DE69002427T2

DE69002427T2 - Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplexes der Blutgerinnung aus Vollplasma.

Info

Publication number: DE69002427T2
Application number: DE90402395T
Authority: DE
Inventors: Thierry Burnouf Thierr Burnouf; Miryana Burnouf-Radosevich
Original assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Current assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Priority date: 1989-09-05
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2010-08-31
Also published as: HU206378B; HU905797D0; FI95654B; DD298110A5; SK431290A3; DE69002427D1; EP0416983A1; FR2651437A1; YU203490A; ES2057475T3; YU48356B; BR9004626A; CA2024667A1; FI904381A0; FR2651437B1; CZ431290A3; NO178716B; ATE91896T1; LV10053A; LV10053B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher spezifischer Aktivität ausgehend von Vollblutplasma.
Die Behandlung der Hämophilie A durch Injektion des Faktors VIII wird routinemäßig durchgeführt und macht die Verwendung von Präparaten hoher Reinheit erforderlich, einerseits um die Risiken einer Viruskontamination zu verringern, andererseits deswegen, weil die Injektionen oft wiederholt werden müssen und jeder Überschuß an kontaminierendem Material unerwünschte und für den Patienten gefährliche Immunreaktionen auslösen könnte.
Mehrere Verfahren werden bereits in den industriellen Zentren zur Behandlung von menschlichem Plasma zum Reinigen des Faktors VIII verwendet. Diese Verfahren umfassen Fällungen von kontaminierenden Proteinen durch verschiedene chemische Mittel, Molekularsiebchromatographien, Immunaffinitätschromatographien, Ionenaustauschchromatographien und verschiedene Kombinationen dieser unterschiedlichen Verfahren.
Da der Faktor VIII in geringer Menge im Plasma vorkommt, ist die Ausbeute der Reinigungsverfahren das Hauptproblem, das es zu lösen gilt. Darüber hinaus ist der Faktor VIII ein instabiles Protein, welches durch andere Faktoren im Blut aktiviert werden kann, aber im aktivierten Zustand sein therapeutisches Interesse verliert; die Reinigungsverfahren und die endgültige Dosierung müssen folglich diesem Problem angepaßt werden.
Die Anmelderin hat bereits ein Verfahren zur Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie entwickelt, welches in der europäischen patentanmeldung 0359593 beschrieben worden ist und welches es möglich macht, ein Konzentrat des Faktors VIII von hoher Reinheit zu erhalten.
Jedoch wird in diesem Verfahren, wie auch in denjenigen, die von anderen Herstellern verwendet werden, als Ausgangsmaterial eine bei tiefen Temperaturen gefällte Fraktion des Plasmas verwendet. Dieser Schritt der Fällung bei tiefer Temperatur verursacht einen Verlust von 30 bis 40% des Faktors VIII, welcher im Überstand verbleibt.
Es wäre folglich von Vorteil, ein Verfahren zur Herstellung ausgehend von nicht bei tiefer Temperatur gefälltem Vollplasma zu entwickeln, um die Verluste an Faktor VIII zu begrenzen. Darüber hinaus würde ein solches Verfahren eine sehr vorteilhafte Vereinfachung für die schlecht ausgerüsteten Herstellungszentren bedeuten, wo die Tieftemperaturfällung schwierig durchzuführen sein kann.
Aus diesem Grund hat die Anmelderin ein einfaches Reinigungsverfahren des Faktors VIII ausgehend von Vollplasma ausgearbeitet, welches die Gewinnung eines stabilen Konzentrats mit hoher Reinheit, mit einer sehr guten Ausbeute gewährleistet.
Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats von Faktor VIII ausgehend von einem Vollplasma, welches eine Vorreinigung, die dazu dient, die Bestandteile des Prothrombinkomplexes (Faktoren II, VII, IX, X) zu entfernen, und eine Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie umfaßt, welche durch die Wahl des Gels und des Elutionspuffers es möglich macht, ein Konzentrat des Faktor VIII-von willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher Reinheit zu erhalten.
Das Verfahren macht es auch möglich, nach einem zusätzlichen Reinigungsschritt gereinigte Lösungen von anderen Proteinen des Plasmas wie dem Fibrinogen, dem Fibronectin, dem Albumin, den Immunglobulinen und dem Antithrombin III zu erhalten.
