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Die vorliegende Erfindung betrifft einen in der Folge als monoklonalen anti-human-
BCDF-Antikörper bezeichneten monoklonalen Antikörper gegen menschliches BCDF
und ein Immunoassay zum Quantifizieren von human-BCDF in einer Probe.
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Bei human-BCDF, das auch als human-B-Zellen-stimulierender Faktor 2 (BSF-2) oder
Interleukin-6 (IL-6) bekannt ist, handelt es sich um eine biologische Substanz, die in
engem Zusammenhang mit dem durch immunologische Zellen erzeugten
immunomodulierenden System steht, und seine gesamte Aminosäuresequenz ist
bestimmt worden ("Nature", Band 324,S.73, 1980).
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Es ist bekannt, daß human-BCDF verschiedene biologische Aktivitäten aufweist.
Beispielsweise führt human-BCDF zur Produktion von Antikörpern durch die aktivierten
B-Zellen ("Journal of Experimental Medicine", Band 167, S.332, 1988) und führt auch
zur Differenzierung von T-Zellen ("Journal of Immunology", Band 140, S.508, 1988). Es
ist auch bekannt, daß human-BCDF zur Synthese des in der Anfangsphase der
Entzündung von Leberzellen auftretenden Akutphasenproteins führt ("FEBS Letters",
Band 221, S.18, 1987), und es wirkt auf die Blutstammzellen, um die Bildung von
Kolonien pluripotenter blutbildender Stammzellen herbeizuführen ("Proceedings of
National Academy of Science", Band 84, S.9035, 1987). Andererseits weisen Patienten,
die an Atrialmyxom leiden, systemische Autoimmunsyndrome auf. Es ist bekannt, daß
die primären Tumorzellen im Atrialmyxom human-BCDF erzeugten und das
Atrialmyxom-Autoimmunsyndrom durch Entfernen der primären Tumorzellen verbessert
wird ("Proceedings of National Academy of Science", Band 82, S.5490, 1985). Es ist
auch bekannt, daß die BCDF-Menge in der Gelenksflüssigkeit von Patienten mit
rheumatischer Arthritis wesentlich höher ist als bei gesunden Menschen ("Medical
Immunology", Band 15, S.195, 1988) und daß human-BCDF beim Castleman-Syndrom
in hypertrophen Lymphknoten anormal erzeugt wird ("Medical Immunology", Band 15,
S.197, 1988). Aufgrund dieser Beobachtungen wird angenommen, daß human-BCDF in
engem Zusammenhang mit einigen Autoimmunerkrankungen steht. Es ist auch bekannt,
daß bei der Abstoßreaktion gegen ein transplantiertes Organ die human-BCDF-Menge
vor der Abstoßreaktion vorübergehend erhöht ist, daß die human-BCDF-Menge bei
einer entzündeten Läsion erhöht ist, daß Tumorzellen, die von an mehrfachem Myelom
leidenden Patienten stammen, human-BCDF erzeugen, und daß das Wachstum der
Tumorzellen durch das Zugeben von human-BCDF beobachtet wird ("Nature", Band
332, S.83,1988).
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Somit spielt human-BCDF eine wichtige Rolle bei der Immunomodulation im Körper,
und anormal hohe Produktion von human-BCDF steht in engem Zusammenhang mit
den oben beschriebenen Autoimmunerkrankungen, Entzündungen und einigen
Krebsarten.
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Daher geht man davon aus, daß die Bestimmung der Menge an human-BCDF im Blut
oder anderen Körperflüssigkeiten wichtig für die Diagnose und Überwachung von
Patienten ist, die an diesen Erkränkungen leiden. Weiters wird erwartet, daß die
Verringerung der Aktivitäten von human-BCDF, das in anormal hohen Mengen erzeugt
wird, eine effiziente Behandlung di(ser Erkrankungen darstellt.
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Zu den herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen der Menge an human-BCDF gehören
Verfahren, bei denen jene Zellen eingesetzt werden, deren Wachstum oder
Differenzierung vom Vorhandensein von human-BCDF abhängt, sowie Immunoassays,
bei denen anti-human-BCDF-Antikörper eingesetzt werden ("European Journal of
Immunology", Band 18, S.951, 1988).
