DE69031351T2

DE69031351T2 - Zubereitungen und behandlungen von pneumonia in tieren

Info

Publication number: DE69031351T2
Application number: DE69031351T
Authority: DE
Inventors: Stephen Acres; Lorne Bariuk; Michael Lawman; Andrew Potter
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1990-04-05
Filing date: 1990-05-25
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2010-05-26
Also published as: ES2108693T3; FI924457A0; WO1991015237A1; JPH05508301A; EP0527724B1; EP0527724A1; FI924457A; ATE157258T1; DE69031351D1; AU5662190A; AU642650B2

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Untereinheit- Antigene, Vakzinzusarnmensetzungen und Verfahren zu deren Verabreichung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Proteine aus Pasteurella haemolytica, die zur Stimulation der Immunität gegen Pneumonie verwendet werden.

Hintergrund der Erfindung

Die Atemwegserkrankungen, von denen in Mastanlagen im Freien gehaltene Rinder betroffen sind, verursachen der Viehwirtschaft jährlich enorme Verluste. Kälber sind am stärksten betroffen, und eine große Zahl dieser Kälber stirbt. Diese Erkrankung ist mit pathogenen Mikroorganismen, insbesondere Pasteurellae-Arten, und verschiedenen Streßfaktoren, beispielsweise durch den Transport und durch Überfüllung, verbunden.
Die mit Pasteurella-Arten verbundene wirtschaftlich wichtigste Atemwegserkrankung ist das "Shipping-fever". Die Erkrankung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie gewöhnlich innerhalb von zwei Wochen Streß plötzlich auftritt. Die Symptome umfassen Atemnot, Husten, Ausfluß aus den Augen und der Nase, Appetitlosigkeit und raschen Gewichtsverlust, Fieber, starke Lungengeräusche, Immunsuppression, allgemeine Entkräftung, virale und/oder bakterielle Infektionen der Lungen. Aus betroffenen Tieren sind verschiedene Bakterien und Viren isoliert worden, beispielsweise Pasteurella-Arten, der Rinder-Herpes-Virus 1, der Parainfluenza-3-Virus, das bovine respiratorische Synzytialvirus und Mycoplasma-Arten. Die Krankheit befällt typischerweise 15 bis 30 % der exponierten Tiere, und die sich ergebenden Todesfälle machen typischer 2 bis 5 % der exponierten Population aus.
Wenn das Tier Streß ausgesetzt wird und mit einer Vielzahl von Viren, nämlich wie oben beschrieben, infiziert wird, scheint das Tier gegen die durch P. haemolytica und in einem geringeren Ausmaß von Pasteurella multocida hervorgerufene fibrinöse Pneumonie anfällig zu werden. Hinsichtlich allgemeiner Informationen bezüglich des "Shipping-fever" vgl. Yates, W.D.G. (1982), Can. J. Comp. Med. 46:225-263.
P. haemolytica kann ferner die enzootische Pneumonie hervorrufen und neben Rindern ein großes Spektrum an Tieren infizieren, beispielsweise wirtschaftlich wichtige Arten wie Schafe, Schweine, Pferde und Geflügel. P. haemolytica wird ferner häufig im oberen Atmungstrakt von gesunden Tieren vorgefunden. Die Pneumonie entwickelt sich, wenn die Bakterien die Lungen dieser Tiere infizieren. Der Schutz gegen mit Pasteurella verbundenen Erkrankungen ist daher für die Landwirtschaft wirtschaftlich wichtig.
Es gibt zwei bekannte Biotypen von P. haemolytica, die mit A und T bezeichnet werden. Ferner gibt es 12 bekannte Serotypen, die aus Wiederkäuern isoliert wurden. Der Biotyp A mit dem Serotyp 1 (im folgenden "A1" bezeichnet) herrscht bei der Rinderpneumonie in Nordamerika vor, vgl. Shewen, P.E. und Wilkie, B.N. (1983), Am. J. Vet. Res. 44:715-719. Die aus verschiedenen Serotypen isolierten Antigene scheinen jedoch eine gewisse Kreuzreaktivität zu zeigen, vgl. z.B. Donanchie et al. (1984), J. Gen. Micro. 130:1209-1216.
Für frühere Pasteurellose-Vakzine wurden Gesamtzellpräparationen von entweder lebenden oder durch Hitze abgetöteten Bakterien verschiedener Serotypen verwendet, nämlich wie in den US-Patenten 4 328 210, 4 171 354, 3 328 252, 4 167 560 und 4 346 074 beschrieben. Traditionelle Vakzinpräparationen bieten jedoch keinen wirksamen Schutz gegen Pasteurella-Infektionen. Tatsächlich sind mit dem Vakzin behandelte Tiere häufig anfälliger gegen die Erkrankung als nicht mit dem Vakzin behandelte, vgl. Martin et al. (1980), Can. J. Comp. Med. 44:1-10. Der fehlende Schutz durch traditionelle Vakzine beruht wahrscheinlich darauf, daß wichtige Antigene und Virulenzdeterminanten fehlen oder daß in den Präparationen immunsuppressive Bestandteile vorhanden sind.
Andere Vakzinpräparationen enthalten rohe Überstandextrakte von P. haemolytica, vgl. z.B. Shewen, P.E. und Wilkie, B.N. (1988) in Can. J. Vet. Res. 52:30-36. Diese Kulturüberstände enthalten jedoch verschiedene lösliche Oberflächenantigene des Bakteriums und ergeben bei der Verabreichung an Tiere unterschiedliche Ergebnisse. Andere Präparationen enthalten durch Natriumsalicylat-Extraktion erhaltene Kapselextrakte (vgl. z.B. Donanchie et al. (1984) 130:1209- 1216; US-Patent 4 346 074), mit Salz extrahierte Antigene (vgl. z.B. Lessley et al. (1985), Veterinary Immunology and Immunopathology 10:279-296; Himmel et al. (1982), Am. J. Vet. Res. 43:764-767) und modifizierte, lebende Pasteurella-Mutanten.
Bei anderen Versuchen zur Immunisierung wurde beispielsweise ein gereinigtes Cytotoxin von P. haemolytica verwendet, vgl. z.B. Gentry et al. (1985), Vet. Immunology and Immunopathology 9:239-250. Dieses Cytotoxin, bei dem es sich um ein Leukotoxin handelt, wird von aktiv wachsenden Bakterien sezerniert, vgl. Shewen, P.E. und Wilkie, B.N. (1987), Infect. Immun. 55:3233-3236. Das dieses Leukotoxin kodierende Gen ist kloniert und in Bakterienzellen exprimiert worden, vgl. Lo et al. (1985), Infect. Immun. 50:667-671. Kälber, welche Infektionen mit P. haemolytica überlebt haben, besitzen das Toxin neutralisierende Antikörper, vgl. Cho, H.J. und Jericho, K.W.F. (1986), Can. J. Vet. Res. 50:27-31; Cho et al. (1984), Can. J. Comp. Med. 48:151-155.
Durch Elektronenmikroskopie intakter Zellen von P. haemolytica A-1 ist das Vorliegen von zwei Typen von Fimbrien gezeigt worden, vgl. Morck et al. (1987), Can. J. Vet. Res. 51:83-88. Der eine Typ ist starr und wird leicht von den Zellen abgeschert, während der andere dünn und flexibel ist. Der Zweck dieser Fimbrien ist bisher noch nicht ermittelt worden. Bei einigen Bakterien spielen die Fimbrien jedoch eine Rolle bei der Infektion, vgl. z.B. Normar et al. (1986) in Protein-carbohydrate Interactions in Biological Systems (D. Lark, Hrsg., 1986), S. 3-12; Mooi, F. und deGraaf, F.K. (1985), Curr. Top. Micobiol. Immunol. 118:119-136.
Kürzlich wurde gezeigt, daß Streptococcen der Gruppe A einen Oberflächenrezeptor besitzen, der Wirtszellplasmin bindet, nicht jedoch dessen Vorläufer Plasminogen, vgl. Lottenberg et al. (1987), Infect. Immun. 55:1914-1928; Broeseker et al. (1988), Microbial Pathogenesis 5:19-27. Plasmin ist ein Protease, die Fibrin, extrazelluläre Matrixproteine und verschiedene Plasmaproteine hydrolysieren kann. Daher kann es sich dabei um einen wichtigen Virulenzmechanismus bei Bakterien und um ein potentielles Immunogen handeln.

Offenbarung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß Untereinheit-Vakzine, die auf aus P. haemolytica isolierten ausgewählten Antigenen basieren, Rinder vor durch dieses Bakterium hervorgerufenen Atemwegserkrankungen wie der Pneumonie, einschließlich der "Shipping-fever"-Pneumonie, schützen. Diese Untereinheit- Vakzine scheinen wesentlich besser zu schützen als Vakzine des Standes der Technik. Darüber hinaus können diese Untereinheit-Vakzine durch Anwendung der DNA-Rekombinationstechnologie oder durch chemische Extraktion hergestellt werden. Auf der Grundlage dieser Entdeckungen kann die vorliegende Erfindung verschiedene Ausführungsformen annehmen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzinzusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine ein abgeschnittenes Leukotoxin aus P. haemolytica enthaltende Untereinheit-Antigenzusammensetzung enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Vakzinzusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein Adjuvans und eine ein immunogenes Polypeptid, das eine immunogene Aminosäuresecuenz eines abgeschnittenen Leukotoxins aus P. haemolytica aufweist, enthaltende Untereinheit-Antigenzusammensetzung und einen Salzextrakt von P. haemolytica.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen DNA-Konstrukte, welche eine Expressionskassette enthalten, die (a) die in Figur 5 dargestellte isolierte Nukleotidsequenz und (b) funktionsfähig an die kodierende Sequenz gebundene Kontrollsequenzen umfaßt, wodurch die kodierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das Plasmid pAA352 (ATCC 68283).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner mit diesen Konstrukten transformierte Wirtszellen sowie Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Polypeptiden, die in einem Untereinheit-Vakzin gegen P. haemolytica verwendbar sind.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Impfverfahren zur Verhütung oder Besserung von Atemwegserkrankungen bei einem Wiederkäuer.
Diese und weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann anhand der hier gegebenen Offenbarung ohne weiteres klar.

Kurzbeschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Struktur des Leukotoxingens von P. haemolytica, das in E. coli kloniert wurde (Plasmid pAA114).
Figur 2 zeigt die Struktur von Plasmid pAA101.
Figur 3 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des lktA::lacZ-Fusionsproteins aus Plasmid pAA101. Der das Leukotoxinprotein lktA darstellende Teil ist umrahmt.
Figur 4 zeigt die Struktur des Plasmids pAA352, wobei tac der trp::lac-Hybridpromotor aus E. coli ist, bla das beta-Lactamasegen (Ampicillinresistenz) darstellt, on der auf Cole1 basierende Replikationsursprung des Plasmids ist, lktA das Strukturgen für das Leukotoxin von Pasteurella haemolytica und lac1 der lac-Operonrepressor von E. coli ist. Die Richtung der Transkription/Translation des Leukotoxingens wird durch den Pfeil angezeigt. Die Größe jedes Bestandteils ist nicht maßstabsgerecht dargestellt.
Figur 5 zeigt die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Leukotoxins 352 (LKT 352) aus dem Plasmid pAA352. Sowohl das Strukturgen für LKT 352 als auch die Sequenzen der flankierenden Vektorregionen sind dargestellt.

Detaillierte Beschreibung

Zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der Virologie, der DNA-Rekombinationstechnologie und der Immunologie angewendet, die dem Fachmann geläufig sind. Diese Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt, vgl. z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Oloning, Bd. I und II (D.N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonudeotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney, Hrsg., 1986); Immobilized Cells and Enzyms (IRL press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe Methods in Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.) und Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986, Blackwell Scientific Publications).

