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DE69118429T2 - Verfahren zur Messung einer Spezies unter Verwendung von Fluoreszenzlicht - Google Patents

Verfahren zur Messung einer Spezies unter Verwendung von Fluoreszenzlicht

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Publication number
DE69118429T2
DE69118429T2 DE69118429T DE69118429T DE69118429T2 DE 69118429 T2 DE69118429 T2 DE 69118429T2 DE 69118429 T DE69118429 T DE 69118429T DE 69118429 T DE69118429 T DE 69118429T DE 69118429 T2 DE69118429 T2 DE 69118429T2
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DE
Germany
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light
fluorescent
species
fluorescent light
time
Prior art date
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DE69118429T
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Yuji Ito
Atsushi Saito
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Canon Inc
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Canon Inc
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Priority claimed from JP2016551A external-priority patent/JP2749928B2/ja
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Licht auf individuelle Spezies aufgebracht wird und dadurch erzeugtes Streu- und Fluoreszenzlicht optisch nachgewiesen werden, um so eine Messung der Spezies vorzunehmen.
    • Zugehöriger technischer Hintergrund
  • Ein Strömungs-Cytometer ist als ein Beispiel der zum Stand der Technik gehörigen Spezies-Untersuchungsvorrichtung bekannt. Diese arbeitet so, daß Spezies in Blutkörperchen oder dergleichen innerhalb einer Probenflüssigkeit mit Fluoreszenz angefärbt und diese Spezies dazu gebracht werden, einzeln zu einem Untersuchungsabschnitt zu strömen, wo ein Lichtstrahl aufgebracht wird, demzufolge von den einzelnen durch den untersuchten Abschnitt laufenden Spezies Streulicht, Fluoreszenzlicht und dergleichen erzeugt wird, welches nach Wellenlängen sortiert und gemessen wird, wodurch die Analyse der Spezies aus der statistischen Tendenz der Meßparameter im Hinblick auf eine Anzahl Spezies vorgenommen wird. Dadurch wird eine DNA-Analyse von Zellen, die Suche nach Oberflächen-Antigenen und dergleichen möglich.
  • Im allgemeinen wird jedoch dann, wenn Licht auf mit Fluoreszenz angefärbte Spezies gelangt, nicht nur das durch den Fluoreszenz-Farbstoff erzeugte Fluoreszenzlicht angeregt, sondern es ist in dem Licht auch Eigen-Fluoreszenz licht der Spezies selbst enthalten, und außerdem wird gleichzeitig Eigen- Fluoreszenzlicht verarbeitet aufgrund von Schwebestoffen wie Staub und Fluid. Dieses Fluoreszenzlicht wird in einem breiten Wellenlängenbereich erzeugt, so daß das Eigen-Fluoreszenzlicht in demselben Wellenlängenbereich wie das durch die Fluoreszenz-Anfärbung emittierte Fluoreszenzlicht optisch nicht ausgefiltert werden kann, so daß die Stärke des Fluoreszenzlichts, welches aus dem gewünschten Fluoreszenzlicht und dem beigemischten Eigen-Fluoreszenzlicht besteht, als Mischlicht gemessen wird.
  • Wenn außerdem keine Laserquelle einer einzelnen Wellenlänge, sondern eine Laserquelle mit mehreren Schwingungstypen, eine Quelle für weißes Licht oder dergleichen als Lichtquelle eingesetzt wird, gibt es die unerwünschte Möglichkeit, das Streulicht mit dem gleichen Wellenlängenbereich wie das Fluoreszenzlicht in dem Beleuchtungslicht aus solchen Quellen enthalten ist und als Mischlicht in dem Meßwert des gewünschten Fluoreszenzlicht enthalten ist.
  • Folglich gab es bei dieser herkömmlichen Vorrichtung die Möglichkeit, daß Mischlicht als Fehler in der gemessenen Stärke des Fluoreszenzlichts enthalten war und der Signal/Rausch-Abstand (S/N-Verhältnis) des sich ergebenden Meßwertes des Fluoreszenzlichtes verschlechtert wurde.