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Bei den ersteren herkömmlichen Verfahren beträgt die Nachweisempfindlichkeit nicht
weniger als mehrere hundert fg/ml. Da es sich dabei jedoch um Bioassays handelt,
werden die Testergebnisse zur Beslimmung der Menge an human-BCDF im Blut oder
anderen biologischen Fluids von verschiedenen Substanzen im Blut oder den
biologischen Fluids beeinflußt, sodaß die Verfahren schwer zu reproduzieren sind.
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Andererseits ist die Nachweisempfindlichkeit bei den herkömmlichen Immunoassays zu
gering, um BCDF im Blut nachzuweisen. In Anbetracht der Tatsache, daß im Blut
gesunder Menschen eine human-BCDF-Menge von etwa 10 pg/ml erwartet werden
kann, ist die Empfindlichkeit herkommlicher Immunoassays zur Quantifizierung von
human-BCDF nicht zufriedenstellend. Weiters werden bei herkömmlichen
lmmunoassays polyklonale Antikorper als sekundärer Antikörper eingesetzt. Im
allgemeinen ist der polyklonale Aitikörper ein Gemisch aus mehreren Antikörpern,
sodaß es unmöglich ist, denselben polyklonalen Antikörper mit den gleichen
Eigenschaften zu reproduzieren. Weiters kann ein polyklonaler Antikörper in einer
Charge nicht in einer großen Menge erzeugt werden, und daher ist es unmöglich, den
polyklonalen Antikörper in gewerblich-industriellem Maßstab herzustellen.
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Wenn ein Immunoassaysystem vorliegt, bei dem nicht nur der erste Antikörper, sondern
auch der zweite Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, kann die human-BCDF-
Menge mit hoher Empfindlichkeit in Proben bestimmt werden, bei denen das Blut
verschiedene Substanzen enthält. Weiters kann, da monoklonale Antikörper durch die
Kultivierung von Hybridomen erzeugt werden können und der gleiche monoklonale
Antikörper wiederholt erzeugt werden kann, das Immunoassaysystem in
gewerblichindustriellem Maßstab hergestellt werden, während die Identität des Systems
gewährleistet wird. Um ein solches mmunoassaysystem bereitzustellen, sind zumindest
zwei monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper erforderlich, bei denen die
entsprechenden Epitope unterschiedlich sind.
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Das EP-312996 offenbart monoklonale Antikörper gegen human-BCDF, die für ein
Epitop von BCDF spezifisch sind.
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Das nach EPÜ-Artikel 54(3) zitierte EP-399,429 offenbart einen für human-BCDF
spezifischen monoklonalen Antikörper, der dazu fähig ist, 50% der BCDF-Aktivität zu
neutralisieren, wenn er in einem 10-fachen Überschuß vorhanden ist.
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Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, einen anti-human-BCDF-
Antikörper mit hoher Spezifität bereitzustellen, bei dem sich das Epitop von jenem
unterscheidet, das von einem herkömmlichen monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper erkannt wird.
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Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Immunoassay
bereitzustellen, bei dem der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper der
vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommt.
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Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper mit der Epitopspezifität eines Antikörpers bereit, der vom als FERM BP-3029
hinterlegten Hybridom HH61-8 oder vom als FERM BP-3030 hinterlegten Hybridom
HH61-10 erhalten wird.
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Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper bereit, wie vom als FERM BP-3029 hinterlegten Hybridom HH61-8 oder vom
als FERM BP-3030 hinterlegten Hybridom HH61-10 erhältlich. Dieser Antikörper kann
sich spezifisch an human-BCDF binden, erkennt ein Epitop, das sich von dem durch die
monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper MH 166 und αBSF2-77 erkannten
unterscheidet und kann human-BCDF-Aktivität neutralisieren.
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Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Immunoassay zur Bestimmung der Menge an
human-BCDF in einer Probe bereit, welches das Umsetzen von human-BCDF mit dem
monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden Erfindung und das
Bestimmen der spezifisch an den monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper
gebundenen Menge an human-BCDF umfaßt.
