DE69012552T2

DE69012552T2 - Avidin-biotin assistiertes immunassayverfahren.

Info

Publication number: DE69012552T2
Application number: DE69012552T
Authority: DE
Inventors: Jack Fellman; Adolph Ferro; Stefan Gavojdea; Thomas Thieme
Original assignee: Epitope Inc
Current assignee: Orasure Technologies Inc
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1990-01-25
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2010-01-26
Also published as: NO912951L; WO1990008957A1; NO912951D0; FI913615A0; EP0455735B1; CA2045673A1; AU640635B2; JPH04503109A; ATE111604T1; EP0455735A1; DE69012552D1; AU5098690A; DK0455735T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf den Nachweis von Antikörpern in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Tränen, Serum oder Plasma zu Durchmusterungs- und diagnostischen Zwecken. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf den Nachweis von Antikörpern, die in geringen Mengen in solchen Flüssigkeiten vorhanden sind, oder auf Fälle, bei denen kleine Mengen solcher Flüssigkeiten verfügbar sind und die vorhandenen Antikörper dennoch antigene Spezifitäten haben, die für bestimmte Krankheitszustände charakteristisch sind, und von diagnostischem Wert sind.
Körperflüssigkeiten von Säugern, wie Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Urin, Milch, Samenflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit usw., können Antikörper enthalten, die sich für die Diagnose von Krankheiten eignen, einschließlich solcher aus bakteriellen und viralen Infektionen und aus Autoimmunreaktionen. Körperflüssigkeiten wie Speichel haben gegenüber Serum und Plasma als Quellen dieser diagnostisch wertvollen Antikörper einen bedeutenden Vorteil, da sie ohne die Möglichkeiten und Gefahren, die mit der Entnahme von Blutproben verbunden sind, erhalten werden können. Die Konzentration von Antikörpern ist in diesen Flüssigkeiten jedoch häufig so niedrig, daß herkömmliche Tests für Antikörper undurchführbar werden.
Insbesondere Speichel wirft als diagnostischer Indikator Probleme auf. Diese Probleme gehen zurück auf die geringe Konzentration von Antikörpern in Speichel und die Schwierigkeit, ausreichende Speichelmengen für einen verläßlichen diagnostischen Test, der rasch durchgeführt werden kann, zu erhalten und zu verarbeiten.

Stand der Technik

GB-A-2 109 931 offenbart ein Immunoassaysystem, bei dem das Filtrat aus einer Säule mit Hilfe eines kompetitiven Assays analysiert wird.
WO-A-86/03589 offenbart ein Immunoassay, das ein säulenartiges Gerät verwendet, das Analyte mittels eines immobilisierten Bindungsreagenses, das für den interessierenden Analyten spezifisch ist, abfängt.
EP-A-0 060 700 offenbart ein kompetitives Immunoassaysystem, bei dem der interessierende Analyt durch ein biospezifisches Reagens auf einem festen Träger abgefangen wird. Das Avidin-Biotin-System ist als mögliche Markierung angegeben.
US-A-4 228 237, EP-A-0 071 976 und US-A-4 535 057 beschreiben die Verwendung von Konjugaten aus spezifischem Bindungspartner und Biotin- bzw. Avidinmarkierung als Signalnachweissystem in Immunoassays.