  • Spezies-Meßverfahren sind bekannt aus der DE-A-2 628 158 und der US-A-4-006-360. Gemäß der zuerst erwähnten Schrift wird ein Lichtimpuls an eine auf einem Träger befestigte Probe gesendet, um reflektiertes Licht von dem Lichtimpuls mit Hilfe einer Photoröhre zu detektieren, wobei anhand des zeitlichen Verlaufs des reflektierten Lichts verzögertes Fluoreszenzlicht von einem Detektor nachgewiesen wird. Nach der zweitens angegebenen Druckschrift wird ebenfalls impulsförmiges Licht auf eine feststehende Probe gestrahlt, und Verzögerungs-Fluoreszenzlicht wird anhand des zeitlichen Ablaufs bei einem vorbestimmten Zeitpunkt erfaßt. Mit anderen Worten: Gemäß beider Druckschriften wird impulsförmiges Licht auf eine feststehende Probe gestrahlt, um Fluoreszenzlicht aus sämtlichen Partikeln in der Probe zu detektieren.
    • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 anzugeben, welches die Stärke eines gewünschten reinen Fluoreszenzlichts ohne Beeinflussung durch Mischlicht nachweisen kann, und welches verschiedene Fluoreszenzlicht-Parameter gleich oder größer der Anzahl von Photodetektoren in dem oben beschriebenen Verfahren und der beschriebenen Vorrichtung zu erhalten vermag.
  • Erreicht wird dieses Ziel durch die Kennzeichnungsmerkmale des Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Figuren 1 und 2 zeigen den Aufbau der Vorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
  • Figur 3 ist ein Blockdiagramm der Signalverarbeitungseinrichtung der Vorrichtung gemäß der ersten Ausführungsform
  • Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Lebenslinie des Fluoreszenzlichtes.
  • Figur 5 zeigt die Beziehung zwischen der Form einer Blende und der Meßzeit.
  • Figur 6 zeigt den Aufbau einer Vorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.
  • Figur 7 zeigt den Aufbau einer Blende für die zweite Ausführungsform.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend detailliert unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Figur 1 zeigt eine optische Anordnung bei Betrachtung der Vorrichtung einer Ausführungsform von der Seite, und Figur 2 zeigt die optische Anordnung für den Fall, daß die Vorrichtung von oben betrachtet wird.
  • Es wird eine Probenflüssigkeit vorbereitet, zum Beispiel eine Blutprobe oder Trägerpartikel, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, wobei winzige Spezies suspendiert werden, und diese Probenflüssigkeit wird in einem Vorbehandlungsschritt mit einem fluoreszierenden Reagens angefärbt und auf eine angemessene Reaktionszeit und -konzentration einreguliert. Andererseits wird eine Mantelflüssigkeit, beispielsweise eine physiologische Salzlösung oder destilliertes Wasser, vorbereitet. Dann werden diese Fiüssigkeiten von einem nicht gezeigten Druckmechanismus unter Druck gesetzt und einer Strömungszelle 3 zugeführt, und es wird ein feiner Strom der Probenflüssigkeit in der Weise gebildet, daß die Probenflüssigkeit in der Mantelflüssigkeit gemäß dem Mantelstromprinzip eingewickelt wird. Zu dieser Zeit werden in der Probenflüssigkeit enthaltene Spezies, das heißt sehr kleine Partikel wie zum Beispiel individuelle Zellen und Gitter, voneinander getrennt und strömen sukzessive einer nach dem anderen von oben nach unten bei Betrachtung in der Zeichnungsebene. Von einer Laserquelle 1 abgegebenes Laserlicht (in der vorliegenden Ausführungsform Ultraviolett-Laser mit einer Wellenlänge von 300 nm) wird auf den Strom dieser Partikel aufgebracht, wobei es durch ein optisches Abbildungssystem 2 in eine elliptische Form gebracht wird, wozu das System zwei Zylinderlinsen aufweist, deren Stabrichtungen einmal einer Durchstromrichtung und einmal einer zu der Durchstromrichtung senkrechte entsprechen. Vorzugsweise kann die Form des auf die Partikel aufgebrachten Lichtstrahls allgemein elliptische Form haben, deren Hauptdurchmesser in einer Richtung senkrecht zur Strömung verläuft. Dies dient dem Zweck, den aufgebrachten Lichtstrahl mit gleichmäßiger Stärke auch dann auf die Partikel aufzubringen, wenn die Lage des Stroms der einzelnen Partikel innerhalb des Fluids einigen Schwankungen unterworfen ist.