A. Definitionen

Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen verwendet, die wie nachstehend angegeben definiert sind.
"Antigen" bezieht sich auf ein ein- oder mehrere Epitope enthaltendes Molekül, welches das Immunsystem eines Wirts zur humoralen und/oder zellulären antigenspezifischen Reaktion stimuliert. Die Bezeichnung wird ferner austauschbar mit "Immunogen" verwendet.
Ein "Hapten" ist ein ein oder mehrere Epitope enthaltendes Molekül, welches das Immunsystem eines Wirts nicht zur humoralen oder zellulären Reaktion stimuliert, solange es nicht an einen Träger gebunden ist.
Die Bezeichnung "antigene Determinante" bezieht sich auf die Stelle an einem Antigen oder Hapten, an welche ein spezifisches Antikörpermolekül bindet. Diese Bezeichnung wird ferner austauschbar mit "Epitop" oder "Stelle mit antigener Determinante" verwendet.
Eine "immunologische Reaktion" auf eine Zusammensetzung oder ein Vakzin ist die Entwicklung einer zellulären und/oder durch Antikörper vermittelten Immunantwort auf die betreffende Zusammensetzung oder das betreffende Vakzin in dem Wirt. Gewöhnlich besteht eine derartige Reaktion daraus, daß der Patient Antikörper, B-Zellen, Helfer-T- Zellen, Supressor-T-Zellen und/oder zytotoxische T-Zellen bildet, die spezifisch gegen ein in der betreffenden Zusammensetzung oder dem betreffenden Vakzin enthaltenes Antigen oder Antigene gerichtet sind.
Ein "immunogenes"Polypeptid oder eine "immunogene Aminosäuresequenz" ist ein Polypeptid bzw. eine Aminosäuresequenz, die in einem Patienten, an den sie verabreicht wurde, eine immunologische Reaktion hervorruft.
Mit "Untereinheit-Antigenzusammensetzung" ist eine Zusammensetzung gemeint, die mindestens ein immunogenes Polypeptid, aber nicht sämtliche Antigene, enthält, das von einem Antigen des betreffenden Pathogens stammt oder homolog dazu ist. Eine derartige Zusammensetzung ist von intakten Pathogenzellen oder -teilchen oder dem Lysat derartiger Zellen oder Teilchen praktisch frei. Statt dessen wird eine "Untereinheit-Antigenzusarnmensetzung" aus zumindest teilweise gereinigten (vorzugsweise im wesentlichen reinen) immunogenen Polypeptiden aus dem Pathogen oder aus rekombinierten Analogen davon hergestellt. Somit kann eine Untereinheit-Antigenzusammensetzung das betreffende Untereinheit-Antigen oder -Antigene praktisch frei von anderen Antigenen oder Polypeptiden des Pathogens enthalten.
Eine "weitgehend angereicherte" Vakzinzusammensetzung ist eine solche, bei der ein Antigen aus einer zellulären Quelle mit einer erhöhten Konzentration an dem gewünschten Antigen oder den gewünschten Antigenen im Vergleich zu der unter normalen Wachstumsbedingungen vorgefundenen Konzentration an dem Antigen oder den Antigenen stammt. Eine Zusammensetzung kann "weitgehend angereichert" werden, indem zusätzliche Mengen an einem oder mehreren der Antigene zu der Zusammensetzung gegeben werden, durch Veränderung der Wachstumsbedingungen zur Erhöhung der Bildung des gewünschten Antigens oder der gewünschten Antigene oder durch selektive Fraktionierung eines Zelllysats zur Erhöhung der Menge an dem gewünschten Antigen oder den gewünschten Antigenen.
Die Bezeichnung "Protein" bezieht sich hier auf ein natürlich vorkommendes Polypeptid. Die Bezeichnung "Polypeptid" wird im weitesten Sinne verwendet, d.h. für ein beliebiges Polymer aus durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäuren (Dipeptid oder größer). Somit umfaßt die Bezeichnung "Polypeptid" Proteine, Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoge, Muteine, Fusionsproteine und dgl.
"Native" Proteine oder Polypeptide sind aus einer in der Natur vorkommenden Quelle gewonnene Proteine oder Polypeptide. Daher umfaßt die Bezeichnung "natives Polypeptid aus P. haemolytica" natürlich vorkommende Proteine aus P. haemolytica und Fragmente davon. "Rekombinierte" Polypeptide sind durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellte Polypeptide, d.h. von mit einem exogenen DNA-Konstrukt, welches das gewünschte Polypeptid kodiert, transformierten Zellen gebildete. "Synthetische" Polypeptide sind durch chemische Synthese hergestellt.
Ein "Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z.B. ein Plasmid, Chromosom, Virus), das in vivo als autonome DNA-Replikationseinheit funktioniert, d.h. unter eigener Kontrolle zur Replikation fähig ist.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, beispielsweise ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment zur Replikation des gebundenen Segments gebunden werden kann.
Die Bezeichnung "doppelsträngiges DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Deoxyribonukleotiden (die Basen Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) in Form einer doppelsträngigen Helix, die sowohl in entspannter als auch in supergeknäuelter Form vorliegen kann. Diese Bezeichnung bezieht sich nur auf die primäre und die sekundäre Struktur des Moleküls und beschränkt sie nicht auf irgendwelche bestimmten tertiären Formen. Daher umfaßt die Bezeichnung doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen DNA- Molekülen (z.B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmiden und Chromosomen vorgefunden wird. Bei der Erörterung der Struktur besonderer doppelsträngiger DNA-Moleküle werden die Sequenzen hier gemäß der normalen Übereinkunft, nach der nur die Sequenz von der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten DNA-Stranges (d.h. des Stranges mit der zur mRNA homologen Sequenz) angegeben wird, beschrieben.
Eine "kodierende Sequenz" einer DNA ist eine DNA-Sequenz, welche in vivo zu einem Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startkodon am 5' (Amino)-Terminus und ein Translationsstopkodon am 3'(Carboxy)-Terminus festgelegt. Eine kodierende Sequenz kann, ohne darauf beschränkt zu sein, prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA- Sequenzen von eukaryotischer (z.B. Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen. Die Transkriptionsterminationssequenz ist gewöhnlich 3' zur kodierenden Sequenz lokalisiert.
Eine "Promotorsequenz" ist ein DNA-Regulationsregion, die in einer Zelle RNA-Polymerase binden und die Transkription einer sich stromabwärts (3'-Richtung) befindlichen kodierenden Sequenz initiieren kann. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz am 3'-Terminus durch das Translationsstartkodon (ATG) einer kodierenden Sequenz gebunden, erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung) und schließt die minimale Anzahl an Basen oder Elementen ein, die zur Initiation der Transkription in einer Stärke, die nachweisbar über dem Hintergrund liegt, erforderlich ist. Innerhalb der Promotorsequenz befindet sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (die bequemerweise durch Kartierung mit Nuklease S1 definiert wird) sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensus-Sequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten häufig, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen neben den -10- und -35-Konsensussequenzen.
Die Bezeichnung "DNA-Kontrollsequenzen" bezieht sich kollektiv auf Promotorsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsterminationssequenzen, stromaufwärts liegende Regulationsdomänen, Enhancer und dgl., die zusammen für die Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle verantwortlich sind.
Eine kodierende Sequenz ist "funktionsfähig gebunden" an oder "unter der Kontrolle" von Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase an die Promotorsequenz bindet und die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das von der kodierenden Sequenz kodierte Polypeptid translatiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die mit einer exogenen DNA-Sequenz transformiert wurde oder transformiert werden kann.
Eine Zelle ist durch exogene DNA "transformiert" worden, wenn eine derartige exogene DNA durch die Zellmembran eingeführt worden ist. Die exogene DNA kann in die chromosomale DNA, welche das Genom der Zelle darstellt, integriert (durch kovalente Bindung) werden oder auch nicht. Beispielsweise kann in Procaryoten und Hefen die exogene DNA auf einem episomalen Element, beispielsweise einem Plasmid, bewahrt werden. Im Hinblick auf eukaryotische Zellen bedeutet eine stabil transformierte Zelle eine solche, bei der die exogene DNA so in das Chromosom integriert worden ist, daß sie durch Chromosomenreplikation von Tochterzellen weitervererbt wird. Diese Stabilität wird dadurch demonstriert, daß die eukaryotische Zelle in der Lage ist, Zellinien oder Klone zu etablieren, die aus einer die exogene DNA enthaltenden Population von Tochterzellen bestehen.
Ein "Klon" ist eine Zellpopulation, die durch Mitose von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorläufer abstammt. Eine "Zellinie" ist ein Klon einer Primärzelle, der viele Generationen in vitro stabil wachsen kann.
Zwei DNA- oder Polypeptidsequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 80 % (vorzugsweise mindestens etwa 90 % und am bevorzugtesten mindestens etwa 95 %) der Nukleotide oder Aminosäuren in einem Abschnitt des Molekül mit definierter Länge zusammenpassen. Im wesentlichen homologe DNA-Sequenzen können in einem Southern- Hybridisierungsversuch unter beispielsweise stringenten Bedingungen wie sie für das bestimmte System definiert sind, identifiziert werden. Die Festlegung geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Bde. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Die Bezeichnung "funktionell äquivalent" bedeutet, daß das betreffende Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die eine einem immunogenen Polypeptid aus P. haemolytica äquivalente immunologische Reaktion, wie sie oben definiert ist, hervorruft.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment, das sich in einem anderen DNA-Molekül, das in der Natur nicht in Verbindung mit dem anderen Molekül vorgefunden wird, befindet oder daran gebunden ist. Wenn somit die heterologe Region ein bakterielles Gen kodiert, ist das Gen gewöhnlich von DNA flankiert, welche das bakterielle Gen in dem Genom der Ursprungsbakterien nicht flankiert. Ein weiteres Beispiel für die heterologe kodierende Sequenz ist ein Konstrukt, bei dem die kodierende Sequenz selber nicht in der Natur vorgefunden wird (z.B. synthetische Sequenzen mit sich vom nativen Gen unterscheidenden Kodonen). Die Allel-Variation oder die natürlich auftretende Mutation ergeben keine heterologe DNA-Region, sowie es hier darunter verstanden wird.
Eine A enthaltene Zusammensetzung ist "praktisch frei" von B, wenn A mindestens etwa 85 Gew.-% des Gesamtgewichts von A + B in der Zusammensetzung ausmacht. Vorzugsweise macht A mindestens etwa 90 Gew.-% des Gesamtgewichts von A + B in der Zusammensetzung aus und noch bevorzugter mindestens etwa 95 Gew.-% oder sogar 99 Gew.-%.
Die Angabe "Behandlung" bezieht sich hier entweder auf (i) die Verhütung der Infektion oder Reinfektion (Prophylaxe) oder (ii) die Abschwächung oder Beseitigung der Symptome oder der betreffenden Erkrankung (Therapie).

