DE69034177T2

DE69034177T2 - Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE69034177T2
Application number: DE69034177T
Authority: DE
Inventors: Daniel Louis San Diego Kacian; Timothy J. Fultz
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1989-07-11
Filing date: 1990-07-10
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2010-07-11
Also published as: FI911152A0; AU650622B2; KR100242252B1; AU7415694A; GR3021704T3; AU6166390A; JPH1146778A; JP3350511B2; DE69028257D1; JPH04500759A; ES2091225T3; EP0731174B1; JP2002355099A; AU677418B2; JP3445131B2; KR920701478A; NO910902D0; PT94662A; IE902539A1; EP0408295A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betriffi Verfahren zur Vergrößerung der Kopienanzahl einer spezifischen Nucleinsäuresequenz oder 'Zielsequenz', welche entweder allein oder als ein, großer oder kleiner, Bestandteil einer homogenen oder heterogenen Mischung von Nucleinsäuren vorhanden sein kann. Die Mischung von Nucleinsäuren kann diejenige sein, welche in einer für diagnostische Tests, Umwelttests, für Forschungsuntersuchungen, für die Herstellung von Reagenzien oder Materialien für andere Verfahren, wie Klonierung, oder für andere Zwecke entnommenen Probe zu finden ist.
Die selektive Vervielfältigung spezifischer Nucleinsäuresequenzen ist von Wert bei der Steigerung der Empfindlichkeit von Diagnose- und Umwelt-Assays unter Beibehaltung der Spezifität; der Erhöhung der Empfindlichkeit, Bequemlichkeit, Genauigkeit und Verlässlichkeit einer Vielzahl von Forschungsverfahren; und der Bereitstellung umfangreicher Vorräte von spezischen Oligonucleotiden für verschiedene Zwecke.
Die vorliegende Erfindung ist aufgrund der Bequemlichkeit, mit welcher sie ausgeübt werden kann, besonders geeignet für die Anwendung in Umwelt- und Diagnose-Tests.
Hintergrund der Erfindung
Die Detektion und/oder Quantifizierung von spezifischen Nucleinsäuresequenzen ist eine zunehmend bedeutende Technik zur Identifizierung und Klassifizierung von Mikroorganismen, zur Diagnose von Infektionskrankheiten, zum Nachweis und Charakterisieren von genetischen Abnormalitäten, zur Identifizierung von mit Krebs verbun denen genetischen Veränderungen, zur Untersuchung genetischer Anfälligkeit gegenüber Krankheiten und zur Messung der Antwort auf verschiedene Behandlungstypen. Derartige Verfahren haben auch zunehmende Anwendungen beim Nachweis und der Quantifizierung von Mikroorganismen in Nahrungsmitteln, Umweltproben, Saatgutvorräten und anderen Typen von Material gefunden, wo die Gegenwart von spezifischen Mikroorganismen überwacht werden können muß. Andere Anwendungen werden in den forensischen Wissenschaften, der Anthropologie, Archäologie und Biologie gefunden, wo die Messung der Verwandtschaft von Nucleinsäuresequenzen verwendet worden ist, um Verdächtige für Verbrechen zu identifizieren, Vaterschaftsstreitigkeiten zu klären, genealogische und phylogenetische Stammbäume aufzustellen und bei der Klassifizierung einer Vielzahl von Lebensformen zu helfen.
Ein verbreitetes Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen ist die Nucleinsäurehybridisierung. Dieses Verfahren beruht auf der Fähigkeit zweier Nucleinsäurestränge, welche komplementäre oder im wesentlichen komplementäre Sequenzen enthalten, unter passenden Bedingungen, spezifisch zu assoziieren, um eine doppeisträngige Struktur zu bilden. Um eine spezifische Nucleinsäuresequenz (bekannt als die "Zielsequenz") nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, wird ein markiertes Oligonucleotid (bekannt als eine "Sonde") hergestellt, welches komplementäre Sequenzen zu denjenigen der Zielsequenz enthält. Die Sonde wird mit einer Probe, die im Verdacht steht, die Zielsequenz zu enthalten, vermischt, und für die Hybridbildung geeignete Bedingungen werden geschaffen. Die Sonde hybridisiert an die Zielsequenz, wenn diese in der Probe vorhanden ist. Die Sonde-Ziel-Hybride werden danach auf einem von vielen Wegen von der einzeisträngigen Sonde getrennt. Die mit den Hybriden assoziierte Menge an Markierung wird gemessen.
Die Empfindlichkeit von Nucleinsäure-Hybridisierungsassays wird hauptsächlich durch die spezifische Aktivität der Sonde, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Hybridisierungsreaktion, die Leistung des Verfahrens hinsichtlich der Trennung von hybridisierter und nichthybridisierter Sonde und die Empfindlichkeit, mit der die Markierung nachgewiesen werden kann, beschränkt. Unter den besten Bedingungen können direkte Hybridisierungsverfahren, wie die obenstehend beschriebenen, etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ Zielmoleküle detektieren. Den empfindlichsten Verfahren fehlen viele der für routinemäßige klinische Tests und Umwelt-Tests erforderlichen Merkmale, wie Schnelligkeit, Bequemlichkeit und Wirtschaftlichkeit. Darüber hinaus könnte ihre Empfindlichkeit für viele gewünschte Anwendungen nicht ausreichend sein. Infektionskrankheiten können mit so wenig wie einem pathogenen Mikroorganismus pro 10 ml Blut oder einer anderen Probe assoziiert sein. Forensischen Wissenschaftlern können nur Spurenmengen an Gewebe, welche vom Schauplatz eines Verbrechens erhältlich sind, zur Verfügung stehen. Forscher können eine spezifische Gensequenz nachweisen und/oder quantifizieren müssen, welche als ein nur winziger Bruchteil aller in dem genetischen Material eines Organismus oder in der Boten-RNA-Population einer Gruppe von Zellen vorhandenen Sequenzen vorliegt.
Als Ergebnis der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Bestandteilen und Teilschritten dieses Typs von Assay besteht fast immer ein entgegengesetztes Verhältnis zwischen Empfindlichkeit und Spezifität. Daher können zur Steigerung der Empfindlichkeit des Assays unternommene Schritte (wie Erhöhen der spezifischen Aktivität der Sonde) zu einem höheren Prozentsatz falsch-positiver Testergebnisse führen. Die Verbindung zwischen Empfindlichkeit und Spezifität ist ein bedeutendes Hindernis für die Verbesserung der Empfindlichkeit von Hybridisierungsassays gewesen. Eine Lösung für dieses Problem wäre die spezifische Erhöhung der vorhandenen Zielsequenz unter Verwendung eines Vervielfältigungsverfahrens. Die Vervielfältigung eines einzelnen Abschnitts der Zielsequenz ohne das Erfordernis der Vervielfältigung eines bedeutenden Anteils der in den verbleibenden Sequenzen der Probe codierten Information könnte eine Steigerung der Empfindlichkeit ergeben, während gleichzeitig die Spezifität nicht gefährdet wird. Eine Nucleinsäuresequenz von 25 Basen Länge zum Beispiel weist eine Wahrscheinlichkeit von 1 zu 4²⁵ oder 1 zu 10¹⁵ auf, durch Zufall vorhanden zu sein, da jede der 25 Positionen in der Sequenz von einem der vier verschiedenen Nucleotide besetzt sein kann.
Ein als Polymerasekettenreaktion" oder "PCR" bezeichnetes Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung von Nucleinsäuresequenzen ist von Mullis et al. beschrieben worden (siehe die U.S.-Patente 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159 und die Europäischen Patentanmeldungen 86302298.4, 86302299.2 und 87300203.4 und Me thods in Enzmology, Band 155, 1987, S. 335–350). Das Verfahren verwendet sich wiederholende Zyklen von Primer-abhängiger Nucleinsäuresynthese, welche unter Verwendung jedes Stranges einer komplementären Sequenz als Matrize gleichzeitig stattfindet. Die Sequenz, die vervielfältigt wird, ist durch die Lage der Primermoleküle, welche die Synthese initiieren, eingegrenzt. Die Primer sind zu dem 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz oder dessen Komplement komplementär und müssen mit diesen Stellen komplexieren, damit die Nucleinsauresynthese beginnt. Nach Synthese von Verlängerungsprodukten werden die Stränge, im allgemeinen durch Hitzedenaturierung, vor dem nächsten Syntheseschritt getrennt. In dem PCR-Verfahren werden Kopien von beiden Strängen einer komplementären Sequenz synthetisiert.
Der zur Trennung der neu synthetisierten Stränge in der PCR verwendete Strangtrennungsschritt am Ende jedes Zyklus der PCR-Reaktion ist häufig eine Hitzedenaturierung. Als Ergebnis wird entweder ein hitzestabiles Enzym benötigt, oder neues Enzym muß zwischen den Hitzedenaturierungsschritten und der Initiation des nächsten Zyklus der DNA-Synthese zugegeben werden. Das Erfordernis des wiederholten Zirkulierens der Reaktionstemperatur zwischen mehreren verschiedenen und extremen Temperaturen ist ein Nachteil des PCR-Verfahrens. Um die PCR bequem zu machen, werden kostspielige programmierbare Thermocycler-Vorrichtungen benötigt.
Das PCR-Verfahren ist durch Eingliedern einer Promotorsequenz in einen der in der PCR-Reaktion verwendeten Primer, und danach, nach Vervielfältigung durch das PCR-Verfahren für mehrere Zyklen, durch Verwenden der doppeisträngigen DNA als Matrize für die Transkription zu einzeisträngiger RNA, an die RNA-Transkription gekoppelt worden (siehe z. B. Murakawa et al., DNA 7: 287–295 (1988)).
Andere Verfahren zur Vervielfaltigung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz umfassen eine Serie von Primerhybridisierungs-, Verlängerungs- und Denaturierungsschritten, um ein intermediäres doppelstrangiges DNA-Molekül mit einer Promotorsequenz durch die Verwendung eines Primers bereitzustellen. Die doppeisträngige DNA wird verwendet, um mehrfache RNA-Kopien der Zielsequenz herzustellen. Die resultierenden RNA-Kopien können als Zielsequenzen verwendet werden, um weitere Kopien herzustellen, und mehrere Zyklen können durchgeführt werden. (Siehe z. B. Burg, et al., WO 89/1050 und Gingeras, et al., WO 88/10315.
Verfahren zur chemischen Synthese verhältnismäßig großer Mengen von DNA einer bestimmten Sequenz in vitro sind dem Fachmann gut bekannt; die Herstellung von DNA auf diesem Wege ist jetzt alltäglich. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und können nicht einfach verwendet werden, um Oligonucleotide von viel größerer Länge als etwa 100 Basen zu synthetisieren. Auch muß die ganze Basensequenz der zu synthetisierenden DNA bekannt sein. Diese Verfahren machen eine kostspielige Vorrichtung erforderlich, welche nur zur Synthese einer einzigen Sequenz zu einer Zeit fähig ist. Der Betrieb dieser Vorrichtung erfordert ein beträchtliches Training und beträchtliche Erfahrung. Verfahren für die chemische Synthese von RNA sind schwieriger zu entwickeln gewesen.
Nucleinsäuren können durch Techniken, welche die Klonierung oder Insertion von spezifischen Nucleinsäuresequenzen in das genetische Material von Mikroorganismen beinhalten, so synthetisiert werden, daß die inserierten Sequenzen repliziert werden, wenn sich der Organismus repliziert. Wenn die Sequenzen nahe bei und stromabwärts von einer geeigneten Promotorsequenz inseriert sind, können RNA-Kopien der Sequenz oder von der Sequenz codierte Proteinprodukte hergestellt werden. Obwohl die Klonierung die Herstellung von praktisch unbegrenzten Mengen von spezifischen Nucleinsäuresequenzen ermöglicht, kann sie aufgrund der Anzahl von beinhalteten Arbeitsschritten für die Verwendung in diagnostischen, Umwelt- oder forensischen Tests ungeeignet sein. Die Verwendung von Klonierungstechniken macht ein beträchtliches Training und beträchtliche Erfahrung notwendig. Die Klonierung einer einzigen Sequenz kann mehrere Mann-Monate an Aufwand oder mehr errfordern.
Verhältnismäßig große Mengen von bestimmten RNAs können unter Verwendung eines rekombinanten einzeisträngigen RNA-Moleküls mit einer Erkennungssequenz für die Bindung einer RNA-gesteuerten Polymerase, bevorzugt Qß-Replikase, hergestellt werden (siehe z. B. das U.S.-Patent Nr. 4 786 600 an Kramer et al.). Eine An zahl von Schritten ist erforderlich, um die spezifische Sequenz in eine DNA-Kopie des verschiedenen Moleküls zu inserieren, es in einen Klonierungsvektor zu klonieren, es in RNA zu transkribieren und dann mit Qß-Replikase zu replizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verfahren zum Synthetisieren mehrfacher Kopien einer Zielnucleinsäuresequenz, welche autokatalytisch sind (d. h. zum automatischen Zyklieren fähig sind, ohne dass eine Modifikation der Reaktionsbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH oder Ionenstärke, erforderlich wäre), und Verwenden eines Produkts aus einem Zyklus im nächsten.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zusammenbringen einer Zielnucleinsäure, welche die Zielsequenz umfasst, mit einem ersten Oligonucleotid-Primer, der eine Nucleotidsequenz aufweist, die zum Hybridisieren an einen 3'-terminalen Bereich der Zielsequenz fähig ist, wodurch ein Oligonucleotid:Zielsequenz-Hybrid gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann;
(b) Extendieren des Primers in einer Primer-Extensionsreaktion unter Verwendung der Zielsequenz als einer Matrize, zum Erhalt eines DNA-Primer-Extensionsprodukts, das eine komplementäre Zielsequenz umfasst;
(c) Verfügbarmachen eines 3'-terminalen Bereichs der komplementären Zielsequenz zur Hybridisation mit einem zweiten Oligonucleotid, welches als eine blockierte Spleißmatrize dient, welches zweite Oligonucleotid eine erste Nucleotidsequenz, die zum Hybridisieren an den 3'-terminalen Bereich der komplementären Zielsequenz fähig ist, und eine Promotorsequenz, die, wenn doppelsträngig gemacht, durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, 5' zu der ersten Nucleotidsequenz umfasst und ein blockiertes 3'-Ende zum Verhindern der DNA-Extension davon aufweist;
(d) Hybridisieren des zweiten Oligonucleotids an das DNA-Primer-Extensionsprodukt;
(e) Extendieren des 3'-Endes des Primer-Extensionsprodukts zum Erhalt eines dop pelsträngigen Promotors, welcher die Promotorsequenz umfasst; und
(f) Verwenden des in Schritt (e) gebildeten Promotors und der RNA-Polymerase zur Erzeugung von RNA-Transkripten.