  • Wenn der Lichtstrahl an die Partikel angelegt ist, werden Streulicht und Fluoreszenzlicht erzeugt. Von dem so erzeugten Streulicht wird das in Vorwärts- Richtung erzeugte Vorwärts-Streulicht durch eine Sammellinse 6, eine Blende 7 und einen Photodetektor 8 gemessen. Die Öffnung der Blende 7 ist konjugiert bezüglich einer Lichtaufbringstelle 4 angeordnet, so daß nur das Licht von der Lichtaufbringstelle 4 auf den Photodetektor 8 gelangt. Um zu verhindern, daß der aufgebrachte leistungsstarke Lichtstrahl direkt auf den Photodetektor 8 auftrifft, befindet sich kurz vor der Sammellinse 6 in dem optischen Weg ein kleiner Stopper 5 mit lichtabsorbierenden Eigenschaften, wodurch ein optisches Dunkelfeldsystem geschaffen wird, damit das direkte Licht von der Lichtquelle und das durch die Partikel hindurchgelangte Licht beseitigt werden. Dadurch läßt sich ausschließlich das Streulicht von der Lichtaufbringstelle 4 messen. Bei diesem Aufbau wird die Stärke des Lichts gemessen, welches das Fluoreszenzlicht sowie das Vorwärts-Streulicht enthält, es gibt aber deshalb kein Problem, weil die Stärke des Fluoreszenzlichts grundsätzlich sehr schwach ist im Vergleich zu der Stärke des Vorwärts-Streulichts. Natürlich könnte ein Bandpaßfilter in der Nähe des Photodetektors 8 angeordnet werden, um die Streulicht- Wellenlängen selektiv durchzulassen.
  • Von dem Streulicht wird das in Seitwärts-Richtung senkrecht zur optischen Achse des Lasers und zu dem Strom der Partikel erzeugte Licht von der Sammellinse 9 gemäß Figur 2 gesammelt. Das gesammelte Licht wird mit seinem Wellenlängenanteil entsprechend der eingestellten oder darunterliegenden Wellenlänge, die von einem dichroiltischen Spiegel 10 reflektiert wird, und die über einen Bandpaßfilter 11 zur selektiven Übertragung der Wellenlängen des gestreuten Lichts, das heißt der Wellenlänge des Laserlichts (in der Nähe von 300 nm) und durch eine Sammellinse 13 sowie eine Blende 15 hindurchgeht, als seitlich gestreutes Licht von einem Photodetektor 17 gemessen. Die Blende 15 befindet sich mit ihrer Öffnung 15a in der Mitte der optischen Achse, wie es dargestellt ist, und die Öffnung 15a steht in konjugierter Lagebeziehung zu der Lichtaufbringstelle 4, so daß nur das von der Lichtaufbringstelle 4 erzeugte Streulicht von dem Photodetektor 17 erfaßt werden kann.
  • Damit man Fluoreszenzlicht langer Fluoreszenzlebensdauer, welches von den Partikeln erzeugt wird, während der Nicht-Aufbringzeitspanne messen kann, wird das von der Sammellinse 9 gesammelte Fluoreszenzlicht, welches den dichroitischen Spiegel 10 durchläuft, von einem Bandpaßfilter 12 entsprechend der Fluoreszenz-Wellenlänge ausgewählt, und Fluoreszenzlicht mit einer speziellen Wellenlänge wird von der aus einer Sammellinse 14, einer Blende 16 und einem Photodetektor 18 gebildeten Gruppe detektiert. Die Blende 16 hat ihre Öffnung 16a etwas aus der Mitte heraus versetzt, wie dieses dargestellt ist. Das heißt, der Öffnungsabschnitt 16a ist bezüglich einer Stelle konjugiert angeordnet, die sich stromab bezüglich der Lichtaufbringstelle befindet, so daß nur Fluoreszenzlicht mit einer speziellen Wellenlänge von einer Nicht-Aufbring- Position stromab bezüglich der Lichtaufbringstelle 4 auf den Photodetektor 18 gelangt. Das heißt, das Licht gelangt nicht in den Photodetektor 17 zum Messen des Streulichts und den Photodetektor 18 zum Messen des Fluoreszenzlichts zur gleichen Zeit, und das Streulicht wird während einer Aufbringphase erfaßt, während das Fluoreszenzlicht während der Nicht-Aufbringphase erfaßt wird, so daß der Ausgangsimpuls jedes Photodetektors zeitlich seriell erhalten werden kann.
