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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bilden von Liposomen,
Liposomen, die dadurch erhalten werden, und ihre Verwendung insbesondere
bei pharmazeutischen Anwendungen.
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Die
Verwendung von Liposomen ist auf einer breiten Vielzahl von Gebieten
gut bekannt, einschließlich der
pharmazeutischen und kosmetischen Gebiete, wo sie als Träger für Arzneimittel
und andere Reagentien verwendet werden, die zum Aufbringen auf die
Haut geeignet sind.
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Zur
Herstellung von Liposomen sind verschiedene Verfahren bekannt. Beispielsweise
können
sie durch eine Dehydrierungs-/Rehydrierungstechnik hergestellt werden,
wobei ein Lipid in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform,
Dichlormethan, oder einem Alkohol, wie Methanol oder Ethanol, gelöst wird.
Anschließend
wird die Lösung
beispielsweise unter Verwendung eines Rotationsverdampfers getrocknet,
um einen Lipidfilm auf der Wand des Verdampfergefäßes zu bilden.
Die Zugabe von Wasser oder einer wässrigen Lösung, wie ein Puffer, zu dem
trockenen Film führt
zur Bildung von multilamellaren Liposomen. Dies bildet einen ersten
Schritt bei der Herstellung von Vesikeln unter Anwendung verschiedener
Verfahren. Die anschließende
Behandlung kann zur Dehydrierung/Rehydrierung von Vesikeln oder
DRVs führen
(Kirby und Gregoriadis, Biotechnology (1984) 2, 979–984). Die
anschließende
Behandlung durch Ultrabeschallung der Lipidsuspensionen unter Bildung
von beispielsweise unilamellaren Liposomen ist eine Alternative
(A. D. Bangham et al., J. Mol. Biol. 13, 238 (1965)).
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Weitere
Verfahren, die alle in der Technik gut dokumentiert sind, umfassen
Detergens-Entfernung (Y. Kagawa et al., J. Biol. Chem. (1971 246,
5477), Umkehrphasen-Eindampfen (F. Szoka und D. Papahadjopoulos,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1978) 75, 4194) und Etherinjektion
(D. Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, (1976) 433, 629) sowie
Gefriertrocknungsverfahren (siehe z.B. Ohsawa et al., Chem. Pharm.
Bull, (1984) 32, 2442–5
und Kirby und Gregoriadis (1984) supra) und Frost-Tau-Prozesse (D.
D. Lasic "Liposomes:
from Physics to Application, Elsevier, 1993, S. 98).
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Die
verschiedenen Herstellungsverfahren führen zu Liposomen unterschiedlicher
Größe und anderer Merkmale.
Liposomen können
zur Einkapselung von Materialien, wie biologisch aktive Materialien,
wie Pharmazeutika, einschließlich
von Impfstoffen sowie nicht pharmazeutischen Mitteln, wie Materialien,
die Einfluss auf die Haut nehmen, wie künstliche Bräunungspräparate oder andere Schönheitsmittel,
verwendet werden. Die Einkapselungstechniken variieren je nach Natur
des einzukapselnden Reagens und Größe und Merkmalen des erzeugten
Liposoms.
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Die
Größe der Liposomen
ist hinsichtlich ihrer Anwendung wichtig. Bei einigen Fällen können große Liposomen
erforderlich sein, beispielsweise wo Teilchen, die Mikroorganismen
wie Bakterien einschließen, beispielsweise
zum Impfstoffgebrauch, wie in der WO 95/09610 beschrieben, einzukapseln
sind.
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Für viele
Anwendungen sind allerdings kleine Liposomen bevorzugt. Der Grund
hierfür
besteht darin, dass kleine Liposomen im Vergleich zu großen Liposomen
(über 200
nm groß)
durch das reticuloendotheliale System (RES) weniger schnell und
zu einem geringeren Ausmaß entfernt
werden. Die Aufnahme durch das RES erhöht sich mit der Größe der Vesikel.
Außerdem
sind große
Liposomen, die in tramuskulär
injiziert werden, nicht in der Lage, die regionalen Lymphknoten
mit guter Effizienz zu erreichen und Impfstoffe und andere Mittel
an diesen Stellen abzugeben (Gregoriadis G. Liposomes as Drug Carriers:
Recent Trends and Progress, Wiley Chichester 1988).
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Liposomen-Formulierungen
verschiedener Arzneimittel können
bezüglich
Arzneimittelgehalt, Stabilität,
Biodistributionsmustern und Zellaufnahme durch Veränderung
der physiochemischen Parameter der Liposomen, wie Phasenübergangstemperatur,
Größe, Größenverteilung,
Oberflächenladung,
Oberflächenhydratation
mit Verbindungen, die lipophile Gruppen tragen, und Größenverteilung,
optimiert werden.
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Die
Liposomengröße ist ein
Parameter, der die durch das RES beseitigte Fraktion festlegt (Senior
et al., Biochem. Biophys. Acta (1985) 839, 1–8; Nagayasu et al., Biol.
Pharm. Bull. (1995), 18 (7), 1020–1023). Kleine Liposomen können unter
Verwendung von Hochdruckhomogenisatoren hergestellt werden (Talsma
et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1989), 15 (2),
197–207,
Vemuri S. et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1990)
16 (15), 2243–2256),
allerdings wurden bisher große
Mengen an Lipiden verwendet, um ein annehmbares eingeschlossenes
Arzneimittel-zu-Lipid-Masseverhältnis
zu erreichen. Ein anderer Weg (Gregoriadis et al., Int. J. Pharm.
