DE69929716T2

DE69929716T2 - Verfahren zur herstellung von transgenen pflanzen, die ein protein exprimieren, das eine wasserstoff-peroxid prodzierende aktivität besitzt, mittels transformation durch agrobakterium rhizogenes

Info

Publication number: DE69929716T2
Application number: DE69929716T
Authority: DE
Inventors: Michel Pagniez; Renω GRISON; Alain Toppan
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: CA2346153A1; AU5990999A; AU769546B2; US7094952B1; EP1121451B1; FR2784393A1; FR2784393B1; ES2257883T3; ATE317018T1; CA2346153C; DK1121451T3; WO2000022148A1; EP1121451A1; DE69929716D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der genetischen Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium rhizogenes in Kombination mit der Verwendung eines Gens, das für ein Protein mit Wasserstoffperoxid produzierender Aktivität, insbesondere die Oxalatoxidase, codiert.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß dabei eine Transformation mit Agrobacterium rhizogenes in Kombination mit einem visuellen Screening der Transformationsereignisse aufgrund der leicht und rasch durchzuführenden Färbung der transformierten Wurzeln, die das Transgen exprimieren, verwendet wird.
Seit 1986 die ersten Feldversuche, also Versuche außerhalb von geschlossenen Räumen, mit transgenen Pflanzen stattgefunden haben, wurde an der Verwendung eines Gens für Resistenz gegen ein Antibiotikum als Selektionsgen von zahlreichen Seiten aus Kritik geübt (Casse-Delbart und Tepfer, Biofutur, (1990), Juni; 56–59, sowie Bryant und Leather, Tibtech, (1992), 10, 274–275). Obwohl die Möglichkeit, daß Gene der transgenen Pflanze auf Bodenbakterien übertragen werden, nicht bewiesen worden ist, ist die Verwendung von Genen für Resistenz gegen Antibiotika von gewissen Autoren sehr negativ aufgenommen worden (Heinemann, TIG, (1991), 7, 181–185).
Obwohl zahlreiche Ersatzprodukte für das Kanamycinresistenzgen vorgeschlagen wurden (Ratner, Bio-Technology, (1989), 7, 337–341), führt der Großteil dieser Gene für Resistenz gegen ein anderes Antibiotikum oder ein Herbizid zu ähnlichen Einwänden oder ist technisch schwierig handzuhaben.
Die Verwendung der Oxalatoxidase als Selektionsgen bietet eine Alternative zu den vorgenannten Systemen. Dieses Protein, das in gewissen Pflanzen nachgewiesen wurde, ist zum Abbau der Oxalsäure, bei der es sich um ein bei Infektion durch viele Pflanzenpathogene produziertes Phytotoxin handelt, fähig.
Eine erste Anwendung der Oxalatoxidase war die Herstellung von transgenen Pflanzen, die gegen Pathogene der Gattung Sclerotinia resistent waren (WO 92/14824).
Die Patentanmeldung WO 94/13790 beschreibt eine neue Verwendung der Oxalatoxidase als Ersatz für Kanamycin in einem Selektionsdrucksystem für Transformanten. Gemäß dem in der WO 94/13790 beschriebenen Verfahren überleben nur diejenigen Transformanten (Kalli), die das Oxalatoxidasegen enthalten, bei einer im Medium vorliegenden, bestimmten subletalen Oxalsäuredosis. Die Herstellung von Selektionsmedien (Oxalsäuredosis, Calciumchelatoren) ist jedoch beschwerlich und unangenehm.
Bis jetzt wurde die Oxalatoxidase in mit dem toxischen Agens, der Oxalsäure, gekoppelter Form im Hinblick auf den Selektionsdruck verwendet, während sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren als einfacher Marker für ein visuelles Screening der Transformanten verwendet wird. Trotzdem schien dieses Protein von vornherein kein guter Kandidat für einen Marker zu sein, da es in Pflanzen, die mit einem Pathogen infiziert waren, stark exprimiert war, wodurch die große Gefahr, zu verfälschten Ergebnissen zu gelangen (z. B. falsche Positive), bestand. Außerdem regt die Lehre der Patentanmeldung WO 94/13790 den Fachmann nicht dazu an, einen colorimetrischen Assay für die Selektion von Transformanten zu verwenden, da mit solch einem Assay einzelne Ereignisse (transformierte Zellen) und nicht in einem heterogenen Material wie Kallus, das das Ergebnise der Transformation mit Agrobacterium tumefaciens ist und eine Mischung von transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen enthält, verstreut vorliegende Ereignisse selektiert werden können.
Die vorliegende Erfindung schlägt daher ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen vor, das insofern vorteilhaft ist, als es die technischen Nachteile des oben beschriebenen Verfahrens durch die Kombination von Eigenschaften von Agrobacterium rhizogenes und einem Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität überwindet. Insbesondere werden von den Erfindern die durch Agrobacterium rhizogenes induzierte Wurzelbildung und der Phänotyp der Transformanten (Blätter mit Reliefausprägung, plagiotrope Wurzeln, verkürzte Internodien) in Kombination mit der Produktion von H₂O₂ (Wasserstoffperoxid) durch das Protein zur Entwicklung eines neuen Selektionssystems für homogene Transformanten genutzt. Bei diesem System wird das produzierte Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase entwickelt, um eine Färbung von Proben transformierter Wurzeln zu erzeugen.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Transformation von Pflanzenzellen mit Agrobacterium rhizogenes, das einen Vektor, der ein für ein H₂O₂-produzierendes Protein codierendes Gen trägt, enthält;
(b) Selektion von Transformanten, die dieses Gen enthalten und exprimieren, mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests;
(c) Regeneration von Pflanzen aus selektierten Wurzeln und Überprüfung der Expression bei erhaltenen Pflänzchen mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests;
(d) phänotypisches Screening und gegebenenfalls Validierung durch molekulare Analyse der Nachkommenschaft der erhaltenen transgenen Pflanzen, was die Selektion oder Bestätigung von Pflanzen, die nur das Transgen und nicht die T-DNA von Agrobacterium rhizogenes enthalten, gestattet.