  • Die Signale der Photodetektoren 8, 17, 18 werden von einer in Figur 3 gezeigten Signalverarbeitungsschaltung verarbeitet. Das Ausgangssignal des Photodetektors 8 für das Vorwärts-Streulicht wird als impulsähnliches elektrisches Signal auf eine Triggerschaltung 21 und eine Analog-Verarbeitungsschaltung 22 gegeben. Das Ausgangssignal des Photodetektors 17 für das seitlich gestreute Licht und das Ausgangssignal des Photodetektors 18 für das Fluoreszenzlicht werden auf Analog-Verarbeitungsschaltungen 23 bzw. 24 gegeben. In den Analog-Verarbeitungsschaltungen 22, 23 und 24 werden die Spitzenwerte und die integrierten Werte der Impulse erfaßt. Wenn die Teilchen an die Lichtaufbringstelle gelangen und das Signal für das vorwärts gestreute Licht, das auf die Triggerschaltung 21 gelangt, einen vorbestimmten Pegel übersteigt, wird ansprechend darauf ein Triggersignal für eine vorbestimmte Zeitspanne erzeugt, und dieses Signal wird in die Analog-Verarbeitungsschaltung 22 und 23 eingegeben. Jede Analog-Verarbeitungsschaltung besitzt eine Abtast- und Haltefunktion, so daß das Eingangssignal nur für die Zeitspanne verarbeitet werden kann, während der ein Triggersignal erzeugt wird. Außerdem wird das Triggersignal von der Triggerschaltung 21 auf eine Triggergeneratorschaltung 25 für Fluoreszenzlicht gegeben, und diese Triggergeneratorschaltung 25 für Fluoreszenzlicht erzeugt ein Triggersignal von einer Zeit t&sub1; bis zu einer Zeit t&sub2;, und dieses Signal wird in die Analog-Verarbeitungsschaltung 24 eingegeben. Dadurch läßt sich das Signal des Photodetektors 18 für fluoreszierendes Licht für die Zeitspanne von t&sub1; bis t&sub2; abtasten, nachdem der Partikel durch die Lichtaufbringstelle 4 hindurchgelangt ist. Die Ausgangssignale der Analog-Verarbeitungsschaltung 22, 23 und 24 werden von einer A/D-Wandlerschaltung 26 in Digitalwerte umgesetzt und als Vorwärts-Streusignal, als Seiten-Streulichtsignal bzw. Fluoreszenzlichtsignal in einem Speicher 27 abgespeichert. Auf der Grundlage der so für eine Anzahl von Spezies erhaltenen und durch den Speicher 27 gespeicherten Meßparameter erfolgt die Berechnung der Spezies-Analyse in einer Berechnungsschaltung 28, und das Berechnungsergebnis wird an eine Ausgabeeinheit 29 gegeben, beispielsweise eine Kathodenstrahlröhre oder einen Drucker.
