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DE69936877T2 - STREPTOKOKKEN-C5a-PEPTIDASE-IMPFSTOFF - Google Patents

STREPTOKOKKEN-C5a-PEPTIDASE-IMPFSTOFF Download PDF

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streptococcus
protein
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University of Minnesota
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt mehrere verschiedene β-hämolytische Streptokokkus-Spezies, die bisher identifiziert wurden. Streptococcus pyogenes, auch bezeichnet als Streptokokken der Gruppe A, stellt ein allgemeines bakterielles Pathogen für Menschen dar. Während primär Kinder daran erkranken, verursacht es bei Menschen unterschiedliche Infektionen, einschließlich Pharyngitis, Impetigo und Sepsis. Im Anschluss an die Infektion können Autoimmun-Komplikationen, wie rheumatisches Fieber und akute Glomerulonephritis beim Menschen auftreten. Dieses Pathogen verursacht außerdem schwere akute Erkrankungen, wie Scharlachfieber, nekrotisierende Fasciitis und toxischen Schock.
  • Rachenentzündung, verursacht durch Streptokokken der Gruppe A, auch bezeichnet als „Streptokokken-Pharyngitis", trägt je nach Jahreszeit zu mindestens 16% aller offiziellen Krankenbesuche in einer allgemeinmedizinischen Praxis dar. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975," J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981). Diese Spezies ist auch die Ursache für das kürzliche Wiederauftreten von toxischem Schock, assoziiert mit nekrotisierender Fasciitis in Nordamerika und vier anderen Ländern. Stevens, D. L., "Invasive group A streptococcus infections, "Clin. Infect. Dis., 14:2-13 (1992). An der Auslösung von Streptokokken-Pharyngitis, und gelegentlich an der Auslösung von toxischem Schock, sind auch Streptokokken der Gruppen C und G beteiligt. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975, "J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981).
  • Streptokokken der Gruppe B, auch bekannt als Streptococcus agalactiae, sind für neonatale Sepsis und Meningitis verantwortlich. T. R. Martin et al., "The effect of type-specific polysaccharide capsule an the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Dis., 165:306-314 (1992). Obwohl diese häufig Bestandteil der mukosalen Flora der Vagina adulter Frauen sind, entwickeln 0,1 bis 0,5/1000 Neugeborenen ein ernsthaftes Krankheitsbild nach Infektion während der Geburt. Trotz der hohen Mortalität auf Grund von Infektionen durch Streptokokken der Gruppe B, werden die Mechanismen der Pathogenität nur unzureichend verstanden. Martin, T. R. et al., "The effect of type-specific polysaccharide capsule an the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Dis., 165:306-314 (1992)
  • Streptokokkusinfektionen werden gegenwärtig durch Antibiotikatherapie behandelt. Bei 25-30% der behandelten Personen tritt jedoch die Krankheit wieder auf, und/oder der Organismus wird in mukosalen Sekreten ausgeschieden. Gegenwärtig steht kein Mittel zur Prävention von Streptokokkusinfektionen zur Verfügung. Historisch betrachtet hat sich die Entwicklung eines Streptokokkusvakzins auf das M-Protein der Zelloberfläche des Bakteriums konzentriert. Bessen, D., et al., "Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M Protein an mucosal colonization by group A streptococci," Infect. Immun., 56:2666-2672 (1988); Bronze, M. S., et al., "Protective immunity evoked by locally ad ministered group A streptococcal vaccines in mice, "Journal of Immunology, 141:2767-2770 (1988).
  • Zwei Hauptprobleme werden die Verwendung, die Vermarktung und möglicherweise die FDA-Zulassung eines M-Protein-Vakzins einschränken. Erstens gibt es 80 verschiedene M-Serotypen von S. pyogenes, und neue Serotypen werden laufend gefunden. Fischetti, V. A., "Streptococcal M Protein: molecular design and biological behavior, Clin. Microbiol. Rev., 2:285-314 (1989). Somit wird die Inokulation mit einem serotypspezifischen M-Protein wahrscheinlich gegen andere M-Serotypen nicht wirksam schützen. Das zweite Problem betrifft die Sicherheit eines M-Protein-Vakzins. Mehrere Regionen des M-Proteins enthalten antigene Epitope, welche immunologisch kreuzreaktiv mit menschlichem Gewebe, insbesondere Herzgewebe, sind. Die N-terminalen Enden von M-Proteinen zeigen eine starke Variabilität in der Sequenz und Antigenspezifität. Um einen breiten Schutz gegen Infektionen von Streptokokken der Gruppe A zu erreichen, müssten in einem Vakzin mehr als 80 verschiedene Peptide, welche diese variable Sequenz repräsentieren, enthalten sein. Neue Varianten von M-Proteinen würden weiterhin auftreten und eine fortgesetzte Kontrolle der Streptokokkus-Erkrankung und Veränderungen in der Vakzinzusammensetzung erfordern. Im Gegensatz dazu, sind die carboxyterminalen Enden von M-Proteinen in ihrer Sequenz konserviert. Diese Region des M-Proteins enthält jedoch eine Aminosäuresequenz, welche mit menschlichem Herzgewebe immunologisch kreuzreaktiv ist. Diese Eigenschaft des M-Proteins verursacht vermutlich die Herzklappenschädigungen, assoziiert mit rheumatischem Fieber. P. Fenderson et al., "Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M Proteins, J. Immunol., 142:2475-2481 (1989). In einer frühen Untersuchung, bei der Kinder mit M-Protein im Jahr 1979 vakziniert wurden, ergab sich eine zehnfach höhere Inzidenz von rheumatischem Fieber und damit assoziierter Herzklappenschädigung. Massell, B. F., et al., "Rheumatic fever following streptococcal vaccination, JAMA, 207:1115-1119 (1969).
  • Andere für die Vakzinentwicklung in Frage kommende Proteine sind erythrogene Toxine, pyrogenes Streptokokkus-Exotoxin A und pyrogenes Streptokokkus-Exotoxin B. Lee, P. K., et al., "Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness," J. Clin. Microb., 27:1890-1892 (1989). Immunität gegen diese Proteine könnte vor den tödlichen Symptomen von toxischem Schock schützen, ohne aber eine Kolonisierung durch Streptokokken verhindern zu können.
  • Die WO 97/26008 beschreibt Vakzine zur Verwendung gegen Kolonisierung durch β-hämolytischen Streptokokkus, umfassend Streptokokkus-C5a-Peptidase oder Fragmente oder Mutanten davon. Stafslien und Cleary (Abstracts of the General Meeting of the American Society of Microbiology, 1998, Bd. 98, Seite 59) beschreiben, dass die Megaprimer-Methode der ortsspezifischen Mutagenese zur Einführung einer Mutation in das scpA49-Gen verwendet wurde, welche das Serin der vermutlichen aktiven Region der Protease in einen Alaninrest überführte. Diese Mutation beeinflusste nicht die Fähigkeit des Proteins an einen polyklonalen Antikörper zu binden, wie durch Western Blotting und kompetitiven ELISA bestimmt wurde. Die Mu tation eliminierte jedoch die Fähigkeit des Enzyms, C5a in vitro zu spalten, wie unter Verwendung eines PMN-Adhärenz-Assays bestimmt wurde.
  • Es besteht somit ein fortgesetzter Bedarf an wirksamen Mitteln zur Prävention oder Linderung von Streptokokkusinfektionen. Insbesondere besteht ein Bedarf an der Entwicklung von Zusammensetzungen, welche als Vakzine zur Prävention oder Linderung einer Besiedelung von Wirtsgewebe durch Streptokokken geeignet sind, wodurch die Inzidenz von Streptokokken-Pharyngitis und Impetigo verringert wird. Die Eliminierung von Folgeerkrankungen, wie rheumatisches Fieber, akute Glomerulonephritis, Sepsis, toxischer Schock und nekrotisierende Fasciitis, würde eine direkte Folge der Verringerung der Inzidenz einer akuten Infektion und des Transports des Organismus sein. Es besteht weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung von Zusammensetzungen, welche als Vakzine zur Prävention oder Linderung von Infektionen, verursacht durch sämtliche β-hämolytischen Streptokokkus-Spezies, insbesondere der Gruppen A, B, C und G, brauchbar sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Vakzin bereit, welches einen suszeptiblen Säuger gegen β-hämolytischen Streptokokkus wirksam immunisiert. Der suszeptible Säuger kann ein Mensch oder ein Haustier, wie z. B. ein Hund, eine Kuh, ein Schwein oder ein Pferd, sein. Eine solche Immunisierung kann die Inzidenz einer Kolonisierung durch β-hämolytischen Streptokokkus in einem Säuger verhindern, lindern oder verringern. Das Vakzin umfasst eine immunogene Menge eines isolierten und gereinigten Peptids, umfassend eine enzymatisch inaktive Streptokokkus-C5a-Peptidase (SCP), deren Menge in wirksamer Weise einen suszeptiblen Säuger gegen β-hämolytischen Streptokokkus immunisiert, in Kombination mit einem physiologisch verträglichen, nicht-toxischen Vehikel, wobei die SCP eine Variante der Wildtyp-SCP ist, in dem die Variante SCP eine Substitution an jedem der Aminosäurereste aufweist, der den Aminosäuren 130 und 512 von SEQ ID NO: 1 entspricht.
  • Eine „Variante" von SCP ist ein Polypeptid oder Oligopeptid von SCP, das mit nativer SCP nicht vollständig übereinstimmt. Eine derartige SCP-Variante kann durch Veränderung der Aminosäuresequenz durch Insertion, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste erhalten werden. Die Aminosäuresequenz des Proteins wird, durch Substitution, modifiziert, um ein Polypeptid zu erzeugen, das im Wesentlichen die gleichen oder verbesserte Qualitäten im Vergleich zum nativen Polypeptid aufweist. Die Substitution kann eine konservative Substitution sein. Eine „konservative Substitution" ist die Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Seitenkette. Eine konservative Substitution würde eine Substitution durch eine Aminosäure darstellen, welche die kleinstmögliche Veränderung in Bezug auf Ladung der Aminosäure oder Größe der Seitenkette der Aminosäure (oder alternativ in Bezug auf Größe, Ladung oder Art einer chemischen Gruppe innerhalb der Seitenkette) verursacht, so dass das Gesamtpeptid seine räumliche Konformation beibehält, jedoch eine veränderte biologische Aktivität aufweist. So können beispielsweise allgemein übliche konservative Veränderungen umfassen: Asp zu Glu, Asn oder Gln; His zu Lys, Arg oder Phe; Asn zu Gln, Asp oder Glu und Ser zu Cys, Thr oder Gly. Alanin wird allgemein verwendet, um andere Aminosäuren zu ersetzen. Die 20 essentiellen Aminosäuren können wie folgt gruppiert werden: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin mit unpolaren Seitenketten; Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin mit ungeladenen polaren Seitenketten; Aspartat und Glutamat mit sauren Seitenketten; und Lysin, Arginin und Histidin mit basischen Seitenketten. L. Stryer, Biochemistry (2. Aufl.) Seiten 14-15; Lehninger, Biochemistry, Seiten 73-75.
  • Diese Aminosäure-Veränderungen erreicht man durch Veränderung in den Kodons für die entsprechende Nukleinsäuresequenz. Es ist bekannt, dass derartige Polypeptide auf der Grundlage einer Substitution bestimmter Aminosäuren durch andere Aminosäuren in der Polypeptidstruktur erhalten werden können, um die antigene oder immunogene Aktivität zu modifizieren oder zu verbessern. Beispielsweise können über die Substitution durch alternative Aminosäuren kleine konformative Änderungen in ein Polypeptid eingeführt werden, welche zu einer erhöhten Aktivität oder verstärkten Immunantwort führen. Alternativ dazu können Aminosäuresubstitutionen in bestimmten Polypeptiden dazu verwendet werden, um Reste bereitzustellen, die dann mit anderen Molekülen verknüpft werden, um Peptid-Molekül-Konjugate bereitzustellen, die ausreichend antigene Eigenschaften des Ausgangspolypeptids beibehalten, um für andere Zwecke brauchbar zu sein.
  • Man kann den hydropathischen Index von Aminosäuren verwenden, um Polypeptiden interaktive biologische Funktion zu verleihen, wobei festgestellt wird, das bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit vergleichbaren hydropathischen Indizes ersetzt werden können und weiterhin ähnliche biologische Aktivität beibehalten. Alternativ dazu kann eine Substitution ähnlicher Aminosäuren auf der Basis der Hydrophilie durchgeführt werden, insbesondere dann, wenn die gewünschte biologische Funktion in dem zu erzeugenden Polypeptid für eine Verwendung in immunologischen Ausführungsformen gedacht ist. Die höchste lokale mittlere Hydrophilie eines „Proteins", vermittelt durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren, korreliert mit dessen Immunogenität. US-Patent 4,554,101 . Folglich ist festzustellen, dass Substitutionen auf der Grundlage der einer jeden Aminosäure zugeordneten Hydrophilie durchgeführt werden können.
  • Unter Verwendung des hydrophilen Index oder hydropathischen Index, wodurch jeder Aminosäure Werte zugeordnet sind, ist es bevorzugt, Substitutionen von Aminosäuren durchzuführen, bei welchen diese Werte ±2, vorzugsweise ±1, betragen, und wobei Werte von ±0,5 die am meisten bevorzugten Substitutionen darstellen.
  • Die SCP-Variante umfasst wenigstens sieben Aminosäurereste, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 1500 Reste, und besonders bevorzugt etwa 300 bis etwa 1200 Reste, und weiter bevorzugt etwa 500 bis etwa 1180 Reste, wobei die SCP-Variante im Vergleich zur Aminosäuresequenz der korrespondierenden nativen SCP eine Sequenzhomologie oder Identität von wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 80% und besonders bevorzugt wenigstens etwa 90%, jedoch weniger als 100%, bezogen auf eine zusammenhängende Aminosäuresequenz aufweist.
  • Die Aminosäuresequenz der SCP-Polypeptidvariante entspricht im Wesentlichen der Aminosäuresequenz des nativen SCP. Der hierin verwendet Begriff „im Wesentlichen entsprechen" betrifft eine Polypeptidsequenz, welche eine protektive immunologische Antwort hervorruft, die im Wesentlichen der durch die native SCP erzeugten Antwort entspricht. Eine derartige Antwort kann wenigsten 60% des durch native SCP erzeugten Werts entsprechen und kann sogar wenigstens 80% des durch die native SCP erzeugten Werts entsprechen. Eine immunologische Antwort auf eine Zusammensetzung oder ein Vakzin betrifft die Entwicklung einer zellulären und/oder einer antikörpervermittelten Immunantwort auf das betreffende Polypeptid oder Vakzin in dem Wirt. Gewöhnlich besteht eine derartige Antwort darin, dass das Subjekt Antikörper, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Suppressor-T-Zellen und/oder zytotoxische T-Zellen mit direkter Spezifität für ein Antigen oder Antigene aufweist, das (die) in der bereffenden Zusammensetzung oder dem betreffenden Vakzin enthalten ist (sind).
  • Die SCP kann eine Variante der SCP von Streptococcus der Gruppe A (SCPA), Streptococcus der Gruppe B (SCPB), Streptococcus der Gruppe C (SCPC) oder Streptococcus der Gruppe G (SCPG) sein.
  • Eine erfindungsgemäße Variante kann Aminosäurereste umfassen, die in der korrespondierenden nativen SCP nicht enthalten sind, oder Deletionen in Bezug auf die korrespondierende native SCP. Eine Variante kann auch ein im Vergleich zur nativen SCP verkürztes „Fragment" sein, d. h. nur einen Teil des Volllängen-Proteins darstellen. Beispielsweise kann sich die SCP-Variante von der nativen SCP dadurch unterscheiden, dass sie kein Zellwand-Insert enthält. SCP-Varianten umfassen auch Peptide, welche wenigstens eine D-Aminosäure aufweisen.