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Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen anti-human-Antikörper
mit hoher Spezifität bereit, der ein Epitop erkennt, das sich von dem durch die
herkömmlichen monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper erkannten unterscheidet.
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Da der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden Erfindung hohe
Spezifität für human-BCDF aufweist und da er ein Epitop erkennt, das sich von dem
durch die herkömmlichen monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper erkannten
unterscheidet, wurde ein Immunoassaysystem zum Quantifizieren von human-BCDF in
einer Probe bereitgestellt, bei dem zwei monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper
zum Einsatz kommen. Somit wurde durch die vorliegende Erfindung ein
hochempfindliches Immunoassaysystem zum Quantifizieren von human-BCDF
bereitgestellt, das in gewerblich-industriellem Maßstab reproduzierbar ist. Die
vorliegende Erfindung leistet einen wesentlichen Beitrag zur Diagnose und
Überwachung von Erkrankungen, die mit human-BCDF in Zusammenhang stehen,
sowie zur Behandlung solcher Erkraukungen.
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In den beiliegenden Zeichnungen:
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zeigt Fig. 1 graphisch die Aktivitäten der monoklonalen Antikörper der vorliegenden zur
Neutralisierung der human-BCDF-Aktivitäten; und
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zeigt Fig. 2 graphisch die Ergebnisse des Enzymimmunoassays, bei dem die
monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt
werden.
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Wie oben erwähnt, hat der monoklonale änti-human-(BCDF)-Antikörper der
vorliegenden Erfindung die folgenden Eigenschaften:
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(i) er bindet sich spezifisch an human-BCDF;
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(ii) er erkennt ein Epitop, das sich von jenem unterscheidet, das von den monoklonalen
anti-human-BCDF-Antikörpern MH166 und αBSF2-77 erkannt wird; und
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(iii) er neutralisiert human-BCDF-Aktivität.
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Beispiele für den monoklonalen anti-human-BCDF-Anti körper gemäß vorliegender
Erfindung sind HH61-8 und HH61-10, die in den nachstehend beschriebenen
Arbeitsbeispielen tatsächlich erhalten wurden und gemäß dem Budapester Vertrag unter
den Eingangsnummern FERM BP-3029 bzw. FERM BP-3030 beim Fermentation
Research Institute of Japan hinterlegt wurden. Die monoklonalen Antikörper HH61-8
und HH61-10 haben die folgenden Eigenschaften:
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I) monoklonaler Antikörper HH6 1-8
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1) Immunoglobulinklasse: IgG
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ii) Molekulargewicht (bestimmt durch SDS-PAGE): 150.000 Dalton
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iii) Molekularabsorptionskoeffizient E&sub2;&sub8;&sub0; nm (bestimmt durch Messung des
Absorptionsvermögens bei 280 nm und des Trockengewichts):14,0
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iv) bindet sich spezifisch an human-BCDF
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v) erkennt ein Epitop, das sich von den durch die monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper MH 166 (beim Fermentation Research Institute von Japan gemäß dem
Budapester Vertrag unter der Eingangsnummer FERM BP-1972 hinterlegt) und αBSF2-77
(beim Fermentation Research Institute von Japan gemäß dem Budapester Vertrag unter
der Eingangsnummer FERM BP-1975 hinterlegt) erkannten unterscheidet
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vi) neutralisiert human-BCDF-Aktivitäten
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vii) hemmt die Bindung von human-BCDF an BCDF-Rezeptoren
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II) Monoklonaler Antikörper HH61-10
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i) Immunoglobulinklasse: IgG
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ii) Molekulargewicht (bestimmt dur( h SDS-PAGE): 150.000 Dalton
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iii) Molekularabsorptionskoeffizient E&sub2;&sub8;&sub0; nm (bestimmt durch Messung des
Absorptionsvermögens bei 280 nm und des Trockengewichts):14,0
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iv) bindet sich spezifisch an human-BCDF
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v) erkennt ein Epitop, das sich von den durch die monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper MH 166 (beim Fermentation Research Institute von Japan gemäß dem
Budapester Vertrag unter der Eingangsnummer FERM BP-1972 hinterlegt) und αBSF2-77
(beim Fermentation Research Institute von Japan gemäß dem Budapester Vertrag unter
der Eingangsnummer FERM BP-1975 hinterlegt) erkannten unterscheidet
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vi) neutralisiert human-BCDF-Aktivitäten
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vii) hemmt Bindung von human-BCDF an BCDF-Rezeptor
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Da sich das vom monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden
Erfindung erkannte Epitop von dem unterscheidet, das von herkömmlichen
monoklonalen anti-human-BCDF-Aiitikörpern erkannt wird, ist offensichtlich, daß sich
der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung von den herkömmlichen
monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörpern unterscheidet.
