DE69910613T2

DE69910613T2 - METHOD FOR THE DOSED APPLICATION OF A LIQUID ON A SURFACE

Info

Publication number: DE69910613T2
Application number: DE69910613T
Authority: DE
Inventors: Robert Moerman; Johannes Frank; Cornelis Johannes MARIJNISSEN
Original assignee: Technische Universiteit Delft
Current assignee: Technische Universiteit Delft
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: WO2000035590A1; NL1010833C2; EP1140365A1; JP2002532230A; ATE247525T1; US7247272B1; AU1898400A; DE69910613D1; CA2355603A1; DK1140365T3; EP1140365B1

Abstract

The invention relates to a method of the dosed application of a liquid onto to selected portion of the surface of a substrate (A) by means of spraying under the influence of an electric current. According to the invention the liquid is fed at a flow rate between 0.01 pl/s and 1 ml/s to a distal tip ( 3 ) of a capillary ( 1 ) having an inside diameter of less than 150 mum, wherein the distance between the distal tip and the surface (A) is less than 2 mm. Surprisingly it has been shown that it is possible in this manner to apply liquid to a restricted surface of a defined size.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum dosierten Auftragen einer Flüssigkeit auf eine Oberfläche eines Substrates, worin die Flüssigkeit zu einer äußeren Spitze einer Kapillare mit einem Durchsatz zwischen 0,01 pl/s und 1 ml/s zugeführt wird, worin die äußere Spitze eine auf die Oberfläche gerichtete Ausflussöffnung aufweist, wobei der innere Durchmesser der Kapillare kleiner ist als 150 μm und eine Spannung zwischen der Ausflussöffnung und einer Gegenelektrode angelegt ist, bis der gewünschte Betrag an Flüssigkeit auf dem ausgewählten Bereich der Oberfläche aufgetragen ist.The present invention relates refer to a method for the metered application of a liquid on a surface a substrate in which the liquid to an outer tip a capillary with a throughput between 0.01 pl / s and 1 ml / s supplied is where the outer tip one on the surface directed outflow opening has, wherein the inner diameter of the capillary is smaller than 150 μm and a voltage between the orifice and a counter electrode is created until the desired one Amount of liquid on the selected one Area of the surface is applied.

Die WO 98/28745 beschreibt ein Verfahren zum Elektro-Spritzen von Lösungen zum Abscheiden von Substanzen wie biologische Makromoleküle in Form von Flecken und Filmen auf einem Substrat. Elektro-Spritzen wird mit einem Abstand vom Substrat von 10–40 mm durchgeführt. Die Anmeldung beschreibt eine Fokussiertechnik, um kleine Flecken von abgeschiedenem Material zu erzeugen. Dieses Dokument ist nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht worden.WO 98/28745 describes a method for electro-spraying solutions for separating substances like biological macromolecules in shape of stains and films on a substrate. Electro spraying will at a distance of 10-40 mm from the substrate. The Application describes a focusing technique to remove small spots to produce deposited material. This document is after priority published the present application Service.

Die vorliegende Erfindung wird charakterisiert durch einen Abstand zwischen der Ausflussöffnung und der Oberfläche, der kleiner ist als 2 mm.The present invention is characterized by a distance between the orifice and the surface, the is less than 2 mm.

Überraschend wurde vom Anmelder herausgefunden, dass mittels der Elektro-Spritz-Technik es möglich ist, Flüssigkeit auf einen sehr kleinen, ausgewählten Abschnitt aufzutragen (mit einem [maximalen] Durchmesser von 1 cm oder weniger), ohne dass irgendein wesentlicher Betrag der Flüssigkeit außerhalb des ausgewählten Abschnittes niedergeht. Dies wird auch dann nicht auftreten, wenn die Auftragungszeiten länger sind. Dann wird ein Tropfen ausgeformt ohne ungünstigen Einfluss auf das Verfahren.Surprised was found by the applicant that by means of electro-spray technology it possible is liquid on a very small, selected one Section to be applied (with a [maximum] diameter of 1 cm or less) without any substantial amount of liquid outside of the selected one Section. This will not occur even if the application times are longer. Then a drop is formed without adversely affecting the process.