Der in Schritt b) und c) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete colorimetrische Peroxidase-Assay besteht darin, daß man eine von pflanzlichem Gewebe entnommene Probe in Gegenwart eines Mediums, das ein Substrat für das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität wie zum Beispiel Oxalsäure enthält, inkubiert und die H₂O₂-Bildung mit Hilfe der Peroxidase in Gegenwart eines geeigneten Substrats, dessen Oxidation von einem Farbwechsel begleitet ist, nachweist. Die Substratkonzentration in dem Inkubationsmedium ist deshalb nicht kritisch, weil das erfindungsgemäße visuelle Screening-System an der Probe kein Überleben der Zellen erfordert, wie dies für das selektive "Vital"-Screening der transformierten Zellen, das in der WO-Anmeldung 94/13790 beschrieben ist, der Fall ist. Im vorliegenden Fall ist die Substratkonzentration vorteilhaft ausreichend hoch, um die H₂O₂-Produktionsaktivität zu begünstigen und die Produkte leicht mit der Peroxidase in Form einer intensiven blauen Färbung nachzuweisen. Die Lehre der WO-Anmeldung 94/13790 beschreibt nicht die Verwendung einer Oxalsäurekonzentration oberhalb der beispielhaft angeführten subletalen Dosis, die 3 mM beträgt; nun stellt sich aber heraus, daß die optimalen Substratkonzentrationen für das visuelle Screening wesentlich oberhalb dieser kritischen Konzentration liegen. So können beispielsweise die Oxalsäurekonzentrationen in einem weiten Bereich von 5 bis 5 mM, vorzugsweise 10 bis 20 mM, insbesondere 15 mM, schwanken.
Der in Schritt b) des Verfahrens durchgeführte colorimetrische Test wird vorteilhaft an einer Wurzelprobe durchgeführt. Er kann auch an dem flüssigen Inkubationsmedium, vorteilhafterweise nach Dekontamination der Explantate (Entfernung der Agrobakterien) durchgeführt werden, wobei man weiß, daß das Protein, wie die Oxalatoxidase, ausgehend von ihrem Expressionsort diffundieren kann. Ein Nachweis auf einem Abdruck, der von den transformierten Explantaten auf einem Agar-Medium oder auf einer Membran hinterlassen wird, ist ebenfalls möglich.
Die Pflanzenzellen werden erfindungsgemäß mit Agrobacterium rhizogenes transformiert, das eine rekombinante DNA, die für ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codiert, in einem Zusammenhang, der seine Expression in der Pflanze gestattet, enthält. Bei Agrobacterium rhizogenes, das zum Beispiel von Tepfer, Physiologica Plantarium (1990), Band 79, S. 140–146 beschrieben ist, handelt es sich um ein Bakterium, das diese Pflanzenzellen infizieren kann und dabei die Integration von interessierenden DNA-Sequenzen, die vorab in der T-DNA von Agrobacterium rhizogenes enthalten sind, in das Genom der Pflanzenzellen ermöglicht. Bei der Transformation von Pflanzenzellen wird eigentlich ein binäres System (Watson in Genetic engineering of crop plants, Butterworths, 1990) verwendet, das zwei Vektoren enthält: der erste Vektor ist pRi, der Agrobacterium rhizogenes zu eigen ist und für die Bildung von tranformierten Wurzeln verantwortlich ist; der zweite Vektor, bei dem es sich um einen Vektor des binären Typs handelt (Bevan, Nuc. Acid. Res. (1984), 12 8711), enthält das für das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität, vorzugsweise die Oxalatoxidase, codierende Gen; dieses Gen wird im folgenden Selektionsgen genannt.
Bei dem von dem Selektionsgen codierten Protein handelt es sich um ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität. Beispiele, die für solche Proteine zu nennen sind, sind die NADPH-Oxidasen, Oxalatoxidasen, Aminoxidasen, Glukoseoxidasen usw. (Bolwell und Wojtazek, Plant Mol. Plant Pathol., (1998), 51, 347). Die für diese Proteine codierenden Gene können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.
Vorzugsweise wird ein Gen, das für ein Protein mit Oxidaseaktivität, wie zum Beispiel die Oxalatoxidase aus Gerste (im Handel von Boehringer erhältlich, Art.-Nr. 567698), Sorghum (Pundier, Phytochemistry, (1991), 30, 4, 1065) oder des Mooses Mnium menziesii (Laker et al., Clinical Chemistry, (1980), 26, 7 827) codiert, verwendet.
Ein besonders gerne verwendetes Protein mit Oxalatoxidaseaktivität ist Weizen-Germin, dessen Sequenz von Dratewka-Kos, J. Biol. Chem., (1989), 264, 4896) und Lane, J. Biol. Chem. (1991), 266, 10461) beschrieben wurde. Unter Berücksichtigung des degenerierten genetischen Codes existiert eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen, die für Oxalatoxidase codieren und ebenfalls für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können.
Die rekombinante DNA enthält das für das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codierende Gen, das von Mitteln, die für seine Expression erforderlich sind, flankiert ist, nämlich einem Promoter, einem Transkriptionsterminator sowie gegegebenenfalls einer Codiersequenz für ein Zielsteuerungspeptid pflanzlichen Ursprungs.
Bei dem Promoter handelt es sich vorzugsweise um einen starken konstitutiven Promoter, z. B. um den 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus.
Man kann jedoch auch den Promoter des Gens, das für den pflanzlichen Elongationsfaktor codiert, verwenden, wie den EF-1α-Promoter, der in der Patentanmeldung WO 90/02172 bzw. von Axelos et al. Plant Mol. Biol., (1989), 219 : 1–2, 106, beschrieben ist. Man kann auch einen für ein Gewebe spezifischen Promoter, einen Promoter, der während eines bestimmten Entwicklungsstadiums der Pflanze aktiv ist, oder einen in Streßsituationen induzierbaren Promoter, zum Beispiel als Folge von Hitzeschock, Verletzung oder Interaktion zwischen Pflanze und Parasiten (Kuhlemeier et al., Ann. Rev. Plant Physiol., (1987), 38 : 221) verwenden, wenn die Selektionsphase die Expression des H₂O₂-Produktionsgens in diesen Situationen erforderlich macht.
Unter den sonstigen Transkriptionspromotern, die verwendet werden können, sind insbesondere die folgenden zu nennen:

– der doppelte konstitutive 35S (pd35S)-Promoter von CaMV, der in der Arbeit von Kay et al., Science, (1987), 236: 4805 beschrieben ist;
– der chimäre Promoter PSP-Superpromoter (Ni M et al., Plant J., (1995), 7: 661), der aus der Fusion einer dreifachen Wiederholung eines Transkriptionsaktivationselements des Promoters des Octopinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens, einem Transkriptionsaktivatorelement des Promoters des Mannopinsynthasegens und dem Mannopinsynthasepromoter von Agrobacterium tumefaciens besteht;
– der Reis-Actinpromoter sowie im Anschluß daran das Reis-Actinintron (PAR-IAR), enthalten in dem von Mc Elroy et al., (Mol. Gen. Genet., (1991), 231:150) beschriebenen Plasmid pAct1-F4.

Man kann auch kornspezifische Promoter verwenden, insbesondere:

– den HMGW (high-molecular-weight glutenin) Promoter der Gerste, der von Anderson et al., T.A.G., (1989), 77, 689–700 beschrieben ist;
– den von Reina et al., Nucleic Acid Research, (1990), 18, 6426 beschriebenen Promoter des γ-Zein-Gens von Mais (Pγ-Zein), der in dem Plasmid pγ63 vorliegt und die Expression im Eiweiß von Maissamen gestattet;
– den PCRU-Promoter des Cruciferingens des Radieschens, der die Expression von Sequenzen, die ausschließlich in den Samen (bzw. Körnern) der erhaltenen transgenen Pflanze assoziiert sind, gestattet; dieser Promoter ist von Depigny-This et al., Plant. Mol., Biol., (1992), 20, 467–479 beschrieben;
– den PGEA1-Promoter und den PGEA6-Promoter, die der 5'-nichtcodierenden Region der Reserveproteingene von Körnern, nämlich GEA1 bzw. GEA6, von Arabidopsis thaliana entsprechen (Gaubier et al., Mol. Gen. Genet (1993), 238, p. 409–418) und die eine spezifische Expression in den Körnern gestatten.

Man verwendet eine Terminatorsequenz, die Polyadenylierungsstellen enthält und die von pflanzlichen Genen oder von Genen, die in Pflanzen exprimiert werden, isoliert werden kann, wie zum Beispiel den Terminator des Nopalinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet (1982), 1, 561–573).
Unter den Sequenzen, die für ein Zielsteuerungspeptid pflanzlichen Ursprungs codieren und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind folgende zu nennen:

– die 69 Nukleotide lange Nukleotidsequenz, die für das 23 Aminosäuren lange Präpeptid (Signalpeptid) von Sporamin A bei der Süßkartoffel codiert und die das Eintreten der rekombinanten Polypeptide in das Sekretionssystem von transformierten Pflanzenzellen ermöglicht;
– die 42 Nukleotide lange Nukleotidsequenz, die für das N-terminale 14 Aminosäuren lange vakuole Zielsteuerungs-Propeptid von Sporamin A bei der Süßkartoffel codiert und die die Akkumulation der rekombinanten Polypeptide in den Vakuolen der transformierten Pflanzenzellen ermöglicht;
– die 111 Nukleotide lange Sequenz, die für das 37 Aminosäuren lange Prä-Propeptid von Sporamin A codiert, das vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende aus den 23 Aminosäuren des obengenannten Signalpeptids sowie im Anschluß daran den 14 Aminosäuren des obengenannten Propeptids besteht, wobei dieses Prä-Propeptid das Eintreten der rekombinanten Polypeptide in das Sekretionssystem und ihre Akkumulation in den Vakuolen der erfindungsgemäß transformierten Pflanzenzellen ermöglichtγ, wobei die drei obengenannten Sequenzen von Murakami et al., Plant Mol. Biol., (1986), 7, 343–355 und von Matsuoka et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991), 88, 834–838 beschrieben sind;
– das carboxy-terminale Propeptid des Gersten-Lectins, das insbesondere von Schroeder et al. in Plant Physiol., (1993), 101, 451–458 sowie von Bednarek et al., in The Plant Cell, (1991), 3, 1195–1206 beschrieben ist;
– sowie das PRS (Pathogenesis-Related Protein) von Cornelissen et al., Nature (1986), 321, 531–532, das die Sekretion ermöglicht.