B. Allgemeine Verfahren

Der Kern der vorliegenden Erfindung beruht auf der Feststellung, daß in einer Vakzinzusammensetzung zum Schutz von Tieren gegen Atemwegserkrankungen wie Pneumonie, einschließlich "Shipping-fever"-Pneumonie, ein abgeschnittenes Leukotoxin aus P. haemolytica verwendet werden kann, und zwar entweder alleine oder in Kombination. Dieses Protein kann durch Salz extrahierten Antigenen, Natriumsalicylat- Kapselextrakten oder Antigenen, die nach anderen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren extrahiert wurden, zur Herstellung eines Vakzins zum Schutz von Tieren gegen "Shipping-fever" oder andere Atmenwegserkrankungen kombiniert werden.
Es ist gezeigt worden, daß aktiv wachsende Zellen von P. haemolytica ein Leukotoxin sezernieren, das auch kloniert, exprimiert und entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren der obigen Antigene zur Immunisierung von Patienten gegen "Shipping-fever" verwendet werden kann. Die das Leukotoxin aus P. haemolytica A1 kodierende Nukleotidsequenz ist bestimmt worden, vgl. z.B. Lo, R.Y.C. (1987), Infect. Immun. 55:1987-1996. Wichtig ist die Tatsache, daß das Gen für das Leukotoxin aus P. Haemolytica und das entsprechende Protein weitgehend zum α-Hämolysin aus Escherichia coli homolog sind (50,3 % der Aminosäurereste sind identisch), vgl. Strathdee, C.A., und Lo, R.Y.C. (1987), Infec. Immun. 55:3233-3236. Das Leukotoxin aus P. haemolytica kann unter Anwendung von Rekombinationstechniken hergestellt und beispielsweise aus Bakterienzellen gereinigt werden. Das Leukotoxin kann ferner durch Immunadsorptionschromatographie aus nativen Bakterien gereinigt werden. Das Molekulargewicht des gereinigten Leukotoxins beträgt etwa 95 000, und der isoelektrische Punkt liegt bei 6,3.
Die Salzextrakte von P. haemolytica können ebenfalls mit dem obigen Untereinheit-Antigen kombiniert werden. Diese Extrakte werden hergestellt, indem die Proteine mit einer 0,85%igen (G/V) Natriumchlorid-Lösung extrahiert werden. Der Extrakt kann außerdem beispielsweise mit Glasperlen und durch Schütteln oder nach anderen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zur Entfernung von Zelloberflächenproteinen behandelt werden. Die Kombination aus derartigen Salzextrakten mit isoliertem oder durch Rekombination hergestelltem Leukotoxin ergibt einen starken Schutz gegen das "Shipping-fever".
Die hier beschriebene Reinigung der obigen Antigene gestattet deren Sequenzierung nach einem beliebigen der dem Fachmann bekannten verschiedenen Verfahren. Beispielsweise können die Aminosäuresequenzen der betreffenden Proteine durch sich wiederholende Zyklen des Edman-Abbaus der gereinigten Proteine mit sich anschließender Aminosäureanalyse durch HPLC ermittelt werden. Auf dem Fachgebiet sind außerdem andere Verfahren zur Aminosäuresequenzierung bekannt.
Nachdem die Aminosäuresequenzen ermittelt sind, können Oligonukleotidsonden, welche die Kodonen für einen Teil der ermittelten Aminosäuresequenzen enthalten, hergestellt und zur Durchmusterung von DNA-Bibliotheken nach den die betreffenden Proteine kodierenden Genen verwendet werden.
Die grundlegenden Strategien zur Herstellung von Oligonukleotidsonden und DNA-Bibliotheken sowie zu deren Durchmusterung durch Nukleinsäurehybridisierung sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. z.B. DNA Cloning: Bd. I, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; T. Maniatis et al., supra.
Zuerst wird eine DNA-Bibliothek hergestellt. Die Bibliothek kann aus einer genomischen DNA-Bibliothek von P. haemolytica bestehen. Nachdem die Bibliothek hergestellt ist, werden Oligonukleotide zur Sondierung der Bibliothek hergestellt und zur Isolierung des das gewünschte Protein kodierenden Gens verwendet. Die Oligonukleotide werden nach einem beliebigen geeigneten Verfahren synthetisiert. Die ausgewählten konkreten Nukleotidsequenzen werden so gewählt, daß sie den Kodonen entsprechen, welche eine bekannte Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins aus P. haemolytica kodieren. Da der genetische Code degeneriert ist, wird es häufig erforderlich sein, mehrere Oligonukleotide zur synthetisieren, um sämtliche oder eine beträchtliche Anzahl der möglichen Nukleotidsequenzen, die eine bestimmte Region des Proteins kodieren, abzudecken. Daher wird im allgemeinen vorzugsweise eine Region, auf der die Sonden basieren sollen, so ausgewählt, daß die Region keine Aminosäuren enthält, deren Kodonen stark degeneriert sind. Unter bestimmtem Umständen kann es für den Fachmann angebracht sein, Sonden herzustellen, die ziemlich lang sind und/oder Regionen der Aminosäuresequenz umfassen, die hinsichtlich der korrespondierenden Nukleinsäuresequenzen eine hohe Redundanz haben, und zwar insbesondere dann, wenn diese lange und/oder redundante Region für das betreffende Protein stark charakteristisch ist. Ferner kann die Verwendung von zwei Sonden (oder Sondensätzen), jeweils für unterschiedliche Regionen des Gens, in einem einzelnen Hybridisierungsexperiment angebracht sein. Durch die automatisierte Oligonukleotidsynthese ist die Herstellung von großen Sondenfamilien verhältnismäßig einfach. Die genaue Länge der verwendeten Sonde ist zwar im allgemeinen nicht kritisch, jedoch ist auf dem Fachgebiet allgemein anerkannt, daß Sonden mit etwa 14 bis etwa 20 Basenpaaren gewöhnlich effektiv sind. Es können auch längere Sonden mit etwa 25 bis etwa 60 Basenpaaren verwendet werden.
Die ausgewählten Oligonukleotidsonden werden unter Anwendung von Standardverfahren mit einem Marker, beispielsweise einem Radionukleotid oder Biotin markiert. Der markierte Sondensatz wird dann in dem Durchmusterungsschritt verwendet, der daraus besteht, daß die einzelsträngige Sonde nach Standardtechniken an isolierte ssDNA aus der Bibliothek hybridisieren gelassen wird. Dafür können in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, beispielsweise der Länge der Sonde und ob die Sonde von der gleichen Spezies wie die Bibliothek oder von einer in der Evolution näher oder ferner stehenden Spezies stammt, entweder stringente oder permissive Hybridisierungsbedingungen geeignet sein. Die Auswahl der geeigneten Bedingungen ist Handwerkszeug, vgl. allgemein Nucleic Acid Hybridization, supra. Das Grunderfordernis ist, daß die Hybridisierungsbedingungen so ausreichend stringent sind, daß es zur selektiven Hybridisierung kommt, d.h. zu einer Hybridisierung, die auf einer ausreichenden Nukleinsäurehomologie (z.B. mindestens etwa 75 %) beruht und nicht auf unspezifischer Bindung. Nachdem ein Klon aus der durchmusterten Bibliothek durch positive Hybridisierung identifiziert worden ist, kann durch Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden, daß das bestimmte Bibliothekinsert ein Gen für das gewünschte Protein enthält.
Alternativ können die DNA-Sequenzen, welche die betreffenden Proteine kodieren, statt kloniert zu werden, synthetisch hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann mit den geeigneten Kodonen für die bestimmte Pasteurella-Aminosäuresequenz konstruiert werden. Im allgemeinen werden die bevorzugten Kodonen des betreffenden Wirtes ausgewählt, wenn die Sequenz zur Expression verwendet werden soll. Die vollständige Sequenz wird aus nach Standardverfahren hergestellten, sich überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt und zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengebaut, vgl. z.B. Edge (1981), Nature 292:756, Nambair et al. (1984), Science 223:1299; Jay et al. (1984), J. Biol. Chem. 259:6311.
Nachdem eine kodierende Sequenz für das gewünschte Protein hergestellt oder isoliert worden ist, kann sie in einen beliebigen geeigneten Vektor oder ein beliebiges Replikon kloniert werden. Dem Fachmann sind zahlreiche Kloniervektoren bekannt, und die Selektion eines geeigneten Kloniervektors ist eine Frage der Auswahl. Beispiele für Vektoren zur Klonierung von rekombinierter DNA und Wirtszellen, welche diese transformieren können, sind der Bacteriophage Lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (gram-negativen Bakterien), pGV1106 (gram-negative Bakterien), pLAFR1 (gram-negative Bakterien), pME290 (gram-negative Nicht-E.-coli-Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und der Rinder- Papillomvirus (Säugerzellen), vgl. allgemein DNA Cloning: Bde. I & II, supra; T. Maniatis et al., supra; B. Perbal, supra.
Die kodierende Sequenz für das betreffende Pasteurella- Protein kann unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (für die bakterielle Expression) und gegebenenfalls eines Operators (die hier gemeinsam mit "Kontrollelemente" bezeichnet werden) gestellt werden, so daß die das Protein kodierende DNA-Sequenz in der durch einen diese Expressionskonstruktion enthaltenden Vektor transformierte Wirtszelle in RNA transkribiert wird. Die kodierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz enthalten oder auch nicht. Die Proteine aus P. haemolytica der vorliegenden Erfindung mit voller Länge können beispielsweise unter Verwendung des nativen Promotors von P. haemolytica oder des Promotors des Protein-A- Gens(spa) und dessen Signalsequenz exprimiert werden. Abgeschnittene Versionen der betreffenden Gene können sowohl Fusionen mit dem B-Galactosidasegen (lacZ) als auch mit den Galactokinase (galK) und Interleukin-2 (Rind) kodierenden Genen sein. Die Leadersequenzen können vom Bakterienwirt bei der post-transiationalen Prozessierung entfernt werden, vgl. z.B. die US-Patente 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397.
Abgesehen von den Kontrollsequenzen kann es angebracht sein, Regulationssequenzen hinzuzufügen, welche die Regulation der Expression der bakteriellen Antigensequenzen in Abhängigkeit vom Wachstum der Wirtszellen gestatten. Regulationssequenzen sind dem Fachmann bekannt, und Beispiele dafür sind solche, die als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, beispielsweise das Vorhandensein einer Regulationsverbindung, die Expression eines Gens an- oder ausschalten. In dem Vektor können ferner andere Typen von Regulationselementen vorhanden sein, beispielsweise Enhancersequenzen. Die betreffenden Proteine können ferner in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden, bei dem eine heterologe Aminosäuresequenz am N- Terminus exprimiert wird, vgl. z.B. US-Patente 4 431 739, 4 425 437.
Ein Expressionsvektor wird so kontruiert, daß die bestimmte kodierende Sequenz sich mit den geeigneten Regulationssequenzen in dem Vektor befindet, wobei die Positionierung und Orientierung der kodierenden Sequenz bezüglich der Kontrollsequenzen derart ist, daß die kodierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d.h. die RNA-Polymerase, welche an die Kontrollsequenzen des DNA-Moleküls bindet, transkribiert die kodierende Sequenz). Zur Erzielung dieses Ergebnisses kann die Modifizierung der das betreffende konkrete Antigen kodierenden Sequenzen angebracht sein. Beispielsweise kann es in einigen Fällen erforderlich sein, die Sequenz so zu modifizieren, daß sie in der geeigneten Orientierung an die Kontrollsequenzen gebunden werden kann, d.h. um das Leseraster beizubehalten. Die Kontrollsequenzen und andere Regulationssequenzen können vor der Insertion in einen Vektor, beispielsweise die oben beschriebenen Kloniervektoren, an die kodierende Sequenz ligiert werden. Alternativ kann die kodierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält.
In einigen Fällen kann es angebracht sein, Sequenzen hinzuzufügen, welche die Sekretion des Polypeptids aus dem Wirtsorganismus unter anschließender Abspaltung des Sekretionssignals bewirken. Ferner kann es angebracht sein, Mutanten oder Analoge des betreffenden Antigens herzustellen. Mutanten oder Analoge können durch die Deletion eines Teils der das Antigen kodierenden Sequenz, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz hergestellt werden. Techniken zur Modifizierung von Nukleotidsequenzen, beispielsweise die ortsgerichtete Mutagenese, sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. z.B. T. Maniatis et al., supra, DNA Cloning, Bde. I und II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Auf dem Fachgebiet ist eine Anzahl prokaryotischer Expressionsvektoren bekannt, vgl. z.B. US-Patente 4 440 859, 4 436 815, 4 431 740, 4 431 739, 4 428 941, 4 425 437, 4 418 149, 4 411 994, 4 366 246, 4 342 832, sowie ferner die UK-Patentanmeldungen GB 2 121 054, GB 2 008 123, GB 2 007 675 und die europäische Patentanmeldung 103 395. Hefe-Expressionsvektoren sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. US-Patente 4 446 235, 4 443 539, 4 430 428 sowie ferner die europäischen Patentanmeldungen 103 409, 100 561, 96 491.
In Abhängigkeit vom Expressionssystem und dem ausgewählten Wirt werden die Proteine der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem mit einem oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte Wirtszellen unter Bedingungen, unter denen das betreffende Protein exprimiert wird, angezüchtet werden. Das bestimmte Pasteurella-Protein wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn des Expressionssystem das Protein in die Nährmedien sezerniert, kann das Protein direkt aus dem Medium gereinigt werden. Wenn das Protein nicht sezerniert wird, wird es aus Zelilysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Anzuchtbedingungen und Gewinnungsverfahren sind Handwerkszeug.
