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DE69120089T2 - Anhäufung von aminosäuren und peptiden in liposomen - Google Patents

Anhäufung von aminosäuren und peptiden in liposomen

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DE69120089T2
DE69120089T2 DE69120089T DE69120089T DE69120089T2 DE 69120089 T2 DE69120089 T2 DE 69120089T2 DE 69120089 T DE69120089 T DE 69120089T DE 69120089 T DE69120089 T DE 69120089T DE 69120089 T2 DE69120089 T2 DE 69120089T2
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DE
Germany
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liposomes
peptide
amino acid
gradient
lysine
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DE69120089T
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Ajoy Chakrabarti
Ian Clark-Lewis
Pieter Cullis
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Original Assignee
Liposome Co Inc
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Publication date
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Description

  • Es konnte gezeigt werden, daß einige biogene Amine und antineoplastische Mittel in Liposomen als Reaktion auf einen auferlegten Protonengradient akkumuliert werden, was als "Fernbeladung" ("remote bading") bekannt ist [siehe z.B. Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta, 857, 123, (1986), Mayer, et al., Biochemistry, 27, 2053, (1988) und M.B. Bally, et al., Chem. Phys. Lipids, 47, 97, (1988)]. Diese Beladungstechnik erlaubt die unabhängige Anderung irgendeines liposomalen Parameters. Viel höhere Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisse können verglichen mit konventionellen Techniken erreicht werden [Mayer, et al., Chem. Phys. Lipids, 40, 333 (1986)]. Zusätzlich wird die Transmembranverteilung des Arzneimittels im allgemeinen durch den Protonengradient bestimmt, der das Austreten des Arzneimittels durch Änderungen in der Pufferkapazität des intravesikulären Mediums bestimmt.
  • Die Verwendung vön Protonen- und anderen Ionengradienten um Arzneimittel einzufangen, die nicht-zwitterionische schwache Basen sind, erwies sich als praktisch für Adriamycin, die Lokalanästhetika Dibucain und Dopamin und andere Arzneimittel. Vorteile dieses Systems schließen den effizienten Arzneimitteleinschluß, geringere Geschwindigkeiten der Arzneimittelfreisetzung als bei passiv eingeschlossenen Arzneimitteln und höhere Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisse ein, verglichen mit solchen, die auf andere Weise erreicht werden können.
  • Zusätzlich können Probleme mit der Arzneimittelabgabe während der Lagerung oder des Arzneimittelabbaus während der Liposomenherstellung vermieden werden, da die Liposome in Abwesenheit der Arzneimittel hergestellt werden können. Man nimmt an, daß die intraliposomale Arzneimittelakkumulation als Reaktion auf pH-Gradienten in ähnlicher Weise auftritt, wie für andere schwache Basen, z.B. die pH-Gradientensonde Methylamin. Methylamin äquilibriert durch die liposomalen Membranen in der ungeladenen Form und reionisiert entsprechend der Henderson- Hasselbach-Beziehung des phs seiner Umgebung. Die Gleichgewichtsverteilung reflektiert den Transmembran-pH-Gradienten und seine Redistribution kann verwendet werden, um diese Gradienten zu messen. Nicht alle Mittel die die Kapazität besitzen entsprechend der Henderson-Hasselbach-Beziehungen ionisiert zu werden akkumulieren jedoch in Liposomen entsprechend dieser Beziehung.
  • Tatsächlich scheinen bestimmte Mittel nicht im geringsten zu akkumulieren. Zusätzlich unterliegen bestimmte Mittel, die entsprechend dieser Beziehung akkumulieren können, der sofortigen Freisetzung, wodurch unbrauchbare Formulierungen entstehen können, die unmittelbar nach ihrer Herstellung verwendet werden müssen, und die praktisch als Produkten mit verzögerter Freisetzung unbrauchbar sind.
  • Liposome sind vollständig geschlossene Lipid-Doppelschichtmembranen, die ein eingeschlossenes wäßriges Volumen enthalten. Liposome sind Vesikel, die unilamellar (Einzelmembran) oder multilamellar sind(zwiebelartige Strukturen, gekennzeichnet durch Mehrfach-membrandoppelschichten, die jeweils von der nächsten durch eine wäßrige Schicht getrennt sind). Die Doppelschicht setzt sich aus zwei Lipidmonoschichten zusammen, die eine hydrophobe "Schwanz"-Region und eine hydrophile "Kopf"-Region aufweisen. In der Membrandoppelschicht orientieren sich die hydrophoben (nicht polaren) "schwänze" der Lipidmonoschichten in Richtung des Zentrums der Doppelschicht, während die hydrophilen (polaren) "Köpfe" sich zur wäßrigen Phase hin orientieren.
  • Die WO-A-8 707 530, US-A-4 885 172, BBA 857 (1986) 123- 126, Biochem. 1988, 27, 2053-2060, Chem. and Phys. of Lipids 53(1990) 37-46 offenbaren die Beladung von Liposomen mit ionisierbaren schwach sauren oder basischen Mitteln, durch Trans-Doppelschicht-pH-Gradienten.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Laden bestimmter Aminosäuren und Peptide zu offenbaren, die schwach saure oder basische Eigenschaften aufweisen wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert. Die Aminosäuren und Peptide dieser Erfindung sind genauer diejenigen, worin das terminale C und andere Carboxyl-Funktionen durch Substitution davon modifiziert wurden, und mit einer funktionellen Gruppe wie z.B. einem Ester oder einem Amid assoziiert werden. Genauer werden die basischen Aminosäuren und Peptide dieser Erfindung zu Methylestern, Ethylestern oder Amid-Formen modifiziert.
  • Die Beladung durch einen Transmembran-Konzentrations- Gradienten, genauer einen Transmembran-pH-Gradienten tritt für bestimmte Aminosäuren und Peptide auf, worin die C-terminale Carboxyl-Funktion substituiert ist, worin die Aminosäure oder das Peptid schwach saure oder basische Eigenschaften zeigt und genauer, worin eine solche Aminosäure oder Peptid-Carboxyl- Funktion zu einer nichtsauren Gruppe wie ein Amid oder ein Methylester modifiziert ist. Eine solche Aminosäure und solche Peptidderivate zeigen schwach basische Eigenschaften. Solche Aminosäuren und Peptide werden in LUVs durch die Verfahren der Erfindung als Reaktion auf einen Transmembran-Konzentrations- Gradienten (z.B. einen Transmembran-pH-Gradienten) (innen sauer) geladen.
  • Die Verfahren der Erfindung führen zur Transmembran- Konzentrations-Gradienten-angetriebenen Beladung der Aminosäurederivate Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester und den Peptiden Bombesin (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu-Met-NH&sub2;), ein Gastrin-verwandtes Peptid (N-t- BOC-Trp-Met-Asp-Phe-Amid), ein Wachstumshormon-Auslösefaktor-Fragment (Growth Hormone Releasing Factor Fragment) (Lys-Tyr- Trp-Trp-Phe-NH&sub2;).
  • Die Verfahren der Erfindung führen jedoch nicht zur Beladung in LUVs bei bestimmten anderen Aminosäuren und Peptiden, z.B. können die Peptide Histidinmethylester, (Lys)&sub5;-Methylester und (Lys-(Ala)&sub4;)-Methylester nicht in Liposome durch die Verfahren der Erfindung geladen werden.
  • Figur 1 stellt graphisch den Zeitverlauf des Lysinmethylesters in 100 nm EPC Vesikel, die einen 7,5/4,0 (außen/innen) pH-Gradienten tragen (offene Kreise). Kontrollvesikel ohne pH- Gradient (7,5/7,5 - offene Dreiecke) und 4,0/4,0 - (offene Quadrate) wurden auch getestet. Die Aufnahme wurde bei 20ºC durchgeführt. Die äußere Konzentration des Lysinmethylesters betrug 1,3 mM.
  • Figur 2 stellt graphisch den Zeitverlauf der Aufnahme des Lysinmethylesters in 100 nm EPC : Cholesterin-Vesikel (55 : 45 mol-%) dar, die einen 7,5/4,0 (außen/innen) pH-Gradienten tragen. Die Aufnahme wurde bei 4ºC (offene Kreise), 20ºC (offene Dreiecke) und 37ºC (offene Quadrate) durchgeführt. Die äußere Konzentration des Lysinmethylesters betrug 2,0 mM.