Das Verfahren ist an menschlichem Plasma entwickelt worden, aber es ist auch auf ein Plasma tierischer Herkunft anwendbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht es folglich möglich, als Ausgangsmaterial ein Vollplasma zu verwenden, d.h. ein frisches oder zu seiner Konservierung eingefrorenes, aber nicht bei tiefer Temperatur gefälltes Plasma. Dieses Plasma wurde vorteilhafterweise in Gegenwart einer antikoagulierenden Lösung oder eines Stabilisators gewonnen. Herkömmlicherweise wird ein Citrat-Dextrose-Phosphat-Gemisch verwendet; jeder spezifische Stabilisator des Faktors VIII kann vorteilhafterweise dazugegeben werden oder es ersetzen.
Als stabilisierende Lösung des Ausgangsplasmas wird vorteilhafterweise ein Gemisch aus Heparin mit 0,2 bis 2 Einheiten(U)/ml, EDTA mit 1 bis 5 mM, CaCl&sub2; 1 bis 10 mM, verwendet, dem eventuell Glucose in einer Konzentration zwischen 5 und 60 g/l zugegeben worden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren umf aßt einen ersten Vorreinigungsschritt, welcher eine Fällung mit Bariumchlorid und eine Adsorption an Aluminiumnydroxidgel vereinigt.
Ein Verfahren zur Reinigung des Faktors VIII, welches eine Adsorption an Aluminiumhydroxid gefolgt von einer Ultrafiltration über Hohlfasern umfaßt, ist bereits in der Patentschrift US-A-4386068 beschrieben. Der Einsatz von Bariumsalzen ist bereits in der Patentschrift US-A-4435318 beschrieben. Jedoch hat die Anmelderin beobachtet, daß besonders befriedigende Ergebnisse erhalten wurden durch die Kombination dieser beiden Behandlungen, wogegen eine Behandlung mit Alhydrogel allein es nicht möglich macht, vollständig das Prothrombin und die anderen Bestandteile des PPSB (Proconvertin, Prothrombin, Stewart-Faktor, antihämophiler Faktor B oder F IX) zu entfernen und eine Behandlung mit Bariumchlorid allein den Faktor X, das Prothrombin und vor allem den Faktor VII weiter vorhandensein läßt.
Die Behandlung mit Bariumchlorid wird vorteilhafterweise an Plasma durchgeführt, dessen pH durch Zugabe einer 1 M Bariumchloridlösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,08 M, unter Rühren auf 6,5 eingestellt worden ist, und darauf folgt eine Zentrifugation bei 50 bis 10ºC, mit dem Ziel, die gefällten Proteine zu entfernen, danach die Gewinnung des Überstands. Die gefällten Proteine können vorteilhafterweise zur Herstellung des Prothrombinkomplexes oder seiner Bestandteile gewonnen werden.
Der Überstand wird anschließend mit 3%igen Aluminiumhydroxidgel, bei pH 6,5 zusammengebracht, welches die verbleibenden kontaminierenden Proteine adsorbiert; auf diese Behandlung folgt eine Abkühlung auf 5º bis 8ºC in einem Kryostat, eine Zentrifugation bei 5ºC und die Gewinnung des Überstands, der bei 50 bis 8ºC gehalten wird.
Der Überstand muß einer Entsalzung unterworfen werden, die entweder durch Ultrafiltration in Gegenwart des Äquilibrierungspuffers der nachfolgenden Chromatographie, dem 0,5 bis 2 Einheiten/ml Heparin zugegeben worden sind, oder durch Chromatographie über Sephadex G 25 im gleichen Puffer ausgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt anschließend eine Trennung durch Anionenaustauschchromatographie. Die Anmelderin hat bereits in der Patentanmeldung EP-A-0359593 die Vorteile beschrieben, die sie für einen Harztyp nachgewiesen hat, der ein geringes Ionenaustauschvermögen bietet und Poren mit großen Abmessungen aufweist, welche die Zurückhaltung von sehr großen Molekülen, d.h. mit einem Molekulargewicht, das höher als 1 Million Dalton sein kann, ermöglichen. Diese länger anhaltende Zurückhaltung ermöglicht die Einrichtung von Bindungen mit schwach hydrophoben Charakter mit dem Harz und die Wahl der Ionenstärke des Puffers ermöglicht eine selektive Desorption der gebundenen Moleküle.
Die Harze dieses Typs sind zum ersten Mal von Y. KATO et.al. (J. Chromato. 245, 1982, 193-211) beschrieben worden, welche ihre Verwendung für chromatographische Trennungen von sehr großen Proteinen mit mittlerer Leistung und in industriellem Maßstab empfahlen.
Die Harze dieses Typs sind im Handel unter der Sammelbezeichnung Fractogel erhältlich. Es können ebenso das DEAE- Fractogel 650 und das T- oder D-MAE-Fractogel (Merck) verwendet werden. Die gleichen Harze sind gegenwärtig in einer Form erhältlich, die der Lieferant als "Harze vom Tentakel- Typ" bezeichnet. Die Struktur ihrer Matrix ist modifiziert, um die Bindungsoberfläche der positiven Ladungen zu vergrößern, was eine Vergrößerung der Kapazität des Gels begünstigen kann.