  • Die SCP-Variante des Vakzins kann von einer isolierten DNA-Sequenz, welche die SCP-Variante kodiert, exprimiert werden. Beispielsweise kann sich die SCP-Variante von nativer SCP dadurch unterscheiden, dass sie keine Signalsequenz oder kein Zellwand-Insert enthält. Die DNA kann die Spezifitätsfurche oder die katalytische Domäne kodieren. Insbesondere kann die DNA die Aminosäurereste 193 oder 295 der katalytischen Domäne kodieren oder die Aminosäurereste 260, 261, 262, 415, 416 oder 417 der Spezifitätsfurche, oder sie kann Modifikationen derartiger Reste kodieren. Die SCP des Vakzins weist keine enzymatische C5ase-Aktivität oder Peptidaseaktivität auf. Das Vakzin kann außerdem ein immunologisches Adjuvans umfassen. Das Vakzin kann zur Prävention einer Infektion durch Streptococcus der Gruppe A, Streptococcus der Gruppe B, Streptococcus der Gruppe C oder Streptococcus der Gruppe G verwendet werden. Das Vakzin kann außerdem die Streptokokkus-C5a-Peptidase, konjugiert oder verknüpft mit einem immunogenen Peptid oder einem immunogenen Polysaccharid, umfassen. „Rekombinant" beschreibt ein(e) durch Verfahren des Genetic Engineering hergestelltes Peptid oder hergestellte Nukleinsäure. Die Begriffe „Protein", „Peptid" und „Polypeptid" können hierein ersatzweise verwendet werden.
  • Das Streptokokkus-C5a-Peptidase-Vakzin kann durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Alternativ dazu kann das Vakzin durch orale Aufnahme oder internasale Inokulation verabreicht werden.
  • Weitere isolierte und gereinigte SCP-Peptide, wobei die SCP eine Variante von Wildtyp-SCP ist, und isolierte und gereinigte Polynukleotide, kodierend für eine SCP-Variante werden in der Anmeldung ebenfalls beschrieben. Diese SCPs können die Aminosäurereste 130, 193, 295 oder 512 der katalytischen Domäne oder die Aminosäurereste 260, 261, 262, 415, 416 oder 417 der Spezifitätsfurche umfassen. Diese SCPs können ausgewählt sein unter: SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A oder ΔSCPA49.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt den Aufbau einer C5a-Peptidase aus β-hämolytischen Streptokokken. D bezeichnet einen Asparaginsäurerest; H bezeichnet Histidin; S bezeichnet Serin; L bezeichnet Leucin; P bezeichnet Prolin; T bezeichnet Threonin und N bezeichnet Asparagin. R1, R2, R3, und R4 stehen für repetitive Sequenzen. Die Zahlen bezeichnen Aminosäurerestpositionen in der Peptidase.
  • 2 zeigt einen Alignment der Aminosäuresequenz von SCP aus Streptokokken der Gruppe A, Serotyp 49 (SEQ ID NO: 1), Streptokokken der Gruppe A, Serotyp 12 (SEQ ID NO: 2), Streptokokken der Gruppe B (SEQ ID NO: 3) und Streptokokken der Gruppe A, Serotyp 1 (SEQ ID NO: 23). Die Sequenzen sind mit Ausnahme der angegebenen Aminosäurepositionen identisch. Das Dreieck (∇) bezeichnet die erwartete Schnittstelle der Signalpeptidase. Die erwarteten Aminosäuren der aktiven Stelle des Enzyms sind mit Sternen gekennzeichnet. Deletionen in der Aminosäuresequenz sind durch Punkte bezeichnet und eingerahmt. Die Sterne (*) bezeichnen Aminosäurereste der katalytischen Domäne.
  • 3 zeigt die Konstruktion von SCP-Insertions- und Deletionsmutanten. Schwarze Kästchen zeigen deletierte Regionen.
  • 4 zeigt eine einfarbige FACS-Analyse. Fluoreszenzdaten wurden durch Gating auf PMNs analysiert. Ein zweites Gate wurde eingestellt, um stark färbende Zellen, definiert durch das erste Gate zu zählen. Luftbläschen wurden mit 1 × 106 CFU inokuliert.
  • 5 zeigt die Persistenz von Wildtyp und SCPA--Serotyp-M49-Streptokokken nach intranasaler Infektion.
  • 6 zeigt einen Vergleich der Fähigkeit von SCPA--Mutanten von Serotyp-M6-Gruppe-A-Streptokokkus zur Kolonisierung von Mäusen nach intranasaler Infektion. BALG/c-Mäuse (10 je Versuchsgruppe) wurden zum Vergleich mit 2 × 107 CFU von M6-Streptokokken inokuliert. Rachenabstriche wurden täglich auf Blutagarplatten, enthaltend Streptomycin, kultiviert. Mäuse wurden als positiv eingestuft, wenn die Platten eine β-hämolytische Kolonie enthielten. Die Daten wurden statistisch mit Hilfe des χ2-Tests analysiert.
  • 7 zeigt die Konstruktion des ΔSCPA49-Vakzins und das Immunisierungsprotokoll.
  • 8 zeigt, dass Kaninchenantikörper die SCPA-Aktivität von verschiedenen Serotypen neutralisiert. Balken 1 zeigt die Positivkontrolle und betrifft rhC5a, welche vor der Exposition mit PMNs nicht vorinkubiert war. Balken 10 entspricht der Kontrolle ohne rhC5a. Ganze intakte Bakterien, vorinkubiert mit normalem Kaninchenserum (Balken 2, M1 90-131; Balken 4, M6 UAB200; Balken 6, M12 CS24; Balken 8, M49 CS101) oder vorinkubiert mit Kaninchenanti-SCPA49-Serum (Balken 3, M1 90-131; Balken 5, M6 UAB200; Balken 7, M12 CS24; Balken 9, M49 CS101), wurden mit 20 μl von 5 μM rhC5a 45 Minuten inkubiert. Verbleibendes rhC5a wurde über dessen Befähigung zur Aktivierung von PMNs zur Anheftung an BSA-beschichtete Vertiefungen von Mikrotiter-Platten getestet. Adhärente PMNs wurden mit Kristallviolett gefärbt.
  • 9 zeigt die Serum-IgG- und die sekretorische IgA-Antwort nach intranasaler Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem ΔSCPA49-Protein. Serum- und Speichelwerte von ΔSCPA49-spezifischem IgG wurden durch indirekten ELISA bestimmt. Die Seren jeder Maus wurden 1:2560 in PBS verdünnt; Speichel wurde 1:2 in PBS verdünnt. 9A zeigt die slgA-Versuchsergebnisse; 9B zeigt die IgG-Versuchsergebnisse.
  • 10 zeigt einen Vergleich der Fähigkeit von Serotyp-M49-Streptokokken zur Kolonisierung von immunisierten und nicht immunisierten weiblichen CD1-Mäusen. Jede Versuchsgruppe umfasste 13 Mäuse, welche intranasal (i.n.) mit 2,0 × 108 CFU infiziert wurden. Die Daten wurden statistisch mit Hilfe des χ2-Tests analysiert. Die 10A und 10B zeigen die Ergebnisse eines wiederholten Experiments.
  • 11 zeigt einen Vergleich der Bindung von Wildtyp- und SCP-Variante an polyklonale Antikörper im kompetitiven ELISA. Das Platten-Antigen ist rekombinantes Wildtyp-SCPA49 (100 ng/Vertiefung). Das konkurrierende Antigen ist in der Legende angegeben.
  • 12 zeigt einen Vergleich im kompetitiven ELISA der Bindung von SCPA1, SCPA49 und SCPB an polyklonale Antikörper. Das Platten-Antigen ist rekombinantes Wildtyp-SCPA49 (100 ng/Vertiefung). Das konkurrierende Antigen ist in der Legende angegeben. SCPA1 und SCPA49, die in dem in dieser Figur angegebenen Experiment verwendet wurden, umfassten die Reste Asn32 bis His1139. SCPB, das in dem in dieser Figur dargestellten Experiment verwendet wurde, wurde gemäß Chmouryguina, I. et al., "Conservation of the C5a Peptidase Gene in Group A and B Streptococci", Infect. Immun., 64:2387-2390 (1996) hergestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Eine wichtige erste Verteidigungslinie gegen eine Infektion durch viele bakterielle Pathogene betrifft die Akkumulierung von phagozytischen polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) und mononuklearen Zellen am Infektionsort. Die Heranführung dieser Zellen wird durch chemotaktische Stimuli, wie Faktoren des Wirts, oder Faktoren, welche durch den eindringenden Organismus ausgeschieden werden, vermittelt. Das Chemoattraktans C5a ist entscheidend für die Stimulation dieser Entzündungsantwort in Säugern. C5a ist ein Glykopeptid mit 74 Resten, welches von der fünften Komponente (C5) des Komplements abgespalten wird. Phagozytische Zellen antworten in gerichteter Weise auf einen C5a-Gradienten und akkumulieren am Infekti onsort. C5a kann als das unmittelbarste Attraktans für Phagozyten während einer Inflammation betrachtet werden. Während PMNs eine inflammatorische Läsion infiltrieren, scheiden sie andere Chemokine, wie z. B. IL8, aus, welche die inflammatorische Antwort weiter intensivieren.
  • Die Streptokokken-C5a-Peptidase (SCP) ist ein proteolytisches Enzym, das an der Oberfläche pathogener Streptokokken lokalisiert ist, wo es C5a zerstört, während C5a lokal produziert wird. SCP spaltet spezifisch das C5a-Chemotaxin an der PMN-Bindungsstelle (zwischen den Resten His67-Lys68 von C5a) und entfernt die sieben am weitesten C-terminal gelegenen Reste von C5a. Diese Spaltung an der PMN-Bindungsstelle eliminiert das chemotaktische Signal (Cleary, P., et al., "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992); Wexler, D. E., et al., "Mechanism of action of the group A streptococcal C5a inactivator," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8144-8148 (1985).
  • SCP von Streptokokken der Gruppe A ist eine subtilisinähnliche Serinprotease mit einem Mr von 124.814 Da und mit einem Zellwand-Ankermotiv, das vielen Oberflächenproteinen grampositiver Bakterien gemeinsam ist. Die Konstruktion der C5a-Peptidase ist in 1 gezeigt. Die vollständige Nukleotidsequenz des Streptokokkus-C5a-Gens aus Streptococcus pyogenes wurde bereits publiziert. Chen, C., und Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Im Gegensatz zu Subtilisin weist SCP eine sehr enge Substratspezifität auf. Diese enge Spezifität ist im Hinblick auf die signifikanten Ähnlichkeiten zwischen deren katalytischen Domänen überraschend. Cleary, P., et al., "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992). Reste, die am Ladungstransfer beteiligt sind, sind konserviert, ebenso wie Reste auf beiden Seiten der Bindungstasche. Die übrige Aminosäuresequenz von SCP ist jedoch mit der von Subtilisin nicht verwandt. Mehr als 40 Serotypen von Streptokokken der Gruppe A wurden als SCP-Proteinproduzenten oder als Träger des Gens identifiziert. Cleary, P., et al., "A streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci," in Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease Seiten 179-180 (S. Kotami and Y. Shiokawa Herausg.; Reedbooks Ltd., Berkshire, England; 1984); Podbielski, A., et al., "The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes," Infect. Immun., 63:9-20 (1995).
  • Die katalytische Domäne oder das Aktivitätszentrum von SCP besteht aus einem Ladungstransfersystem und der Spezifitätsfurche. Das Ladungstransfersystem, das Teil der katalytischen Domäne ist, umfasst die Reste Asp130, His193, Asn295 und Ser512 (1 und 2). Eine Modifikation, d. h. eine Deletion, Insertion oder Substitution, irgendeiner dieser Aminosäuren inaktiviert das Enzym. Die Spezifitätsfurche andererseits wird vermutlich durch die Reste Ser260, Phe261, Gly262, Ile415, Tyr416 und Asp417 gebildet. Eine Modifikation dieser Aminosäuren durch Substitution könnte die Substratspezifität des Enzyms verändern oder die proteolytische Aktivität insgesamt eliminieren. Eine Modifikation dieser Aminosäuren durch Deletion würde das Enzym ebenfalls inaktivieren. Die katalytische Domäne ist abhängig von der Tertiärstruktur des Proteins, welche erzeugt wird, wenn das reife Enzym in dessen aktiven Zustand gefaltet wird. Diese Domäne wird nicht aus einer zusammenhängenden linearen Anordnung von Aminosäureresten gebildet. Alternativ dazu können Modifikationen auch die Bindung der SCP-Variante an das Substrat reduzieren. Die Bindung kann um 50%, 70% oder sogar 80% reduziert werden.
  • Ein C5a-Peptidaseenzym, assoziiert mit Streptokokken der Gruppe B, wurde ebenfalls identifiziert. Hill, H. R., et al., "Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement," J. Immunol., 141:3551-3556 (1988). Eine Restriktionsenzym-Kartierung und eine Vervollständigung der scpB-Nukleotidsequenz ergab, dass scpB eine 97-98%ige Ähnlichkeit mit scpA besitzt. Siehe 2 für den Vergleich der Aminosäuresequenz von SCP aus Streptokokkus, Gruppe A, Serotyp 49, Streptokokkus, Gruppe A, Serotyp 12, Streptokokkus Gruppe B und Streptokokkus Gruppe, Serotyp 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 23). Mehr als 30 Stämme, welche sämtliche Serotypen von Streptokokken der Gruppe B repräsentieren, tragen das scpG-Gen. Cleary P. P., et al. "Similarity between the Group B and A streptococcal C5a Peptidase genes," Infect. Immun., 60:4239-4244 (1992); Suvorov A. N., et al., "C5a peptidase gene from group B streptococci," in Genetics and Molecular Biologs of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Seiten 230-232 (G. Dunny, P. Cleary and L. McKay (Herausg.); American Society for Microbiology, Washington, D. C.; 1991).
  • Menschliche Isolate von Streptokokken der Gruppen G und C tragen ebenfalls scpA-ähnliche Gene. Einzelne Gruppe-G-Stämme exprimieren eine C5a-spezifische Proteaseaktivität auf ihrer Oberfläche. Cleary, P. P., et al., "Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci," Infect. Immun., 59:2305-2310 (1991). Folglich produzieren alle Serotypen (>80) von Streptokokken der Gruppe A, Streptokokken der Gruppe B, Streptokokken der Gruppe C und Streptokokken der Gruppe G das SCP-Enzym.
  • SCP unterstützt die Streptokokken bei der Kolonisierung eines potenziellen Infektionsortes, wie z. B. der nasopharyngealen Mukosa, indem sie den Zustrom von phagozytischen weißen Zellen zum Infektionsort inhibieren. Dies beeinträchtigt das initiale Clearance der Streptokokken durch den Wirt. Die Bedeutung von SCP für die Entzündung, die C5a-Leucozyten-Chemotaxis und die Streptokokkenvirulenz wurde unter Verwendung von Streptokokkenstämmen mit definierten Mutationen im Protease-Strukturgen untersucht. SCP-Varianten wurden durch gezielte Plasmidinsertion und durch Austausch des Wildtyp-Gens durch scpA, enthaltend eine spezifische internale Deletion, konstruiert. Varianten, denen die C5a-Proteaseaktivität fehlte, inhibierten nicht die chemotaktische Antwort humaner oder muriner PMNs auf C5a in vitro.
  • Ein murines Bindegewebe-Luftbläschenmodell wurde verwendet, um zu bestätigen, dass SCP den Zustrom von phagozytischen Zellen und das Clearance von Streptokokken vom Infektionsort retardiert. Ein Bindegewebs-Luftbläschen wurde erzeugt, indem man eine geringe Menge Luft und PBS (mit oder ohne darin enthaltene Streptokokken) mit einer 25-Gauge-Nadel unter die Haut auf dem Rücken einer Maus injiziert. Boyle, M. D. P. et al., "Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo", Meth. Enzymol., 162:101:115 (1988). Am Ende des Experiments wurden die Mäuse durch Zervix-Dislokation getötet, die Luftbläschen wurden aus den Tieren entnommen, und die Luftbläschen wurden in Puffer homogenisiert. Ein Vorteil dieses Luftbläschenmodells besteht darin, dass das Luftbläschen mehrere Tage aufgeblasen bleibt und frei von Entzündung ist, es sei denn, man injiziert ein Irritans. Somit werden die injizierten Bakterien und die resultierende inflammatorische Antwort über kurze Infektionszeiträume lokalisiert.