65 (1990) 235–242),
die Mikrofluidisierung von multilamellaren dehydrierten/rehydrierten
Vesikeln (DRVS) in Gegenwart eines nicht eingekapselten Arzneimittels,
erzeugte Vesikel mit Größen von
weniger als 200 nm, wobei Mengen des ursprünglich eingeschlossenen gelösten Stoffs beibehalten
wurden.
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Die
Vesikel-Stabilisierungswirkung der Zugabe von Zucker nach der Herstellung
von Liposomen wurde bereits bewiesen (Crowe L. M. et al., Arch.
Biochem. Biophys. 242 (1985) 240–247, Hauser et al., Biochem. Biophys.
Acta (1987) 897, 331–334),
beispielsweise wenn Arzneimittel enthaltende Liposomen zur Aufbewahrung
gefriergetrocknet und sodann zur Verwendung rehydratisiert werden.
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WO-A-9735561
offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines
Reagens, wobei das Verfahren die Schritte umfasst
- (i)
Bilden von leeren Liposomen
- (ii) Mischen der Liposomen aus Schritt (i) mit einer Zuckerlösung und
einem Reagens; und
- (iii) Trocknen des Gemisches aus Schritt (ii).
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EP 0800822 offenbart ein
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus einem Regens,
wobei das Verfahren umfasst
- (i) Bilden von
leeren Liposomen
- (ii) Mischen mit einem Reagens und Füllen der Liposomen
- (iii) Mischen der gefüllten
Liposomen mit einer Zuckerlösung
- (iv) Trocknen des Gemisches.
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US 4,883,665 offenbart ein
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines Reagens, wobei das
Verfahren umfasst
- (i) Bilden von gefüllten Liposomen,
die Zucker und Reagens enthalten
- (ii) Mischen der gefüllten
Liposomen mit einer Zuckerlösung
- (iii) Trocknen des Gemisches aus (ii).
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WO86/01103
offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus
einem Reagens, wobei das Verfahren umfasst
- (i)
Bilden von leeren Liposomen
- (ii) Mischen mit einer Zuckerlösung
- (iii) Trocknen des Gemisches aus (ii)
- (iv) Mischen mit einem in die Liposomen einzufüllenden
Reagens.
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Die
Anmelder haben einen verbesserten Weg der Herstellung von Liposomen
und insbesondere von kleinen Liposomen gefunden, der die Anzahl
der Herstellungsschritte vermindert und stabile Liposomen mit hoher
Einschlusseffizienz bildet.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zur Herstellung einer Liposomen-Zubereitung bereitgestellt,
wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- (i)
Bilden von leeren Liposomen;
- (ii) Mischen der Liposomen aus Schritt (i) mit einer Zuckerlösung und
einem Wirkstoff; und
- (iii) Trocknen des Gemisches aus Schritt (ii);
dadurch
gekennzeichnet, dass das in Schritt (ii) eingesetzte Masseverhältnis von
Zucker zu Lipid 1:1 bis 6:1 Gew./Gew. beträgt.
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Bei
Rehydratation des getrockneten Materials aus Schritt (iii) werden
Liposomen gebildet, die den Wirkstoff einkapseln. Die Zunahme in
der Größe der so
erhaltenen Liposomen im Vergleich mit den in Schritt (i) erhaltenen
Liposomen ist viel geringer im Vergleich zu den Liposomen in Zubereitungen,
die keinen Zucker einschließen.
Die Notwendigkeit weiterer Extrusions-, Mikrofluidisierungs-, oder
Homogenisierungsschritte, wie vorstehend ausgeführt, kann somit vermieden werden.
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Es
wurde bewiesen, dass während
des Trocknens in Gegenwart von entsprechenden Konzentrationen an
Zuckern die Kondensation und Aggregation von Liposomen in einem
gewissen Ausmaß durch
die Bildung eines amorphen Glases (Crowe et al., Arch. Biochem.
Biophys. 242 (1985) 240–247)
und die Wechselwirkung des Zuckers mit den Phospholipid-Kopfgruppen
(Crowe et al., Cryobiology 31 (1994) 355–366) verhindert wird. Bei
früheren
Studien wurde die Dehydratation/Rehydratation von Vesikeln (DRV)
ohne Verwendung von Zuckern als Stabilisatoren durchgeführt, wobei
das Verfahren auf der Auslösung
der Kondensation/Aggregation der hergestellten kleinen unilamellaren
Vesikel unter kontrollierter Rehydratation beruhte (Kirby Gregoriadis, 1984).
Auf dieser Grundlage konnte vorhergesagt werden, dass die Gesamtstabilisierung
von kleinen unilamellaren Vesikeln durch die Gegenwart entsprechender
Mengen von Zuckern bei der Rekonstitution zu den unsprünglichen
SUV zu einem sehr geringen Einschluss führt.
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Unerwarteterweise
wurde gefunden, dass dies nicht der Fall ist. Obwohl wie bei sämtlichen
Liposomen der Reagens-Einschlussgrad zu einem gewissen Ausmaß von dem
Verhältnis
Lipid:Reagens in dem System abhängt,
wird erwartet, dass die Menge des Reagens, das in den Liposomen
eingekapselt ist, die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
erhalten werden, gut ist.
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Außerdem ist
die physikalische und chemische Stabilität der Liposomen für ihre Anwendung
als Arzneimittelabgabesystem erforderlich. Liposomen im Zustand
von wässrigen
Dispersionen unterliegen der Hydrolyse und physikalischen Änderungen
während
der Lagerung, einschließlich
Auslecken der eingekapselten Arzneimittel und Änderungen in der Vesikelgröße auf Grund
von Aggregation oder Kondensation. Die physikalische und chemische
Stabilität
der Liposomen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden,
ist erwartungsgemäß gut.