Die EP-A-0258016 beschreibt ein elektrostatisches Beschichtungssystem, welches zur Auftragung einer sehr dünnen Be schichtung auf einem Substrat geeignet ist, worin mittels einer Potentialdifferenz eine Beschichtungsflüssigkeit auf einen Nebel von hochaufgeladenen Tröpfchen reduziert wird, wobei die aufgeladenen Tröpfchen in Richtung auf das Substrat angezogen werden. Da die aufgeladenen Tröpfchen das gleiche Vorzeichen aufweisen, stoßen sie sich gegenseitig ab, wobei eine im Wesentlichen regelmäßige (ebene) Beschichtung der Oberfläche erzielt wird.EP-A-0258016 describes an electrostatic Coating system which is used to apply a very thin coating is suitable on a substrate, wherein by means of a potential difference a coating liquid is reduced to a mist of highly charged droplets, whereby the charged droplets towards the substrate. Because the charged droplet have the same sign, they repel each other, with a substantially regular (flat) coating of the surface is achieved.

Der Ausdruck „Kapillare", wie er in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, soll derart verstanden werden, dass er irgendeinen Kanal bestimmt, durch den eine wasserähnliche Flüssigkeit passieren kann und für den Fall, dass die Weite der Kapillare angegeben ist, so bezieht sich diese (offensichtlich) auf den inneren Durchmesser des Kanales.The term "capillary" as used in the present invention used should be understood to mean that it is any Channel through which a water-like liquid can pass and for the If the width of the capillary is specified, it refers to this (obviously) on the inner diameter of the channel.

Wenn vom inneren Durchmesser der Kapillare die Rede ist, bezieht sich dies insbesondere auf den inneren Durchmesser der äußeren Spitze, die auf das Substrat gerichtet ist.If the inner diameter of the Capillary is mentioned, this refers particularly to the inner Diameter of the outer tip, which is directed to the substrate.

Wenn von der Anwendung einer Spannung zwischen der Ausflussöffnung und einer Gegenelektrode die Rede ist, dann umfasst dies, wie es für einen Fachmann leicht erkennbar ist, die Anwendung einer Spannung zwischen der Flüssigkeit in einer elektrisch nicht leitenden Ausflussöffnung der Kapillare und der Gegenelektrode.If from applying a voltage between the outflow opening and a counter electrode is mentioned, then this includes how it for one One skilled in the art can easily see the application of a tension between the liquid in an electrically non-conductive outlet opening of the capillary and the Counter electrode.

Auf diese Art und Weise ist es möglich, Flüssigkeit auf eine begrenzte Oberfläche mit einer bestimmten Abmessung zu bringen.In this way it is possible to liquid on a limited surface to bring with a certain dimension.

Dadurch wird das Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung besonders geeignet beispielsweise für die dosierte Auftragung einer Flüssigkeit auf ein Objekt zur Ausführung einer Analyse (Probe, Versuch). Das Objekt kann beispielsweise eine Mikrotitrierplatte sein; ein Substrat kann hergestellt werden unter Einsatz von bekannten Techniken aus der Halbleiterindustrie, beispielsweise durch Substrate auf Silikonbasis und ähnlichem.This makes the procedure corresponding the present invention particularly suitable for example for the dosed Applying a liquid on an object for execution an analysis (sample, trial). The object can be, for example Be a microtitration plate; a substrate can be manufactured using of known techniques from the semiconductor industry, for example through silicon-based substrates and the like.