Kurzbeschreibung der Erfindung

In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines interessierenden Antikörpers in einer den interessierenden Antikörper und andere Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines kovalent an einen Träger gebundenen Antikörper-bindenden Proteins; Kontaktieren und Inkubieren einer Testkörperflüssigkeit, die den interessierenden Antikörper und andere Antikörper enthält, mit dem proteingebundenen Träger, wobei das Protein mit den Antikörpern unter Immobilisierung der Antikörper einschließlich des interessierenden Antikörpers reagiert; Kontaktieren und Inkubieren eines biotinylierten Antigens, das für den interessierenden Antikörper spezifisch ist, mit dem immobilisierten interessierenden Antikörper, wobei das biotinylierte Antigen mit dem immobilisierten Antikörper unter Immobilisierung des biotinylierten Antigens reagiert; Kontaktieren und Inkubieren einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist, mit dem proteingebundenen Komplex aus immobilisiertem biotinyliertem Antigen und immobilisiertem Antikörper, wobei das enzymmarkierte Avidin unter Immobilisierung mit dem Komplex reagiert; Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes mit einer Substratlösung, wobei das an Avidin gebundene Enzym eine Reaktion des Substrats induziert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt erzeugt; und Korrelieren des nachweisbaren Reaktionsprodukts mit der Anwesenheit des nachzuweisenden interessierenden Antikörpers.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines interessierenden Antikörpers in einer diesen Antikörper und andere Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines kovalent an einen Träger gebundenen Antikörper-bindenden Proteins; Kontaktieren und Inkubieren einer Testkörperflüssigkeit, die diesen Antikörper und andere Antikörper enthält, mit einer Lösung eines Antigens, das für den Antikörper spezifisch ist, wobei das Antigen biotinyliert ist; Kontaktieren und Inkubieren dieser kombinierten Lösung mit einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist; Kontaktieren und Inkubieren der kombinierten Lösung mit dem Träger, so daß ein Komplex aus Antikörper, biotinyliertem Antigen und enzymmarkiertem Avidin durch den Träger immobilisiert wird; Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes mit einer Substratlösung, wobei das an Avidin gebundene Enzym eine Reaktion des Substrats induziert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt erzeugt; und Korrelieren des nachweisbaren Reaktionsprodukts mit der Anwesenheit des nachzuweisenden Antikörpers.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens in einer biologischen Testflüssigkeit, die das Antigen enthält, mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines Fc-Rezeptor-Antikörper-bindenden Proteins, das kovalent an einen Träger gebunden ist; Bereitstellen einer Lösung der Testflüssigkeit, die das Antigen enthält und eine kleine Menge Antikörper gegen das Antigen in wäßrigem Puffer enthält; Kontaktieren und Inkubieren der Lösung mit dem Träger, so daß ein Komplex aus Antikörper und Antigen durch den Träger immobilisiert wird; Bereitstellen einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers, der so modifiziert ist, daß es sich um ein Fab-Fragment handelt, dem der Fc-Bereich fehlt, welcher an das Protein bindet, jedoch seine Fähigkeit zur Bindung von Antigen beibehält, wobei der Antikörper biotinyliert ist; Kontaktieren und Inkubieren der Lösung mit dem immobilisierten Komplex, so daß ein Antikörper-Antigen-Fab-Antikörper-Komplex durch den Träger immobilisiert wird; Bereitstellen einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist; Kontaktieren und Inkubieren der Lösung mit dem immobilisierten Antikörper-Antigen-Fab-Antikörper-Komplex, wobei das enzymmarkierte Avidin mit dem Komplex unter Immobilisierung des enzymmarkierten Avidins reagiert; Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes mit einer Substratlösung, wobei das an Avidin gebundene Enzym eine Reaktion des Substrats induziert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt auf dem immobilisierten Komplex erzeugt; und Korrelieren des nachweisbaren Reaktionsprodukts mit der Anwesenheit des nachzuweisenden Antikörpers. Die Erfindung zieht auch ein Test-Kit in Betracht, das einen Träger mit einem kovalent daran gebundenen Antikörper-bindenden Protein umfaßt. Das Kit umfaßt auch ein biotinyliertes Antigen, das spezifisch für einen interessierenden Antikörper ist (zum Antikörpernachweis), oder einen biotinylierten monoklonalen Antikörper, der so modifiziert ist, daß es sich um ein Fab-Fragment handelt, dem der Fc-Bereich fehlt, welcher an das Protein bindet, jedoch seine Fähigkeit zur Bindung eines interessierenden Antigens beibehält (zum Antigennachweis), eine Lösung von enzymgebundenem Avidin und ein Substrat für das Enzym.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht schematisch den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Bindemechanismus; und