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Somit
ergibt sich durch dieses Verfahren die Möglichkeit, kleine, hoch beladene
Vesikel oder Liposomen zu erhalten, die, wie vorstehend ausgeführt, besonders
bei der Bildung von pharmazeutischen Zusammensetzungen brauchbar
sein können.
Somit kann dieses Verfahren zur Herstellung eingekapselter Materialien
vielerlei Arten verwendet werden.
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Es
ist allerdings besonders zur Herstellung von kleinen Liposomen zum
pharmazeutischen Einsatz geeignet. In diesem Fall umfassen die bei
dem Verfahren verwendeten Reagentien ein biologisch aktives Material,
wie ein Pharmazeutikum oder ein Arzneimittel. Für diesen Zweck sind die in
Schritt (i) erhaltenen Liposomen zweckmäßigerweise kleine unilamellare
Vesikel mit einer mittleren Größe beispielsweise
im Bereich von 25–90
nm, vorzugsweise im Bereich von 50–90 nm und zweckmäßigerweise
von 70–90
nm. Liposomen, die schließlich
durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden, sind immer noch klein, mit einer mittleren Größe von weniger
als 500 nm, üblicherweise
von 100–200
nm.
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Die
in Schritt (i) verwendeten Liposomen sind leere Liposomen, die durch
jedes der herkömmlichen Verfahren
erhalten werden, beispielsweise unter Verwendung eines klassischen
Verfahrens, wie vorstehend beschrieben. Alle hergestellten Liposomen
mit einer mittleren Größe, die
für den
gewünschten
Zweck zu groß ist,
können
beispielsweise unter Verwendung von Ultraschall-, Homogenisierungs-,
Extrusions- oder Mikrofluidisierungstechniken, wie aus der Technik
bekannt, verkleinert werden.
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Die
Lipide, die bei der Herstellung von Liposomen verwendet werden,
sind aus der Technik gut bekannt. Sie umfassen beispielsweise Lecithine,
wie Phosphatidylcholin (PC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC),
Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) oder geladene Lipide, insbesondere
anionische Lipide, wie Phosphatidinsäure oder kationische Lipide,
wie Stearylamin, gegebenenfalls in Gegenwart von Cholesterin. Ein
weiteres bevorzugtes Lipid ist DSPC. Die Wahl des Lipids hängt zu einem
gewissen Ausmaß von
der Natur des wirksamen Mittels und von dem beabsichtigten Zweck
des Liposoms ab.
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Geeignete
Zuckerlösungen
zur Verwendung in Schritt (ii) umfassen wässrige Lösungen von Monosacchariden,
wie Glucose und Fructose, Disacchariden, wie Lactose und Saccharose,
sowie Polysacchariden. Ein besonders bevorzugter Zucker zur Verwendung
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist ein Disaccharid, wie Saccharose oder Lactose, oder ein Monosaccharid,
wie Glucose. Insbesondere ist der Zucker Saccharose.
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Die
Menge des in Schritt (ii) verwendeten Zuckers ist so, dass das Masseverhältnis von
Zucker zu Lipid im Bereich von 1:1 bis 5:1 Gew./Gew. liegt. Es wurde
festgestellt, dass je größer die
vorhandene Menge an Zucker ist, desto geringer die Zunahme in der
Größe der nach
Rehydratation erhaltenen Liposomen im Vergleich zu denjenigen, die
in Schritt (i) erhalten werden, ist. Allerdings kann der Einschlussgrad
des Reagens geringer sein. Somit hängt die genaue Wahl der angewendeten
Verhältnisse
von der erforderlichen Endanwendung ab, wobei ein Gleichgewicht
zwischen Einschlussgrad für
einen gegebenen Lipidgehalt und Liposomengröße festgelegt wird. Der Unterschied,
den dies für
die Liposomenbildung ausmacht, variiert zu einem gewissen Ausmaß, in Abhängigkeit
von dem bestimmten eingesetzten Reagens, wie im Folgenden erläutert. Zweckmäßigerweise
ist die vorhandene Menge an Zucker geringer als 10% Gew./Vol. der
Zusammensetzung.
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Es
wurde ferner gefunden, dass eine Erhöhung des Volumens der bei dem
Verfahren eingesetzten Zuckerlösung
durch Herabsetzung der Konzentration der Zuckerlösung den Einschluss erhöht. Geeignete
Konzentrationen der Zuckerlösungen
betragen 20–60
mM, vorzugsweise 30–150
mM.
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Zusätzlich wurde
festgestellt, dass wenn die anschließende Rehydratation bei erhöhten Temperaturen,
beispielsweise von 30–80°C, insbesondere
von 40–65°C, und insbesondere
bei etwa 60°C,
durchgeführt wird,
die Einschlusswerte erhöht
werden können.
Es wurde festgestellt, dass dies für Liposomen zutrifft, die PC
und CHOL einschließen
und in der Regel bei Raumtemperatur gebildet werden. Im Vergleich
zu den Ausgangsliposomen kann bei Anwendung erhöhter Temperaturen auf diese
Weise eine gewisse Größenzunahme erfolgen,
und darum sollte dies bei der Wahl der speziellen Bedingungen, die
zur Herstellung der Liposomen eingesetzt werden, von Fall zu Fall
berücksichtigt
werden.
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Weitere
Faktoren, von denen eine Beeinflussung des Einschlusses festgestellt
wurde, umfassen die spezielle Natur des Reagens, wie des Arzneimittels,
das eingekapselt wird, und insbesondere seine Löslichkeit und die Menge des
vorhandenen Reagens. Die Löslichkeit
des Reagens kann in einigen Fällen
die Menge einschränken,
die in Schritt (ii) gelöst
und somit in das Liposom eingeschlossen werden kann. Weitere Faktoren, die
die Menge der Reagentien, die eingeschlossen werden, beeinflussen,
umfassen die Wechselwirkungen des Reagens mit den das Liposom bildenden
Lipiden und die Permeabilität
des Liposoms für
das Reagens.