Beschrieben werden hierin Nucleinsäure-Amplifikationsmethoden, welche umfassen: (a) Behandeln einer RNA-Zielsequenz mit einem ersten Oligonucleotid, welches einen ersten Primer umfasst, der eine Komplexierungssequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-terminalen Bereich des Ziels ist, um damit zu komplexieren, und der wahlweise eine Sequenz 5' zur Primersequenz aufweist, die einen Promotor für eine RNA-Polymerase enthält, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (b) Verlängern des ersten Primers in einer Extensionsreaktion unter Verwendung des Ziels als einer Matrize, um ein erstes DNA-Primer-Extensionsprodukt zu ergeben, das zum RNA-Ziel komplementär ist; (c) Abtrennen des DNA-Extensionsprodukts vom RNA-Ziel unter Verwendung eines Enzyms, welches das RNA-Ziel selektiv abbaut, (d) Behandeln des DNA-Primer-Extensionsprodukts mit einem zweiten Oligonucleotid, welches einen Primer oder eine Spleißmatrize umfasst, und welches eine Komplexierungssequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-terminalen Bereich des DNA-Primer-Extensionsprodukts ist, um damit unter Bedingungen zu komplexieren, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann, vorausgesetzt, dass dann, wenn das erste Oligonucleotid keinen Promotor aufweist, das zweite Oligonucleotid eine Spleißmatrize ist, die eine Sequenz 5' zur Komplexierungssequenz aufweist, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase enthält; (e) Verlängern des 3'-Terminus entweder des zweiten Oligonucleotids oder des ersten Primer-Extensionsprodukts, oder von beidem, in einer DNA-Extensionsreaktion, um eine Matrize für die RNA-Polymerase zu erzeugen; und (f) Verwenden der Matrize zum Erzeugen mehrfacher RNA-Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer RNA-Polymerase, welche die Promotorsequenz erkennt. Das Oligonucleotid und die RNA-Kopien können zur autokatalytischen Synthese von mehrfachen Kopien der Zielsequenz verwendet werden.
Bei einer Ausführungsform umfasst solch ein allgemeines Verfahren (a) das Behan deln einer RNA-Zielsequenz mit einem ersten Oligonucleotid, welches einen ersten Primer umfasst, der eine Komplexierungssequenz enthält, die ausreichend komplementär zum 3'-terminalen Bereich des Ziels ist, um damit zu komplexieren, und die eine Sequenz 5' zur Komplexierungssequenz aufweist, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase enthält, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonucleotid/Ziel-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann, (b) Verlängern des ersten Primers in einer Extensionsreaktion unter Verwendung des Ziels als einer Matrize, um ein erstes DNA-Primer-Extensionsprodukt zu ergeben, das komplementär zum RNA-Ziel ist, (c) Abtrennen des ersten DNA-Primer-Extensionsprodukts vom RNA-Ziel unter Verwendung eines Enzyms, welches das RNA-Ziel selektiv abbaut; (d) Behandeln des DNA-Primer-Extensionsprodukts mit einem zweiten Oligonucleotid, welches einen zweiten Primer umfasst, der eine Komplexierungssequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-terminalen Bereich des DNA-Primer-Extensionsprodukts ist, um damit unter Bedingungen zu komplexieren, bei denen ein Oligonucleotid/Ziel-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (e) Verlängern des 3'-Terminus des zweiten Primers in einer DNA-Extensionsreaktion, um ein zweites DNA-Primer-Extensionsprodukt zu ergeben, dabei Erzeugen einer Matrize für die RNA-Polymerase; und (f) Verwenden der Matrize, um mehrfache RNA-Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer RNA-Polymerase zu erzeugen, welche die Promotorsequenz erkennt. Das Oligonucleotid und die RNA-Kopien können zum autokatalytischen Synthetisieren mehrfacher Kopien der Zielsequenz verwendet werden. Dieser Aspekt umfasst weiterhin: (g) Behandeln einer RNA-Kopie aus Schritt (f) mit dem zweiten Primer unter Bedingungen, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (h) Verlängern des 3'-Terminus des zweiten Primers in einer DNA-Extensionsreaktion, um ein zweites DNA-Primer-Extensionsprodukt unter Verwendung der RNA-Kopie als einer Matrize zu ergeben; (i) Abtrennen des zweiten DNA-Primer-Extensionsprodukts von der RNA-Kopie unter Verwendung eines Enzyms, welches die RNA-Kopie selektiv abbaut; (j) Behandeln des zweiten DNA-Primer-Extensionsprodukts mit dem ersten Primer unter Bedingungen, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (k) Verlängern des 3'-Terminus des zweiten Primer-Extensionsprodukts in einer DNA-Extensionsreaktion, um eine Matrize für eine RNA- Polymerase zu erzeugen; und (l) Verwenden der Matrize aus Schritt (k), um mehrfache Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer RNA-Polymerase zu erzeugen, die den Promotor erkennt. Unter Verwendung der RNA-Kopien aus Schritt (l) können die Schritte (g) bis (k) autokatalytisch wiederholt werden, um mehrfache Kopien der Zielsequenz zu synthetisieren. Der erste Primer, der in Schritt (k) als eine Spleißmatrize dient, kann in der DNA-Extensionsreaktion aus Schritt (k) ebenfalls verlängert werden.
Eine Ausführungsform solch eines allgemeinen Verfahrens stellt alternativ ein Verfahren der Erfindung bereit, welches umfasst: (a) Behandeln einer RNA-Zielsequenz mit einem ersten Primer, der eine Komplexierungssequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-terminalen Bereich der Zielsequenz ist, um damit unter Bedingungen zu komplexieren, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (b) Verlängern des 3'-Terminus des Primers in einer Extensionsreaktion unter Verwendung des Ziels als einer Matrize, um ein DNA-Primer-Extensionsprodukt zu ergeben, das zum RNA-Ziel komplementär ist; (c) Abtrennen des DNA-Extensionsprodukts vom RNA-Ziel unter Verwendung eines Enzyms, welches das RNA-Ziel selektiv abbaut; (d) Behandeln des DNA-Primer-Extensionsprodukts mit einem zweiten Oligonucleotid, welches eine Spleißmatrize umfasst, die eine Komplexierungssequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-Terminus des Primer-Extensionsprodukts ist, um damit zu komplexieren, und eine Sequenz 5' zur Komplexierungssequenz, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase enthält, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (e) Verlängern des 3'-Terminus des DNA-Primer-Extensionsprodukts, um eine Sequenz hinzuzufügen, die zum Promotor komplementär ist, dabei Erzeugen einer Matrize für eine RNA-Polymerase; (f) Verwenden der Matrize zur Erzeugung mehrfacher RNA-Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer RNA-Polymerase, welche die Promotorsequenz erkennt; und (g) Verwenden der RNA-Kopien aus Schritt (f), autokatalytisches Wiederholen der Schritte (a) bis (f), um die Zielsequenz zu amplifizieren. Wahlweise kann die Spleißmatrize aus Schritt (d) auch als ein Primer fungieren und in Schritt (e) verlängert werden, um ein zweites Primer-Extensionsprodukt zu ergeben, unter Verwendung des ersten Primer-Extensionsprodukts als einer Ma trize.
Dort, wo die zu amplifizierende Sequenz als DNA vorhanden ist, kann die Anwendung eines geeigneten einleitenden Verfahrens RNA-Kopien erzeugen, die dann gemäß einer wie oben beschriebenen allgemeinen Methode, einschließlich eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung, amplifiziert werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Kopienzahl einer spezifischen Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe. Bei einem Aspekt bezieht die vorliegende Erfindung die gemeinsame Wirkung einer DNA-Polymerase (z. B. einer reversen Transkriptase) und einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase (Transkriptase) mit einem enzymatischen Hybrid-Auftrennschritt zum Erhalt von Produkten ein, die dann selbst zur Erzeugung von zusätzlichem Produkt verwendet werden können, was zu einer autokatalytischen Reaktion führt, die keine Manipulation der Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel eine Hitzezyklierung, erfordert. Bei einigen Ausführungsformen der Verfahren der vorliegenden Erfindung, die ein einleitendes Verfahren einbeziehen, werden alle bis auf den/die anfänglichen Schritte) des einleitenden Verfahrens bei einer Temperatur vorgenommen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können als Bestandteil von Assays zum Nachweis und/oder der Quantifizierung von spezifischen Nucleinsäurezielsequenzen in klinischen, Umwelt-, forensischen und ähnlichen Proben oder zur Herstellung großer Zahlen von Kopien von DNA und/oder RNA von einer spezifischen Zielsequenz für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Diese Verfahren können auch verwendet werden, um mehrfache DNA-Kopien einer DNA-Zielsequenz zur Klonierung herzustellen oder Sonden zu erzeugen oder RNA- und DNA-Kopien für die Sequenzierung herzustellen.
In einem Beispiel eines typischen Assays wird eine zu vervielfältigende Probe mit einem Pufferkonzentrat vermischt, welches den Puffer, Salze, Magnesium, Nucleotidtriphosphate, Primer, einschließlich einer blockierten Spleißmatrize, Dithiothreitol und Spermidin enthält. Die Reaktion wird dann gegebenenfalls zwei Minuten lang bei rund 100°C inkubiert, um jegliche Sekundärstruktur zu denaturieren. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird, wenn das Ziel ein DNA-Ziel ohne einen definierten 3-Terminus ist, reverse Transkriptase zugegeben, und die Reaktionsmischung wird 12 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wird wieder bei rund 100°C denaturiert, dieses Mal um das Primerverlängerungsprodukt von der DNA-Matrize zu trennen. Nach Abkühlung werden reverse Transkriptase, RNA-Polymerase und RNAse H zugegeben, und die Reaktion wird zwei bis vier Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion kann dann durch Denaturieren des Produkts, Zugeben einer Sondenlösung, 20 Minuten langes Inkubieren bei 60°C, Zugeben einer Lösung zur selektiven Hydrolyse der nicht-hybridisierten Sonde, sechs Minuten langes Inkubieren der Reaktion bei 60°C und Messen der verbleibenden Chemolumineszenz in einem Luminometer geassayt werden (siehe z. B. Arnold., PCT US88/02746 (eingereicht am 21. September 1988, veröffentlicht am 29. März 1989, worin der als "HPA" bezeichnet Assay beschrieben ist). Die Produkte der Verfahren der vorliegenden Erfindung können in vielen anderen dem Fachmann bekannten Assaysystemen eingesetzt werden.
Wenn das Ziel einen definierten 3-Terminus aufweist oder das Ziel eine RNA ist, schließt ein typischer Assay das Vermischen des Ziels mit dem obenstehend erwähnten Pufferkonzentrat und das Denaturieren jeglicher Sekundärstruktur ein. Nach Abkühlung werden reverse Transkriptase, RNA-Polymerase und RNAse H zugegeben, und die Mischung wird zwei bis vier Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion kann dann wie obenstehend beschrieben geassayt werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung und die darin verwendeten Materialien können als Teil von diagnostischen Kits zur Verwendung in Diagnoseverfahren eingebunden werden.
Definitionen
Wie hierin verwendet, besitzen die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen, es sei denn, es ist gegenteilig angegeben.
1. Matrize
Eine 'Matrize" ist ein Nucleinsäuremolekül, das von einer Nucleinsäure-Polymerase kopiert wird. Eine Matrize kann abhängig von der Polymerase entweder einzelsträngig, doppeisträngig oder partiell doppeisträngig sein. Die synthetisierte Kopie ist komplementär zu der Matrize oder zu mindestens einem Strang einer doppelsträngigen oder partiell doppelstrangigen Matrize. Sowohl RNA als auch DNA werden immer in der 5'- nach 3-Richtung synthetisiert und die zwei Stränge eines Nucleinsäuredoppelstranges sind immer so angeordnet, daß die 5'-Enden der zwei Stränge an entgegengesetzten Enden des Doppelstranges liegen (und dann notwendigerweise die 3-Enden ebenso).
2. Primer, Spleißmatrize
Ein "Primer" ist ein Oligonucleotid, das komplementär zu einer Matrize ist, welches (über Wasserstofibrückenbindung oder Hybridisierung) mit der Matrize komplexiert, um einen Primer/Matrize-Komplex für die Initiation der Synthese durch eine DNA-Polymerase zu erhalten, und welches durch das Anfügen von an sein 3-Ende verknüpften kovalent gebundenen Basen, welche komplementär zu der Matrize sind, in dem Vorgang der DNA-Synthese verlängert wird. Das Ergebnis ist ein Primerverlängerungsprodukt. Praktisch alle DNA-Polymerasen (einschließlich reversen Transkriptasen), die bekannt sind, erfordern die Komplexierung eines Oligonucleotids an eine einzelsträngige Matrize ("priming"), um die DNA-Synthese zu initiieren, wohingegen RNA-Replikation und -Transkription (Kopieren der RNA von DNA) im allgemeinen keinen Primer erfordern. Unter geeigneten Umständen kann ein Primer ebenfalls als eine Spleißmatrize wirken (siehe die Definition von "Spleißmatrize", die folgt).
Eine "Spleißmatrize" ist ein Oligonucleotid, das mit einer einzeisträngigen Nucleinsäure komplexiert und als eine Matrize verwendet wird, um den 3-Terminus einer Zielnucleinsäure unter Anfügen einer spezifischen Sequenz zu verlängern. Die Spleißmatrize ist genügend komplementär zu dem 3-Terminus des Zielnucleinsäuremoleküls, das verlängert werden soll, um damit zu komplexieren. Eine DNA- oder RNA-abhängige Polymerase wird dann verwendet, um das Zielnucleinsäuremolekül unter Verwendung der Sequenz 5' zu der komplementären Region der Spleißmatrize als Matrize zu verlängern. Das Verlängerungsprodukt des verlängerten Moleküls hat die spezifische Sequenz an seinem 3-Terminus, welche komplementär zu der Se quenz am 5-Terminus der Spleißmatrize ist.
Wenn der 3-Terminus der Spleißmatrize nicht blockiert ist und komplementär zu der Zielnucleinsäure ist, kann sie auch als ein Primer wirken und durch die DNA-Polymerase unter Verwendung des Zielnucleinsäuremoleküls als Matrize verlängert werden. Der 3'-Terminus der Spleißmatrize kann auf verschiedenen Wegen, einschließlich des Aufweisens eines 3'-terminalen Didesoxynucleotids oder einer zum Ziel nicht komplementären 3-terminalen Sequenz, oder auf anderen dem Fachmann gut bekannten Wegen blockiert werden.
Entweder ein Primer oder eine Spleißmatrize können mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure komplexieren und eine Priming-Funktion für eine DNA-Polymerase ausüben.
3. Zielnucleinsäure, Zielsequenz
Eine 'Zielnucleinsäure' besitzt eine zu vervielfältigende 'Zielsequenz' und kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann andere Sequenzen neben der Zielsequenz einschließen, welche nicht vervielfältigt werden sollen.
Der Begriff "Zielsequenz" bezeichnet die besondere Nucleotidsequenz der Zielnucleinsäure, welche vervielfaltigt werden soll. Die "Zielsequenz" schließt die komplexierenden Sequenzen ein, an welche die Oligonucleotide (Primer und/oder Spleißmatrize) während den Verfahren der vorliegenden Erfindung komplexieren. Wenn die Zielnucleinsäure ursprünglich einzelsträngig ist, wird der Begriff 'Zielsequenz auch die zu der "Zielsequenz", wie sie in der Zielnucleinsäure vorhanden ist, komplementäre Sequenz betreffen. Wenn die "Zielnucleinsäure" ursprünglich doppelsträngig ist, bezeichnet der Begriff "Zielsequenz" sowohl den (+) als auch den (–)-Strang.
4. Promotor/Promotorsequenz
Eine "Promotorsequenz" ist eine spezifische Nucleinsäuresequenz, die von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase ("Transkriptase") als ein Signal, an die Nucleinsäure zu binden und die Transkription von RNA an einer spezifischen Stelle zu beginnen, erkannt wird. Für die Bindung erfordern derartige Transkriptasen im allge meinen DNA, die in dem die Promotorsequenz und ihr Komplement umfassenden Bereich doppelsträngig ist; der Matrizenbereich (zu transkribierende Sequenz) muß nicht doppeisträngig sein. Individuelle DNA-abhängige RNA-Polymerasen erkennen eine Vielzahl von verschiedenen Promotorsequenzen, welche in ihrer Wirksamkeit zur Förderung der Transkription deutlich variieren können. Wenn eine RNA-Polymerase an eine Promotorsequenz bindet, um die Transkription zu initiieren, ist diese Promotorsequenz nicht Teil der transkribierten Sequenz. Deswegen werden die davon hergestellten RNA-Transkripte diese Sequenz nicht einschließen.
5. DNA-abhängige DNA-Polymerase
Eine "DNA-abhängige DNA-Polymerase" ist ein Enzym, das eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize synthetisiert. Beispiele sind DNA-Polymerase I aus E. coli und Bakteriophage T7-DNA-Polymerase. Alle bekannten DNA-abhängigen DNA-Polymerasen benötigen einen komplementaren Primer, um die Synthese zu initiieren. Es ist bekannt, daß unter geeigneten Bedingungen eine DNA-abhängige DNA-Polymerase eine komplementäre DNA-Kopie von einer RNA-Matrize synthetisieren kann.
6. DNA-abhängige RNA-Polymerase (Transkriptase)
Eine "DNA-abhängige RNA-Polymerase" oder "Transkriptase" ist ein Enzym, das mehrfache RNA-Kopien von einem doppelsträngigen oder partiell doppelsträngigen DNA-Molekül mit einer (gewöhnlich doppelstrangigen) Promotorsequenz synthetisiert. Die RNA-Moleküle ("Transkripte") werden in der 5' → 3'-Richtung beginnend an einer spezifischen Position etwas stromabwärts des Promotors synthetisiert. Beispiele von Transkriptasen sind die DNA- abhängige RNA-Polymerase aus E. coli und den Bakteriophagen T7, T3 und SP6.
7. RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase)
Eine "RNA-abhängige DNA-Polymerase" oder "reverse Transkriptase" ist ein Enzym, das eine komplementäre DNA-Kopie von einer RNA-Matrize synthetisiert. Alle bekannten reversen Transkriptasen besitzen auch die Fähigkeit, eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize herzustellen; somit sind sie beides, RNA- als auch DNA-abhängige Polymerasen. Ein Primer ist erforderlich, um die Synthese sowohl mit RNA- als auch mit DNA-Matrizen zu initiieren.
8. RNAse H
Eine 'RNAse H" ist ein Enzym, das den RNA-Teil eines RNA:DNA-Doppelstranges abbaut. RNAse H's können Endonucleasen oder Exonucleasen sein. Die meisten reverse Transkriptase-Enzyme enthalten normalerweise eine RNAse H-Aktivität zusätzlich zu ihrer Polymeraseaktivität. Jedoch sind andere Quellen von RNAse H-Aktivität ohne eine assoziierte Polymeraseaktivität verfügbar. RNA-Abbau durch eine RNAse H kann zur Abtrennung von RNA aus einem RNA:DNA-Doppelstrang führen. Alternativ dazu kann die RNAse H die RNA einfach an verschiedenen Stellen schneiden, so daß diese Teile der RNA abschmelzen oder es Enzymen ermöglichen, Abschnitte der RNA zu entwinden.
9. Plus/Minus-Strang bzw. -Stränge
Erörterungen von Nucleinsäure-Synthese werden in großem Maße vereinfacht und aufgeklärt, indem Bezeichnungen angenommen werden, um die zwei komplementären Stränge eines Nucleinsauredoppelstranges zu benennen. Herkömmlicherweise wurde der für die, zur Herstellung von Proteinen oder von strukturellen RNAs verwendeten, Sequenzen codierende Strang als der "Plus"-Strang bezeichnet und sein Komplement als "Minus"-Strang bezeichnet. Es ist jetzt bekannt, daß in vielen Fällen beide Stränge funktional sind, und dann muß die Zuordnung der Bezeichnung "Plus" an einen und "Minus" an den anderen willkürlich sein. Nichtsdestoweniger sind die Bezeichnungen sehr nützlich zur Bezeichnung der Sequenzorientierung von Nucleinsäuren und werden hier zu diesem Zweck benutzt.
10. Hybridisieren. Hybridisierung
Die Begriffe "Hybridisieren" und "Hybridisierung" bezeichnen die Bildung von Komplexen zwischen Nucleotidsequenzen, welche genügend komplementär sind, um über Watson-Crick-Basenpaarung Komplexe zu bilden. Wenn ein Primer (oder eine Spleißmatrize) mit einem Ziel (Matrize) "hybridisiert", sind solche Komplexe (oder Hybride) genügend stabil, um die von der DNA-Polymerase erforderte Priming- Funktion bereitzustellen, um die DNA-Synthese zu initiieren.
11. Primersequenzen
Die Sequenzen der Primer, auf die hierin Bezug genommen wird, sind nachfolgend dargestellt:
HBV-Region 2-Primer

(+): 5'CACCAAATGCCCCTATCTATCAACACTTCCGG3'
(–): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGAGATTGAGATCTTCTGCGAC3'

Sonde

(): 5'GGTCCCCTAGAAGAACTCCCTCG3'

HIV-Region 1-Primer

(–): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC3'
(–): 5'GTCTAACCAGAGAGACCCAGTACAGGC3'

Sondensequenz

5'GCAGCTGCTTATATGCAGGATCTGAGGG3'

HIV-Region 2-Primer

(+): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACA3'
(–) 5'CCCTTCACCTTTCCAGAG3'

Sondensequenz

(–): 5'CTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTACCCC3'

HIV-Region 3-Primer

(+): 5'CTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTG3'
(–): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCCCCCGCTTAATACTGACGCT3'

Sonde

(+–): 5'GACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGG3'

HIV-Region 4-Primer

(+): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATG3'
(–): 5'CCATCCTATTTGTTCCTGAAGGGTAC3'

Sonde

(–): 5'CTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCC3'

HIV-Region 5-Primer

(+): 5'GGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAG3'
(–): 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTTCTGATAATGCTG3'

Sonde

5'GAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATG3'

Primer für den BCL-2 Chromosomentranslokations-Hauptbruchpunkt t(14; 18)

(–): 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTGAGGAGACGGTGACC3'
(+): 5'TATGGTGGTTTGACCTTTAG3'

Sonden

5'GGCTTTCTCATGGCTGTCCTTCAG3'
5'GGTCTTCCTGAAATGCAGTGGTCG3'

Primer für die CML-Chromosomentranslokation t(9; 22)

(–): 5'GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC3'
(+) 5'GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC3'

Sonde

5'GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGG3'