Fig. 2 stellt ein Schema der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vorrichtung dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur raschen Isolierung von Antikörpern aus einer Körperflüssigkeit durch Leiten der Flüssigkeit durch eine poröse Matrix, an die die Substanz Protein A chemisch gebunden ist, ein Protein, das rasch an Antikörpermoleküle bindet. Die Antikörper werden so rasch aus der Flüssigkeit entfernt, während sie durch die Matrix sickert, und die Antikörper werden für den anschließenden kolorimetrischen Test auf antigene Spezifität in der Matrix konzentriert. Vorzugsweise ist die poröse Matrix eine vorherbestimmte Menge eines zu Kugeln geformten Agarose-Gels mit kovalent gebundenem Protein A, die in eine Säule aus einem transparenten Material gegeben wird. Die Säule hat am Boden eine poröse Fritte, um das Agarose-Gel zurückzuhalten, während sie die Körperflüssigkeit rasch durch das Gel hindurchsickern läßt. Die Menge des Protein-A-haltigen Gels in der Säule reicht aus, um eine optimale Menge der Antikörper in der Körperflüssigkeit zu binden und eine ausreichend große Oberfläche für den anschließenden kolorimetrischen Test bereitzustellen.
Protein A ist ein Protein, das aus der Zellwand des Bakteriums Staphylococcus aureus (Cowan-Stamm 1) isoliert wird. Protein A (das auch Fc-Rezeptor des Typs 1 genannt wird) ist als aus diesen Bakterien isoliertes Protein und auch in einer in anderen Bakterien exprimierten rekombinanten Form kommerziell erhältlich. Protein A kann durch jede von mehreren üblicherweise verwendeten chemischen Reaktionen kovalent mit Agarose verknüpft werden. Einige Beispiele für diese Techniken sind die folgenden: Aminogruppen oder Carboxygruppen werden nach dem Cyanbromidverfahren mit Diaminoalkanen (Einführung der Aminogruppe) oder Aminocarboxyalkanen (Einführung von Carboxygruppen) in die Agarosematrix eingeführt. Dieses Verfahren wird von M. Wilchek et al. beschrieben, "The purification of biologically active compounds by affinity chromatography", Methods of Biochemical Analysis, 23:347-385, 1986. Diese derivatisierten Agarose-Gele werden dann durch Verwendung der häufig verwendeten Carbodiimidchemie oder die Verwendung häufig verwendeter Abgangsgruppen wie N-Hydroxysuccinimid, das mit O-Bromacetyl-N-hydroxysuccinimid in die aminoderivatisierte Agarose eingeführt wird, mit Carboxygruppen oder Aminogruppen an dem Protein gekoppelt. Andere bekannte Techniken können verwendet werden, um Protein A kovalent an Agarose oder andere Polysaccharidmatrices zu binden.
Weitere Proteine, die Antikörper rasch und mit hoher Avidität binden, sind verfügbar und können für die in dieser Anmeldung beschriebenen Zwecke anstelle von Protein A verwendet werden. Zu diesen Proteinen gehören bestimmte Proteine, die aus Streptokokken der Gruppe A isoliert werden (Fc-Rezeptor des Typs II), Protein G (Fc-Rezeptor des Typs III), das aus den meisten humanen Streptococcus-C- und -G-Stämmen isoliert wird, Fc-Rezeptor des Typs IV, der aus einigen Streptococcus-Stämmen des G-Stammes isoliert wird, sowie die aus Streptococcus zooepidimicus isolierten Fc-Rezeptoren der Typen V und VI. Jedes dieser Proteine hat gegenüber den anderen bestimmte Vorteile bezüglich der Stärke seiner Bindung an verschiedene Unterklassen von Immunoglobulinen und Immunoglobuline von verschiedenen Säugerarten.
Andere Typen poröser Matrices sind für die Zwecke dieser Erfindung geeignet, wenn sie eine geringe nichtspezifische Bindung von Proteinen und funktionelle Gruppen wie Hydroxygruppen oder eine einzigartige Chemie besitzen, die die kovalente Bindung von Protein A oder anderer Proteine, die Antikörper binden, erlaubt. Ein Beispiel für eine solche Matrix ist das von Röhm Pharma unter dem Namen "Eupergit C" erhältliche Methacrylamidpolymer aus Glycidylmethacrylat in Form von Kügelchen.
Nach der Bindung von Antikörpern an die poröse Matrix, wie oben angedeutet, werden überschüssige Mengen der Körperflüssigkeit durch Waschen mit einem geeigneten wäßrigen Puffer von der Matrix entfernt. Die Matrix mit gebundenem Antikörper wird dann als Substrat verwendet, um auf die antigene Spezifität des gebundenen Antikörpers zu testen.
Für den Test auf die antigene Spezifität isolierter Antikörper stehen mehrere Verfahren zur Verfügung. Dazu gehört die Verwendung von Enzymen wie Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase, die kovalent an die interessierenden Antigene gebunden sind. Diese Technik wird in T. Kitagawa et al., "Enzyme coupled immunoassay of insulin using a novel coupling reagent", Journal of Biochemistry, 79:233-236, 1976, erläutert. Diese Enzyme werden verwendet, um Farbreaktionen zu entwickeln, die die Gegenwart des Antigens anzeigen. Ein weiteres verfügbares Verfahren ist die kovalente Bindung von Biotin an das Antigen, wie in G.R. Dreesman et al., U.S.-Patent 4,535,057; D.A. Fuccillo, "Application of the avidin-biotin technique in microbiology", Bio-Techniques, 3:494- 501, 1985; und M. Wilchek et al., "The use of the avidin-biotin complex as a tool in molecular biology", Methods of Biochemical Analysis, 26:1-45. Biotin (auch als Vitamin H bekannt) hat die folgende chemische Struktur:
Es wird mit sehr hoher Avidität (Kd 10&supmin;¹&sup5;M) durch das Protein Avidin gebunden. Pro Avidinmolekül werden vier Biotinmoleküle gebunden. Wenn Enzyme wie Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase chemisch an das Avidinmolekül gebunden werden, kann die Avidin-Biotin-Wechselwirkung eine molekulare Brücke zwischen dem interessierenden Antigen und dem Enzym, das verwendet wird, um die Farbreaktion zu entwickeln, die die Gegenwart des Antigens anzeigt, bilden. Da jedes Avidinmolekül vier Biotin-Bindebereiche hat, wird die Zahl der Enzymmoleküle pro Antikörpermolekül in Gegenwart von überschüssigem biotinyliertem Antigen erhöht, und die Empfindlichkeit des Tests wird erhöht.
Die chemische Bindung zwischen dem Antigen und dem Biotinmolekül kann durch mehrere verschiedene verfügbare chemische Reaktionsfolgen gebildet werden. Diese Reaktionen verwenden typischerweise N-Hydroxysuccinimidyl- oder Iodabgangsgruppen, um Aminogruppen in den Proteinstrukturen des Antigens zu derivatisieren. Typische Reagentien sind unten gezeigt:
Kohlenhydrat-Antigene können durch die Reaktion von Biotinhydrazid mit Aldehydgruppen, die in Polysaccharidstrukturen nach der Reaktion mit Periodat erzeugt werden, biotinyliert werden. Die Auswahl des besten Biotinylierungssystems unter diesen und anderen verfügbaren chemischen Reaktionen hängt von der besonderen Natur des getesteten Antigens ab.
Die vorliegende Erfindung stellt eine einzigartige Anwendung der Verwendung der Biotin-Avidin-Reaktion zur Verknüpfung eines Antigens mit einem Enzymnachweissystem dar. Die Einzigartigkeit der Verwendung beruht auf der Tatsache, daß das Antigen immobilisiert wurde, da es durch eine poröse Matrix hindurchtritt, die einen spezifischen Antikörper enthält, der seinerseits durch Protein A immobilisiert wurde, wie in Fig. 1 gezeigt, die das System schematisch veranschaulicht.
In Gegenwart von überschüssigem biotinyliertem Antigen können für jeden durch Protein A immobilisierten Antikörper viele Avidin- Enzym-Konjugate an das Gel binden. Dies verleiht der Technik ihre hohe Empfindlichkeit.
Das an das Avidin gekoppelte Enzym bestimmt den beim Nachweis des Antigens verwendeten kolorimetrischen Test, bei dem es sich letztlich um einen Test auf die Gegenwart bestimmter Antikörpertypen in der biologischen Flüssigkeit handelt. Zwei der häufiger verwendeten Enzyme sind Alkalische Phosphatase und Meerrettich- Peroxidase. Diese Enzyme können mit Hilfe häufig verwendeter Wege für Proteine chemisch an das Avidinmolekül gebunden und mit ihm verknüpft werden; die kovalente Proteinverknüpfung beinhaltet die Verwendung von Glutaraldehyd oder die Verwendung anderer homobifunktioneller und heterobifunktioneller Reagentien, wie Disuccinimidylsuberat und Succinimidyl-N-(4-carboxycyclohexylmethyl)maleinimid (S. Yoshitake et al., "Conjugation of glucose oxidase from Aspergillus niqer and rabbit antibodies using N-hydroxysuccinimide ester of N-(4-carboxy-cyclohexylmethyl)-maleimide", Eur. J. Biochem., 101:395-399). Diese Chemie verwendet die Reaktivität der Aminogruppe von Proteinen mit dem Succinimidylester und die Reaktivität der freien SH-Gruppe von Proteinen mit der Maleinimid-Struktureinheit.
Wenn Meerrettich-Peroxidase als Nachweisenzym verwendet wird, sind typische Substrate Diaminobenzidin, 4-Chlor-1-naphthol oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(7). Wenn einer dieser Stoffe mit Wasserstoffperoxid gemischt und dem Enzym ausgesetzt wird, bildet sich ein dunkel gefärbtes polymeres Material. Dieses gefärbte Produkt liegt fest, d.h. es ist unlöslich und schlägt sich auf dem festen Träger nieder. Die Erzeugung dieses gefärbten Niederschlags zeigt die Gegenwart des Enzyms und im Zusammenhang dieser Erfindung die Anwesenheit von Antikörpern, die spezifisch für das untersuchte Antigen sind, an. Andere Stoffe, die stark gefärbte Niederschläge ergeben, werden verwendet, um die Gegenwart von Alkalischer Phosphatase anzuzeigen, wie ein Gemisch von 4-Chlor- 2-methylanilin und 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-4'-chlor-2'-methylanilidphosphat oder ein Gemisch von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblautetrazolium.
In der vorliegenden Erfindung erfolgt das Abfangen von Antikörpern durch das an der unlöslichen Matrix befestigte Protein A innerhalb von Minuten mit einer Gesamttestzeit von weniger als 15 Minuten. Die Verwendung der Säulentechnik macht die vorliegende Erfindung auch schnell und bequem und erlaubt die Konzentrierung von Antikörpern aus einem großen Flüssigkeitsvolumen.