Ebenfalls zu nennen unter den Sequenzen, die für ein Zielsteuerungspeptid codieren, sind diejenigen, die für die Peptide Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL) und His-Asp-Glu-Leu (HDEL) codieren und eine Zielsteuerung in das endoplasmatische Retikulum ermöglichen.
Zur Klonierung dieser rekombinanten DNA kann ein Bakterium, zum Beispiel der Art Escherichia coli verwendet werden, das die oben definierte rekombinante DNA und die Mittel, die ihre Replikation ermöglichen, enthält. Zur Transformation von Pflanzenzellen dient ein Bakterium, das eine Pflanze unter Übertragung von genetischem Material infizieren kann, nämlich Agrobacterium rhizogenes, das diese DNA in einem Zusammenhang, der seine Expression gestattet, enthält.
Die Erfindung gestattet auch die Herstellung einer Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit der zuvor definierten rekombinanten DNA transformiert ist. Diese Pflanzenzelle kann von einer Hauptkulturart wie zum Beispiel Mais, Soja, Weizen, Gerste, Raps, Sonnenblume und Erbse oder einer Gemüseart wie Salat, Melone, Tomate, Kohl, Zwiebel und Mais, vorzugsweise Zuckermais, stammen. Besonders gerne verwendete Arten sind Raps Brassica napus, Sonnenblume Helianthus annuus, Tabak Nicotiana tabacum, Blumenkohl Brassica oleracea sowie Tomate Lycopersicon esculentum. Vorzugsweise betrifft die Erfindung Arten, die nicht endogen Oxalatoxidase exprimieren.
Die Erfindung gestattet auch die Herstellung einer Pflanze oder eines Pflanzenteils, dadurch gekennzeichnet, daß diese(r) die oben definierte rekombinante DNA enthält und durch Sichtbarmachung der Enzymaktivität des Proteins mit H₂O₂-produzierender Aktivität durch Verwendung eines colorimetrischen Peroxidasetests, der an Wurzeln der in-vitro-Kultur oder an Pflanzengeweben, die von den ganzen Pflanzen entnommen wurden, durchgeführt wird, selektiert wird. Die transgenen Pflanzen werden direkt aus den mittels des colorimetrischen Peroxidasetests selektierten Wurzeln oder Organen regeneriert.
Die erfindungsgemäß definierten Pflanzenteile umfassen insbesondere die Hypokotylen, Blütenschäfte und Blattstiele, vorzugsweise die Kotyledonen. Unter Pflanzenteil versteht man auch die in vitro kultivierten Zellen oder die Zellen dieser Pflanze.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die für ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codierende rekombinante DNA-Sequenz für die Selektion von mit einer interessierenden Sequenz transformierten Pflanzenzellen verwendet.
So betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die ein interessierendes Gen exprimieren, bei dem es sich nicht um das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität handelt, in Kombination mit einem Gen, das für ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Transformation von Pflanzenzellen mit Agrobacterium rhizogenes, das eine rekombinante DNA, die gleichzeitig ein für ein H₂O₂-produzierendes Protein codierendes Gen und ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, in einem Zusammenhang, der seine Expression in dem Pflanzenmaterial gestattet, enthält;
(b) Selektion von Transformanten, die das Gen, das für das interessierende Protein codiert, enthalten, mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests;
(c) Regeneration von Pflanzen aus selektierten Transformanten und Überprüfung der Expression bei den erhaltenen Pflänzchen, mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests;
(d) phänotypisches Screening und gegebenenfalls molekulare Analyse der Nachkommenschaft der transgenen Pflanzen, um diejenigen Pflanzen, die nur das Transgen und nicht die T-DNA von A. rhizogenes enthalten, zu selektieren oder zu bestätigen;
(e) gegebenenfalls Aufreinigung des produzierten interessierenden Proteins.