Der Äquilibrierungspuffer der Chromatographie ist ein Puffer auf der Basis von Natriumcitrat und Natriumchlorid, der auf pH 7 eingestellt ist, welcher vorteilhafterweise Calciumchlorid in einer Konzentration zwischen 0,5 und 6 mM und Lysin in einer Konzentration in der Größenordnung von 2 bis 4 g/l und Glycocoll in einer Konzentration von 8 bis 11 g/l enthält. Die Durchführung des Verfahrens umfaßt definierte Erhöhungen dieser Natriumchloridkonzentration.
Die Durchführung des Reinigungsverfahrens gemäß der Erfindung umfaßt die Einspritzung des weiter oben beschriebenen vorgereinigten Präparates auf die Chromatographiesäule. Unter definierten Bedingungen (0,11 M NaCl) kann die Säule sehr große Moleküle wie den von Willebrand-Faktor-Faktor VIII-Komplex binden und läßt das Fibrinogen, das Albumin, die Immunglobuline, das Antithrombin III und das Fibronectin in das Filtrat hindurchgehen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die darauf abzielt, die beste Ausbeute der Gewinnung des Faktors VIII zu erhalten, wird die Ionenstärke des Elutionspuffers der Chromatographie einmalig auf 0,27 m Natriumchlorid erhöht. Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung geht dieser Elution eine Vorwaschung durch Erhöhung der Ionenstärke auf 0,13 M Natriumchlorid voraus, welche das Fibronectin entfernt.
Der unter diesen Bedingungen desorbierte und eluierte Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex weist eine spezifische Aktivität von mindestens 5 bis 10 Einheiten/mg auf. Die Gesamtausbeute des Verfahrens ist mindestens 350 Einheiten/Liter Ausgangsplasma und kann mindestens 500 Einheiten/Liter sein, wenn dem Ausgangsplasma das weiter oben beschriebene Stabilisierungsgemisch zugegeben wird.
In Abhängigkeit von seiner späteren Verwendung kann diese Lösung des Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplexes noch einem zusätzlichen Reinigungsschritt und insbesondere einem Konzentrationsschritt durch eine erneute Chromatographie unterworfen werden. Diese kann, wie die vorhergehende, über DEAE- oder T/D-MAE-Fractogel oder über anderen Harzen ausgeführt werden; andere Träger wie das Dextransulfat, immobilisiertes Amino-Hexyl, immobilisiertes Heparin, die Sulfopropylharze, mit Affinität oder Immunaffinität können ebenfalls verwendet werden.
Diese zusätzliche Chromatographie wird im gleichen Basispuffer wie die vorhergehende durchgeführt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die darauf abzielt, den Faktor VIII so konzentriert wie möglich zu erhalten, wird diese zusätzliche Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie die erste ausgeführt, d.h. mit einem einzigen Desorptionsschritt durch Erhöhung der Ionenstärke des Puffers auf 0,27 M NaCl. Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden durch eine erste Erhöhung der Ionenstärke des Puffers auf 0,13 M die restlichen kontaminierenden Proteine entfernt und durch eine zweite Erhöhung auf 0,27 M wird der konzentrierte Faktor VIII-von Willebrand-Faktor- Komplex mit hoher Reinheit gewonnen, der dann eine spezifische Aktivität von mindestens 10 bis 20 Einheiten/mg aufweist.
Die anderen Proteine des ersten Filtrats der Säule wie die Immunglobuline, das Albumin, das Antithrombin III, das Fibrinogen und das Fibronectin können ebenfalls durch herkömmliche chromatographische Verfahren gereinigt und konzentriert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch eine Behandlung zur Inaktivierung von Viren nach einer bekannten Methode. Im Fall, daß ein chemisches Mittel verwendet wird, z.B. eine Behandlung durch Lösungsmittel-Detergens, ist es ratsam, diese Behandlung vor irgendeinem der chromatographischen Schritte durchzuführen, damit dieser die Entfernung der Inaktivierungsmittel gewährleistet.
Die Konzentrate des Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplexes und der anderen durch das beschriebene Verfahren erhaltenen Plasmaproteine sind auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Die Konzentrate werden nach den Bestimmungen des Arzneibuchs konditioniert und können für eine therapeutische Verwendung bestimmt sein.
Die folgenden Beispiele erläutern zwei Ausführungsformen der Erfindung, ohne jedoch deren Umfang zu beschränken.