Beispiel I

Das folgende ist eine typische und praktische Verwendung der Ideen und Techniken, die die Grundlage dieser Erfindung bilden: Vernetzte Agarose, die aus Kügelchen besteht (75-300 um Durchmesser) und an die Protein A durch die oben angegebenen Techniken gebunden wurde (entweder durch den Hersteller oder einen kommerziellen Lieferanten, z.B. Bio Rad Corp. Product 1536154), wird in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und 12 Stunden bei 4ºC als 25%ige Suspension in PBS, das 0,75% Gelatine und 0,3% des Tensids Tween 20 enthält, inkubiert. Dies reduziert die nichtspezifische Bindung von Proteinen an die Agarose. Die Agarose-Protein-A-Kügelchen werden wiederum in PBS gewaschen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wird eine saubere Polystyrolsäule 10 (8 mm Innendurchmesser x 102 mm) mit einem Volumen von 6 Milliliter und eine poröse (70 um Porengröße) Polyethylenscheibe (Fritte) 12 am Boden verwendet (z.B. Pierce Chemical Co. Produkt 29920). Eine Kappe 14 wird an der Bodenspitze der Säule verwendet, um den Fluß der Flüssigkeit durch die Säule zu steuern. Säulen mit anderen Abmessungen, die die Grundanforderungen der Erfindung erfüllen, lassen sich verwenden. Zweihundert Mikroliter der vorbereiteten Agarose- Protein-A-Kügelchen 16 werden mit ausreichend PBS zum Übertragen auf die Fritte am Boden der Säule gebracht. Eine zweite Fritte 18 wird oben auf die abgesetzten Agarosekügelchen gelegt, was zu einer 4 mm dicken Scheibe von Agarosekügelchen führt, die sandwichartig zwischen 2 porösen Fritten eingeschlossen sind. Die hier beschriebene Säule erfüllt die wesentliche Voraussetzung einer Vorrichtung, die (1) eine ausreichende Menge von Agarose- Protein-A-Kügelchen enthält, (2) eine leichte Beobachtung der Kügelchen ermöglicht, (3) das Fließen einer zu testenden Körperflüssigkeit durch die Kügelchen mit ausreichender Kontaktfläche zwischen gelösten Stoffen in der Körperflüssigkeit und dem an den Kügelchen befestigten Protein A erlaubt, (4) das nacheinander erfolgende Zugeben und Auswaschen der Reagentien erlaubt, die verwendet werden, um die kolorimetrischen Tests auf die Antikörper in der Körperflüssigkeit durchzuführen.
Nachdem man die Agarose-Protein-A-Kügelchen wie beschrieben in die Säule gebracht hat, wird etwa ein Milliliter der zu testenden Körperflüssigkeit mit 2 Milliliter eines wäßrigen Puffers verdünnt, bei dem es sich um 0,25 M TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), 0,37% Gelatine, 0,30% Tween 20, 0,075 M NaCl und 0,01 M Natriumphosphat handelt. Dieser Puffer wird "Verdünnungspuffer" genannt und hat einen pH-Wert von etwa 8,0. Die verdünnte Körperflüssigkeit wird in die Säule auf die obere Fritte gegeben und durch Entfernen der Bodenkappe durch die Säule laufen gelassen (3 bis 5 Minuten für diesen Schritt). Die Säule wird dann zweimal mit 3-ml-Portionen Verdünnungspuffer gewaschen (3 Minuten pro Waschvorgang). Zehn Mikrogramm biotinyliertes Antigen (vom Hersteller hergestellt) werden zu 2 ml Verdünnungspuffer gegeben und durch die Säule laufen gelassen (2 Minuten). Zusätzliche Empfindlichkeit kann erreicht werden, indem man Antigen 5 Minuten mit Körperflüssigkeit vorinkubiert und dann durch die Säule laufen läßt. Darauf folgen 2 x 3-ml-Waschvorgänge mit Verdünnungspuffer (jeweils 3 Minuten). Zwanzig Mikrogramm Avidin-Peroxidase- Konjugat (hergestellt vom Hersteller oder vom kommerziellen Lieferanten, z.B. Sigma Chemical Co. Produkt 3151) werden in 2 ml Verdünnungspuffer gelöst und durch die Säule laufen gelassen (2 Minuten). Wiederum wird die Säule zweimal mit 3 ml Verdünnungspuffer gewaschen (jeweils 3 Minuten). Auf diese Waschvorgänge folgt das Durchlaufenlassen von 2 ml einer Substratlösung durch die Säule. Bei der Substratlösung kann es sich um 0,5 mg/ml 3,3- Diaminobenzidin in PBS, das 0,00004 Prozent H&sub2;O&sub2; enthält, handeln (2 Minuten). Das Ausmaß der Verdunkelung des Gels an dieser Stelle zeigt die Gegenwart von Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit an, die spezifisch für das Testantigen sind. Ein weiterer Waschvorgang mit Wasser ermöglicht es, die Testsäule mit der Kappe zu verschließen und mehrere Tage bei Kühlschranktemperatur aufzubewahren, wobei sich eine stabile Farbe entwickelt.
Die Kontrolle besteht darin, daß man gleichzeitig Säulen mit bekannten positiven und negativen Proben von Körperflüssigkeiten oder geeigneten Lösungen positiver und negativer Antikörper laufen läßt. Alternative oder zusätzliche Kontrollen zum Zwecke des Farbvergleichs können auf Agarose ohne Protein A (negativ) oder Agarose mit daran gekoppeltem Biotin beruhen. Biotin, das eine Carbonsäure enthält, kann durch dieselben chemischen Reaktionen, die man verwendet, um Protein A an Agarose zu koppeln, an Agarose gekoppelt werden. Diese Farbvergleichskontrollen kann man in derselben Säule wie der Test laufen lassen, indem man einfach die zusätzlichen Agarosealiquote mit dem Agarose-Protein-A in die Säule gibt; jedes Agarosealiquot wird durch eine Polyethylenfritte von den anderen getrennt.

Beispiel II

Das in Beispiel I beschriebene Verfahren zum Testen von 1 ml Körperflüssigkeit dauert etwa 27 Minuten. Diese Zeit kann durch die folgende Modifizierung erheblich reduziert werden: Ein Milliliter Körperflüssigkeit wird mit 2 ml Verdünnungspuffer kombiniert. Zehn Mikrogramm Biotin-Antigen-Komplex werden hinzugefügt, anschließend wird 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zwanzig Mikrogramm Avidin-Peroxidase-Komplex werden hinzugefügt, und das Gemisch wird unmittelbar darauf durch die Säule geschickt (3 Minuten). Darauf folgen 2 Waschvorgänge mit 3 ml Verdünnungspuffer (6 Minuten) und die Farbentwicklung mit 2 ml Diaminobenzidin- H&sub2;O&sub2;-Substratlösung (2 Minuten). Die Gesamttestzeit beträgt mit diesem modifizierten Verfahren etwa 13 Minuten, und die Empfindlichkeit ist gleich oder größer als die des vorher beschriebenen.

