale Form umgruppiert wurde, ist eine detaillierte Erläuterung
überflüssig. Es sollte angemerkt werden, daß in Figur 6 ein Antriebssystem 7
vorgesehen ist, um den beweglichen Spiegel M entlang der optischen Achse zu
bewegen.
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Obwohl bei den vorangehend beschriebenen Ausführungsformen
angenommen wurde, daß der Laser 10 mit variabler Wellenlänge kontinuierlich oszilliert,
sollte angemerkt werden, daß auch ein gepulster Laser mit variabler
Wellenlänge
verwendet werden kann. Insbesondere im Fall einer Probe, deren
Eigenschaften sich bei kontinuierlicher Bestrahlung mit Laserlicht rapide ändert, ist es
vorzuziehen, einen gepulsten Laser mit variabler Wellenlänge zu verwenden.
Obwohl hinsichtlich des Detektors 2 keine speziellen Erläuterungen gemacht
wurden, kann jedes Detektormittel Verwendung finden. Der reflektierende
Spiegel des Michelson-Interferometers kann entweder mit einer konstanten
Geschwindigkeit bewegt werden oder er oszilliert nach Art einer
Sägezahnwelle.
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Wie oben ausgeführt, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und
Vorrichtung zur Messung der spektralen Absorption in einer undurchsichtigen Probe
eine streuende Probe mit einem hochgerichteten Licht von variabler
Wellenlänge aus einer bestimmten Richtung beleuchtet, so daß die gestreuten Strahlen
so weit als möglich entfernt werden, und darüber hinaus wird ausschließlich die
Intensität der parallelen Strahlen eines in eine bestimmte Richtung
hindurchtretenden Anteils (d.h., Strahlen eines geradlinigen Anteils) erfaßt, in dem ein
hochgerichtetes, lichtempfängliches System vom Michelson-Typ verwendet
wird.
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Demzufolge ist es möglich, die spektralen Absorptionseigenschaften einer
streuenden Probe mit hoher Genauigkeit zu messen, ohne in andere,
unerwünschte Richtungen gestreutes Licht oder anderweitiges Lichtrauschen
aufzunehmen. Zusätzlich wird die Steuerung der Messung gegenüber den
herkömmlichen Meßverfahren außerordentlich vereinfacht, so daß die Messung
extrem erleichtert ist. Solchermaßen ist das Verfahren und die Vorrichtung der
vorliegenden Erfindung geeignet für die Messung der spektralen Absorption
eines in eine bestimmte Richtung hindurchgelassenen Anteils nicht nur in
dünnen, heterogenen Systemen mit einem räumlichen Auflösungsvermögen, bspw.
in Suspensionen oder organischen Geweben, sondern auch in dichten,
transparenten Objekten, welche in einem gewissen Umfang Streuungen
verursachen.
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Bei dem Verfahren und der Vorrichtung zur Messung einer mikroskopischen
Absorptionsverteilung in einer undurchsichtigen Probe gemäß einem anderen
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein sehr kleiner Meßpunkt einer Probe
mit gesammeltem, stark gerichteten Licht beleuchtet, und Licht, welches von
dem Meßpunkt ausgeht, wird in parallele Strahlen umgewandelt oder
unverändert in der Form einer Kugewelle belassen, und sodann unter Verwendung
eines hochgerichteten lichtempfindlichen Systems vom Michelson-Typ erfaßt.
Demzufolge ist es möglich, die Absorption in einem sehr kleinen Bereich einer
Probe mit hoher Auflösung zu messen, ohne gestreutes Licht aus der
Umgebung des Meßpunkts oder anderes Lichtrauschen aufzunehmen. Demzufolge
sind das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung geeignet
zur Messung einer mikroskopischen Absorptionsverteilung in einer undurch
sichtigen Probe, bspw. einem organischen Gewebe.