Zur Durchführung einer Analyse enthält die Flüssigkeit vorzugsweise ein biologisches Teilchen, ausgewählt von einem einzelligen Organismus, einem Enzym, einem Sensor zur Detektion einer Nukleinsäuresequenz, einem Enzym, einem Rezeptor und einem Ligand. Es ist ebenso denkbar, dass kleine, mehrzellige Organismen und Gewebe zusammen mit der Flüssigkeit angewandt werden, unter der Bedingung, dass der innenseitige Durchmesser der Kapillare dies zulässt.To perform an analysis, the liquid contains preferably a biological particle selected from a unicellular organism, an enzyme, a sensor for detecting a nucleic acid sequence, an enzyme, a receptor and a ligand. It is also conceivable that small, multicellular organisms and tissues along with the liquid be applied on condition that the inside diameter the capillary allows this.

Als Sensor zur Detektion einer Nukleinsäuresequenz kann ein auf diesem Gebiet allgemein bekanntes Oligonukleotid verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird unter Rezeptor ein ligand-spezifisches Protein verstanden. Ein derartiger Rezeptor kann beispielsweise ein Membranenrezeptor sein. Entsprechend einer äußerst vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Rezeptor ein Antikörper. Es ist vorteilhaft, dass zumindest der ausgewählte Abschnitt der Oberfläche des Substrates in der Lage ist, unpolar (kovalent) an dem biologischen Teil zu koppeln.As a sensor for the detection of a nucleic acid sequence can use an oligonucleotide well known in the art become. In the present invention, a ligand-specific protein is used under receptor Roger that. Such a receptor can be, for example, a membrane receptor his. According to an extremely advantageous The receptor is an antibody. It it is advantageous that at least the selected section of the surface of the Substrate is capable of being non-polar (covalent) on the biological To couple part.

Entsprechend einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Anwendung in einer Atmosphäre ausgeführt, die im Wesentlichen mit Dampf aus der Flüssigkeit gesättigt ist.According to a preferred embodiment the application is run in an atmosphere that is essentially with Vapor from the liquid saturated is.

Dies vermindert die Möglichkeit eines Rayleigh Ausbrechens von geladenen Teilchen, und trägt somit dazu bei zu vermeiden, dass die Flüssigkeit außerhalb des ausgewählten Bereiches der Oberfläche zum Liegen kommt.This reduces the possibility a Rayleigh breakout of charged particles, and thus contributes to it at avoiding the liquid outside of the selected one Area of the surface comes to rest.

Entsprechend einer weiteren Ausgestaltung wird die Anwendung in einer Atmosphäre umgesetzt, die im Vergleich mit atmosphärischer Luft die Wahrscheinlichkeit der Entladung reduziert.According to a further embodiment, the application is implemented in an atmosphere that reduces the likelihood of discharge compared to atmospheric air.

Deshalb kann, solange eine mögliche biologische Aktivität von einem in der Flüssigkeit vorhandenen biologischen Teilchen im Wesentlichen nicht ungünstig beeinflusst wird, die Aussicht auf eine Beschädigung des Substrates vermindert werden, indem beispielsweise eine stickstoffverminderte Atmosphäre eingesetzt wird. Im Vergleich zur Luft enthält die Atmosphäre vorzugsweise einen relativ hohen Anteil von einem oder mehr Gasen mit einer relativ hohen Elektronenaffinität. Beispielsweise enthält die Atmosphäre in geeigneter Weise SF₆ oder einen erhöhten Anteil von CO₂.Therefore, as long as a possible biological activity is not substantially adversely affected by a biological particle present in the liquid, the prospect of damage to the substrate can be reduced by using, for example, a nitrogen-reduced atmosphere. Compared to air, the atmosphere preferably contains a relatively high proportion of one or more gases with a relatively high electron affinity. For example, the atmosphere suitably contains SF ₆ or an increased proportion of CO ₂ .