  • Das Luftbläschenmodell wurde modifiziert, um das Clearance von Wildtyp-SCP+- und SCP--Streptokokken (d. h. Streptokokken der Gruppe A, welche eine nicht funktionale, variante Form von SCP enthielten) zu vergleichen und um das zelluläre Infiltrat in einem frühen Stadium der Infektion zu analysieren. Gewebesuspensionen wurden auf lebensfähige Streptokokken aus Blutagar-Platten getestet, und das zelluläre Infiltrat wurde durch Fluoreszenz-Zellsortierung (FACS) analysiert. Bei der FACS-Analyse werden einzelne Zellen in Suspension mit spezifischen fluoreszierenden Mono-Antikörpern markiert. Teilmengen der markierten Zellen werden in ein FAC-Scan-Flusszytometer oder einen Fluoreszenz-Zellsorter injiziert, der die Zellen auf der Basis ihrer spezifischen Fluoreszenz zählt. Die unter Verwendung des Luftbläschenmodells durchgeführten Experimente weisen darauf hin, dass SCP+-Streptokokken virulenter waren als SCP--Streptokokken.
  • Eine Studie wurde durchgeführt, um die Produktion menschlicher Antikörper, sowohl IgG als auch IgA, gegen SCP in menschlichem Serum und Speichel zu messen. O'Connor, SP, et al., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase,". Infect. Dis., 163:109-16 (1991). Im allgemeinen fehlten in Seren und Speichel junger, nicht infizierter Kinder Antikörper gegen SCP. Im Gegensatz dazu zeigten die meisten Seren und Speichelproben gesunder Erwachsener nachweisbare Mengen an Anti-SCP IgG und SCP-spezifischem sekretorischem IgA (Anti-SCP slgA). Gepaarte akute und konvaleszente Seren aus Patienten mit Streptokokken-Pharyngitis zeigten signifikant erhöhte Werte an Anti-SCP IgG im Vergleich zu Seren gesunder Individuen. Seren mit hohen Anti-SCP-Immunoglobulinkonzentrationen konnten die SCP-Aktivität neutralisieren. Die Detektion dieses Antikörpers in > 90% der Speichelproben, erhalten von Kindern, die kurz zuvor an einer Streptokokken-Pharyngitis gelitten hatten, zeigten, dass Kinder eine Antikörperantwort produzieren können.
  • Obwohl menschliche Individuen IgG und IgA gegen SCP als Antwort auf eine natürliche Streptokokkusinfektion produzierten, war nicht bekannt, ob das Anti-SCP-Immunglobulin irgendeinen Schutz gegen Infektion bewirkt. Außerdem war nicht bekannt, ob das SCP-Protein als Vakzin gegen die Kolonisierung oder Infektion durch β-hämolytische Streptokokken wirken könnte. Zuerst wurde eine Studie durchgeführt, um die Rolle von SCP bei der Kolonisierung von Nasopharynx zu untersuchen. Nach intranasaler Infektion mit lebenden Streptokokken der Gruppe A wurden täglich Rachenkulturen über einen Zeitraum von bis zu zehn Tagen genommen. Wildtyp- und isogene SCP-defiziente Streptokokkusmutanten wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit, im Rachen über diesen Zeitraum von zehn Tagen persistent zu sein, verglichen. Wie erwartet, wurden die SCP-defizienten Streptokokkusmutanten aus dem Nasopharynx schneller entfernt.
  • Das gleiche intranasale Mausmodell wurde verwendet, um die Fähigkeit von SCP zur Induzierung einer die Kolonisierung verhindernden Immunität zu testen. Eine variante Form des rekombinanten scpA49-Gens, beginnend bei dem Nukleotid, das für Thr63 kodiert, wurde kloniert. Diese Variante wird als ΔSCP49 bezeichnet und weist eine Länge von 2908 bp auf (vgl. Beispiel 4 unten). Das variante SCP-Protein wurde durch Affinitätschromatographie aus einem rekombinanten E. coli gereinigt. Seren von intradermal mit diesem Proteinpräparat vakzinierten Kaninchen neutralisierten die SCP-Aktivität in vitro. Das gereinigte Protein (40 μg) wurde Mäusen intranasal über einen Zeitraum von fünf Wochen verabreicht. Immunisierte Mäuse zeigten ein Clearance von Streptokokkus innerhalb von 1-2 Tagen, wohingegen Rachenkulturen von nicht immunisierten Mäusen über einen Zeitraum von bis zu zehn Tagen positiv blieben. Die Experimente wurden mit drei Gruppen von Mäusen, vakziniert mit drei separaten Präparaten von SCP-Protein wiederholt.
  • Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Immunisierung eines Tiers mit einem einzelnen Antigen die Kolonisierung durch mehrere Serotypen inhibieren würde. ΔSCPA49 wurde in einen Expressionsvektor kloniert und in E. coli exprimiert. Die affinitiätsgereinigte ΔSCPA49-Proteinvariante erwies sich als hochimmunogen in Mäusen und Kaninchen. Obwohl das gereinigte variante ΔSCPA49-Immunogen enzymatische Aktivität nicht aufwies, induzierte es hohe Titer an Kaninchenantikörpern, die die Fähigkeit besaßen, Peptidaseaktivität, assoziiert mit den Streptokokken M1, M6, M12 und M49, in vitro zu neutralisieren. Dies bestätigte, dass Anti-Peptidase-Antikörpern die Serotypspezifität fehlte. Vier Gruppen von Mäusen wurden mit der gereinigten Variante ΔSCPA49 intranasal immunisiert und jede wurde mit einem anderen Serotyp von Streptokokken der Gruppe A infiziert. Die Immunisierung von Mäusen mit ΔSCPA49-Protein stimulierte signifikante Mengen spezifischer Speichel-slgA- und Serum-IgG-Antikörper und verringerte das Potenzial von Wildtyp-M1-, -M2-, -M6-, -M11- und -M49-Streptokokken zur Kolonisierung. Diese Experimente bestätigen, dass die Immunisierung mit Streptokokkus-C5a-Peptidasevakzin einen wirksamen Weg zur Prävention der Kolonisierung von Nasopharynx darstellt.
  • Außerdem wurden Experimente durchgeführt, um SCP-Varianten eines M1-OF--Stammes und eines M49-OF+-Stamms zu entwickeln. Da aktive SCP schädlich für den Wirt sein könnte, war es wichtig, dass die Proteinvarianten keine Enzymaktivität aufwiesen. Aminosäuren, welche für die katalytische Aktivität erforderlich waren, wurden durch solche ersetzt, die erwartungsgemäß das Enzym inaktivieren.
  • Zwei Eigenschaften der Proteinvarianten wurden evaluiert. Erstens wurde die spezifische Aktivität von Wildtyp- und Proteinvarianten mit Hilfe des PMN-Adhärenz-Assays bestimmt. Diese Experimente zeigten, dass die substituierten Aminosäuren die enzymatische Aktivität um mehr als 90% verringerten. Zweitens wurden die Proteinvarianten ebenfalls mit dem Wildtyp-Protein im Hinblick auf deren Fähigkeit zur Bindung von Antikörpern gegen das Wildtypenzym verglichen. Kompetitive ELISA-Assays wurden zu diesem Zweck verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäuresubstitutionen die Fähigkeit des Antikörpers, die Proteinvarianten zu binden, nicht veränderten.
  • Alle früheren Protektionsuntersuchungen wurden durchgeführt, indem man affinititätsgereinigtes ΔSCPA49-Protein intranasal ohne Adjuvans verabreichte. Eine intramuskuläre oder subkutane (SQ) Injektion von Antigenen ist jedoch historisch betrachtet eine bevorzugte, stärker akzeptierte Methode zur Vakzinverabreichung. Deshalb wurden Experimente durchgeführt, um zu testen, ob SQ-Injektionen von ΔSCPA49 mit Monophosphoryllipid A (MPL) und Alum (AlPO4) eine protektive Immunantwort induzieren würden, und ob diese Antwort die Kolonisierung reduzieren würde, nachdem ein Streptokokkus-Gruppe-A-Stamm zur Infektion verwendet wurde, der sich im Serotyp von der Quelle für das SCPA-Vakzin unterschied. Die Fähigkeit immunisierter Mäuse, zum Clearance von Streptokokken aus der Mund-Nasen-Pharyngealmukosa wurde durch Rachenkulturen oder durch Untersuchung von entnommenem Nasengewebe evaluiert.
  • Die Anzahl von Streptokokken in Nasengewebe nahm, wie erwartet, zeitabhängig ab und die Abnahme erfolgte schneller und vollständiger in Mäusen, welche mit dem SCPA-Antigen immunisiert waren. Die Ergebnisse bestätigten, dass ein einzelnes SCPA-Antigen Schutz gegen heterologe Serotypen induzieren kann. Der Schutz wird durch Antikörper verliehen, welche die Peptidaseaktivität auf der Bakterienoberfläche neutralisieren. Dies erhöht den Zustrom von Phagozyten innerhalb weniger Stunden, beginnend mit dem Zeitpunkt, an dem Streptokokken auf dem Mukosagewebe abgelagert werden. Ein schnelles Clearance von Streptokokken durch Phagozyten verhindert vermutlich die anschließende Vermehrung und Persistenz von Bakterien. Somit induzierte die SQ-Injektion von SCPA-Antigen mit Adjuvans durchwegs eine starke Antikörperantwort.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Vakzin zur Verwendung für den Schutz eines Säugers gegen die Kolonisierung von oder Infektion durch β-hämolytischen Streptococcus bereit, wobei das Vakzin eine immunogene Menge eines isolierten und gereinigten Peptids umfasst, umfassend eine enzymatisch inaktive Streptokokkus-C5a-Peptidase (SCP), wobei diese Menge einen suszeptiblen Säuger gegen β-hämolytischen Streptokokkus wirksam immunisiert, in Kombination mit einem physiologisch verträglichen, nicht toxischen Träger, wobei die SCP eine Variante von Wildtyp-SCP ist, indem die SCP-Variante jeweils eine Substitution bei einem Aminosäurerest, entsprechend den Aminosäureresten 130 und 512 von SEQ ID NO: 1 aufweist. Erfindungsgemäße Vakzine können außerdem wirksame Mengen immunologischer Adjuvanzien enthalten, welche eine Immunantwort in bekannter Weise verstärken.
  • Das SCP kann mit einem anderen Peptid oder Polysaccharid konjugiert oder verknüpft sein. Beispielsweise können aus dem Stand der Technik bekannte immunogene Proteine, auch bekannt als „Carrier", verwendet werden. Brauchbare immunogene Proteine umfassen Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin, Humanserumalbumin, menschliches Gammaglobulin, Hühnerimmunoglobulin G und Rindergammaglobulin. Brauchbare immunogene Polysaccharide umfassen Polysaccharid aus Streptokokken der Gruppe A, C-Polysaccharid aus Streptokokken der Gruppe B oder Kapselpolysaccharid aus Streptococcus pneumoniae oder Streptokokken der Gruppe B. Alternativ dazu können Polysaccharide oder Proteine von anderen Pathogenen, die als Vakzine verwendet werden, mit SCP vermischt oder daran konjugiert oder geknüpft werden.
  • Die Erfindung stellt außerdem isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle, wie z. B. DNA-Moleküle, bereit, welche ein ausgewähltes Nukleinsäuresegment umfassen, das wenigstens für einen Teil der Streptokokkus-C5a-Peptidase kodiert, d. h. diese kodieren für SCP oder eine der hierin beschriebenen Varianten, wie z. B. SCPA49S512A, SCPA49D130A, SCPA49N295A, SCPA1S512A, SCPA1D130A, SCPA1N295A, ΔSCPA49, SCPBS512A, SCPBD130A, SCPBH193A oder SCPBN295A, oder jegliche Kombination dieser Mutanten. Die Erfindung offenbart außerdem eine Expressionskassette, umfassend ein ausgewähltes DNA-Segment, welches für ein RNA-Molekül kodiert, das im Wesentlichen identisch ist (sense) mit der Messenger-RNA („target" mRNA) oder einem Teil davon, d. h. einer endogenen oder „nativen" SCP-mRNA. Das ausgewählte DNA-Segment in der Expressionskassette ist mit einem Promotor operativ verknüpft. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen identisch" in einer Sequenz bedeutet, dass zwei Nukleinsäuresequenzen zueinander eine Identität von wenigstens etwa 65% vorzugsweise etwa 70%, insbesondere etwa 90% und besonders bevorzugt etwa 98% bezogen auf eine zusammenhängende Nukleotidsequenz aufweisen. Vorzugsweise hybridisiert das ausgewählte DNA-Segment unter Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, mit einem Nukleinsäuremolekül, das für das korrespondierende native SCP kodiert.
  • Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen rein" bedeutet, dass eine bestimmte Spezies eine vorherrschende Spezies ist (d. h. auf molarer Basis häufiger als die anderen individuellen Spezies in einer Zusammensetzung vorliegt), und vorzugsweise stellt eine im Wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung dar, worin die betreffende Spezies wenigstens etwa 50% (auf molarer Basis) aller vorliegender makromolekularer Spezies ausmacht. Im Allgemeinen wird eine im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als 80% aller in der Zusammensetzung vorliegenden makromolekularen Spezies, insbesondere mehr als etwa 85%, etwa 90%, etwa 95% und etwa 99% ausmachen. Besonders bevorzugt wird die betreffende Spezies im Wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (die kontaminierende Spezies kann in der Zusammensetzung durch herkömmliche Nachweisverfahren nicht nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer einzelnen makromolekularen Spezies besteht.
  • Der hierin verwendete Ausdruck „rekombinante Nukleinsäure" oder „ausgewählte Nukleinsäure" wie z. B. „rekombinante(s) DNA-Sequenz oder -Segment" oder „ausgewählte(s) DNA-Sequenz oder -Segment" betrifft eine Nukleinsäure, wie z. B. DNA, welche von irgendeiner geeigneten Quelle abgeleitet oder daraus isoliert wurde, die anschließend chemisch in vitro verändert werden kann, so dass deren Sequenz eine nicht natürlich vorkommende Sequenz ist, oder natürlich vorkommenden Sequenzen entspricht, die nicht so positioniert sind, wie sie in einem Genom positioniert wären, das mit der exogenen DNA nicht transformiert wurde. Ein Bei spiel einer ausgewählten DNA, „abgeleitet" aus einer Quelle, wäre eine DNA-Sequenz, die als brauchbares Fragment innerhalb eines bestimmten Organismus identifiziert wurde, und welche dann in im Wesentlichen reiner Form chemisch synthetisiert wurde. Ein Beispiel für eine DNA, „isoliert" aus einer Quelle, wäre eine brauchbare DNA-Sequenz, welche aus der Quelle mit chemischen Mitteln ausgeschnitten oder daraus entfernt wurde, wie z. B. durch Verwendung von Restriktionsendonukleasen, so dass diese weiter manipuliert, wie z. B. durch Verfahren des Genetic Engineering, zur erfindungsgemäßen Verwendung amplifiziert, werden kann.
  • Die Gewinnung oder Isolierung eines bestimmten Fragmentes einer DNA aus einem Restriktionsverdau kann die Auftrennung des Verdaus auf einem Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese umfassen, die Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität im Vergleich zu Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entnahme des Gelabschnittes, der das gewünschte Fragment enthält, und die Abtrennung des Gels von der DNA. Vgl. Laven et al., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981), und Goeddel et al., Nucleic Acides Res., 8, 4057 (1980). Daher umfasst eine „ausgewählte DNA" vollständig synthetische DNA-Sequenzen, semisynthetische DNA-Sequenzen und DNA-Sequenzen, isoliert aus biologischen Quellen, und DNA-Sequenzen, isoliert aus RNA sowie Mischungen davon.
  • Der hierin verwendete Begriff „abgeleitet" bedeutet in Bezug auf ein RNA-Molekül, dass das RNA-Molekül eine komplementäre Sequenzidentität mit einem bestimmten DNA-Molekül aufweist.