Dieses neue direkte, an den Wurzeln durchgeführte Nachweissystem ist insbesondere dann interesssant, wenn das interessierende Gen in einem späteren Entwicklungsstadium oder in einem anderen vegetativen Organ, als demjenigen, an dem die Selektion durchgeführt wird, exprimiert wird oder schwierig nachzuweisen ist. Es kann zum Beispiel für die Selektion von Transformationsereignissen, die sich auf ein interessierendes Gen unter der Kontrolle eines kornspezifischen Promoters oder eines spezifisch in den grünen Geweben exprimierten Promoters befinden, verwendet werden.
Bei der interessierenden Sequenz kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz von landwirtschaftlichem oder industriellem Interesse handeln. Sie kann zum Beispiel an einem gegebenen Stoffwechselweg, insbesondere bei den Stoffwechselwegen der Öle, Stärken, Proteine, Aminosäuren, des Lignins, von Zellwandbestandteilen oder auch am Weg der Resistenz gegen Pathogene beteiligt sein. Diese interessierende Sequenz kann weiterhin als "sense"- oder "antisense"-Sequenz verwendet werden.
Weiterhin kann es sich dabei zum Beispiel um eine vorteilhafte Regulationssequenz handeln. Es kann sich auch um eine Codiersequenz für ein interessierendes Protein oder für eine Vorstufe solch eines interessierenden Proteins handeln. Als Beispiele für Codiersequenzen für ein interessierendes Protein sind die Codiersequenzen für die Lipasen zu nennen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vermittelt die interessierende Sequenz den Pflanzen eine Resistenz gegen pathogene Agenzien wie Pilze, Bakterien, sowie Arthropoden, insbesondere Insekten, und Nematoden.
Bei solch einer interessierenden Sequenz kann es sich zum Beispiel um eine Codiersequenz für ein Protein mit Endochitinaseaktivität oder für eine Vorstufe solch eines Proteins handeln. Man weiß nämlich, wie dies in der Patentanmeldung WO 92/01792 beschrieben ist, daß solch ein Protein eine pflanzenschützende Wirkung ausübt, da es zum Abbau von Chitin, einem aus N-Acetylglukosamin-Einheiten, die über β-1,4-Bindungen verknüpft sind, bestehenden Polysaccharid-Polymer, bei dem es sich um eine wichtige Strukturverbindung der Wand der meisten pathogenen Pilze, des Außenskeletts von Arthropoden, insbesondere Insekten, sowie der äußeren Hülle von Eiern und Zysten von Nematoden handelt, befähigt ist.
Eine interessante Codiersequenz für ein Protein mit Endochitinaseaktivität oder für eine Vorstufe solch eines Proteins ist diejenige, die in der Patentanmeldung WO 92/01792, welche durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben ist.
Eine weitere Codiersequenz für ein Protein mit Endochitinaseaktivität oder für eine Vorstufe solch eines Proteins ist diejenige der Chitinase aus Aphanocladium album, die in der Patentanmeldung EP-A1-531 218, die durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben ist.
Außerdem gestattet die Erfindung die Herstellung von pflanzlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit der oben definierten rekombinanten DNA, nämlich der rekombinanten DNA, die ein für ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codierendes Gen und ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, transformiert werden, sowie die für ihre Expression erforderlichen Mittel enthält. Diese Mittel sind die gleichen, die bereits oben definiert wurden. Diese pflanzlichen Zellen können von den zuvor angegebenen Hauptkulturarten oder Gemüsearten stammen.
Die Erfindung gestattet weiterhin die Herstellung einer Pflanze oder eines Pflanzenteils, dadurch gekennzeichnet, daß sie bzw. er das oben beschriebene interessierende Protein zusammen mit den für die Expression des für ein Protein, das zur Produktion von H₂O₂ fähig ist, insbesondere die Oxalatoxidase, codierenden Gens erforderlichen Mitteln exprimiert. Diese Pflanze bzw. dieser Pflanzenteil wird mittels eines colorimetrischen Tests, bei dem das an den Wurzeln, die aus einer in-vitro-Kultur oder im Gewächshaus gezogenen Pflanzen stammen, gebildete H₂O₂ nachgewiesen wird, selektiert. Die transgenen Pflanzen werden direkt aus den Wurzeln, die das Transgen exprimieren und die mit dem colorimetrischen Test selektiert werden, regeneriert.
Die Pflanzenteile sind wie oben definiert.
Die Erfindung soll nun mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Beispiele erläutert werden.
In diesem Versuchsteil wird der von Lane et al., J. Biol. Chem., (1991), 226, 10461 beschriebene Klon gf-2.8 des Weizen-Germins verwendet.
Ein Großteil aller Techniken, die nun folgen, ist dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in den Werken von Sambrook et al. "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", die 1989 von Cold Spring Harbor Press in New York (2. Ausgabe) veröffentlicht wurde, sowie in dem Werk von Gelvin et al. "Plant Molecular Biology Manual", das 1988 von Kluwer Academics veröffentlicht wurde, beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Transformation von Pflanzen mit dem Germin-Gen von Weizen sowie Selektion der Transformanten mit einem colorimetrischen Wurzeltest
1.1 Herstellung von transgenem Raps
a) Transformationsvektoren
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird die Codiersequenz für das Weizen-Germin mit der 35S-Promotersequenz des Blumenkohlmosaikvirus sowie der NOS-Terminatorsequenz von Agrobacterium tumefaciens ligiert und anschließend in den binären Vektor pBIN19 (Bevan, Nucl. Acid, Res., (1984), 12, 8711–8721) nach der in Abschnitt 2 der Anmeldung WO 94/13790, die durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschriebenen Vorgehensweise insertiert. Der erhaltene Vektor, der pPH100 genannt wird, wird in den E. coli-Stamm HB101 (Clontech) kloniert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird gleich wie oben vorgegangen, wobei die Promotersequenz des Gens, das für den Promoter des aus Arabidopsis thaliana (Axelos et al, Plant Mol Biol, (1989), 219:1- 2,106) isolierten Elongationsfaktors EF-1α codiert, statt der 35S-Promotersequenz verwendet. Der neue Vektor, der p631 genannt wird, wird in den E. coli-Stamm HB101 kloniert.
Bei der Promotersequenz kann es sich auch um die in der Patentanmeldung WO 94/21793 beschriebene induzierbare Promotersequenz, die von dem Vektor pPH118, der in Beispiel 3 unten beschrieben wird, getragen wird, handeln.
b) Übertragung in Agrobacterium rhizogenes
Die Übertragung der oben beschriebenen Plasmide wird nach der von Gelvin et al. in dem obengenannten Werk Plant Molecular Biology Manual beschriebenen Gefrier-Tau-Methode durchgeführt, und zwar mit dem Stamm Agrobacterium rhizogenes A4, der von Guerche et al. in Mol. Gen. Genet., (1987), 206, 382 beschrieben ist.
Die Bakterien werden auf Petrischalen, die 100 mg/l Rifampicin sowie 25 mg/l Kanamycin enthalten, ausgestrichen. Die sich bildenden Kolonien werden nun mehrmals auf Selektionsmedium umgesetzt. Das Vorliegen des Oxalatoxidasegens in Agrobacterium rhizogenes wird nach der Methode von Southern anhand einer Gesamt-DNA-Präparation (Lyse der Bakterien, Aufreinigung der DNA durch Extraktion mit Hilfe einer Phenol-Chloroform-Mischung nach der von Gelvin in dem obengenannten Werk zitierten Vorschrift, Schneiden der aufgereinigten DNA mit Restriktionsenzymen, Elektrophorese an Agarosegel, Übertragung auf Membranen und Hybridisierung nach fachbekannten Techniken) überprüft.
c) Herstellung von transformierten Wurzeln sowie Selektion
Die Transformation wird nach dem Protokoll von Guerche et al. (1987) durchgeführt; bei den verschiedenen Kulturmedien, deren Zusammensetzung in Tabelle 1 unten angeführt ist, handelt es sich um die von Pelletier et al. (Mol. Gen. Genet., (1983) 191, 244) beschriebenen Medien.
Vom Apikalende von Rapspflanzen (Brassica napus: Sommerrapssorten Brutor und Winterrapssorten Nickel bzw. Navajo) werden Stengelabschnitte entnommen. Diese Segmente werden oberflächensterilisiert, mit sterilem Wasser gewaschen, in Abschnitte mit einer Länge von ungefähr 1,5 cm geschnitten und in ein Röhrchen, das Medium A enthält, gegeben. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß das für die Transformation verwendete Explantat aus Kotyledonen, die von jungen, ungefähr 8 Tage alten Keimungen entnommen werden, besteht. Die Inokulation des Endes von Abschnitten der Blütenschäfte, Hypokotylen oder Blattstielen von Kotyledonen wird dadurch durchgeführt, daß man eine Suspension des Agrobacterium rhizogenes-Stamms, der den Vektor pPH100 oder den Vektor p631 enthält, aufträgt. Transformierte Wurzeln erscheinen auf dem Stengelsegment oder auf den Blattstielen der Kotyledonen nach 1 bis 2 Wochen; diese werden nach 3 Wochen entnommen und auf mit Agar (15 g/l) verfestigtes Medium B gelegt. Diese Wurzeln enthalten die T-DNA des Vektors pRi von Agrobacterium rhizogenes, und zwar entweder alleine oder zusammen mit der T-DNA des Vektors, der das Gen, das für die Oxalatoxidase codiert, trägt.
Die Selektion von Transformanten, die die T-DNA der Plasmide pPH100 bzw. p631 enthalten, die das Gen, das für das Weizen-Germin codiert, tragen, wird nach der folgenden Vorschrift durchgeführt:

– Der erste Schritt besteht darin, daß man die apikalen Enden (0,5 bis 1 cm) von vorzugsweise in vitro kultivierten Wurzeln (Dekontaminationsstadium oder Flüssigkultur) oder von Blattstücken von im Gewächshaus gezüchteten Pflanzen mit einem Skalpell herauspräpariert und sie in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen, die 0,5 ml der "Oxalatoxidase"-Reaktionsmischung (0,015 M Na-Oxalat in einem Bernsteinsäurepuffer pH 4; 0,05 M) enthalten, gibt. Die Röhrchen, die die Wurzeln enthalten, werden bis zum Ende des Entnahmevorgangs in Eis aufbewahrt.
– Der zweite Schritt besteht darin, daß man die Röhrchen eine Stunde lang im Wasserbad bei 37°C inkubiert, also unter Bedingungen, die die von der Oxalatoxidase katalysierte Reaktion ablaufen lassen.
– Der dritte und letzte Schritt besteht darin, daß man das in dem vorhergehenden Schritt produzierte Perhydrol nachweist: ein Substrat, dessen Oxidation von einem Farbwechsel begleitet wird, wird nach und nach der Reaktionsmischung zugesetzt; dieses Substrat stammt aus der Reihe der Phenolverbindungen oder der aromatischen Amine, und zum Beispiel 0,1 ml 4-Chlor-1-naphthol in einer Konzentration von 0,3% in absolutem Ethanol und 0,1 ml Peroxidase mit einer Konzentration von 0,006% in Tris-Puffer pH 7,6, 50 mM. Die Röhrchen werden geschüttelt und anschließend mindestens 2 Stunden lang bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Bei den transformierten Wurzeln erhält man eine blaue Färbung, vorzugsweise am apikalen Teil und am Zentralzylinder der Wurzeln. Dieser Farbtest an einer Wurzelprobe gestattet den Nachweis von Transformanten, die das Oxalatoxidasegen integriert haben und dieses exprimieren.