Eine sehr wichtige Ausgestaltung des Verfahrens entsprechend der vorliegenden Erfindung wird dadurch charakterisiert, dass nach der Auftragung der Flüssigkeit auf den ausgewählten Bereich der Oberfläche das Substrat und die Ausflussöffnung relativ zueinander bewegt werden in einer Ebene, die sich im Wesentlichen im rechten Winkel zu der Achse der Kapillare erstreckt, und dass ein zweiter ausgewählter Bereich der Oberfläche mit Flüssigkeit versorgt wird, wobei dieser zweite ausgewählte Bereich sich nicht mit dem ersten ausgewählten Bereich, an dem Flüssigkeit bereitgestellt ist, überlappt.A very important design the method according to the present invention characterized that after applying the liquid to the selected area the surface that Substrate and the orifice be moved relative to each other in a plane that is essentially extends at right angles to the axis of the capillary, and that a second selected Area of the surface with liquid is supplied, whereby this second selected area does not coincide with the first selected Area where liquid is provided overlaps.

Anstelle oder zusätzlich kann vorteilhaft eine Anordnung von Kapillaren verwendet werden, wobei die Kapillaren gegenseitig beabstandet sind, so dass die ausgewählten Oberflächen, auf die Flüssigkeit aufgebracht werden soll durch zwei benachbarte Kapillaren, sich nicht überlappen.Instead of or in addition, a Arrangement of capillaries are used, the capillaries are mutually spaced so that the selected surfaces are on the liquid to be applied through two adjacent capillaries do not overlap.

Mit Hilfe solcher Verfahren ist es möglich, eine große Anzahl von nicht überlappenden Teilbereichen auf dem Substrat ausgewählt zu bestimmen, wodurch eine große Anzahl von Analysen (Versuchen) gleichzeitig ausführbar ist.With the help of such procedures it is possible, a big Number of non-overlapping To determine sub-areas selected on the substrate, creating a size Number of analyzes (attempts) can be carried out simultaneously.

Entsprechend einer ersten Ausgestaltung ist die Gegenelektrode durch das Substrat dargestellt.According to a first embodiment the counter electrode is represented by the substrate.

In solch einem Fall enthält das Substrat einen Leiter oder Halbleiter oder selbige sind an dem Substrat appliziert.In such a case the substrate contains a conductor or semiconductor or the like are applied to the substrate.

Entsprechend einer alternativen Ausgestaltung wird eine Elektrode als Gegenelektrode verwendet, welche im Wesentlichen den ausgewählten Bereich der Oberfläche umgibt, und welche in der Umgebung der Oberfläche gehalten wird. In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck „in der Umgebung der Oberfläche" in der Nähe oder in einem Abstand von der Oberfläche mit der Bedeutung, dass in dem letzten Fall die Gegenelektrode normalerweise weniger als die halbe Entfernung zwischen der Spitze der Kapillare und dem Substrat beabstandet positioniert ist.According to an alternative embodiment an electrode is used as the counter electrode, which essentially the selected one Area of the surface surrounds, and which is held in the vicinity of the surface. In the present Registration means the expression "in the vicinity of the surface" near or at a distance from the surface meaning that in the latter case the counter electrode is normally less than half the distance between the tip of the capillary and is positioned spaced from the substrate.

Der Vorteil dieser Ausgestaltung liegt darin, dass nicht leitende Substrate, wie beispielsweise Mikrotitrierplatten aus Polystyren, mit Flüssigkeit belegt werden können unter zu Hilfenahme des Verfahrens entsprechend der vorliegenden Erfindung. Dies erlaubt den Einsatz von Substraten mit erhöhten Konzentrationen von beispielsweise Antikörpern, die schnell aufgetragen werden müssen, ohne Kostenerhöhung, was sich in einer geringeren Ausschussrate beim Startmaterial auswirkt, da lediglich kleine Volumina von Flüssigkeit auf der Oberfläche aufgetragen werden.The advantage of this design is that non-conductive substrates, such as microtitration plates made of polystyrene, with liquid can be occupied using the procedure according to the present Invention. This allows the use of substrates with increased concentrations for example antibodies, that need to be applied quickly without cost increase, which results in a lower reject rate for the starting material, since only small volumes of liquid are applied to the surface become.