12. Spezifität
Merkmal einer Nucleinsäuresequenz, welches deren Fähigkeit beschreibt, zwischen Ziel- und Nicht-Ziel-Sequenzen in Abhängigkeit von der Sequenz und den Assaybedingungen zu unterscheiden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1a bis 10 zeigen die allgemeinen Verfahren zur Vervielfältigung von Nucleinsäure, einschließlich der hierin beanspruchten Verfahren unter Verwendung einer blockierten Spleißmatrize.
Die 2a bis 2e zeigen die als einleitendes Verfahren I bezeichneten Verfahrensweise.
Die 3 zeigt die als einleitendes Verfahren II bezeichnete Verfahrensweise.
Die 4a bis 4d zeigen das weiter verbesserte Vervielfältigungsverfahren.
4a
4a zeigt den autokatalytischen Zyklus, der während der Vervielfältigungsreaktion stattfindet. Das RNA-Produkt (–) lagert sich an den ersten Primer (+) an, und eine DNA-Kopie der RNA wird durch die RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivtät der in der Reaktionsmischung vorhandenen reversen Transkriptase synthetisiert. Dann findet ein selektiver RNAse H-Abbau des RNA-Stranges des RNA:DNA-Doppelstranges statt. Es sind nicht notwendigerweise alle RNAse H-Schnittstellen in der Figur gezeigt; jedoch tritt ein ausreichender Abbau in der zu der zweiten Primer/Spleißmatrize-Bindungsstelle homologen Region auf, um RNA-Fragmente in dieser Region zu entfernen (Struktur 4). Der zweite Primer/Spleißmatrize lagert sich dann an den DNA-Strang an, und eine DNA-abhängige DNA-Synthese, ebenfalls durch die in der Reaktionsmischung vorhandene reverse Transkriptase vermittelt, kopiert einen Abschnitt des zweiten Primers/Spleißmatrize, um eine doppelsträngige Promotorregion herzustellen. Struktur 6 dient dann als eine Matrize für die Synthese von mehrfachen Kopien von RNA-Produkt (–) durch die in der Reaktionsmischung vorhandene RNA-Polymerase.
4b
Die 4b zeigt die Vervielfältigung eines RNA-Ziels, wobei das 5'-Ende der RNA und das 5'-Ende der Zielregion identisch sind. Der erste Primer (+) lagert sich an das RNA-Ziel an, und eine komplementäre DNA-Kopie von demjenigen Bereich der RNA stromabwärts des Primers wird durch die RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität der in der Reaktionsmischung vorhandenen reversen Transkriptase synthetisiert. RNAse H-Abbau des resultierenden RNA:DNA-Doppelstranges erzeugt die Struktur 3, in welcher ein ausreichender Abbau der RNA stattgefunden hat, um die Bindungsregion für den zweiten Primer/Spleißmatrize (–) zu exponieren. Andere RNAse H-Schnittstellen können vorhanden sein, aber werden in der Figur nicht gezeigt. Der zweite Primer/Spleißmatrize lagert sich an den komplementären DNA- Strang an, um Struktur 4 zu erzeugen. Die DNA-abhängige DNA-Synthese, vermittelt durch die in der Reaktionsmischung vorhandene DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität, kopiert eine Region der Spleißmatrize, um eine doppelsträngige DNA-Promotorregion herzustellen, wie gezeigt (Struktur 5). Die Struktur 5 dient als eine Matrize zur Herstellung eines RNA-Produktes (–), das dann durch den gezeigten autokatalytischen Zyklus weiter vervielfältigt wird.
4c
Die 4c zeigt die Vervielfältigung eines RNA-Ziels, wobei die Ziel-RNA zusätzliche Sequenzen 5' zur Zielregion enthält. Der erste Primer, der Promotorsequenzen 5' zu den zur Ziel-RNA komplementären Sequenzen enthält, lagert sich an die Ziel-RNA an und wird durch die in der Reaktionsmischung vorhandene RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität verlängert, um die Struktur 2 herzustellen. Es findet ein RNAse H-Abbau des RNA-Stranges des RNA:DNA-Doppelstranges statt. In dieser Figur ist der RNAse H-Abbau ausreichend, um Fragmente zu erzeugen, welche entweder schließlich alle von der Zielregion dissoziieren werden oder von der DNA-abhängigen DNA-Synthese, vermittelt durch die Anlagerung des zweiten Primers (–) verdrängt werden. Die Verlängerung des zweiten Primers (–) erzeugt eine doppelsträngige DNA-Struktur (Struktur 5), welche als eine Matrize für die RNA-Polymerare dient, um mehrfache Kopien von RNA mit der Zielregionsequenz herzustellen. Diese RNAs werden dann durch den autokatalytischen Zyklus wie gezeigt weiter vervielfältigt.
4d
Die 4d zeigt die Vervielfältigung eines RNA-Ziels, wie diejenige, die in der 4c gezeigt ist, außer daß hier die durch RNAse H-Verdau hergestellten RNA-Fragmente nicht alle dissoziieren oder von der DNA-abhängigen Synthese verdrängt werden. Stattdessen dienen einige oder alle der RNA-Fragmente als Primer für DNA-abhängige DNA-Synthese, um die Struktur 5 herzustellen, welche als eine Matrize für die RNA-Polymerase dienen kann, um DNA-Kopien herzustellen, welche über den autokatalytischen Zyklus wie gezeigt vervielfältigt werden.
Die 5 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, welche die Hypothese testen, daß RNAse H aus AMV und MMLV und E. coli spezifische RNA-Schnittstellen besitzt.
Die 6 zeigt die Ergebnisse des Einbaus von ³²P-markierten Primern während der Vervielfältigung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Verfahren und Zusammensetzun gen für die Vervielfältigung von spezifischen Nucleinsäure-Zielsequenzen für die Anwendung in Assays zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von spezifischen Nucleinsäure-Zielsequenzen oder für die Herstellung großer Zahlen an Kopien von DNA und/oder RNA spezifischer Zielsequenzen für eine Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung gestellt.
1. Allgemeines Verfahren
Die Erfindung, wie nun beansprucht, stellt eine Ausführungsform eines allgemeinen Verfahrens dar, wobei eine autokatalytische Vervielfältigung zur Synthese einer großen Zahl von DNA- und RNA-Kopien einer RNA-Zielsequenz führt. Die Zielnucleinsäure enthält die zu vervielfältigende Zielsequenz. Die Zielsequenz ist diejenige Region der Zielnucleinsäure, welche an jedem Ende von den Primern, Spleißmatrizen und/oder den natürlichen Zielnucleinsäure-Enden definiert wird, und schließt sowohl den (+)- als auch den (–)-Strang ein.
Gemäß einem Aspekt umfaßt solch ein allgemeines Verfahren das Behandeln einer Zielnucleinsäure, die eine RNA-Zielsequenz umfaßt, mit einem ersten Oligonucleotid, welches einen ersten Primer umfasst, welcher eine zu dem 3-terminalen Abschnitt der Zielsequenz genügend komplementäre Komplexierungssequenz aufweist, um damit zu complexieren, und welcher gegebenenfalls eine Sequenz 5' zu der Komplexierungssequenz aufweist, welche eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase einschließt, unter Bedingungen, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann. Der erste Oligonucleotidprimer kann auch andere Sequenzen 5' zu der primenden Sequenz aufweisen. Das 3-Ende des ersten Primers wird durch eine geeignete DNA-Polymerase in einer Verlängerungsreaktion unter Verwendung der RNA als Matrize verlängert, um ein erstes DNA-Primerverlängerungsprodukt zu erhalten, das komplementär zu der RNA-Matrize ist. Das erste Primerverlängerungsprodukt wird unter Verwendung eines Enzyms, das die RNA-Matrize selektiv abbaut, (wenigstens teilweise) von der RNA-Matrize abgetrennt.
Geeignete Enzyme sind solche, die am RNA-Strang eines RNA-DNA-Duplex selektiv wirken, was Enzyme einbezieht, die eine RNAse H-Aktivität umfassen. Obschon ei nige reversen Transkriptasen eine RNAse H-Aktivität aufweisen, kann das Zugeben von exogener RNAse H, z. B. einer E. coli-RNAse H, vorzuziehen sein.
Das einzelsträngige erste Primerverlängerungsprodukt wird mit einem zweiten Oligonucleotid, welches ein zweiter Primer oder eine Spleißmatrize ist und welches eine zu dem im ersten Primerverlängerungsprodukt enthaltenen 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz genügend komplementäre komplexierende Sequenz aufweist, um damit zu komplexieren, unter Bedingungen, bei welchen ein Oligonucleotid/-Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann, behandelt. Wenn der erste Primer keine Promotorsequenz besitzt, dann ist das zweite Oligonucleotid eine Spleißmatrize, welche eine Sequenz 5' zu der komplexierenden Region besitzt, welche eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase einschließt. Gegebenenfalls kann die Spleißmatrize an ihrem 3-Terminus blockiert sein. Der 3'-Terminus des zweiten Oligonucleotids und/oder des Primerverlängerungsprodukts wird in einer DNA-Verlängerungsreaktion verlängert, um eine Matrize für eine RNA-Polymerase herzustellen. Die hergestellten RNA-Kopien oder Transkripte können ohne weiteres Eingreifen autokatalytisch vermehrt werden.
Wenn ein Oligonucleotid als eine Spleißmatrize wirkt, wird seine Primerfunktion nicht benötigt. Daher kann der 3-Terminus der Spleißmatrize gemäß der beanspruchten Verfahren blockiert sein. Die Bestandteile der resultierenden Reaktionsmischung (d. h. ein RNA-Ziel, das die Herstellung eines ersten Primerverlängerungsproduktes mit einem definierten 3'-Terminus erlaubt, ein erster Primer und eine blockierte Spleißmatrize) wirken dahingehend, große Mengen an RNA und DNA autokatalytisch zu synthetisieren.
Gemäß des hierin beschriebenen allgemeinen Verfahrens sind das erste und das zweite Oligomer beide Primer. Der erste Primer weist eine Sequenz 5' zu der komplexierenden Sequenz auf, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase einschließt und andere Sequenzen einschließen kann. Der zweite Primer kann auch eine Sequenz 5' zu der komplexierenden Sequenz einschließen, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase und gegebenenfalls andere Sequenzen einschließen kann. Wenn beide Primer eine Promotorsequenz aufweisen, wird es bevorzugt, daß beide Sequenzen von derselben RNA-Polymerase erkannt werden, es sei denn, es ist beabsichtigt, den zweiten Promotor für andere Zwecke, wie Klonierung, einzuführen. Das 3-Ende des zweiten Primers wird durch eine geeignete DNA-Polymerase in einer Verlängerungsreaktion verlängert, um ein zu dem ersten Primerverlängerungsprodukt komplementäres zweites DNA-Primerverlängerungsprodukt herzustellen. Man bemerke, daß, so wie der erste Primer ein Ende der Zielsequenz definierte, der zweite Primer nun das andere Ende definiert. Das doppelsträngige Produkt der zweiten Verlängerungsreaktion ist eine geeignete Matrize für die Herstellung von RNA durch eine RNA-Polymerase. Wenn der zweite Primer auch eine Promotorsequenz aufweist, werden zu beiden Strängen der doppelsträngigen Matrize komplementäre Transkripte während der autokatalytischen Reaktion hergestellt werden. Die RNA-Transkripte können nun unterschiedliche Termini als die Zielnucleinsäure besitzen, aber die Sequenz zwischen dem ersten Primer und den zweiten Primer bleibt intakt. Die so hergestellten RNA-Transkripte können ohne weiteren Eingriff in dem obengenannten System automatisch recyclieren. Somit ist diese Reaktion autokatalytisch.
Wenn die komplexierende Sequenz des zweiten Primers mit dem 3-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes komplexiert, kann der zweite Primer als eine Spleißmatrize wirken, und das erste Primerverlängerungsprodukt kann verlängert werden, um irgendeine Sequenz des zweiten Primers 5' zu der primenden Sequenz an das erste Primerverlängerungsprodukt anzufügen (siehe z. B. 1e und 1g). Wenn der zweite Primer als eine Spleißmatrize wirkt und 5' zu der hybridisierenden Sequenz eine Promotorsequenz einschließt, erzeugt die Verlängerung des ersten Primerverlängerungsproduktes unter Anfügung der Promotorsequenz eine zusätzliche Matrize für eine RNA-Polymerase, die transkribiert werden kann, um RNA-Kopien von jedem Strang herzustellen (siehe 1e und 1g). Der Einschluß von Promotoren in beide Primer kann die Anzahl von synthetisierten Kopien der Zielsequenz steigern.
Ein anderer Aspekt des allgemeinen Verfahrens der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung eines ersten Oligonucleotids, das einen Primer umfasst, und eines zweiten Oligonucleotids, das eine Spleißmatrize umfasst, und das fähig sein kann, als ein Primer zu wirken (dadurch, daß es nicht selbst in einer Primerverlängerungsreaktion verlängert wird), oder nicht, ein. Dieser Aspekt des allgemeinen Verfahrens umfaßt das Behandeln einer Zielnucleinsäure, die eine RNA-Zielsequenz umfaßt, mit einem ersten Oligonucleotidprimer, welcher eine zu dem 3-terminalen Abschnitt der Zielsequenz genügend komplementäre komplexierende Sequenz aufweist, um damit zu komplexieren, unter Bedingungen, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann. Der erste Primer kann andere Sequenzen 5' zu der komplexierenden Sequenz aufweisen, wobei ein Promotor eingeschlossen ist. Das 3'-Ende des ersten Primers wird durch eine geeignete DNA-Polymerase in einer Verlängerungsreaktion unter Verwendung der RNA als Matrize verlängert, um ein erstes Primerverlängerungsprodukt zu erhalten, das komplementär zu der RNA-Matrize ist. Das erste Primerverlängerungsprodukt wird mittels eines Enzyms, das die RNA-Matrize selektiv abbaut, von der RNA-Matrize abgetrennt. Geeignete Enzyme sind solche, die am RNA-Strang eines RNA-DNA-Duplex selektiv wirken, was Enzyme einbezieht, die eine RNAse H-Aktivität umfassen. Obschon einige reversen Transkriptasen eine RNAse H-Aktivität aufweisen, kann das Zugeben von exogener RNAse H, z. B. einer E. coli-RNAse H, vorzuziehen sein. Das einzelsträngige erste Primerverlängerungsprodukt wird mit einer Spleißmatrize, welche eine zu dem 3-Terminus des Primerverlängerungsproduktes genügend komplementäre komplexierende Sequenz aufweist, um damit zu komplexieren, und eine Sequenz 5' zu der komplexierenden Sequenz aufweist, welche eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase einschließt, unter Bedingungen, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann, behandelt. Der 3-Terminus der Spleißmatrize kann entweder blockiert (wie durch das Anfügen eines Didesoxynucleotides) oder nicht-komplementär zu der Zielnucleinsäure sein (so daß sie nicht als Primer wirkt), oder alternativ dazu nicht blockiert sein. Der 3-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes wird unter Verwendung einer geeigneten DNA-Polymerase in einer DNA-Verlängerungsreaktion verlängert, um an den 3-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes eine zu der Sequenz der Spleißmatrize komplementäre Sequenz 5' zu der komplexierenden Sequenz anzufügen, welche den Promotor einschließt. Wenn der 3'-Terminus nicht blockiert ist, kann die Spleißmatrize verlängert werden, um ein zu dem ersten Primerverlängerungsprodukt komplementäres zweites Primerverlängerungsprodukt zu erhalten. Das Produkt der Verlängerungsreaktion mit der Spleißmatrize (ob blockiert oder nicht blockiert) kann als eine Matrize für die RNA-Synthese unter Verwendung einer RNA-Polymerase fungieren, welche den Promotor erkennt. Wie obenstehend bemerkt, können die so hergestellten RNA-Transkripte ohne weiteren Eingriff in dem obengenannten System automatisch recyclieren. Somit ist die Reaktion autokatalytisch.
In manchen Ausführungsformen wird die zu vervielfältigende Zielsequenz an beiden Enden durch die Lage der zu den verwendeten Primern (oder Spleißmatrizen) komplementären spezifischen Sequenzen definiert. In anderen Ausführungsformen wird die Zielsequenz an einer Stelle von einer spezifischen Sequenz definiert, die komplementär zu einem verwendeten Primermolekül ist, und, am entgegengesetzten Ende, von der Lage einer spezifischen Sequenz, die durch eine spezifische Restriktionsendonuclease, oder mittels anderer geeigneter Methoden, geschnitten wird, welche einen natürlichen 3'-Terminus einschließen kann. In anderen Ausführungsformen wird die Zielsequenz an beiden Enden durch die Lage von spezifischen Sequenzen definiert, welche durch eine oder mehrere spezifische Restriktionsendonucleasen) geschnitten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des allgemeinen Verfahrens wird die RNA-Zielsequenz bestimmt und dann analysiert, um festzustellen, wo der RNAse H-Abbau Schnitte oder die Entfernung von RNA-Abschnitten aus dem Duplex verursachen wird. Es können Analysen vorgenommen werden, um die Wirkung des RNAse-Abbaus der Zielsequenz durch RNAse H, die in AMV-reverser Transkriptase und MMLV-reverser Transkriptase vorhanden ist, durch E. coli-RNAse H oder andere Quellen und durch Kombinationen davon zu bestimmen.
Bei der Auswahl eines Satzes an Primern wird es bevorzugt, daß einer der Primer so gewählt wird, daß er an einen Bereich von RNA hybridisieren wird, welcher durch die in der Reaktionsmischung vorhandene RNAse H im wesentlichen nicht-abgebaut vorliegt. Wenn ein wesentlicher Abbau besteht, können die Schnitte in dem RNA-Strang in der Region des Primers die Initiation der DNA-Synthese inhibieren und die Verlängerung des Primers verhindern. Daher wird es bevorzugt, einen Primer zu wählen, der mit einer Sequenz des RNA-Ziels hybridisieren wird, die so gelegen ist, daß wenn die RNA der RNAse H unterzogen wird, dort kein wesentlicher Abbau vorliegt, welcher die Bildung des Primerverlängerungsproduktes verhindern würde.
Die Stelle für die Hybridisierung des Promotor-Primers wird so ausgewählt, daß ein ausreichender Abbau des RNA-Stranges auftritt, um die Entfernung des Abschnitts des RNA-Strangs zu ermöglichen, welcher an den Bereich des DNA-Stranges hybridisiert ist, an welchen der Promotor-Primer hybridisieren wird. Typischerweise werden nur Teile der RNA aus dem RNA:DNA-Doppelstrang durch RNAse H-Abbau entfernt, und ein wesentlicher Teil des RNA-Stranges bleibt in dem Doppelstrang.
Die Bildung des den Promotor enthaltenden doppelsträngigen Produktes für die RNA-Synthese wird in der 4 veranschaulicht. Wie in der 4 dargestellt, hybridisiert der Ziel-RNA-Strang an einen Primer, der so gewählt ist, daß er mit einer Region des RNA-Strangs hybridisiert, welche nicht wesentlich durch die in der Reaktionsmischung vorhandene RNAse H abgebaut wird. Der Primer wird dann verlängert, um einen zu dem RNA-Strang komplementären DNA-Strang zu bilden. Danach wird der RNA-Strang von der in der Reaktionsmischung vorhandenen RNAse H an verschiedenen Stellen geschnitten oder abgebaut. Es sollte verstanden werden, daß dieses Schneiden oder Abbauen an diesem Punkt oder zu anderen Zeiten während dem Verlauf der Reaktion stattfinden kann. Dann dissoziieren die RNA-Fragmente von dem DNA-Strang in Regionen, wo Schnitte oder Abbau signifikant auftreten. Der Promotor-Primer hybridisiert dann mit dem DNA-Strang an dessen 3-Ende, wo der RNA-Strang im wesentlichen abgebaut und vom DNA-Strang abgetrennt worden ist. Als nächstes wird der DNA-Strang verlängert, um eine doppelsträngige DNA-Promotorsequenz zu bilden, wodurch eine Matrize für die RNA-Synthese gebildet wird. Es ist zu erkennen, dass diese Matrize eine doppelsträngige DNA-Promotorsequenz enthält. Wenn diese Matrize mit RNA-Polymerase behandelt wird, werden mehrere Stränge von RNA erzeugt.
Obwohl die exakte Beschaffenheit des aus der RNAse-H resultierenden RNA-Abbaus nicht bekannt ist, ist gezeigt worden, daß das Ergebnis des RNAse H-Abbaus auf den RNA-Strang eines RNA:DNA-Hybrids zur Dissoziation kleiner Stücke von RNA aus dem Hybrid führt. Es ist ebenfalls gezeigt worden, daß Promotor-Primer ausgewahlt werden können, die nach einem solchen RNAse H-Abbau an die DNA in dem Bereich binden werden, wo die kleinen Fragmente entfernt sind.
Die 1 und 2 zeigen, wie sie dargestellt sind, nicht die RNA, welche nach einem RNAse H-Abbau verbleiben wird. Es soll verstanden werden, daß obwohl diese Figuren im allgemeinen die vollständige Entfernung der RNA aus dem RNA:DNA-Doppelstrang zeigen, unter den bevorzugten Bedingungen nur ein partieller Abbau auftritt, wie in der 3 veranschaulicht. Unter Bezug auf 1A, kann ersehen werden, daß der vorgeschlagene Mechanismus nicht stattfinden könnte, wenn ein wesentlicher Teil des RNA-Strangs von 1 nicht-abgebaut bleibt, womit die Hybridisierung des zweiten Primers oder die Verlängerung des hybridisierten zweiten Primers zur Herstellung eines zur Promotorsequenz komplementären DNA-Strangs verhindert wird. Auf der Grundlage der entdeckten und in dieser Anmeldung offenbarten Syntheseprinzipien, können jedoch Routinemodifikationen durch den Fachmann gemäß den Erkenntnissen dieser Erfindung vorgenommen werden, um ein effektives und wirksames Vorgehen für die Vervielfältigung von RNA vorzusehen.
Wie aus den Beschreibungen hierin und den 1a bis 1o ersehen werden kann, umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung wahlfreie Variationen. Die 1a zeigt ein Verfahren, worin die Zielnucleinsäure zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid umfasst einen ersten Primer mit einer Promotorsequenz 5' zu seiner komplexierenden Sequenz, welcher mit dem 3'-terminalen Bereich der Zielsequenz einer Zielnucleinsäure (RNA) komplexiert, die zusätzliche Sequenzen 3' zum Ende der Zielsequenz aufweist. Das zweite Oligonucleotid umfasst einen zweiten Primer, der mit dem 3'-terminalen Abschnitt des ersten Primerverlängerungsproduktes komplexiert, welcher mit dem 3-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes zusammenfällt. In Schritt (1) wirkt der erste Primer wegen der zusätzlichen Sequenzen 3' zur Zielsequenz nicht als eine Spleißmatrize; in Schritt (10) jedoch kann der erste Primer als eine Spleißmatrize wirken, da das zweite Primerverlängerungsprodukt keine zusätzlichen Sequenzen 3' zur Zielsequenz besitzt.
Die 1b zeigt ein Verfahren, worin die Zielnucleinsäure (RNA) zusätzliche Sequenzen sowohl 5' als auch 3' zur Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid ist wie das in der 1a abgebildete beschaffen. Das zweite Oligonucleotid umfasst ein Primer, der mit dem 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz des ersten Primerverlängerungsproduktes hybridisiert, welches zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz besitzt.
Die 1c zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche definierte 5'- und 3'-Enden besitzt, und somit keine zusätzlichen Sequenzen entweder 5' oder 3' zur Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid ist wie in den 1a und 1b gezeigt, aber da es mit dem 3-Terminus der Zielnucleinsäure komplexiert, wirkt es in Schritt 1 sowohl als ein Primer als auch als Spleißmatrize. Das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1a gezeigt beschaffen.
Die 1d zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche ein definiertes 3-Ende besitzt und daher keine zusätzlichen Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist, aber zusätzliche Sequenzen 5' zur Zielsequenz besitzt. Das erste Oligonucleotid ist wie das in der 1c gezeigte und fungiert sowohl als ein Primer als auch als Spleißmatrize. Das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1b gezeigt beschaffen.
Die 1e zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche ein definiertes 5-Ende besitzt, aber zusätzliche Sequenzen 3' zu der Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid ist wie in der 1a gezeigt beschalten. Das zweite Oligonucleotid ist ein zweiter Primer, welcher, da er mit dem 3'-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes komplexiert, ebenfalls eine Spleißmatrize umfasst. Das zweite Oligonucleotid weist ebenfalls einen Promotor 5' zu seiner komplexierenden Sequenz auf.
Die 1f zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA) mit zusätzlichen Sequenzen sowohl 5' als auch 3' zur Zielsequenz. Das erste Oligonucleotid ist wie in der 1a gezeigt beschaffen. Das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1e gezeigt beschaffen, außer daß es nicht als eine Spleißmatrize in Schritt (4) wirken kann, da das erste Primerverlängerungsprodukt zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist.
Die 1g zeigt eine Zielnucleinsaure (RNA), welche sowohl definierte 5'- als auch 3-Enden mit keinen Sequenzen neben der Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid ist wie in der 1c gezeigt beschaffen, und das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1e beschaffen. Da das Ziel keine zusätzlichen Sequenzen aufweist, wirken beide Oligonucleotide auch als Spleißmatrizen.
Die 1h zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche ein definiertes 3'-Ende mit keinen Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist, aber zusatzliche Sequenzen 5' zu der Zielsequenz besitzt. Das erste Oligonucleotid ist wie in den 1c und 1g gezeigt beschaffen und wirkt sowohl als Primer als auch als Spleißmatrize. Das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1f abgebildet beschaffen.