  • Nukleinsäuremoleküle, welche für Aminosäuresequenzvarianten eines SCP kodieren, können mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden aus dem Stand der Technik hergestellt werden. Diese Methoden umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle einer natürlich auftretenden Aminosäuresequenzvariante) oder die Herstellung durch oligonukleotidvermittelte (oder ortsspezifische) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Variante oder einer nicht-varianten Version von SCP.
  • Zur Immunisierung eines Subjekts wird die SCP-Variante parenteral, gewöhnlich durch intramuskuläre oder subkutane Injektion, in einem geeigneten Vehikel verabreicht. Andere Verabreichungsarten, wie orale Verabreichung oder intranasale Verabreichung, sind jedoch ebenfalls akzeptabel. Vakzinformulierungen enthalten eine wirksame Menge des aktiven Bestandteils in einem Vehikel. Die wirksame Menge ist ausreichend, um die Inzidenz einer Kolonisierung durch β-hämolytischen Streptococcus in dem betreffenden Säuger zu unterbinden, zu lindern oder zu verringern. Die wirksame Menge kann durch den Fachmann in einfacher Weise bestimmt werden. Der aktive Bestandteil kann typischerweise in einem Anteil von etwa 1% bis etwa 95% (w/w) in der Zusammensetzung oder in einem größeren oder kleineren Anteil, falls angebracht, enthalten sein. Die zu verabreichende Menge ist abhängig von Faktoren, wie Alter, Gewicht und physischem Zustand des zu vakzinierenden Lebewesens oder Menschen. Die Menge ist außerdem abhängig von der Kapazität des Immunsystems des Lebewesens, Anti körper zu synthetisieren, sowie vom beabsichtigten Schutzgrad. Die wirksame Dosis kann von einem Fachmann mit Hilfe von Routineuntersuchungen unter Erstellung von Dosis-Ansprechkurven in einfacher Weise bestimmt werden. Das Individuum wird durch Verabreichung der SCP in einer oder mehreren Dosen immunisiert. Mehrfache Dosen können verabreicht werden, wenn dies zur Beibehaltung der Immunität gegen Streptokokken erforderlich ist.
  • Intranasale Formulierungen können Vehikel enthalten, welche weder eine Irritation der Nasenschleimhaut noch eine signifikante Störung der Ciliarfunktion verursachen. Verdünnungsmittel, wässrige Kochsalzlösung oder andere Substanzen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nasalformulierungen können außerdem Konservierungsstoffe, wie z. B. Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, ohne darauf beschränkt zu sein, enthalten. Ein oberflächenaktives Mittel kann enthalten sein, um die Absorption des in der Rede stehenden Proteins durch die Nasalmukosa zu fördern.
  • Orale Flüssigpräparate können beispielsweise in Form einer wässrigen oder öligen Suspension, als Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixiere vorliegen oder können trocken in Tablettenform oder als Produkt zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung bereitgestellt werden. Derartige Flüssigpräparate können herkömmliche Additive, wie z. B. Suspendiermittel, Emulgiermittel, nicht-wässrige Vehikel (welche essbare Öle umfassen) oder Konservierungsmittel enthalten.
  • Zur Herstellung eines Vakzins kann das gereinigte SCP isoliert, lyophilisiert und stabilisiert werden. Das SCP-Peptid kann dann auf eine geeignete Konzentration eingestellt werden, gegebenenfalls in Kombination mit einem Vakzinadjuvans, und zur Verwendung verpackt werden. Geeignete Adjuvanzien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis(2hydroxyethyl-propandiamin), Methoxyhexadecyl-glycerin, und Pluronicpolyole; Polanionen, z. B., Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol; Peptide, z. B., Muramyldipeptid, MPL, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen, Alum, und Mischungen davon. Andere potenzielle Adjuvanzien umfassen die B-Peptiduntereinheiten des hitzelabilen E. coli-Toxins oder des Choleratoxins. McGhee, J. R., et al., "On vaccine development," Sem. Hematol., 30:3-15 (1993). Schließlich kann das immunogene Produkt in Liposomen zur Verwendung in einer Vakzinformulierung inkorporiert werden oder kann mit Proteinen, wie Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) oder Humanserumalbumin (HSA) oder anderen Polymeren konjugiert werden.
  • Die Verwendung von SCP zur Vakzinierung eines Säugers gegen eine Kolonisierung bietet Vorteile gegenüber anderen Vakzinkandidaten. Eine Prävention der Kolonisation oder Infektion durch Inokulation mit einem einzelnen Protein verringert nicht nur die Inzidenz des sehr verbreiteten Problems einer Streptokokken-Pharyngitis und Impetigo sondern eliminiert auch Folgeerkrankungen wie rheumatisches Fieber, akute Glomerulonephritis, Sepsis, toxischen Schock und nekrotisierende Fasciitis.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung, ohne diese jedoch zu beschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion und In-vitro-Analyse von Insertions- und Deletionsmutanten in scpA49 und scpA6
  • a) Bakterielle Stämme und Kultivierungsbedingungen.
  • Der S. pyogenes-Stamm CS101 ist ein Serotyp M49 und ein Serumopazität-positiver (OF+)-Stamm. CS159 ist ein klinisches Isolat mit einer Deletion, welche sich über den M-Gencluster und scpA erstreckt. Ein spontanes, streptomycinresistentes Derivat des Stamms CS101 mit der Bezeichnung CS101Sm wurde durch Ausplattieren von Streptokokken aus einer Stationärphasenkultur auf Tryptose-Blutagar, enthaltend Streptomycin (200 μg/ml), selektiert. Die Streptokokkusstämme CS210 und CS463 sind spontane streptomycinresistente Derivate von OF+, Klasse II, Serotyp-M2- bzw. -M11-Stämmen. Die Streptokokkusstämme 90-131 und UAB200 sind spontane streptomycinresistente Derivate von OF-, Klasse I, Serotyp-M1- bzw. -M6-Humanisolaten von Streptokokken der Gruppe A.
  • CS101::pG+host5 entspricht Stamm CS101 wobei pG+host5 in das Chromosom an einem unbekannten Ort, jedoch außerhalb von scpA und dem emm-Gencluster integriert ist.
  • Escherichia coli-Stamm ER1821 (von New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) wurde als Rezipient für einen Suizidvektor, Plasmid pG+host5, verwendet. Plasmid pG+host5 wurde von Appligene, Inc. Pleasanton, CA., erworben. Streptokokken wurden in Todd-Hewitt-Brühe, supplementiert mit 2% Neopepton oder 1% Hefeextrakt, oder auf Tryptose-Agarplatten mit 5% Schafsblut gezüchtet. Der E. coli-Stamm ER1821, enthaltend das Plasmid pG+host5, wurde in LB-Medium mit Erythromycin (300 μg/ml) gezüchtet. Streptokokken mit Plasmid pG+host5 wurden in Todd-Hewitt-Medium mit 1% Hefeextrakt (THY), enthaltend 1 μg/ml Erythromycin (Erm), kultiviert.
  • SCP bezeichnet allgemein Streptokokkus-C5a-Peptidase aus β-hämolytischem Streptococcus. SCPA1, SCPA12, SCPA49, SCPA6 sind spezifische Peptidasen aus den Stämmen 1, 12, 49 und 6 von Streptococcus der Gruppe A, Serotyp M. Der Ausdruck scpA bezeichnet das für SCP aus Streptokokken der Gruppe A kodierende Gen. ScpA1, scpA12, scpA6 und scpA49 sind die für die SCPA1-, SCPA12-, SCPA49- und SCPA6-Peptidasen kodierenden Gene. SCPB und scpB bezeichnen die Peptidase und das entsprechende Gen aus Streptokokken der Gruppe B. Die Aminosäuresequenzen für SCPA49 (SEQ ID NO: 1), SCPA12 (SEQ ID NO: 2), SCPA1 (SEQ ID NO: 23) und SCPB (SEQ ID NO: 3) sind in 2 gezeigt.
  • b) Konstruktion der scpA49-Insertionsmutante.
  • Definierte Insertionsmutanten von scpA49 wurden unter Verwendung von Plasmidinsertions- und Gen-Austauschmethoden konstruiert. Ein internes scpA49-BgIII-BamHI-Fragment, das Insertionstarget, wurde in den thermosensitiven Shuttlevektor pG+host5 zur Bildung des Plasmids pG::scpA1.2 insertiert und in E. coli ER1821 (3) transformiert. Der pG+host5-Vektor enthält einen E. coli- Replikationsursprung, der bei 39 °C aktiv ist, einen temperatursensitiven grampositiven Replikationsursprung (aktiv bei 30 °C und inaktiv bei 39 °C in Streptokokken), und ein Erythromycinresistenzgen zur Selektion. Durch hohe Temperatur wird das Plasmid zur Integration in die chromosomale DNA von Streptokokken der Gruppe A durch homologe Rekombination mit einer Häufigkeit im Bereich von 10-2 bis 10-3 gezwungen.
  • Rekombinante Plasmid-DNA pG::scpA1.2 wurde in CS101-Empfängerzellen durch Elektroporation überführt. Die Transformanten wurden auf THY-Agarplatten, enthaltend 1 μg/ml Erythromycin bei 30 °C selektiert. Chromosomale Integranten, welche aus der Rekombination zwischen dem Plasmidinsert und chromosomalem scpA49 resultierten, wurden durch Erythromycinresistenz bei 39 °C selektiert. Zwei Insertionsmutanten mit den Bezeichnungen M14 und M16 wurden analysiert. Emrs-Revertanten von Stamm M14 und M16 wurden durch Passage in THY ohne Antibiotikum bei 30 °C erhalten und schließlich bei 37 °C ohne Erm-Selektion ausplattiert. Kolonien, welche das Plasmid verloren hatten, wurden isoliert, um zu bestätigen, dass der Mutanten-Phänotyp aus der Insertion des Plasmids in scpA49 und nicht aus einer gleichzeitigen anderen Mutation resultierte.
  • c) Konstruktion der scpA6-Insertionsmutanten.
  • Die scpA6-Insertionsmutante AK1.4 wurde wie oben in Abschnitt (b) beschrieben konstruiert. Rekombinante Plasmid-DNA pG::scpA1.2 enthält das interne BgIII-HindIII-Fragment des scpA-Gens. Das Plasmid wurde in UAB200-Empfängerzellen durch Elektroporation eingeführt, und die Transformanten wurden auf THY-Agarplatten, enthaltend Erythromycin bei 30 °C selektiert. Ein chromosomaler Integrant von pG::scpA1.2, nämlich Stamm AK1.4, der aus der Rekombination zwischen dem Plasmidinsert und chromosonalem scpA6 resultierte, wurde durch Wachstum auf Agarmedium, enthaltend Erythromycin, bei 39 °C selektiert. Die Insertion in scpA6 wurde durch Southern Blotting unter Verwendung von scpA als Sonde und durch PCR unter Verwendung eines M13-Universalprimers (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ ID NO: 6), spezifisch für das Plasmid, und eines scpA For835-Primers (5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3') (SEQ ID NO: 7), spezifisch für chromosomales scpA aus GAS bestätigt.
  • d) Einführung einer definierten Deletion in scpA (3).
  • Ein Mutantenstamm mit einer definierten Deletion innerhalb von scpA49 wurde konstruiert, um die Möglichkeit auszuschließen, dass Insertionen in scpA49 polar sein könnten und die Expression stromabwärts gelegener Gene, unbekannter Gene, die auch zur Virulenz des Organismus beitragen könnten, reduzieren. Zunächst wurde eine definierte Deletion in dem BgIII-HindIII-Fragment von scpA durch Inside-Out-PCR unter Verwendung von Primer 1 (5'GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATGGGAC-3'), SEQ ID NO: 4, und Primer 2 (5'-GGGGGGGAATTCGGGTGCTGCAATATCTGGC-3'), SEQ ID NO: 5 hergestellt. Unterstrichene Nukleotide entsprechen den scpA-Sequenzen mit den Koordinaten 2398 bzw. 2322 und die fett gedruckten Nukleotide entsprechen einer EcoRI-Schnittstelle. Die Primer wurden so ausgewählt, dass sie eine In-Frame-Deletion im scpA-Gen verursachen. Diese Primer kopieren Plasmid-DNA in entgegengesetzten Richtungen und definieren die Grenzen der Deletion. Innis, M. A., et al., Herausg., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990). Das Plasmid pG::scpA1.2 DNA wurde als Template verwendet.
  • Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI verdaut und mit dem Plasmid pG+host5 ligiert. Das resultierende Plasmid pG::AscpA1.1 enthielt eine 76 bp-Deletion innerhalb von scpA. Diese In-Frame-Deletion entfernte 25 Aminosäuren, einschließlich des Serinrestes, der Teil des vorhergesagten katalytischen Zentrums von Serinproteasen ist. Chen, C., und Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Eine EcoRV-Schnittstelle wurde am Deletionsort erzeugt. DNA, welche die Deletion überlappt, wurde sequenziert, um die Grenzen der Deletion zu bestätigen.
  • Das Plasmid pG::ΔscpA1.1, welches die Deletion enthält, wurde in E. coli ER1821 insertiert. Kolonien wurden auf ErmR selektiert und unter Verwendung von Miniprep-Plasmid-DNA, verdaut mit EcoRI, auf geeignete scpA-Deletion gescreent. Die genauen Grenzen der Deletion wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid pG::ΔscpA1.1 wurde in den Stamm CS101Sm, wie oben beschrieben, durch Elektroporation eingeführt, und anschließend wurden die Integranten durch Wachstum auf Erm bei 39 °C selektiert. Die Integration des Plasmids in das Chromosom des M49-Stammes CS101sm wurde unter Verwendung der Hochtemperaturselektion durchgeführt. Der Ort der Insertion wurde durch PCR bestätigt. Das Wachstum von C5101Sm (pG::ΔscpA1.1) bei niedriger Temperatur ohne Erythromycinselektion führte zu einer hochfrequenten Segregation von ErmS-Revertanten, die das Plasmid durch Zufallsdeletionsereignisse oder durch Exzision auf Grund von Rekombination zwischen duplizierten scpA-Sequenzen, erzeugt durch die Insertion, verloren hatten. Zwei Deletionsmutanten, nämlich MJ2-5 und MJ3-15 wurden identifiziert und weiter untersucht. Die durch Rekombination bedingte chromosomale Deletion von Plasmid pG::ΔscpA1.1 wurde durch PCR und Southern-Hybridisierung mit EcoRV-verdauter DNA überprüft.
  • e) In-vitro-Effekte von Mutationen auf SCP.
  • Der Einfluss von Insertionen und Deletionen auf die Expression des SCP-Antigens und die Peptidaseaktivität wurde durch Western Blotting und PMNs-Adhärenz-Assays überprüft. Streptokokken wurden in 100 ml THY bei 37 °C über Nacht inkubiert. Das Kulturpellet wurde zweimal in 5 ml kaltem 0,2 M Natriumacetat (pH 5,2) gewaschen, anschließend in 1 ml TE-Sucrosepuffer (20% Sucrose 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,0) und 40 μl Mutanolysin suspendiert. Das Gemisch wurde 2 h bei 37 °C rotiert, anschließend 5 min bei 4500 Upm zentrifugiert. Die Überstände enthielten Proteaseinhibitor, nämlich 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Elektrophorese und Western-Blotting-Methoden wurden wie beschrieben in Laemmli, U. K., "Cleavage of structural Proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4," Nature 227:680-685 (1970), durchgeführt. Das zur Detektion von SCP-Protein in Western- und Kolonie-Blots verwendete primäre Antiserum wurde durch Immunisierung eines Kaninchens mit gereinigtem rekombinantem SCP-Protein hergestellt. Die Bindung wurde detektiert durch Anti-Kaninchen-Anikörper-Alkalisches-Phosphatase-Konjugat.