  • Figur 3 stellt graphisch den Zeitverlauf der Aufnahme von Lys-Tyr-Trp-Trp-Phe-Amid in 100 nm EPC-Vesikel dar, die einen 7,5/4,0 (außen/innen) (offene Quadrate) und einen 7,5/7,5 (außen/innen) (offene Kreise)-pH-Gradienten tragen. Die Aufnahme wurde bei 23ºC durchgeführt. Die äußere Konzentration des Lys-Tyr-Trp-Trp-Phe-Amid betrug 76 uM.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft liposomale Zusammensetzungen nach den Ansprüchen 5 bis 11. Solche Liposome zeigen eine deutlich erhöhte Akkumulation von Aminosäuren und Peptiden, wie es aufgrund der Henderson-Hasselbach-Beziehung erwartet worden war, durch Formulierung der Liposome unter Verwendung eines ersten inneren wäßrigen Puffers und eines zweiten äußeren wäßrigen Puffers, der erste und zweite Puffer unterscheiden sich hinsichtlich der Jonen(Protonen)-Konzentration.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Beladung von Liposomen mit C-terminal-Carboxylfunktionsubstituierten Aminosäuren oder Peptiden, worin die Aminosäure oder das Peptid schwach saure oder basische Eigenschaften zeigen und genauer, worin eine solche Aminosäure oder Peptid- Carboxylfunktion zu einer nicht-ionischen Gruppe wie einem Amid oder Methylester modifiziert ist. Solche Aminosäure- und Peptid-Derivate zeigen schwach basische Eigenschaften.
  • Die Beladung schließt die Herstellung von Liposomen mit einem Konzentrationsgradienten einer oder mehrerer geladener Spezies durch ihre Membranen ein, wobei der Konzentrationsgradient fähig ist zur Erzeugung eines Transmembran-Potentials mit einer Orientierung, die das Laden des Peptids in die Liposome verursacht, und Mischen der Aminosäure oder des Peptids mit den Liposomen. Die Liposome sind diejenigen, die durch irgendein Verfahren gebildet werden können. Sie stellen jedoch bevorzugt große unilamellare Vesikel dar. Der Konzentrationsgradient wird gebildet durch Einschließen eines ersten Mediums in den Liposomen, wobei dieses Medium eine erste Konzentration einer oder mehrerer geladener Spezies aufweist und Suspendieren der Liposome in einem zweiten Medium, das eine zweite Konzentration einer oder mehrerer geladener Spezies aufweist. Ein solcher Konzentrationsgradient kann z.B. ein pH-Gradient sein.
  • Die Aminosäure- und Peptid-Derivate, die durch den Transmembran-Konzentrations-Gradienten nach dem Verfahren der Erfindung geladen werden können, schließen die Aminosäuredenvate Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester und die Peptide Bombesin (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH&sub2;), Gastrin-verwandtes Peptid (N-t-BOC-Trp-Met- AsP-Phe-Amid), die Growth Hormone Releasing Peptide Tyr-Gly- Trp-Phe-Phe-Amid und Trp-Ala-Trp-Phe-Ala-Amid und das Growth Hormone Releasing Factor Fragment (Lys-Tyr-Trp-Trp-Phe-NH&sub2;) ein.
  • Die Peptide Histidinmethylester, Trp-Nle-Arg-Phe-Amid (molluscacardioexzitatorisches-Neuropeptid-Analog), p-Glu-Ser- Leu-Arg-Trp-Amid (Seeanemonen-Neuropeptid), Luteinizing Hormone Releasing Hormone (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&sub2;), Lys&sup8;-Vasopressin (Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly- NH&sub2;), (Lys)&sub5;-Methylester und (Lys-(Ala)&sub4;) Methylester können nicht durch die Verfahren der Erfindung in Liposome geladen werden.
  • Auch werden pharmazeutische Präparate offenbart, die solche C-terminal substituierten Aminosäuren oder Peptide umfassen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung in die Liposome geladen wurden.
  • Das Beladungsverfahren verläuft durch Vermischen des Aminosäure- oder Peptid-Derivates mit den Liposomen, die einen Transmembran-Potential durch ihre Membranen aufweisen, wobei die Orientierung des Transmembran-Potential so ist, daß, wenn das Mittel positiv geladen ist, das innere Potential der Liposome negativ zu dem Potential des äußeren Mediums ist, und wenn das Mittel negativ geladen ist, das innere Potential der Liposome positiv relativ zu dem Potential des äußeren Mediums ist. Das Transmembran-Potential kann hergestellt werden durch Erzeugen eines Konzentrations-Gradienten einer oder mehrerer geladenen Spezien durch die Liposomen-Membranen wie z.B. H&spplus;- Ionen, worin der Konzentrations-Gradient ein pH-Gradient ist.
  • Im allgemeinen können die Liposomen-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung unter anderen Phospholipide wie Ei- Phosphatidylcholin (EPC), hydriertes Sojaphosphatidylcholin, Distearoylphosphati-dylcholin, Dimyn stoylphosphatidylcholin oder Diarachidonyl-phosphatidylcholin und zusätzlich eine Anzahl steroidaler Zusammensetzungen ebenso wie andere Zusammensetzungen umfassen.
  • Wenn die liposomalen Zusammensetzungen zusätzlich steroidale Zusammensetzungen umfassen, können diese Cholesterin einschließen, das bevorzugt in einem 55 : 45 (Lipid steroidales Lipid) Gew./Gew.-Verhältnis verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart den wirksamen Einfang von Aminosäuren und Peptiden in Liposomen, die einen Transmembran-Ionen-Gradienten zeigen, bevorzugt einen Transmembran-pH- Gradienten.
  • Die Aminosäure- und Peptid-Derivate, die durch das Transmembran-Konzentrations-Gradienten-Verfahren der Erfindung geladen werden können, schließen die Aminosäure-Derivate Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester und die Peptide Bombes in (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- Met-NH&sub2;), Gastrin-verwandte Peptide (N-t-BOC-Trp-Met-Asp-Phe- Amid), und das Wachstumshormon-Auslösefaktor-Fragment (Growth Hormone Releasing Factor Fragment) (Lys-Tyr-Trp-Trp-Phe-NH&sub2;) ein.
  • Die Peptide Histidinmethylester (Lys)&sub5;-Methylester und (Lys-(Ala)&sub4;)-Methylester können nicht durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Liposome geladen werden.
  • Die Liposome der vorliegenden Erfindung können durch irgendein bekanntes Verfahren aus dem Stand der Technik gebildet werden, bevorzugt werden sie jedoch entsprechend der Verfahren, offenbart in Bally et al., PCT-Anmeldungsnr. US 86/01102, veröffentlicht am 27. Februar 1986 und Mayer et al., PCT-Anmeldungsnr. US 88/006436, veröffentlicht am 7. September 1988 gebildet. Diese Techniken erlauben die Beladung von Liposomen mit ionisierbaren Mitteln, um Innenkonzentrationen zu erreichen, die beträchtlich größer sind als sie aufgrund der Löslichkeit der Mittel in wäßriger Lösung bei neutralem pH zu erwarten wären und/oder Konzentrationen, die höher sind als die die durch passive Einschlußtechniken erhalten werden können.
  • In dieser Technik wird ein Transmembran-Ionen-(pH)-Gradient zwischen den inneren und äußeren Membranen der Liposome erzeugt, und das Mittel wird in die Liposome mittels des Ionen(pH)-Gradienten geladen, der die Aufnahme antreibt. Der Transmembran-Gradient wird erzeugt durch Bilden eines Konzentrations-Gradienten für eine oder mehrere geladene Spezies, z.B. Na+, Cl-, K+, Li+, OH- und bevorzugt H+ durch die Liposomenmembranen, so daß der Ionen-Gradient die Aufnahme der ionisierbaren Mittel durch die Membran antreibt.
  • In der vorliegenden Erfindung werden Transmembran-Ionen- (H+)-Gradienten bevorzugt verwendet, um den Ionen-Gradienten zu erzeugen, und die Mittel, die dazu neigen schwach basische Stickstoffgruppen aufzuweisen, in die Liposome zu laden. In der vorliegenden Erfindung werden die Liposome bevorzugt zunächst in einer wäßrigen Pufferlösung gebildet. Die erste Lösung ist entweder sauer oder basisch, abhängig davon, ob das zu ladende Mittel bei einem basischen oder bei einem sauren pH eine geladene Spezies bildet. Z.B. wird im Falle des Beladens schwach basischer Mittel eine geladene Spezies bei einem niedrigen pH erzeugt, d.h. einem pH von 2,0 bis 5,0, bevorzugt bei einem pH von 4,0. Nach Bildung der Liposome mit einer sauren inneren wäßrigen Pufferlösung wird die Pufferlösung außerhalb der Liposome dann auf einen pH geändert, der signifikant über dem pH der inneren Pufferlösung liegt, bevorzugt mindestens 3,0 bis 4,0 pH-Einheiten über der inneren Pufferlösung.