  • Das Meßprinzip der vorliegenden Ausführungsform soll anhand der Figur 4 im folgenden beschrieben werden. Der hier verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist einer, dessen Fluoreszenzlebensdauer länger ist als das normale Eigen- Fluoreszenzlicht oder dergleichen. Figur 4 zeigt eine graphische Darstellung der Lebenslinie des durch das Aufbringen von Licht angeregten Fluoreszenzlichts. Die Abszisse stellt die verstreichende Zeit dar, und der Zeitpunkt, zu dem Licht an die Partikel in dem untersuchten Abschnitt angelegt wird, und die Aufbringung des Lichts beendet wird, ist eine Zeit 0. Die Ordinate stellt die Stärke des erzeugten Fluoreszenzlichts dar. In Figur 4 bedeutet die Kurve 19 die Lebenslinie aufgrund des üblicherweise verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs oder des Eigen- Fluoreszenzlichts, welches von Zellen oder Staub stammt; die Lebensdauer des Fluoreszenzlichts nach dessen Anregung bis zur Fluoreszenzlicht-Stärke von 0 beträgt etwa 100 ns. Im Gegensatz dazu ist die Kurve 20 die Lebenslinie des Fluoreszenzfarbstoffs mit einer längeren Lebensdauer als üblich, wie er bei der vorliegenden Ausführungsform verwendet wird, wobei es sich zum Beispiel um eine Eu³&spplus;-Chelatsubstanz handelt. Die Lebensdauer des Fluoreszenzlichts beträgt in diesem Fall 1000 ns oder mehr. Diese Fluoreszenzlicht-Lebenslinie hat einen Spitzenwert, der sich entsprechend der Menge des Fluoreszenzlicht-Färbemittels bestimmt, wenn die Stärke des Fluoreszenzlicht anregenden Laserlichts konstant ist.
  • Angenommen, im Zeitpunkt 0 sei Licht auf die Partikel aufgebracht worden, so endet die Erzeugung von Streulicht in einem Zeitpunkt, und die erzeugte Menge normalen Fluoreszenzlichts mit einer kurzen Fluoreszenzlebensdauer, oder von Eigen-Fluoreszenzlicht, das von Zeilen oder Staub abgegeben wird, wird zur Zeit t&sub1; Null. Die Öffnung 16a der Blende 16 in Figur 5 ist konjugiert bezüglich der Nicht-Aufbring-Stelle angeordnet, die etwas stromab bezüglich der Licht- Aufbringstelle liegt, wo ein Lichtfleck aufgebracht wird, so daß nur das Licht von diesem Abschnitt auf den Photodetektor 18 gelangt. Mit anderen Worten, berücksichtigt man, daß die Strömungsgeschwindigkeit der Partikel konstant ist, so wird nur das Licht in dem schraffierten Abschnitt von der Zeit t&sub1; bis zu der Zeit t&sub4; gemessen. Wie aus Figur 4 ersichtlich ist, wird nur das Fluoreszenzlicht der Eu3&spplus;-Chelatsubstanz mit einer langen Fluoreszenzlebensdauer während der Zeit von t&sub1; bis t&sub2; erzeugt, und daher läßt sich die Stärke des reinen gewünschten Fluoreszenzlichts messen, ohne daß dieses beeinflußt wird durch das Beimischen des Eigen-Fluoreszenzlichts mit dem übrigen Mischlicht außer dem gewünschten Fluoreszenzlicht oder dem Licht von anderen Fluoreszenz-Farbstoffen oder des Streulichts.
  • Die Stärke des während der Zeit t&sub1; bis t&sub2; gemessenen Fluoreszenzlichts ist zum Teil eine, die den Spitzenwert nicht enthält, jedoch bleibt dies kein Problem, weil ein Wert im wesentlichen proportional zu dem Spitzen-Ausgangswert entsprechend der Menge des Fluoreszenz-Farbstoffs erhalten wird. Falls notwendig, kann ein Korrekturkoeffizient für das Lichtmeßsignal auf der Grundlage der Form dieser Kurve und entsprechend den Zeiten t&sub1; und t&sub2; bereitgestellt werden, um damit den Spitzenwert oder den integrierten Wert abzuschätzen. In diesem Fall wird nach dem Abspeichern des Meßwerts im Speicher 27 der Meßwert korrigiert durch einen Berechnungsprozeß, um so den Spitzenwert oder den integrierten Wert abzuschätzen.
  • Um nun ein spezielleres Beispiel für den Einsatz der oben beschriebenen Apparatur zu liefern, wird im folgenden ein Verfahren zum Herstellen eines Reagens zum Untersuchen des Oberflächenantigens von Blutkörperchen unter Verwendung einer Eu³&spplus;-Chelatsubstanz als Fluoreszenz-Farbstoff mit hoher Fluoreszenz-Lebensdauer einer vorbestimmten oder darüberliegenden Zeitspanne beschrieben, außerdem ein Meßverfahren unter Verwendung dieses Reagens.