  • Die C5a-Peptidaseaktivität wurde unter Verwendung eines PMN-Adhärenz-Assays bestimmt. Booth, S. A. et al., "Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherence function," J. Invest. Dermatol., 98:135-140 (1992). Nach Inkubation von C5a (Sigma, St. Louis, MO) mit Streptokokkusextrakten oder gereinigter Protease kann verbleibendes C5a PMNs dazu aktivieren, an BSA-beschichtete Vertiefungen anzuheften. Zunächst wurden Mikrotiter-Vertiefungen mit 0,5% BSA in PBS beschichtet und 1 h bei 37 °C inkubiert. Humane PMNs wurden durch Zentrifugation in Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis, MO) isoliert. 40 μl intakte Streptokokken oder Proteinextrakte wurden mit 20 μl 5 μM C5a in 340 μl PBS mit 1% Glucose und 0,1% CaCl2 bei 37 °C 45 min inkubiert. BSA-beschichtete Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen und resuspendierte PMNs und restliches C5a wurden den Vertiefungen zugesetzt. Das Gemisch wurde 45 min bei 37 °C in 7% CO2 inkubiert. Schließlich wurden die Vertiefungen gewaschen, um nicht adhärente PMNs zu entfernen. Adhärente PMNs wurden mit Kristallviolett gefärbt und die OD570nm wurde in einem ELISA-Lesegerät bestimmt. Die optische Dichte ist proportional zur Menge an verbleibendem C5a oder invers proportional zur Menge an SCP-Aktivität.
  • Mutanolysinextrakte von Zelloberflächenproteinen aus parentalen und Mutantenkulturen wurden durch Western-Blotting unter Verwendung von SCPA-spezifischem Serum analysiert. Die Mutanten wurden auf fehlendes SCPA überprüft. Extrakte der SCPA--Mutanten AK1.4 und MJ3-15 reagierten nicht mit Anti-SCPA-Serum. SCPA-Proteine mit der erwarteten Größe wurden in Extrakten der Wildtyp-Stämme CS101 und UAB200 beobachtet. Eine fehlende Produktion der C5a-Peptidaseaktivität durch die Mutantenstämme AK1.4 und MJ3-15 wurde durch Vergleich ihrer Fähigkeit zur Zerstörung von rhC5a verifiziert. Die Exposition von isolierten PMNs mit rhC5a induzierte diese dazu, an BSA-beschichtete Mikrotiter-Vertiefungen zu binden. Die Inkubation mit Streptokokken oder gereinigtem SCPA führte zu einer spezifischen Spaltung von rhC5a und veränderte dessen Potenzial zur Aktivierung von PMNs. PMNs, welche auf restliches rhC5a reagierten, und an BSA-beschichtete Vertiefungen banden, wurden gefärbt und anschließend spektrophotometrisch vermessen. Die Inkubation von rhC5a mit den Ausgangskulturen UAB200 und CS101 führte zu einer Zerstörung von rhC5a, wodurch die PMN-Adhärenz um 58,8% bzw. 54,5% inhibiert wurde. Im Gegensatz dazu veränderten die SCPA--Mutanten AK1.4 und MJ3-15 rhC5a oder die Adhärenz von PMNs an BSA-beschichtete Vertiefungen nicht (Tabelle 1). Dieses Experiment bestätigte die Western-Blotting-Experimente und zeigte, dass SCPA--Kulturen keine anderen Proteasen enthielten, welche rhC5a abbauen könnten. Tabelle 1: Phagozytose-Assay und PMN-Adhärenz-Assay von Wildtyp- und Mutanten stämmen
    Stamm Beschreibung Kolonie-bilden (cfu)/ml de Einheiten n-fache Zunahme in cfu/ml Prozentuale Inhibition von C5a-induzierter PMN-Adhärenz*
    Zeit=0h Zeit = 3 h
    UAB200 M6+, SCPA+ 1.8 × 103 7.2 × 104 40 58.8
    AK1.4 M6+, SCPA 1.2 × 103 4.5 × 104 37.5 0
    CS101 M49+, SCPA+ 1.0 × 104 4.9 × 103 49 54.5
    MJ3-15 M49+, SCPA+ 1.5 × 104 2.1 × 103 14 0
    • * Prozentuale Inhibition ist = [(OD570nm von PMNs, aktiviert durch C5a alleine – OD570nm PMNs, aktiviert durch C5a, vorinkubiert mit Bakterien/OD570nm von PMNs, aktiviert mit C5a alleine)] × 100%
  • Obwohl nicht erwartet wurde, dass die M-Protein-Expression durch Mutationen in scpA beeinflusst wird, wurden Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob SCPA--Streptokokkusmutanten weiterhin M-Protein exprimieren und die Fähigkeit besitzen, einer Phagozytose zu widerstehen. Das Wachstum von Streptokokken in frischem Humanblut während einer 3-stündigen Inkubation dient als Hinweis auf das antiphagozytotische M-Protein auf deren Oberfläche. R. C. Lancefield, "Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test", J. Exo. Med., 106, Seiten 525-685 (1957). Wie erwartet, nahmen unveränderte Streptokokkusstämme UAB200 und CS101 um das 40- bzw. 49-fache zu (Tabelle 1). Die M+SCPA--Kulturen, die Stämme AK1.4 und MJ3-15 nahmen um das 37,5- bzw. 14-fache zu, was bestätigt, dass scpA-Mutationen einen geringen Einfluss auf die M-Proteinexpression oder Resistenz gegenüber Phagozytose in menschlichem Gesamtblut besitzen. Das etwas geringere Wachstum beider Mutantenstämme in rotiertem Blut war reproduzierbar und unerwartet. Die Wachstumsraten für Mutantenkulturen und Ausgangskulturen in menschlichem Plasma waren nicht unterscheidbar. Es besteht die Möglichkeit, dass die Inaktivierung von SCPA eine Akkumulierung von C5a in rotiertem Blut ermöglicht, welches seinerseits PMNs aktiviert. Aktivierte PMNs haben eine stärkere phagozytotische Wirkung und können M+-Streptokokken besser ausschalten. Oberflächenproteinextrakte enthalten M6- und M49-Antigen, wie eine Analyse durch Western-Blotting unter Verwendung von Anti-M49- und Anti-M6-Seren zeigt, was bestätigt, dass Mutationen in SCPA die M-Protein-Expression nicht verändern.
  • BEISPIEL 2
  • SCP verzögert die Rekrutierung von Phagozyten und das Clearance von Streptokokken aus subdermalen Infektionsstellen
  • Um zu verifizieren, dass SCP für die Inaktivierung von C5a verantwortlich ist, wurden die Insertions- und Deletionsmutanten von scpA49 wie in obigem Beispiel 1 beschrieben konstruiert und auf Aktivität getestet. Werden die Insertionen oder Deletionen in scpA49 eingeführt, so verliert die SCP-Variante die Fähigkeit, die C5a-aktivierte Adhärenz von PMNs an Mikrotiter-Platten zu unterbinden.
  • Der Einfluss von Mutationen in scpA49 auf die Virulenz wurde unter Verwendung eines Tiermodells getestet, bei welchem die Streptokokken lokalisiert bleiben und worin der Zustrom inflammatorischer Zellen analysiert werden konnte. Um die Hypothese zu untersuchen, dass SPC in einem frühen Stadium bewirkt ein initiales Clearance des Organismus' zu verzögern, wurde das Schicksal von SCP+- und SCP--Streptokokken nur vier Stunden nach Inokulation von Bindegewebsluftbläschen verglichen. Darüber hinaus wurde außerdem die Dissemination von Streptokokken in Lymphknoten und der Milz nach diesem kurzen Infektionszeitraum bestimmt.
  • Männliche CD1-Outbred-Mäuse (25 g), bezogen von Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA, wurden zu allen Experimenten verwendet. Ein Bindegewebsluftbläschen wurde durch Injektion von 0,9 ml Luft und 0,1 ml Streptokokken der Gruppe A, verdünnt in PBS, mit einer 25-Gauge-Nadel unter die Haut auf dem Rücken der Maus erzeugt. In einzelnen Experimenten wurde SCP+ CS101::pG+host5 als positive Kontrolle verwendet. In anderen Experimenten wurde der Stamm CS101Sm als positive Kontrolle verwendet. Mäuse wurden durch Zervix-Dislokation 4 Stunden nach Infektion getötet. Wo angegeben, wurden alle vier Leistenlymphknoten, die Milz und das Luftbläschen aus den Tieren entnommen und in PBS homogenisiert. Gewebesuspensionen wurden auf lebensfähige, Kolonie-bildende Einheiten (CFU) auf Blutagar-Platten, enthaltend 1 μg/ml Erythromycin oder 200 μg/ml Streptomycin getestet.
  • In einem vorausgehenden Experiment wurden Luftbläschen auf Objektträgern fixiert, mit Wright's Stain gefärbt und mikroskopisch untersucht. Obwohl Granulozyten-Counts mit Hilfe dieser Methode nicht verlässlich sind, so zeigte sich doch eine signifikant geringere verbleibende Anzahl von SCP--Streptokokken im Vergleich zu Wildtyp-Streptokokken im fixierten Gewebe. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um diesen Unterschied zu messen. Dispergierte Zellpopulationen der Luftbläschen wurden durch Verreiben der Luftbläschen in PBS und anschließende Auftragung auf ein Nylon-Monofilamentgitter (TETKO Co. New York) hergestellt.
  • Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 300 × g pelletiert und zu 5 × 106/ml in FACS-Puffer (Hank's Balanced Salt Solution ohne Phenolrot, 0,1% NaN3, 1,0% BSA, Fraktion V) resuspendiert. Die Zellen (1,0 × 106) wurden direkt mit einem 1 μg FITC-Anti-Maus-Mac-1 oder indirekt mit 1 μg biotinkonjugiertem Anti-Maus-Gr-1, gefolgt von 1 μg Streptavidin, markiert mit Fluoreszenz oder FITC gefärbt. Die monoklonalen Antikörper Mac-1 und Gr-1 wurden von Pharmingen Inc., CA, bezogen. Markierte Zellen wurden in 1,0% Paraformaldehyd fixiert. Fluoreszenzprofile wurden unter Verwendung eines FAC-Scan-Flusszytometers und der Consort-32-Software (Becton Dickinson) erzeugt. PMNs der Maus wurden aus Gesamtblut durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und als Standard für definierte PMNs in Mischpopulationen verwendet. Zur Messung spezifisch markierter Zellen wurde die mittlere Fluoreszenz für jeden Antikörper-Marker bestimmt, und Fenster wurden bestimmt, um intensiv markierte Zellen zu erfassen. Kontrollen umfassten ungefärbte Zellen sowie Zellen, welche nur Streptavidin-FITC ausgesetzt waren.
  • Zwei Experimente wurden durchgeführt. Im ersten wurde die scpA49-Insertionsmutante M16 mit der korrespondierenden SCP+-Ausgangskultur, Stamm CS101, verglichen. Im zweiten wurde die scpA49-Deletionsmutante MJ3-15 mit dem Ausgangsstamm CS101Sm verglichen (Tabelle 2). In beiden Experimenten enthielten homogenisierte Luftbläschen aus Mäusen, inokuliert mit SCP--Streptokokken, eine geringere Anzahl an Streptokokken nach 4 Stunden als Luftbläschen, inokuliert mit Wildtyp-Streptokokken. Das erste Experiment zeigte eine zweifache Verringerung und dass zweite eine vierfache Verringerung. Die Unterschiede waren statistisch signifikant (P<0,05 bzw. P<0,001 unter Verwendung eines nicht gepaarten t-Tests). Es wurde außerdem beobachtet, dass Wildtyp-SCP+-Streptokokken in Milzhomogenaten von 7 von 8 Mäusen bzw. 6 von 8 Mäusen gefunden wurden, wohingegen die SCP-Mutanten kaum in der Milz zu finden waren. Ein gegenteiliges Bild ergab sich für Lymphknoten-Homogenate. Knoten von 10 von 16 Mäusen, infiziert mit SCP--Streptokokken, enthielten lebensfähige Streptokokken, wohingegen nur 4 von 16 Lymphknoten aus Mäusen, infiziert mit den Wildtyp-Streptokokken lebensfähige Bakterien enthielten. Dieser Unterschied war statistisch signifikant (P<0,05 bei Verwendung des exakten Tests nach Fischer). Tabelle 2: Distribution von SCP+- und SCP--Streptokokken 4 Stunden nach Luftbläschen infektion
    Stämme Anzahl der Mäusea Anzahl positiver Kulturen Homogenisierte Luftbläschenc
    Milzb Lymph -knoten
    CS101pG(SCP+) 8 7 2 1.3 × 108 ± 2.2 × 107
    M16(SCP-) 8 0 5 6,0 × 107 ± 1.3 × 107
    CS101Sm(SCP+) 8 6 2 1.6 × 108 ± 2.6 × 107
    MJ3-15 (SCP-) 8 1 5 3.7 × 107 ± 1.5 × 107
    • a Jede Maus wurde mit 3 × 108 CFU Streptokokken aus der stationären Phase inokuliert.
    • b Unterschied in der Häufigkeit der Isolation von SCP+-Streptokokken aus der Milz im Vergleich zu SCP--Streptokokken war statistisch signifikant (P<0,05) für jedes Experiment nach dem exakten Test nach Fischer.
    • c Die Unterschiede in CFU, isoliert aus homogenisierten Luftbläschen (Mittelwert ± SEMs) waren signifikant, Stämme CS101pG (SCP+) und M16 (SCP-) und MJ3-15 (SCP) (P<0,001) für jedes Experiment im ungepaarten t-Test.
  • Das raschere Clearance von Streptokokken aus Luftbläschen resultierte aus einer intensiveren Rekrutierung von PMNs. Die Gesamtzellpopulation, der Prozentsatz an Mac-1-positiven Granulozyten (Springer, G. et al., "Mac-1:macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody," Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)) und der Prozentsatz an Gr-1-positivem PMN (Brummer, E. et al., "Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungal killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in vitro", L. Leuko. Bio., 36:505-520 (1984)) in Luftbläschen wurde an Hand einer Einzelfarben-FACS-Analyse verglichen. Clark, J. M., "A new method for quantitation of cell-mediated immunity in the mouse", J. Reticuloendothel. Soc., 25:255-267 (1979). In einer FACS-Analyse werden einzelne Zellen in Suspension mit spezifischen fluoreszierenden Mono-Antikörpern markiert. Aliquote der markierten Zellen werden in ein FAC-Scan-Flusszytometer oder einen Fluoreszenz-Zellsorter injiziert, der die Zellen auf der Grundlage ihrer spezifischen Fluoreszenz zählt.
  • Luftbläschen, infiziert mit der SCP--Deletionsmutante enthielten zweimal so viele inflammatorische Zellen wie diejenigen, die mit SCP+-Streptokokken infiziert wurden. (4). Eine einhundertfache Erhöhung der Inokulumgröße veränderte diesen Unterschied nicht. Luftbläschen, infiziert mit 1 × 106 SCP--Zellen, Stamm MJ3-15, enthielten dreimal mehr Gr-1-positive Zellen als diejenigen, die mit einer SCP+-Kultur inokuliert waren. In Luftbläschen, inokuliert mit SCP+-Streptokokken, waren annähernd 6% der Zellen PMNs, und 21% waren andere Formen von Mac-1+-Granulozyten, einschließlich PMNs. Im Gegensatz dazu enthielten Luftbläschen, inokuliert mit SCP--Streptokokken, überwiegend PMNs. Die Anzahl von Gr-1-positiven Zellen war gleich oder größer als die Anzahl von Mac-1-positiven Zellen. Flusszytometer-Fenster wurden gesetzt, um nur stark gefärbte Granulozyten zu messen. Die verbleibenden 70-80% der Zellen, die mit keinem der Antikörper gefärbt wurden, waren wahrscheinlich entweder gering färbende Granulozyten, rote Blutzellen oder Lymphozyten. Hohe Lymphozytenzahlen wurden mikroskopisch in Wright's-gefärbten Luftbläschenpräparaten beobachtet.