Bei einem alternativen Verfahren zur Identifizierung von Antigenen der vorliegenden Erfindung werden Genbibliotheken konstruiert, indem die sich ergebenden Klone zur Transformation von E. coli verwendet und einzelne Kolonien unter Verwendung von polyklonalem Serum oder monoklonalen Antikörpern gegen das gewünschte Antigen gepoolt und durchmustert werden.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können ferner aus P.-Haemolytica-Kulturen unter Anwendung von Standard- Proteinreinigungsverfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, vgl. z.B. Protein Purification Principles and Practice, 2. Auflage (Robert K. Scopes, Hrsg., 1987), isoliert werden. Diese Techniken umfassen die Gelfiltrationschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie, die Immunadsorptionschromatographie, die Polyacrylamid-Gelelektrophorese und andere elektrophoretische Techniken, die Zentrifugation, die Dialyse und die Ausfällung.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können ferner durch chemische Synthese, z.B. Festphasenpeptidsynthese, unter Verwendung bekannter Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, die von der DNA-Sequenz des betreffenden Gens abgeleitet wurden, hergestellt werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Die chemische Synthese von Peptiden kann vorzuziehen sein, wenn ein kleines Fragment des fraglichen Antigens eine immunologische Reaktion in dem betreffenden Patienten hervorrufen kann.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung oder ihre Fragmente können zur Herstellung von Antikörpern, und zwar sowohl polyklonalen als auch monoklonalen, verwendet werden. Wenn polyklonale Antikörper erwünscht sind, wird ein ausgewählter Säuger (z.B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd usw.) mit einem Antigen der vorliegenden Erfindung oder seinem Fragment oder einem mutierten Antigen immunisiert. Das Serum des immunisierten Tieres wird gesammelt und nach bekannten Verfahren behandelt. Wenn polyklonale Antikörper enthaltendes Serum verwendet wird, können die polyklonalen Antikörper durch Immunaffinitätschromatographie unter Anwendung bekannter Verfahren gereinigt werden.
Der Fachmann kann ferner ohne weiteres monoklonale Antikörper gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung oder gegen deren Fragmente herstellen. Die allgemeine Vorgehensweise zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit Hybridomen ist gut bekannt. Unsterbliche, Antikörper bildende Zellinien können durch Zelifusion und auch durch andere Techniken, z.B. durch die direkte Transformation von B-Lyphozyten mit onkogener DNA oder durch Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus, erzeugt werden, vgl. z.B. M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980), Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981), Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980), sowie ferner 4 452 570, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632 und 4 493 890. Die gegen das betreffende Antigen oder ein Fragment davon gebildeten Gruppen monoklonaler Antikörper können hinsichtlich verschiedener Eigenschaften durchmustert werden, beispielsweise hinsichtlich des Isotyps, des Epitops, der Affinität usw. Monoklonale Antikörper sind unter Anwendung von Immunaffinitätstechniken zur Reinigung der Antigene verwendbar, gegen die sie gerichtet sind.
Die Tiere können mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch Verabreichung des betreffenden Proteins oder eines Fragments davon oder eines Analogen davon immunisiert werden. Wenn das Fragment oder Analoge verwendet wird, umfaßt es die Aminosäuresequenz des Epitops, das mit dem Immunsystem zur Immunisierung des Tieres gegen dieses und strukturell ähnliche Epitope in Wechselwirkung tritt.
Die zur Immunisierung eines Patienten verwendeten Fragmente enthalten mindestens 6-30 Aminosäuren, welche die Sequenz des gewünschten Proteins bilden und das bestimmte Epitop enthalten. In größere Peptide oder Polypeptide können das Epitop umfassende kleinere Fragmente so insertiert werden, daß die das Epitop flankierenden Regionen nicht diejenigen sind, die von den natürlich vorkommenden Genen kodiert werden. Die Techniken zur Synthese dieser Peptide oder Polypeptide sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann die ein bestimmtes Antigen kodierende Gensequenz durch Klonierung isoliert und die Sequenz an Stellen verändert werden, die das bestimmte Epitop nicht kodieren. Diese Veränderung kann durch ortsgerichtete Mutation oder durch Deletionen oder durch Insertionen bewirkt werden. Alternativ kann eine das Epitop kodierende Oligonukleotidsequenz in eine andere Sequenz, die ein anderes Peptid oder Polypeptid kodiert, insertiert oder daran gebunden werden. Dann wird eine rekombinierte Sequenz in einem Expressionsvektor insertiert, der mit dem zu transformierenden Wirt verträglich ist, und das Expressionssystem zur Synthese des gewünschten Peptids, welches das bestimmte Epitop enthält, verwendet. Die Techniken, mit denen dies bewirkt werden kann, sind dem Fachmann bekannt, vgl. z.B. T. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Bde. I und II, supra und Nucleic Acid Hybridization, supra. Alternativ kann ein Oligopeptid durch Festphasensynthese synthetisiert werden, welches das bestimmte Epitop enthält, wobei aber flankierende Aminosäuren hinzugefügt werden, die in der Sequenz des natürlich vorkommenden Antigens nicht enthalten sind.
Es kann angebracht sein, vor der Immunisierung die Immunogenität des bestimmten Pasteurella-Proteins oder eines Analogen des Proteins oder insbesondere der Fragmente des Proteins zu steigern. Dies kann mit einem beliebigen einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, bewirkt werden. Beispielsweise kann das antigene Peptid an einen Träger gebunden verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein Fragment mit einem makromolekularen Träger konjugiert werden. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie beispielsweise: Proteine, Polysaccharide, z.B. Sepharose, Agarose, Cellulose, Celluloseperlen und dgl., polymere Aminosäuren, z.B. Polyglutaminsäure, Polylysin und dgl., Aminosäure-Copolymere und inaktive Virus-Partikel. Besonders günstige Proteinsubstrate sind Serumalbumine, Schlüssellochnapfschnecken- Hämocyanin, Immunglobulin-Moleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere dem Fachmann gut bekannte Proteine.
Die Proteinsubstrate können in ihrer nativen Form verwendet werden, oder ihr Gehalt an funktionellen Gruppen kann beispielsweise durch Succinylierung der Lysin-Reste oder durch Umsetzung mit Cys-Thiolacton modifiziert werden. Ferner kann eine Sulfhydryl-Gruppe in den Träger (oder das Antigen) eingeführt werden, indem beispielsweise die Amino- Funktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(4-Dithiopyridylpropionat) umgesetzt werden. Geeignete Träger können ferner so modifiziert werden, daß sie Spacerarme (beispielsweise Hexamethylendiamin oder andere bifunktionelle Moleküle mit änlicher Größe) zur Befestigung von Peptiden enthalten.
Andere geeignete Träger für die Proteine/Fragmente/Analogen der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise die VP6- Polypeptide von Rotaviren oder funktionelle Fragmente davon. Ein Fusionsprodukt eines viralen Proteins und des betreffenden Epitops, das nach den im US-Patent 4 722 840 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, ist ebenfalls verwendbar. Weitere geeignete Träger sind beispielsweise Zellen, z.B. Lymphozyten, da durch die Präsentation in dieser Form die natürliche Präsentation in dem Patienten, durch welche sich der immunisierte Zustand ergibt, nachgeahmt wird. Alternativ können die Antigene der vorliegenden Erfindung oder ein antigenes Fragment davon oder ein Analoges davon an Erythrozyten gekuppelt werden, und zwar vorzugsweise an die eigenen Erythrozyten des Patienten. Verfahren zur Kupplung von Peptiden an Proteine oder Zellen sind dem Fachmann bekannt.
Darüber hinaus ist es möglich, einen Patienten mit einem Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Schutzfragment oder einem Analogen davon zu immunisieren, das alleine, oder mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel oder Träger vermischt, verabreicht wird. Typischerweise werden Vakzine in Form von Injektionen hergestellt, und zwar entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen. Außerdem können feste Formen hergestellt werden, die vor der Injektion in flüssigen Vehikeln gelöst oder suspendiert werden können. Die Präparation kann ferner emulgiert werden, oder der Wirkstoff wird in Liposomenvehikeln verkapselt. Der immunogene Wirkstoff wird häufig mit Vehikeln vermischt, die pharmazeutisch akzeptable und mit dem Wirkstoff verträgliche Träger enthalten. Geeignete Vehikel sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dgl. und Kombinationen daraus. Darüber hinaus kann, wenn dies erwünscht ist, das Vehikel geringe Menge Hilfssubstanzen enthalten, beispielsweise Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien, welche die Wirksamkeit des Vakzins erhöhen. Adjuvantien sind beispielsweise Muramyldipeptide, Avridin, Aluminiumhydroxid, Öle, Saponine und andere auf dem Fachgebiet bekannte Substanzen. Effektive Verfahren zur Herstellung derartiger Dosierformen sind dem Fachmann bekannt oder klar, vgl. z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. Auflage, 1975. Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung enthält in jedem Fall eine Proteinmenge, die zur Erzielung des erwünschten immunisierten Zustandes des behandelten Individuums angemessen ist.
Weitere Vakzinformulierungen, die für andere Verabreichungswege geeignet sind, umfassen Suppositorien und, in einigen Fällen, Aerosolformulierungen, intranasale und orale Formulierungen. Für Suppositorien enthält die Vehikelzusammensetzung herkömmliche Bindemittel und Träger, beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyceride. Diese Suppositorien können aus Gemischen hergestellt werden, die den Wirkstoff in einer Menge im Bereich von etwa 0,5 % bis etwa 10 % (G/G), vorzugsweise etwa 1 % bis etwa 2 %, enthalten. Orale Vehikel umfassen normalerweise verwendete Träger wie beispielsweise Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dgl. einer pharmazeutischen Güteklasse. Diese oralen Vakzinzusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit protrahierter Freisetzung oder Pulvern hergestellt werden und etwa 10 % bis etwa 95 %, vorzugsweise etwa 25 % bis etwa 70 %, des Wirkstoffs enthalten.
Intranasale Formulierungen enthalten gewöhnlich Vehikel, die weder die Nasenschleimhaut reizen noch signifikant die Ziliarfunktion beeinträchtigen. In der vorliegenden Erfindung können Verdünnungsmittel wie Wasser, wäßrige Salzlösung oder andere bekannte Substanzen verwendet werden. Die nasalen Formulierungen können ferner Konservierungsmittel wie beispielsweise Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein. Zur Steigerung der Absorption der betreffenden Proteine durch die Nasenschleimhaut kann ein grenzflächenaktives Mittel enthalten sein.
Darüber hinaus können die Antigene aus P. haemolytica (oder Komplexe davon) in entweder neutraler Form oder in Salzform zu Vakzinzusammensetzungen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze sind beispielsweise Säureadditionssalze (welche mit den freien Amino-Gruppen der wirksamen Polypeptide gebildet werden), die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dgl. hergestellt werden. Mit anorganischen Basen wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dgl. können auch Salze, und zwar mit den freien Carboxy-Gruppen, hergestellt werden.
Zur Immunisierung eines Patienten wird das betreffende Polypeptid oder ein immunologisch wirksames Fragment davon parenteral verabreicht, und zwar gewöhnlich durch intramuskuläre Injektion in einem geeigneten Vehikel. Andere Verabreichungswege wie die subkutane und intravenöse Injektion und die intranasale Abgabe sind jedoch ebenfalls akzeptabel. Injizierbare Vakzinformulierungen enthalten eine wirksame Menge des Wirkstoffs in einem Vehikel, wobei die genaue Menge ohne weiteres vom Fachmann ermittelt wird. Der Wirkstoff kann typischerweise in einer Menge im Bereich von 1 % bis etwa 95 % (G/G) der Zusammensetzung vorliegen oder sogar in einer höheren oder geringeren Menge, wenn dies angebracht ist. Die zur verabreichende Menge ist von dem zu behandelnden Tier, der Kapazität des Immunsystems des Tieres zur Synthese von Antikörpern und dem erwünschten Schutzausmaß abhängig. Es wurde gefunden, daß bei den vorliegenden Vakzinformulierungen 50 µg Wirkstoff pro ml injizierte Lösung zur Hervorrufung einer immunologischen Reaktion angemessen sind, wenn eine Dosis von 1 bis 5 ml pro Tier verabreicht wird. Durch Routineversuche zur Ermittlung von Dosis-Wirkungs-Kurven kann der Durchschnittsfachmann ohne weiteres andere wirksame Dosierungen ermitteln. Der Patient wird durch Verabreichung des bestimmten Antigens oder eines Fragments oder eines Analogen davon in mindestens einer Dosis, vorzugsweise zwei Dosen, immunisiert. Darüber hinaus können dem Tier so viele Dosen verabreicht werden, wie es zur Aufrechterhaltung der Immunität gegen Pneumonie erforderlich ist.
Es folgen Beispiele für konkrete Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung des Rahmens der vorliegenden Erfindung.