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Wo
in der Lösung,
die in Schritt (ii) der Reaktion verwendet wird, hohe Reagens-Konzentrationen
vorhanden sind, kann der prozentuale Einschluss geringer sein. Darum
kann es aus wirtschaftlichen Gründen
ein Vorteil sein, die Menge des verwendeten Reagens herabzusetzen.
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Die
Wahl der Bedingungen, die Liposomen von gewünschter Größe und Beladung, einschließlich des Zuckers,
ergeben: Lipidmasse verhältnis,
Wahl des Lipids, Konzentration der verwendeten Zuckerlösung, Menge
des Reagens, das in die Lösung
eingeschlossen ist, und Temperatur der Rehydratation, kann unter
Anwendung von Routineverfahren für
ein bestimmtes Reagens bestimmt werden.
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Der
Trocknungsschritt (iii), vorstehend, kann unter Anwendung herkömmlicher
Verfahren, beispielsweise durch Gefriertrocknen, Sprühtrocknen,
Schnellkristallisation, Luftstromtrocknen (beispielsweise auf einem
Wirbelbett), Vakuumtrocknen, Ofentrocknen, oder jedes andere aus
der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Obwohl die mechanischen
Eigenschaften der Produkte dieser beiden Verfahren unterschiedlich
sein können,
wobei das Produkt eines Sprühtrocknungsverfahrens
ein diskretes und häufig
fließfähiges Pulver
ist, und das Gefriertrocknen einen festen Kuchen erzeugt, sind die
Eigenschaften der Liposomen bei der Rehydratation bezüglich ihrer
Stabilität
und ihres Einschlusses weitgehend ähnlich.
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Für viele
Anwendungen, einschließlich
der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, kann das
Sprühtrocknen
auf Grund der zweckmäßigen mechanischen
Eigenschaften des Produkts zur weiteren Verarbeitung bevorzugt sein.
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Das
Produkt des Gefriertrocknens umfasst einen Block von porösem Kuchen,
der relativ schlechte mechanische Eigenschaften aufweist. Der Einsatz
des Strahlmahlens des Kuchens zum Erreichen von besseren Eigenschaften
kann durchgeführt
werden, allerdings kann bei diesem zusätzlichen Schritt eine Beschädigung auftreten.
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Das
Sprühtrocknen
kann ein trockenes Produkt mit guten mechanischen Eigenschaften
ergeben, das durch Inhalation oder Rekonstitution in Wasser und
Verabreichung auf parenteralem Weg abgegeben werden kann.
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Der
anschließende
Rehydratationsschritt kann während
des Herstellungsverfahrens durchgeführt werden, oder alternativ
kann die Zusammensetzung im trockenen Zustand bereitgestellt und
am Ort der beabsichtigten Verwendung rehydratisiert werden, beispielsweise
im Krankenhaus oder in der Apotheke, wo den Patienten ein eingekapseltes
Pharmazeutikum zu verabreichen ist.
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Die
erhaltenen Liposomen besitzen eine gute Stabilität, was eine lange Lagerungsdauer
des Produkts bewirkt. Dies ist beispielsweise für Kosmetika, Toilettenartikel
und Pharmazeutika von Bedeutung.
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Wie
vorstehend besprochen, ist das Verfahren besonders bei der Herstellung
relativ kleiner Liposomen mit hoher Reagensbeladung geeignet. Dies
ist besonders für
pharmazeutische Anwendungen, wie Abgabe von Materialien, wie polymere
oder proteinartig Arzneimitteln, DNA-Impfstoffe, Gentherapie, Vektoren
oder Chemikalien wünschenswert.
Geeignete Chemikalien umfassen Antibiotika, wie Oxitetracycline, β-Lactam-Antibiotika,
wie Penicilline, wie Penicillin G, Ampicillin oder Amoxicillin oder
Cephalosporine, Antikrebsarzneimittel, Hormone, immuntherapeutische
Mittel, antivirale Mittel, antiinflammatorische Verbindungen etc.
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Die
unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens erhaltenen Liposomenprodukte
können
als pharmazeutische Zusammensetzungen beispielsweise durch ihre
Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Hilfsstoffen formuliert
sein. Die Formulierungen können
zur oralen, parenteralen, insbesondere intravenösen oder topischen Anwendung,
beispielsweise auf der Haut oder Schleimhautoberfläche geeignet
sein. Eine besonders geeignete erfindungsgemäße Zusammensetzung ist eine
Zusammensetzung, die für
die Anwendung über
ein Aerosol oder durch eine Inhalationsvorrichtung geeignet ist.
Für diesen
Zweck wurde festgestellt, dass neutrale Liposomen auf Lipidbasis
mit hohem Phasenübergang,
wie die aus Gemischen von DSPC und Cholesterin gebildeten, geeignet
sind. Bei erfindungsgemäßer Herstellung
braucht die Extrusion vor dem Trocknen nicht notwendig sein.