Es werden nun die Lösungen der verwendeten Produkte beschrieben:
Bernsteinsäurepuffer 0,05 M, pH 4, ad 250 ml (bei 4°C aufbewahren, maximal 3 Wochen)
3,375 g Na-Succinat, mit HCl auf pH 4 einstellen
"Oxalatoxidase"-Reaktionsmischung (frisch herstellen)
18 mg Na-Oxalat in 10 ml Bernsteinsäurepuffer
4-Chlor-1-naphthol-Stammlösung (bei 4°C aufbewahren)
0,3 g/10 ml absolutem Ethanol
4-Chlor-1-naphthol-Gebrauchslösung (frisch herstellen)
0,1 ml Stammlösung/10 ml Tris 50 mM; pH 7,6
Tris-Puffer 50 mM; pH 7,6 ad 250 ml (bei 4°C aufbewahren)
1,96 g Tris-HCl, mit NaOH auf pH 7,6 einstellen
Peroxidase (in Portionen teilen und bei –20°C einfrieren)
6 mg/100 ml Tris-Puffer 50 mM; pH 7,6
d) Regeneration von transformierten Pflanzen und phänotypisches Screening
Abschnitte von selektierten Wurzeln werden 15 Tage lang auf Medium D, das 3 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthält, inkubiert und anschließend auf ein RCC-Sproßinduktionsmedium gegeben. Die bewurzelten Pflanzen werden anschließend durch Passagieren der Sprosse auf die Medien F und G erhalten. Die Pflanzen werden herangezogen und geselbstet, wodurch Samen erhalten werden. Die Expression der erhaltenen regenerierten Pflanzen kann leicht mit Hilfe von einfachen Techniken überprüft werden (Quetschpräparat, Abdruck, "Dot" oder direkte Färbung an Blattabschnitten, Stengelabschnitten usw.). Mit einem Screening der Nachkommenschaft auf phänotypische Merkmale der transformierten Pflanzen kann man die Pflanzen, die die T-DNA von pRi enthalten und die insbesondere Blätter mit Waffelstruktur und verkürzte Internodien aufweisen, eliminieren. Dieses Screening wird anschließend mit molekularanalytischen Methoden bestätigt.
1-2 Herstellung von transgenem Blumenkohl
Nach der gleichen Vorschrift werden Stengelabschnitte von jungen Blüten von Brassica oleracea L. var. Botrytis der Sorte Taroke entnommen und über die obengenannten Stämme von Agrobacterium rhizogenes A4 transformiert. Die Wurzeln, die das für die Oxalatoxidase codierende Gen exprimieren, werden nach dem zuvor beschriebenen Farbtest selektiert und zwecks Gewinnung von transgenen Pflanzen regeneriert. Die erhaltenen regenerierten Pflanzen werden im Gewächshaus herangezogen, vernalisiert und anschließend geselbstet, und ihre Nachkommenschaft wird auf der Grundlage von phänotypischen Merkmalen und molekularen Analysen gescreent, so daß nur diejenigen Pflanzen, die einzig die T-DNA, die das Oxalatoxidasegen trägt, enthalten, zurückbehalten werden.
1-3 Gewinnung von transgenen Sonnenblumenkalli
Es werden von Sonnenblumenpflanzen Helianthus annuus (Sorte Euroflor Rustica Prograin Génétique) im Alter von 6 bis 10 Wochen Blattstielsegmente entnommen. Die Segmente werden durch 30minütiges Eintauchen in eine 1%ige Calciumhypochloritlösung desinfiziert. Die Blattstielabschnitte werden anschließend in ein Röhrchen, das mit Agar verfestigtes Murashige-Skoog-Kulturmedium enthält, gegeben. Die Inokulation des Endes dieser Abschnitte wird dadurch durchgeführt, daß man eines Suspension des Agrobacterium rhizogenes-Stamms, der das Plasmid pPH100 enthält, aufträgt. Nach ungefähr 1 Monat erscheinen auf dem Blattstielabschnitt transformierte Wurzeln. Diese Wurzeln werden entnommen und auf verfestigtes Medium M (Tabelle 2, Beilage), dem 6 g/l Agarose zugesetzt worden waren, gelegt.
Im Wurzelstadium wird eine Selektion der Wurzeln, die das Protein mit Oxalatoxidaseaktivität exprimieren, gemäß der zuvor beschriebenen Vorschrift durchgeführt.
Die im colorimetrischen Test positiven Wurzeln werden nun auf das gleiche Medium umgesetzt, wodurch man vollständig transformierte Kalli, die die Oxalatoxidase exprimieren, erhält.
1-4 Herstellung von transgenem Tabak
Die Mittelrippe von Tabakblättern wird in Abschnitte zerschnitten und diese werden auf ein mit Agar verfestigtes Murashige-Skoog-(MS)-Medium gelegt. Diese Explantate werden nun mit Hilfe einer Suspension des A. rhizogenes-Stamms, der das Plasmid pPH100 enthält, inokuliert. Die Wurzeln, die nach einigen Tagen erscheinen, werden auf das gleiche Medium, das 500 mg/l Cefotaxim zur Elimination der Bakterien enthält, umgesetzt und anschließend auf ein mit Agar verfestigtes Murashige-Skoog-Medium, das 0,1 mg/l AIA (3-Indolylessigsäure) und 1 mg/l BAP (6-Benzylaminopurin) enthält, umgesetzt. Die sich bildenden Sprosse werden auf ein mit Agar verfestigtes MS-Medium umgesetzt und die erhaltenen Pflanzen werden ins Gewächshaus gestellt.
1-5 Herstellung von transgenen Tomaten
Ausgehend von Wurzeln von transformierten Pflanzen können nach der gleichen Transformations- und Selektionsvorschrift Tomatenpflanzen erhalten werden (Shahin et al., TAG (1986) 72:770; Morgan et al., Plant Science (1987), 49:37).
Beispiel 2: Verwendung dieses Peroxidase-Selektionsverfahrens zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die ein zweites interessierendes Gen, nämlich das Gen, das für ein Protein mit Endochitinaseaktivität codiert exprimieren.
2-1 Herstellung von transgenem Raps
Der Transformationsvektor pPH106, der das Gen, das für das Weizen-Germin aus dem oben beschriebenen Plasmid pPH100 codiert und das chimäre Gen, das für eine Endochitinaseaktivität (WO 92/01792) codiert, enthält, wird nach der in der Patentanmeldung WO 94/13790, die durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschriebenen Vorschrift erhalten.
Die Herstellung des Transformationsvektors umfaßt die folgenden Schritte:
a) Herstellung des Fragments, das das für die Oxalatoxidase codierende Gen trägt.
Das ungefähr 1420 Bp große Fragment HindIII-EcoRI aus dem in Abschnitt 1-1 von Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pPH100 wird auf gereinigt und nach fachbekannten Verfahren in einen pUC19-Vektor umkloniert. Dieses Plasmid wird anschließend mit der Restriktionsendonuklease EcoRI linearisiert und das kohäsive Ende wird mit Hilfe des Klenow-Fragments aufgefüllt. Anschließend wird nach Schneiden mit der Endonuklease HindIII das stumpfendige HindIII-Fragment auf gereinigt.
b) Herstellung des Fragments, das ein Hybridgen, das für ein Protein mit Endochitinaseaktivität codiert, trägt.
Das aus dem Plasmid pBR1, welches in der Patentanmeldung WO 92/01792, Beispiel 1, die durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben wird, stammende HindIII-EcoRI-Fragment, das ein chimäres Gen, das für ein Protein mit Endochitinaseaktivität codiert und das den 35S-Promoter, eine Codiersequenz für eine Tomate-Tabak-Hybridchitinase, sowie den NOS-Terminator enthält, wird auf gereinigt und in den Vektor pUC19 umkloniert, und die HindIII-Stelle wird anschließend auf traditionelle Weise zerstört. Das stumpfendige EcoRI-Fragment wird auf gereinigt.
c) Herstellung eines Pflanzentransformationsvektors, der kein Kanamycinresistenzgen enthält.
Das NheI-HindIII-Fragment, das den Abschnitt, der für das Kanamycinresistenzgen codiert, enthält, wird von der T-DNA des Plasmids pBIN19 eliminiert. Mit den Oligonukleotiden CTAGCA und AGCTTG kann nach fachbekannten Methoden das Plasmid wiederum ringförmig geschlossen werden, wodurch man wiederum die NheI- und die HindIII-Restriktionsstellen erzeugt. Das erhaltene Plasmid wird nun mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI linearisiert.
d) Assemblierung des Transformationsvektors
Mit Hilfe der T4-DNA-Ligase wurden das oben unter a) erhaltene Gen, das für die Oxalatoxidase codiert, und das chimäre Gen, das für ein Protein mit Chitinaseaktivität codiert (aus b) oben erhalten) in einen binären pBIN19-Vektor ligiert, in dem man das Kanamycinresistenzgen, das in Pflanzen exprimiert wird, eliminiert hat (in c) oben erhalten). Der erhaltene Vektor, der pPH106 genannt wird, wird in den E. coli-Stamm HB 101 (Clontech) kloniert.
Die Transformations-, Selektions- und Regenerationsschritte werden nach der in dem ersten Beispiel angegebenen Vorschrift durchgeführt.
2-2 Nachweis der Expression des interessierenden Proteins in den regenerierten transgenen Pflanzen
Wie in der Patentanmeldung WO 94/13790, die durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben, kann mit Western-Blot-Techniken und Messung der chitinolytischen Aktivität an Rohproteinextrakten von transformierten Pflanzen bestätigt werden, daß die Expression der Endochitinase mit der Expression der Oxalatoxidase korreliert ist.
Die Herstellung von Rohproteinextrakten von transformierten Pflanzen wird nach der folgenden Methode durchgeführt: die Gewebestücke (Pflanzenkalli und -blätter) wurden in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, zermörsert und bei –20°C aufbewahrt.
Für die Durchführung von Elektrophoresen wird die Oxalatoxidase direkt aus dem Pflanzenpulver mit Laemmli-Ladepuffer (Zitat folgt) direkt extrahiert.
Für die quantitativen Bestimmungen der Oxalatoxidaseaktivität wird der Enzymextrakt durch Suspendieren des Pflanzenpulvers in einem 0,05 M Bernsteinsäurepuffer, pH 4 durchgeführt.
Für die quantitative Bestimmung der Proteine wird der in dem oben genannten Bernsteinsäurepuffer suspendierte Pflanzenextrakt 5 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert.
Die Konzentration der Gesamtproteine wird an den Überständen, im folgenden Rohproteinextrakte genannt, nach der Technik von Bradford, Anal. Biochem., (1976), 72, 248–254 bestimmt.
Die Western-Blot-Versuche bzw. Nachweise der chitinolytischen Aktivität werden nach den folgenden Vorschriften durchgeführt:
a) Immunnachweis der Hybridchitinase (Western-Blot)
Mit den Rohproteinextrakten wird ein Western-Blot nach der fachbekannten, von Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, (1979), 76, 4350–4354) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt, die insgesondere die folgenden Schritte umfaßt:

– Denaturierung durch 10minütiges Erhitzen auf 100°C in einem Puffer, Ladepuffer genannt, der aus 0,125 M Tris, pH 6,8, 4% SDS, 0,002% Bromphenolblau, 20% Glycerin, 10% β-Mercaptoethanol (nach der vom Laemmli, U.K, Nature, (1970), 227, 680–685 beschriebenen Vorschrift) besteht, und anschließende Zentrifugation bei 10.000 g;
– elektrophoretische Trennung der verschiedenen, in dem Solubilisat enthaltenen Proteine nach der Vorschrift von Laemmli;
– Elektrotransfer dieser in dem Gel enthaltenen Proteine auf eine PVDF-Membran (gemäß Towbin et al., siehe Zitat oben).

Der Immunnachweis wird nach der Vorschrift, die die folgenden Schritte enthält, durchgeführt:

– Sättigung der PVDF(Polyvinylidenfluorid)-Membran, auf die die Proteine transferiert worden sind, durch mindestens 2stündige Inkubation bei 37°C in einer 3%igen Gelatinelösung in Phosphat-Kochsalz-Puffer, der 0,05% des Tensids Tween 20 enthält.
– Inkubation (1 Stunde bei 37°C) in Gegenwart des zuvor hergestellten Immunserums (das die polyklonalen Antikörper, die das rekombinante Protein erkennen, enthält) in 1/10.000iger Verdünnung in Phosphat-Kochsalz-Puffer.
– 3mal Waschen mit Phosphat-Kochsalz-Puffer, der 0,05% des Tensids Tween 20 enthält.