  • Die Modifizierung des äußeren pHs führt zu einem pH-Gradienten, der die Akkumulierung des Mittels in den Liposomen antreibt. Im allgemeinen wird das Mittel durch die Lipid-Schicht(en) der Liposome in seiner ungeladenen Form viel schneller passieren, als es in seiner geladenen (im Falle von schwach basischen Mitteln, protonierten) Form. Somit wird das ungeladene Mittel in dem äußeren Puffer schnell durch die Liposome in den inneren Puffer passieren, protoniert werden und in den Liposomen als "eingefangenes" protoniertes Molekül verbleiben, das nicht leicht durch die Liposomen-Schicht(en) passieren kann. Das Mittel wird sich folglich in den Liposomen als Funktion des pH-Gradienten zwischen den inneren und äußeren Puffer-Lösungen konzentrieren.
  • Für eine typische Liposomen-Herstellungstechnik, wie sie im folgenden vollständig beschrieben wird, wird die erste wäßrige Puffer-Lösung die Liposome bei der Bildung umgeben, was zu einer Puffer-Lösung führt, die innerhalb und außerhalb der Liposome vorliegt. Um den Konzentrations-Gradienten zu erzeugen, kann die ursprüngliche äußere Puffer-Lösung angesäuert oder alkalisch gemacht werden, so daß die Konzentration der geladenen Spezies sich von dem inneren Puffer unterscheidet, oder alternativ kann der äußere Puffer durch ein neues äußeres Medium mit einer verschiedenen Ladungsspezies ersetzt werden. Der Ersatz des äußeren Mediums kann durch verschiedene Techniken bewerkstelligt werden, wie der Überführung des Liposomen- Präparates durch eine Gel-Filtrations-Kolonne z.B. eine Sephadex-Kolonne, die mit dem neuen Medium äquilibriert wurde oder durch Dialyse oder durch verwandte Techniken.
  • e In der vorlliegenden Erfindung sind Liposomen-Zusammensetzungen bevorzugt, die unter Verwendung einer ersten inneren Puffer-Lösung von saurem Charakter (pH 3,0 bis 5,0) und einer zweiten äußeren Puffer-Lösung, deren pH bevorzugt zwischen 6,5 und 8,0, bevorzugt 7,5 liegt, gebildet werden. Der niedrige pH des inneren Puffers relativ zu dem basischeren oder neutralen pH des äußeren Puffers erzeugt einen Transmembran-Gradienten, der die Wirkung besitzt, die Akkumulierung des Mittels in den Liposomen anzutreiben.
  • Lipide, die in den Liposomenformulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können schließen synthetische oder natürliche Phospholipide ein und können Phosphatidylcholin (PC), Phoshatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin (SPM) und Cardiolipin unter anderem entweder allein oder in Kombination einschließen. Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Phospholipide können auch Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPG) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) einschließen. In anderen Ausführungsformen können auch Distearylphosphatidylcholin (DSPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) oder hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC) verwendet werden. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Diarachidonoylphosphatidylcholin (DAPC) können ähnlich verwendet werden.
  • Infolge der erhöhten Übergangstemperatur (Tc) der Lipide wie DSPC (Tc von 65ºC), DPPC (Tc von 45ºC) und DAPC (Tc von 85ºC), werden solche Lipide bevorzugt auf ungefähr ihren Tc oder Temperaturen, die leicht darüber liegen, z.B. bis zu 5ºC höher als Tc erhitzt, um diese Liposome herzustellen.
  • In den bevorzugten Ausführungsformen wird Ei-Phosphatidylcholin verwendet. In einer Anzahl von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine steroidale Komponente zu den Liposomen unabhängig von dem gewählten Phospholipid hinzugegeben werden. Eine solche steroidale Komponente kann z.B. ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Cholesterin, Cholestanol, Coprostanol oder Cholestan. Zusätzlich können Polyethylenglykolderivate des Cholesterins (PEG-Cholesterin) ebenso wie organische Säurederivate von Sterolen z.B. Cholesterinhemisuccinat (CHS) in Kombination mit irgendeinem der oben erwähnten Phospholipide verwendet werden. Organische Säurederivate des alpha-Tocopherol-Hemisuccinats (THS) können auch verwendet werden. CHS- und THS-enthaltende Liposome und ihre Trissalzformen können im allgemeinen durch irgendein bekanntes Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die Sterole enthalten, hergestellt werden.
  • Irgendeines der oben erwähnten Sterole kann in den Liposomen verwendet werden, solange die resultierende Phospholipid- Sterol-Mischung stabile Liposome liefert. Insbesondere siehe die Verfahren von Janoff, et al., US-Patent Nr. 4.721.612, herausgegeben am 26. Januar 1988 mit dem Titel "steroidal Liposomes", und Janoff, et al., PCT-Publikationsnr. 87/02219, veröffentlicht am 23. April 1987 mit dem Titel "alpha Tocopherol-Based Vehides", deren bedeutende Teile hier als Referenz enthalten sind. In bestimmten Ausführungsformen, in denen die Liposome so gebaut sind, daß sie eine rasche Freisetzung des Mittels verhindern, wird das Cholesterin in einer Menge entsprechend 30 mol/Gew.-% bis 45 mol/Gew.-% des von den Liposomen umfaßten Lipipds bevorzugt in Kombination mit irgendeinem der oben genannten Phospholipide oder der Phospholipid/ Steroid-Kombinationen verwendet. Solche Zusammensetzungen sollten im allgemeinen die unerwünschte rasche Freisetzung des akkumulierten Mittels aus den Liposomen verhindern. Irgendeine Kombination einer Membran-stabilisierenden Komponente und eines Lipids können verwendet werden, die die rasche Freisetzung der Mittel aus den Liposomen verhindert, und der Fachmann wird in der Lage sein die Membran-stabilisierende Komponente und das Phospholipid zu modifizieren, um Liposome zu bilden, die die rasche Freisetzung des Mittels verhindern.
  • Am meisten bevorzugt werden in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung Liposome verwendet, die entweder Phosphatidylcholin oder eine Mischung von 45 mol/Gew.-% Cholesterin und 55 mol/Gew.-% Phosphatidylcholin umfassen.
  • Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um die Liposome der vorliegenden Erfindung zu bilden. Z.B. können multilamellare Vesikel (MLVs), stabile plurilamellare Vesikel (SPLVs) oder Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (reverse phase evaporation vesides) (REVs) verwendet werden. Bevorzugt werden jedoch die MLVs durch Filter gegeben, wobei sich große unilamellare Vesikel (LUVs) mit Größen bilden, die von der verwendeten Filtergröße abhängen. Im allgemeinen werden Polycarbonatfilter mit 30, 50, 60, 100, 200 oder 800 nm-Poren verwendet. In diesem Verfahren, offenbart in Cullis et al., PCT-Püblikationsnr. WO 86/000238 vom 16. Januar 1986, deren bedeutende Anteile hier als Referenz erhalten sind, kann die Liposomen- Suspension wiederholt über die Extrusionsvorrichtung gegeben werden, was zu einer Population von Liposomen mit homogener Größenverteilung führt.
  • Z.B. kann das Filtrieren durch einen Durchlauf-Membranfilter (ein Nukleopore-Polycarbonat-Filter) oder einen Windungsweg (tortuous path)-Filter (z.B. ein Nukleopore-Filter- Membrafilfilter (gemischte Celluloseester) von 0,1 um Größe), oder durch alternative Größenreduktions-techniken wie der Homogenisierung durchgeführt werden. Die Größe der Liposome kann von 0,03 bis ungefähr 2 Mikron im Durchmesser variieren, bevorzugt 0,05 bis 0,3 Mikron und am meisten bevorzugt 0,1 bis 0,2 Mikron. Der Größenbereich schließt Liposome ein, die MLVs, SPLVs oder LUVs sind.
  • In der vorliegenden Erfindung sind diejenigen Liposome bevorzugt, die unilamellare Liposome mit 0,1 bis 0,2 Mikron sind. Wie oben beschrieben, kann eine Anzahl von Lipiden verwendet werden, um Liposome mit einem Gel zu flüssig-kristallinen Tc oberhalb Raumtemperatur verwendet werden. In solchen Fällen kann ein Extruder mit einer Heiztrommel oder einem Thermomantel verwendet werden. Eine solche Vorrichtung dient dazu, die Liposome-Suspensionstemperatur zu erhöhen, was die Extrusion der LDVs erlaubt. Die mit dem Thermo-ummantelten Extruder verwendeten Lipide sind z.B. DSPC, DPPC, DMPC und DAPC oder Mischungen davon, die Cholesterin in bestimmten Ausführungsformen zur Verhinderung der raschen Freisetzung der Mittel aus den Liposomen einschließen. Liposome, die DSPC enthalten, werden im allgemeinen bei 65ºC, DPPC bei 45ºC und DAPC bei 85ºC (5ºC oberhalb des Lipid Tc) extrudiert.