Hinterlegung von zur Durchführung der Erfindung verwendbaren Stämmen

Biologisch reine Kulturen der folgenden Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland hinterlegt. Die angegebene Zugangs-Nr. wurde nach erfolgreich festgestellter Lebensfähigkeit vergeben und die entsprechenden Gebühren gezahlt. Die Kulturen sind während der Anhängigkeit der Patentanmeldung für solche Personen zugänglich, die nach der Entscheidung des Commissioner nach 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 dazu befugt sind. Sämtliche Beschränkungen der Zugänglichkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich nach der Erteilung eines Patentes auf der Grundlage dieser Anmeldung aufgehoben. Darüber hinaus werden die bezeichneten Hinterlegungen für einen Zeitraum von 30 (dreissig) Jahren ab dem Hinterlegungstag oder 5 (fünf) Jahren nach der letzten Anforderung der Hinterlegung oder die Laufzeit des US-Patents, je nachdem was länger ist, aufbewahrt. Sollte eine Kultur nicht lebensfähig werden oder versehentlich zerstört werden oder im Falle von plasmidhaltigen Stämmen ihr Plasmid verlieren, wird sie durch eine lebensfähige Kultur(en) der gleichen taxonomischen Beschreibung ersetzt.

C. Experimentelles

Materialien und Verfahren

Die Enzyme wurden aus dem Handel bezogen und nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Radionukleotide und Nitrocellulose-Filter wurden ebenfalls aus dem Handel bezogen.
Bei der Klonierung von DNA-Fragmenten wurden, sofern nichts anderes angegeben ist, sämtliche DNA-Manipulationen nach Standardverfahren durchgeführt, vgl. T. Maniatis et al., supra. Die Restriktionsenzyme, T&sub4;-DNA-Ligase, E. coli, DNA- Polymerase I, Klenow-Fragment und andere biologische Reagenzien wurden aus dem Handel bezogen und nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Doppelsträngige DNA- Fragmente wurden auf Agarose-Gelen aufgetrennt.
Die cDNA- und genomischen Bibliotheken wurden nach Standardtechniken in pUC13 bzw. im Bacteriophagen Lambda gt11 hergestellt, vgl. DNA CLONING: Bde. I und II, supra.
P. haemolytica, Biotyp A, Serotyp 1 ("A1"), Stamm B122 wurde aus der Lunge eines Kalbes isoliert, das an pulmonaler Pasteurellose gestorben war, und in entfibriniertem Blut bei -70ºC aufbewart. Die Routinevermehrung wurde auf Blutagarplatten oder in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (Difco Laboratories, Detroit, MI), die mit 5 % (V/V) Pferdeserum (Gibco Kanada Ltd., Burlington, Kanada) ergänzt worden war, durchgeführt. Alle Kulturen wurden bei 37ºC inkubiert.

Beispiel 1

Die Schutzkapazität des Leukotoxins aus P. haemolytica und eines 50K-Proteins der äußeren Membran wurde durch Verabreichung der in Tabelle 1 angegebenen rekombinierten und/oder authentischen Produkte an Kälber untersucht.

Tabelle 1

In Beispiel 1 an Kälber verabreichte Proteine

(1) Rekombiniertes 50K-Protein der äußeren Membran.
(2) Kontroll-Gruppe - nur Avridin (Adjunvans).
(3) Authentisches Leukotoxin.
(4) Rekombiniertes Leukotoxin:B-Galactosidase (aus dem nachstehend beschriebenen pAA101).
(5) Rekombiniertes Leukotoxin (aus dem nachstehend beschriebenen pAA352).
(6) Rekombiniertes 50K-Protein der äußeren Membran plus authentisches Leukotoxin.
(7) Rekombiniertes Protein der äußeren Membran plus rekombiniertes Leukotoxin.
(8) Salzextrakt von P. haemolytica.
(9) Salzextrakt plus authentisches Leukotoxin.
(10) Salzextrakt plus rekombiniertes Leukotoxin (aus pAA352).
Die Produkte in Tabelle 1 wurden folgendermaßen hergestellt. Das oben erwähnte 50K-Protein der äußeren Membran gehört nicht zur vorliegenden Erfindung.

Reinigung des authentischen Leukotoxins aus P. haemolytica

P. haemolytica A1 wurde bei 37ºC bis zur mittleren logarithmischen Phase in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (Difco) angezüchtet. Die Zellen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 9 000 Upm unter Verwendung eines Sorval-GSA- Rotors geerntet. Dann wurde der Überstand in einen frischen Kolben überführt und bis zur 70%igen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Gemisch wurde in der Kälte über Nacht gerührt. Anschließend wurde der Niederschlag wie oben durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 10 ml sterilem Wasser pro Liter der ursprünglichen Kultur gelöst. Das gelöste Pellet wurde durch Hindurchleiten durch Sephadex G-25 entsalzt. Dann wurde die gesammelte Probe der präparativen isoelektrischen Fokussierung unter Verwendung einer Rotofor-Apparatur (Biorad Labs) mit einem pH-Gradienten von 5 bis 7 unterzogen. Die Fraktionen oberhalb eines Bereiches von pH 6 bis 7 wurden gepoolt und auf 1,0 M mit NaCl versetzt. Dann wurde die Probe durch eine Sephadex-G-25-Säule geleitet. Das gereinigte Leukotoxin wurden auf ein 12,5%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen. Die Probe enthielt eine Protein-Hauptbande, die einem Molekulargewicht von 95 000 entsprach.

1. Herstellung von rekombiniertem Leukotoxin aus P. haemolytica aus pAA101

Zur Herstellung von rekombiniertem Leukotoxin wurden unter Anwendung von Standardtechniken, vgl. Lo et al., Infect. Immun., supra; DNA CLONING: Bde. I und II, supra, und T. MANIATIS et al., supra, Gen-Bibliotheken von P. haemolytica A1 (Stamm B122) hergestellt. Eine genomische Bibliothek wurde im Plasmidvektor pUC13 und eine DNA-Bibliothek im Bacteriophagen Lamda gt11 konstruiert. Die sich ergebenden Klone wurden zur Transformation von E. coli verwendet. Einzelne Kolonien wurden gepoolt und hinsichtlich der Reaktion mit dem Serum eines Kalbes, das eine Infektion mit P. haemolytica überlebt hatte und mit einem konzentrierten Kulturüberstand von P. haemolytica zur Steigerung der Anti- Leukotoxin-Antikörperspiegel geboostet worden war, durchmustert. Positive Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung des Leukotoxins durchmustert, indem Zelllysate mit neutrophilen Rinderzellen inkubiert und anschließend die Freisetzung von Lactatdehydrogenase aus letzteren bestimmt wurde.
Es wurden mehrere positive Kolonien identifiziert und diese Rekombinierten durch Restriktionsendonukleasekartierung analysiert. Ein Klon enthielt anscheinend ein Gen, das mit einem bereits klonierten Leukotoxingen identisch war, vgl. Lo et al., Infect. Immun, supra. Um dies zu bestätigen, wurden kleinere Fragmente erneut kloniert und die Restriktionskarten verglichen. Es wurde festgestellt, daß etwa 4 Kilobasenpaare DNA kloniert worden waren. Dann wurden progressiv größer werdende Klone durch "Chromosomewalking" (von der 5'-Richtung zur 3'-Richtung) isoliert, um Rekombinierte mit voller Länge, die eine Länge von etwa 8 kb hatten, zu isolieren. Das sich ergebende Konstrukt wurde pAA114 genannt. Dieses Konstrukt enthielt die vollständige Sequenz des Leukotoxingens. Die Struktur dieses Plasmids ist in Figur 1 dargestellt.
Sowohl Versionen mit voller Länge als auch abgeschnittene Versionen des Leukotoxingens wurden exprimiert. Bei den abgeschnittenen Formen handelte es sich um Fusionen mit B- Galactosidase (lacZ). Die Versionen mit voller Länge wurden unter Verwendung des nativen Promotors von P. haemolytica oder des Promotors des Protein-A-Gens (spa) und dessen Signalsequenz exprimiert. Die Klone wurden folgendermaßen konstruiert.
Die Plasmide pLTX1.1 und pLTX3.2 wurden aus der genomischen DNA von P. haemolytica als gereinigte Restriktionsfragmente (1,0 kb bzw. 2,1 kb) einer EcoRV-Pst1-Doppelverdauung isoliert. Diese Fragmente wurden in mit HincII-Pst1-verdautes pTZ18R kloniert. Der Vektor wurde zur Transformation des E.-coli-Stammes JM105 verwendet. Transformierte Zellen wurden durch Ausplattieren auf einem Ampicillin plus Xgal und IPTG enthaltenden Medium identifiziert. Blaue Kolonien zeigten das Vorliegen eines funktionellen lacZ-Gens an. Die DNA aus diesen Kolonien wurde durch Restriktionsendonuklease-Verdauung analysiert und enthielt das 5'-Ende des Leukotoxingens (lktC + lktA). Dieses Plasmid wurde pLTX3P.1 genannt.
Das Plasmid pLTX3P.1 wurde in vitro mit Hydroxylamin mutiert, in JM105 transformiert und auf einem Ampicillin plus eine geringere Konzentration an Xgal enthaltenden Nährmedium ausplattiert. Auf diese Weise werden höhere Mengen des lktA-lacZ-Produkts exprimierende Klone dunkelblau, wohingegen die ein unmodifiziertes Gen enthaltenden weiß oder hellblau werden. Die Klone der dunkelblauen Kolonien wurden pAA134 genannt.
Dann wurde ein Leukotoxin-EcoRV/Pst1-5'-Fragment (aus pLTX3P.1) in mit EcoR1/Pst1 verdauten und den nativen Leukotoxinpromotor (aus pLTX3P.1) plus ein promotorloses lacZ-Gen mit voller Länge aus dem Plasmid pMC1871 (Pst1- Fragment) enthaltenden pBR325 subkloniert. Das Plasmid wurde zur Transformation von E. coli JM105 verwendet. Blaue Kolonien wurden aus Xgal-Agar isoliert. Dieses Plasmid wurde paalol genannt und ist in Figur 2 dargestellt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist in Figur 3 dargestellt.