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Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kann auf Basis des nach
dem Stand der Technik wohlbekaimten sogenannten Hybridomverfahrens hergestellt
werden, bei dem ein den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erzeugendes
Hybridom kultiviert und der monoktonale Antikörper daraus gewonnen wird.
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Das Hybridom kann durch Hybridisieren einer Myelomzelle und einer Antikörper
erzeugenden Zelle hergestellt werden. Die Antikörper erzeugende Zelle kann durch
Immunisieren eines Tieres, wie z.B. einer Maus oder Ratte, mit human-BCDF und
Gewinnen von Antikörper erzeugenden Zellen, wie z.B. Milzzellen oder Lymphozyten,
aus dem immunisierten Tier erhalten werden Das dem Tier zu verabreichende human-
BCDF kann durch einen Mikroorganismus wie z.B. E.coli hergestelltes rekombinantes
human-BCDF oder ein durch menschlichen Tonsillen-Monozyten oder menschlichen
peripheren Blut-Monozyten oder menschliche Tumorzellen, wie z.B. human-T-
Lymphom, erzeugtes sein, oder es kann ein durch ein künstlich hergestelltes Hybridom
erzeugtes sein. Das Verfahren zum Gewinnen von Antikörper erzeugenden Zellen aus
dem Tier ist nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
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Die Antikörper erzeugenden Zellen, die vom mit human-BCDF immunisierten Tier
gesammelt wurden, werden dann mit Myelomzellen hybridisiert. Die Spezies des
Tieres, von dem die Myelomzelle stammt, kann sich zwar von der Spezies des für die
Immunisierung verwendeten Tieres unterscheiden, üblicherweise werden aber bessere
Ergebnisse erzielt, wenn die gleiche Spezies verwendet wird. Ein Beispiel für das
bevorzugte Hybridom zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden
Erfindung ist ein Hybridom zwischen einer Maus-Lymphom- oder einer Maus-Milzzelle
und einer Maus-Myelomzelle. Beispielsweise wird ein Hybridom zwischen einem
Antikörper erzeugenden Lymphom von BALB/c-Maus, die mit mit komplettem
Freundschem Adjuvans emulgiertem human-BCDF immunisiert war, und Maus-
Myelomzelle P3-X63-Ag8-U1 bevorzugt, wie in den nachstehend beschriebenen
Arbeitsbeispielen gezeigt. Anstelle der Maus-Myelomzelle P3-X63-Ag8-U1 können
auch 8-Azaguanin-resistente Myelomzellen, wie z. B. Maus-P3-X63-Ag8-Zelle, Maus-P3-
NSI/1-Ag4-1-Zelle, Maus-MPC11-45 6.TG. 1.7-Zelle, Maus-SP2/V-Ag14-Zelle, Maus-X63-
Ag8-6.5.3, Ratten-210.RCY.Ag1.2.3-Zelle, human-SKO-007-Zelle und human-
GH15006TG-A12-Zelle, eingesetzt werden, die nach dem Stand der Technik alle
wohlbekannt sind. Das Hybridisierungsverfahren für die Antikörper erzeugende Zelle
und die Myelomzelle, bei dem Polyethylenglykol oder Sendai-Virus (HVJ) eingesetzt
wird, ist nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
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Nach der Zelhybridisierung werden die Zellen in einem HAT-Medium kultiviert, in
dem nur Hybridomen überleben können, um die Hybridomen zu selektieren. Dieses
Kultivieren wird üblicherweise in einer 96-Napf-Mikrotiterplatte durchgeführt. Der
Hybridom erzeugende monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper kann selektiert
werden, indem der Kulturüberstand auf das Vorhandensein des anti-human-BCDF-
Antikörpers überprüft wird. Die Überprüfung erfolgt durch ein Immunoassay, wie z.B.