  • Wie angegeben, sind die bevorzugten Liposome für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung LUVs ungefähr 0,06 bis 0,3 Mikron groß. Wie in der vorliegenden Anmeldung definiert, ist eine homogene Population der Vesikel eine solche, die im wesentlichen Liposome gleicher Größe umfaßt, und die eine Gauss-Verteilung der Partikelgrößen aufweisen kann. Eine solche Population nennt man gleichförmige Größenverteilung und sie kann hinsichtlich der Größe unimodal sein. Der Ausdruck "unimodal" bezieht sich auf eine Population mit einer engen Polydispersität der Partikelgrößen, und die Partikel besitzen eine einzelne Erscheinungsform ("mode"). Eine liposomale Population ist unimodal, wenn sich die Population bei Messung durch quasielastische Lichtstreuungsverfahren einer Gauss-Verteilung annähert, und wenn ein Polynom zweiter Ordnung auf den natürlichen Logarithmus der Autokorrelationsfunktion der Probe paßt (Koppel, 1972, J. Chem. Phys., 57 : 4814). Je besser diese Anpassung ist, desto besser ist das Ausmaß der Unimodalität.
  • Der Grad dieser Anpassung kann bestimmt werden, indem man feststellt, wie nahe der chi-Quadrat (chi²)-Wert der Probe an eins liegt. Ein chi²-Wert von 2,0 oder weniger ist kennzeichnend für eine unimodale Population.
  • Weitere Größenreduktionstechniken können bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Z.B. können Homogenisierungs- oder Mahltechniken erfolgreich angewendet werden. Solche Techniken können zur Bildung von Liposomen führen, die homogen oder unimodal im Hinblick auf ihre Größenverteilung sind. Liposome können hergestellt werden, die wie zuvor beschrieben, eine erste wäßrige Pufferlösung einschließen.
  • Während der Herstellung der Liposome können auch organische Lösungsmittel verwendet werden, um die Lipide zu suspendieren. Geeignete organische Lösungsmittel für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen diejenigen mit einer Anzahl von Polaritäten und dielektrischen Eigenschaften ein, die Lipide lösen, z.B. unter anderen Chloroform, Methanol, Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Methylenchlorid und Lösungsmittelmischungen wie Benzol : Methanol (70 : 30). Als Ergebnis werden Lösungen (Mischungen, in denen die Lipide und andere Komponenten gleichförmig verteilt sind), die die Lipide enthalten, gebildet. Die Lösungsmittel werden im allgemeinen auf der Grundlage ihrer Bioverträglichkeit, geringen Toxizität und ihren Lösungseigenschaften ausgewählt.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein 3-Komponenten-liposomales Mittel-Behandlungssystem, das den hocheffizienten Einschluß des Mittels in der Klinik erlaubt. Wenn das Mittel eines ist, das als Antwort auf einen Transmembran-pH-Gradienten, bei dem das Innere der Liposome sauer ist, lädt, umfaßt die erste Komponente des Systems (Ampulle 1) Liposome in einer sauren, wäßrigen oder Pufferlösung, z.B. ein Zitronensäurepuffer (bei 300 mM, pH 3,8 bis 4,2, bevorzugt 4,0).
  • Die zweite Komponente des Systems (Ampulle 2) umfaßt einen relativ basischen Puffer oder eine wäßrige Lösung, z.B. eine Natriumcarbonat- oder Natriumbiphosphat-Lösung oder eine Natriumchlorid/HEPES gepufferte Salzlösung ("HBS") bei pH 10 bis 12, bevorzugt pH 11,5, die dazu dient, Teil der äußeren wäßrigen oder Pufferlösung der Liposomen-Formulierung zu werden.
  • Die dritte Komponente (Ampulle 3) ist das einzuschließende Mittel. Das oben beschriebene Behandlungssystem kann als 3- Ampullen-System bereitgestellt werden, die erste Ampulle, die die Liposome in saurem Medium enthält, die zweite Ampulle, die eine Lösung mit relativer Alkalinität enthält, und die dritte Ampulle, die das Aminosäure- oder Peptid-Derivat (das Mittel), wie zuvor beschrieben, enthält. Ein ähnliches Behandlungssystem kann für ein Mittel bereitgestellt werden, das als Antwort auf einen Transmembran-Gradienten lädt, worin der innere Puffer der Liposome relativ basisch ist, d.h. einen pH von 8,5 bis 11,5 besitzt. In einem solchen Fall würde die erste Ampulle die Liposome in einem relativ alkalischen Medium enthalten, die zweite Ampulle würde eine Lösung mit relativer Acidität enthalten und die dritte Lösung das einzuschließende Mittel.
  • Nach der Bildung des pH-Gradienten durch die Liposomen (durch Mischen der ersten und zweiten Ampullen) können die Liposome vor dem Vermischen mit der Aminosäure oder dem Peptid erhitzt werden. Unter bestimmten Umständen und in Fällen, worin das Mittel in Liposome, die, um die rasche Freisetzung des Mittels zu minimalisieren, mindestens 30 mol-% Cholesterin umfassen, zu laden ist, kann es vorteilhaft sein, die Liposome zu erhitzen, um das Beladen zu erleichtern, bis zu der Temperatur, die für die Liposomenzusammensetzung und die Gegenwart der Aminosäure oder des Peptids geeignet sind. Z.B. kann das Beladen bei Temperaturen von 4ºC bis 60ºC stattfinden.
  • Um das Mittel (die Mittel) in die Liposome unter Verwendung des oben beschriebenen Behandlungssystems zu laden, können die in Mayer, et al., PCT-Veröffentlichungsnr. WO 88/06442, 7. September 1988, deren bedeutende Teile hier als Referenz enthalten sind, beschriebenen Verfahren für die Verwendung mit den Mitteln der vorliegenden Erfindung modifiziert werden.
  • In einem Liposomen-Arzneimittel-Abgabesystem, wird das Mittel in den Liposomen eingeschlossen oder damit assoziiert und dann den zu behandelnden Patienten verabreicht. Wenn die Mittel z.B. Arzneimittel sind, siehe z.B. Rahman et al., US- Patent Nr. 3.993.754; Sears, US-Patent Nr. 4.145.410; Papahadjopoulos et al., US-Patent Nr. 4.235.871; Schneider, US- Patent Nr. 4.114.179; Lenk et al., US-Patent Nr. 4.522.803; und Fountain et al., US-Patent nr. 4.588.578. Die Ausdrücke Aminosäure und Peptid und der Ausdruck Mittel werden durch die gesamte Beschreibung austauschbar verwendet.
  • Die Wahl des Puffers, zur Verwendung als innere Pufferlösung, kann von dem für die Beladung ausgewählten Mittel abhängen. Der Fachmann ist in der Lage, die relativen Löslichkeiten der ionisierten Spezies eines bestimmten Mittels festzustellen und die Pufferstärke der als innere Pufferlösung zu verwendenden Pufferlösung zu bestimmen. Irgendeine Pufferlösung, die die allgemein hierin zuvor beschriebenen Eigenschaften aufweist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Lösung, falls notwendig, pharmazeutisch verträglich ist, d.h., wenn die Lösung dem Patienten ohne schädliche Wirkungen verabreicht werden kann.
  • Typische innere Pufferlösungen schließen Zitronensäure, Oxalsäure, Succinsäure und andere organische Säuresalze bevorzugt unter anderen ein. Zitronensäure mit einer Konzentration im Bereich von 100 mM bis 300 Itim ist bevorzugt. Am meisten bevorzugt besitzt die Zitronensäure-Pufferlösung eine Konzentration von 300 mM.
  • Typische äußere Pufferlösungen können NaCl, KCL, Kaliumphosphat, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Natriumbiphosphat, Kaliumsulfat, (N-2-Hydroxyethyl-Piperazin-N'-2- Ethansulfonsäure) oder "HEPES", 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure oder "MES", N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-3- propansulfonsäure oder "EPPS", 2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure oder "CHES", Piperazin-N,N'-bis [2-ethansulfonsäure] oder "PIPES" und Mischungen davon unter anderen einschließen. In der vorliegenden Erfindung ist die bevorzugte äußere Pufferlösung NaCl/HEPES und bevorzugter 150 mM NA&sub2;SO4, 20 mM HEPES bei pH 7,5.
  • Die Beladungswirkungsgrade der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mittel reichen im allgemeinen von 20 % bis zu 100 %, bevorzugt mindestens 50 %. Im allgemeinen können die Beladungswirkungs grade für die Mittel der vorliegenden Erfindung aus der Henderson-Hasselbach-Beziehung vorhergesagt werden. Natürlich akkumulieren nicht alle Mittel leicht in Liposomen entsprechend der Henderson-Hasselbach-Beziehung und bestimmte Mittel (siehe Vergleichsbeispiele 13, 14 und 15) scheinen in bestimmten Fällen nicht im geringsten zu akkumulieren.