Beispiel III

Unter Verwendung des abgekürzten Säulenverfahrens von Beispiel II testeten wir den Speichel und das Serum von AIDS-Patienten (Acquired Immune Deficiency), von denen bestätigt worden war, daß sie Serumantikörper gegen die HIV-1-Proteine (Human Immunodeficiency Virus-1) besitzen (positive Proben). Zehn Mikrogramm biotinyliertes HIV-Lysat wurden pro Säule verwendet. Bei Verwendung von 6 Mikroliter positivem Serum oder 150 Mikroliter positivem Speichel erhielt man mit Hilfe des Diaminobenzidinsubstrats eine fast maximale dunkelbraune Farbe auf den Agarosekügelchen. Kontrollserum und -speichel von uninfizierten Personen ergaben mit dem gleichen Verfahren im wesentlichen farblose Agarosekügelchen. Dieselben Ergebnisse wurden bei Verwendung eines durch Expression eines rekombinanten Gens (kommerzielles Produkt, Hüllpeptid p121, Centocor, Inc.) erzeugten HIV-Proteins als Antigen erhalten. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Verwendung eines Viruslysats des Virus HTLV-1 und Serum von infizierten Patienten erhalten.
In einer ähnlichen Weise sollte sich diese Erfindung für den Nachweis von krankheitsspezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten von Patienten eignen, die durch solche Erreger wie Hepatitis B und Herpes simplex Typ I und Typ II infiziert sind.
Bei einem anderen Format, das die Grundfunktion der Säule erfüllt, bringt man das Sandwich aus Fritte-(Protein-A-Agarose)- Fritte in die Spitze einer Kunststoffeinwegpipette. Die Fritten keilen sich fest gegen die Wände der Spitze, wobei sie die Agarosekügelchen einschließen und das Fließen von Flüssigkeit durch die Kügelchen ermöglichen. Wenn man sie an der Standardhandpipettiereinheit befestigt, kann die Spitze verwendet werden, um die Körperflüssigkeiten und verschiedene Reagentien und Waschflüssigkeiten durch die Agarosekügelchen zu ziehen.

Beispiel IV

Zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, Antikörper nachzuweisen, die spezifisch für HIV und andere Antigene sind, kann die vorliegende Erfindung so modifiziert werden, daß die interessierenden Antigene direkt nachgewiesen werden. Auf biotinyliertes Antigen wird bei diesem Verfahren verzichtet. Die zu testende biologische Flüssigkeit wird in der Säule zu Blockierungspuffer gegeben. Zwei Mikrogramm menschlicher Antikörper gegen das (die) Antigen(e) wird ebenfalls zu dieser Lösung im Blockierungspuffer gegeben. Nach 5-10 Minuten Inkubation werden 2 Mikrogramm eines monoklonalen Mausantikörpers, der so modifiziert wurde, daß es sich um ein Fab-Fragment handelt (dem der Fc-Teil des Moleküls, der an Protein A bindet, fehlt, das jedoch seine Fähigkeit zum Binden von Antigen beibehält), hinzugegeben (D.W. Dresser, "Assays for immunoglobulin-secreting cells", in D.M. Weir (Hrsg.), Handbook of Experimental Immunology, 34. Ausg., Blackwell Scientific Publications, Oxford; und J.J. Langone, "Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by Streptococci and Pneumonococci", Advances in Immunology, 32:157-252). Dieser modifizierte monoklonale Antikörper wird ebenfalls wie zuvor beschrieben biotinyliert. Der monoklonale Antikörper bindet an diejenigen Bereiche des Antigens, die nicht an den menschlichen Antikörper gebunden sind. Nach weiteren 5-10 Minuten Inkubation wird das Avidin-Enzym-Nachweisreagens hinzugefügt und das Gemisch durch die Säule laufen gelassen. Nach dem Waschen wird wie zuvor der chromogene Nachweis durchgeführt. Nur das Fab-Fragment des monoklonalen Antikörpers bindet an die Säule, und daher sieht man nur eine Farbentwicklung, wenn das interessierende Antigen zugegen ist. Im Gegensatz zu anderen Immunoassays zum direkten Nachweis von Antigen wird bei dieser Technik das Antigen durch Binden von Antikörpern einschließlich des Antikörpers, der endogen in der biologischen Probe vorhanden ist, als Antigen- Antikörper-Komplex abgefangen. Auch können größere Volumina biologischer Flüssigkeit auf einer kleinen Nachweisfläche konzentriert werden.