  • Eu³&spplus;-Chelat hat die Eigenschaft, daß es an einer Wellenlänge in der Nähe von 300 nm angeregt wird und Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge in der Nähe von 610 nm über eine längere Zeitspanne erzeugt. Zunächst wird ein monoklonaler Antikörper, der in einzigartiger Weise an dem gewünschten Oberflächenantigen an der Oberfläche einer eine Spezies bildenden Zelle ankoppelt, vorbereitet und zu Biotin gemacht, und das Eu³&spplus;-Chelat wird auf Streptoavidin markiert, und Biotin und Streptoavidin werden miteinander gekoppelt, wodurch man ein monoklonales Antikörperreagens mit daran markiertem Eu³&spplus;-Chelat erhalten kann.
  • Dann wird dieses Reagens mit einer Blutprobe gemischt, die auf eine gemäßigte Konzentration verdünnt ist, und wird mit letzterer für eine vorbestimmte Zeitspanne zum Reagieren gebracht, um dadurch eine Zellen-Anfärbung zu erreichen. Durch Messen dieser reagierten Probenflüssigkeit mit der oben beschriebenen Apparatur läßt sich eine qualitative oder quantitative Messung des Oberflächenantigens der Zelle aus der gemessenen Stärke des Fluoreszenzlichts des erhaltenen Eu³&spplus;-Chelats erhalten.
    • [Zweite Ausführungsform]
  • Im folgenden wird eine zweite Ausführungsform der Erfindung beschrieben, die mehr Parameter erhalten kann. Figur 6 zeigt den Aufbau des optischen Systems der zweiten Ausführungsform und entspricht der Figur 2. In Figur 6 bezeichnen gleiche Bezugszeichen wie in Figur 2 entsprechend oder äquivalente Elemente. Figur 7 zeigt die Einzelheiten einer Blende 30.
  • Bei der vorliegenden Ausführungsform ist das Bandpaßfilter 12 in Figur 2 der vorhergehenden Ausführungsform weggelassen, und anstelle der Blende 16 ist eine Blende 30 mit mehreren Öffnungen dargestellt. Der detaillierte Aufbau der Blende 30 ist in Figur 7 gezeigt. In Figur 7 sind zwei Öffnungen 30a und 30b in der Nähe des Mittelabschnitts der Lichtabfangblende 30 vorgesehen. Bandpaßfilter 31 und 32 sind an den Öffnungsabschnitten 30a und 30b befestigt, und jedes dieser Bandpaßfilter hat die Eigenschaft, selektiv Fluoreszenzlicht einer speziellen Wellenlänge durchzulassen. Der Öffnungsabschnitt 30a ist im mittleren Abschnitt der Blende 30 vorgesehen, der Öffnungsabschnitt 30b liegt etwas darüber. Der Öffnungsabschnitt 30a ist konjugiert mit der Lichtaufbringstelle 4, der Öffnungsabschnitt 30b ist konjugiert mit einer Stelle etwas stromab bezüglich der Lichtaufbringstelle 4. Das heißt, von der Lichtaufbringstelle 4 emittiertes Fluoreszenzlicht einer speziellen Wellenlänge wird selektiv über die Öffnung 30a dem Photodetektor 18 zugeführt, und nur Fluoreszenzlicht einer speziellen Wellenlänge aus der Nicht-Aufbringstelle stromab bezüglich der Lichtaufbringstelle 4 wird über die Öffnung 30b auf den Photodetektor 18 gerichtet. Das heißt, die Ausgestaltung ist so, daß die Lichtmeß- Ausgangsimpulse von zwei Arten von Fluoreszenzlicht zeitlich seriell in dem Photodetektor 18 erhalten werden, und es werden zwei Arten von Fluoreszenzlicht-Parameter zeitlich seriell mit ein und demselben Photodetektor ermittelt. Um mehreren Fluoreszenz-Farbstoffen zu entsprechen, wenn mehrere Arten von Fluoreszenz-Farbstoffen gleichzeitig angeregt werden, kann eine Lichtquelle mit einem breiteren Wellenlängenbereich eingesetzt werden, beispielsweise eine Multimoden-Laserlichtquelle, oder es können mehrere Lichtstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen optisch kombiniert werden zu einem einzigen Lichtstrahl.