  • SCP+-Kolonien von Streptokokken aus Milzhomogenaten waren stark verkapselt und ähnelten Wassertropfen. Im Gegensatz dazu waren die wenigen SCP--Kolonien aus Lymphknoten eher wie das Inokulum. Sie bestanden aus Mischungen von nicht mukoiden und moderat mukoiden Kolonien. Diese Daten legen nahe, dass verkapselte M+SCP+-Streptokokken sich innerhalb von 4 Stunden nach Infektion anpassen und vermehren können und in den Blutkreislauf eindringen können. Ursache für die Unterschiede zwischen Mutanten und Wildtyp-Streptokokken können durch den stärkeren Zustrom von phagozytischen Zellen als Antwort auf SCP--Bakterien verursacht sein. Makrophagen und/oder dendritische Hautzellen umhüllten SCP--Streptokokken mit höherer Geschwindigkeit und übertrugen diese zu den Lymphknoten. Die Verringerung der Streptokokkusmutanten relativ zum Wildtyp ist eine unerwartete Beobachtung, da SCP--Streptokokken vom Typ M+ sind und in vitro resistent sind gegen Phagozytose durch menschliche Neutrophile.
  • BEISPIEL 3
  • SCP ist für die Kolonisierung von Maus-Nasopharynx erforderlich
  • Mäuse wurden intranasal inokuliert, um die relative Befähigung von Wildtyp-(SCP+)- und SCP--Streptokokken zur Kolonisierung der Nasopharynx zu evaluieren. Der streptomycinresistente M49-Stamm CS101 und die Deletionsmutante MJ3-15 wurden in diesen Experimenten verwendet. Die Kulturen wurden nicht in Mäusen passagiert, um die Selektion von Varianten zu vermeiden, welche spezifisch mausvirulent sein könnten, aber für die Persistenz in dem Tier nicht länger vom M-Protein und/oder von SCP abhängig sind.
  • Sechzehnstündige Kulturen von Streptokokkus-Challenge-Stämmen (1 × 108 – 9 × 108 CFU), vermehrt in Todd-Hewitt-Brühe, enthaltend 20% normales Kaninchenserum, und resuspendiert in 10 μl PBS, wurden 25 g schweren weiblichen CD1-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA.) oder BALG/c-Mäusen (Sasco, Omaha, NE) intranasal verabreicht. Viabilitätszahlen wurden durch Ausplattieren von Kulturverdünnungen auf Blutagar-Platten bestimmt. Rachenabstriche wurden den anästhetisierten Mäusen täglich über einen Zeitraum von 6 bis 10 Tagen nach Inokulation entnommen und auf Blutagar-Platten, enthaltend 200 μg/ml Streptomycin, ausgestrichen. Nach einer Über-Nacht-Kultur bei 37 °C wurde die Anzahl β-hämolytischer Kulturen auf den Platten bestimmt. Sämtliche Challenge-Stämme waren durch Streptomycinresistenz markiert, um sie von β-hämolytischen Bakterien zu unterscheiden, welche in der normalen Flora resistent sein könnten. Die Rachenabstriche wurden auf Blutagar, enthaltend Streptomycin, kultiviert. Die Präsenz einer β-hämolytischen Kultur wurde als positive Kultur gewertet.
  • CD1-Outbred-Mäuse wurden mit 2 × 108 CFU aus der stationären Phase intranasal inokuliert. Die Nasopharynx anästhetisierter Mäuse wurde über einen Zeitraum von 8-10 Tagen täglich abgewischt und auf Blutagar, enthaltend Streptomycin ausgestrichen. Unterschiede zwischen SCP+ und SCP waren nach einem Tag erkennbar, statistisch signifikante Unterschiede waren jedoch bis zu den Tagen 3 und 4 nicht zu beobachten (5). Am Tag 4 produzierten 9/18 Mäusen, infiziert mit M+SCP+-Streptokokken, positive Rachenkulturen, wohingegen nur 2/18 Mäusen, infiziert dem M+SCP-Stamm, Streptokokken in ihrem Rachen enthielten. Vier der 18 Mäuse starben in Folge der Infektion mit SCP+-Streptokokken. Keine der Mäuse, infiziert mit SCP--Bakterien erlag der Infektion. Die Anzahl der Kolonien auf den Blutagar-Platten war ebenfalls konsistent mit dem rascheren Clearance von SCP--Streptokokken. So enthielten beispielsweise am dritten Tag die Kulturen von sieben Mäusen > 100 SCP+ CFU, wohingegen nur eine Maus, inokuliert mit SCP--Streptokokken, > 100 CFU enthielt.
  • Da M49-Streptokokken häufiger mit Hautinfektionen assoziiert sind, wurden die obigen Experimente mit einem M6-Stamm wiederholt, einem Serotyp, der häufiger mit Racheninfektionen assoziiert ist. Eine Insertionsmutante, Stamm AK1.4, wurde unter Verwendung des M6-Stammes UAB200 und der bereits in Beispiel 1 beschriebenen Strategie hergestellt. Der Stamm AK1.4 wurde ebenfalls rascher als die Wildtyp-M6-Kultur aus der Nasopharynx entfernt (6). Die obigen Experimente bestätigen, dass Streptokokken der Gruppe A für eine Persistenz in Mausnasopharynx von SCP abhängig sind. Sämtliche SCP-Varianten, die in den obigen Experimenten verwendet wurden, waren M+, d. h. sie widerstanden einer Phagozytose durch frisches Humanblut. Sie wurden jedoch von der Nasopharyngealmukosa entfernt.
  • BEISPIEL 4
  • Intranasale Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem rekombinantem SCPA49 blockiert eine Kolonisierung nach intranasalem Challenge
  • a) Konstruktion eines rekombinanten Vakzins ΔSCPA49, kodierend Thr63 bis His1031 (2 und 7)
  • Ein PCR-Fragment, welches einer verkürzten Form des scpA49-Gens entsprach, wurde aus CS101-M49-Streptokokken, Gruppe A (ΔSCPA49), kloniert. Dieses Fragment wurde durch PCR amplifiziert, wobei ein Vorwärts-Primer, beginnend bei Nukleotid 1033 und ein Rückwärts-Primer, beginnend bei Nukleotid 3941 (Nummerierung entsprechend Chen, C., und Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," L. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)) verwendet wurde. Das Fragment wurde an die Thrombin-Bindungsstelle des Glutathiontransferase-Gens auf dem pGes-4T-1-Hochexpressionsvektor von Pharmacia Inc. ligiert. Das Plasmid, enthaltend das rekombinante scpA-Fragment mit der Bezeichnung pJC6, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, gemäß Budapester Vertrag unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 98225 hinterlegt.
  • Das ΔSCPA49, ein 2908 bp großes Fragment von scpA49, wurde durch PCR unter Verwendung eines scpA49-Vorwärts-Primers, enthaltend eine BamHI-Erkennungssequenz (5'-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3') (SEQ ID NO: 8) und einen scpA-Rückwärts-Primer (5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3') (SEQ ID NO: 9) amplifiziert. Sequenzen, welche für ein Signalpeptid kodieren, und Membrananker-Regionen des SCPA-Proteins wurden aus dem resultierenden PCR-Produkt deletiert. Die PCR-Produkte wurden mit BamHI verdaut und mit den BamHI- und SmaI-Restriktionsschnittstellen in der Thrombin-Erkennungssequenz des Glutathion-S-Transferase-Gens auf dem pGEX-4T-1-Hochexpressionvektor von Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde in E. coli-DH5α transformiert. Das ΔSCPA49-Fusionsprotein aus einem Transformanten, E. coli (pJC6), wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Glutathion-Sepharose-4B-Säule gereinigt. Das Transferase-SCP-Fusionsprotein aus einem E. coli-Klon wurde exprimiert und durch Affinitätschromatographie auf einer Glutathion-Sepharose-4B-Säule gereinigt. Sämtliche Verfahren werden vom Hersteller (Pharmacia) beschrieben. ΔSCPA49 wurde durch Thrombinverdau aus dem Hybridprotein herausgeschnitten. Das Thrombin wurde von eluiertem SCP durch Chromatographie über eine Benzamidin-Sepharose-6B-Säule (Pharmacia) abgetrennt. Im Anschluss an den Verdau mit Thrombin wurde das Thrombin durch Chromatographie über eine Benzamidin-Sepharose-6B-Säule entfernt. Die Verfahren zur Expression und Reinigung werden vom Hersteller beschrieben. Durch SDS-PAGE und durch Western Blotting wurde bestätigt, dass das affinitätsgereinigte Protein reines ΔSCPA49 war. Diesem affinitätsgereinigten, verkürzten ΔSCPA49-Protein fehlte die Peptidaseaktivität, wie durch den PMN-Adhärenz-Assay (beschrieben in obigem Beispiel 1) festgestellt wurde. Hyperimmun-Antiserum gegen gereinigtes ΔSCPA49 wurde in Kaninchen hergestellt.
  • b) Immunisierung und Challenge-Protokoll.
  • Vier Wochen alte, weibliche CD1-Outbred-Mäuse wurden durch Verabreichung von 20 μg affinitätsgereinigtem ΔSCPA49 in 10 μl PBS in jedes Nasenloch immunisiert. Die Mäuse wurden dreimal an alternierenden Tagen immunisiert und drei Wochen nach der dritten Immunisierung geboostet. Nach zweiwöchiger Pause erhielten die Mäuse eine weitere Boosterimpfung. D. Bessen et al., "Influence of intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein an Mucosal Colonization by Group A Streptococci", Infect. Immun., 56, Seiten 2666-2672 (1988). Kontrollmäuse erhielten nur PBS. Mit Hilfe von ELISA wurde festgestellt, dass vor der Infektion sämtliche Mäuse, welche mit dem ΔSCPA49-Protein infiziert waren, einen höheren Titer von Antikörpern gegen das ΔSCPA49-Antigen in ihrem Serum und Speichel enthielten. Streptokokken der Gruppe A, Stamm CS101 (2,0 × 108 CFU), CS210 (3,6 × 108 CFU), CS463 (7,8 × 108 CFU), 90-131 (3,4 × 108 CFU), und UAB200 (9,6 × 108 CFU) wurden als intranasaler Challenge bei den Mäusen 7 Tage nach dem letzten Vakzin-Booster verwendet. Tierversuche wurden nach den Richtlinien des National Institutes of Health durchgeführt.
  • c) Probensammlung und ELISA.
  • Blut- und Speichelproben wurden den anästhetisierten Mäusen nach der Immunisierung entnommen. Sämtliche Seren wurden auf das Vorliegen von ΔSCPA49-Antikörpern mit Hilfe eines ELISA, wie bereits früher von S. P. O'Connor et al., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis., 163, Seiten 109-116, (1990) beschrieben, bestimmt. Gereinigtes SCPA49-Protein wurde an Mikrotiter-Vertiefungen durch Zugabe von 500 ng gereinigtem Protein in 0,05 M Bicarbonatpuffer (pH 9,6) gebunden. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Vertiefungen gewaschen, anschließend 1 Stunde mit 0,5 BSA in PBS blockiert. Der Speichelfluss wurde in Mäusen durch subkutane Injektion von 100 μl einer Pilocarpin (Sigma)-Lösung stimuliert. Speichelproben wurden gesammelt und bei 14.000 Upm 5 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden auf das Vorliegen sekretorischer IgA-Antikörper gegen das ΔSCPA49-Protein mit Hilfe eines ELISA getestet. Die ELISA-Titer mit den höchsten Verdünnungen einzelner Serum- und Speichelproben zeigten einen OD405-Wert z 0,1.
  • d) Evaluierung der Antikörperantwort auf ΔSCPA49.
  • Die Immunogenität des ΔSCPA49-Subunit-Vakzins wurde evaluiert. Kaninchen wurden mit gereinigtem ΔSCPA49 immunisiert. Die Kaninchen entwickelten hohe Antikörperspiegel gegen das ΔSCPA49-Protein, wie durch ELISA festzustellen war. Obwohl das gereinigte ΔSCPA49-Immunogen keine funktionale Aktivität aufwies, konnten Kaninchen-Hyperimmun-Antiseren die Peptidaseaktivität von gereinigtem Wildtyp-ΔSCPA49-Enzym in vitro neutralisieren. Darüber hinaus konnte unverdünntes Kaninchen-Antiserum gegen ΔSCPA49 die C5a-Peptidaseaktivität, assoziiert mit verschiedenen Serotypen, neutralisieren (8). Die C5a-Peptidaseaktivität, assoziiert mit intakten Streptokokken M1, M6 und M12, wurde durch dieses Antiserum inhibiert, was bestätigt, dass der Antikörper gegen ΔSCPA49-Protein keine Serotypspezifität besitzt.
  • Außerdem wurden Serum- und Speichelproben von zehn immunisierten und zehn Kontrollmäusen erhalten, um die Immunogenität des ΔSCPA49-Proteins bei Verabreichung über den intranasalen Weg ohne Adjuvans zu bestimmen. Mäuse, welche mit gereinigtem ΔSCPA49-Protein immunisiert worden waren, entwickelten höhere Titer an ΔSCPA49-spezifischem IgG in ihren Seren im Vergleich zu Kontrollmäusen, immunisiert mit PBS (9). Titer von Serum-IgG gegen ΔSCPA49 reichten von 1:10.240 bis 1:20.480. Im Gegensatz dazu waren keine ΔSCPA49-spezifischen IgG-Titer von Kontrollmäusen in Seren nachweisbar. Mäuse, immunisiert mit gereinigtem ΔSCPA49-Protein, zeigten außerdem eine signifikante Zunahme von ΔSCPA49-spezifischem Speichel-slgA im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Spezifische slgA-Titer im Speichel immunisierter Mäuse waren größer als 1:16. Im Gegensatz dazu war im Speichel von Kontrollmäusen slgA gegen ΔSCPA49 nicht nachweisbar. Die relative Konzentration von IgG und slgA, in Serum 1/2560 verdünnt und Speichel 1/2 verdünnt, ist in 9 gezeigt. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass gereinigtes ΔSCPA49-Protein ein wirksames Immunogen für die Induktion einer spezifischen systemischen und sekretorischen Antikörperantwort in Mäusen bei intranasaler Verabreichung darstellt.
  • e) Einfluss des ΔSCPA49-Vakzins auf das Clearance von Streptokokken in infizierten Mäusen.
  • Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Immunisierung mit der C5a-Peptidase das Clearance der Streptokokken aus dem Nasopharynx verstärkt. Sowohl Hyperimmun-Seren von Kaninchen und Menschen, die hohe Spiegel an Anti-SCPA-Antikörpern enthalten, können die SCPA-Aktivität in vitro neutralisieren. S. P. O'Connor et al., The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis., 163, Seiten 109-116 (1990). Die Tatsache, dass SCPA die Kolonisierung der oralen Mukosa signifikant erleichtert, weist darauf hin, dass die Immunisierung von Mäusen mit gereingtem ΔSCPA49 die Fähigkeit von Streptokokken zur Kolonisierung des Nasopahrynx verringern könnte. Die Mäuse wurden intranasal mit affinitätsgereinigtem, genetisch inaktiviertem SCPA immunisiert, um diese Möglichkeit zu testen. Das verkürzte Protein, ΔSCPA49, wurde intranasal ohne Adjuvans oder Carrier verabreicht. Die Pharyngealkolonisierung von vakzinierten Mäusen durch M+SCPA+-Wildtyp-Streptokokken unterschied sich signifikant von denjenigen, immunisiert mit PBS in drei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von Mäusen, vakziniert mit zwei verschiedenen Präparaten von gereinigtem ΔSCPA49-Protein (Tabellen 3 und 4; 10). Nur eine von 13 Mäusen, immunisiert mit dem ΔSCPA49-Protein, zeigte eine positive Streptokokkenkultur, zehn Tage nach der Inokulation (Tabelle 4; 10). Im Gegensatz dazu waren 30-58% der nicht vakzinierten Kontrollen über einen Zeitraum von sechs Tagen kulturpositiv, und einzelne waren noch immer zehn Tage nach Infektion positiv. Die Anzahl der β-hämolytischen, streptomycinresistenten Kolonien auf Blutagar-Platten zeigte auch eine signifikante Differenz zwischen ΔSCPA49-vakzinierten und Kontrollmäusen. Verschiedene Gruppen immunisierter Mäuse beseitigten Streptokokken vom Serotyp M49 mit signifikant höherer Geschwindigkeit aus dem Nasopharynx als nicht immunisierte Kontrollmäuse. Tabelle 3: Rachenkulturen von Streptokokken nach intranasalem Challenge von Mäusen, intranasal vakziniert mit PBS oder SCP, exprimiert in E. coli-DH5α (CFU nach Vakzin)
    Tage nach Challenge
    Mäuse* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    PBSCT-I
    1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    3 77 >200 150 4 11 3 0 51 97 53
    4 9 >200 >200 3 11 3 0 0 0 0
    5 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0
    6 4 6 45 47 3 >200 29 >200 83 70
    7 15 >200 120 125 91 145 >200 >200 >200 166
    8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    9 0 32 4 4 0 0 0 0 0 0
    10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    11 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    13 127 4 0 0 0 0 0 0 0 0
    Anzahl Positive 8 6 5 5 4 4 2 3 2 2
    SCPAD-1
    1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    5 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    6 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    8 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    11 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0
    12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    Anzahl Positive 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
    Tabelle 4: Rachenkulturen von Streptokokken nach intranasalem Challenge von Mäusen, intranasal vakziniert mit PBS oder SCP, exprimiert in E. coli-DH5α (CFU nach Vakzin)
    Tage nach Challenge
    Mäuse* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    PBSCT-I
    1 112 143 85 16 0 0 0 0 0 0
    2 127 27 18 89 3 7 7 7 70 3
    3 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 108 >200 66
    4 31 200 4 2 0 0 0 0 0 0
    5 4 0 0 3 3 0 0 0 0 0
    6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    7 >200 >200 120 125 91 145 >200 >200 >200 166
    8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    11 37 >200 194 16 >200 47 >200 101 >200 >200
    Anzahl Positive 8 6 6 5 4 4 4 4 4
    SCPAD-1
    1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    2 105 41 0 0 0 0 0 0 0 0
    3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    6 9 0 11 0 0 0 0 0 0 0
    7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    8 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    9 0 19 0 0 5 57 0 0 21 91
    10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    11 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    Anzahl Positive 7 2 1 0 1 1 0 0 1 1
    • * Mäuse wurden zweimal inokuliert, da die Bakteriendosis bei der ersten Inokulation zu gering war.
  • Schließlich wurde untersucht, ob man durch Impfung mit einem Serotyp von SCP Tiere gegen Infektion durch andere Serotypen impfen kann. Es gibt mehr als 80 verschiedene Serotypen von Streptokokken der Gruppe A. Ein wirksames Vakzin sollte eine Infektion von mehr als einem Streptokokkus-Serotyp verhindern. Eine Kreuzschutzwirkung wurde gegen die Kolonisierung durch die Streptokokkus OF+-Serotypen M2 und M11 und die OF--Serotypen M1 und M6 erzielt. Die Tatsache, dass Kaninchenserum gegen ΔSCPA49-Protein aus Streptokokken von Serotyp M49 Peptidaseaktivität, assoziiert mit verschiedenen Serotypen, neutralisiert, weist darauf hin, dass die intranasale Immunisierung mit einem einzelnen Subunit-Vakzin die Pharyngealkolonisierung durch diese Serotypen reduzieren oder eliminieren könnte. Um diese Möglichkeit auszuloten, wurden vier Gruppen von zwanzig Mäusen durch intranasale Inokulation mit affinitätsgereinigtem ΔSCPA49-Protein wie oben beschrieben immunisiert. Kontrollmäuse erhielten PBS. Vor einem Challenge mit Streptokokken wurden Serum- und Speichelproben von zufällig ausgewählten immunisierten und Kontrollmäusen auf Anti-SCPA-Antikörper untersucht. Alle getesteten immunisierten Mäuse entwickelten eine starke Serum- und eine messbare Spei chel-Antikörperantwort. Die Pharyngealkolonisierung von Mäusen, immunisiert mit dem ΔSCPA49-Protein durch Stämme aller vier Serotypen, wurde relativ zu den nicht immunisierten Kontrollmäusen verringert. Die Unterschiede waren an den Tagen 3 und 5 nach der Inokulation am signifikantesten (Tabelle 5). Tabelle 5. Der immunulogische Schutz ist serotypunabhängig
    Tag 3 nach Inokulation Tag 5 nach Inokulation
    Nicht immun Immun Nicht immun Immun
    (+/total) % (+/total) % (+/total)% % (+/total) %
    M2 10/19 52,6 2/19* 10,5 3/19 15,8 1/19 5,2
    M11 17/20 85 11/20* 55 8/20 40 2/20* 10
    M1 16/19 84,2 11/19 57,9 7/19 37 2/19* 10,5
    M6 14/20 70 12/19 63,2 8/20 40 4/19 21,1
    • + Mittelwerte kulturpositiver Mäuse.
    • * Unterschiede zwischen immunisierten und nicht immunisierten Mäusen sind statistisch signifikant (P < 0,05). P-Werte wurden durch x2-Analyse berechnet.
  • Statistisch signifikante Unterschiede wurden zwischen immunisierten und Kontrollmäusen, inokuliert mit den Serotyp-M2-, -M11 und -M1-Stämmen, beobachtet. Die OF+-Serotypen M2 und M11 wurden jedoch durch die immunisierten Mäuse wirksamer eliminiert als die OF--Stämme M1 und M6. Die Kolonisierung durch Streptokokkus M1 von immunisierten Mäusen wurde relativ zu den Kontrollmäusen signifikant reduziert. Nur 10,5% der immunisierten Mäuse waren kulturpositiv am Tag 5 nach der Infektion. Im Gegensatz dazu waren 37% der Kontrollmäuse kulturpositiv mit diesem Stamm. Obwohl die immunisierten Mäuse M6-Streptokokken rascher zu beseitigen schienen, waren die Unterschiede nicht statistisch signifikant. Wie in früheren Experimenten, war die Anzahl von β-hämolytischen Streptokokkuskolonien auf Blutagar- Platten signifikant geringer in Proben, welche von vakzinierten Mäusen genommen wurden, im Vergleich zu solchen, die von Kontrollmäusen genommen wurden. Somit stellt das ΔSCPA49-Protein ein wirksames Vakzin dar, das eine Kreuzschutzwirkung gegen andere Streptokokkus-Serotypen hervorruft.
  • BEISPIEL 5
  • Ortsspezifische Mutagenese von SCPA49
  • Serotypen von Streptokokken der Gruppe A können in zwei Hauptgruppen, nämlich die OF+- und die OF--Stämme eingeteilt werden. Letztere sind häufiger mit rheumatischem Fieber und toxischem Schock assoziiert, wohingegen die OF+-Stämme eine allgemeine Ursache für Impetigo und akute Glomerulonephritis darstellen. Obwohl die SCPA-Proteine dieser beiden Gruppen zu 95-98% identisch sind, besteht die Möglichkeit, dass deren Immunantwort etwas unterschiedlich ist. Diese Bedenken veranlassten die Entwicklung definierter Varianten von SCPA aus einem M1 OF--Stamm und einem M49 OF+-Stamm in parallelen Experimenten. Die für die katalytische Aktivität erforderlichen Aminosäuren wurden durch solche ersetzt, von denen man eine Enzyminaktivierung erwartete (1). Die N- und C-terminalen Aminosäuregrenzen von SCPA49, exprimiert von pGEX-4T-1-Subklonen, waren Asn32 bzw. His1139 (1 und 8). Ser512 (SCPA49S512A), Asn295 (SCPA49N295A) und Asp130 (SCPA49D130A) im SCPA49-Protein wurden durch Ala ersetzt, und Asn295 (SCPA49N295R) wurde durch Arg ersetzt (Deborah Stafslien, M. S. Thesis, University of Minnesota).
  • Die zur Einführung von Mutanten in das scpA49-Gen aus dem Streptokokkusstamm CS101 verwendete Methode war die „Megaprimer"-Methode der ortsspezifischen Mutagenese. Bank, S., "Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR", In: Methods in Molecular Biology, Band 57: In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996). Die Serinmutation wurde eingeführt unter Verwendung der Primer scpFor940 (5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC-3'), SEQ ID NO: 10, und scpmutrev1883 (5'-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3'), SEQ ID NO: 11, um ein doppelsträngiges 1450 bp-PCR-Produkt zu amplifizieren. Diese erste PCR-Produkt, ein "Megaprimer", wurde unter Verwendung des Qiagen-Qiaquick-Gel-Extraction-Kits gereinigt und anschließend in einer zweiten, asymmetrischen PCR-Reaktion verwendet, um das 3,3 kb-scpA49-Gen, das die gewünschte Mutation enthielt, zu amplifizieren. Fünf Zyklen von Denaturierung (93 °C, 1 min) und Extension (72 °C, 5 min) wurden durchgeführt, bevor der Rückwärts-Primer scpRev4263, (3'-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3'), SEQ ID NO: 12, zugesetzt wurde. Während des fünften Zyklus bei 72 °C wurde der Rückwärts-Primer in einer Konzentration von 1 mM zugesetzt. Die Amplifikation wurde unter Verwendung von 25 Zyklen bei 94 °C, 1 min; 58 °C, 2 min und 72 °C, 2-3,5 Minuten komplettiert. Die Konzentration der Reaktanden war die gleiche wie im vorausgegangenen Abschnitt beschrieben, mit Ausnahme davon, dass der Vorwärts-Primer nicht zugesetzt wurde, und der Megaprimer in einer Konzentration von 4-6 μg pro 100 μl Reaktionsansatz zugesetzt wurde. Dieses Verfahren ergab die Proteinvariante SCPA49S512A (siehe folgende Tabelle 6).
  • Die Aspartat- und Asparaginvarianten wurden im Wesentlichen in gleicher Weise hergestellt, wobei die Rückwärts-Primer scpmutrev717 (5'-CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA-3') SEQ ID NO: 13 und scpmutrev1214 (5'-AGCTACTATCAGCACCAG-3') SEQ ID NO: 14 verwendet wurden, um 311 bp bzw. 805 bp Megaprimer zu konstruieren. Der Primer scpmutrev717 wurde verwendet, um die Proteinvariante SCPA49D130A zu erzeugen, und der Primer scpmutrev1214 wurde verwendet, um die Proteinvariante SCPA49N295A zu erzeugen (vgl. Tabelle 6 unten). Nach Qiaquick-Reinigung wurde jedoch der Megaprimer mit 0,1 U Mungbohnen-Nuklease (je 4 μg DNA) behandelt und 10 Minuten bei 30 °C inkubiert. Die Nuklease wurde durch Phenol-/Chloroformextraktion entfernt und der Megaprimer in einer wässrigen Phase durch Ethanolpräzipitation isoliert. Das Pellet wurde in 80 μl sterilem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert und 37 μl davon wurden in jedem 100 μl-Ansatz der asymmetrischen PCR-Reaktion eingesetzt. Das mutierte Gen wurde anschließend in pGEX 4T-1 wie oben beschrieben einkloniert. Die Sequenzierung der Varianten wurde unter Verwendung von 35S-markiertem dATP und des Sequenase-Kits (Stratagene) oder unter Verwendung einer automatischen Fluoreszenzsequenzierung an der University of Minnesota Microchemical Facility durchgeführt.
  • Tabelle 6: Vergleich der Aminosäuresequenz von Proteinvarianten
    Figure 00320001
  • Der E. coli-Expressionsvektor pGEX 4T-1 wurde verwendet, um die SCPA-Varianten als GST-Fusionsproteine zu überexprimieren. Rekombinantes SCPA wurde gemäß dem vor dieser Arbeit im GST Gene Fusion System Handbook (Pharmacia) beschriebenen Protokoll gereinigt. Das SCPA-Proteinantigen wurde wie oben beschrieben durch Affinitätschromatographie gereinigt.
  • BEISPIEL 6
  • Konstruktion von SCPA1- und SCPB-Varianten
  • Das Wildtyp-scpA1-Gen wurde durch PCR aus dem Serotyp M1 von S. pyogenes (Stamm 90-226) in folgender Weise amplifiziert. Primer wurden in der Weise entworfen, dass nur ein Fragment des vollständigen Gens exprimiert wird. Dieses Fragment entspricht dem Start des reifen Proteins und endet unmittelbar vor der zellwandassoziierten Domäne Rest Asn32 bis Asp1038 (2). Der Vorwärts-Primer 5'-CCCCCCGAATTCATTACTGTGACAGAAGACACTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 15) verbindet sich beginnend bei Base Nummer 940 (Nummerierung entsprechend Chen, C. und Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990). Der entgegengesetzte reverse PCR-Primer 5'-CCCCCCGGATCCTTATTGTTCTGGTTTATTAGAGTGGCC-3 (SEQ ID NO: 16) verbindet sich bei Base 3954 stromaufwärts einer Region von DNA-Repeats. Von dieser Repeatregion des Proteins vermutet man, dass es durch die Zellwand hindurch reicht und sich anschließend an das Peptidoglykan der Zellwand anlagert. Der kursiv geschriebene Abschnitt jedes Primers stellt eine zusätzliche Sequenz dar, welche an die S. pyogenes-Sequenz addiert wurde, um den Klonierungsprozess zu ermöglichen. Der unterstrichene Abschnitt des Vorwärts-Primers umfasst eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle und der unterstrichene Abschnitt des reversen Primers umfasst eine BamHI-Schnittstelle. Der reverse Primer umfasst einen die Translation terminierenden Stoppkodon (TAA) im Leserahmen mit dem Gen.
  • Das resultierende PCR-Produkt entspricht den Basen 940-3954 und wurde in einen Zwischenvektor pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) kloniert und in E. coli-Top10E-Zellen (Invitrogen, Inc.) transformiert. Die Plasmid-DNA aus einem geeigneten Transformanten wird mit EcoRI und BamHI verdaut. Das 3018 Basen lange Fragment, enthaltend das Fragment von scpA1 wurde unter Anwendung von Standardverfahren gelgereinigt und in den Expressionsvektor pTrc99a (Pharmacia), geschnitten mit den gleichen Enzymen, ligiert. Diese Ligation wurde in E. coli- DH5a-Zellen transformiert und ein Transformant, der das gewünschte Plasmidkonstrukt enthielt, wurde selektiert. Das resultierende Plasmid platziert das PCR-Fragment von scpA1 hinter eine Shine-Dalgarno-Sequenz und das ATG-Startkodon. Es steht außerdem unter der transkriptionalen Kontrolle des trc-Promotors, der durch das Allolaktose-Analogon IPTG induzierbar ist.
  • Ortsspezifische genetische Varianten von Wildtyp-scpA1 wurden unter Befolgung des von C. L. Fisher and G. K. Pei, "Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method", BioTechnigues, 23:570-574 (1997), beschriebenen Verfahrens konstruiert. Die geeigneten Aminosäurereste innerhalb von SCPA1, von Bedeutung für die Proteaseaktivität, wurden durch Sequenzvergleiche mit der Familie von subtilisinähnlichen Serinproteasen abgeleitet. Siezen, R. J., et al., "Homology modeling and Protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases", Protein Engineering, 4:719-737 (1991); Chen, C. und Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Drei innerhalb dieser Familie konservierte Reste sind an der Bildung des Aktivitätszentrums beteiligt. In SCPA1 entsprechen diese Reste Asp130, His193, und Ser512. Drei Sätze von nicht überlappenden Oligonukleotiden wurden zur Verwendung in der PCR entworfen, um jeden dieser drei Aminosäurereste zu verändern. Diese Oligonukleotide wurden so entworfen, dass sie voneinander weggerichtet auf gegenüber liegenden Strängen der DNA amplifizieren. In jedem Satz enthält das 5'-Ende eines der Primer das für eines dieser zu mutierenden Aminosäuren kodierende Kodon, und dieses Kodon wird so geändert, dass es für ein Alanin kodiert. Diese drei Sätze von Primern sind im Folgenden aufgeführt. Die für die Veränderung verantwortlichen Kodons sind kursiv dargestellt.
  • D130A:
    • Vorwärts (SEQ ID NO: 17)
    • 5'-ATT GCT GCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG-3'
    • Änderung des GAT-Kodons zu GCT entspricht einer Aminosäure-Änderung von Asparagin zu Alanin.