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Die
Erfindung wird nun insbesondere an Hand des Beispiels unter Bezugnahme
auf die beigefügten Zeichnungsdiagramme
beschrieben. Es zeigen:
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1 einen
Graph, der die Größenentwicklung
von Dipalmitoylphosphatidylcholin(DPPC)- und Cholesterin(CHOL)-Liposomen
von Ultrabeschallung bis Gefriertrocknung in Gegenwart von 0,375
M Saccharose und bei Rehydratation zeigt;
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2 einen
Graph, der die Wirkung der Molarität von Saccharose auf die PC:CHOL-Liposomen,
die FITC-Albumin einschließen,
auf die Größenverteilung
(% Verteilung:Intensität),
erhalten nach Gefriertrocknen und Rehydratation, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zeigt;
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3 einen
Graph, der die Wirkung der Saccharose-Molarität auf die Größenverteilung
nach der Rehydratation von PC:CHOL-Liposomen, die den epidermal
growth factor (EGF) einschließen,
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zeigt;
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4 einen
Graph, der einen Vergleich der Größenverteilung von extrudierten
und rehydratisierten PC:CHOL-Liposomen, die erfindungsgemäß hergestellt
wurden und FITC-Albumin einschließen, zeigt;
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5 einen
Graph, der die Größenverteilung
von extrudierten und gefriergetrockneten Liposomen, die durch das
erfindungsgemäße Verfahren
erhalten wurden und Carboxyfluorescein (CF) einschließen, zeigt;
und
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6 einen
Graph, der die Größenverteilung
verschiedener erfindungsgemäßer Liposomenzusammensetzungen
zeigt.
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In
den folgenden Beispielen wurden Ei-Phosphatidylcholin (PC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC)
und Distearoylphosphatidincholin (DSPC) von Lipoid GmbH, Ludwigshafen,
Germany; Cholesterin, Carboxyfluorescein (CF), Fluoresceinisothiocyanat
markiertes Albumin (FITC-Albumin), Riboflavin, Daunorubicin, Doxorubicin,
Triton X-100, Saccharose, Glucose und Natriumdodecylsulfat (SDS)
von der Firma Sigma, London bezogen. Der epidermal growth factor
(EGF) war ein Geschenk vom Center of Biological Sciences Havana,
Cuba. Na125I, 14C-markiertes
Hydroxypropylbetacyclodextrin, 14C-markiertes
Penicillin wurden von der Firma Amersham International (Amersham,
UK) bezogen. Das Markieren von EGF mit 125I
erfolgte nach dem Chloramin-T-Verfahren. Alle anderen Reagentien
waren analysenrein.
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Beispiel 1
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Gefriertrocknungsverfahren
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DRV-Liposomen,
die gelösten
Stoff enthielten, wurden wie folgt hergestellt: verschiedene Lipidgemische,
insbesondere Gemische von PC:CHOL und DPPC:CHOl, in einem Molverhältnis von
1:1 wurden in Chloroform gelöst.
Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels
an einem Rotationsverdampfer bei 37°C bildete sich an der Wand eines
Rundkolbens ein Film. Multilamellare Vesikel (MLV) wurden durch
Dispersion des Lipidfilms bei Temperaturen über der Lipidübergangstemperatur
(> Tc) (welche in
einigen Fällen
Raumtemperatur war) mit bidestilliertem Wasser erzeugt. Die Suspension
wurde entspre chend ultrabeschallt, um kleine unilamellare Vesikel
(SUV) herzustellen, die zur Entfernung der Metallteilchen zentrifugiert
wurden.
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Anschließend wurde
die SUV-Suspension in ein Röhrchen übergeführt, in
dem die gewünschte
Menge eines gewählten
Arzneimittels (entweder FITS-Albumin (1 mg), CF (1 mg), Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(2 mg) oder EGF (150 μg))
in Lösung
sowie 0,0357 M Saccharose vorgelegt waren, und Wasser wurde zugesetzt, so
dass die gewünschte
Molarität
der Saccharose erreicht wurde.
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Dann
wurde die Zubereitung eingefroren und anschließend lange genug (je nach Endvolumen)
gefriergetrocknet. Der trockene Kuchen wurde sodann durch Zugabe
von 100 μl
destilliertem Wasser der kontrollierten Rehydratation bei einer
Temperatur > Tc (z.B.
60°C) 15
min unterzogen. Die Zubereitung wurde in PBS verdünnt, damit
ein spezifisches Gewicht vorliegt, das die Abtrennung des freien
Arzneimittels von den Liposomen durch Ultrazentrifugation erlaubt.
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Die
Liposomengröße nach
der Rehydratation wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie
unter Verwendung eines 2C-Malvern-Autosizer (Malvern Instruments UK),
ausgestattet mit einem 25 mW Helium/Neon-Laser, bestimmt. Der mittlere
Durchmesser und die Größenverteilung
wurden erhalten.
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Die
Mittelwertsdurchmesser Z, die kumulative und differentielle Polydispersitätsindexverteilung,
wurden als Funktion der Saccharosemolarität oder, wo die DRV extrudiert
wurden, nach ihrer Größe aufgezeichnet.
Für die
Zubereitungen, die große
Größen aufwiesen,
(bis zu 6 Micron) wurde ein Mastersizer (Malvern) verwendet.
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Die
Einschlusswerte für
die Arzneimittel wurden nach Ultrazentrifugation der Liposomen bei
40000 × g
bestimmt. Die Menge an einge kapseltem Material wurde in % von insgesamt
verwendetem CF, FITC-Albumin, EGF oder Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
berechnet.
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Die
gesamte und die eingekapselte Menge von Carboxyfluorescein und FITX-Albumin
wurden durch Fluoreszenzphotometrie bei λEmission =
486 nm und λAnregung = 514 nm für CF und λEmission =
= 495 nm und λAnreung = 520 nm für FITC-Albumin aus dem mit
Triton oder SDS (5% Endkonzentration) gelösten Pellet gemessen. Die 14C-Emission von markiertem Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
wurde durch einen Radioaktivitätstest
in einem β-Scintillationszähler gemessen.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle
1
- * bezeichnet ein aus einem Gemisch von
32:32 μmol
PC:CHOL gebildetes Liposom;
- # = 16:16 μmol
PC:CHOL;
- ** + = 64:64 μmol
PC:CHOL; und
- ⊕ =
16:16 μmol
DPPC:CHOL
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Die
Ergebnisse zeigen, dass bei einem mäßigen Stabilisierungsgrad durch
Saccharose die Rekonstitution, die einen gewissen Grad an Kondensation
erlaubt (1), zu einem recht hohen prozentualen
Einschlußgehalt
führen
kann.