  • Die Liposome, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet werden, können gefriergetrocknet oder dehydratisiert werden an verschiedenen Stellen ihrer Bildung. Z.B. kann der Lipid-Film nach Entfernung des Lösungsmittels und vor der Zugabe des Mittels oder der Bildung der Liposome durch Hydratisieren des Films gefriergetrocknet werden. Eine solche Dehydratisierung kann durchgeführt werden, indem man die Lipide oder Liposome verringertem Druck aussetzt, wodurch das gesamte suspendierende Lösungsmittel entfernt wird.
  • Die Liposome selbst können durch eine Anzahl von Verfahren dehydratisiert werden. Sie können in Gegenwart eines hydrophilen Mittels entsprechend der Verfahren von Bally et al., PCT-Veröffentlichungsnr. 86/01102, veröffentlicht am 27. Februar 1986 mit dem Titel "Encapsulation of Antineoplastic Agents in Liposomes", Janoff et al., PCT-Veröffentlichungsnr. 86/01103, veröffentlicht am 27. Februar 1986 mit dem Titel "Dehydrated Liposomes", Schneider et al., in US-Patent Nr. 4.229.360, herausgegeben am 29. Oktober 1980 und Mayer et al., PCT-Veröffentlichungsnr. 88/06442, veröffentlicht am 7. September 1988, deren bedeutende Anteile hier als Referenz enthalten sind, dehydratisiert werden. Alternativ oder zusätzlich können die hydratisierten Liposompräparate auch dehydratisiert werden durch Anordnen in einem Umgebungsmedium in flüssigem Stickstoff und Ausfrieren vor dem Dehydratisierungsschritt.
  • Die Dehydratisierung mit vorherigem Ausfrieren kann in Gegenwart eines oder mehrerer Schutzmittel wie Zucker bei der Herstellung durchgeführt werden, entsprechend der Techniken von Bally, et al., PCT-Anmeldenr. 86/01103, veröffentlicht am 27. Februar 1986, deren bedeutende Anteile hier auch als Referenz enthalten sind. Solche Techniken vergrößern die Langzeitlagerung und die Stabilität der Präparate. Das Mittel kann z.B. mit einer Zuckerlösung in einem Zucker : Lipid-Gew./Gew.-Verhältnis im Bereich von 0,5 : 1 bis 100 : 1, bevorzugt 20 : 1 vermischt werden, ohne die Fähigkeit der Liposome zu beeinträchtigen, das geladene Mittel während der Rehydratisierung zu behalten. Andere geeignete Verfahren können in der Dehydratisierung der oben offenbarten Liposomenpräparate verwendet werden. Die Liposome können auch ohne vorheriges Ausfrieren dehydratisiert werden.
  • Sind die Liposome einmal dehydratisiert, können sie für ausgedehnte Zeiträume bis zu ihrer Verwendung gelagert werden. Die geeignete Lagertemperatur hängt ab von der Lipid-Formulierung der Liposome und der Temperaturempfindlichkeit der eingeschlossenen Materialien. Aminosäuren und Peptide sind z.B. wärmelabil und dehydratisierte Liposome, die solche Mittel enthalten, sollten bevorzugt unter Kühlung bei z.B. 4ºC gelagert werden, so daß die Wirksamkeit der Mittel nicht verlorengeht. Für solche Mittel ist es auch bevorzugt, daß der Dehydratisierungsprozeß bei verringerten Temperaturen eher als bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Wenn die dehydratisierten Liposome zu verwenden sind, wird die Rehydratisierung durch einfache Zugabe einer wäßrigen Lösung, z.B. destilliertes Wasser oder ein geeigneter Puffer zu den Liposomen erreicht, und dann läßt man sie rehydratisieren. Die Liposome können in der wäßrigen Lösung durch gelindes Schütteln der Lösung resuspendiert werden. Die Rehydratisierung kann bei Raumtemperatur oder einer anderen Temperatur durchgeführt werden, die für die Zusammensetzung der Liposome und ihre Inhalte geeignet ist.
  • Der zur Bildung des Transmembran-pH-Gradienten verwendete Konzentrations-Gradient kann entweder vor der Dehydratisierung oder nach der Rehydratisierung unter Verwendung der Austauschtechniken für das äußere Medium wie oben beschrieben erzeugt werden. Die Liposome können z.B. vor Einrichten des Transmembran-pH-Gradienten dehydratisiert werden, z.B. durch Dehydratisierung in ihrem ersten äußeren Medium. Nach der Rehydratisierung kann der pH-Gradient durch Mischen der Liposome mit dem zweiten äußeren Medium von relativ saurem oder basischem pH eingerichtet werden. Das Mittel kann mit den Liposomen gleichzeitig mit oder gefolgt von der Einrichtung des pH- Gradienten vermischt werden. Wenn die Liposome nach Aufweisen eines Transmembran-pH-Gradienten dehydratisiert werden, können die Liposome durch Mischen derselben mit einem wäßrigen Lösungsmittel von neutralem pH rehydratisiert werden. Z.B. in dem oben erwähnten Fall, worin Liposome, die einen Zitronensäurepuffer als erstes Medium enthalten, verwendet werden, würde der Rehydratisierungsschritt durch Zugeben des NaCl-HEPES-Puffers und des Mittels, z.B., des Lysinmethylesters erfolgen.
  • Wenn die Liposome bereits die relativ basische Lösung (z.B. NaCl-HEPES) enthalten, und daher den Transmembran-pH- Gradienten bereits aufweisen, rehydratisiert werden, werden Wasser oder andere neutrale wäßrige Lösungen und das Mittel hinzugegeben. Schließlich verläuft in dem Fall, worin die Liposome mit einem Transmembran-pH-Gradienten und worin sie das Mittel enthalten, dehydratisiert werden, die Rehydratisierung unter Verwendung von Wasser oder einer anderen wäßrigen Lösung. Alternativ kann ein zweites Mittel, falls gewünscht, hinzugegeben werden.
  • Liposome, die die Aminosäure- und Peptid-Formulierung der vorliegenden Erfindung enthalten, können therapeutisch bei Säugetieren, insbesondere Menschen in der Behandlung einer Anzahl von Krankheitszuständen oder pharmakologischen Bedingungen verwendet werden, die Formulierungen mit verzögerter Freisetzung ebenso wie eine wiederholte Verabreichung erfordern. Die Art der Verabreichungen der die Mittel der vorliegenden Erfindung enthaltenden Liposome kann den Ort und die Zellen in dem Organismus, an den die Verbindung verabreicht werden kann, bestimmen.
  • Die Liposome der vorliegenden Erfindung können alleine verabreicht werden, im allgemeinen werden sie jedoch in Zusammenmischung mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der im Hinblick auf die ausgewählte Verabreichungsroute und die pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wird. Die Präparate können parenteral, z.B. intravenös injiziert werden. Für die parenterale Verabreichung können sie z.B. in Form steriler wäßriger Lösungen verwendet werden, die andere gelöste Stoffe enthalten, z.B. genügend Salze oder Glukose, um die Lösung isotonisch zu machen, sollte die Isotonizität notwendig oder gewünscht sein. Die Liposome der vorliegenden Erfindung können sübkutan oder intramuskulär verwendet werden. Andere Verwendungen können abhängig von den besonderen Eigenschaften der Präparate durch die Fachleute in Betracht gezogen werden.
  • Für die orale Art der Verarbreichung kann die liposomale Formulierung der vorliegenden Erfindung in der Form von Tabletten, Kapseln, Losenges, Pastillen, Pulver, Sirups, Elixiere, wäßrige Lösungen und Suspensionen und ähnliches verwendet werden. Im Falle von Tabletten schließen Träger, die verwendet werden können, Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure ein. Verschiedene Aufschlußmittel wie Stärke, Gleitmittel und Talk werden gewöhnlich in Tabletten verwendet. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und hochmolekulargewichtige Polyethylenglykole. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der aktive Bestandteil mit Emulgatoren und Suspensionsmitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßstoffe und/oder Aromastoffe hinzugegeben werden.
  • Für die topische Art der Verabreichung können die liposomalen Formulierungen der vorliegenden Erfindung in solchen Dosierungsformen wie Gelen, Ölen, Emulsionen und ähnlichem enthalten sein. Diese Formulierungen können durch direkte Anwendung als Creme, Paste, Salbe, Gel, Lotion oder ähnliches verabreicht werden. Für die Verabreichung bei Menschen in der Behandlung von Erkrankungszuständen oder pharmakologischen Zuständen wird letztlich der verschreibende Arzt die geeignete Dosis des neoplastischen Arzneimittels für ein gegebenes menschliches Subjekt bestimmen, und es ist zu erwarten, daß diese mit dem Alter, dem Gewicht und der Antwort des Individuums ebenso wie der Pharmakokinetik des verwendeten Mittels variieren wird.