  • Im folgenden wird das Meßprinzip der Erfindung unter Bezugnahme auf Figur 4 erläutert. Bei der vorliegenden Ausführungsform, bei der ein zweiter Fluoreszenz- Farbstoff mit einer kurzen Fluoreszenz-Lebensdauer wie üblich verwendet wird, wird ein zweites Fluoreszenzlicht mit einer Fluoreszenz-Lebensdauer ausgewählt, die länger ist als das übliche Eigen-Fluoreszenzlicht oder dergleichen. Alternativ werden ein erster und ein zweiter Fluoreszenz-Farbstoff ausgewählt, die beide eine lange Fluoreszenz-Lebensdauer besitzen. Wenn Partikel doppelt für zwei Arten von Fluoreszenzlicht gefärbt werden, daß heißt mit einem ersten Fluoreszenz-Farbstoff üblicher Fluoreszenz-Lebensdauer und einem zweiten Fluoreszenz-Farbstoff mit langer Fluoreszenz-Lebensdauer, beispielsweise Eu³&spplus;- Chelat, können Bandpaßfilter mit Kennlinien zum selektiven Durchlassen des ersten und des zweiten Fluoreszenzlichts als Bandpaßfilter 31 und 32 der Blende 30 gewählt werden. Jedes Mal, wenn bei einem solchen Aufbau ein Partikel eine Lichtaufbringstelle passiert, gelangen zeitlich nacheinander in den Photodetektor 18 selektiv das erste und das zweite Fluoreszenzlicht, und man kann zwei unterschiedliche Fluoreszenzlichte mit einem einzigen Photodetektor messen. Dabei wird das zweite Fluoreszenzlicht mit einer langen Lichtemissionsdauer in dem Zeitbereich t&sub1; - t&sub2; gemessen, während das erste Fluoreszenzlich nicht erzeugt wird, so daß sehr genau gemessene Werte erhalten werden können, ohne daß diese durch Beimischung von Mischlicht beeinträchtigt sind.
  • Außerdem ist es einfach, den Aufbau nach der oben beschriebenen Ausführungsform weiterzuentwicklen. Das heißt, wenn die Anzahl der Öffnungen in der Blende 30 nicht auf zwei beschränkt wird, sondern stattdessen mehrere Öffnungen vorgesehen sind, die mit mehreren Nicht-Aufbringstellen entlang dem Strom der Partikel konjugiert sind, so lassen sich noch mehr Parameter zeitlich seriell erhalten. In diesem Fall werden mehrere Arten von Fluoreszenzlicht mit einer langen Fluoreszenz-Lebensdauer erzeugt, und die Partikel werden mit diesen gleichzeitig angefärbt. Dann werden diese verschiedenen Arten von Fluoreszenzlicht nach der Wellenlänge mit Hilfe von Bandpaßfiltern selektiert, wobei letztere an entsprechenden Öffnungsbereichen ausgebildet sind, um individuell nachgewiesen zu werden, womit die Stärken der Fluoreszenzlichtarten mehrerer Parameter frei von dem Einfluß durch Mischlicht mit einer Messung zeitlich seriell erhalten werden können.
  • Wenn außerdem die Kennlinie des Bandpaßfilters 31 so gestaltet wird, daß selektiv die Wellenlängen von Streulicht durchgelassen werden, können zwei unterschiedliche Parameter seitlichen Streulichts und Fluoreszenzlichts von ein und demselben Photodetektor 18 nachgewiesen werden. In diesem Fall besitzen das Streulicht und das Fluoreszenzlicht eine starke Intensitätsdifferenz, so daß es zu bevorzugen ist, einen Photodetektor 18 mit einem großen dynamischen Bereich einzusetzen oder ein Bandpaßfilter 31 mit einem hohen Maß an Lichtdämpfung zu verwenden.
  • Somit läßt sich bei dieser Ausführungsform ebenso wie bei der vorhergehenden Ausführungsform die Stärke von Fluoreszenzlicht, die durch den Einsatz der Zeitverzögerung gemessen wird, vollständig frei vom Einfluß von Mischlicht und mit hoher Genauigkeit erhalten, außerdem können mehrere Arten von gemessenen Parametern erhalten werden, als es der Anzahl der Photodetektoren entspricht.