Beispiel 1

Es werden 250 ml frisches oder eingefrorenes und bei 22 - 25ºC aufgetautes Plasma verwendet, welches in Gegenwart eines Antikoagulationsmittels/Stabilisators (z . B. Citrat-Dextrose-Phosphat) gewonnen wurde, und auf einen pH von 6,5 durch Essigsäure eingestellt wurde.

a) Vorreinigung

Es werden 20 ml 1 M Bariumchlorid mit pH 6,5 mittels einer peristaltischen Pumpe bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,08 M zugegeben. Die Zugabe erfolgt mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 bis 8 ml/Minute, danach wird das Gemisch unter Rühren 15 Minuten lang bei gewöhnlicher Temperatur gelassen.
Das Gemisch wird anschließend mit 2.700 Umdrehungen/Minute 20 Minuten lang bei 8ºC zentrifugiert, dann wird der Überstand gewonnen.
Der Überstand wird anschließend an einem Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel Eurobio mit 3% Al(OH)&sub3;) in einem Verhältnis von 2,3 g/l Plasma adsorbiert. Der pH wird auf 6,5 eingestellt und die Temperatur wird in einem Kryostat bis auf 5ºC gesenkt. Das Gemisch wird bei 5ºC mit 2.700 Umdrehungen/Minute 20 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wird gewonnen und bei 5ºC aufbewahrt.
Diese Behandlung ermöglicht die Entfernung der Bestandteile des Prothrombinkomplexes (Faktoren II, VII, IX, X), die nach bekannten Verfahren gewonnen und gereinigt werden können.
Besonders befriedigende Ergebnisse werden durch die Kombination dieser beiden Behandlungen erhalten, wogegen eine Behandlung mit Alhydrogel allein es nicht möglich macht, vollständig das Prothrombin und die anderen Bestandteile des PPSB zu entfernen und eine Behandlung mit Bariumchlorid allein den Faktor X, das Prothrombin und vor allem den Faktor VII weiter vorhandensein läßt.
Der gewonnene Überstand wird entweder durch Ultrafiltration in Gegenwart des Puffers der nachfolgenden Chromatographie (siehe weiter unten), dem 1 Einheit/ml Heparin zugegeben worden ist, oder durch Chromatographie über Sephadex G 25 in dem gleichen Puffer entsalzt.
Anschließend wird eine herkömmliche Behandlung zur Inaktivierung von Viren mit Lösungsmittel-Detergens 6 Stunden lang bei 24ºC durchgeführt (dieses Behandlungsverfahren ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0131740 beschrieben worden).