    • Rückwärts (SEQ ID NO: 18)
    • 5'-CAC TGC AAC AAC AGT CCC-3'
  • H193A:
    • Vorwärts (SEQ ID NO: 19)
    • 5'-GAG GCC GGC ACA CAC GTG-3'
    • Eine Veränderung des CAC-Kodons in GCC entspricht einer Aminosäure-Änderung von Histidin zu Alanin.
    • Rückwärts (SEQ ID NO: 20)
    • 5'-TTG ATC GAC AGC GGT TTT ACC-3'
  • S512A:
    • Vorwärts (SEQ ID NO: 21)
    • 5'-ACT GCT ATG TCT GCT CCA TTA G-3'
    • Eine Veränderung des Kodons ACT zu GCT entspricht einer Aminosäure-Änderung von Serin zu Alanin.
    • Rückwärts (SEQ ID NO: 22)
    • 5'-TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C-3'
  • Diese drei Gruppen von PCR-Primern wurden in drei getrennten Reaktionen verwendet. Als Template-DNA wurde pLP605 verwendet, die die Wildtyp-scpA1-Sequenz enthielt. Die PCR-Produkte wurden anschließend untereinander ligiert und in den E. coli-Stamm Top10F' (Invitrogen, Inc.) transformiert. Die Transformanten wurden auf geeignete Größe und Restriktionsmuster gescrennt. Die Sequenzänderung in der S512A-Variante zerstört eine spezifische SpeI-Restriktionsschnittstelle, so dass diese Mutante direkt durch Restriktionsanalyse identifiziert werden konnte. Alle potenziellen Varianten wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft. Anschließend wurde die D130A-Mutation mit der S512A-Mutation kombiniert, um eine Doppelvariante zu erzeugen. Hierzu wurde eine spezifische PstI-Schnittstelle zwischen diesen beiden Regionen des Proteins verwendet. Die abschließende Änderung diente einem Wechsel der Antibiotikaselektion von Ampicillin zu Kanamycin durch Übertragung des scpA1-Variantengens in einen zuvor geänderten pTRC99a-Vektor (Pharmacia, Inc.), enthaltend das Kanamycingen.
  • Eine Variante des SCPB-Proteins wurde unter Verwendung des oben für die SCPA1-Mutanten beschriebenen Verfahrens konstruiert. Das Wildtyp-SCPB-Gen wurde aus dem Gruppe-B-Streptokokkus 78-471 (Typ Ila+) kloniert.
  • BEISPIEL 7
  • Analyse von Proteinvarianten
  • Die von jedem der Variantenkonstrukte exprimierten Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die erwartete Proteingröße beträgt 121 kD, wobei jedoch die prolinreiche Zellwand-überspannende Domäne am carboxyterminalen Ende des Enzyms eine etwas langsamere Wanderungsgeschwindigkeit des Proteins durch das SDS-PAGE verursacht. Daher wurde ein scheinbares Molekulargewicht von 130 kD durch SDS-PAGE bestimmt. Da aktives SCP für den Wirt schädlich sein könnte, war es wichtig, dass den Proteinvarianten die Enzymaktivität fehlte. Zwei Eigenschaften der Proteinvarianten wurden evaluiert. Die spezifischen Aktivitäten von Wildtyp- und Proteinvarianten, bestimmt durch den PMN-Adhärenz-Assay, werden in Tabelle 7 verglichen. Diese Experimente zeigten, dass die substituierten Aminosäuren die enzymatische Aktivität um mehr als 90% verringerten. Tabelle 7: Bestimmung der Aktivität von Proteasevarianten im PMN-Adhärenz-Test
    Protein Aktivität (U/mg*10-3)
    Wildtyp 170
    SCPA49D130A <20
    SCPA49N295A <20
    SCPA49S512A <20
  • Die Proteinvarianten wurden außerdem mit dem Wildtyp-Protein in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Bindung von Antikörpern gegen das Wildtyp-Enzym verglichen. Kompetitive ELISA-Assays wurden zu diesem Zweck durchgeführt. Durch diese kompetitiven ELISAs wurde die Inhibition der Antikörperbindung an immobilisiertes Antigen durch lösliches Antigen gemessen. Eine konstante Menge von Wildtyp-Antigen wurde an die Vertiefungen von Mikrotiter-Platten gebunden. Eine konstante Menge Antikörper wird zur gleichen Zeit mit unterschiedlichen Mengen an löslichem kompetitivem Antigen zugesetzt. Die Steigung der Kurve aus der Auftragung der prozentualen Inhibition in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration erlaubt die Abschätzung der relativen Bindungsaffinität des löslichen Antigens für Antikörper. Während die Bindungskonstanten ohne Kenntnis über die genaue Konzentration an Anti-SCPA im Antiserum nicht bestimmt werden können, können die relativen Bindungsaffinitäten mehrerer Proteine verglichen werden (11). Da die Steigungen der Kurven aus der Auftragung der prozentualen Inhibition in Abhängigkeit von der Konzentration für Wildtyp- und Proteinvarianten identisch sind, wurde gefolgert, dass die Aminosäuresubstitution die Fähigkeit des Antikörpers, an die Proteinvarianten zu binden, nicht verändert.
  • Für die rekombinanten Proteine SCPA1, SCPa49 und SCPB wurde außerdem bestimmt, dass sie gleich gut an Anti-SCP-Antikörper binden (12). In diesem Experiment wurde als Platten-Antigen SCPA49 und als Antikörper der Kaninchen-Anti-SCPA49-Antikörper verwendet. Die relativen Affinitäten dieses Antikörpers für diese Antigene, veranschaulicht durch die Steigung der Kurven, sind stark ähnlich. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass SCPA-Proteine aus M49 OF+- und M1 OF--Streptokokken der Gruppe A und aus Streptokokken der Gruppe B äquivalent sind in Bezug auf Antikörpererkennung und gegeneinander austauschbar für die Vakzinherstellung einsetzbar sind.
  • BEISPIEL 8
  • Subkutane (SQ) Verabreichung von SCPA-Antigen induziert Schutz bei Mäusen
  • Alle früheren Schutzversuche wurden auf der Grundlage einer intranasalen Verabreichung von affinitätsgereinigtem SCPA49-Protein ohne Adjuvans durchgeführt. Die intramuskuläre oder SQ-Injektion von Antigenen ist jedoch historisch gesehen eine bevorzugte, stärker akzeptierte Methode zur Vakzinverabreichung. Deshalb wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob SQ-Injektionen von SCPA mit MLP/Alum eine protektive Immunantwort induzieren, und ob diese Antwort die Kolonisierung verringert, wenn der Challenge-Stamm ein Streptokokkus der Gruppe A mit einem Serotyp ist, der sich von demjenigen der Quelle für das SCPA-Vakzin unterscheidet. Die Befähigung von immunisierten Mäusen Streptokokken aus dem Bereich der oralen-nasalen Pharyngealmukosa zu entfernen, wurde durch Rachenkulturen oder durch Probenahme von entnommenem Nasengewebe evaluiert. Repräsentative Rachenkulturdaten sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8: Subkutane Vakzinierung von Mäusen
    Vakzina Challenge-Bakteriumb Prozentuale Kolonisierungc
    Kontrollmäuse SCPA-immunisierte Mäuse
    SCPA49S512A OF+M49 64% (3) 36%
    ΔSCPA49 OF+M49 64% (3) 20%
    ΔSCPA49 OF-M1 33% (S) 8%
    SCPA1S512A OF-M49 23% (5) 8%
    • a Die Vakzine enthielten 10 μg des angegebenen Antigens im Gemisch mit den Adjuvanzien MPL und Alum. Die Versuchsgruppen umfassten jeweils 13-20 Mäuse. Kontrollmäuse wurden mit Tetanustoxoid, gemischt mit dem gleichen Adjuvans immunisiert.
    • b Mäuse wurden durch intranasale Inokulation infiziert.
    • c Die Kolonisierung wurde an Hand von Rachenkulturen bestimmt. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben den Tag der Entnahme der Kulturen wieder.
  • Mäuse, die durch SQ-Injektion mit jedem der drei verschiedenen Formen des SCPA-Antigens immunisiert wurden, entwickelten moderate Schutzwirkung. Die Immunisierung mit ΔSCPA49 schützte sowohl gegen den M1 OF-- als auch gegen den M1 OF+-Stamm. SCPA49S512A und SCPA1 S512A wurden für die folgende Untersuchung ausgewählt.
  • Die Persistenz von Streptokokken nach intranasalem Challenge wurde auch an Hand eines quantitativeren Tests bestimmt. Dieses Verfahren beinhaltete die Tötung von Gruppen von Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion sowie die Entnahme von Nasalgewebe (NT), welches dann auf lebensfähige Streptokokken (CFU) untersucht wurde. Standardmengen von NT wurden in Puffer homogenisiert und die Anzahl von CFU/mg Gewebe wurde durch Viabilitätszählung bestimmt.
  • Drei Gruppen von Mäusen wurden SQ mit SCPA49S512A, SCPA1 S512A oder Tetanustoxoid immunisiert. Sämtliche Vakzine wurden mit MLP-/Alum-Adjuvanzien wie vorher gemischt. Die Mäuse erhielten vier Injektionen von 5 μg Protein-Antigen und wurden anschließend zwei Wochen nach der letzten Injektion infiziert. Nasalgewebe wurde 16 Stunden nach dem Challenge mit dem OF+-M49-Stamm CS101 entnommen. Die geometrischen Mittelwerte von CFU/mg Gewebe sind in Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9: Geometrische Mittelwerte für CFU/mg Nasalgewebe
    Vakzinantigen 16 Stundena
    Tetanus 5.71b
    SCPA49S512A 2.27
    SCPA1S512A 1.60
    • a Zeitpunkt der Entnahme von NT nach intranasaler Infektion der Mäuse.
    • b Werte sind log-Werte.
  • Die Anzahl von Streptokokken, assoziiert mit Nasalgewebe, nahm wie erwartet mit zunehmender Zeit ab und die Abnahme erfolgte rascher und vollständig in Mäusen, die mit SCPA-Antigen immunisiert waren. Sämtliche Mäusegruppen, die mit SCPA immunisiert waren, enthielten weniger Streptokokken als die Kontrollmäuse. In diesem Experiment war die Immunisierung mit SCPA1 S512A am effektivsten und induzierte eine kreuzschützende Antwort, da der Challenge-Stamm CS101 OF+ M49 ist und die Quelle des Vakzinproteins SCPA1S512A aus einem OF- M1-Stamm stammt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass ein einzelnes SCP-Antigen einen Schutz gegen heterologe Serotypen induzieren kann. Der Schutz wird durch Antikörper verliehen, welche die Peptidaseaktivität auf der bakteriellen Oberfläche neutralisieren. Dies erhöht den Zustrom von Phagozyten innerhalb weniger Stunden nach dem Zeitpunkt, zu dem Streptokokken auf dem Mukosagewebe abgelagert werden. Ein rasches Streptokokken-Clearance durch Phagozytose verhindert vermutlich die anschließende Vermehrung und Persistenz der Bakterien. Die Mäuse zeigten gleichmäßig Serum-lgG-Titer von 1:32.000 oder mehr bei Überprüfung durch ELISA, was darauf hinweist, dass die SQ-Injektion von SCPA-Antigen mit Adjuvans durchweg eine kräftige Antikörperantwort induziert.
  • BEISPIEL 9
  • Die C5a-Peptidase aus Streptokokken der Gruppe B ist bezüglich ihrer Sequenz nahezu identisch mit derjenigen aus den Gruppe-A-Streptokokken M12 und M49
  • Das Gen der C5a-Peptidase aus Streptokokkus Gruppe B (SCPB) wurde kloniert, sequenziert und mit dem entsprechenden Gen aus Gruppe-A-Streptokokken, Serotyp M12 und M49 verglichen. Das vollständige scpB-Gen wurde durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche Abschnitten der scpA12-Sequenz entsprechen, und wobei die oben beschriebene Methode verwendet wurde. Das SCPB-Gen kodiert für einen offenen Leserahmen(ORF) von 3450 bp, welches ein Protein von 1150 Aminosäuren mit einem Mr von 126.237 da spezifiziert. Die Aminosäuresequenz von SCPB ist in 2 dargestellt. Ein Ver gleich des scpB-Nukleotids und der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit den entsprechenden Sequenzen aus den Gruppe-A-Streptokokken M12 und M49 ergab hohe Ähnlichkeiten von 98% bzw. 97%. ScpB enthält eine 50 bp umfassende Deletion, welche zwei der C-terminalen Repeats überlappt, und enthält weitere andere kleinere Unterschiede relativ zu den scpA-Genen. Ein Alignment dieser Sequenzen zeigte, dass scpA12 tatsächlich phylogenetisch näher an scpB als an scpA49 liegt. Dreißig Stämme, repräsentierend die Serotypen III, III/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/R1 tragen eine Kopie von scpB.
  • Rekombinantes SCP wurde in E. coli unter Verwendung des Expressionsvektorplasmids pGEX-4T-1 (ATCC-Hinterlegungsnummer 98225) exprimiert und die Identität zu dem aus dem parentalen Streptokokkus-Gruppe-B-Stamm 78-471 (Typ II a+b) extrahierten Enzym wurde gezeigt. Eine Western-Blot-Analyse legte nahe, dass das rekombinante SCP-Protein mit dem C5ase-Enzym identisch ist, das zuvor aus Streptokokken der Gruppe B isoliert wurde.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001

Claims (13)

  1. Vakzin, umfassend eine immunogene Menge eines isolierten und gereinigten Peptids umfassend eine enzymatisch inaktive Streptococcus C5a Peptidase (SCP), wobei diese Menge einen suszeptiblen Säuger gegen β-hämolytischen Streptococcus wirksam immunisiert, in Kombination mit einem physiologisch verträglichen, nicht toxischen Träger, wobei die SCP eine Variante von Wildtyp-SCP ist, indem die SCP-Variante jeweils eine Substitution bei den Aminosäureresten, entsprechend den Aminosäuren 130 und 512 von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  2. Vakzin nach Anspruch 1, wobei die SCP von einer isolierten DNA-Sequenz, welche SCP kodiert, exprimiert wird.
  3. Vakzin nach Anspruch 1 oder 2, wobei die SCP eine von benachbarten Aminosäureresten definierte Spezifitätsfurche aufweist, die den Resten etwa von Rest 260 bis Rest 417 gemäß SEQ ID NO: 1 entspricht, oder eine katalytische Domäne von benachbarten Aminosäureresten, entsprechend den Resten etwa von Rest 130 bis Rest 510 gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.
  4. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Substitution eine konservative Substitution ist.
  5. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die SCP-Variante zusätzlich von der Wildtyp-SCP darin abweicht, dass sie keine Signalsequenz und/oder kein Zellwand-Insert enthält.
  6. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die SCP eine Variante der SCP aus Streptococcus Gruppe A, Streptococcus Gruppe B, Streptococcus Gruppe C oder Streptococcus Gruppe G ist.
  7. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches zusätzlich eine wirksame Menge eines immunologischen Adjuvans umfasst.
  8. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Säuger ein Mensch, ein Hund, ein Rind, ein Schwein oder ein Pferd ist.
  9. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der β-hämolytische Streptococcus eine Variante der SCP aus Streptococcus Gruppe A, Streptococcus Gruppe B, Streptococcus Gruppe C oder Streptococcus Gruppe G ist.
  10. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die SCP mit einem Peptid oder einem Polysaccharid konjugiert oder verknüpft ist.
  11. Vakzin nach Anspruch 10, worin das Peptid oder Polysaccharid, das mit der SCP konjugiert oder verknüpft ist, von einem anderen Pathogen stammt.
  12. Vakzin nach Anspruch 11, worin das Polysaccharid des anderen Pathogens ein Streptococcus Gruppe A-Polysaccharid, ein C-Polysaccharid von Streptococcen der Gruppe B oder ein Kapsel-Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae oder Streptococcen der Gruppe B ist.
  13. Verwendung des Vakzins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz gegen die Kolonisierung von oder die Infektion mit β-hämolytischem Streptococcus.
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