Entsprechend einem wesentlichen Ausführungsbeispiel wird der Betrag der aufgetragenen Flüssigkeit mittels Strom und/oder Spannungseigenschaften gemessen.According to an essential embodiment the amount of liquid applied by means of electricity and / or Voltage properties measured.

Dies ermöglicht die Dosierung der Flüssigkeit, die während der Betriebszeit überwacht wird.This enables the liquid to be dosed, the while the operating time is monitored becomes.

Entsprechend einem bevorzugten Ausführungsbeispiel verändert sich der Durchsatz zwischen 1 pl/s und 1 nl/s und vorzugsweise zwischen 10 und 100 pl/s.According to a preferred embodiment changed the flow rate is between 1 pl / s and 1 nl / s and preferably between 10 and 100 pl / s.

Derartige Durchflussraten sind gut geeignet für die Anwendung kleiner Beträge von Flüssigkeit auf einem sehr kleinen (Teil)Bereich einer Oberfläche eines Substrates. Dabei könnte ein Bereich mit einem Oberflächenabschnitt von 1 mm² oder weniger betrachtet werden, und insbesondere 0,1 mm² oder weniger.Such flow rates are well suited for the application of small amounts of liquid on a very small (partial) area of a surface of a substrate. An area with a surface section of 1 mm ² or less could be considered, and in particular 0.1 mm ² or less.

Wenn Flüssigkeit auf einen kleinen, ausgewählten Bereich mit einem Oberflächenabschnitt von 1 mm² oder weniger aufgebracht wird, so beträgt der Abstand zwischen der Ausflussöffnung und der Oberfläche entsprechend einer vorteilhaften Ausgestaltung 200 bis 1.000 μm.If liquid is applied to a small, selected area with a surface section of 1 mm ² or less, the distance between the outflow opening and the surface is, according to an advantageous embodiment, 200 to 1,000 μm.

Entsprechend einer bevorzugten Ausgestaltung wird der ausgewählte Bereich auf der Oberfläche festgelegt durch Mittel zur Begrenzung der Flüssigkeitsversprühung über die Oberfläche.According to a preferred embodiment the selected one Area on the surface determined by means of limiting liquid spraying over the Surface.

Auf diese Art und Weise wird eine im Wesentlichen homogene Flüssigkeits-Beschichtung der Oberfläche auf dem ausgewählten Bereich erreicht und die Möglichkeit, dass Flüssigkeit außerhalb des ausgewählten Bereiches auftrifft, ist vermindert.In this way, one essentially homogeneous liquid coating the surface on the selected one Area reached and the opportunity that liquid outside of the selected area is reduced.

Entsprechend einer ersten Ausgestaltung wird ein Substrat verwendet, dessen Oberfläche ein Loch mit dem ausgewählten Bereich enthält, wobei dieser den Boden des Loches umfasst, worin eine Wand des Loches die über die Oberfläche versprühte Flüssigkeit enthält.According to a first embodiment a substrate is used, the surface of which is a hole with the selected area contains which comprises the bottom of the hole, wherein a wall of the hole the above the surface sprayed liquid contains.

Entsprechend einer zweiten Ausgestaltung ist das Mittel zur Vermeidung der Flüssigkeitsversprühung über die Oberfläche eine Barriere, ausgewählt von (i) einer hydrophilen Barriere und (ii) einer hydrophoben Barriere. In dem Fall einer polaren Flüssigkeit wird eine hydrophobe Barriere verwendet und bei einer unpolaren Flüssigkeit eine hydrophile.According to a second embodiment is the means to avoid liquid spray over the surface a barrier, selected of (i) a hydrophilic barrier and (ii) a hydrophobic barrier. In the case of a polar liquid a hydrophobic barrier is used and a non-polar one liquid a hydrophilic.