ein Enzym-Immunoassay, bei dem die spezifische Bindungsreaktion zwischen dem
Antikörper und human-BCDF ausgenutzt wird.
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Der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kann
nach einem herkömmlichen Verfahren, wie z.B. Aussalzen und
Ionenaustauschchromatographie, vom Kulturüberstand des so selektierten Hybridoms
gereinigt werden. In Fällen, in denen eine große Menge des monoklonalen Antikörpers
herzustellen ist, kann das Hybridom in den Abdomen eines histokompatiblen Tiers wie
z.B. einer Nacktmaus oder dergleichen transplantiert werden, und der monoklonale
Antikörper kann aus dem Abdominalfluid gewonnen werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Immunoassay zum Bestimmen der human-
BCDF-Menge in einer Probe bereit, bei dem der monoklonale Antikörper der
vorliegenden Erfindung spezifisch mit dem human-BCDF in der Probe zur Reaktion
gebracht wird. Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kann bei
jedem beliebigen Immunoassay zum Quantifizieren von human-BCDF eingesetzt
werden. Wie zuvor erwähnt, wird beim Immunoassay nach einem bevorzugten Modus
der vorliegenden Erfindung ein sogenanntes Sandwich-Verfahren eingesetzt, bei dem
zwei monoklonale anti-human-(BCDF)-Antikörper entsprechende Epitope aufweisen, die
sich voneinander unterscheiden. Da ein monoklonaler anti-human-BCDF-Antikörper,
der ein Epitop erkennt, das sich von dem vom herkömmlichen monoklonalen
antihuman-BCDF-Antikörper erkannten unterscheidet, erstmals durch die vorliegende
Erfindung bereitgestellt wurde, wurde demgemäß auch dieses
Sandwichlmmunoassaysystem, bei dem zwei monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper
eingesetzt werden, erstmals durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
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Das Sandwich-Immunoassay, bei dem der monoklonale Antikörper der vorliegenden
Erfindung und ein herkömmlicher monoklonaler anti-human-BCDF-Antikörper
eingesetzt werden, kann beispielsweise folgendermaßen durchgeführt werden. Der
monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung, der als erster
Antikörper dient, wird an der Oberfläche eines Napfs fixiert. Nach dem Blockieren der
Oberfläche des Napfs mit einem Protein wie z.B. BSA, um die nicht-spezifische
Bindung zu verhindern, wird eine Probe, die human-BCDF enthalten kann, in den Napf
gegeben. Nachdem es reagieren gelassen wurde, wird das Probenfluid verworfen, und
der Napf wird gewaschen. Dann wird markierter herkömmlicher monoklonaler
antihuman-Antikörper, wie z.B. MH166 oder αBSF-2, der als zweiter Antikörper dient, in
den Napf gegeben, und dann wird der Napf gewaschen. Zum Markieren des zweiten
Antikörpers kann jegliches herkömmliches Markieren, wie z.B. Markieren mit
Radioisotop oder Enzym, eingesetzt werden. Durch Quantifizieren des gebundenen
zweiten Antikörpers je nach der Markierung kann die Menge des human-BCDF
bestimmt werden. Es sollte angemerkt werden, daß der herkömmliche monoklonale
anti-human-BCDF-Antikörper am Napffixiert werden kann und der monoklonale
Antikörper der vorliegenden Erfindung als sekundärer Antikörper verwendet werden
kann.
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Der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kann
neben dem Immunoassay auch für immunohistochemische Färbung verwendet werden.