Der immunologische Nachweis des interessierenden Proteins erfolgt mit einem Immunserum, das polyklonale Antikörper, die das Hybridprotein mit chitinaseaktivität enthalten, enthält (vgl. WO 92/01792, Beispiel 5, die durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Der Antigen-Antikörper-Komplex wird anschließend mit Hilfe eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Streptavidin-Biotin-Systems mit dem Kit RPN 23 von Amersham ("Blotting detection kit") nach den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.
Der erhaltene Abdruck zeigt bei den Blättern von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pPH106 transformiert wurden, das Vorliegen eines Proteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 26 ± 6 kDa, das von den polyklonalen Antikörpern erkannt wird und bei den Blättern von Vergleichspflanzen fehlt. Dieses Protein weist das gleiche scheinbare Molekulargewicht wie das in der Anmeldung WO 92/01792 beschriebene Hybridprotein mit Chitinaseaktivität auf.
b) Nachweis der chitinolytischen Aktivität des rekombinanten Proteins.
Die chitinolytische Aktivität von Rohproteinextrakten von Blättern von Pflanzen, die mit dem Plasmid pPH106 transformiert wurden, sowie von Rohproteinextrakt von Blättern von nichttransformierten Pflanzen kann nach dem folgenden Verfahren bestimmt werden.
Die Endochitinaseaktivität des Proteins wird mit einem radiochemischen Verfahren bestimmt, mit dem die Menge an Monomeren oder Oligomeren, die von dem Enzym aus einem Substrat (dem tritiummarkierten Chitin) freigesetzt wurden, bestimmt wird. Dieses Verfahren, das von Molano et al., Anal. Biochem., (1977), 83, 648–656 beschrieben wurde, soll nun kurz zusammengefaßt werden.
Ein Proteinextrakt mit einem Volumen von 10 μl wird mit 50 μl einer Suspension von tritiummarkiertem Chitin mit einer spezifischen Aktivität von 0,58 MBq/ml versetzt. Das Endvolumen wird mit 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0 auf 300 μl eingestellt.
Nach 90minütiger Inkubation bei 30°C wird die Hydrolysereaktion des Chitins mit 100 μl 20%iger Trichloressigsäure gestoppt. Die Reaktionsröhrchen werden anschließend 10 Minuten lang bei 12.000 g zentrifugiert. Ein aliquoter Teil von 100 μl Überstand, der die löslichen Chitinoligomere enthält, wird entnommen, und die entsprechende Radioaktivität wird mittels Flüssigkeitsszintillation in Gegenwart von 5 ml Szintillationscocktail bestimmt. Die spezifische chitinolytische Aktivität wird in dpm/μg Protein ausgedrückt.
Man stellt fest, daß die Extrakte von Pflanzen, die mit dem Plasmid pPH106 transformiert wurden, eine chitinolytische Aktivität aufweisen, die wesentlich oberhalb der chitinolytischen Aktivität eines Extrakts von Kontrollpflanzen liegt. Durch Selektion mit dem colorimetrischen Test kann man also Pflanzen erhalten, die ein interessierendes Gen exprimieren, im vorliegenden Fall also das Hybridgen, das für ein in der Patentanmeldung WO 92/01792 beschriebenes Protein mit Chitinaseaktivität codiert.
Eine Variante der oben beschriebenen rekombinanten DNA kann dadurch erhalten werden, daß man den 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus durch den Promoter des EF-1α-Gens von Arabidopsis stromaufwärts des einen oder der beiden zuvor beschriebenen Gene ersetzt.
Nach dem gleichen Verfahren können auch transgene Blumenkohl-, Sonnenblumen-, Tabak- und Tomatenpflanzen erhalten werden.
Beispiel 3: Verwendung und Einschleusung eines induzierbaren Promoters
Man kann vorzugsweise einen in Stressituationen (zum Beispiel Hitzeschock, Verwundung, Hormonschock, biotischer oder abiotischer Elicitor oder Infektion durch Bakterien, Pilze oder Viren) induzierbaren Promoter, der in den verschiedenen Organen und Geweben einer Pflanze, insbesondere den Wurzeln und dem Meristem einer Pflanze, intensiv exprimiert wird, verwenden.
In diesem Beispiel wurde der stressinduzierbare Promoter, der die DNA-Sequenz (Sequenz B sowie davor die Sequenz C) [SEQ ID NR. 4 sowie davor SEQ ID NR. 5] oder eine Sequenz, die eine stärkere Homologie mit dieser Sequenz aufweist, verwendet, wie in der Anmeldung WO 94/21793 beschrieben, die durch Bezugnahme aufgenommen wird. Dieser Promoter wird im folgenden p246-C genannt.
3-1 Herstellung der Transformationsvektoren
a) Konstrukt aus induzierbarem Promoter und Oxalatoxidase
Der in Beispiel 1-1 a) beschriebene Vektor pPH100 wird mit Hilfe der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert, und anschließend wird das ungefähr 13.500 Basenpaare lange Fragment, das dem Codierteil der Oxalatoxidase sowie im Anschluß daran dem NOS-Terminator im Vektor pBIN19 entspricht, mittels Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
Der Vektor pPH118, der durch Insertion des oben definierten stressinduzierbaren Promoters p246-C nach fachbekannten Verfahren in das von Pharmacia im Handel erhältliche Plasmid pTZ19R erhalten wurde, wurde mit Hilfe der gleichen Restriktionsenzyme linearisiert. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese wird das ungefähr 1275 Bp lange HindIII-BamHI-Fragment isoliert und aufgereinigt. Es entspricht der Sequenz B sowie davor der Sequenz C des induzierbaren Promoters, wie diese oben sowie in der Anmeldung WO 94/21793 beschrieben sind.
Die so erhaltene Ligation der Promotersequenz mit dem obigen Vektor HindIII-BamHI stellt den Codierteil der Oxalatoxidase unter die Kontrolle des induzierbaren Promoters und des NOS-Terminators; der so erzeugte binäre Vektor wird p643 genannt. Die Konstruktion dieses Vektors wird in der beigelegten I dargestellt.
3-2 Transformation und Selektion
Die Transformation von Raps wird nach der oben in Beispiel 1-1 beschriebenen Vorschrift durchgeführt. Die transformierten Wurzeln, die das Oxalatoxidasegen exprimieren, werden wie zuvor beschrieben selektiert und regeneriert. Nach einem Hormonschock bildet sich ausgehend von den Wurzeln ein Kallus, der Sprosse produziert, die anschließend umgesetzt werden, um zu Pflanzen zu gelangen. Diese Pflanzen werden nach Abhärtung ins Gewächshaus umgestellt.
Nach der gleichen Vorschrift können Tabak-, Tomaten- und Blumenkohlpflanzen erhalten werden.
Beispiel 4: Selektion von Transformanten mit einem colorimetrischen Test auf Flüssigmedium oder Abdruck auf Agarmediumplatte oder Membran.
Dadurch, daß die Oxalatoxidase von dem Ort, wo sie exprimiert wird, wegdiffundieren kann, kann man zur Durchführung des colorimetrischen Tests nicht nur Wurzeln, sondern auch andere Träger verwenden.
4-1. Flüssigmedium
Die Selektion von Transformanten, die das Gen, das für das Weizen-Germin codieren, tragen, kann direkt in vitro an dem Kulturmedium nach Elimination der Agrobakterien durchgeführt werden. Nach Entfernung der unter Punkt c) von Beispiel 1, § 1.1, beschriebenen gelben Pflanzen, versetzt man das Kulturmedium oder eine von diesem Kulturmedium entnommene Probe mit der "Oxalatoxidase"-Reaktionsmischung und verfährt anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben, um die Emzymreaktion zu fördern und die so erhaltenen Produkte nachzuweisen.
4-2. Abdruck auf einer Membran
a) Sceening der jungen Pflanzen
Gemäß Beispiel 1, § 1.1, beschriebene transgene Rapssamen werden oberflächensterilisiert und in einer Plastikschachtel keimen gelassen, deren Boden mit mehreren Schichten Filterpapier und einer Membran aus PVDF, Hybond C oder Nitrozellulose, die üblicherweise für die Durchführung von Western-Blots verwendet werden, bedeckt ist. Die Samen werden auf der Membran auf einer Schablone, mit deren Hilfe ihre Lage ermittelt werden kann, aufgelegt. Die Membran wird mit sterilem Wasser befeuchtet; die Kiste wird anschließend verschlossen und ungefähr 8 Tage lang in einen Kulturraum gestellt. Wenn die Wurzeln der jungen Keimungen 1 bis 2 cm lang sind, werden die Pflänzchen in eine andere Kiste auf feuchtes Filterpapier umgesetzt, und zwar unter Beibehaltung der Lage, die sie auf der Membran eingenommen haben.
Die Membran wird anschließend gemäß einer Variante der oben in Beispiel 1, § 1.1, beschriebenen Vorschrift entwickelt:

– die Membran wird erst mit einer "Oxalatoxidase"-Reaktionsmischung (0,015 M Na-Oxalat in 0,05 M Bernsteinsäurepuffer, pH 4) getränkt und anschließend 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert,
– die Membran wird durch Versetzen mit dem Substrat (Phenol- oder aromatische Aminverbindung) entwickelt, zum Beispiel mit 0,03%igem 4-Chlor-1-naphthol in absolutem Ethanol und einer 0,0006%igen Peroxidaselösung in 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,6. Diese Entwicklung wird 2 Stunden lang bei 37°C durchgeführt.