Ein weiteres Mittel, welches benutzt werden kann, ist eine aufgeladene Barriere mit einer Ladung, deren Vorzeichen das gleiche ist wie das der Flüssigkeit, die auf der Oberfläche aufgetragen ist.Another remedy that uses is a charged barrier with a charge whose Sign is the same as that of the liquid applied to the surface is.

Entsprechend einer alternativen und/oder zusätzlichen Ausgestaltung können die ausgewählten Zonen, in denen Flüssigkeit abzuscheiden ist, ausgestattet werden mit einem Wirkstoff, der das Versprühen über der Oberfläche der ausgewählten Zonen fördert. Dieses kann ein Zucker oder eine oberflächenaktive Substanz sein. Beispielsweise kann der Wirkstoff mittels einer Drucktechnik aufgetragen werden. Dieses unterstützt die Absicherung dafür, dass die Flüssigkeit wirklich den ausgewählten Bereich abdeckt. Dies ist insbesondere in Fällen wichtig, in denen der ausgewählte Bereich nicht rund ist, insbesondere wenn er winkelförmig ist und beispielsweise einen rechten Winkel aufweist.According to an alternative and / or additional embodiment, the selected Zo Those in which liquid is to be separated are equipped with an active ingredient that promotes spraying over the surface of the selected zones. This can be a sugar or a surfactant. For example, the active ingredient can be applied using a printing technique. This helps ensure that the liquid really covers the selected area. This is particularly important in cases where the selected area is not round, especially if it is angular and has a right angle, for example.

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die Figuren genauer erklärt, wobei die Figuren Folgendes darstellen: 1 zeigt eine Vorrichtung zur Umsetzung des Verfahrens entsprechend der vorliegenden Erfindung;The present invention will now be explained in more detail with reference to the figures, the figures showing the following: 1 shows an apparatus for implementing the method according to the present invention;

2 zeigt eine Einzelheit einer alternativen Ausgestaltung; und 2 shows a detail of an alternative embodiment; and

3 zeigt eine unterschiedliche Ausgestaltung einer Vorrichtung zur Umsetzung des Verfahrens entsprechend der Erfindung. 3 shows a different embodiment of a device for implementing the method according to the invention.

1 zeigt eine Kapillare 1 mit einer ersten Spitze 2 und einer zweiten Spitze 3. Die erste Spitze 2 steht in Verbindung mit einer 25 Mikroliter Hamilton Spritze 4. Diese Spritze 4 beinhaltet die Flüssigkeit, in dem vorliegenden Fall 0,3 M NaCl in einer Ethylen-Glykol-Wassermischung (70/30 vol.%/ vol.%), welche auf das Substrat A aufzutragen ist. In der dargestellten Ausgestaltung wird der Kolben 5 der Spritze 4 durch eine Harvard PHD 2000 Infusionspumpe 6 (Antec, Leiden, Niederlande) bewegt. Die Infusionspumpe 6 bewegt die Flüssigkeit B zu dem äußeren Ende 3 der Kapillare 1. Die verwendete Kapillare 1 weist einen inneren Durchmesser von 110 μm auf und einen äußeren Durchmesser von 210 μm. In der vorliegenden Ausgestaltung besteht die Kapillare 1 aus Metall. 1 shows a capillary 1 with a first tip 2 and a second tip 3 , The first tip 2 is connected to a 25 microliter Hamilton syringe 4 , That syringe 4 contains the liquid, in the present case 0.3 M NaCl in an ethylene glycol / water mixture (70/30 vol.% / vol.%), which is to be applied to the substrate A. In the illustrated embodiment, the piston 5 the syringe 4 by a Harvard PHD 2000 infusion pump 6 (Antec, Leiden, The Netherlands) moved. The infusion pump 6 moves the liquid B to the outer end 3 the capillary 1 , The capillary used 1 has an inner diameter of 110 μm and an outer diameter of 210 μm. In the present embodiment there is the capillary 1 made of metal.