Die 1i zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche einen definierten 5 '-Terminus aufweist und keine zusätzlichen Sequenzen 5' zur Zielsequenz besitzt, aber zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielseqeuenz aufweist. Das erste Oligonucleotid umfasst einen Primer ohne einen Promotor. Das zweite Oligonucleotid umfasst eine nicht blockierte Spleißmatrize, welche 5' zu ihrer komplexierenden Sequenz einen Promotor aufweist.
Die 1j zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche einen definierten 5'- und 3-Terminus und keine Sequenzen neben der Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid umfasst einen Primer ohne einen Promotor. Das zweite Oligonucleotid ist wie in der 1l gezeigt beschaffen.
Die 1k zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche einen definierten 5'-Terminus ohne zusätzliche Sequenzen 5' zur Zielsequenz aufweist, aber welche zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz besitzt. Das zweite Oligonucleotid umfasst eine Spleißmatrize mit einem Promotor 5' zu ihrer komplexierenden Sequenz, welche jedoch an ihrem 3-Terminus blockiert ist. Das zweite Oligonucleotid ist unfähig dazu, als ein Primer zu wirken.
Die 1l zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche definierte 5'- und 3'-Enden und keine zusätzlichen Sequenzen neben der Zielsequenz aufweist. Das erste Oli gonucleotid wirkt sowohl als ein Primer als auch als eine Spleißmatrize. Das zweite Oligonucleotid ist eine blockierte Spleißmatrize und ist wie in der 1k gezeigt beschaffen.
Die 1m zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche einen definierten 5-Terminus und somit keine zusätzlichen Sequenzen 5' zur Zielsequenz aufweist, aber welche zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz besitzt. Das erste Oligonucleotid ist ein Primer wie in der 1l gezeigt. Das zweite Oligonucleotid ist eine blockierte Spleißmatrize mit einem Promotor, wie in den 1k und 1l gezeigt.
Die 1n zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche sowohl definierte 5'- als auch 3'-Sequenzen ohne zusätzliche Sequenzen neben der Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid umfasst einen Primer ohne einen Promotor, wie in der 1j gezeigt. Das zweite Oligonucleotid umfasst eine blockierte Spleißmatrize mit einem Promotor, wie in den 1k, 1l und 1m gezeigt.
Die 10 zeigt eine Zielnucleinsäure (RNA), welche einen definierten 5-Terminus ohne zusätzliche Sequenzen 5' zur Zielsequenz aufweist, aber welche zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz besitzt. Es wird ein Oligonucleotid sowohl als das erste als auch als das zweite Oligonucleotid verwendet. Das Oligonucleotid besitzt eine 3'-Primersequenz, welche, wie in Schritt (1) gezeigt, mit dem 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz komplexiert, und weist eine 5'-Spleißmatrizensequenz mit einem Promotor auf, welche mit dem 3'-Terminus des Primerverlängerungsproduktes, wie in Schritt (4) gezeigt, komplexiert.
Zusammengefaßt stellen die hierin beschriebenen Verfahren ein Verfahren zur autokatalytischen Synthese mehrfacher Kopien einer Zielnucleinsäuresequenz ohne wiederkehrende Manipulation der Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, Ionenstärke und pH, zur Verfügung, welches (a) das Vereinigen in einer Reaktionsmischung von einer Zielnucleinsäure, die eine RNA-Zielsequenz umfaßt; von zwei Oligonucleotidprimern, eines ersten Oligonucleotids mit einer zum 3'-terminalen Abschnitt der RNA-Zielsequenz (zum Beispiel dem (+)-Strang) genügend komplementären komplexierenden Sequenz, um damit zu komplexierenden, und eines zweiten Oligonucleotids mit einer zum 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz von ihrem Komplement (zum Beispiel dem (–)-Strang) genügend komplementären Sequenz, um damit zu komplexierenden, wobei das erste Oligonucleotid einen ersten Primer umfasst, welcher gegebenenfalls eine Sequenz 5' zur komplexierenden Sequenz besitzt, welche eine Promotorsequenz einschließt, und das zweite Oligonucleotid ein Primer oder eine Spleißmatrize umfasst; mit der Maßgabe, daß dann, wenn das erste Oligonucleotid keinen Promotor aufweist, das zweite Oligonucleotid eine Spleißmatrize ist, welche eine Sequenz 5' zu der primenden Sequenz besitzt, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase; eine DNA-Polymerase; eine Enzymaktivität, welche den RNA-Strang eines RNA-DNA-Komplexes selektiv abbaut (z. B. eine RNAse H) und eine RNA-Polymerase, welche den Promotor erkennt, einschließt. Die Bestandteile der Reaktionsmischung können schrittweise oder auf einmal vereinigt werden. Die Reaktionsmischung wird unter Bedingungen, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird, einschließlich Bedingungen für das DNA-Priming und die Nucleinsäuresynthese (wobei Ribonucleotidtriphosphate und Desoxyribonucleotidtriphosphate eingeschlossen werden), für eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, wodurch mehrfache Kopien der Zielsequenz hergestellt werden. Die Reaktion findet vorteilhafterweise unter für die Aufrechterhaltung der Stabilität der Reaktionsbestandteile, wie den Enzymbestandteilen, geeigneten Bedingungen und ohne die Notwendigkeit einer Modifikation oder Manipulation von Reaktionsbedingungen während des Verlaufs der Vervielfaltigungsreaktion statt. Folglich wird die Reaktion unter Bedingungen stattfinden, welche im wesentlichen isothermisch sind und im wesentlichen konstante Ionenstärke und konstanten pH-Wert einschließen.
Die vorliegende Reaktion erfordert keinen Denaturierungsschritt, um den durch die erste DNA-Verlängerungsreaktion hergestellten RNA-DNA-Komplex zu trennen. Solche Schritte erfordern die Manipulation von Reaktionsbedingungen, wie durch eine wesentliche Erhöhung der Temperatur der Reaktionsmischung (im allgemeinen von Umgebungstemperatur auf etwa 80°C bis etwa 105°C), eine Verringerung ihrer Ionenstärke (im allgemeinen um 10× oder mehr) oder eine Veränderung des pH (gewöhnlich Anheben des pH auf 10 oder mehr). Derartige Manipulationen der Reaktionsbedingungen beeinträchtigen oft in verschlechternder Weise die Enzymaktivitäten, was die Zugabe von zusätzlichem Enzym erforderlich macht und ebenfalls weite re Manipulationen der Reaktionsmischung notwendig macht, um diese wieder auf für eine weitere Nucleinsäuresynthese geeignete Bedingungen zu bringen.
Zu geeigneten DNA-Polymerasen zählen reverse Transkriptasen. Zu besonders bevorzugten DNA-Polymerasen zählen AMV-reverse Transkriptase und MMLV-reverse Transkriptase.
Für den Einbau in die bei den hierin beschriebenen Verfahren verwendeten Primer und/oder Spleißmatrizen geeignete Promotorsequenzen sind Nucleinsäuresequenzen (entweder natürlich vorkommende, synthetisch hergestellte oder ein Produkt eines Restriktionsverdaus), die von einer RNA-Polymerase spezifisch erkannt werden, die diese Sequenz erkennt und daran bindet und den Vorgang der Transkription initiiert, wodurch RNA-Transkripte hergestellt werden. Die Sequenz kann gegebenenfalls über die tatsächliche Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase hinausgehende Nucleotidbasen einschließen, welche zusätzliche Stabilität oder Anfälligkeit gegenüber Abbauvorgängen oder erhöhte Transkriptionseffizienz vermitteln können. Promotorsequenzen, für die eine bekannte und verfügbare Polymerase vorliegt, welche dazu fähig ist, die Initiationssequenz zu erkennen, sind für die Verwendung besonders geeignet. Typischerweise schließen bekannte und brauchbare Promotoren solche, welche von bestimmten Bakteriophagenpolymerasen erkannt werden, wie denjenigen aus Bakteriophage T3, T7 oder SP6, oder einen Promotor aus E. coli, ein.
Obschon einige der reversen Transkriptasen, die zur Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, eine RNAse H-Aktivität aufweisen, wie etwa AMV-reverse Transkriptase, kann der Zusatz von exogener RNAse H, z. B. einer E. coli-RNAse H, bevorzugt sein. Obschon, wie die Beispiele zeigen, die Zugabe von exogener RNAse H nicht erfolderlich ist, kann unter bestimmten Bedingungen die in AMV-reverser Transkriptase vorhandene RNAse H-Aktivität durch im Reaktionsgemisch vorhandene Komponenten gehemmt werden. In solchen Situationen kann die Zugabe von exogener RNAse H wünschenswert sein. Wo relativ große Mengen an heterologer DANN im Reaktionsgemisch vorhanden sind, kann die native RNAse H-Aktivität der AMV-reversen Transkriptase etwas gehemmt sein (siehe z. B. Beispiel 8) und dementsprechend die Zahl der erzeugten Kopien der Zielsequenz reduziert sein. In Situtationen, bei denen die Zielsequenz lediglich einen kleinen Abschnitt der vorhandenen DNA umfasst (z. B. wo die Probe beträchtliche Mengen an heterologer DNA enthält), ist der Zusatz von exogener RNAse H besonders bevorzugt. Eine solche bevorzugte RNAse H ist E. coli-Rnase H. Von der Zugabe dieser exogenen RNAse H wurde gezeigt, dass sie die durch große Mengen der DNA bewirkte Hemmung überwinden kann. (Siehe z. B. Beispiel 8)
Die durch diese Verfahren hergestellten RNA-Transkripte können als Matrizen dienen, um weitere Kopien der Zielsequenz durch die obenstehend beschriebenen Mechanismen herzustellen. Das System ist autokatalytisch und die Amplifikation durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgt autokatalytisch ohne die Notwendigkeit wiederholter Modifizierung oder Veränderung der Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, pH, Ionenstärke oder dergleichen. Das Verfahren erfordert keine kostspielige Thermocycier-Vorrichtung noch erfordert es mehrere Zugaben von Enzymen oder anderen Reagenzien während des Verlaufs einer Vervielfältigungsreaktion.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können als ein Bestandteil von Assays verwendet werden, um spezifische Nucleinsäurezielsequenzen in klinischen, Umwelt-, forensischen und ähnlichen Proben nachzuweisen und/oder zu quantifizieren oder große Zahlen an Kopien von DNA und/oder RNA einer spezifischen Zielsequenz für eine Vielzahl von Anwendungen herzustellen.
In einem typischen Assay der Erfindung wird eine zu vervielfältigende Probe mit einem Pufferkonzentrat mit dem Puffer, Salzen, Magnesium, Triphosphaten, Primern, einschließlich einer blockierten Spleißmatrize, Dithiothreitol und Spermidin gemischt. Die Reaktion kann gegebenenfalls bei um die 100°C zwei 10 Minuten lang inkubiert werden, um jegliche Sekundärstrukturen in der Nucleinsäure zu denaturieren. Nach Abkühlen wird, wenn das Ziel ein DNA-Ziel ohne einen definierten 3-Terminus ist, reverse Transkriptase zugegeben und die Reaktionsmischung wird 12 Minuten lang bei etwa 42°C inkubiert. Die Reaktion wird wieder bei um die 100°C denaturiert, diesesmal zur Trennung des Primerverlängerungsprodukts von der DNA-Matrize. Nach Abkühlen, werden reverse Transkriptase, RNA-Polymerase und RNAse H zugegeben, und die Reaktion wird zwei bis vier Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reakti on kann dann durch Denaturieren des Produktes, Zugeben einer Sondenlösung, 20 Minuten langes Inkubieren bei 60°C, Zugeben einer Lösung, um die Markierung der nicht-hybridisierten Sonde selektiv zu hydrolysieren, sechs Minuten langes Inkubieren der Reaktion bei 60°C und Messen der verbleibenden chemolumineszenten Markierung in einem Luminometer geassayt werden. Die obenstehend angegebenen Verfahren der HPA-Anwendung sind hierbei inbegriffen. Mehrere andere Verfahren zur Produktbestimmung können anstatt der Sondenhybridisierung in Lösung angewandt werden.
Wenn das Ziel einen definierten 3-Terminus besitzt und eines der Oligonucleotide eine Spleißmatrize ist, welche eine zu dem 3-Terminus genügend komplementäre hybridisierende Sequenz, um damit zu hybridisieren, und eine Promotorsequenz 5' zu der hybridisierenden Sequenz aufweist, oder das Ziel RNA ist, schließt ein typischer Assay das Mischen des Ziels mit dem obenstehend erwähnten Pufferkonzentrat und das Denaturieren jeglicher Sekundärstruktur ein. Nach Abkühlen werden reverse Transkriptase, RNA-Polymerase, und sofern erwünscht, RNAse H zugegeben, und die Mischung wird zwei bis vier Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion kann dann wie obenstehend beschrieben geassayt werden.
II. Einleitende Verfahren
Es folgen mehrere Ausführungsformen von einleitenden Verfahren, welche gegebenenfalls in Verbindung mit einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden können. Da manche Zielnucleinsäuren eine Modifikation vor der autokatalytischen Vervielfältigung erfordern, können diese Verfahren verwendet werden, um die Modifikationen vorzunehmen. Wenn die Zielnucleinsäure (und die Zielsequenz) ursprünglich DNA ist, können diese Verfahren angewandt werden, um RNA-Kopien der Zielsequenz zur Verwendung in dem allgemeinen Verfahren herzustellen. Es sollte erkannt werden, daß diese einleitenden Verfahren selbst wiederholt werden können, und deshalb von sich selbst aus als Vervielfältigungsverfahren eingesetzt werden können.
Einleitendes Verfahren 1
Dieses Verfahren liefert RNA-Kopien einer Zielsequenz einer Zielnucleinsäure, welche eine (einzelsträngige) DNA mit einem definierten 3'-Terminus umfaßt. Das einleitende Verfahren 1 wendet zwei Nucleinsäurebestandteile an: ein Zielnucleinsäuremolekül und eine Oligonucleotidspleißmatrize. Dieses Verfahren erfordert eine DNA-Zielnucleinsäure mit einem definierten 3-Ende. Wenn der native 3-Terminus nicht bekannt ist oder aus irgendeinem Grunde nicht zufriedenstellend ist, kann ein neuer definierter 3-Terminus durch Verwenden einer Restriktionsnuclease, Ligation an eine andere Sequenz oder einige andere Methoden erzeugt werden.
In der folgenden Beschreibung (siehe 2A bis 2C) wird die Zielnucleinsäure willkürlicherweise den "Minus"-Sinn aufweisen. Daher wird die Spleißmatrize den "Plus-Sinn besitzen, so daß sie zu dem Ziel genügend komplementär ist, um damit zu komplexieren. Die Spleißmatrize weist eine zum 3'-Terminus des Ziels genügend komplementäre komplexierende Sequenz auf, um damit zu komplexieren. Die Spleißmatrize weist ebenfalls eine Sequenz 5' zur komplexierenden Sequenz auf, welche eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase einschließt. Die Spleißmatrize kann gegebenenfalls andere Sequenzen 5' zum Promotor, zwischen dem Promotor und den komplexierenden Seqenzen und/oder 3' zur komplexierenden Sequenz besitzen. Gemäß der beanspruchten Erfindung kann die Spleißmatrize auch am 3'-Terminus modifiziert werden, um "blockiert" zu werden, so daß sie nicht durch Anfügen zusätzlicher Nucleotide in einer Verlängerungsreaktion verlängert werden kann und dazu unfähig gemacht wird, zusätzlich zur Wirkung als eine Spleißmatrize, als ein Primer zu wirken.
Das einleitende Verfahren 1 verwendet zwei Enzymaktivitäten: eine DNA-abhängige DANN-Polymerase und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase.
Die Zielnucleinsäure wird mit der Spleißmatrize unter Bedingungen behandelt, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann. In einer DNA-Verlängerungsreaktion wird unter Verwendung einer geeigneten DNA-Polymerase eine zu der Sequenz der Spleißmatrize 5' zur komplexierenden Sequenz komplementare Sequenz an den 3'-Terminus der Ziel-DNA angefügt. Die Spleißmatrize, wenn am 3'-Terminus nicht blockiert, kann ebenfalls als ein Primer für die DNA-Polymerase dienen und verlängert werden, um ein Primerverlängerungsprodukt zu ergeben. Das Produkt der Verlängerungsreaktion, ob doppelsträngig oder partiell doppelsträngig, der Ziel/Spleißmatrizen-Komplex, wirkt als eine Matrize für die Synthese von RNA-Transkripten unter Verwendung einer RNA-Polymerase, welche den Promotor erkennt. Die RNA-Transkripte können dann für das allgemeine Verfahren verwendet werden oder verwendet werden, um wie folgt DNA-Kopien der RNA zu erzeugen:
Ein die Zielsequenz (mit dem "Plus-Sinn) umfassendes RNA-Transkript wird mit einem Primer (welcher nominell den "Minus-Sinn hat), der eine zum 3'-Ende der Zielsequenz des RNA-Transkripts genügend komplementäre Sequenz aufweist, um damit zu komplexieren, unter Bedingungen behandelt, bei welchen ein Oligonucleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann. Der Primer wird dann in einer DANN-Verlängerungsreaktion unter Verwendung des RNA-Transkripts als Matrize verlängert, um ein die Zielsequenz besitzendes DNA-Primerverlängerungsprodukt zu erzeugen. Die DNA-Zielsequenz wird vom RNA-Transkript entweder durch Denaturieren oder durch Abbau der RNA abgetrennt, und der Zyklus wird, beginnend mit der Spleißmatrize, wiederholt. Gegebenenfalls kann der Primer auch zusätzliche Sequenzen 5' zu der primenden Sequenz aufweisen. Die Spleißmatrize kann auch zusätzliche Sequenzen 3' zu ihrer komplexierenden Sequenz aufweisen.
In einer Ausführungsform kann das obenstehende Verfahren unter Verwendung eines Oligonucleotids ausgeführt werden, indem ein Oligonucleotid verwendet wird, das eine Sequenz besitzt, die den Primer 3' zur Sequenz umfasst, welche die Spleißmatrize umfassen würde. (siehe z. B. 2c).
Das einleitende Verfahren 1 wird weiter unter Bezugnahme auf die 2a bis 2e beschrieben. Die 2a zeigt eine Zielnucleinsäure (DNA), welche einen definierten 3'-Terminus ohne zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist. Das erste Oligonucleotid umfasst sowohl einen Primer als auch als eine Spleißmatrize und besitzt einen Promotor 5' zu seiner komplexierenden Sequenz.
Die 2b zeigt eine Zielnucleinsäure (DNA), wie in der 2a gezeigt. Das erste Oligonucleotid umfasst eine Spleißmatrize, welche an ihrem 3'-Ende blockiert ist und daher unfähig dazu ist, als ein Primer zu wirken.
Die 2c zeigt eine Ziel-DNA, wie in den 2a und 2b gezeigt. Die 2c zeigt die Verwendung von einem Oligonucleotid, welches eine Spleißmatrizensequenz (mit einem Promotor) 5' zu einer Primersequenz an seinem 3'-Ende aufweist. Somit wirkt das Oligonucleotid als eine blockierte Spleißmatrize in den Schritten (1) und (7) und als ein Primer (und eine Spleißmatrize) in Schritt (4).
Die 2d zeigt eine Zielnucleinsäure (DNA), welche ein definiertes 5'-Ende und zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist, welche die einleitenden Komplexier-, Primerverlängerungs- und Abtrennschritte (Schritte 1 und 2) vollzieht, um ein komplementäres DNA-Ziel mit einem definierten 3-Terminus zu erzeugen. Das in den Schritten (1) und (7) verwendete Oligonucleotid ist ein Primer, welcher mit dem 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz der ursprünglichen Ziel-DNA (hier nominell (+)) komplexiert. Das andere Oligonucleotid (aus den Schritten (4) und (10)) umfasst eine unblockierte Spleißmatrize, welche mit dem 3'-Ende des Komplementes des ursprünglichen Ziels komplexiert.
Die 2e zeigt eine Zielnucleinsäure (DNA), welche einen definierten 5-Terminus und zusätzliche Sequenzen 3' zur Zielsequenz aufweist, welche die einleitenden Komplexier-, Verlängerungs- und Abtrennschritte (Schritte (1) und (2)) vollzieht, um ein komplementäres DNA-Ziel mit einem definierten 3'-Terminus zu erzeugen. Das in den Schritten (1) und (7) verwendete Oligonucleotid umfasst einen Primer, welcher mit dem 3'-tenninalen Abschnitt der Zielsequenz der ursprünglichen Ziel-DNA (hier nominell (+)) komplexiert. Das in den Schritten (4) und (10) verwendete Oligonucleotid umfasst eine blockierte Spleißmatrize, welche mit dem 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz des Komplements des ursprünglichen Ziels komplexiert.
Die Spleißmatrize wird mit dem 3'-Terminus der Zielnucleinsäure unter komplexbildenden Bedingungen komplexiert, so daß ein Ziel/Spleißmatrizen-Komplex gebildet wird und die DNA-Synthese initiiert werden kann (Schritt 1). Eine geeignete DNA- Polymerase wird zur Verlängerung des 3'-Terminus der Zielnucleinsäure eingesetzt, um eine zu der 5' zur komplexierenden Sequenz gelegenen Sequenz der Spleißmatrize komplementäre Sequenz anzufügen. Wenn der 3'-Terminus der Spleißmatrize nicht blockiert worden ist und genügend komplementär zur Zielnucleinsäure ist, kann die Spleißmatrize als ein Primer wirken, so daß der 3'-Terminus der Spleißmatrize ebenfalls verlängert werden kann (2a). Der resultierende Ziel/Spleißmatrizen-Komplex kann entweder teilweise oder vollständig doppelsträngig sein (siehe 2a im Vergleich zu 2b und 2c). Die doppelsträngige Region umfaßt im Minimum die Promotorsequenz und die primende Sequenz, welche mit der Zielnucleinsäure komplexiert hat.
Die Matrize aus Schritt 2 wird von einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert. Die RNA-Polymerase erzeugt etwa 5–1000 Kopien an RNA für jede Matrize. In den 2a bis 2c weist die hergestellte RNA nominell den "Plus-Sinn auf und schließt die Sequenz vom 3'-Ende des Promotors bis zum 5'-Ende der Zielnucleinsäure ein.
Das RNA-Produkt von Schritt 3 kann gemäß dem allgemeinen Verfahren verwendet werden, um die Zielsequenz autokatalytisch zu vervielfältigen, oder kann alternativ dazu unter komplexierenden und primenden Bedingungen mit einem Primer behandelt werden, welcher an seinem 3'-Terminus eine zum 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz in der RNA genügend komplementäre komplexierende Sequenz aufweist, um damit zu komplexieren, und gegebenenfalls andere Sequenzen 5' zur komplexierenden Sequenz einschließt. Der Primer wird unter Verwendung der RNA als einer Matrize durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase in einer Primerverlängerungsreaktion verlängert. Dies ergibt ein Produkt, das zumindest teilweise doppelsträngig ist und das zumindest teilweise einzelsträngig gemacht werden muss für eine weitere Synthese durch Abbau des RNA-Abschnitts, z. B. durch eine RNAse H (Schritt 5) oder durch irgendeine andere Methode, wie etwa der Denaturierung.
Die in Schritt 6 erzeugte DNA kann als ein Zielmolekül für Schritt 1 verwendet und wie obenstehend beschrieben mit einer Spleißmatrize behandelt werden, um mehr RNA und DNA herzustellen. Diese Schritte können zyklisch wiederholt werden, um jedes gewünschte Ausmaß an Vervielfältigung zu bewirken. Es sollte ebenfalls bemerkt werden, daß durch geeignete Wahl der Spleißmatrize und des(der) Primer dieses neue Zielmolekül (Schritt 6) unterschiedliche Termini besitzen kann als das Originalmolekül. Darüber hinaus kann, wenn das Primerverlängerungsprodukt von der RNA eine Promotorsequenz 5' zur komplexierenden Sequenz aufweist, ein zweiter Primer mit einer komplexierenden Sequenz vom "Plus-Sinn und gegebenenfalls anderen Sequenzen 5' zur komplexierenden Sequenz verwendet werden, um das verlängerte Primerprodukt zur Herstellung einer doppelsträngigen Matrize für eine RNA-Polymerase zu kopieren. Eine so hergestellte Matrize ermöglicht der RNA-Polymerase, "Minus"-Sinn-RNA herzustellen, welche unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens vervielfältigt werden kann oder unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren weiter vervielfältigt werden kann.
Einleitendes Verfahren II
Das einleitende Verfahren II unterscheidet sich von dem einleitenden Verfahren 1 hinsichtlich der Weise, auf welche die autokatalytische Spezies erzeugt wird. Die DNA-Zielnucleinsäure muß keinen definierten 3'-Terminus besitzen. Gemäß einem Aspekt wird ein Primer mit einer Promotorsequenz 5' zur komplexierenden Sequenz anstelle einer Spleißmatrize verwendet, um die Promotorsequenz in die Matrize für die RNA-Polymerase einzuführen. Der Primer besitzt eine zum 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz genügend komplementäre komplexierende Sequenz, um damit zu komplexieren, und 5' zu der komplexierenden Sequenz eine Sequenz, welche einen Promotor für eine RNA-Polymerase einschließt. Der Primer wird mittels einer DNA-Polymerase verlängert, um ein Primerverlängerungsprodukt zu erhalten.
Nach der Trennung der Stränge, gewöhnlich durch Hitzedenaturierung, wird ein zweites Oligonucleotid von gleichem Sinn wie das Zielmolekül als ein Primer verwendet, um ein DNA-Komplement zum ersten Primerverlängerungsprodukt zu synthetisieren. Der zweite Primer kann zusätzliche Sequenzen 5' zur komplexierenden Region aufweisen, welche einen Promotor einschließen können. Der Einschluß einer Promotorsequenz in den zweiten Primer kann die Vervielfältigung verbessern. Der zweite Primer kann auch eine Spleißmatrize sein.