Das kann durch den Einsatz einer indirekten Enzyni-Antikörper-Technik erreicht
werden. Das heißt, beispielsweise wird nach dem Fixieren eines Abschnitts eines
topisch entzündeten Gewebes als Abstrichprobe die Probe mit einem Protein wie z.B.
BSA blockiert, um die nicht-spezifische Bindung des Antikörpers zu verhindern, und
monoklonaler anti-human-BCDF-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung wird dann
mit der Probe zur Reaktion gebracht. Dann wird die Probe mit einem
Peroxidasemarkierten anti-Maus-Ig-Antikörper behandelt, und das Resultierende wird
stehengelassen, um die Reaktion zu ermöglichen. Nach dem Waschen wird die Probe
dann mit 3,3-Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid behandelt, um die Probe zu
färben. Nach der Behandlung sind die Zellen, die human-BCDF enthalten, braun
gefärbt.
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Der monoklonale anti-human-(BCDF)-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung kann
auch als Reagens zur Gewinnung von human-BCDF verwendet werden. Beispielsweise
wird der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden Erfindung an
einem geeigneten Träger, wie z.B Kunstharz, fixiert, und Affinitätschromatographie
wird unter Verwendung des Antikörper-gebundenen Harzes durchgeführt. Im
spezielleren kann der monoklonale anti-human-BCDF-Antikörper der vorliegenden
Erfindung an einem Zelluloseträger lixiert werden, der mit Cyanogenbromid (im Handel
von Pharmacia erhältlich) aktiviert st, und der Träger wird dann in eine Säule gepackt,
um eine Affinitätssäule bereitzustellen. Durch Auftragen eines human-BCDF
enthaltenden Fluids auf die Affinitätssäule und darauffolgendes Eluieren des an den
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, der am Träger fixiert ist, gebundenen
human-BCDF kann human-BCDF mit hoher Reinheit erhalten werden.
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Weiters kann der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie in den
nachstehend beschriebenen praktischen Arbeitsbeispielen gezeigt, da er in der Lage ist,
die human-BCDF-Aktivitäten zu neutralisieren, verwendet werden, um die
Autoimmunerkrankungen, Entzündung und einige Krebsarten zu behandeln, an denen
human-BCDF beteiligt ist.
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Es sollte angemerkt werden, daß F(ab')&sub2;-Fragment, das hergestellt wird, indem Fc-
Bereich durch ein Enzym vom erfindungsgemäßen monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörper entfernt wird, bei den oben erwähnten Verwendungsarten anstelle des
monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung möglicherweise ebenfalls
eingesetzt werden könnte. Weiters kann möglicherweise anstelle des monoklonalen
Antikörpers der vorliegenden Erfindung auch ein Chimären-Antikörper verwendet
werden, bei dem der Fc-Bereich des monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörpers der
vorliegenden Erfindung durch einen human-Fc-Bereich ersetzt ist.
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Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben. Es versteht
sich, daß die Beispiele nur zur Verauschaulichung dienen und keinesfalls einschränkend
interpretiert werden sollten.
Beispiel 1
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1) Herstellung von Hybridom, das monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper erzeugt
Eine BALB/c-Maus (männlich, 8 Wochen alt) wurde intraperitoneal mit 2 - 3 µg durch
E.coli erzeugtes gereinigtes human-BCDF immunisiert, das mit einem gleichen Volumen
an komplettem Freundschem Adjuvans vermischt war. Die Maus wurde weiter 4 bis 6
Mal mit der gleichen Antigenzusammensetzung immunisiert, und dann wurde ihre Milz
entnommen. Eine Milzzellen-Suspension wurde hergestellt, und die Milzzellen wurden
nach dem herkömmlichen Polyethylenglykol-Verfahren mit P3-X63-Ag8-U1 (P3U1)
hybridisiert.