  • Auch wird die Natur und Schwere des Erkrankungszustands oder die Verfassung des Patienten die Therapiedosis beeinflussen. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß die Dosis des Arzneimittels in liposomaler Form der entspricht, die für das freie Arzneimittel verwendet wird. In einigen Fällen kann es jedoch notwendig sein, Dosierungen außerhalb dieser Bereiche zu verabreichen.
  • Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen.
  • Beispiele Materialien und Verfahren
  • Ei-Phosphatidylcholin (EPC) wurde von Avanti Polar Lipids (Birmingham, Alabama) erhalten. ¹&sup4;-C-Methylamin und ³H-Triphenylphosphoniumbromid wurden von New England Nudear bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen.
  • Lysinmethylester wurde von Sigma Chemical Co. bezogen. Das hydrophobe Pentapeptid (H&sub3;N&spplus;-Ala-Met-Leu-Trp-Ala-COO; worin die Carboxylfunktion als Methylester oder Amid modifiziert wurde, wurde entsprechend dem Syntheseverfahren in der festen Phase von de Kroon et al., 1989, BBA, 981 : 371 synthetisiert.
  • Beispiel 1 Beladung des Lysinmethylesters durch liposomale TransmembranpH-Gradienten-EPC-Vesikel
  • Multilamellare Vesikel (MLVs) wurden hergestellt durch Hydratisieren von 50 mg EPC in 1,0 ml Citrat (300 mM) Puffer bei pH 4,0. Die MLVs wurden in flüssigen Stickstoff gefroren und in Wasser bei 50 bis 60ºC aufgetaut für fünf Gefrier-Tau- Zyklen.
  • Die resultierenden MLVs wurden 10-mal durch zwei übereinanderliegende 100 nm Porengröße Polycarbonatfilter (Nudeopore) unter Verwendung einer Vorrichtung von Lipex Biomembranes Inc. (Vancouver, Canada), wie in Hope et al., 1985, BBA, 812 : 55 extrudiert. Die resultierenden großen unilamellaren Vesikel (LUVs) waren 108 nm im Durchmesser bestimmt durch quasielastische Lichtstreuung (QELS) unter Verwendung eines NICOMP-Partikelgrößenbestimmungsgerätes.
  • Die LUVs in dem pH 4,0-Medium wurden über eine 10 cm Sephadex G-50 (Medium) Kolonne gegeben, die zuvor mit 150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,5) (HEPES gepufferte Salzelösung oder "HBS") äquilibriert worden war, um den pH 7,5/4,0 außen/innen- pH-Gradienten zu erzeugen.
  • Die Aufnahme von Lysinmethylester wurde gestartet durch zunächst Lösen von 0,47 mg Lysinmethylester in 1,0 ml HBS- Medium 2,0 mM Lysinmethylester, wozu 0,25 ml LUVs gegeben wurden, die einen pH-Gradienten zeigten. Die Liposome wurden bei 23ºC inkubiert und Aliquote von 0,1 ml wurden zu ausgewählten Zeiten (siehe Figur 1) aus dieser Inkubationsmischung entfernt und nichteingeschlossenes Material wurde durch Passieren über eine 1-ml (trocken) Sephadex G-50-Kolonne entfernt, die für eine Minute bei 2500 Upm zentrifugiert wurde.
  • Beispiel 2 Kontrolle, wenn kein pH-Gradient vorlag.
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden wiederholt, worin die LUVs in dem pH 4,0-Medium über eine 10 cm Sephadex G-50 (Medium) Kolonne gegeben wurden, die zuvor mit 300 mM Citratpuffer bei pH 4,0 äquilibriert worden war, wodurch kein pH-Gradient erzeugt wurde.
  • Ähnlich wurden die Verfahren wiederholt, worin die LUVs in einem pH 7,5 Medium hergestellt wurden, und über eine 10 cm Sephadex G-50 (Medium) Kolonne gegeben wurde, die zuvor mit 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, bei pH 7,5 (HEPES gepufferte Salzlösung oder "HBS") äquilibriert wurden, wodurch kein pH-Gradient erzeugt wurde.
  • Beispiel 3 Bestimmung des geladenen Lysinmethylesters in EPC LUVs
  • Lysinmethylesterkonzentrationen im Inneren der LUVs der Beispiele 1 und 2 wurden bestimmt durch die Modifizierung einer Technik, die von Hope und Cullis angewendet wurde, 1987, J. Biol. Chem., 262 : 4360, unter Verwendung von TNBS (Trinitrobenzolsulfonsäure) um die primären Aminogruppen des Lysinmethylesters zu markieren. Der Puffer, der für die Markierung verwendet wurde, war 100 mM NaHCO&sub3;, 50 mM H&sub3;BO&sub3; bei pH 10,0. Eine Referenzküvette, die 2,5 ml des Puffers (pH 10,0) enthielt, wurde in einen Referenzstrahl gehalten. Die Probenküvette, die 2,5 ml Puffer (pH 10,0) enthielt, mit 0,5 mM TNBS- Aliquoten (50 ul) der Vesikel, die Lysinmethylester enthielten, wurde dann hinzugegeben. Die resultierende Anderung in der Extinktion wurde bei 420 nm nach der Inkubation im Dunkeln für eine Stunde gemessen. Triton X-100 (200 ul, 0,5 %) wurde zu beiden Küvetten gegeben, um die Vesikel löslich zu machen und alle vorhandenen primären Aminogruppen dem TNBS auszusetzen. Die Extinktion in Gegenwart des Detergents wurde genommen, um die 100 % Markierung darzustellen.
  • Beispiel 4 Messung des pH-Gradienten und der Membran-Potentiale
  • Die Größe der pH-Gradienten und der Membran-Potentiale, die vorhanden waren, wurden gemessen unter Verwendung von ¹&sup4;C- Methylamin und ³H-Triphenylphosphoniumbromid (³H-TPP) wie in Hope et al., 1985, BBA, 812 : 55 und in Madden et al., 1990, Chem. Phys. Lipids, 53 : 37 angegeben. Die verwendeten Konzentrationen waren 1 uci/ml. Die Menge der akkumulierten Probe wurde durch Flüssigszintillationsauszählung bestimmt. Die Transmembran-pH-Gradienten konnten dann unter Verwendung der Beziehung pH log ([Methylamin)jnnen/[Methylamin]außen) wie in Mayer et al., 1988, Biochemistry, 27 : 2053 angegeben, berechnet werden. Die Membran-Potentiale wurden ähnlich für ³H-TPP (siehe Hope et al., 1985, BBA, 812 : 55) berechnet.
  • Beispiel 5 Messung der Phospholipidkonzentration
  • Die Phospholipidkonzentrationen wurden durch eine Modifizierung des Verfahrens von Fiske und Subbarow, 1925, J. Biol. Chem., 66 : 375 berechnet.
  • Typische Phospholipidkonzentrationen betrugen ungefähr 3, mM.
  • Beispiel 6 Ergebnisse der Beladung von Lysinmethylester in EPC-LUVs
  • Figur 1 zeigt das Lysinmethylester rasch in EPC-LUVs durch die Verfahren von Beispiel 1 mit einem sauren Inneren akkumuliert wird (worin pHi = 4,0 und pHo = 7,5) wie durch die offenen Kreise dargestellt. Die Aminosäure lädt sich rasch, wobei die maximalen Niveaus mit den ersten 5 bis 10 Minuten der Inkubation geladen werden. Eine entsprechende Abnahme in dem gemessenen pH-Gradienten wurde auch beobachtet, dargestellt durch die geschlossenen Kreise und gelesen unter Verwendung der Skala auf der rechten Achse, worin der Gradient von 3,5 auf 1 pH-Einheiten sank; ein solches Absinken im zurückgebliebenen pH-Gradient ist eine Folge der Protonierung des Methylesters nach Durchquerung der Membran in der neutralen Form. Die maximal eingeschlossenen Konzentrationen betrugen ungefähr 85 nmol Lysinmethylester/umol Phospholipid. Dieses hohe Niveau der Aufnahme wurde für mindestens 24 Stunden ohne Freisetzung des Lysinmethylesters aufrechterhalten.
  • In dem Fall, worin die Liposome keinen pH-Gradienten zeigten (siehe Beispiel 2 oben), aber worin beide die inneren und die äußeren Basislösungen pH 4,0 (4,0/4,0) zeigten, offene Quadrate oder worin beide pH 7,5 (7,5/7,5) waren, offene Dreiecke, wurde wenig Lysinmethylester in die LUVs aufgenommen (nur ungefähr 10 % dessen was für die Vesikel mit dem pH-Gradient beobachtet wurde).