2. Herstellung des rekombinierten Leukotoxins aus P. haemolytica aus pAA352

Es wurde eine zweite Version des rekombinierten Leukotoxins aus P. haemolytica exprimiert. Dieses Leukotoxin wurde "Leukotoxin 352" oder "LKT 352" genannt. Zur Herstellung dieses Leukotoxins wurde das folgende Genkonstrukt aus dem oben beschrieben pAA114 hergestellt.
lktA, ein MaeI-Restriktionsendonuklease-Fragment, welches das vollständige Gen enthielt, wurde mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I plus Nukleotidtriphosphaten behandelt und in die SmaI-Stelle des Kloniervektors pUC13 ligiert. Dieses Plasmid wurde pAA179 genannt. Aus diesem wurden zwei Expressionskonstrukte in dem mit SmaI verdauten, auf ptac-basierenden Vektor pGH432:lacI hergestellt. Ein Konstrukt, nämlich pAA342, bestand aus dem 5'- AhaIII-Fragment des lktA-Gens, wohingegen das andere Konstrukt, nämlich pAA345, das oben beschriebene vollständige MaeI-Fragment enthielt. Der Klon pAA342 exprimierte ein abgeschnittenes Leukotoxinpeptid in hoher Menge, während pAA345 das Leukotoxin mit voller Lange in sehr geringen Mengen exprimierte. Daher wurde das 3'-Ende des lktA-Gens (StyI-BamHI-Fragment von pAA345) unter Erhalt des Plasmids pAA352 an mit StyI-BamHI verdautes pAA342 ligiert. Die Struktur dieses Plasmids ist in Figur 4 dargestellt.
Die Nukleotidsequenz des von dem Plasmid pAA352 (LKT 352 oder neue Leukotoxin) exprimierten Leukotoxins ist in Figur 5 dargestellt. Das von dieser Sequenz kodierte Peptid hat eine Länge von 914 Aminosäuren und ist zu 98 % homolog zum authentischen Leukotoxin.

3.a. Reinigung des rekombinierten Leukotoxins aus Beispiel 1.1

2 l E. coli JM105/pAA101 wurden in Nährbrühe bis zur mittleren exponentiellen Wachstumsphase angezüchtet, worauf die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden. Das Pellet wurde in 50 ml TEP-Puffer (100 rnm Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert, sofort bei -70ºC gefroren und über Nacht aufbewahrt. Dann wurden die Zellen aufgetaut und insgesamt 4 min (30- sekündige Stöße, 200 W) beschallt, worauf die Zelltrümmer durch Zentrifugation in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 10 000 Upm entfernt wurden. Der Überstand wurde mit 3 Volumenteilen gesättigtem Ammoniumsulfat vermischt und 60 min bei 4ºC gerührt. Diese Aufschlämmung wurde über Nacht bei 4ºC aufbewahrt und dann wie oben zentrifugiert. Das aus E.-coli-JM105/pAA101-Zellen erhaltene Pellet wurde in 10 ml TEP-Puffer gelöst und mit TBSN (10 mM Tris-HCl, pH 8, 500 mM NaCl, 0,2 % NP-40) auf 20 ml verdünnt. Diese Lösung wurde durch eine einen monoklonalen Antikörper gegen β-Galactosidase ("Protosorb" von Promega Biotech) enthaltende Affinitätssäule geleitet. Die Säule wurde einmal mit 20 ml TBSN gewaschen. Das Fusionsprotein wurde mit 5,0 ml 0,1 M NaHCO&sub3;/Na&sub2;CO&sub3;, pH 10,8, eluiert und bei 4ºC aufbewahrt.

3.b. Reinigung des rekombinierten Leukotoxins (LKT 352) aus Beispiel 1.2.

Das rekombinierte LKT 352 wurde unter Anwendung des folgenden Verfahrens gereinigt. 5 bis 10 Kolonien E. coli W1485/pAA352 (ATCC 68283) wurden in 10 ml mit 100 µg/ml Ampicillin ergänzte TB-Brühe eingeimpft und 6 h bei 37ºC auf einem G10-Schüttler mit 220 Upm inkubiert. 4 ml dieser Kultur wurden in jeweils zwei Fernbach-Kolben mit Baffle, die 400 ml TB-Brühe + Ampicillin enthielten, verdünnt und über Nacht wie oben beschrieben inkubiert. Dann wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 4 000 Upm in Polypropylen-Flaschen mit einem Volumen von 500 ml und unter Verwendung eines Sorvall-GS3-Rotors geerntet. Das Pellet wurde in einem gleichen Volumenteil Ampicillin enthaltender TB-Brühe, die auf 37ºC vorerwärmt worden war, (d.h. 2 x 400 ml) resuspendiert, worauf die Zellen wie oben beschrieben 2 h inkubiert wurden.
Dann wurden 3,2 ml Isopropyl-B,D-thioglactopyranosid (IPTG, Gibco/BRL), 500 mM in Wasser (Endkonzentration = 4 mM), zu jeder Kultur gegeben, um die Synthese des rekombinierten Leukotoxins zu induzieren. Die Kulturen wurden 2 h inkubiert. Dann wurden die Zellen wie oben beschrieben durch Zentrifugation geerntet, in 30 ml 50 mM Tris-Hydrochlorid, 25 % (G/V) Sucrose, pH 8,0 resuspendiert und dann bei -70ºC gefroren. Nach 60 min bei -70ºC wurden die gefrorenen Zellen auf Raumtemperatur aufgetaut und mit 5 ml Lysozym (Sigma, 20 mg/ml in 250 mM Tris-HCl, pH 8,0) versetzt. Das Gemisch wurde 10 s mit hoher Geschwindigkeit verwirbelt und dann 15 min auf Eis gestellt. Dann wurden die Zellen zu 500 ml Lysepuffer in einem 1000-ml-Becher gegeben und durch Rühren mit einer 2-ml-Pipette durchmischt. Anschließend wurde der die lysierte Zellsuspension enthaltende Becher auf Eis gestellt und insgesamt 2,5 min (5-30-sekündige Stöße, 1 min Kühlen zwischen jedem Stoß) mit einem auf 100 W Leistung eingestellten Braun-Ultraschallgerät mit großer Sonde beschallt. Dann wurde gleiche Volumenteile der Lösung in Teflon-SS34-Zentrifugenbecher gegeben und in einem Sorvall-SS534-Rotor 20 min bei 10 000 Upm zentrifugiert. Die Pellets wurden in insgesamt 100 ml sterilem, doppelt destillierten Wasser durch Verwirbeln mit hoher Geschwindigkeit resuspendiert, worauf der Zentrifugationsschritt wiederholt wurde. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets in 20 ml 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0 (Tris-gepufferte Salzlösung) kombiniert und die Suspension über Nacht bei -20ºC eingefroren.
Die Suspension des rekombinierten Leukotoxins wurde auf Raumtemperatur aufgetaut und zu 100 ml 8 M Guanidin-HClk (Sigma) in Tris-gepufferter Salzlösung gegeben und kräftig durchmischt. Dann wurde ein Magnetrührstab in das Gefäß gegeben und die solubilisierte Probe 30 min bei Raumtemperatur durchmischt. Dann wurde die Lösung in einen 2000-ml- Erlenmeyer-Kolben überführt und rasch mit 1200 ml Trisgepufferter Salzlösung versetzt. Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere 2 h gerührt. Dann wurden Aliquots zu 500 ml in Dialsysebeutel (Spektrum, 63,7 mm Durchmesser, MW-Ausschlußgrenze 6 000-8 000, #132670, von Fisher scientific) gegeben, worauf diese in 3 500 ml Trisgepufferte Salzlösung + 0,5 M Guanidin-HCl enthaltende Becher mit einem Volumen von 4 000 ml gegeben wurden. Die Becher wurden in einem 4ºC-Raum über Nacht auf einen Magnetrührer gestellt, worauf der Dialysepuffer durch Trisgepufferte Salzlösung + 0,1 M Guanidin-HCl ersetzt und die Dialyse 12 h fortgesetzt wurde. Anschließend wurde der Puffer durch Tris-gepufferte Salzlösung + 0,05 M Guanidin- HCl ersetzt und die Dialyse über Nacht fortgesetzt. Anschließend wurde der Puffer durch Tris-gepufferte Salzlösung (ohne Guanidin ersetzt) und die Dialyse 12 h fortgesetzt. Dieses wurde noch 3-mal wiederholt. Die sich schließlich ergebende Leukotoxinlösung wurde in eine Kunststoffrollflasche mit einem Volumen von 2000 ml (Corning) gegossen und mit 13 ml 100 mM PMSF (in Ethanol) zur Inhibition der Proteaseaktivität versetzt. Die Lösung wurde bei -20ºC in Aliquots zu 100 ml aufbewahrt.

Reinigung des authentischen 50K-Proteins der äußeren Membran von P. haemolytica

Präparationen der äußeren Membran wurden auf Polyacrylamidgelen elektrophoretisiert, worauf die Bande des 50K- Proteins der äußeren Membran in Form eines einzelnen Gelstreifens ausgeschnitten wurde. Die Gelstreifen wurden zerstoßen und in 3 ml eines aus 0,1 % SDS, 0,05 M Tris-HCl (pH 7,9), 0,1 mM EDTA, 5 mM Dithiotheritol, 0,2 M NaCl bestehenden Puffers suspendiert. Dieses Gemisch wurde 2 h bei 37ºC geschüttelt, worauf der Puffer ohne die Gelfragmente entfernt und über Nacht gegen 1 l 10 mM Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert wurde. Die dialysierte Präparation wurde dann lyophilisiert und das Protein vor der Verwendung in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert.

Herstellung des rekombinierten 50K-Proteins der äußeren Membran von P. haemolytica

1. Klonierung des Gens für das 50K-Protein

Das gereinigte authentische 50K-Protein (50 g) wurde mit unvollständigem Freudschen Adjuvans vermischt und intramuskulär in ein weißes Neuseeland-Kaninchen injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und 28 Tagen wiederholt, worauf das Kaninchen eine Woche nach der letzten Injektion ausgeblutet wurde. Das so erhaltene Serum enthielt hohe Spiegel an Antikörpern gegen das 50K-Protein der äußeren Membran. Dieses Antiserum wurde zur immunologischen Durchmusterung einer Gen-Bibliothek von P. haemolytica auf das 50K-Protein exprimierende rekombinierte Klone verwendet.
Die Lambda-gt11-P.-haemolytica-Genbibliothek wurde wie oben für das Leukotoxin aus P.haemolytica beschrieben konstruiert. Die Ausplattierung der Bibliothek und die Verwendung der Kaninchen-Anti-50K0-Antiseren zur Selektion von rekombinierten Klonen erfolgte nach eingeführten Techniken (Maniatis et al., French et al. (1986), Anal. Biochem. 156:417-423). Mit dem Anti-50K-Antiserum reagierende Plaques wurden gereinigt und im E.-coli-Stamm Y1090 vermehrt und dann in den E.-coli-Stamm Y1089 zur Expression des Gens für das 50K-Protein in hoher Menge und zur anschließenden Reinigung des rekombinierten 50K-B-Galactosidase-Fusionsproteins transduziert.