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Die hybridisierten Zellen wurden in HAT-Medium suspendiert, und die Suspension
wurde getrennt in Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte (im Handel erhältlich von
Corning Glass) mit einer Populationsdichte von 2,5 x 10&sup5; Zellen/Napf gegeben. Nach
etwa 2 Wochen ab dem Zeitpunkt der Hybridisierung wurden die Kulturüberstände in
den Näpfen, in denen Wachstun von Hybridomen festgestellt wurde, nach dem
folgenden Verfahren auf die Eizeugung von monoklonalem anti-human-BCDF-
Antikörper untersucht: Von E. coli erzeugtes rekombinantes human-BCDF (2 µg/ml)
aufgelöst in PBS wurde getrennt in die Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte gegeben
und über Nacht bei 4ºC stehengelassen, um das human-BCDF in den Näpfen zu
fixieren. Nach dem Entfernen von ungebundenem human-BCDF wurde PBS, das 0,5 %
BSA enthielt, in die Näpfe gegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
stehengelassen. Nach dem Entfernen des ungebundenen BSA wurden Kulturüberstände
der Hybridomen getrennt in jeden Napf gegeben und 2 Stunden lang bei
Raumtemperatur stehengelassen. Nach dem Waschen der Näpfe mit PBS, das 0,05 %
Tween 20 enthielt, wurde mit Peroxidase markierter anti-Maus-lg-Antikörper (im
Handel erhältlich bei DAKO) den Näpfen zugegeben und 2 Stunden lang bei
Raumtemperatur stehengelassen. Nach dem Waschen der Näpfe mit PBS, das 0,05 %
Tween20 enthielt, wurde der Näpfen 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-
schwefelsäure) [ABTS] und Wasserstoffperoxid zugegeben, und das
Absorptionsvermögen der Näpfe wurde gemessen. Es wurde festgestellt, daß die
Hybridomen in zwei Näpfen monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper erzeugten,
und jedes Hybridom wurde kloniert um zwei Klonen mit der Bezeichnung HH61-8 und
HH61-10 zu erhalten. Die Spezifitäten der monoklonalen Antikörper HH61-8 und
HH61-10 hinsichtlich Absorptionsvermögen bzw. dekadischen Extinktion der Näpfe
werden iii nachstehender Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Antikörper
Absorptionsvermögen
Normaler Maus-IgG (Kontrolle
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2) Untersuchung, ob monoklonal anti-human-BCDF-Antikörper das gleiche Epitop
erkennen
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Ob der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper das gleiche Epitop erkennt wie die
bekannten monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörper wurde nach dem folgenden
Verfahren untersucht: Mit PBS auf (eine Konzentration von 10 µg/ml verdünntes BCDF
wurde in einer Menge von jeweils 100 µl in die Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte
(im Handel erhältlich bei Nunc) gegeben und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die
Lösung in den Näpfen wurde verworfen und 0,5% BSA enthaltendes PBS wurde in einer
Menge von 200 µl/Napf in jeden Napf gegeben, gefolgt von einstündigem Stehenlassen
bei Raumtemperatur. Die Lösung in den Näpfen wurde dann verworfen, und 50 µl einer
mit etwa 1 µg/µl Biotin markierten monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörperlösung in
BSA und 50 µl an 100 µg/ml nichtmarkiertem monoklonalem human-BCDF-Antikörper
in BSA wurde in jeden Napf gegeben, gefolgt von zweistündigem Reagierenlassen bei
Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde die Lösung verworfen, und jeder Napf
wurde dreimal mit PBS gewaschen, das 0,5 % Tween 20 enthielt (PBS-Tween). Dann
wurden jedem Napf 100 µl Avidinlösung und mit Biotin markierte alkalische
Phosphatase (Vectorstein ABC-Set) zugegeben, und das Cemisch wurde eine Stunde
lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Schließlich wurde jeder Napf dreimal mit
PBS-Tween gewaschen, und in jeden Napf wurden 100 µl 1 mg/ml p-
Nitrophenolphosphatlösung gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur
stehengelassen, bis es die richtige Farbe aufwies, wenn das Absorptionsvermögen des
Gemisches bei 405 nm gemessen wurde.