  • Beispiel 7 Laden des Lysinmethylesters durch liposomalen Transmembran-pH- Gradienten-EPC: Cholesterin-Vesikel
  • EPC Cholesterin-Vesikel (55 45 mol-%) wurden hergestellt durch Lösen von 43 mg EPC und 17 mg Cholesterin in 1,0 ml Chloroform. Das Chloroform wurde dann in einem Stickstoffstrom und durch anschließende Lagerung unter vermindertem Druck entfernt. Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet unter Verwendung von 20 ml Citratpuffer (pH 4,0) um Gefrierund Tau-MLVs herzustellen, die dann genauso extrudiert wurden, um LUVs zu bilden. Im Falle der EPC Cholesterin-Vesikel fand der Extrusionsschritt bei 65ºC statt.
  • Ein pH-Gradient wurde eingerichtet, und der Lysinmethylester wurde in die Vesikel, wie in Beispiel 1 offenbart bei 20ºC, geladen.
  • Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei der Beladungsschritt mit dem Lysinmethylester bei 4ºC und 37ºC durchgeführt wurde. Den Verfahren der Beispiele 3, 4 und 5 wurde gefolgt, um das Ausmaß der Beladung des Lysinmethylesters in EPC; Cholesterin-Vesikel zu bestimmen.
  • Figur 2 ist eine graphische Darstellung des Zeitverlaufs der Aminosäurebeladung in die LUVs, die einen pH-Gradienten von 7,5/4,0 (außen/innen) zeigen. Der Zeitverlauf der Aufnahme ist bei einer Aufnahmeinkubationstemperatur von 37ºC (offene Quadrate), 20ºC (offene Dreiecke) und 4ºC (offene Kreise) berichtet. Sehr hohe Niveaus der Beladung (ungefähr 70 nmol/umol Phospholipid) wurden innerhalb von 10 Minuten bei 37ºC, einer Stunde bei 20ºC und potentiell nach mehr als 22 Stunden bei 4cc erreicht. Die Menge des eingeschlossenen Lysinmethylesters wurde erneut als sehr stabil gefunden, selbst nach langen Zeiträumen (mehr als 20 Stunden) bei erhöhten Temperaturen (37ºC).
  • Beispiel 8
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin der Aminosäurelysinethylester in die LUVs folgend der Inkubation bei 23ºC für eine Stunde geladen wurde. Die Beladung dieses Aminosäurederivates trat mit einem Wert von 378,0 nmol Peptid/umol Phospholipid auf.
  • Beispiel 9
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin das Peptid Bombesin (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH&sub2;) in die LUVs folgend der Inkubation bei 23ºC für eine Stunde geladen wurden. Die Beladung dieses Peptidderivates trat mit einem Wert von 34,6 nmol Peptid/umol Phospholipid auf.
  • Beispiel 10
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin Gastrin verwandtes Peptid (N-t-BOC-Trp-Met-ASP-Phe-NH&sub2;) in die LUVs folgend der Inkubation bei 23ºC für eine Stunde geladen wurden. Nach diesem Inkubationszeitraum wurden 25,1 nmol Peptid/umol Phospholipid in die LUVs geladen.
  • Beispiel 11
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin 74 ug des Peptids Growth Hormone Releasing Factor Fragment (Lys- Tyr-Trp-Trp-Phe-NH&sub2;) mit den LUVs bei 60ºC für 2 Stunden inkübiert wurde. Nach diesem Inkubationszeitraum waren 195,0 nmol Peptid/umol Phospholipid in die LUVs geladen.
  • Beispiel 12
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin 74 ug des Peptids Growth Hormone Releasing Factor Fragment (Lys- Tyr-Trp-Trp-Phe-NH&sub2;) mit den LUVs bei 23ºC für 2 Stunden inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt. Nach zweistündiger Inkubationszeitdauer wurden ungefähr 55 nmol Peptid/umol Phospholipid in die LUVs geladen. In der Figur stellen die offenen Quadrate den Aufnahmeverlauf mit einem 7,5/4,0 (außen/innen) anfänglichen pH-Gradienten, die geschlossenen Quadrate den zurückbleibenden pH-Gradienten dar, wie er unter Verwendung der Skala auf der rechten Achse abgelesen werden kann. Die offenen Kreise stellen den Aufnahmeverlauf ohne pH-Gradient dar, worin die innere und äußere Lösung beide anfänglich pH 7,5 aufwiesen.
  • Vergleichsbeispiel 13
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin 0,48 mg des Aminosäurederivates Histidinmethylester (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei 23ºC mit den LUVs inkubiert wurden. Nach einstündiger Inkubation fand keine Beladung statt (0 nmol Peptid/umol Lipid geladen).
  • Vergleichsbeispiel 14
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin 0,34 mg des Peptids (Lys)s-Methylester bei 23ºC mit den LUVs inkubiert wurden. Nach einstündiger Inkubation fand keine Beladung statt (0 nmol Peptid/umol Lipid geladen).
  • Vergleichsbeispiel 15
  • Die Verfahren von Beispiel 1 wurden angewendet, worin 0,95 mg Peptids (Lys-(Ala)&sub4;)-Methylester bei 23ºC mit den LUVs inkubiert wurden. Nach einstündiger Inkubation fand keine Beladung statt (0 nmol Peptid/umol Lipid geladen).

Claims (11)

1. Verfahren zum Beladen von Liposomen mit einer Aminosäure oder einem Peptid, die am terminalen C substituiert sind, das die Schritte umfaßt:
a) Herstellen von Liposomen, die einen Konzentrationsgradienten einer oder mehrerer geladener Spezien über ihre Doppeischichten aufweisen, wobei der genannte Konzentrationsgradient fähig ist zur Bildung eines Transmembranpotentials, das eine Orientierung besitzt, die das Laden der Aminosäure oder des Peptids in die Liposome hervorruft; und
b) Mischen der Aminosäure oder des Peptids mit den Liposomen, worin die terminale Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids zu einer nichtsauren funktionellen Gruppe modifiziert wird, so daß die Aminosäure oder das Peptid schwach saure oder basische Eigenschaften besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Konzentrationsgradient gebildet wird durch:
a) Einschließen eines ersten Mediums in den Liposomen, wobei das Medium eine erste Konzentration einer oder mehrerer geladener Spezien aufweist; und
b) Suspendieren der Liposome in einem zweiten Medium, das eine zweite Konzentration eines oder mehrerer geladendener Spezien aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Konzentrationsgradient ein pH- Gradient ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Aminosäure oder das Peptid Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester, Bombesin, ein gastrinverwandtes Peptid oder ein Wachstumshormon-Auslösefaktor-Fragment ist.
5. Pharmazeutisches Präparat, das umfaßt: Fine Aminosäure oder ein Peptid, die am terminalen C substituiert sind, und durch das Verfahren nach Anspruch 1 in die Liposome geladen wurden.
6. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 5, worin die Aminosäure oder das Peptid Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester, Bombesin, ein gastrinverwandtes Peptid oder ein Wachstumshormon-Auslösefaktor- Fragment ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die Liposome umfaßt, die durch das Verfahren 1 erhältlich sind, und die, darin eingeschlossen, eine Aminosäure oder ein Peptid aufweisen, die am terminalen C-Atom substituiert sind, wobei die Liposome ein Transmembranpotential über ihre Membranen besitzen, die Orientierung des Transmembranpotentials so ist, daß wenn die Aminosäure oder das Peptid netto eine positive Ladung aufweisen (das Mittel ist positiv geladen), das innere Potential der Liposome negativ relativ zu dem Potential des äußeren Mediums ist, und wenn die Aminosäure oder das Peptid netto eine negative Ladung aufweisen (das Mittel ist negativ geladen), das innere Potential der Liposome positiv relativ zum Potential des äußeren Mediums ist, und die terminale Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids zu einer nichtsauren funktionellen Gruppe modifiziert ist, so daß die Aminosäure oder das Peptid schwach saure oder basische Eigenschaften besitzt.
8. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 7, worin das Transmembranpotential durch Einstellen eines Konzentrationsgradienten einer oder mehrerer geladener Spezien über die Liposomenmembranen erzeugt wird.
9. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 8, worin der Konzentrationsgradient ein pH-Gradient ist.
10. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 7, worin die Aminosäure oder das Peptid Lysinmethylester, Lysinamid, Lysinethylester, Bombesin, ein gastrinverwandtes Peptid oder ein Wachstumshormon-Auslösefaktor- Fragment ist.