2. Expression des Gens für das 50K-Protein

Das rekombinierte 50K-Protein wurde direkt in E.-coli Y1089 als Fusionsprodukt mit B-Galactosidase exprimiert. Den rekombinierten Lambda-gt11-Klon enthaltende E. coli Y1089 wurden bei 32ºC angezüchtet, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 erreicht war. Dann wurde die Kultur auf 44ºC erwärmt und 20 min angezogen. Anschließend wurde Isopropyl-thiogalactopyranosid auf 10 mM (Endkonzentration) hinzugegeben und die Kultur 1 h bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen geerntet, durch Beschallung aufgebrochen und die Zelitrümmer durch 15-minütige Zentrifugation bei 10 000 x g entfernt. Der das 50K-B-Galactosidase-Fusionsprotein enthaltende Überstand wurde anschließend wie oben beschrieben (vgl. "Reinigung des rekombinierten Leukotoxins") der Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen.

3. Reinigung des rekombinierten 50K-Proteins

Das rekombinierte 50K--Protein wurde unter Anwendung des gleichen Verfahrens gereinigt, das zur Reinigung des rekombinierten Leukotoxins angewendet wurde, mit dem Unterschied, daß es sich bei der Affinitätssäule um an Agaroseperlen gebundenes p-Aminophenyl-B-D-thiogalactopyranosid (von Sigma bezogen) handelte. Das gelöste Pellet aus der Ammoniumsulfat-Fällung wurde auf eine Affinitätssäule mit einem Volumen von 5 ml aufgetragen, die dann mit einem aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 250 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA und 0,1 % Triton x-100 bestehenden Puffer zur Entfernung ungebundenen Proteins gewaschen wurde. Anschließend wurde das gebundene Protein mit 5 ml 100 mM Natriumborat (pH 10,0) eluiert. Das eluierte Protein wurde dann vor der Verwendung über Nacht gegen 1 l phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.

Herstellung eines Salzextraktes von P. haemolvtica zur Verwendung im Impfversuch A

Eine 1-l-Kultur P. haemolytica A1 (Stamm B122) wurde in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (Difco) hergestellt, worauf die Zellen durch 20-minütige Zentrifugation mit 9 000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor geerntet wurden. Das Pellet wurde einmal mit 200 ml 0,85%igem Natriumchlorid (G/V), das auf 65ºC vorerwärmt worden war, gewaschen und dann in 30 ml der Salzlösung resuspendiert. Dann wurde die Suspension 20 min unter kontinuierlichem Rühren auf 65ºC erhitzt und die Bakterien durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde dekantiert und bei 4ºC aufbewahrt.

Herstellung eines Salzextraktes von P. haemolytica zur Verwendung im Impfversuch D

Mit den folgenden Abänderungen wurde wie oben ein Salzextrakt hergestellt. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5 000 Upm in einem Sorvall-GS3-Rotor geerntet. Nach dem Waschen wurde das Pellet in 100 ml Natriumchlorid-Lösung, die auf 65ºC vorerwärmt worden war, resuspendiert. Die Suspension wurde in einen großen Kolben (auf 65ºC vorerwärmt) gegeben, dessen Boden mit Glasperlen bedeckt war. Dann wurde der Kolben mit den Zellen kräftig in einem New-Brunswick-G25-Schüttler (250-300 Upm) 1 h bei 65ºC geschüttelt. Anschließend wurde die Probe 20 min bei 10 000 Upm in einem Sorvall-SS34-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig in eine sterile Flasche dekantiert. Dann wurde Phenylmethylsulfonylfluorid auf eine Endkonzentration von 0,1 mM dazugegeben und bei 20ºC aufbewahrt.

Herstellung der Vakzinzusammensetzungen

Jede Dosierung der in der obigen Tabelle 1 angegebenen Vakzinzusammensetzungen 1 bis 4 und 6 bis 9 wurde durch Vermischen von 1,0 ml des angegebenen Antigens (100 µg), 0,1 M PBS, pH 7,2 mit einem gleichen Volumenteil frisch hergestellten Avridins hergestellt. Gruppen mit sechs Kälbern wurden intramuskulär geimpft und drei Wochen später mit der gleichen Vakzinzusammensetzung geboostet. Zehn Tage nach dem Boosten wurden die Kälber dem Rinderherpes-Virus-1 und dann vier Tage später dem P.-haemolytica-A-1-Stamm B122 ausgesetzt. Die Kälber wurden hinsichtlich klinischer Anzeichen für die Erkrankung, der Temperatur und des Gewichtsverlustes beobachtet. Die Ergebnisse dieses Versuchs (Impfversuch A) sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Ergebnisse des Impfversuchs A von Beispiel 1
Wie in Tabelle 2 veranschaulicht, wurden die Gruppen 4 und 8 vollständig geschützt, während die Gruppen 3 und 5 signifikant geschützt wurden. Die Kontrollgruppe, nämlich Gruppe 2, hatte die höchste Mortalitätsrate. Diese Ergebnisse zeigen, daß das rekombinierte Leukotoxin:β-Galactosidase- Fusionsprotein und das authentische Leukotoxin wirksame Immunogene zur Verhütung der bovinen pulmonalen Pasteurellose sind. Darüber hinaus ergibt sich durch die Verwendung des 50K--Proteins in Kombination mit dem Leukotoxin im Vergleich zur Kontrollgruppe ein höherer Schutz.
Dann wurde ein zweiter Impfversuch (Impfversuch B) unter Verwendung des oben beschriebenen gereinigten rekombinierten Leukotoxin-Fusionsprote ins durchgeführt. Dieses Protein wurde mit Emulsigen (25 % V/V) vermischt und die Kälber gemäß den in Tabelle 3 angegebenen Gruppen geimpft. Die Kälber wurden nach 3 Wochen geboostet und schließlich wie oben beschrieben der Einwirkung von Rinderherpes- Virus/P. haemolytica ausgesetzt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Ergebnisse des Impfversuchs B von Beispiel 1
Es zeigt sich, daß die Gruppen 2 und 3, denen Emulsigen plus 100 µg bzw. 50 µg Antigen verabreicht wurden, eine niedrigere Mortalitätsrate haben als die Kontrollgruppe. Es sei darauf hingewiesen, daß dieser Versuch mit weniger als der optimalen Menge Adjuvans durchgeführt wurde, was möglicherweise die Ursache für die höheren Mortalitätsraten im Vergleich zum Impfversuch A ist.
Die Immunogenität des durch Rekombination gebildeten LKT 352, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde in einem dritten Impfversuch (Impfversuch C) wie folgt untersucht. 12 Mastrindkälber wurden zufällig in zwei 6er-Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe wurde mit einem aus steriler Salzlösung in Kombination mit dem Adjuvans bestehenden Plazebo geimpft. Die zweite Gruppe wurde mit 100 µg LKT 352 in Adjuvans geimpft. Im Abstand von 21 Tagen wurden intramuskulär zwei Injektionen verabreicht. Von jedem Kalb wurde zum Zeitpunkt jeder Impfung und 12 Tage im Anschluß an die zweite Impfung Blut entnommen. Die Anti- Leukotoxin-Titer wurden mit einem Standard-ELISA bestimmt und sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Anti-Leukotoxin-Titer von mit LKT 352 geimpften Kälbern
Es ergibt sich, daß zum Zeitpunkt der zweiten Impfung und 10 Tage nach der zweiten Impfung die Anti-Leukotoxin-Titer bei der mit LKT 352 behandelten Gruppe signifikant höher waren als bei den Kontrollkälbern.
Die Schutzkapazität des durch Rekombination hergestellten LKT 352 in Kombination mit einem Salzextrakt von P. haemolytica wurde in einem vierten Impfversuch (Impfversuch D) versucht. Das LKT 352 und der Salzextrakt von P. haemolytica (SE) wurden unter Anwendung der oben angegebenen allgemeinen Verfahren hergestellt. Der Salzextrakt hatte eine Proteinkonzentration von 250 µg/ml. Er wurde mit sterilem doppelt destillierten Wasser auf ein Endvolumen von 1330 ml verdünnt, um die Proteinkonzentration auf 150 µg/ml einzustellen. Das rekombinierte LKT 352 enthielt 250 µg/ml Protein. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das Vorliegen einer Hauptbande, daher wurde diese Antigen ohne weitere Verdünnung verwendet. Jede Vakzindosis enthielt 100 µg des neuen Leukotoxins und 50 µg Salzextrakt.
Die Kälber wurden im Abstand von 21 Tagen zweimal mit folgendem intramuskulär geimpft:
(1) Plazebo, oder
(2) P.-haemolytica-Untereinheit-Vakzin (LKT 352 plus SE) in Emulsigen Plus, oder
(3) P.-haemolytica-Untereinheit-Vakzin in Avridin.
Der Versuchsablauf war folgendermaßen:
Tag-31 1. Impfung
Tag-10 2. Impfung
Tag 0 Einwirkung von BHV-1
Tag 4 Einwirkung von P. haemolytica
Tag 5 Ende der klinischen Beobachtung
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 5 angegeben. Es ergab sich, daß 25 % der Kontrollkälber starben. Im Gegensatz dazu gab es in den zwei Gruppen, denen das Untereinheit-Vakzin verabreicht worden war, keine Todesfälle. Bei den mit dem Untereinheit-Vakzin behandelten Gruppen war die Morbidität außerdem signifikant geringer als bei der Placebo-Gruppe (Fisher-Exact-Test p < 0,05). Tabelle 5 Ergebnisse des Impfversuchs D
a Prozentsatz an Kälbern, die Fieber bekamen > 40,0 mit klinischen anzeichen von BRD nach der Infektion mit P. haemolytica.
b Prozentsatz an Kälber, die an fibrinböser Penumonie nach der Infektion mit P. haemolytica starben.
c Mittlere Scores und Temperaturen von lebenden Tieren.
d Mittelwert Tage/Kalb mit Fieber T 40,0 mit klinischen Anzeichen von BRD, Kälber die starben, wurden bis zum Ende des Versuches als Krank angesehen.
e Mittelwert der Gewichtsveränderung (kg) durch Infektion mit P. haemolytica bis das Kaolb stirbt oder der Versuch zu Ende ist.
* Die Morbidität war signifikant geringer (P< 0,05) als bei der Kontrollgruppe - Fisher-Exakt-Test
Dann wurde unter Verwendung des aus LKT 352 und einem Salzextrakt (SE) von P. haemolytica bestehenden Untereinheit-Vakzin ein Feldversuch (Impfversuch E) durchgeführt. Bei den Vakzin-Formulierungen handelte es sich um die in dem Impfversuch D beschriebenen.
Bei den Kälbern handelte es sich um Mastrindkälber mit einem Gewicht von 250 kg bis 325 kg. Die Kälber wurden im Frühling geboren, im Herbst entwöhnt und für die Mastviehlaufhofanlage auf Auktionen verkauft. Sie wurden mit einem Lastkraftwagen zur Mastviehlaufhofanlage transportiert und kamen innerhalb einiger Tage nach dem Kauf dort an.
Die Kälber wurden zufällig verteilt einer von zwei Vakzingruppen zugeordnet. Den Kälbern in der Gruppe I wurde eine einzelne intramuskuläre 2-ml-Injektion des Pasteurella- Untereinheiten-Vakzins verabreicht. Den Kälbern der Gruppe 2 wurde eine einzelne 2-ml-Injektion des Plazebos verabreicht. Die Kälber wurden zum Zeitpunkt des Eintreffens auf der Mastviehlaufhofanlage verarbeitet und im Rotationsverfahren, so wie sie über eine Rinderrutsche kamen, zwei Behandlungsgruppen zugeordnet. Ein Techniker verabreichte die Vakzine und zeichnete die Behandlungsgruppe auf, der das Kalb zugeordnet wurde. Insgesamt wurden 2 324 Kälber geimpft, und zwar 1 168 in Gruppe I und 1 156 in Gruppe II.
Die Kälber wurden als typische Mastviehlaufhofanlagen-Tiere gehalten und behandelt. Für die Auswahl und die Behandlung von erkrankten Kälbern nach einem von einem konsultierenden Mastviehlaufhofanlagen-Tierarzt vorgeschriebenen Protokoll waren die Mastviehlaufhofanlagen-Cowboys verantwortlich. Die Auswahl von Kälbern zur Behandlung und zur Post-mortem- Diagnose erfolgte ohne Kenntnis des Impfstatus der Kälber. Die tägliche Diagnose, die Temperatur und die Behandlung jedes erkrankten Kalbes wurde aufgezeichnet. Die Gesundheit der Kälber wurde 60 Tage nach der Ankunft untersucht. Bei allen Todesfällen wurde von einem Tierarzt innerhalb etwa 24 h nach dem Tod eine grobe Post-mortem-Untersuchung vorgenommen und Proben zu weiteren Untersuchung in das Labor weitergeleitet, wenn dies erforderlich war. Diese Information wurde zur Bestimmung des Morbiditäts (Behandlungs)-Risikos und des Mortalitätsrisikos verwendet. Die BRD-Morbiditätsrisiko-Scores wurden nach der folgenden Gleichung ermittelt:
BRD-Morbiditätsrisiko =
Anzahl an BRD erkrankter Kälber in der Gruppe/ Anzahl Rinder in der ursprünglichen Gruppe
Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung von Risikoverhältnissen (oder relatives Risiko, RR) beurteilt und durch Ermittlung des 95%-Konfidenzintervalls unter Verwendung der Taylor- Reihe-Konfidenzintervalle, wenn der Vergleich zwischen zwei Gruppen erfolgte. Die Risikoverhältnisse wurden gemäß der folgenden Gleichung beurteilt.
Risikoverhältnis (Relatives Risiko, RR) =
Risiko für eine Gruppe/ Risiko für die Vergleichsgruppe
Die Signifikanz der Unterschiede wurde unter Anwendung des Verfahrens von Mantel-Haenszel für Summenrisikoverhältnisse (MHRR) und des Verfahrens von Greenland and Robins zur Berechnung der 95%-Konfidenzintervalle ermittelt. Sämtliche RRs wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn die 95%-Konfidenzintervalle die Einheitlichkeit nicht umfaßten. Wenn die RRs und die Konfidenzintervalle nicht berechnet werden konnten, wurde der Fisher-Exact-2-Endentest zur Bestimmung der statistischen Signifikanz zwischen den Risiken angewendet.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 6 dargestellt. Es ist klar, daß die Impfung mit LKT 352 in Kombination mit einem Salzextrakt von P. haemolytica (Gruppe I) signifikant die Morbidität der Rinderatemwegserkrankung und die Mortalität der Rinderatemwegserkrankung (sämtliche Pneumonien) im Vergleich zur Behandlung mit dem Plazebo (Gruppe II) verringert. Die Verringerung der Mortalität durch fibrinöse Pneumonie war auf dem 5%-Niveau nicht signifikant. Dies beruht jedoch wahrscheinlich darauf, daß auch ein Vakzin gegen den Rinderherpes-Virus-1 in Kombination mit dem Vakzin gegen Pasteurella untersucht wurde. Das Vakzin gegen BHV-1 scheint eine Immunsuppression zu verursachen, welche die Reaktion auf das Vakzin gegen Pasteurella beeinträchtigt. Tabelle 6 Schutz gegen die natürliche Rinderatemwegserkrankung (Impfversuch E)
a Signifikant geringer (P < 0,05) als bei Gruppe II.