  • Dies trägt zur Kompaktheit und den geringen Kosten der Apparatur bei.
  • Als nächstes soll ein Beispiel für die Verwendung der Vorrichtung bei dieser Ausführungsform anhand eines Verfahrens zum Herstellen eines Reagens zum Untersuchen mehrerer Arten von Oberflächenantigenen an Blutkörperchen zur gleichen Zeit beschrieben werden, außerdem das Untersuchungsverfahren mit Hilfe dieses Reagens.
  • Zuerst werden zwei Arten eines ersten und eines zweiten monoklonalen Antikörpers vorbereitet, die in einzigartiger Weise an dem ersten und dem zweiten Oberflächenantigen auf der Oberfläche einer eine Spezies bildenden Zelle gekoppelt sind. Weiterhin werden zwei Arten von Fluoreszenz-Farbstoffen, nämlich ein erster Fluoreszenz-Farbstoff und ein zweiter Fluoreszenz-Farbstoff mit einer längeren Fluoreszenz-Lebensdauer als der erste Fluoreszenz-Farbstoff vorbereitet. Der erste Fluoreszenz-Farbstoff wird dann auf dem ersten monoklonalen Antikörper mit Hilfe eines Prozesses markiert, der dem oben beschriebenen Prozeß ähnlich ist, und in ähnlicher Weise wird der zweite Fluoreszenz-Farbstoff auf dem zweiten monoklonalen Antikörper markiert. Diese werden gemischt, wodurch man ein Reagens zum Untersuchen von zwei Arten von Oberflächenantigenen zur gleichen Zeit erhält.
  • Dieses Reagens wird dann mit einer Blutprobe gemischt, die in mäßiger Konzentration verdünnt ist, und wird mit letzterer über eine bestimmte Zeitspanne zum Reagieren gebracht, und jeder monoklonale Antikörper wird mit einem gewünschten Antikörper auf der Oberfläche der Zelle gekoppelt, wodurch die Fluoreszenz-Färbung der Zelle im wesentlichen über die monoklonalen Antikörper erfolgt. Diese reagierte Probenflüssigkeit wird mit der oben beschriebenen Apparatur gemessen, und es werden zeitlich seriell die Arten von Fluoreszenzlicht der beiden Farben gemessen. Wenn das erste Fluoreszenzlicht nachgewiesen wird, läßt sich das Vorhandensein des ersten Oberflächenantigens bestätigen, wenn das zweite Fluoreszenzlicht nachgewiesen wird, läßt sich das Vorhandensein des zweiten Oberflächenantigens bestätigen. Die Menge der Oberflächenantigene läßt sich ebenfalls abschätzen anhand der Intensität der Fluoreszenzlichtarten. Auf diese Weise lassen sich mit einer Messung zur gleichen Zeit die qualitativen oder quantitativen Messungen von zwei Arten von Oberflächenantigenen durchführen.

Claims (6)

1. Verfahren zum Messen einer Spezies, mit den Schritten
- Bestrahlen einer Spezies, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbte Partikel enthält, an einer vorbestimmten Position mit Licht,
- Detektieren von Streulicht von der Spezies an der vorbestimmten Position und
- Detektieren von Fluoreszenzlicht von der Spezies, gekennzeichnet durch die Schritte
- Durchleiten der Partikel in der Spezies, eines nach dem andern, durch die vorbestimmte Position und
- Detektieren des Fluoreszenzlichtes von jedem Partikel an einer stromabwärts der vorbestimmten Position gelegenen Position, die nicht von dem Licht bestrahlt ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den Schritt
- Einstellen einer Periode zum Detektieren des Fluoreszenzlichtes anhand einer Zeitsteuerung auf der Basis der Streulichtdetektierung.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch den Schritt
- Korrigieren der detektierten Fluoreszenzlichtintensität zur Bestimmung eines Peak-Schätzwertes des Fluoreszenzlichtes durch Errechnen eines Korrektionskoeffizienten auf der Basis der Lebensdauerkurve des Fluoreszenzlichtes.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezies mit dem Fluoreszenzfarbstoff unter Verwendung eines Antikörpers gefärbt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff ein Eu³&spplus;-Chelat umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezies eine biologische Zelle umfaßt.
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