Das Substrat A, welches schematisch in 1 dargestellt ist, ist eine halbleitende Silicium Mikroanordnung mit 25 Löchern, die mittels Nassätzen ausgeformt sind, unter Verwendung bekannter Techniken, die in der Halbleiterindustrie eingesetzt werden. Die Löcher waren rechtwinklig mit Seitenwänden von 200 μm. Die Tiefe war 20 μm. Das (halb)leitende Substrat A wird unterstützt durch eine Metallplatte 7. Die Kapillare 1 ist verbunden mit der positiven Elektrode der Hochspannungsquelle 9 (HCN 12500, Air Parts, Alphen aan de Rijn, Niederlande) über einen Metallhalter 8, der auch mehr als eine Kapillare umfassen kann.The substrate A, which is shown schematically in 1 is a semiconducting silicon microarray with 25 holes formed by wet etching using known techniques used in the semiconductor industry. The holes were rectangular with side walls of 200 μm. The depth was 20 μm. The (semi) conductive substrate A is supported by a metal plate 7 , The capillary 1 is connected to the positive electrode of the high voltage source 9 (HCN 12500, Air Parts, Alphen aan de Rijn, the Netherlands) using a metal holder 8th , which can also comprise more than one capillary.

Von der äußersten Spitze 3 der Kapillare 1 kann die Oberflächenspannung überwunden werden mittels der Hochspannung von beispielsweise 1–2 kV, angelegt mittels der Stromquelle 9, was sich in äußerst kleinen Tröpfchen auswirkt, die von der zweiten Spitze 3 zum Substrat A bewegt werden und insbesondere zu einem Loch C, welches darin vorhanden ist. Ein Loch kann mit mehr als einer Flüssigkeit gefüllt sein, so dass ein Versuch mit sehr kleinem Reaktionsvolumen ausgeführt werden kann.From the very top 3 the capillary 1 the surface tension can be overcome by means of the high voltage of, for example, 1-2 kV, applied by means of the current source 9 , which results in extremely small droplets from the second tip 3 be moved to the substrate A and in particular to a hole C which is present therein. A hole can be filled with more than one liquid so that an experiment with a very small reaction volume can be carried out.

Vor dem Anlegen der Potentialdifferenz wird eine überflüssige Flüssigkeit um die äußerste Spitze 3 herum entfernt. 2 zeigt, wie ein Bereich eines Substrates A beschichtet wird mit der Flüssigkeit. Die äußerste Spitze 3 der Kapillare 1 (mit einem äußeren Durchmesser von 210 μm und einem inneren Durchmesser von 110 μm) war in einem Abstand von 400–450 μm von der Oberfläche des Substrates A positioniert. Eine Spannung von 1,45 kV wurde angelegt und die Durchflussrate der Pumpe war 50 pl/s. Während des Spritzens für 2–40 Sekunden betrug der Durchmesser der Teiloberfläche, die mit Flüssigkeit beschichtet wurde, 300–350 μm. Tabelle I zeigt das Ergebnis der Messung für einen Durchsatz von 150 und 300 pl/s.Before applying the potential difference, an unnecessary liquid around the outermost tip 3 is removed. 2 shows how an area of a substrate A is coated with the liquid. The extreme tip 3 the capillary 1 (with an outer diameter of 210 μm and an inner diameter of 110 μm) was positioned at a distance of 400-450 μm from the surface of the substrate A. A voltage of 1.45 kV was applied and the flow rate of the pump was 50 pl / s. During spraying for 2-40 seconds, the diameter of the partial surface that was coated with liquid was 300-350 μm. Table I shows the result of the measurement for a throughput of 150 and 300 pl / s.