Identifizierung der neutralisierenden Epitope des Leukotoxins

Das Leukotoxinprotein aus P. haemolytica enthält eine Reihe von sich wiederholenden Aminosäuredomänen in der Nähe des Carboxy-Terminus. Diese Domänen sind wahrscheinlich Epitope, die in Vakzinzusammensetzungen verwendbar sind. Die Konsensus-Aminosäuresequenz ist Gly-Gly-X-Gly-X-Asp, wobei X Lys, Asp, Val oder Asn ist (Highlander et al. (1989), DNA 8:15-28). Andere Substitutionen, die wahrscheinlich immunologisch wirksame Peptide ergeben, umfassen jedoch auch Substitutionen mit einer aliphatischen Aminosäure wie beispielsweise Gly, Ala, Val, Leu, Ile, einer geladen Aminosäure wie beispielsweise Asp, Glu, Arg, His oder Lys oder einer entsprechenden neutralen Aminosäure wie beispielsweise Asn oder Gln.
Aufgrund dieser Information wurde ein synthetisches Peptid mit der Sequenz GGNGDDFIDGGKGNDLLHGG mit Hilfe der Standard-Festphasentechnologie mit einem Peptidsynthesizer von Applied Biosystems konstruiert. Die Mäuse wurden mit den authentischen Leukotoxinen immunisiert. Die entweder aus P. haemolytica oder aus Actinobacillus pleuropneumoniae (Serotypen 1 und 5) hergestellt worden waren, und zwar mit 100 µg pro Dosis mit dem kompletten Freudschen Adjuvans (erste Impfung) oder mit dem inkompletten Freudschen Adjuvans (sämtliche nachfolgende Impfungen). Mit einem Standard-ELISA wurden von immunisierten Mäusen Serumproben mit hohem Titer auffolgendes untersucht: (1) ihre Fähigkeit zur Reaktion mit rekombiniertem und authentischem Leukotoxin aus P. haemolytica, (2) ihr Vermögen zur Reaktion mit dem von A. pleuropneumoniae gebildeten Toxin und (3) ihre Vermögen zur Reaktion mit dem oben beschriebenen synthetischen Peptid. Die in Tabelle 7 zusammengefaßten Ergebnisse sind in Form der relativen Reaktivität bei einer Serumverdünnung von 1 in 100 000 ausgedrückt. Tabelle 7 Vorhandensein von synthetischen Peptidepitopen in Toxinen aus P. haemolytica und A. pleurodneumonia der Serotypen 1 und 5
Diese Daten zeigen, daß mit irgendeinem der drei Leukotoxine geimpte Tiere Antikörper entwickelten, die mit sämtlichen Toxinen und einem synthetischen Peptid, das auf einem Teil des Toxins von P. haemolytica basierte, reagierten. Nachdem ein geeigneter Spiegel an Anti-Peptid-Serumantikörpern erreicht war (ELISA-Titer 100 000 oder höher) wurden Milzzellen mit NS1-Zellen fusioniert und nach Standardverfahren monoklonale Antikörper bildende Klone isoliert. Die Kulturüberstände dieser Klone wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Reaktion mit dem synthetischen Peptid (oben) und den jeweiligen Toxinen mit einem ELISA-Assay untersucht. Die Ergebnisse für 2 Klone sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8
1 Nicht bestimmt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß jeder dieser monoklonalen Antikörper mit einem Epitop reagiert, das die Toxine aus P. haemolytica und A. pleuropneumoniae gemeinsam haben, und daß dieses Epitop dem des synthetischen Peptids strukturell ähnlich ist. Dieses Peptid ist ferner einem synthetischen Peptid des Rinderrotavirus der Sequenz T M N G N E F Q T G G I G N L P I R N W N A C, welche die Aminosäureen 40-60 des VP6-Proteins darstellt, strukturell ähnlich. Die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper können daher zur Bestimmung des Grades ihrer Kreuzreaktivität mit Rotavirus- Proteinen auf der Grundlage des durch die synthetischen Peptide dargestellten Epitops verwendet werden. Außerdem könnten sich die immunologisch wirksamen Leukotoxinfragmente als günstig zur Immunisierung gegen Rotaviren erweisen.
Die obigen Antikörper können ferner hinsichtlich (1) ihrer Fähigkeit zur Reaktion mit oder zur Neutralisation anderer ähnlicher Toxine untersucht werden, beispielsweise die von E. coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis und Actinobacillus actinomycetemcomitans. Eine dieses Epitop kodierende DNA-Sequenz kann kloniert und entweder in E. coli, S. aureus oder Baculovirus exprimiert werden.

Claims

1. Vakzinzusammensetzung, die ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel und eine Untereinheit-Antigenzusammensetzung enthält, wobei die Untereinheit-Antigenzusammensetzung ein abgeschnittenes P.-haemolytica- Leukotoxin enthält.

2. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das abgeschnittene Leukotoxin das P.-haemolytica- Leukotoxin 352 (LKT 352) mit der in Figur 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist.

3. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung außerdem einen Salzextrakt von P. haemolytica enthält.

4. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, die außerdem ein Adjuvans enthält.

5. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das abgeschnittene Leukotoxin die Aminosäuresequenz Gly-Gly-X-Gly-X-Asp enthält, in der X aus der aus einer aliphatischen Aminosäure und einer geladenen Aminosäure oder der dieser entsprechenden neutralen Aminosäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei X aus der aus Lys, Asp, Val und Asn bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

7. Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das abgeschnittene Leukotoxin die Aminosäuresequenz GGNGDDFIDGGKGNDLLHGG enthält.

8. Vakzinzusammensetzung, die ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel, ein Adjuvans, das P.-haemolytica- Leukotoxin 352 (LKT 352) mit der in Figur 5 dargestellten Aminosäuresequenz und einen Salzextrakt von P. haemolytica enthält.

9. Isoliertes P.-haemolytica-Leukotoxin 352 (LKT 352) mit der in Figur 5 dargestellten Aminosäuresequenz.

10. Isolierte Nukleotidsequenz, die das P.-haemolytica- Leukotoxin 352 (LKT 352) kodiert, mit der in Figur 5 dargestellten Sequenz.

11. DNA-Konstrukt, daß eine Expressionskassette aufweist, die zusammengesetzt ist aus:

(a) der isolierten Nukleotidsequenz nach Anspruch 10 und

(b) Kontrolisequenzen, die funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz verbunden sind, so daß die Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen zu der Nukleotidsequenz heterolog ist.

12. Plasmid pAA352 (ATCC-Zugangs-Nr. 68283) wie in Figur 4 dargestellt.

13. Wirtszelle, die stabil mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 11 oder 12 transformiert ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines rekombinierten Polypeptids, bei dem:

(a) eine Population von Wirtszellen nach Anspruch 13 bereitgestellt wird und

(b) die Zellpopulation unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen das von der Expressionskassette kodierte Polypeptid exprimiert wird.

15. Zusammensetzung zur Verwendung zur Verhütung oder Besserung von Atemwegserkrankungen bei einem Wiederkäuer&sub1; wobei die Zusammensetzung als Wirkstoff ein immunogenes abgeschnittenes P.-haemolytica-Leukotoxin im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel enthält.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das abgeschnittene Leukotoxin das Leukotoxin 352 (LKT 352) mit der in Figur 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, die außerdem einen Salzextrakt von P. haemolytica enthält.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 15, 16 oder 17, die außerdem ein Adjuvans enthält.

19. Verwendung einer Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4 zur Herstellung eines polyklonalen Antiserums gegen P. haemolytica in einem Säuger.