b) Reinigung durch Chromatographie

Der vorgereinigte und dialysierte Überstand wird einem Reinigungsschritt durch Chromatographie unterworfen. Es wird eine Säule K26/30 (Pharmacia-Uppsala-Schweden) mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einer nutzbaren Länge von 30 cm verwendet, die auf 10 cm mit dem Harz DEAE- Fractogel-TSK 650(M) (Merck) gefüllt ist.
Der Äquilibrierungspuffer der Säule und der Probenladung hat die folgende Zusammensetzung: Natriumcitrat 10 mM, Calciumchlorid 1 mM, Glycocoll 9 g/l, Lysin 3 g/l. Diesem Puffer wird Natriumchlorid zugegeben, das auf eine Endkonzentration von 0,11 M und einen pH von 7 eingestellt ist.
Die Probe wird auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/h eingespritzt.
Die Säule wird mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen, um die nicht adsorbierten Proteine, die das Fibrinogen, das Albumin, die Immunglobuline, das Antithrombin III und das Fibronectin umfassen, ebenso wie die Mittel zur Inaktivierung von Viren zu entfernen.
Der Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex wird anschließend durch Erhöhung der Ionenstärke des Puffers auf 0,27 M Natriumchlorid desorbiert.
Die durch dieses Verfahren erhaltene Lösung des Faktors VIII weist eine spezifische Aktivität von 5 bis 10 IE/mg auf und die Ausbeute der Reinigung bezogen auf das auf die Säule eingespritzte Plasma beträgt 60 bis 80 %.
Es wird immer ein Verhältnis nahe bei 1 Einheit/1 Einheit für die Konzentration der beiden Faktoren VIII und von Willebrand beobachtet, wobei letzterer in Einheiten des Cofaktors des Ristocetins ausgedrückt wird.
Die Reinheit dieser Lösung des Faktors VIII kann noch leicht verbessert werden durch einen zusätzlichen Schritt einer chromatographischen Trennung, welcher es ermöglicht, das Produkt zu konzentrieren. Es wird z.B. eine zweite DEAE-Fractogel-Säule unter den gleichen Beladungsbedingungen wie zuvor verwendet und ein Vorwaschen bei 0,13 M NaCl durchgeführt, was die restlichen kontaminierenden Proteine eliminiert. Die Ionenstärke des Puffers wird anschließend auf 0,27 M Natriumchlorid erhöht, um den hochgereinigten und konzentrierten Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex zu desorbieren und zu eluieren.
Der zweite Schritt der Konzentration durch Chromatographie kann durch eine Ultrafiltration ersetzt werden.
Gemäß der üblichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die erste Reinigung durch Chromatographie an einem DEAE-Fractogel -Harz durchgeführt. Jedoch sind sehr gute Ergebnisse auch mit den neuen Harzen erhalten worden, die von Merck vertrieben werden, wie z.B. dem TMAE-Fractogel (TMAE = Tri.Methyl.Amino.Ethyl) oder dem DMAE-Fractogel (DMAE = Di-MAE), die Eigenschaften aufweisen, die denen von DEAE-Fractogel äquivalent sind. Es können auch neue Harze vom "Tentakel-Typ" verwendet werden, die von der Firma Merck entwickelt worden sind und von W. Müller bei der "Conference on Liquid chromatography" im Juni 1989 in Stockholm vorgestellt worden sind.