Die Wurzelabdrücke von Pflanzen, die die Oxalatoxidase exprimieren, färben sich auf der Membran blau, wodurch man die zu behaltenden Transformanten identifizieren kann.
b) Screening anhand von mit Gewebeschnitten hergestellten Abdrücken
Es werden verschiedene Organe (Blätter, Blattstiele, Wurzeln, Stücke von Blüten usw.) von Pflanzen, die gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Schritte transformiert wurden, entnommen. Mit diesen frischen Proben wird mit Hilfe eines Skalpells ein Schnitt hergestellt, und die Schnittoberfläche wird fest gegen die Oberfläche einer Nitrozellulosemembran gedrückt. Nachdem einige Minuten lang an der Luft trocknen gelassen wurde, wird die Membran wie oben beschrieben entwickelt.
Beispiel 5: Verwendung eines samenspezifischen Promoters.
Das direkte Entwicklungssystem an den Wurzeln ist insbesondere dann von Interesse, wenn das interessierende Gen zu einem späteren Entwicklungsstadium, wie zum Beispiel im Samen, exprimiert wird.
5-1 Herstellung der Transformationsvektoren
Es wurde ein erster Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Lipase unter der Kontrolle des samenspezifischen PGEA1-Promoters von Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993, siehe Zitat oben) codiert, enthält, nach fachbekannten Klonierungsverfahren ausgehend von Sequenzen, deren Beschreibungen aus Genbank entnommen werden können, erzeugt: die 1641 Nukleotide lange Sequenz U02622, die für eine Lipase 1 von Geotrichum candidum, ATCC-Stamm 34614, codiert, wurde unter die Kontrolle der PGEA1-Promoternukleotidsequenz von Arabidopsis thaliana (Z11158, 1659 Nukleotide lang) gestellt und in einem pBluescript-Plasmid mit dem NOS-Terminator fusioniert.
Das oben erhaltene Fragment für den Transformationsschritt wurde wie in Punkt d) von Beispiel 2, § 2.1, beschrieben mit Hilfe der T4-DNA-Ligase mit dem für die Oxalatoxidase codierenden Gen in einen binären Vektor pBIN19 ligiert.
5-2 Transformation und Selektion
Die Transformation von Raps wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift mit Hilfe des oben beschriebenen von pBIN19 abgeleiteten Vektors durchgeführt, und die Selektion der Transformanten nach der Wurzelbildung nach einem der in Beispiel 1 oder Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, daß es mit dem erfindungsgemäßen direkten Entwicklungssystem im Wurzelstadium möglich ist, sehr früh Transformanten zu selektieren, die das interessierende Gen normalerweise zu einem späteren Entwicklungsstadium (Samen) oder in einem vegetativen Organ exprimieren, bei dem es sich nicht dasjenige handelt, an dem die Selektion durchgeführt wird.
Nach einer ähnlichen Vorschrift können auch Tabak-, Tomaten- und Blumenkohlpflanzen erhalten werden.
TABELLE 2 Zusammensetzung des für die Kultivierung der transformierten Sonnenblumenwurzeln verwendeten Kulturmediums M

Claims

Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die ein Protein exprimieren, das eine H₂O₂-produzierende Aktivität besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt (a) Transformation von Pflanzenzellen oder Explantaten mit Agrobacterium rhizogenes, das einen Vektor, der ein für ein H₂O₂-produzierendes Protein codierendes Gen trägt, in einem Zusammenhang, der seine Expression in dem Pflanzenmaterial gestattet, enthält, wobei diese Transformation die Bildung von transformierten Wurzeln induziert; (b) Selektion von transformierten Wurzeln, die dieses Gen enthalten und exprimieren, mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests; (c) Regeneration von Pflänzchen aus selektierten Wurzeln und Überprüfung der Expression des Gens, das für ein H₂O₂-produzierendes Protein codiert, in den erhaltenen Pflänzchen, wobei diese Überprüfung der Expression mit einem colorimetrischen Peroxidasetest durchgeführt wird; (d) phänotypisches Screening und gegebenenfalls molekulare Analyse der Nachkommenschaft der transgenen Pflanzen, was eine Selektion oder Bestätigung von erhaltenen transgenen Pflanzen, die nur das Transgen und nicht die T-DNA von A. rhizogenes enthalten, gestattet.
Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die ein interessierendes Gen und ein Gen; das für ein Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität codiert, exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: (a) Transformation von Pflanzenzellen oder Explantaten mit Agrobacterium rhizogenes, das eine rekombinante DNA, die gleichzeitig ein für ein H₂O₂-produzierendes Protein codierendes Gen enthält und ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, in einem Zusammenhang, der seine Expression in dem Pflanzenmaterial gestattet, enthält, wobei diese Transformation die Bildung von transformierten Wurzeln induziert; (b) Selektion von transformierten wurzeln, die das Gen, das für das interessierende Protein codiert enthalten und das Gen, das für ein H₂O₂-produzierendes Protein codiert exprimieren, mittels eines colorimetrischen Peroxidasetests; (c) Regeneration von Pflänzchen aus selektierten Wurzeln und Überprüfung der Expression des Gens, das für ein H₂O₂-produzierendes Protein codiert, in den erhaltenen Pflänzchen, wobei diese Überprüfung der Expression mit einem colorimetrischen Peroxidasetest durchgeführt wird; (d) phänotypisches Screening und gegebenenfalls molekulare Analyse der Nachkommenschaft der transgenen Pflanzen, um diejenigen Pflanzen, die nur das Transgen und nicht die T-DNA von A. rhizogenes enthalten, zu selektieren oder zu bestätigen; (e) gegebenenfalls Aufreinigung des produzierten interessierenden Proteins.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der colorimetrische Peroxidasetest gemäß Schritt (b) oder (c) in Gegenwart eines Substrats für das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität sowie in Gegenwart von Peroxidase zum Nachweis der H₂O₂-Bildung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem H₂O₂-produzierenden Protein um ein Protein mit Oxalatoxidaseaktivität handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit Oxalatoxidaseaktivität aus der Gruppe Oxalatoxidase aus Gerste, aus Sorghum, aus dem Moos Mnium menziesii oder Weizenkeim stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der colorimetrische Test in Schritt (b) an einer Wurzelprobe durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der colorimetrische Test in Schritt (b) an einem flüssigen Inkubationsmedium nach Entfernung der Agrobakterien durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der colorimetrische Test in Schritt (b) an dem von den transformierten Pflanzen auf einem mit Agar verfestigtem Medium oder auf einer Membran hinterlassenem Abdruck durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion in Schritt (b) in Gegenwart von Oxalsäure als Substrat für das Protein mit H₂O₂-produzierender Aktivität durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxalsäurekonzentration zwischen 5 und 50 mM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxalsäurekonzentration 15 mM beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der colorimetrische Test von Schritt (c) an einer Probe von Pflanzengewebe der erhaltenen Pflänzchen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem interessierenden Gen um ein interessierendes Gen, das während eines späten Entwicklungsstadiums exprimiert wird, handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den pflanzlichen Zellen um pflanzliche Zellen handelt, die von einer Hauptkulturart aus der Reihe Raps, Blumenkohl, Sonnenblume, Weizen, Mais, Gerste, Tabak, Soja, oder um eine Gemüseart wie Tomate, Melone, Salat, Zwiebel handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den pflanzlichen Zellen um Zellen von Kotyledonen, Hypokotylen oder Blütenschäften handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die pflanzlichen Zellen endogen keine Oxalatoxidase produzieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem interessierenden Protein um eine Endochitinase handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Protein aus der Gruppe Protein, das am Metabolismus von Ölen, Stärken, Proteinen, Aminosäuren, Lignin, Zellwandbausteinen oder an der Resistenz gegen Pathogene beteiligt ist, stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Protein den Pflanzen eine Resistenz gegenüber pathogenen Agenzien vermittelt.