Beispiel V

Diese Technik kann auch an biologische Flüssigkeiten angepaßt werden, die über keine endogenen Antikörper gegen das interessierende Antigen verfügen, wobei es keine anderen Quellen menschlicher Antikörper, die spezifisch für das Antigen sind, gibt. Dies wäre zum Beispiel in einem Pflanzengewebeextrakt der Fall, das auf Antigene eines Pflanzenpathogens getestet werden soll. Hier würde man zwei monoklonale Antikörper verwenden, die spezifisch für die Antigene des Pathogens sind. Der eine Antikörper würde zu dem Extrakt gegeben, um das Antigen zu binden und seine Bindung an das immobilisierte Protein A zu vermitteln. Den zweiten monoklonalen Antikörper würde man zu einem biotinylierten Fab- Fragment verarbeiten und als Nachweisantikörper verwenden.
Es gibt eine spezifische potentielle Anwendung dieser Technik zum Nachweis einer Infektion von Kartoffeln durch Corynebacterium sepedonicum. Eine Infektion durch C. sepedonicum erzeugt die Bakterienringfäule bei Kartoffeln, eine Krankheit mit bedeutenden kommerziellen Auswirkungen. Stengel- und Knollenextrakte betroffener Pflanzen enthalten viele dieser Gram-positiven Bakterien. In Mäusen wurden eine Vielzahl monoklonaler Antikörper gegen die Antigene von C. sepedonicum erzeugt, die in einem Immunoassay für den Organismus verwendet werden können. Extrakte verdächtiger Pflanzengewebe werden nach Standardtechniken in tensidhaltiger Flüssigkeit hergestellt, um die Löslichkeit der bakteriellen Antigene zu maximieren. Unlösliche Stoffe werden durch Filtrieren und Zentrifugieren entfernt. Zwischen 1 und 5 ml dieses Extrakts werden auf die oben beschriebene Säule gegeben. Die Säule enthält 1 ml Verdünnungspuffer und 10 Mikrogramm eines monoklonalen Antikörpers gegen ein bakterielles Hauptantigen. Zehn Mikrogramm eines zweiten monoklonalen Antikörpers, der biotinyliert und als Fab-Fragment vorhanden ist, sind ebenfalls zugegen. Dieser monoklonale Antikörper ist spezifisch für ein zweites Epitop auf demselben bakteriellen Antigen. Nach 5 Minuten Inkubation wird das Gemisch durch die Säule laufen gelassen. Die Säule wird wie oben beschrieben mit Verdünnungspuffer gewaschen. Dann wird enzymgebundenes Avidin durch die Säule geschickt, anschließend wird gewaschen, wie zuvor in Beispiel I und II beschrieben. Geeignete chromogene Substrate für das Enzym werden hinzugefügt und die Farbentwicklung im Vergleich zu positiven und negativen Kontrollen abgeschätzt, um die Gegenwart von Bakterien in den ursprünglichen Geweben zu beurteilen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines interessierenden Antikörpers in einem den interessierenden Antikörper und andere Antikörper enthaltenden Körperfluid, mit den Schritten:

a. Bereitstellen eines kovalent an einen Träger gebundenen, Antikörper-bindenden Proteins;

b. Kontaktieren und Inkubieren eines Testkörperfluids, enthaltend den interessierenden Antikörper und andere Antikörper, mit dem proteingebundenen Träger gemäß Schritt (a), wobei das Protein mit den Antikörpern unter Immobilisierung der Antikörper einschließlich des interessierenden Antikörpers reagiert;

c. Bereitstellen einer Lösung eines gegen den interessierenden Antikörper spezifischen Antigens, wobei das Antigen biotinyliert ist;

d. Kontaktieren und Inkubieren des biotinylierten Antigens gemäß Schritt (c) mit dem immobilisierten, interessierenden Antikörper gemäß Schritt (b), wobei das biotinylierte Antigen mit dem immobilisierten, interessierenden Antikörper unter Immobilisierung des biotinylierten Antigens reagiert;

e. Bereitstellen einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist;

f. Kontaktieren und Inkubieren der Lösung gemäß Schritt (e) mit dem immobilisierten, biotinylierten, antigenimmobilisierten, Antikörper-Protein-gebundenen Komplex gemäß Schritt (d), wobei das enzymmarkierte Avidin mit dem Komplex unter Immobiliserung des enzymmarkierten Avidins reagiert;

g. Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes gemäß Schritt (f) mit einer Substratlösung, wobei das an Avidin gebundene Enzym eine Reaktion mit dem Substrat induziert und ein bestimmbares Reaktionsprodukt auf dem immobilisiertem Komplex erzeugt; und

h. Korrelieren des bestimmbaren Reaktionsproduktes auf dem immobilisiertem Komplex mit der Anwesenheit des zu bestimmenden, interessierenden Antikörpers

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Körperfluid Speichel ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Träger ein beliebiges poröses Material mit einer niedrigen nicht-spezifischen Bindung von Proteien und funktionellen Gruppen oder anderen chemischen Gegebenheiten, die die Bindung von antikörperbindenden Proteinen gestatten, ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Träger Agarose ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man Farbvergleichskontrollen unter Verwendung zusätzlicher Aliquots an Agarose, voneinander getrennt mit Polyethylenscheiben, laufen läßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Protein Protein A ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Protein von Quellen abgeleitet ist, die aus der von den Typen II, III, IV, V und VI Fc-Rezeptoren gebildeten Gruppe ausgewählt sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach dem Kontaktieren und Inkubieren des Testfluids mit dem proteingebundenen Träger der Träger gewaschen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach dem Kontaktieren und Inkubieren des biotinylierten Antigens mit dem immobilisiertem Antikörper der Träger gewaschen wird .

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach dem Kontaktieren und Inkubieren des enzymgebundenen Avidins mit dem immobilisierten Antigenkomplex der Träger gewaschen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Träger in einer offenendigen Kolonne festgehalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Kolonne aus Polystyrol besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Träger von einer porösen Polyethylenscheibe gehalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Testkörperflüssigkeit vor dem Auftragen mit einem wäßrigen Puffer verdünnt wird.