Beispiel 2

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht es auch möglich, Konzentrate von Fibrinogen und Fibronectin herzustellen, wobei gleichzeitig ein konzentrierter Faktor VIII-von Willebrand-Faktor mit einer geringeren Ausbeute und einer leicht verbesserten spezifischen Aktivität geliefert wird.
Dieses Verfahren ist identisch mit dem des Beispiels 1 bis zur Elution des Faktor VIII-von Willebrand-Faktors von der ersten Säule aus DEAE-Fractogel .
Das Fibrinogen, das Antithrombin III, das Albumin und die Immunglobuline werden nicht von der Säule zurückgehalten und können im Filtrat gewonnen werden.
Der Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex kann durch eine zweite chromatographische Trennung an einer DEAE-Fractogel -Säule mit dem Äquilibrierungspuffer mit einer Ionenstärke von 0,17 M Natriumchlorid, um nicht die restlichen kontaminierenden Proteine zu binden, gereinigt und konzentriert werden; eine Erhöhung der Ionenstärke auf 0,27 M Natriumchlorid ermöglicht es, dem Faktor VIII-von Willebrand- Faktor-Komplex zu desorbieren und zu eluieren. So wird eine spezifische Aktivität von 10 bis 20 IE/mg erhalten.
Das Fibrinogen und das Fibronectin können anschließend nach bekannten chromatographischen Verfahren gereinigt und konzentriert werden, um Lösungen mit einer Qualität zu ergeben, die mit einer therapeutischen Verwendung vereinbar ist, und die in der französischen Patentanmeldung Nr. 88 07530 beschrieben worden sind.
Die anderen Proteine des Plasmas können nach herkömmlichen Fraktionierverfahren gereinigt und konzentriert werden.

Beispiel 3

Die Ausbeute der Reinigung kann noch verbessert werden, indem das Ausgangsplasma nach seinem Auftauen bei 25ºC durch Zugabe des folgenden Gemisches stabilisiert wird:
Heparin 1 Einheit/ml
EDTA 2 mM, d.h. 0,74 g/l
Calciumchlorid 6 mM, d.h. 0,67 g/l
Zu diesem Gemisch kann noch Glucose in einer Konzentration zwischen 5 und 60 g/l zugegeben werden.
Der pH wird anschließend auf 6,5 durch Zugabe von Essigsäure gesenkt.
Anschließend werden die Reinigungsschritte wie in Beispiel 1 oder 2 angewandt.
Unter diesen Bedingungen ist die Gesamtausbeute des Reinigungsverfahrens mindestens gleich 500 Einheiten des FVIII : C/Liter Ausgangsplasma.
Dies entspricht einer Gesamtrückgewinnung von 55 bis 65% der Aktivität des Faktors VIII für eine spezifische Aktivität zwischen 10 und 30 Einheiten des FVIII:C/mg Protein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Konzentrats von Faktor VIII-von Willebrand-Faktor mit hoher spezifischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vollplasma einer Vorreinigung durch eine zweifache Behandlung, welche eine Fällung mit Bariumchlorid und eine Adsorption an Aluminiumhydroxidgel umfaßt und einer Reinigung durch Chromatographie über ein Anionenaustauschergel, welches die Zurückhaltung von sehr großen Molekülen ermöglicht, unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vollplasma ein frisches oder gefrorenes (congelé) Plasma ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Plasma ein stabilisierendes Gemisch zugegeben wird, welches 0,2 bis 2 U/ml Heparin, 1 bis 5 mM EDTA und 1 bis 10 mM CaCl&sub2; umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das stabilisierende Gemisch darüberhinaus Glucose mit einer Konzentration zwischen 5 und 60 g/l umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorreinigung umfaßt:

a) eine Fällung mit Bariumchlorid gefolgt von einer Zentrifugation und der Rückgewinnung des Überstands,

b) eine Adsorption an Aluminiumhydroxidgel gefolgt von einer Zentrifugation in der Kälte und der Rückgewinnung des Überstands,

c) eine Entsalzungsbehandlung.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fällung mit Bariumchlorid durch Zugabe einer Lösung von 1 M Bariumchlorid bei pH 6,5 unter Rühren bewirkt wird und darauf eine Zentrifugation bei 5 bis 10ºC und die Rückgewinnung des Überstands folgt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption an Aluminiumhydroxidgel mit einem 3%igen Gel bei einem pH von 6,5 durchgeführt wird und darauf eine rasche Abkühlung auf 5ºC, eine Zentrifugation bei 5ºC und die Rückgewinnung des Überstands folgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entsalzungsbehandlung durch Ultrafiltration in Gegenwart des Equilibrierungspuffers der nachfolgenden Chromatographie, dem Heparin zugegeben ist, bewirkt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entsalzungsbehandlung durch Chromatographie über eine einfache Gelfiltrationssäule, wie Sephadex G 25, in Equilibrierungspuffer der nachfolgenden Chromatographie, dem Heparin zugegeben ist, bewirkt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Überstand des Plasmas, welches vorgereinigt worden ist, auf eine Chromatographiesäule eingespritzt wird, die ein Anionenaustauschergel enthält, welches die sehr großen Moleküle nicht ausschließt und in das Filtrat das Fibrinogen, das Albumin, die Immunglobuline, das Antithrombin III und das Fibronectin durchgehen läßt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromatographiegel ein Gel vom Typ eines mit Gruppen vom DEAE- oder T- oder D-MAE-Typ gepfropften Vinylpolymers ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergel aus Fractogel ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Equilibrierungspuffer der Chromatographie ein Puffer auf der Grundlage von Natriumcitrat und Calciumchlorid ist, welcher Glycocoll und Lysin enthält, dem 0,11 M Natriumchlorid zugegeben ist und der auf pH 7 eingestellt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer 8 bis 11 g/l Glycocoll und 2 bis 4 g/l Lysin enthält.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke des Puffers auf 0,27 M Natriumchlorid erhöht wird, um den Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex von der Chromatographiesäule zu desorbieren.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke des Puffers auf 0,13 M Natriumchlorid erhöht wird, was das Fibronectin eliminiert, und danach auf 0,27 M Natriumchlorid erhöht wird, um den Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex von der Chromatographiesäule zu desorbieren.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der von der Chromatographiesäule desorbierte Faktor VIII-von Willebrand-Faktor-Komplex einem zusätzlichen Reinigungs-Konzentrations-Schritt durch Chromatographie unterworfen wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatographie über ein Ionenaustauscherharz, das ausgewählt wird unter dem DEAE- oder T/D-MAE-Fractogel , immobilisiertem Aminohexyl, immobilisiertem Heparin, Dextransulfat, Sulfopropyl, oder über ein Affinitäts- oder Immunaffinitätsharz durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatographie in einem Puffer durchgeführt wird, der auf 0,11 M Natriumchlorid eingestellt ist, und zwei aufeinanderfolgende Erhöhungen der Ionenstärke auf 0,13 M und danach auf 0,27 M umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatographie in einem Puffer durchgeführt wird, der auf 0,17 M Natriumchlorid eingestellt ist, und eine einzige Erhöhung der Ionenstärke auf 0,27 M umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine des Filtrats der Chromatographie nach Anspruch 10 einem zusätzlichen Reinigungs- Konzentrations-Schritt unterworfen werden.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine klassische Behandlung zur Inaktivierung von Viren durch Lösungsmittel-Detergens vor irgendeinem der Chromatographieschritte durchgeführt wird.