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Obwohl
eine ähnliche
prozentuale Einkapselung von FITC-Albumin in Gegenwart oder Abwesenheit von
40 mM Saccharose (87% bzw. 84%) erreicht werden kann, war die Endgröße für die Zubereitung
unter Verwendung von Saccharose viel kleiner.
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Durch
Variation der Molarität
von Saccharose in den verschiedenen Zubereitungen von FITC-Albumin enthaltenden
Liposomen (Tabelle 1) konnten verschiedene Größenverteilungen der Liposomen
erhalten werden (2), obwohl die Einschlusswerte
mit zunehmender Molarität
abnahmen.
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Die
Einkapselung von EGF und CF wurde in Gegenwart von Saccharose bei
verschiedenen Molaritäten
durchgeführt.
Die prozentualen Einschlusswerte entsprachen denjenigen, die mit
anderen Zubereitungen unter Verwendung der gleichen Menge an Lipiden,
allerdings unter Durchführung
in Abwesenheit von Saccharose, erhalten wurden (c.f. Tabelle 1).
In diesem Fall beeinflusste die Molarität der Saccharose nicht die
prozentualen Einschlusswerte, sondern nahm doch Einfluss auf die
Größen und
die Größeverteilung
(3).
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Die
Mittelwertsdurchmesser Z der DRV-Liposomen, die in Gegenwart oder
Abwesenheit von Saccharose erzeugt wurden, sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine kleinere Vesikelgröße erzielt
wird, wenn die Saccharose bei hoher Molarität verwendet wird, entsprechend
einer engeren Größeverteilung
und somit mäßigen prozentualen
Einschlusswerten. Die Werte des prozentualen Einschlusses sind proportional
zur Größe und Größenverteilungsbreite.
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Bei
zwei verschiedenen Saccharose-Molaritäten können wir fast die zwei gleichen
gemittelten Durchmesser zweier Vesikel-Populationen, die verschiedene
Breiten aufweisen, messen (3).
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Für Liposomen,
die EGF einschließen,
hergestellt bei 35,70 mM und 126 mM Saccharose, betrugen die zwei
gemittelten Durchmesser nach der Rehydratation 144,8 ± 32 nm
bzw. 146,4 ± 1,3
nm.
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Bei
Betrachten der Größenverteilung
stellen wir fest, dass sie für
die 126-mM-Saccharose-Zubereitung enger ist. Die Abnahme der Größe der Liposomen
und eine Verengung der Größenverteilung
unter Verwendung von hoch molarer Saccharose (über 36 mM) hatten keine niedrigen
Einschlusswerte zur Folge. Unter Verwendung von zwei verschiedenen
Saccharose-Konzentrationen (35,7 mM und 135 mM) wurde festgestellt, dass
Liposomen, die die gleiche Menge an CF einschließen (etwa 30%), mit engerer
Größenverteilung
(PDI = 0,13) hergestellt werden konnten als Liposome, die bei 135
mM Saccharose hergestellt wurden.
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Beispiel 2
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Vergleich der erfindungsgemäßen Liposomen
mit extrudierten Liposomen
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Um
das erfindungsgemäße Verfahren
mit demjenigen der Extrusion zu vergleichen, das ebenfalls eine Vesikelgrößenverminderung
bewirkt, verwendeten wir einen Extruder, um DRV-Liposomen, die ohne
Verwendung von Saccharose hergestellt wurden, zu behandeln. Die
Liposomen, die hergestellt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben,
wurden mit denjenigen verglichen, die durch ein Extrusionsverfahren
erhalten wurden.
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Die
ohne Saccharose hergestellten DRV-Liposomen wurden unter Verwendung
einer Hochdruckfilterfassung einer Extrusion unterzogen. Die Liposomen
wurden vor der Beseitigung von nicht eingeschlossenem gelöstem Stoff über Polycarbonatmembranen
passiert, deren Porengröße 1,2 μm, 0,4 μm, 0,2 μm und 0,1 μm betrug.
Bei jedem Extrusionsschritt wurden 5 Durchgänge durch die gleichen Membranen
durchgeführt.
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Sodann
wurde der freie gelöste
Stoff durch Ultrazentrifugation von den extrudierten Vesikeln abgetrennt.
Das Pellet wurde in 1 ml PBS (pH 7,4) suspendiert.
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Anschließend wurde
die Größe der Liposomen
wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Größenverteilung wurde mit derjenigen
von ähnlichen
Liposomen verglichen, die erhalten wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt.
Es wurde festgestellt, dass die extrudierten Liposomen eine engere
Verteilung der Vesikelgrößen zeigten.
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Der
Materialeinschluss in den Vergleichsliposomen wurde sowohl vor als
auch nach der Extrusion gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
2 gezeigt.
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Die
mittleren Durchmesser und Einschlusswerte sind in Tabelle 2 angegeben.
Sie zeigen, dass für
die extrudierten Liposomen geringe Einschlusswerte und eine enge
Größenverteilung
(PDI ≤ 0,1)
erhalten werden. Die geringen Einschlusswerte in Verbindung mit
dem Erfordernis eines zusätzlichen
Schritts (Extrusion) für
die Herstellung von Liposomen kleiner Größe vermindert die praktische
Anwendungsmöglichkeit
dieses Verfahrens wesentlich.