Das einleitende Verfahren II wird weiter unter Bezug auf die 3 beschrieben. Die 3 zeigt eine Ziel-DNA, welche zusätzliche Sequenzen sowohl 5' als auch 3' zur Zielsequenz besitzt. Der erste Primer besitzt eine komplexierende Sequenz an seinem 3'-Terminus und eine Sequenz 5' zur komplexierenden Sequenz, welche eine Promotorsequenz einschließt und genügend mit dem Ziel hybridisiert, um eine Priming-Funktion auszuüben und die DNA-Synthese zu intiieren. Eine geeignete DNA-Polymerase verlängert den Primer, um ein Primerverlängerungsprodukt zu erhalten. Die Stränge werden durch Denaturierung oder auf anderem Wege getrennt, um ein einzelsträngiges, den Promotor enthaltendes Primerverlängerungsprodukt zu ergeben.
Ein zweiter Primer wird verwendet, welcher an seinem 3'-Terminus eine zum 3'-terminalen Abschnitt der Zielsequenz des ersten Primerverlängerungsprodukts genügend komplementäre komplexierende Sequenz und gegebenenfalls andere Sequenzen 5' zur komplexierenden Sequenz besitzt, welche eine Promotorsequenz einschließen können. Der zweite Primer wird ausreichend mit dem Primerverlängerungsprodukt von Schritt 3 komplexiert, um eine primende Funktion auszuüben und die DNA-Synthese zu initiieren. Die DNA-Polymerase verlängert den zweiten Primer, um ein zweites Primerverlängerungsprodukt zu erhalten. Das resultierende doppelsträngige DNA-Molekül kann nun als eine Matrize für die RNA-Polymerase dienen, um RNA-Transkripte für das allgemeine Verfahren zu erzeugen. Wie in der 3 gezeigt, sind die hergestellten RNA-Moleküle nominell vom "Plus-Sinn und können unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens der vorliegenden Erfindung vermehrt werden.
Wenn die komplexierende Sequenz des zweiten Primers komplementar zum 3'-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes aus Schritt 3 ist und der zweite Primer eine Promotorsequenz 5' zur komplexierenden Sequenz einschließt, kann der zweite Primer als eine Spleißmatrize dienen, so daß der 3'-Terminus des ersten Primerverlängerungsproduktes aus Schritt 3 weiter verlängert werden kann, um die Promotorsequenz anzufügen und eine Matrize für die RNA-Polymerase herzustellen, welche RNA-Transkripte von beiderlei Sinn herstellt. Die so hergestellten RNA-Moleküle können unter Anwendung des allgemeinen Verfahrens vervielfältigt werden.
Bei einer anderen Variation wirkt der zweite Primer als eine Spleißmatrize und besitzt einen Promotor 5' zur komplexierenden Sequenz, so daß der erste Primer keinen Promotor aufweisen muß. In diesem Fall wird das erste Primerverlängerungsprodukt aus Schritt 2 weiter verlängert, um ein Komplement zu der Promotorsequenz herzustellen, wodurch eine Matrize für die Herstellung von "Minus"-Sinn-RNA durch die RNA-Polymerase erzeugt wird.
Durch Wiederholen der obenstehend beschriebenen Schritte können zusätzliche RNA- und DNA-Kopien der Zielsequenz hergestellt werden.
Beispiele
Vorbemerkung
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der zuvor beschriebenen Verfahren, einschließlich der beanspruchten Methoden unter Verwendung einer blockierten Spleißmatrize.
Viele der in einem oder mehreren der Beispiele verwendeten Materialien sind gleich. Um die Beschreibungen in den Beispielen zu vereinfachen, werden einige der Materialien abgekürzt und hier beschrieben.
Die als "frag 1" bezeichnete Matrize ist ein doppelsträngiges Segment von DNA, welches homolog zu einer Region der DNA aus dem Hepatitis B-Genom ist. Es wurde mittels Restriktionsnucleasen-Verdau aus einem Plasmid heraugeschnitten und von der verbleibenden Nucleinsäure durch chromatographische Verfahren gereinigt. Anschließend an die Reinigung ist das Fragment mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten und über Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt worden, um das gewünschte Ziel zu erhalten.
Die als "M13L(–)" bezeichnete Matrize ist ein gereinigtes einzelsträngiges DNA-Ziel, das als kleinen Bruchteil der Gesamtsequenz die Minus-Strang-Zielsequenz enthält.
In den hier beschriebenen Beispielen wurden mehrere verschiedene Primer und Spleißmatrizen verwendet. Das als T7(pro)+ bezeichnete Oligonucleotid enthält nahe dem 5'-Terminus einen T7-RNA-Polymerasepromotor und nahe dem 3'-Terminus eine zum 3'-Terminus der Minus-Strang-Zielsequenz der zwei obenstehend beschriebenen Matrizen komplementäre Sequenz; T7pro(+) enthält auch andere Sequenzinformation zur Steigerung der Leistung. Die Sequenz für T7pro(+) ist 5'-AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GAGGT TATCG C*TGGA* TGTGT CTGCG GC*GT3.
Ein anderes zu T7pro(+) ähnliches Oligonucleotid ist ddT7pro(+). Es unterscheidet sich von T7pro(+) dadurch, daß der 3'-Terminus mit einem Didesoxynucleotid unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyltransferase verlängert worden ist. Im Unterschied zu T7pro(+) ist ddT7pro(+) nicht dazu fähig, als ein Primer für DNA-Synthese durch reverse Transkriptase zu dienen, kann aber als eine Spleißmatrize wirken.
HBV(–)Pr ist ein Primer, welcher an den Plus-Strang der frag 1-Matrize hybridisieren wird und homolog zu einer Sequenz innerhalb des M13L(–) ist. [HBV(–)Pr ist komplementär zu einer Sequenz 3' von der zu T7pro(+) homologen Plus-Strangsequenz.] Die Sequenz für HBV(–)Pr ist 5'-GAGGA CAAAC GGGCA ACATA CCTTG-3'.
Ein anderes Oligonucleotid mit einer Promotorregion ist T7pro(–). Dieser Promotor-Primer enthält eine zu T7pro(+) identische Sequenz, aber ersetzt die zum Minus-Ziel komplementäre Sequenz mit einer zum Plus-Ziel komplementären Sequenz. Der 3'-Terminus von T7pro(–) ist komplementär zum 3'-Terminus des Plus-Stranges von frag 1. Die Sequenz für T7pro(–) ist 5'-AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GATCC TGGAA TTAGA GGACA AACGG GC-3'. Wie ddT7pro(+) ist ddT7pro(–) ein 3'-blockiertes Oligonucleotid, welches durch Verlängern des 3'-Terminus mit einem Didesoxynucleotid unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyltransferase hergestellt wurde. Das ddT7pro(–) kann nicht als ein Primer dienen, aber ist ansonsten ähnlich zu T7pro(–).
Die in diesen Beispielen verwendeten Matrizen enthalten erhebliche Sequenz zwischen den zu den obenstehend beschriebenen Primern und Spleißmatrizen homolo gen oder komplementären Regionen. Da die Sequenz zwischen den Oligonucleotiden als ein Ergebnis der Erfindung vervielfältigt werden wird, stellt die Quantifizierung dieser Sequenz einen spezifischen Weg zur Messung der Vervielfältigung zur Verfügung. Es ist angemessen gewesen, die Produkte durch Hybridisierungstechniken unter Verwendung von für die zwischen den Oligonucleotidprimern und Spleißmatrizen codierten Sequenzen spezifischen DNA-Sonden zu assayen. In den nachfolgend vorgestellten Beispielen werden zwei Sonden verwendet: Sonde (+) und Sonde (–). Die Sonde (+) ist komplementär zu dem Minus-Sinn-Produkt und die Sonde (–) ist komplementär zu dem Plus-Sinn-Produkt. Die Sequenz für die Sonde (+) ist 5'-CCTCT TCATC CTGCT GCTAT GCCTC-3' und die Sequenz für die Sonde (–) ist 5'-GAGC ATAGC AGCAG GATGA AGAGG-3'. Die hier eingesetzten Sonden sind mit einer chemolumineszenten Markierung markiert worden. In dem Assay sendet die Markierung auf der hybridisierten Sonde Licht aus, welches in einem Luminometer gemessen wird.
In den folgenden Beispielen wurde die relative Vervielfältigung wie folgt gemessen. Eine Probe der Vervielfaltigungsreaktionsmischung (gewöhnlich 10 μl) wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, auf 50 μl verdünnt und zwei Minuten lang bei 95°C denaturiert. Nach Abkühlen auf Eis wurden 50 μl einer Sondenlösung mit etwa 75 fmol Sonde (+) oder Sonde (–), 0,2 M Lithiumsuccinat, pH 5,2, 21% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 2 mM EDTA und 2 mM EGTA zu der Probe zugegeben und vermischt. Die Reaktionen wurden dann 20 Minuten lang bei 60°C inkubiert und abgekühlt. Zu jeder Hybridisierungsreaktion wurden 500 μl einer Lösung zugegeben, welche durch Einstellen einer gesättigten Natriumboratlösung auf pH 8,5 mit Chlorwasserstoffsäure, dann Verdünnen, um die Borat-Endkonzentration auf 0,8 M zu bringen, und Zugeben von Triton^®X-100 auf letztlich 5% (v/v) hergestellt wurde. Die Reaktionen wurden danach gemischt und sechs Minuten lang bei 60°C inkubiert, um die chemilumineszente Markierung der nicht-hybridisierten Sonde zu zerstören. Dieses Verfahren zur Zerstörung der chemolumineszenten Markierung der nicht-hybridisierten Sonde ist ziemlich spezifisch; nur ein sehr kleiner Bruchteil der nicht-hybridisierten Sonde bleibt chemilumineszent. Die Reaktionen wurden abgekühlt und die verbleibende Chemilumineszenz wurde in einem Luminometer nach Zugeben von 200 μl an 1,5 M Natriumhydroxid, 0,1% (v/v) Wasserstoffperoxid, quantifiziert. In dem Assay emittiert die hybri disierte Sonde Licht, welches in einem Luminometer gemessen wird. Da die Reaktion, welche die chemilumineszente Markierung der nicht hybridisierten Sonde zerstört, nicht zu 100% wirksam ist, ist im allgemeinen ein Hintergrundswert des Signals im Bereich von 300 bis 1300 relativen Lichteinheiten (RLU) vorhanden.
Es sind ebenfalls viele andere Assayverfahren anwendbar, wobei Assays, welche Hybridisierung an mit Isotopen markierte Sonden verwenden, Blottingtechniken und Elektrophorese eingeschlossen sind.
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind reverse Transkriptase aus Geflügel-Myeloblastosis-Virus von Seikagaku America, Inc., T7-RNA-Polymerase von New England Biolabs oder Epicentre und reverse Transkriptase aus Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MMLV) und E. coli-RNAse H von Bethesda Research Laboratories. Andere Enzyme mit ähnlichen Aktivitäten und Enzyme von anderen Quellen können verwendet werden; und andere RNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Promotorspezifitäten können ebenfalls für den Einsatz geeignet sein.
Falls nicht anderweitig angegeben, bestanden die in den folgenden Beispielen verwendeten Reaktionsbedingungen in 40 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, 8 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidintrihydrochlorid, 1 mM rATP, 1 mM rCTP, 1 mM rGTP, 1 mM rUTP, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, jeweils 0,15 μM Primer oder Spleißmatrize, und die angegebenen Mengen an Matrize und Enzymen in Volumina von 100 μl.
Diese Reaktionsbedingungen sind nicht notwendigerweise optimiert, und sind für manche Systeme wie angegeben verändert worden. Die verwendeten Oligonucleotidsequenzen sind beispielhaft und nicht als einschränkend beabsichtigt, zumal andere Sequenzen für diese und andere Zielsequenzen verwendet worden sind.
Beispiel 1
Einleitendes Verfahren 1
Um zu demonstrieren, daß dieses System funktioniert hat, wurde jedes der obenste hend beschriebenen vier Promotor-enthaltenden Oligonucleotide jeweils in Reaktionen mit oder 4 fmol Ziel (frag 1) eingebracht. Die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei 95°C inkubiert, um das Ziel zu denaturieren, dann abgekühlt, um den Oligonucleotiden zu ermöglichen, sich an das Ziel anzulagern. Reverse Transkriptase, 13 Units, und T7-RNA-Polymerase, 100 Units, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Ein Zehntel der Reaktion wurde unter Verwendung des Hybridisierungsverfahrens geassayt. Die in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse (in relativen Lichteinheiten oder "RLU(s)' und fmol) zeigen, dass sowohl die blokkierten als auch die nicht blockierten Oligonucleotide als Spleißmatrizen zur Herstellung von Produkt dienen. Die bei Reaktionen ohne Ziel gemessenen Signale stellen typische Signalhintergrundswerte für diesen Typ von Assay dar.
Tabelle 1. Vergleich von Spleißmatrizen im einleitenden Verfahren 1
Beispiel 2
Zyklisches Wiederholen des einleitenden Verfahrens 1
Das Vervielfältigungssystem wurde mit ddT7pro(+) und T7pro(+) zyklisch durchge führt. In diesem Experiment wurden 4 amol frag 1, HBV(–)Pr und ddT7pro(+) oder T7pro(+) in Standardreaktionen vermischt und bei 95°C inkubiert. Nach Abkühlen wurden 13 Units reverse Transkriptase und 100 Units T7-RNA-Polymerase zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Ein Zehntel der Reaktion wurde für den Assay entnommen, und der Zyklus wurde mit dem Rest wiederholt. Nach dem Wiederholen des Zyklus für ein drittes Mal, wurden die 10 μl-Aliquots mittels des Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung von Sonde (–) geassayt. Die in der Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das Produkt durch zirkulierende Durchführung sowohl mit blockierten als auch nicht-blockierten Spleißmatrizen vervielfaltigt wird.
Tabelle 2. Zyklische Wiederholung des einleitenden Verfahrens 1
Beispiel 3
Empfindlichkeit des einleitenden Verfahrens 1
In diesem Beispiel wurden die nicht-blockierte Spleißmatrize, T7pro(+)' und der Primer, HBV(–)Pr, verwendet, um die Empfindlichkeit des Vervielfältigungsverfahrens zu testen. Sechs Zyklen des einleitenden Verfahrens 1 wurden wie im Beispiel 2 beschrieben bei abnehmenden Mengen von frag 1 durchgeführt. Nach der Vervielfältigung wurde das Produkt unter Verwendung des in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung beschriebenen Hybridisierungsverfahrens geassayt. Unter Verwendung dieses Verfahrens konnten 4 × 10^–21 Mol frag 1 nachgewiesen werden (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3. Empfindlichkeit des einleitenden Verfahrens 1 bei Verwendung von 6 Zyklen
Beispiel 4
Vervielfältigung unter Einschluß des einleitenden Verfahrens 1
In dem folgenden Beispiel war das zu vervielfältigende Ziel frag 1. Im ersten Satz von Reaktionen wurden verschiedene Kombinationen von Ziel und Spleißmatrizen bei 95°C zwei Minuten lang inkubiert und danach abgekühlt, bevor 13 Units reverse Transkriptase und 100 Units T7-RNA-Polymerase zugegeben wurden. Die Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert, danach wurden 5 μl-Aliquots der Reaktionen mit beiden Sonden geassayt, um die Produkte zu quantifizieren. Anschließend an diesen Assay wurden Reaktionen unter Verwendung von 5 μl der Reaktionen 1 und 2 und der T7pro(–)-Spleißmatrize zubereitet. Die Mischungen wurden 2 Minuten lang bei 95°C inkubiert, danach abgekühlt, bevor 13 Units reverse Transkriptase und 100 Units T7-RNA-Polymerase zugegeben wurden. Die neuen Reaktionen wurden dann gemischt und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Aliquots von 10 μl wurden zu den nachfolgend in der Tabelle 4 angegebenen Zeitpunkten in ein Eisbad überführt. Die Produkte wurden unter Verwendung des vorhergehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren geassayt. Die Daten zeigen, daß beide Spleißmatrizen die Herstellung von RNA von frag 1 ermöglichen. Die Daten zeigen ebenfalls, daß signifikant mehr Minus- und Plus-Sinn-Produkte in den Reaktionen hergestellt werden, welche RNA und die zu dieser RNA komplementäre Spleißmatrize enthalten. Und schließlich zeigen die Reaktionskinetiken für die Reaktion 1B eine geome trische Zunahme des Produkts, wohingegen die Kinetiken für die Reaktion 2B von einer mehr linearen Form sind. Dieser Unterschied zeigt, daß das Produkt in der Reaktion 1B als Substrat für die Herstellung von mehr Produkt dient; somit ist die Reaktion autokatalytisch.
Tabelle 4. Einleitendes Verfahren 1
Beispiel 5
Reaktionskinetiken für die Vervielfältigung unter Einschluß des einleitenden Verfahrens 1
Das folgende Beispiel demonstriert weiter das Potential dieser Ausführungsform der Verfahren der Erfindung. Eine kleine Menge an frag 1 (10 amol) wurde in Reaktionen mit verschiedenen Kombinationen von T7pro(+), T7pro(–) und HBV(–)Pr eingesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden zwei Minuten lang bei 95°C inkubiert, um das DNA-Ziel zu denaturieren, und abgekuhlt, bevor reverse Transkriptase und T7-RNA-Polymerase zugegeben wurden. Nach dem Vermischen wurden die Reaktionen 30 min lang bei 37°C inkubiert. Fühnfzehn Mikroliter große Aliquots wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entfernt und bei 0°C aufbewahrt, bis sie geassayt wurden. Der Hybridisierungsassay wurde angewandt, um die Produkte der Reaktionen zu quantifizieren. Die in der Tabelle 5 dargestellten Daten zeigen, daß die Erfindung eine Spleißmatrize und einen Primer benötigt. Eine zweite Spleißmatrize ist jedoch vorteilhaft. Die Ergebnisse mit nur einem Primer oder nur einer Spleißmatrize lagen unterhalb der Nachweisgrenzen des Assays. Wie in dem vorhergehenden Beispiel sind die Reaktionskinetiken geometrisch, was ein autokatalytisches System anzeigt.
Tabelle 5. Einleitendes Verfahren II, Reaktionskinetiken
Unsere anschließende Arbeit hat eine über 5,0 Stunden lange kontinuierliche Produktsynthese aufgezeigt, was wesentlich besser ist als bei Verfahren nach dem Stand der Technik. Wir haben auch eine gesteigerte Empfindlichkeit gezeigt.
Beispiel 6
Vervielfältigung unter Einschluß des einleitenden Verfahrens II
In diesem Beispiel wurden verschiedene Kombinationen von Primern verwendet, um 500 amol eines DNA-Ziels ohne definierte Termini zu vervielfältigen. Das Ziel war das obenstehend erwähnte M13L(–). Nach Zubereitung der Reaktion wurden die Proben zwei Minuten lang bei 95°C inkubiert, danach abgekühlt, bevor 13 Units reverse Transkriptase zugegeben wurden. Die Reaktionen wurden dann zwölf Minuten lang bei 42°C inkubiert. Als nächstes wurden die Reaktionen wieder zwei Minuten lang auf 95°C erwärmt und abgekühlt. Reverse Transkriptase und T7-RNA-Polymerase wurden zugegeben und die Reaktionen wurden zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zehn Mikroliter große Aliquots der Reaktion wurden sowohl mit Sonde(+) als auch mit Sonde(–) geassayt. Die in der Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die Synthese von großen Mengen an Nucleinsäure nur stattfindet, wenn zwei Primer verwendet werden. Sie zeigen auch den Vorteil von zwei Promotor-Primern gegenüber einem Promotor-Primer und einem Primer. Die geringwertige Synthese in den Reaktionen 4 und 5 entsprechen der Synthese von etwa einer Kopie an DNA von der ursprunglichen Matrize. Das System verwendet einen anfänglichen 95°C-Denaturierungsschritt, welcher dazu dienen kann, doppelsträngige Ziele oder doppelsträngige Regionen eines einzelsträngigen Ziels zu denaturieren, als auch unerwünschte Nuclease- und Proteaseaktivitäten zu inaktivieren.
Tabelle 6. Einleitendes Verfahren II-System
Beispiel 7
Wirkung von RNAse H
Um zu zeigen, daß die Zugabe von exogener RNAse H die Vervielfältigung in den durch die vorliegende Erfindung beschriebenen autokatalytischen Systemen verbessert sein kann, wurden mehrere Reaktionen unter Verwendung verschiedener Mengen an Ziel, M13L(–) und entweder 0 oder 2 Units an exogener RNAse H präpariert. Die verwendete exogene RNAse H stammte von E. coli. Alle Reaktionen wurden mit T7pro(+) und T7pro(–) präpariert. Die Reaktionen wurden der Denaturierung bei 95°C unterzogen und vor Zugabe von reverser Transkriptase abgekühlt. Nach einer 12-minütigen Inkubation bei 42°C wurden die Reaktionen wiederum bei 95°C denaturiert. Nach dem Abkühlen wurde reverse Transkriptase, T7 RNA-Polymerase und, sofern angegeben (siehe Tabelle 7), RNAse H zugegeben und die Reaktionen 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Aliquots von 10 μl wurden aus jeder Reaktion in stündlichen Intervallen zur Untersuchung mittels der Hybridisierungsmethode entnommen. Die Daten in Tabelle 7 zeigen, daß exogene RNAse H die Reaktionskinetiken signifikant steigert und die Empfindichkeit der Erfindung erhöht. Signale von weniger als 600 RLUs wurden als typische Hintergrundwerte interpretiert.
Tabelle 7. Wirkung von exogener RNAse H auf die Vervielfältigung, einschließlich der Empfindlichkeit des einleitenden Verfahrens II
Beispiel 8
Wirkung von exogener DNA
Es wurde gezeigt, daß die Zugabe von exogener DNA dieses autokatalytische Vervielfältigungssystem wesentlich hemmen kann. Um weiter den Nutzen von endogener RNAse H nachzuweisen, wurden Vervielfältigungsreaktionen mit oder ohne 2 μg Kälberthymus-DNA zum Nachweis dieser Hemmung präpariert. In Reaktionen mit der Kälberthymus-DNA wurden 2 Konzentrationen der reversen Transkriptase verwendet, um zu testen, ob zusätzliche AMV RNAse H die Hemmung überwinden könnte. Auch wurde RNAse H von E. coli einigen der Reaktionen aus denselben Grün-den zugegeben. Die Reaktionen weichen von den Standardreaktionen darin ab, daß die Konzentration für jedes der Ribonucleotide auf 2,5 mM erhöht war und die Konzentration an Magnesiumchlorid auf 12,8 mM erhöht war. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 100 amol an M13L(–) als einem Ziel und T7pro(+) und T7pro(–) präpariert. Nach 2-minütigem Denaturieren bei 95°C wurden die Reaktionen abgekühlt und 13 oder 39 Units der reversen Transkriptase zugegeben, und die Reaktionen wurden 12 Min. lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden nochmals bei 95°C denaturiert und vor Zugabe von 13 oder 39 Units an reverser Transkriptase, 100 oder 300 Units an T7 RNA-Polymerase, und entweder 0 oder 2 Units von E. coli-RNAse H abgekühlt. Nach 1-stündigem Inkubieren bei 37°C wurden 10 μl jeder Reaktion unter Anwendung des Hybridisierungsassays untersucht. Die in Tabelle 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Kälberthymus-DNA die Reaktion um 90% hemmte, im Vergleich zu einem Reaktionssystem ohne exogener DNA, und daß zusätzliche reverse Transkriptase (und ihre assoziierte RNAse H) die Produktvervielfältigung nicht wesentlich beeinflusste. Die Zugabe von mehr T7 RNA-Polymerase zeigte eine signifikante Wirkung auf die Produktausbeute, doch war relativ zur Zunahme aufgrund der Zugabe von exogener RNAse H gering. Nicht nur war die Hemmung ausgeschaltet, sondern die Vervielfältigung war auch über 5-fach erhöht, relativ zur Reaktion ohne die Kälberthymus-DNA und E. coli-RNAse H. Die mit der höheren Menge an E. coli-RNAse H beobachteten Signale waren für die Menge an Sonde, die im Hybridisierungsassay verwendet wurde, sättigend. Um diese Proben exakt zu quantifizieren, wäre eine Verdünnung des vervielfältigten Produkts vor der Untersuchung erforderlich.
Tabelle 8. Wirkung von RNAse H auf die Vervielfältigung, Hemmung durch exogener DNA
Beispiel 9
Vervielfältigung durch das allgemeine Verfahren
Dieses System erfordert keine anfängliche Transkription und Denaturierung; ein DNA-Komplement des RNA-Ziels wird hergestellt, und das ursprüngliche Ziel wird durch die RNAse H entfernt. Die DNA kann sich dann an einen zweiten Primer oder Promotor-Primer und durch DNA-Synthese eine Matrize für die RNA-Polymerase herstellen. Ist die RNAse H nicht aktiv, so wird der zunächst erzeugte DNA:RNA-Hybrid die Reaktion beendigen und, ohne eine Matrize für die RNA-Polymerase erzeugt zu haben. Bei einem Versuch, das Verfahren dieser Erfindung zu demonstrieren, wurde ein Plasmid mit einem RNA-Polymerase-Promotor und der Zielnucleinsäure verwendet, um große Mengen von einzelsträngigen RNA-Transkripten mit der Zielsequenz innerhalb anderer Sequenzen herzustellen. Es wurden auch zwei ähnliche Reaktionen präpariert: eine mit dem Plasmid ohne die RNA-Polymerase und die andere mit der RNA-Polymerase ohne das Plasmid. Verdünnungen von jeder dieser Reaktionen wurden geassayt, um die Produkte zu quantifizieren. Äquivalente Ver dünnungen von allen drei Reaktionen wurden verwendet, um Vervielfältigungsreaktionen zu präparieren, welche die zwei Promotor-Primer T7pro(+) und T7pro(–) enthielten. Die Reaktion 1 aus Tabelle 9 enthielt 60 amol RNA und 0,6 amol des Ausgangsplasmids. Die Reaktion 2 enthielt 0,6 amol Ausgangsplasmid, aber keine RNA. Die Reaktion 3 enthielt kein Ziel. Die Reaktionen wurden nicht bei 95°C denaturiert, stattdessen wurden reverse Transkriptase und T7 RNA-Polymerase zugegeben, und die Reaktion wurde 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Aliquots wurden stündlich für den späteren Assay durch das Hybridisierungsverfahren entnommen. Wie in der Tabelle 9 gezeigt, ergaben Reaktionen mit dem Plasmid und der von dem Plasmid hergestellten RNA große Hybridisierungssignale; die Reaktion mit dem Plasmid allein erzeugte in signifikantem Ausmaß Produkt, da die T7 RNA-Polymerase RNA von dem Plasmid herstellen konnte, welche dann gemäß dem allgemeinen Verfahren verwendet werden konnte, um mehr Nucleinsäure von beiderlei Sinn herzustellen; und schließlich stellte die Kontrolle (Reaktion 3), die kein Ziel enthielt, nichts her. Tabelle 9. Einleitendes Verfahren IV, Reaktionskinetiken