11. Liposom, erhältlich durch das Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, das umfaßt: eine Aminosäure oder ein Peptid, worin eine terminale Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids zu einer nichtsauren funktionellen Gruppe modifiziert ist, so daß die Aminosäure oder das Peptid schwach saure oder basische Eigenschaften besitzt.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5871945A (en) * 1994-11-23 1999-02-16 Icos Corporation Modulators of anchoring protein function
US5807693A (en) * 1994-11-23 1998-09-15 Icos Corporation Calcineurin inhibitory compounds and anchoring protein
US5972379A (en) * 1995-02-14 1999-10-26 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome composition and method for administering a quinolone
AU4981896A (en) * 1995-02-14 1996-09-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome composition and method for administering liposome-loadable drugs
US5800833A (en) * 1995-02-27 1998-09-01 University Of British Columbia Method for loading lipid vesicles
WO1996032930A1 (en) * 1995-04-18 1996-10-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposome drug-loading method and composition
US5795735A (en) * 1995-07-17 1998-08-18 Icos Corporation Isolated polynucleotides encoding PKA-binding proteins and methods of producing the proteins recombinantly
US6447800B2 (en) 1996-01-18 2002-09-10 The University Of British Columbia Method of loading preformed liposomes using ethanol
US5858753A (en) * 1996-11-25 1999-01-12 Icos Corporation Lipid kinase
US5741890A (en) * 1996-12-19 1998-04-21 Oregon Health Sciences University Protein binding fragments of gravin
US7094423B1 (en) * 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
AU2002220121A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-11 Lorillard Licensing Company, Llc A smoking article including a selective carbon monoxide pump
US6481442B1 (en) 2000-11-28 2002-11-19 Lorillard Licensing Company, Llc Smoking article including a filter for selectively removing carbonyls
ATE440593T1 (de) * 2001-03-27 2009-09-15 Phares Pharm Res Nv Verfahren und zusammensetzung zur solubilisierung einer biologisch wirksamen verbindung mit geringer wasserlíslichkeit
DE10214983A1 (de) * 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
US7244743B2 (en) * 2002-06-05 2007-07-17 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Non-peptidic BRS-3 agonists
EP1599183A2 (de) * 2002-11-26 2005-11-30 Gilead Sciences, Inc. Verfahren zur arzneimittelladung von liposomen durch gradient.
CA2526284C (en) 2003-06-25 2014-11-18 Crucell Holland B.V. Binding molecules for the treatment of myeloid cell malignancies
US20050129753A1 (en) * 2003-11-14 2005-06-16 Gabizon Alberto A. Method for drug loading in liposomes
KR101245990B1 (ko) * 2004-03-26 2013-03-20 테루모 가부시키가이샤 리포솜 제제
TW200618820A (en) * 2004-11-05 2006-06-16 Alza Corp Liposome formulations of boronic acid compounds
US20080045575A1 (en) * 2004-12-29 2008-02-21 Van Dyke Thomas E Delivery of H2 Antagonists
TW200732347A (en) 2005-10-06 2007-09-01 Trophogen Inc VEGF analogs and methods of use
US20080305157A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 University Of Maryland Office Of Technology Commercialization Encapsulation and separation of charged organic solutes inside catanionic vesicles
WO2009136965A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Sequella, Inc. Compositions and methods comprising capuramycin analogues
WO2010014812A2 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Peptide compositions and methods of use
US9445975B2 (en) * 2008-10-03 2016-09-20 Access Business Group International, Llc Composition and method for preparing stable unilamellar liposomal suspension
EP2682106A1 (de) 2012-07-03 2014-01-08 Phares Pharmaceutical Research N.V. Verfahren zum Auflösen biologisch aktiver Verbindungen
US10457713B2 (en) 2012-07-30 2019-10-29 Trophogen, Inc. Glycoprotein hormone long-acting superagonists
ES2894135T3 (es) 2012-07-30 2022-02-11 Trophogen Inc Superagonistas de acción prolongada de la hormona glicoproteica
US9693958B2 (en) 2013-03-15 2017-07-04 Cureport, Inc. Methods and devices for preparation of lipid nanoparticles
JP2017502079A (ja) 2013-11-05 2017-01-19 トロフォジェン インコーポレイテッド 糖タンパク質ホルモン長時間作用性スーパーアゴニスト

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3962429A (en) * 1973-08-01 1976-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for reducing side effects of aminoglycoside antibiotics and composition therefor
US3993754A (en) * 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
JPS5186117A (en) * 1975-01-27 1976-07-28 Tanabe Seiyaku Co Johoseibiryushiseizainoseiho
US4217344A (en) * 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4086257A (en) * 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
GB1575343A (en) * 1977-05-10 1980-09-17 Ici Ltd Method for preparing liposome compositions containing biologically active compounds
CH624011A5 (de) * 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
CH621479A5 (de) * 1977-08-05 1981-02-13 Battelle Memorial Institute
US4460577A (en) * 1977-09-30 1984-07-17 Farmitalia Carlo Erba S.P.A. Pharmaceutical compositions consisting or consisting essentially of liposomes, and processes for making same
IT1110989B (it) * 1979-01-19 1986-01-13 Erba Farmitalia Forme farmaceutiche costitutite da liposomi e procedimenti relativi
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4529561A (en) * 1978-03-24 1985-07-16 The Regents Of The University Of California Method for producing liposomes in selected size range
US4193983A (en) * 1978-05-16 1980-03-18 Syva Company Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith
AU530415B2 (en) * 1978-06-02 1983-07-14 International Standard Electric Corp. Integrated circuits
US4241046A (en) * 1978-11-30 1980-12-23 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
GB2046092B (en) * 1979-03-05 1983-11-02 Toyama Chemical Co Ltd Pharmaceutical composition containing a lysophospholid and a phospholipid
CA1173360A (en) * 1979-06-22 1984-08-28 Jurg Schrank Pharmaceutical preparations
DE3068743D1 (en) * 1980-01-16 1984-08-30 Weder Hans G Process and dialysis-installation for the preparation of bilayer-vesicles and their use
US4389330A (en) * 1980-10-06 1983-06-21 Stolle Research And Development Corporation Microencapsulation process
US4419348A (en) * 1981-04-27 1983-12-06 Georgetown University Anthracycline glycoside compositions, their use and preparation
US4397846A (en) * 1981-05-15 1983-08-09 Murray Weiner Storage-stable lipid vesicles and method of preparation
US4485045A (en) * 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522803A (en) * 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
GB2134869A (en) * 1983-02-15 1984-08-22 Squibb & Sons Inc Method of preparing liposomes and products produced thereby
US4588578A (en) * 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4532089A (en) * 1984-01-14 1985-07-30 Northwestern University Method of preparing giant size liposomes
US4721612A (en) * 1984-04-12 1988-01-26 The Liposome Company, Inc. Steroidal liposomes
CA1264668C (en) * 1984-06-20 1990-01-23 EXTRUSION TECHNIQUES FOR THE PRODUCTION OF LIPOSOMES
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
CA1270198A (en) * 1984-08-08 1990-06-12 Marcel B. Bally Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US4885172A (en) * 1985-06-26 1989-12-05 The Liposome Company, Inc. Composition for targeting, storing and loading of liposomes
IE58981B1 (en) * 1985-10-15 1993-12-15 Vestar Inc Anthracycline antineoplastic agents encapsulated in phospholipid micellular particles
US4861580A (en) * 1985-10-15 1989-08-29 The Liposome Company, Inc. Composition using salt form of organic acid derivative of alpha-tocopheral
WO1987007530A1 (en) * 1986-06-16 1987-12-17 The Liposome Company, Inc. Induction of asymmetry in vesicles
CA1338702C (en) * 1987-03-05 1996-11-12 Lawrence D. Mayer High drug:lipid formulations of liposomal- antineoplastic agents
US4927571A (en) * 1987-05-18 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Preparation of injectable doxorubicin/liposome suspension
US4946683A (en) * 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
IL91664A (en) * 1988-09-28 1993-05-13 Yissum Res Dev Co Ammonium transmembrane gradient system for efficient loading of liposomes with amphipathic drugs and their controlled release
US5049392A (en) * 1989-01-18 1991-09-17 The Liposome Company, Inc. Osmotically dependent vesicles

Also Published As

Publication number Publication date
AU8436591A (en) 1992-03-02
ATE138803T1 (de) 1996-06-15
AU660288B2 (en) 1995-06-22
ES2089227T3 (es) 1996-10-01
CA2087965A1 (en) 1992-02-01
EP0555229B1 (de) 1996-06-05
HK1007497A1 (en) 1999-04-16
DE69120089D1 (de) 1996-07-11
GR3020686T3 (en) 1996-10-31
JPH06501246A (ja) 1994-02-10
JP3533215B2 (ja) 2004-05-31
WO1992002244A1 (en) 1992-02-20
EP0555229A1 (de) 1993-08-18
EP0555229A4 (de) 1993-06-16
US5380531A (en) 1995-01-10
DK0555229T3 (da) 1996-08-19

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