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5 zeigt
eine übereinander
gelegte Größenverteilung
von extrudierten Liposomen, die CF einschließen (6% Einschluss), und von
gefriergetrockneten Liposomen in Gegenwart von 135 mM Saccharose mit
30% eingekapseltem CF.
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Die
enge Größenverteilung
der durch die Extrusion erhaltenen Vesikelgröße ist nicht von hauptsächlicher
Bedeutung, da die entsprechenden prozentualen Einschlusswerte schlecht
sind.
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Beispiel 3
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Größenverteilung der erfindungsgemäßen Liposomen
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Durch
die Verwendung von Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur
kann sich diese Technik, die die Größenverteilungsbreite betrifft,
verbessern lassen. Dies wurde erreicht, wenn äquimolare DPPC:CHOL-Liposomen,
die EGF einschließen,
wie in Beispiel 1 beschrieben, in Gegenwart von 35,71 mM Saccharose
formuliert wurden. Die EGF-Einschlusswerte betrugen 25%. Allerdings
zeigten die Liposomen eine engere Größenverteilung (Mittelwert Z
= 128 nm) als die entsprechende PC:CHOL-Zubereitung. Die Ergebnisse
sind in 6 gezeigt. Somit scheint es,
dass in diesem Fall die Wahl der Lipide mit hohen Phasenübergangstemperaturen
bevorzugt ist, um Liposomen mit engerer Größenverteilung zu erzielen.
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Beispiel 4
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Hohe Einschluss-Ausbeute
an Riboflavin in kleinen Liposomen
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Zur
Herstellung kleiner unilamellarer Vesikel (SUV) durch Ultraschall
wurden äquimolares
Phosphatidylcholin (390 μmol)
und Cholesterin verwendet. Die SUV wurden sodann mit Riboflavin
(12 mg) und steigenden Mengen von Saccharose (0–5 mg pro mg Gesamtlipid) vermischt.
Die Gemische wurden sprühgetrocknet und
sodann rehydratisiert. Der Arzneimittel-Einschluss wurde in den
suspendierten Pellets der zentrifugierten Zubereitungen gemessen.
Die Größe der SUV
in den Vesikel-Endzubereitungen wurde durch Photokorrelationsspektroskopie
oder in einem Mastersizer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 angegeben.
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Es
scheint, dass das Sprühtrocknen
von kleinen Liposomen (SUF) in Gegenwart von Arzneimittel und Saccharose
(1 mg/1 mg Lipid) zu relativ kleinen Liposomen führt, die nahezu die Hälfte (47,5%)
der Menge des verwendeten Arzneimittels einschließen. Durch
Erhöhen
der Menge an vorhandener Saccharose wird die Vesikelgröße weiter
vermindert, allerdings mit einer gleichzeitigen Herabsetzung der
Einschlusswerte.
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Beispiel 5
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Liposomen, die Glucose
enthalten
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Die
Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, allerdings unter
Verwendung von Riboflavin als wirksames Mittel in einer Menge, um
eine Konzentration von 1 mg (insgesamt in 1 ml) in der Lösung zu
ergeben und in einigen Fällen
unter Verwendung von Glucose anstelle von Saccharose. Die Liposomengröße bei der
Rehydratation wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die
Riboflavin-Einkapselungseffizienz wurde durch Messen des gesamten
und des eingekapselten Riboflavins durch Fluoreszenzphotometrie
bei Emissionswellenlänge
= 480 nm und Anregungswellenlänge
= 520 nm berechnet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5
angegeben.
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Hinsichtlich
der Qualität
erzeugte die Zugabe von Glucose statt von Saccharose zu den SUV-Liposomen
die gleiche Stabilisierungswirkung. Die Einschlusswerte von Riboflavin
waren bei beiden Lipid-zu-Zucker-Verhältnissen
von 3 g/g und 5 g/g von Glucose oder Saccharose ähnlich (Tabelle 5).
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Die
durch Zugabe der äquivalenten
Menge an Glucose hergestellten Liposomen zeigten bei Rehydratation
im Vergleich zu den in Gegenwart von Saccharose hergestellten Proben
eine größere Vesikelgröße (Tabelle
4).
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Beispiel 6
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Wirkung der Rehydratationstemperatur
auf die Liposomenbildung
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Das
Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von äquimolaren
PC:CHOl-Liposomen, einer Saccharoselösung (68,7 mM) und 5 mg 14C-Penicillin (Pen G) als wirksames Mittel
wiederholt. In diesem Fall allerdings wurde die Rehydratation bei
verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Insbesondere wurden einige
Zubereitungen bei Raumtemperatur rehydratisiert, während andere
15 min bei 60°C
erwärmt
wurden.
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Die
Einschlusseffizienz wurde nach der Ultrazentrifugation der hergestellten
Liposomen bei 40000 g bestimmt, und sodann wurde die Radioaktivität von 14C-Penicillin als Prozentgehalt der Gesamtmenge
in Überstand
und Pellet ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
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In
der obigen Tabelle sowie in den folgenden Tabellen stellt "AV" die mittlere Liposomengröße dar, "SD" ist die Standardabweichung,
und "PDI" stellt die Größenverteilung
oder den Polydispersitätsindex
dar.
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Liposomen,
die bei Raumtemperatur rehydratisiert wurden, zeigten nur eine leichte
Zunahme in der Größe von 68
nm (ultrabeschalltes SUV) auf durchschnittlich nur 90 nm, gestatteten
allerdings im Durchschnitt eine Einkapselung von 6,5% des ursprünglich zugesetzten
Penicillins. Auch bei hohen Konzentrationen an Saccharose konnte
ein Grad an Einkapselung erreicht werden. Die 100-nm-Vesikel zeigen eine
prozentuale Einkapselung von 14%.