Reaktion 1: Plasmid plus RNA.
Reaktion 2: Plasmid.
Reaktion 3: kein Ziel.

Beispiel 10
Vervielfältigung durch das allgemeine Verfahren
Das folgende Experiment wurde zur Bestimmung dessen vorgenommen, ob andere Verfahren der Initiation bei der Erfindung möglich wären, die das Erfordernis der ersten Primerverlängerung und des Denaturierungsschritts für die DNA-Ziele ohne definierte Termini erleichtern könnten. Bei diesem Experiment werden die angegebenen Mengen an Ziel mit oder ohne den ersten Schritt mit reverser Transkriptase verviel fältigt, wie in Tabelle 10 angegeben. Die Vervielfältigungsdauer, sobald alle Enzyme zugegeben waren, betrug 4 Stunden. Das verwendete Ziel war M13(+), verdünnt in normaler Salzlösung. T7pro(+) und T7pro(–) wurden verwendet. 20 μl jeder Verdünnung wurden 25 μl an 0,1 N KOH zugegeben. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 98°C inkubiert und dann abgekühlt. Jede Probe wurde auf 100 μl und Endkonzentrationen von 50 mM Trizma-Base, 40 mM Glutaminsäure, 25 mM Kaliumhydroxid, 12,8 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidintrihydrochlorid, 2,5 mM jedes Ribonucleotidtriphoshats, 0,2 mM jedes Deoxyribonucleotidtriphosphats und 0,15 μM jedes Primers gebracht. Den Standardprotokoll-Röhrchen wurden 13 U reverse Transkriptase zugegeben, und die Reaktion wurden 12 Minuten lang bei 42°C, dann 2 Minuten lang bei 95°C, inkubiert und abgekühlt. Dann wurde allen Röhrchen 13 U reverse Transkriptase, 100 U T7 RNA-Polymerase und 0,5 U RNAse H zugegeben. Die Reaktionen wurden dann 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und 10 μl-Aliquots wurden unter Anwendung des chemilumineszenten Sondenassays untersucht. Die in Tabelle 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß eine gewisse Vervielfältigung unter Verwendung des abgekürzten Protokolls erkennbar war. Obschon die Menge an beobachteter Vervielfältigung signifikant geringer war als die beim Standardprotokoll, so kann dies weiterentwickelt werden, um ebenso wirksam zu sein, oder kann in Fällen nützlich sein, bei denen beträchtliche Mengen an Zielnucleinsäure vorhanden sind.
Tabelle 10. Vervielfältigung ohne vorherige Primerverlängerung
Die wahrscheinliche Erklärung für diese Daten ist die, daß T7 RNA-Polymerase nicht völlig spezifisch ist. Es gibt einen geringen Grad an willkürlicher RNA-Synthese, die kleine Anzahlen an RNA-Kopien der Zielregionen erzeugt. Diese Kopien werden über das standardmäßige Verfahren vervielfältigt.
Unsere anfängliche Arbeit demonstrierte eine hervorragende Vervielfältigung mit bestimmten Primersätzen und Zielen ohne Zugabe von exogener RNAse H. In unserer weiteren Arbeit hat die Aufklärung des Mechanismus der Reaktion es möglich gemacht, das Verfahren effektiv auf eine breitere Auswahl von Zielen anzuwenden. Wir beschreiben und beanspruchen hierin Verfahren, die sowohl exogene RNAse H verwenden als auch auf der mit reverser Transkriptase assoziierten RNAse H-Aktivität beruhen.
Wir haben herausgefunden, daß E. coli-RNAse nicht routinemäßig zugegeben werden sollte, da sie die Vervielfältigung nicht immer verbessert. Wir haben bestimmt, daß manche Formen von RNAse H sequenzspezifisch in Bezug darauf sind, wo sie die RNA von RNA:DNA-Hybriden schneiden. Bei der Vervielfältigungsreaktion haben wir den Promotor-enthaltenden Primer in Vollängen-Produkt-DNA nicht nachgewiesen. In Ausführungsformen, welche zwei Promotor-Primer anwenden, wird lediglich einer der Promotor-Primer nachweisbar in Vollängen-Produkt-DNA eingebaut. Alle anderen Mechanismen, die von Fachleuten des Gebiets postuliert worden sind, zeigen eine Vollängen-Produkt-DNA, die beide Primer enthält. Wir schreiben diese Feststellungen der Wahrscheinlichkeit zu, daß RNAse H die während der Vervielfältigung synthetisierten Haupt-RNA-Spezies nicht vollständig abbaut. Basierend auf diesen Befunden wird hier ein neuartiger Vervielfältigungsmechanismus dargestellt, der unsere Befunde bezüglich der RNAse H-Sequenzspezifität einbezieht. Neue und nützliche Entwurfskriterien für Promotor-Primer werden beschrieben. Weiterhin beanspruchen wir hier neuartige Verfahren zum Synthetisieren von mehrfachen Kopien einer Zielnucleinsäuresequenz, welche umfasst:

1) Auswählen eines Primers, der zu einem Abschnitt der RNA-Zielsequenz komplementär ist, welcher mit dem Abschnitt des RNA-Ziels komplexiert, welcher Ab schnitt des Ziels so lokalisiert ist, daß er zum Bilden eines Primerverlängerungsprodukts in der Lage bleibt, nachdem er einem Abbau durch eine ausgewählte RNAse H ausgesetzt wurde;
2) Auswählen eines Promotor-Primers, der zu einem Abschnitt der DNA, die durch Verlängerung des Primers zu erhalten ist, komplementär ist, welcher mit der DNA in einem Bereich komplexiert, wo im wesentlichen die ganze komplementäre RNA aus dem Doppelstrang durch den Abbau der RNAse H entfernt ist; und
3) Kombinieren des RNA-Ziels mit dem Primer, Promotor-Primer, RNAse H, reverse Transkriptase und Transkriptase, und Bilden mehrfacher Kopien der RNA und mehrfache Kopien der zu der RNA komplementären DNA. Die hierin beschriebenen neuartigen Verfahren stellen nicht eine im wesentlichen äquivalente Kopienzahl von DNA der gleichen Polarität (oder „Sinn") wie die RNA-Zielsequenz her.

Diese Vorgehensweise liefert ein Verfahren, welches den Entwurf effizienter Promotor-Primer und Primer für neue Zielstellen erlaubt. Wir beschreiben und beanspruchen hierin solche Promotor-Primer und Primer-Kombinationen und Entwurfkriterien für dieselben. Der hierin beschriebene Mechanismus beinhaltet ein neuartiges Reaktionsintermediat für die Transkription der RNA-Stränge. Dieses Intermediat ist ein doppelsträngiger Komplex aus RNA und DNA, welcher eine doppelsträngige DNA-Promotorregion enthält. Nichts derartiges ist nach unserer Kenntnis bisher in der Literatur beschrieben worden. Tatsächlich ist bei keinem der Systeme nach dem Stand der Technik, insbesondere weder bei Guatell, J. C. et al., 87 PNAS 1874–1878 (1990), nocht in der PCT-Anm. der lauf. Nr. 88/10315 an Gingeras, T. R. et al., die geeignete Auswahl der Primer und Promotor-Primersequenz auf der Grundlage der Lokalisation der RNAse H-Abbaustellen beschrieben. Daher sind die hierin beschriebenen Verfahren neuartig und aus keinem der bisher beschriebenen erkennbar.
Die Erkennung der Bedeutung der RNAse H-Sequenzspezifität und ein Verständnis des Reaktionsmechanismus sind der Schlüssel für die effiziente Anwendung dieses Ziel-Vervielfältigungsverfahrens auf eine breite Auswahl von Zielsequenzen. Darüber hinaus gingen die Fachleute bisher davon aus, daß RNAse H den RNA-Strang eines RNA:DNA-Komplexes vollständig und systematisch abbauen würde.
I. Der Mechanismus der Vervielfältigungsverfahren
Das Testen der Vervielfältigungseffizienz mit Verfahren nach dem Stand der Technik enthüllte ein großes Maß an Variabilität in der Vervielfältigungseffizienz bei kleinen Veränderungen in den verwendeten Primersätzen. Die im Stand der Technik allgemein angenommen Reaktionsverfahren stellten unserer Ansicht nach keine vernünftige Erklärung zur Verfügung, warum ein Primersatz so viel besser funktionierte als ein anderer.
Versuche, die Vervielfältigung unter Verwendung von Verfahren nach den Stand der Technik zu verbessern, ergaben keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Die Effizienz des Primings wurde untersucht, um zu ersehen, ob Unterschiede in der Fähigkeit, DNA-Ketten zu initiieren, für die beobachteten Unterschiede in der Wirksamkeit der Primersätze verantwortlich waren. Es konnte keine Korrelation zwischen der Primingwirksamkeit und der Gesamt-Vervielfältigung gefunden werden. Die Analyse von Primersätzen hinsichtlich der Fähigkeit, selbst-komplementäre Strukturen und kreuzkomplementäre Strukturen zu bilden, zeigte, daß Unterschiede in der Primerwirksamkeit auch nicht lediglich diesen Faktoren zuzuschreiben waren.
Wir haben ebenfalls festgestellt, daß die Zugabe von E. coli-RNAse H nicht gleichmäßig die Vervielfältigung verbesserte. Wie die hier angegebenen Daten zeigen, variierten die erhaltenen Ergebnisse von Ziel zu Ziel und von Primersatz zu Primersatz. Die Menge der zugegebenen E. coli-RNAse H ist auch sehr bedeutsam und muß innerhalb eines eng definierten Bereichs liegen. Bei einem gegebenen Ziel und Primersatz ist die Zugabe von E. coli-RNAse H in manchen Fällen hilfreich, wenn die reverse Transkriptase diejenige aus Geflügel-Myeloblastosis-Virus ("AMV") ist, aber nicht, wenn die reverse Transkriptase diejenige aus Moloney-Maus-Leukämie-Virus ("MMLV') ist. Daten, welche diese Schlußfolgerungen veranschaulichen, werden hierin zur Verfügung gestellt.
Frühere Arbeiten legen nahe, daß AMV-reverse Transkriptase relativ große Fragmente übrig läßt, wenn sie die RNA von einem während der Virusreplikation gebilde ten RNA:DNA-Hybrid verdaut. Diese Fragmente dienen als Primer, um die Synthese des zweiten DNA-Stranges zu intiieren. Wir berichten hier über unsere Feststellungen, daß es Beweise für die Sequenzspezifität der AMV- und MMLV-RNAse H-Aktivitäten gibt.
Um den Mechanismus der Reaktion aufzuklären, wurden individuelle Primer terminal mit ³²P markiert, und der Einbau von jedem Primer in DNA-Produkte wurde mittels Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht. Nach dem allgemein angenommen Mechanismus des Stands der Technik würden beide Primer in Vollängen-DNA-Produkte eingebaut werden. Unsere Experimente zeigten allerdings, daß nur der zu der während der Vervielfältigung synthetisierten hauptsächlichen RNA-Spezies komplementäre Primer in das Vollängen-Produkt eingebaut wurde. Der Primer mit derselben Polarität wie der hauptsächliche RNA-Strang wurde nie in Vollängen-DNA-Produkt nachgewiesen. Tatsächlich blieb er ziemlich klein. Diese Ergebnisse wurden mit einer Anzahl von verschiedenen Zielen und Primersätzen bestätigt.
Der Fehlschlag, die Verlängerung eines der Primer nachzuweisen, zeigte, daß sich während der Vervielfältigung ein vollständig doppelsträngiges DNA-Intermediat nicht anhäufte und für die autokatalytische Vervielfältigung nicht erforderlich war. Diese Beobachtungen zeigen einen Mechanismus für die Vervielfältigungssysteme dieser Erfindung, welcher mögliche Sequenzspezifitäten der RNAse H in Betracht zieht. Der Mechanismus ist im allgemeinen in der 4 abgebildet.
Experimente haben gezeigt, daß das Enzym die RNA eines RNA:DNA-Hybrides in spezifische Stücke schneidet. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß sich die Lagen der Schnittstellen in spezifischen Regionen befinden. Um den Mechanismus zu bestätigen, wurde ein RNA:DNA-Hybrid hergestellt, welches die Plus-Strang-RNA enthält, die von unserer Kombination aus T7pro+/T7pro^–-Ziel und Primersatz erzeugt werden würde. Die ³²P-markierte RNA wurde an komplementäre DNA hybridisiert, mit AMV-reverser Transkriptase (mit ihrer assoziierten RNAse H-Aktivität) inkubiert, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (5). Die Fragmentgröße zeigte, daß mehrere kleine Stücke erzeugt wurden und daß diese durch Schnitte nahe einem oder beiden Enden hergestellt wurden. Die innere Region des Moleküls wurde nicht geschnitten. Dieses Experiment zeigt, daß das Enzym unter den verwendeten Reaktions bedingungen Sequenz- oder Strukturspezifität besitzt. Die Ergebnisse waren vollständig konsistent mit dem Reaktionsmechanismus von 4.
Es wurden weitere Experimente durchgeführt, um zu ermitteln, wo die Schnittstellen auftraten. Es wird bevorzugt, daß mehrere Schnittstellen in der zu dem Promotor-enthaltenden Primer homologen Region und nicht in der den anderen Primer bindenden Region auftreten. Durch individuelles Markieren der Termini der RNA und Analysieren der Produkte des Verdaus wurde festgestellt, daß unter den verwendeten Bedingungen die Schnitte nur am 5'-Ende der RNA nachgewiesen wurden. Dies ist konsistent mit dem Mechanismus aus 4.
Sequenzierungsexperimente wurden durchgeführt, um die Sequenzen zu bestimmen, an welchen die RNAse H-Aktivitäten von AMV- und MMLV-reverser Transkriptase schneiden. Es wurden Sequenzen identifiziert, die spezifisch von jedem Enzym geschnitten wurden. Wie vorhergesagt, sind die Sequenzspezifitäten der zwei Enzyme unterschiedlich und davon wird angenommen, zu erklären, warum manche Primersätze mit dem einen Enzym besser arbeiten und manche mit dem anderen. Die für das MMLV-Enzym unter unseren Reaktionsbedingungen erhaltenen Sequenzspezifitäten entsprechen nicht denjenigen, über welche in der Literatur unter einem anderen Satz von Reaktionsbedingungen berichtet wurde, was zeigt, daß die Spezifität durch die Reaktionsbedingungen beeinflußt werden kann.
Die genaue Prüfung der Rolle der RNAse H in dem Vervielfältigungsmechanismus hat zu unserer Feststellung geführt, daß die vollständige Entfernung des Promotorgesteuerten Transkriptes von seiner cDNA-Kopie nicht notwendig oder nicht einmal wünschenswert für die Bildung einer neuen transkriptionell aktiven Matrize sein muß. Somit wird bei manchen Anwendungen selbst ein sehr niedriger Spiegel an RNAse H-Aktivität, stammend von der der reversen Transkriptase innewohnenden RNAse H, für eine wirksame Vervielfältigung ausreichend sein, wenn die RNAse H stellenselektiver beim Ermöglichen der Anlagerung des Promotor-Primers an das Erststrang-cDNA-Produkt ist, oder wenn sie die Anlagerung des anderen Primers an das Tran skript weniger stört.
Da E. coli-RNAse_H nach Berichten weniger spezifisch ist als die retroviralen Enzyme, kann sie in der Region schneiden, an welche der den Promotor nicht enthaltende Primer bindet, insbesondere wenn die Konzentrationen dieses Primers, des Ziels, der E. coli-RNAse H und der Bestandteile, welche die Enzymaktivität beeinflußen, nicht sorgfältig ausgeglichen werden. Nach unserer Ansicht veranlassen diese Ergebnisse dazu, die Verwendung von E. coli-RNAse H in kommerziellen Anwendungen nicht zu bevorzugen. Die Zugabe einer anderen RNAse H-Aktivität, einer mit verschiedenen Spezifitaten, kann in den Fällen nützlich sein, in denen die reverse Transkriptase-RNAse H nicht in den gewünschten Regionen schneidet oder nicht unter angemessenen Bedingungen schneidet. Die Arbeit mit MMLV-reverser Transkriptase zum Beispiel hat gezeigt, daß dieses Enzym gegenüber Inhibition durch Proben-DNA weniger empfindlich ist als das AMV-Enzym. Es ist für viele Systeme die beste Vorgehensweise.
Es wurden neue Primersätze entworfen, und diese sind hierin basiernd auf dem Modell und der RNAse H-Sequenzspezifitätsinformation, welche wir bis heute erhalten haben, dargestellt. Eine bedeutend bessere Synthese wurde mit diesen Primersätzen erhalten als sie mit denjenigen erhalten wurde, welche zuvor ohne die Kenntnis des Mechanismus und der Sequenzspezifitäten, entworfen wurden. Die hier beschriebene Erfindung macht den Entwurf von funktionellen Primersätzen für spezifische Zielregionen möglich.
Der neue Mechanismus, den wir entdeckt haben, beinhaltet ein neues Reaktionsintermediat für die Transkription von RNA-Strängen. Dieses Intermediat ist ein doppelsträngiger Komplex aus RNA und DNA, welcher auch eine doppelsträngige DNA-Promotorregion enthält. Nach unserer Kenntnis ist die Reaktion aufzeigbar unterschiedlich von jeglicher zuvor offenbarten.
Ein Verständnis des Reaktionsmechanismus ist für die Verwendung dieser Ziel-Vervielfältigungsverfahren ausschlaggebend. Das Erkennen der Bedeutung der RNAse H-Sequenzspezifität ist der Schlüssel für die effiziente Anwendung dieses Ziel-Vervielfältigungsverfahrens auf eine breite Auswahl von Zielsequenzen. Andererseits ist das empirische Vorgehen zum Promotor-Primer-Entwurf sehr aufwendig, kostspielig und weist eine geringe Erfolgsfrequenz auf, was diese Erfindung zu einem nützlichen Fortschritt auf dem Fachgebiet macht.
A. Enger Bereich der Aktivität für RNAse H-Konzentration
Das Vervielfältigungssystem mit E. coli-RNAse H wurde anfänglich als die bevorzugte Ausführungsform angesehen, weil eine größere Synthese mit dem jeweiligen untersuchten Ziel und Primersatz erzielt wurde und festgestellt wurde, daß die E. coli-RNAse H brauchbar ist, dabei zu helfen, die Inhibition durch Proben-DNA zu überwinden. Die Analyse der Reaktion zeigt jedoch, daß die Zugabe von E. coli-RNAse H der Vervielfältigung in vielen Fällen abträglich ist. Darüber hinaus müssen die zugegebenen Mengen von E. coli-RNAse H sorgfältig über einen engen Bereich kontrolliert werden, da die Gegenwart von zuviel oder zu wenig davon schädlich ist. Für die praktische kommerzielle Anwendung des Verfahrens ist dies ein bedeutender Nachteil, insbesondere da das Enzym bei Lagerung nicht vollständig stabil sein kann. Zusätzlich fügt die Verwendung von E. coli-RNAse H dem System bedeutende Kosten und Komplexität hinzu. Der Kostenaufwand kann für viele handelsübliche Anwendungen hinderlich sein. Die Verwendung von E. coli-RNAse H macht den Assay komplexer, was wiederum die Forschungs- und Entwicklungskosten steigert und den Assay zu schwierig für die breite kommerzielle Anwendung machen kann. Somit hat unsere Aufklärung des Assay-Mechanismus zu Verfahren für einen breit anwendbaren Assay, sowohl hinsichtlich technischer Durchführbarkeit (Anwendbarkeit auf Zielstellen) als auch dahingehend, ein kostengünstigeres und robusteres Verfahren zu sein, geführt.
Beispiel 11
Optimierung der E. coli-RNAse H-Konzentration
Experimente wurden durchgeführt, um die Menge an E. coli-RNAse H zu bestimmen, die für eine optimale Vervielfältigung in Serum erforderlich ist. Im folgenden Experiment wurde diese Vervielfältigung mit dem T7pro(+)/T7pro(–)-Primerpaar in Gegenwart von 0, 0,25, 0,5 und 1 U RNAse H pro Assay verglichen. HBV + Plasma, die zu den in HBV-Humanserum oder HBV-Serum allein gezeigten Mengen verdünnt wurden, wurden getestet.
Zehn μl Serum wurden einem gleichen Volumen an 0,1 N KOH zugegeben und mit einer Schicht Öl bedeckt, um die Verdampfung zu verhindern. Die Proben wurden gemischt, bei 95°C erhitzt, und durften sich dann auf Raumtemperatur abkühlen. Die Proben wurden auf ein Reaktionsvolumen von 90 μl mit einer Endkonzentration von 50 mM Trisacetat, pH 7,6, 20,8 mM MgCl₂, 5 mM Dithiotheritol, 2 mM Spermidinhydrochlorid, 0,15 μM jedes Primers, 6,25 mM GTP, 6,25 mMATP, 2,5 mM UTP, 2,5 mM CTP, 0,2 mM jeweils von dTTP, dATP, dGTP, dCTP und 13 U an AMV-reverser Transkriptase gebracht. Die Proben wurden gemischt und bei 37°C für 12 Minuten erhitzt, dann auf 95°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. 13 Units an RT und 100 U an T7 RNA-Polymerase wurden zugegeben und die Reaktionen 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. 25 μl jeder Reaktion wurden untersucht.
Die Daten zeigen, daß es einen engen Optimalbereich der Konzentration von E. coli-RNAse H gibt, der sich um 0,25 U E. coli-RNAse H pro Reaktion bei diesem System zentriert. Obschon E. coli-RNAse H schwer verwendbar ist, erwies sich etwas dazuaddierte RNAse H-Aktivität bei diesem Experiment als vorteilhaft.
Tabelle 11
Beispiel 12
Als nächstes wurde die Menge an E. coli-RNAse H, die zur optimalen Vervielfältigung eines HIV-Primerpaars erforderlich war, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Lysats bestimmt, daß 8 μg an humaner DNA enthielt. 2 × 10^–18 Mol des viralen Ziels waren in jeder Reaktion vorhanden. Das DNA-Ziel wurde mit 50 pmol jedes Primers in 40 mM Tris-HCl, pH 8,3, 25 mM NaCl, 20,8 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 2 mM Spermidinhydrochlorid und Nucleotidtriphosphaten, wie in Tabelle 11 beschrieben, gemischt, auf 95°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 13 Units der AMV-reversen Transkriptase wurden zugegeben, und die Reaktion wurde auf 42°C für 12 Minuten erhitzt, dann auf 95°C erhitzt und wiederum auf Raumtemperatur ab gekühlt. 13 Units der AMV-reversen Transkriptase und 100 Units der T7 RNA-Polymerase wurden zugegeben und die Reaktion auf 37°C für 3,5 Stunden vor dem Assay erhitzt.
Tabelle 12
Diese Ergebnisse veranschaulichen, daß die E. coli-RNAse H-Mengen vorsichtig kontrolliert worden sind, da zuviel E. coli-RNAse H für die Vervielfältigung abträglich war. Außerdem wurde die optimale Konzentration durch das Vorhandensein von nicht-spezifischer humaner DNA verändert, und die Hemmung durch humane DNA war bei allen RNAse H-Mengen signifikant.
Beispiel 13
Wir untersuchten die Wirkung von E. coli-RNAse H auf die Vervielfältigung einer zweiten Region, bezeichnet als HIV-Region 2. Die folgenden Daten zeigen, daß E. coli-RNAse H die Vervielfältigung eines engen Konzentrationsbereichs erhöht. Die HIV-Region 2-Primer wurden wie in Tabelle 12 beschrieben in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von E. coli-RNAse H vervielfältigt. 10 μl jeder Reaktion wur den untersucht, und es wurden, wo erforderlich, Verdünnung vorgenommen. Die Signale wurden mit einer Standardkurve zur Bestimmung der Menge an erzeugtem Ziel verglichen.
Diese Daten zeigen, daß die Vervielfältigung ohne Zugabe von E. coli-RNAse H erreicht werden kann, was im Gegensatz zu den Behauptungen von Guatelli, et al., 87 PNAS 1874–1878, steht.
Wir untersuchten die Verwendung von E. coli-RNAse H mit MMLV-reverser Transkriptase in mehreren Zielregionen. Die Reaktionen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 8 μg humaner DNA unter Verwendung von wie obenstehend in Beispiel 12 beschriebenen Bedingungen mit einem dreistündigen Autokatalyseschritt durchgeführt. Es wurden Primersätze aus den HIV-Regionen 1, 3 und 4 getestet. Die Menge an viraler Matrize wurde gewählt, um RLUs im linearen Bereich des Hybridisierungsassay zu ergeben. MMLV-reverse Transkriptase wurde bei 400 U während der Initiation und bei 800 U für die Vervielfältigung verwendet. 400 U T7 RNA-Polymerase wurden eingeschlossen, und 1 U E. coli-RNAse H wurde zugegeben, wie angegeben. Die unter den Spaltenüberschriften +RNAse H, –RNAse H gezeigten Werte sind aus einem Assay von 10 μl der Reaktionen erhaltene RLUs.
Tabelle 15
In Gegenwart von DNA stimulierte E. coli-RNAse H scheinbar die von den HIV-Region 4-Primern gesteuerte Vervielfältigung. In den meisten Fällen, die wir getestet haben, ist die Vervielfältigung unter Verwendung von MMLV-reverser Transkriptase allein mindestens so gut, wie wenn MMLV-reverse Transkriptase mit E. coli-RNAse H verwendet wird. Im Gegensatz zu den Behauptungen von Guatelli et al., 87 PNAS 1874–1878, wird E. coli-RNAse H nicht für eine effiziente Vervielfältigung benötigt.
Sequenzspezifität der reversen Transkriptase
Wir haben auch herausgefunden, daß manche Primersätze am besten mit AMV-reverser Transkriptase funktionieren, während andere am besten mit MMLV-reverser Transkriptase oder mit einer der reversen Transkriptasen und zugegebener E. coli-RNAse H funktionieren. Das beobachtete Ausmaß an Variabilität in der Vervielfältigungseffizienz bei kleinen Veränderungen in den Promotor-Primern und Primern oder der Quelle der RNAse H unterstützt unseren vorgeschlagenen Mechanismus. Wir stellen im folgenden unsere auführlichen Daten dar, welche diese Ergebnisse unterstützen.
MMLV-reverse Transkriptase ist kloniert worden und ist im Handel von BRL (Bethesda Research Labs), US. Biochemicals und anderen in einer sehr konzentrierten Form (mehr als 300 Units pro μl) erhältlich. Es sollte bemerkt werden, daß ein vergleichbare DNASyntheseaktivität auf natürliche Nucleinsäure-Matrizen bei etwa 10-fach größerer Unit-Konzentration von MMLV-reverser Transkriptase im Vergleich zu AMV-reverser Transkriptase erhalten wird. Das Fehlen der Vergleichbarkeit hinsichtlich der Unit-Aktivität beruht auf der Tatsache, daß die Enzyme verschiedene relative Aktivitäten aufweisen, wenn sie mit Homopolymer-Matrizen (in dem Unit-Aktivitätsassay verwendet) und heteropolymeren Nucleinsäure-Matrizen getestet werden. Wir haben den Einsatz von MMLV-reverser Transkriptase bei verschiedenen Höhen in unseren Vervielfältigungsreaktionen getestet. Beispiele dieser Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen gezeigt. In den Proben mit AMV-reverse Transkriptase wurde die reverse Transkriptase bei 14 U während des Initiationsschritts und bei 56 U während des Vervielfältigungschritts verwendet. Die Menge von MMLV-reverser Transkriptase wurde sowohl für die Initiations- als auch die Vervielfaltigungsschritte titriert. Die verwendeten Inkubationsbedingungen waren wie in Beispiel 12 beschrieben, außer daß 15 pmol jedes HIV-Region 2-Primers verwendet wurden und 25 mM KCl das NaCl ersetzte. Während der Vervielfältigung wurde T7-Polymerase bei 400 U verwendet. Die folgende Tabelle zeigt die Leistung in Gegenwart oder Abwesenheit von 8 μg humaner DNA. Spalten, welche als Überschrift die Bezeichnung AMV oder MMLV tragen, zeigen die Ergebnisse von mit AMV-reverser Transkriptase bzw. MMLV-reverser Transkriptase durchgeführten Vervielfältigungen. Die Zahlen betreffen die Anzahl von Units, welche während Initiation bzw. Autokatalyse verwendet worden sind. Die in der Tabelle enthaltenen Werte sind RLUs. Man bemerke, daß Verdünnungnen der Vervielfältigungsprodukte nicht vorgenommen wurden, und Werte > 200 000 RLU das Ausmaß der Vervielfältigung bedeutend unterschätzen können, da eine Signalsättigung bei einem Wert der Ziel-Hybridisierung auftritt, welcher ausreichend ist, um bei den verwendeten Bedingungen etwa 250 000 RLU zu ergeben.
Tabelle 16
Obwohl die Empfindlichkeit der von MMLV-reverser Transkriptase gesteuerten Vervielfältigung in Abwesenheit von humaner DNA bedeutend geringer war als bei AMV-gesteuerter Vervielfältigung, war die MMLV in Gegenwart von exogener DNA viel effektiver.
Nach der Beobachtung der in hohem Ausmaß erfolgten Vervielfältigung der HIV-Region 2 haben wir die anderen Zielregionen in der Gegenwart von humaner DNA getestet und herausgefunden, daß bei Verwendung von AMV-reverser Transkriptase E. coli-RNAse H für die effektivste Vervielfältigung bei diesen Regionen noch benötigt wurde. Wir haben dann jede Zielregion unter Verwendung von MMLV-reverser Transkriptase ohne E. coli-RNAse H getestet, um die Vervielfältigungsleistung mit Reaktionen zu vergleichen, welche AMV-reverse Transkriptase + E. coli-RNAse H enthielten. Ein Beispiel dieser Ergebnisse für zwei Zielregionen ist in der folgenden Tabelle gezeigt. Die HIV-Region 3 und 4-Primer wurden wie für Beispiel 12 beschrieben verwendet (50 pmol pro Reaktion). In AMV-reverse Transkriptase verwendenden Reaktionen wurden 14 U bei der Initiation verwendet, 56 U reverse Transkriptase + 1 U E. coli-RNAse H wurden für die Vervielfältigung zugegeben. In MMLV-reverse Transkriptase verwendenden Reaktionen wurden 400 U bei der Initiation zugegeben und 800 U für die Vervielfältigung. Alle Reaktionen enthielten 400 U T7-RNA-Polymerase während der vierstündigen Vervielfaltigungs-Inkubation. Die Werte in den Tabellen sind aus dem homogenen Protektions-Assay, welcher unter Verwendung von 10 μl der Vervielfaltigungsreaktionen durchgeführt wurde, erhaltene RLUs. In manchen Fällen wurden vor dem Assay Verdünnungen der Reaktionen vorgenommen.
Tabelle 17
Wie bei der HIV-Region 2 beobachtet, ist bei Abwesenheit von humaner DNA die Vervielfältigung mit MMLV bedeutend niedriger als mit AMV-reverser Transkriptase + RNAse H, aber in Gegenwart von DNA ist die MMLV-gesteuerte Vervielfältigung mindestens so gut, wie dies durch AMV-reverse Transkriptase + RNAse H erzielt wird.
Beispiel 14
Primer für die zweite Region des HBV-Genoms
Das folgende Experiment wurde mit Primersätzen durchgeführt, welche gegen zwei Regionen des HBV-Genoms gerichtet sind. Die Daten zeigen, daß die Primersätze mit AMV-RT nicht zum selben Ausmaß eine Vervielfältigung bewirken. Das Experiment wurde wie in Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung von HBV-positivem Plasma in Verdünnung in negativem Serum durchgeführt. Zehn Mikroliter der Vervielfältigungsreaktion wurden im Hybridisierungsassay getestet.
Tabelle 18 Beobachtete RLUs
Diese Ergebnisse wurden durch zusätzliche Experimente unter Verwendung von Standardprotokollen bestätigt. Die Region 1-Primer ergaben konsistent höhere RLUs in diesen Experimenten.
Wenn im Gegensatz dazu 800 U MMLV-Enzym verwendet wurden, um dieselben beiden Primerpaare zu vervielfältigen, wurde, wie im folgenden gezeigt, der entgegengesetzte Effekt gesehen.
Tabelle 19 Beobachtete RLUs
In diesem Experiment enthielt jede Reaktion 5 μl Serum.
Somit wurde das Vervielfältigungspotential von jedem Primerpaar von der während der Vervielfältigung gegenwärtigen reversen Transkriptase beeinflußt. Faktoren, wie die Verfügbarkeit von Matrizensequenzen, die Fähigkeit der Primer, spezifisch zu hybridisieren, und die Effizienz der RNA-Synthese sollten nicht signifikant durch den Typ von vorhandener reverser Transkriptase beeinflußt werden. Faktoren, wie die RNAse H-Spezifität und -Aktivität und die DNA-Polymerisierungsaktivität könnten beeinflußt werden.
Die folgenden Daten veranschaulichen, daß bei den passenden Bedingungen verwendete Promotor-Primer-Kombinationen entworfen werden können, um die Vervielfältigung zu erhöhen.
Tabelle 21
Dieses Experiment wurde mit den wie obenstehend beschriebenen HBV-Region 2-Primern wie für Tabelle 11 beschrieben durchgeführt, außer daß die gesamte Vervielfältigungreaktion mittels Hybridisierung analysiert wurde.
Beispiel 15
Vergleich von AMV-reverser Transkriptase und MMLV-reverser Transkriptase
Das folgende Experiment verglich die Vervielfältigung von Primern für einen BCL-2-Chromosomentranslokations-Hauptbruchpunkt humaner Chromosomen t(14; 18), der in Patienten mit CML gefunden wird, unter Verwendung von MMLV (300 Units) oder AMV (39 Units). Der Effekt von E. coli-RNAse H wurde mit jedem Enzym ausgewertet. Vervielfältigungen wurden wie für Beispiel 12 beschrieben durchgeführt, außer daß 24 mM MgCl₂ und 50 pmol jedes Primers verwendet wurden. In Reaktionen, die Lysat enthielten, waren 4 μg DNA aus weißen Blutzellen vorhanden. Alle Reaktionen entielten 300 Units T7-RNA-Polymerase und 10 amol des doppelsträngigen Eingangs-DNA-Ziels.
Tabelle 22
Die Ergebnisse zeigen, daß MMLV- und AMV-RT diesen Primersatz nicht in gleichem Ausmaß vervielfältigen, insbesondere bei Abwesenheit von E. coli-RNAse H. In Reaktionen mit AMV-reverser Transkriptase zugegebene E. coli-RNAse H verbesserte merklich die Vervielfältigung; dies zeigt, daß die RNAse H-Aktivität in diesen Reaktionen limitierend war. Im Gegensatz dazu steigerte E. coli-RNAse H die Vervielfältigung nicht, wenn sie zu Reaktionen mit MMLV-RT zugegeben wurde. Die Daten bestätigen auch einen Punkt, welcher bereits betreffend die Fähigkeit der MIVILV-RT, eine bedeutende Vervielfältigung in Gegenwart großer Mengen nicht-spezifischer humaner DNA aufrecht zu erhalten, angesprochen wurde.
C. Ein Primer wurde nicht in Vollängen-Produkt eingebaut
Eines unserer bedeutsamsten Ergebnisse ist, daß der Primer von der gleichen Polarität wie die Haupt-RNA-Spezies nicht nachweisbar in das Vollängen-DNA-Produkt eingebaut wurde. Um dies zu zeigen, wurden individuelle Primer terminal mit ³²P markiert, und der Einbau jedes Primers in DNA-Produkte wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht. Wir erwarteten anfänglich, daß beide Primer in Vollängen-DNA-Produkte eingebaut werden würden. Jedoch wurde der den Promotor enthaltende Primer nicht in Vollängen-DNA-Produkt beobachtet. Tatsächlich blieb er ziemlich klein. Diese Ergebnisse wurden mit einer Anzahl von verschiedenen Zielen und Primersätzen bestätigt. Unser Verfahren ist nachfolgend erklärt.
Um die während der Autokatalyse akkumulierte Spezies von cDNA zu identifizieren, wurden Primer am 5'-Ende mit Polynucleotidkinase ³²P markiert und in Vervielfältigungsreaktionen untergemischt. Die folgenden Beispiele zeigen, daß cDNA einer Polarität sich während der Vervielfältigung präferentiell ansammelte, und daß der akkumulierte Strang immer komplementär zu der vorherrschenden, während der Autokatalyse synthetisierten RNA-Spezies ist. Die 5 zeigt das Ergebnis des Einbaus von ³²P-markierten HIV-Region 2-Primern während der Vervielfältigung. Dieser Primersatz resultierte in der Synthese einer 214 Basen großen RNA des (+)-Sinns. Der zu der RNA komplementäre Primer wurde in zwei größere Banden von 235 und 214 Basen Länge eingebaut, wenn Zielsequenzen vorhanden waren (Spur 3). Keine Vollängenfragmente wurden bei Abwesenheit des Ziels gesehen (Spur 4). Das 214 Basen große Fragment repräsentiert cDNA von gleicher Länge wie die RNA, wohingegen das 235 Basen große Fragment von gleicher Länge ist wie die RNA + 21 Basen der T7-Promotorsequenz. Im Gegensatz dazu wurde der Promotor-Primer nicht in Vollängen-DNA-Produkt bei Gegenwart oder Abwesenheit des Ziels beobachtet (Spur 1 bzw. 2).
Die Spuren 5–8 von 5 zeigen das Ergebnis des Einbaus von ³²P-markierten HBV-Region 1-Primern während der Vervielfältigung. Diese sind als T7pro⁺ und T7pro^– bekannt. Dieser Primersatz ist fähig zur Herstellung von 132 Basen großer RNA von zwei Polaritäten, aber die (+)-Strang-RNA überwiegt. T7pro⁺, welcher komplementär zu der vorherrschenden RNA ist, wurde in Fragmente von 132 Basen und 153 Basen eingebaut, was mit unserem vorgeschlagenen Mechanismus in Übereinstimmung steht (Spur 7, (+)-Ziel, Spur 8, (–)-Ziel). Das 153 Basen große Fragment ist von gleicher Länge wie die RNA + 21 Basen der T7-Promotorsequenz des T7pro+. Im Gegensatz dazu wurde der ³²P-markierte T7pro⁺-Primer nicht in Fragmente irgendeiner Länge eingebaut (Spur 5, (+)-Ziel, Spur 6, (–)-Ziel).
Die mittels Gelelektrophorese analysierten Reaktionen wurden auch mittels HPA analysiert, um festzustellen, ob cDNA der gleichen Polarität wie die vorherrschende RNA durch ein anderes Verfahren nachgewiesen werden konnte. Plus- und Minus-Strangsonden wurden verwendet, um das relative Verhältnis der hergestellten Stränge zu bestimmen, und ein Teil jeder Reaktion wurde mit RNAse A behandelt, um das Verhältnis von RNA zu DNA zu ermitteln. Die Ergebnisse sind im folgenden dargestellt.
Tabelle 23
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Vervielfältigungen gut funktionierten, selbst wenn Vollängen-Produkt nicht mit dem Promotor-Primer beobachtet wurde. Diese Ergebnisse korrelieren mit dem, was in der vorhergehenden Untersuchung beobachtet wurde, daß heißt, der Großteil des mit einer Sonde eines Sinns beobachteten Signals rührt von RNA her, und das Komplementärstrang-Signal stammt wie erwartet von der DNA. Dies war selbst für den HBV-Region 1-Primersatz gültig, welcher RNA von beiden Polaritäten hergestellt haben sollte.
D. Bestätigung des Mechanismus, zeigend, daß das Enzym RNA aus dem RNA/DNA-Hybrid an spezifischen Stellen schneidet
Auf Grundlage der hier obenstehend berichteten Experimente und Beobachtungen ist der Mechanismus für die Vervielfältigungssysteme, welcher mögliche Sequenzspezifitäten in der RNAse H in Betracht zieht, in der 4 abgebildet. Da die RNAse H-Sequenzspezifität ein Schlüsselelement ist, ist es in Unterstützung dieses Mechanismus notwendig, zu zeigen, daß die Enzyme die RNA eines RNA:DNA-Hybrids tatsächlich an spezifischen Stellen schneiden. Weiterhin mußten die Lagen der Schnittstelllen in spezifischen Regionen gemäß dem Modell sein, damit eine gute Vervielfältigung erhalten wird. Um diese Frage zu untersuchen, wurde ein RNA:DNA-Hybrid hergestellt, das die RNA enthielt, welche aus einer bekannten Kombination von Ziel und Primersatz erzeugt werden würde. Die RNA wurde mit ³²P markiert, mit AMV-reverser Transkriptase (mit ihrer assoziierten RNAse H-Aktivität) inkubiert, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse waren vollständig konsistent mit dem neuen Reaktionsmechanismus, namentlich zeigte die Fragmentgröße, daß mehrere kleine Stücke erzeugt wurden, und daß diese durch Schnitte nahe einem oder beiden Enden hergestellt wurden. Die innere Region des Moleküls wurde nicht geschnitten. Dieses Experiment bestätigte, daß das Enzym Sequenz- oder Strukturspezifität unter den verwendeten Reaktionsbedingungen aufweist.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, wo die Schnitte auftraten, da der vorgeschlagene Mechanismus erfordert, daß mehrere Schnitte in der den Promotor enthaltenden Primer-bindenden Region auftreten. Durch individuelles Markieren der Termini der RNA und Analysieren der Verdauprodukte wurde gezeigt, daß die Schnitte nur am 5'-Ende der RNA vorgenommen wurden. Dies ist ebenfalls mit dem vorgeschlagenen Mechanismus konsistent.
Beispiel 16
Die 6 zeigt, daß die RNAse H-Aktivitäten von AMV, MMLV und E. coli an spezifischen RNAse H-Spaltstellen schneiden. Die Pfeile in der Figur zeigen die Position von Vollängen-RNA.
Die 6 zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem die HIV-Region 2-RNA intern mit ³²P markiert, an eine einzelsträngige Zielsequenz hybridisiert, und mit RNAse H von AMV 45 Minuten lang (Spur 2), von MMLV 5, 15, 45 oder 120 Minuten lang (Spur 3–6) oder mit E. coli-RNAse H 5 Minuten lang (Spur 7) genickt wurde. Die Größen der hergestellten Fragmente waren diskret und unterschiedlich bei jedem Enzym, was die Spezifität der Spaltung der Enzyme und variierende Spezifitat bei dieser Matrize unter den Enzymen anzeigt. Der rascheste Abbau wurde in Gegenwart von E. coli-RNAse H beobachtet, was geringere Spezifität oder größere Aktivität des Schneidens mit diesem Enzym zeigt.
Die 6b zeigt die Ergebnisse der Hybridisierung von HBV-Region 1-RNA an eine synthetische Zielsequenz, gefolgt von Nicking mit RNAse H aus AMV-reverser Transkriptase für 5, 30, 60 oder 120 Ivlinuten (Spur 2–5) oder E. coli-RNAse H für 1, 3, 15 oder 60 Minuten (Spur 6–9). Es wurden Fragmente verschiedener Größe mit den zwei Enzymen hergestellt, was die Spezifität der Spaltung zeigt. Wenn die HBV-RNA am 3'-Terminus markiert und mit AMV-reverser Transkriptase genickt wurde, wurden Fragmente der gleichen Größe erhalten, was zeigt, daß die Schnittstellen nahe dem 5'-Ende der RNA lagen.
Diese Daten zeigen, daß mit RNAse H aus AMV, MMLV und E. coli spezifische Stellen geschnitten werden, und daß mit den drei Enzymen wenigstens einige Stellen unterschiedlich sind. Die Gegenwart spezifischer Stellen innerhalb der zu vervielfältigenden Region erlaubt, daß die RNA in einem RNA:DNA-Hybrid geschnitten wird, was es der Autokatalyse ermöglicht, effizient stattzufinden. Unter Verwendung der Schnittstelleninformation entworfene Primer zeigen eine verbesserte Vervielfältigungseffizienz. Dies ist konsistent mit unseren Beobachtungen, daß gewisse Primersätze in Abhängigkeit von der RNAse H-Quelle in verschiedenen Ausmaßen eine Vervielfältigung bewirkten.
E. Identifizierung von MMLV- und AMV-RNAse H-Schnittstellen
Beispiel 17
Um die von AMV-RNAse H verdauten Stellen zu identifizieren, wurde RNA mit einer komplementären Sequenz hybridisiert und mit AMV-RNAse H genickt. Im Anschluß an eine Denaturierung wurde ein zum 3'-Ende der zu sequenzierenden Region komplementärer Primer hybridisiert und in Gegenwart von Didesoxynucleotiden mittels des Sanger-Sequenzierungsverfahrens verlängert. Eine Beendigung der cDNA-Synthese, welche eine Spaltung der RNA anzeigt, wurde für die HBV-RNA an den folgenden Stellen beobachtet:
5'-GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGCGUUUUAUCA*UAUUCCUCUUCA*UCCUG ... -3'
Um die von MMLV-RNAse H-verdauten Stellen zu identifizieren, wurde RNA mit einer komplementären Sequenz hybridisiert und mit MMLV-RNAse H genickt. Im An schluß an eine Denaturierung wurde ein zum 3'-Ende der zu sequenzierenden Region komplementärer Primer hybridisiert und in Gegenwart von Didesoxynucleotiden mittels des Sanger-Sequenzierungsverfahrens verlängert. Eine Beendigung der cDNA-Synthese wurde für die HBV-RNA an den folgenden Stellen beobachtet:
5'-GGGAGAGGUUAUCGC*UGGA*UGUGUCUGCGGC*GUUUUAUCA*UAUUCCUCUUCAUCCUGC*UGCUAUGCCUCA*UCUUC ... -3'
Die folgenden Stellen wurden für eine zweite HBV-RNA-Sequenz identifiziert:
5'-GGGAGACCCGAGAU*UGA*GAUCUUCUGCGACGCGGCGAU*UGA*GAUCUGCGUCU*GCGAGGCGAGGGAGU*UCU*UCUU*CUAGGGGACCUGCCUCGGUCCCGUC*GUCUA ... -3'
Die folgenden Stellen wurden für eine HIV-RNA-Sequenz identifiziert:
5'-GGGAGACAAA*UGGCAGUA*UUCAUCCACAAUUUUAAAAGAAAAGGGGGGAUUGGGGGGUACAGUGCAGGGGAAAGAAUAGUAGACAUAAUAGCAACAGACAUAC*AAACUAAAGAAUUACAAAAACAAAUUAC*AAAAAUUCAAAAUUUUCGGGUUUAUUACAGGGAC*AGC*AGAAA ... 3'
Die meisten Spaltstellen traten nahe den Dinucleotiden CA oder UG auf. Das zum Nachweis der Spaltstellen verwendete Verfahren identifizierte nur Stellen, die sich während der Spaltreaktion akkumulierten. Es wird erwartet, daß zusätzliche Stellen geschnitten werden könnten, welche durch das verwendete Verfahren nicht erkannt wurden.
F. Primer für Vervielfältigungssysteme
Auf Grundlage von Ergebnissen, daß die verschiedenen RNAse H-Enzyme Sequenzspezifität aufweisen, haben wir verschiedene Primer/Ziel-Kombinationen getestet und versucht, ihre Leistung in Vervielfältigungssystemen zu optimieren. Die bis jetzt erhaltenen Daten zeigen, daß die Stückgröße der hergestellten RNA-Fragmente relativ groß ist, und daß die Fragmente wahrscheinlich nicht spontan aus dem Doppelstrang dissoziieren. Dies ist nicht unerwartet, da Arbeiten mit AMV-reverser Transkriptase, welche AMV-RNA oder Poliovirus-RNA kopierte, zeigten, daß die RNA-Fragmente, welche von der RNAse H hergestellt wurden, von dem Enzym verwendet wurden, um die Synthese von cDNA von dem anfänglich synthetisierten cDNA-Strang zu primen.
Wenn die RNAse H-Enzyme Sequenzspezifität besitzen, verläuft die Vervielfältigungsreaktion wie folgt (beginnend mit dem RNA-Intermediat in der Reaktion):
Der zu der während der Vervielfältigung hergestellten hauptsächlichen RNA-Spezies komplementäre Primer bindet am 3'-Terminus der RNA. Da die Konzentration des Primers in der Reaktion hoch ist, erzeugt überschüßiger Primer RNA:DNA-Doppelstränge, welche von der RNAse H-Aktivität geschnitten werden können, bevor sie dazu fähig sind, eine Synthese zu intiieren. Deshalb wird es bevorzugt, daß die Primer-bindende Region keine große Anzahl von Sequenzen enthält, welche von dem in der Reaktion verwendeten RNAse H-Enzym erkannt werden.
Da die Schnittstellen häufig vorkommen, kann es in manchen Fällen nicht durchführbar sein, einen RNA-komplementären Primer ohne erkannte Schnittstellen zu entwerfen. In diesem Fall sollten die Schnittstellen so nahe wie möglich am 5'-Terminus liegen, um dem 3'-terminalen Bereich des Primers zu ermöglichen, an der RNA angelagert zu bleiben.
Nach Verlängerung des Primers durch eine geeignete DNA-Polymerase, muß nun die Bindestelle für den zweiten Primer, welcher den RNA-Polymerase-Promotor enthält, exponiert werden. Es ist ausreichend, nur einen Teil der RNA zu entfernen, um die Nucleation bzw. Anlagerung und das Zippering (Ausbilden von Wasserstoffbrükken) des Primers zu ermöglichen, wenn er an die cDNA hybridisiert, um die durch reverse Transkriptase vermittelte Bindung des Primers und die Initiation der Synthese zu ermöglichen, oder die RNA lediglich zu nicken, so daß das RNA-Fragment, das resultiert, verdrängt werden kann. Da unsere Daten zeigen, daß relativ große RNA-Stücke hergestellt werden, und daß der Promotor-enthaltende Primer nicht in die Vollängen-DNA eingebaut wird, können die folgenden Ereignisse stattfinden:

1. Es besteht ein ausreichendes Nicking der RNA, um die Bindung des Promotor-Primers zu erlauben. Ob ein Nick an der geeigneten Stelle nur ein genügend kleines RNA-Fragment erzeugt, um abzuschmelzen und die Primerbindestelle oder einen Abschnitt davon freizusetzen, oder ob ein Nick eine mit einem oder mehreren der Enzyme assoziierte Entwindungsaktivität ermöglicht, um das RNA-Fragment zu verdrängen, ist zu dieser Zeit nicht bekannt.
2. Der cDNA-3'-Terminus wird durch die reverse Transkriptase verlängert, um die Promotorregion zu doppelsträngiger DNA zu machen.
3. RNA wird von dem so hergestellten Komplex synthetisiert. Dieser Komplex würde aus einer an RNA gebundenen cDNA bestehen und einen doppelsträngigen DNA-Promotor enthalten.

Somit muß eine von der in der Reaktion vorhandenen RNAse H-Aktivität erkannte Sequenz irgendwo in oder nahe der Bindestelle für den Primer vorkommen, welcher den RNA-Polymerase-Promotor enthält.
In manchen Anwendungen kann es auch erwünscht sein, keine RNAse H-Erkennungsstellen innerhalb der Zielsequenz zu haben. Stellen innerhalb des Ziels können geschnitten und verwendet werden, um RNA-Primer für die Synthese von doppelsträngigen cDNA-Regionen herzustellen. Es kann zu bevorzugen sein, die Möglichkeit dieser enzymatischen Aktivität zu elimineren.
Auf Grundlage des Modells und der RNAse H-Sequenzspezifitätsinformation, die wir erhalten haben, wurden neue Primersätze entworfen. Unsere Entwurfskriterien sind wie folgt:
Für den T7-Promotor-Primer

1) Die Primerregion sollte eine oder mehrere Schnittstellen pro 10 Basen aufweisen.
2) Die Primerregion sollte eine Schnittstelle nahe dem 5'-Ende besitzen.
3) Die Primerregion sollte eine Schnittstelle nahe dem 3'-Ende und möglicherweise eine partielle Stelle am 3'-Ende besitzen.
4) Die Primerlänge sollte > 18 Basen sein.
5) Die Tm est. sollte etwa 55–65°C betragen.

Für den anderen Primer

1) Der Primer sollte wenige oder keine RNAse H-Schnittstellen aufweisen.
2) Jegliche Schnittstellen in dem Primer sollten nahe dem 5'-Ende sein.
3) Die Primerlänge sollte etwa 18–28 Basen lang sein.
4) Die Tm est. sollte etwa 55–65°C betragen.

Es wurde eine signifikant bessere Synthese von Primersätzen aus erhalten, welche unter Verwendung dieser Kriterien und der Kenntnis des Mechanismus und der Sequenzspezifitäten entworfen wurden. Dies zeigt die Nützlichkeit der Erfindung bei der Ermöglichung des Entwurfs von funktionellen Primersätzen für spezifische Zielregionen. Diese werden im folgenden vollständiger erklärt.
Beispiel 18
Unsere Ergebnisse hinsichtlich der RNAse H-Spezifität sind verwendet worden, um effiziente Promotor-Primer-Kombinationen zu entwerten. Die Verfahren nach dem Stand der Technik fügten einfach unselektiv Promotoren an Primersequenzen an. Wir sind in der Lage gewesen, Promotor-Primer-Kombinationen zu entwerfen und zu optimieren, um die Ausbeute an vervielfältigtem Produkt zu steigern. Das folgende Experiment zeigt, daß kleine Veränderungen in der Promotor-Primer-Sequenz zu großen Veränderungen der Vervielfältigungseffizienz führen.
Die folgenden Beispiele zeigen Primer aus ähnlichen Regionen, welche hinsichtlich RNAse H-Schnittstellen und GP-III-Vervielfältigungseffizienz verglichen wurden. In jedem Beispiel wurden Vervielfältigungen in doppelter Ausführung unter Verwendung gebräuchlicher Reagenzien, außer den zu testenden Primern, durchgeführt.
1. Nicht-Promotor-Primer
In dem ersten Beispiel wurde die Nicht-Promotor-Primer-Stelle für die CML-Haupt-t(14; 18)-Bruchpunkt-Vervielfältigungsregion um 15 Basen verschoben, was zu einer Verminderung der Anzahl möglicher RNAse H-Schnittstellen von 4 auf 1, wobei eine 4 Basen große Erkennungssequenz angenommen wurde, oder von 5 auf 2, wobei eine 3 Basen große Erkennungssequenz angenommen wurde, führte. Die Reaktion wurde wie für Beispiel 15 beschrieben durchgeführt, außer daß 2,5 mM ATP, 16,5 mM MgCl₂ und 50 mM KCl eingeschlossen wurden. Diese Veränderung in der Primersequenz hatte einen dramatisch positiven Effekt auf die Vervielfältigungseffizienz Im zweiten Fall wurde eine beabsichtige Fehlpaarung intern in den Nicht Promotor-Primer der HBV-Region 1 gesetzt, um die einzige mögliche RNAse H-Schnittstelle zu entfernen, wobei eine 4 Basen große Erkennungsstelle angenommen wurde. Im Fall einer 3 Basen großen Schnittstelle würde der Fachmann erkennen, daß die Fehlpaarung die dem 3'-Ende nächstgelegene Schnittstelle entfernt hätte. Diese Veränderung wies ebenfalls eine definitiv positive Auswirkung auf die Vervielfältigungseffizienz auf. Die Daten zeigen, daß zwei Verfahren, das Verändern der Position des Primers oder der Einschluß von Fehlpaarungen verwendet werden können, um die Vervielfältigung zu verbessern. Schätzungsweise führt die Entfernung von RNAse H-Schnittstellen aus dem Nicht-Promotor-Primer zu einer wirksameren Einleitung der cDNA-Synthese während der Autokatalyse.
2. Promotor-Primer
Die folgenden Beispiele zeigen Promotor-Primer, welche aus ähnlichen Regionen stammen, aber sich in der Zahl möglicher RNAse H-Schnittstellen unterscheiden. Im ersten Fall werden die zwei Promotor-Primerstellen für die HIV-Region 5 um 10 Basen verschoben, was die Anzahl möglicher RNAse H-Schnittstellen von zwei auf drei verändert, wobei eine vier Basen große Erkennungsstelle angenommen wurde, oder von drei auf fünf verändert, wobei eine drei Basen große Erkennungsstelle angenommen wurde. Dies weist einen positiven Effekt auf die Vervielfältigungseffizienz auf Im zweiten Fall wurde eine, mögliche RNAse H-Schnittstellen enthaltende, Sequenz stromaufwärts des Promotor-Primers für die Haupt-Bruchpunkt-(14; 18)-Translokation eingefügt, und eine Fehipaarung zum Ziel wurde eingeführt, um eine Schnittstelle innerhalb der Primerregion zu erzeugen. Dies hatte ebenfalls eine positive Auswirkung auf die Vervielfältigungseffizienz. Dies zeigt, daß die Einfügung von RNAse H-Schnittstellen in den Promotor-Primer verwendet werden kann, um die Vervielfältigungseffizienz zu verbessern. Schätzungsweise ist der Einschluß von RNAse H-Schnittstellen bei der Verdrängung des RNA-Strangs behilflich, was die Effizienz des Kopierens der Promotorregion steigert, wodurch eine wirksamere Autokatalyse erzielt wird.
Die Sequenzen der obenstehenden Primer sind;
Primer A

AATTTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATCTTGTGGGGTGGCTCCTTCT-3'

Primer B

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTTCTGATAATGCTG-3'

Primer C

ATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTG-3'

Primer D

TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATCAGTTACAATCGC TGGTATCAACGCTGAGCAGACGCTGACCGTGGTCCCTTG-3'

In den obenstehenden Beispielen resultierte die Entfernung von RNAse H-Schnittstellen aus dem Nicht-Promotor-Primer in einer verbesserten Vervielfältigung, selbst wenn die Entfernung der Schnittstelle die Einbindung einer Fehlpaarung zum ursprünglichen Ziel beinhaltete. Der Entwurf des Promotor-enthaltenden Primers, um zusätzliche RNAse H-Schnittstellen einzuschließen, verbesserte ebenfalls die Vervielfältigung, wiederum selbst wenn der Einschluß von Schnittstellen die Einbindung von Fehlpaarungen zum ursprünglichen Ziel beinhaltete. Die Anzahl, Verteilung und Position von möglichen RNAse H-Schnittstellen bestimmen teilweise die Nützlichkeit eines gegebenen Primers.
Die Verbesserung der Vervielfältigung durch Einschluß beabsichtigter Fehlpaarungen oder Einfügung von Sequenzen zwischen den Promotor und den Primer sind nicht-offensichtliche Verbesserungen an dem Vervielfaltigungsverfahren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die RNA-Zielsequenz bestimmt und dann analysiert, um festzustellen, wo der RNAse H-Abbau Schnitte oder die Entfernung von Abschnitten der RNA aus dem Doppelstrang verursachen wird. Es können Experimente durchgeführt werden, um den Effekt des RNAse-Abbaus der Zielsequenz durch die vorhandene RNAse H in AMV-reverser Transkriptase oder MMLV-reverser Transkriptase, z. B. durch E. coli-RNAse H oder durch Kombinationen davon, zu bestimmen.
Bei der Auswahl eines Primers ist es zu bevorzugen, daß der Primer so gewählt wird, daß er an einen RNA-Abschnitt hybridisieren wird, welcher im wesentlichen durch die in der Reaktionsmischung vorhandene RNase H unabgebaut bleibt. Wenn ein wesentlicher Abbau vorliegt, können die Schnitte im RNA-Strang in der Region des Primers die DNA-Synthese stoppen oder inhibieren und die Verlängerung des Primers verhindern. Daher ist es wünschenswert, einen Primer zu wählen, welcher mit einer Sequenz des RNA-Ziels hybridisieren wird, die so gelegen ist, daß, wenn die RNA der RNAse H unterzogen wird, dort kein wesentlicher Abbau stattfindet, der die Bildung des Primerverlängerungsprodukts verhindern würde.
Die Stelle für die Hybridisierung des Promotor-Primers wird so gewählt, daß ein ausreichender Abbau des RNA-Stranges auftritt, um die Entfernung des an den Bereich des DNA-Stranges, an den der Promotor-Primer hybridisieren wird, hybridisierten Abschnitts des RNA-Stranges zu ermöglichen. Typischerweise werden durch RNAse H-Abbau lediglich Abschnitte der RNA aus dem RNA:DNA-Doppelstrang entfernt, und ein wesentlicher Teil des RNA-Strangs verbleibt im Doppelstrang. Es resultiert ein RNA:DNA-Doppelstrang, welcher einen doppelsträngigen DNA-Promotor enthält.

Claims

Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Zusammenbringen einer Ziel-Nukleinsäure, welche die Zielsequenz umfasst, mit einem ersten Oligonukleotid-Primer, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum Hybridisieren an einen 3'-terminalen Bereich der Zielsequenz fähig ist, wodurch ein Oligonukleotid:Zielsequenz-Hybrid gebildet wird und die DNA-Synthese eingeleitet werden kann; (b) Extendieren des Primers in einer Primer-Extensionsreaktion unter Verwendung der Zielsequenz als einer Template, zum Erhalt eines DNA-Primer-Extensionsprodukts, das eine komplementäre Zielsequenz umfasst; (c) Verfügbarmachen eines 3'-terminalen Bereichs der komplementären Zielsequenz zur Hybridisation mit einem zweiten Oligonukleotid, welches als eine blockierte Spleiß-Template dient, welches zweite Oligonukleotid eine erste Nukleotidsequenz, die zum Hybridisieren an den 3'-terminalen Bereich der komplementären Zielsequenz fähig ist, und eine Promotorsequenz, die, wenn doppelsträngig gemacht, durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, 5' zu der ersten Nukleotidsequenz umfasst und ein blockiertes 3'-Ende zum Verhindern der DNA-Extension davon aufweist; (d) Hybridisieren des zweiten Oligonukleotids an das DNA-Primer-Extensionsprodukt; (e) Extendieren des 3'-Endes des Primer-Extensionsprodukts zum Erhalt eines doppelsträngigen Promotors, welcher die Promotorsequenz umfasst; und (f) Verwenden des in Schritt (e) gebildeten Promotors und der RNA-Polymerase zur Erzeugung von RNA-Transkripten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ziel-Nukleinsäure RNA ist und Schritt (c) unter Verwendung eines Enzyms ausgeführt wird, welches das RNA-Ziel selektiv abbaut, wenn in einem RNA:DNA-Duplex vorhanden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Enzym eine reverse Transkriptase mit RNase H-Aktivität ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren bei im wesentlichen konstanter Temperatur durchgeführt wird.
Kit zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, welcher umfasst: (i) einen Oligonukleotid-Primer, der zum Hybridisieren an einen 3'-terminalen Bereich der Zielsequenz fähig und extendierbar ist, um ein Primer-Extensionsprodukt zu erzeugen, das eine komplementäre Zielsequenz enthält, und (ii) ein zweites Oligonukleotid, das eine erste Nukleotidsequenz, die zum Hybridisieren an einen 3'-terminalen Bereich der komplementären Zielsequenz fähig ist, und eine Promotorsequenz, die, wenn doppelsträngig gemacht, durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, 5' zu der ersten Nukleotidsequenz umfasst und ein blockiertes 3'-Ende zum Verhindern der DNA-Extension davon aufweist.
Kit nach Anspruch 5, welcher außerdem die RNA-Polymerase umfasst.
Kit nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, welcher außerdem eine reverse Transkriptase umfasst.
Oligonukleotid zur Verwendung als einer blockierten Spleiß-Template bei einem Verfahren nach Anspruch 1, welches eine Hybridisierungsregion und 5' zu dieser Hybridisierungsregion eine Promotorsequenz umfasst, welche, wenn doppelsträngig gemacht, durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, welches Oligonukleotid ein blockiertes 3'-Ende zum Verhindern der Primer-Extension davon aufweist.