15. Verfahren zum Bestimmen eines interessierenden Antikörpers in einem den interessierenden Antikörper und andere Antikörper enthaltenden Körperfluid, mit den Schritten:

a. Bereitstellen eines kovalent an einen Träger gebundenen, antikörperbindenden Proteins,

b. Kontaktieren und Inkubieren eines Testkörperfluids, enthaltend den interessierenden Antikörper und andere Antikörper, mit einer Lösung eines für den interessierenden Antikörper spezifischen Antigens, wobei das Antigen biotinyliert ist,

c. Kontaktieren und Inkubieren der kombinierten Lösung gemäß Schritt (b) mit einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist,

d. Kontaktieren und Inkubieren der kombinierten Lösung gemäß Schritt (c) mit einem Träger gemäß Schritt (a), so daß ein Komplex von Antikörper-biotinyliertem, Antigen-Enzym-markiertem Avidin durch den Träger immobilisiert wird,

e. Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes gemäß Schritt (d) mit einer Substratlösung, wobei das mit Avidin verknüpfte Enzym eine Reaktion mit dem Substrat induziert und ein bestimmbares Reaktionsprodukt auf dem immobilisiertem Komplex bildet; und

f. Korrelieren des bestimmbaren Reaktionsproduktes auf dem immobiliserten Komplex mit der Anwesenheit des zu bestimmenden Antikörpers.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem nach dem Kontaktieren und Inkubieren der kombinierten Lösung gemäß Schritt (c) mit dem Träger gemäß Schritt (a) der Träger gewaschen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Antigen HIV-1 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1 oder 15, bei dem der Assay in einer Pipettespitze durchgeführt wird.

19. Verfahren zum Bestimmen eines Antigens in einem das Antigen enthaltenden biologischen Testfluid, mit den Schritten:

a. Bereitstellen eines Fc-Rezeptor-, Antikörper-bindenden Proteins, das kovalent an einen Träger gebunden ist;

b. Bereitstellen einer das Antigen enthaltenden Lösung des Testfluids, enthaltend eine geringe Menge von Antikörpern gegen das Antigen in einem wäßrigen Puffer;

c. Kontaktieren und Inkubieren der Lösung gemäß Schritt (b) mit dem Träger gemäß Schritt (a), so daß ein Komplex aus Antikörper und Antigen durch den Träger immobilisert wird;

d. Bereitstellen einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers, der so modifiziert ist, daß er ein Fab- Fragment ist, dem der Fc-Bereich fehlt, welcher an das Protein bindet, jedoch seine Fähigkeit zur Bindung des Antigens beibehält, wobei der Antikörper biotinyliert ist;

e. Kontaktieren und Inkubieren der Lösung gemäß Schritt (d) mit dem immobilisiertem Komplex gemäß Schritt (c), so daß ein Antikörper-Antigen-Fab-Antikörperkomplex durch den Träger immobilisiert wird;

f. Bereitstellen einer Lösung von Avidin, wobei das Avidin kovalent an ein Enzym gebunden ist;

g. Kontaktieren und Inkubieren der Lösung gemäß Stufe (f) mit dem immobilisierten Antikörper-Antigen-Fab-Antikörperkomplex gemäß Stufe (e), wobei das enzymmarkierte Avidin mit dem Komplex unter Immobilisierung des enzymmarkierten Avidins reagiert;

h. Kontaktieren und Inkubieren des immobilisierten Komplexes gemäß Stufe (g) mit einer Substratlösung, wobei das mit Avidin verbundene Enzym eine Reaktion mit dem Substrat induziert und ein bestimmbares Reaktionsprodukt auf dem immobilisierten Komplex bildet; und

i. Korrelieren des bestimmbaren Reaktionsproduktes auf dem immobilisiertem Komplex mit der Anwesenheit des zu bestimmenden Antigens.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem nach dem Kontaktieren und Inkubieren des enzymgebundenen Avidins der Träger gewaschen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der anti-Antigen-Antikörper gemäß Schritt (b) und der anti-Antigen-Antikörper gemäß Schritt (d) für verschiedene Epitope des Antigens spezifisch sind.

22. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der biologischen Testflüssigkeit endogene Antikörper gegen das Antigen fehlen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das biologische Testfluid ein Pflanzenextrakt ist, der Antigene eines Pflanzenpathogens enthält.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Antigen ein Bakterium ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem das Bakterium Corynebacterium sepedonicum ist.

26. Kit für die Bestimmung eines interessierenden Antikörpers in einem den interessierenden Antikörper und andere Antikörper enthaltenden Körperfluid, enthaltend:

ein antikörperbindendes Protein, das kovalent an einen Träger gebunden ist;

ein biotinyliertes Antigen, das gegen den interessierenden Antikörper spezifisch ist;

eine Lösung von enzymverknüpftem Avidin; und

ein Enzymsubstrat.

27. Kit für die Bestimmung eines interessierenden Antigens in einem das interessierende Antigen und andere Antigene enthaltenden Körperfluid, enthaltend:

ein Fc-Rezeptor-, antikörperbindendes Protein, das kovalent an einen Träger gebunden ist;

einen biotinylierten monoklonalen Antikörper, der zu einem Fab-Fragment modifiziert ist, dem der Fc-Bereich, der an das Protein bindet, fehlt, der jedoch die Fähigkeit zur Bindung des interessierenden Antigens beibehalten hat;

eine Lösung von enzymgebundenem Avidin; und

ein Enzymsubstrat.