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Das
Erwärmen ähnlicher
Zubereitungen während
des Rehydratationsschrittes führt
zu größeren Vesikeln.
Liposomen eines mittleren Durchmessers von 230 nm konnten 24% des
ursprünglich
zugesetzten 14C-Penicillins einkapseln (Verhältnis von
3 g Saccharose/g Lipid). Die Erhöhung
der Saccharosemenge durch Erhöhen
des Masseverhältnis
von Zucker/Lipid von 3 auf 5 bewirkt etwas größere Vesikel, die eine geringere prozentuale
Einkapselung zeigen.
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Beispiel 7
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Einkapselung von 14C-Penicillin bei verschiedenen Saccharosekonzentrationen
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Das
Verfahren von Beispiel 6 wurde unter Verwendung von äquimolaren
PC:CHOL-Liposomen und 14C-Penicillin (5
mg) als wirksames Mittel, allerdings entweder mit einer hoch molaren
Saccharoselösung (68,78
mM) oder einer verdünnteren
Saccharoselösung
(35 mM), wiederholt.
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Die
Ergebnisse sind zusammen mit den Ergebnissen für die bereits in Tabelle 6
gezeigte 25-°C-Rehydratation
in Tabelle 7 gezeigt.
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Die
unter Verwendung einer niedermolaren Zuckerlösung hergestellten Liposomen
zeigten eine mittlere Größe von ca.
200 nm, die größer war
als bei denjenigen, die unter Verwendung einer hochmolaren Zuckerlösung hergestellt
wurden. Allerdings waren die Einschlusswerte höher und der Polydispersitätsindex
geringer.
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Darum
scheint es, dass die Herabsetzung der Molarität der Saccharose während der
Liposomenhersellung eine bessere Alternative zur Anwendung von hohen
Temperaturen (c.f. Beispiel 6) während
des Rehydratationsschrittes ist, um den Einschluss zu erhöhen. Obwohl
eine vergleichbare prozentuale Einkapselung erreicht wird, behalten
die Liposomen bei Verwendung von niedermolarer Saccharose kleinere
Größen bei.
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Beispiel 8
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DSPC-Liposomen-Zubereitung
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Das
Verfahren von Beispiel 6 wurde unter Verwendung von DSPC und äquimolarem
Cholesterin zur Herstellung von Liposomen wiederholt. Bei diesem
Experiment wurden eine hohe Saccharosemolarität (71 mM) und Penicillin (5
mg) verwendet.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die Erhöhung
der Saccharose-Menge zu einer Herabsetzung der Einschlusswerte von 14C-Penicillin und des mittleren Durchmessers
führte.
DSPC:CHOL-Liposomen zeigten im Vergleich zu PC:CHOL-Liposomen höhere Einschlusswerte
und kleinere Größen. Dies
kann auf der hohen Phasenübergangstemperatur (TC)
von DSPC beruhen, was eine höhere
Stabilität
beim Erwärmen
ermöglichte.
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Beispiel 9
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Doxorubicin-Einkapselung
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dDoxorubicin
enthaltende Liposomen wurden unter Verwendung der in Tabelle 9 ausgeführten experimentellen
Bedingungen hergestellt.
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Tabelle 9
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Experimentelle Bedingungen
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- Doxorubicin (1,3 mg/ml)
- Doxorubicin-Test bei einer Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge von
480 nm bzw. 560 nm.
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Liposomen-Zusammensetzungen
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Die
Größe der rehydratisierten
Liposomen wurde bestimmt, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben.
Die Einschlusswerte für
Doxorubicin wurden nach der Ultrazentrifugation bestimmt, wie vorstehend
beschrieben. Das gesamte und das eingekapselte Doxorubicin wurden
durch Fluoreszenzphotometrie bei einer Emissionswellenlänge von
490 nm und einer Anregungswellenlänge von 560 nm gemessen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
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Doxorubicin
wurde erfolgreich in kleinen Liposomen eingekapselt. Äquimolare
PC:CHOL-Liposomen, hergestellt mit 5 g Saccharose auf 1 g Lipid,
zeigten eine Größe von 160
nm und eine Einkapselungseffizienz von 45%. Eine Erhöhung des
Saccharose-zu-Lipidverhältnisses
beeinflusste die prozentuale Einkapselung nicht nennenswert. Der
Ersatz von PC mit DSPC erzeugte Liposomen, die eine höhere prozentuale
Einkapselung zeigten.
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Beispiel 10
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Auswirkungen zunehmender
Saccharosekonzentration
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Das
Verfahren von Beispiel 4 wurde unter Verwendung von schrittweise
höheren
Saccharosekonzentrationen wiederholt. Die verwendeten Konzentrationen
zusammen mit den Riboflavin-Einschlusswerten und die Liposomengröße-Ergebnisse
sind in Tabelle 11 gezeigt.
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Tabelle
11 Auswirkung
der Saccharosekonzentration auf den Einschluss von Riboflavin
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Die
Ergebnisse zeigen, dass bei hohen Saccharose/Lipid-Masseverhältnissen,
insbesondere über 10%
Gew./Vol. Saccharose, die Einschlusswerte gering sind, obwohl die
Stabilisierungswirkungen auf die Größe der Liposomen gut sind.
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Beispiel 11
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Desoxyfructo-serotonin(DFS)-Einkapselung
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Liposomen,
die DFS enthalten, wurden unter Verwendung der in Tabelle 12, nachstehend,
zusammengefassten Bedingungen hergestellt. Die Ergebnisse umfassen
die Einschlusswerte, und in dieser Tabelle ist auch die Größe nach
der Rehydratation gezeigt.
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In
diesem Beispiel wurden gute Einschlussniveaus sowie eine annehmbare
Größenstabilisierung
erzielt.