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Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. In Tabelle 2 weist die Markierung "+"
darauf hin, daß Bindungshemmung auftrat (d.h., die Epitope der monoklonalen
Antikörper sind identisch), und die Markierung "-" weist darauf hin, daß keine
Bindungshemmung auftrat (d.h. die Epitope der monoklonalen Antikörper sind
verschieden). Wie aus Tabelle 2 zu entnehmen ist, erkennen die erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper HH61-8 und HH61-10 ein Epitop, das sich von dem
unterscheidet, das von den herkömmlichen monoklonalen anti-human-BCDF-
Antikörpern MH166 und αBSF2-77 erkannt wird.
Tabelle 2
Biotin-markierter monoklonaler anti-human-BCDF-Antikörper
nicht-markierter
Beispiel 2
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Neutralisation von human-BCDF-Aktivität durch monoklonale anti-human-BCDF-
Antikörper
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(1) Zu 5 µg/ml human-BCDF-Lösung, die sich in den Näpfen einer 96-Napf-
Mikrotiterplatte befanden, wurden die erfindungsgemäßen monoklonalen anti-human-
BCDF Antikörper HH61-8 oder HH61-10 in einer Menge von 100 - 0,05 µg/ml
zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37ºC reagieren gelassen. Jedem
Reaktionsgemisch wurden SKW6-CL-4-Zellen, die in Gegenwart von human-BCDF zu
IgM-erzeugenden Zellen differenziert werden, in einer Populationsdichte von 1 x 10&sup5;
Zellen/ml zugegeben, und das resuitierende Gemisch wurde 72 Stunden lang kultiviert.
Der Kulturüberstand in jedem Napf wurde dann gewonnen und die IgM-Menge nach
dem wohlbekannten Enzym-Immunoassay bestimmt.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt. In Fig. 1 bezeichnen die weißen Kreise die
Ergebnisse bei Verwendung des monoklonalen Antikörpers HH61-8, und die schwarzen
Kreise bezeichnen die Ergebnisse bei Verwendung des monoklonalen Antikörpers
HH61-10. Linie A gibt das Absorptionsvermögen an, wenn kein monoklonaler
Antikörper zugegeben wurde, und Linie B bezeichnet den Hintergrund.
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Wie aus Fig. 1 zu erkennen, neutralisierten die monoklonalen Antikörper HH61-8 und
HH61-10 die human-BCDF-Aktivität spezifisch dosisabhängig, und sie neutralisierten
die human-BCDF-Aktivität bei einer Konzentration von 25 µg/ml oder mehr vollständig.
Beispiel 3
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Herstellung von Enzym-lmmunoassaysystem unter Verwendung von zwei
monoklonalen anti-human-BCDF-Antikörpern, die verschiedene Epitope erkennen
Jeweils 100 µl gereinigte Lösung des monoklonalen anti-human-Antikörpers HH61-8
wurden in die Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte gegeben und über Nacht bei 4ºC
stehengelassen. Nach dem Entfernen des ungebundenen monoklonalen anti-human-
BCDF-Antikörpers wurde jedem Napf 1,0% BSA enthaltendes PBS zugegeben, und das
Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Entfernen des
ungebundenen BSA wurden in jeden Napf 50 µl Standard-human-BCDF-Lösung mit
einer bekannten Konzentration gegeben, und dann wurden jedem Napf 50 µl
Peroxidase-markierter monoklonaler anti-human-BCDF-Antikörper MH166 zugegeben.
Das resultierende Gemisch wurde zwei Stunden lang bei 37ºC stehengelassen. Nach
dem Waschen der Näpfe wurden in jeden Napf 100 µl einer Lösung des
Peroxidasesubstrats (ABTS-Wasserstoffperoxid) gegeben, und das Gemisch wurde eine
Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Enzymreaktion wurde durch die
Zugabe von jeweils 100 µl 1%iger Oxalsäure abgebrochen, und das
Absorptionsvennögen bei 415 nm von jedem Napf wurde gemessen. Die oben
beschriebene Messung wurde unter Verwendung von human-BCDF-Lösungen mit
unterschiedlichen BCDF-Mengen durchgeführt.
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Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, kann durch das
oben beschriebene Enzymimmunoassay human-BCDF in einer Menge von etwa 5 pg/ml
oder darüber quantifiziert werden.