Wenn der Spritzvorgang für eine längere Zeit fortgeführt wird, wird die dünne Flüssigkeitsschicht auf dem ausgewählten Abschnitt einen Tropfen ausbilden, der keine nachteilige Wirkung auf den Spritzvorgang haben wird, und es wird nicht zu einem Abbruch führen.If the spraying process for a long time continued will, the thin liquid layer on the selected one Section form a drop that has no adverse effect will have on the spraying process and it will not stop to lead.

Tabelle I Durchmesser des ausgewählten Bereiches in μm

Table I Diameter of the selected area in μm

Ausgewählte Teile der Oberfläche des Substrates A können ebenso mit einer oligonukleotiden Substanz beschichtet werden. In der vorliegenden Erfindung ist unter einer oligonukleotiden Substanz jedes Nukleinsäurepolymer zu verstehen mit einer Länge, die geeignet ist für die ausgewählte Hybridisierung mit einem komplementären RNA- oder DNA- Strang in einer Probe, die zu untersuchen ist.Selected parts of the surface of the Substrate A can can also be coated with an oligonucleotide substance. In The present invention is under an oligonucleotide substance any nucleic acid polymer to understand with a length which is suitable for the selected one Hybridization with a complementary RNA or DNA strand in a sample to be examined.

Für einen Fachmann ist es offensichtlich, dass viele unterschiedliche Verfahren, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, zur Durchführung von Analysen mit dem Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispielsweise können die ausgewählten Bereiche ausgestattet werden mit (monoklonalen) Antikörpern, die unter schiedlich sein können oder auch nicht, und die in der Lage sind, ein Antigen (oder eine Variante eines Antigenes) zu erkennen, welches detektiert werden soll. Für den Fachmann wird es offensichtlich sein, dass es auch möglich ist, zusammen mit der Flüssigkeit Reagenzien aufzutragen wie ein Enzymsubstrat oder einen Wirkstoff zur Detektion der Gestalt eines Komplexes. Ebenso wird, wenn das biologische Teilchen zu immobilisieren ist, ein für die Anwendung von biologischen Teilchen geeignetes und im Stand der Technik bekanntes Substrat verwendet werden. Die Oberfläche kann dann in der Lage sein oder auch nicht, eine kovalente Bindung mit diesem Teilchen einzugehen. Für die nichtkovalente Immobilisierung der Nukleinsäuren ist es beispielsweise möglich, eine Goldoberfläche zu verwenden.For It is obvious to a professional that there are many different ones Methods that are well known in the art for execution analysis using the method according to the present invention can be used. For example the selected ones Areas are equipped with (monoclonal) antibodies that can be different or not and who are able to produce an antigen (or a Variant of an antigen) to recognize which are detected should. For it will be obvious to those skilled in the art that it is also possible along with the liquid Apply reagents such as an enzyme substrate or an active ingredient to detect the shape of a complex. Likewise, if that immobilizing biological particles is one for application biological particles suitable and known in the art Substrate are used. The surface may then be able to or also not to form a covalent bond with this particle. For the For example, it is noncovalent immobilization of the nucleic acids possible, a gold surface to use.

Die Gegenelektrode kann eine in sich geschlossene Struktur sein, deren Zentrum, wenn es auf die Oberfläche projiziert ist, im Wesentlichen mit dem Teil der Oberfläche zusammenfällt, welcher mit Flüssigkeit zu versorgen ist. Wenn die Gegenelektrode nicht auf der Oberfläche des Substrates platziert ist oder wenn sie nicht auf dieser abgestützt ist, so dass sie aus diesem Grund zwischen dem Substrat A und der zweiten Spitze 3 der Kapillare 1 platziert ist, dann wird die Oberfläche des Querschnittes der Gegenelektrode allgemein schmaler sein als der Oberflächenbereich des ausgewählten Abschnittes. In den meisten Fällen wird die Gegenelektrode eine ringförmige Elektrode sein, wobei jedoch andere Formen, insbesondere rechteckige Gegenelektroden ebenso möglich sind. Wenn eine Gegenelektrode verwendet wird, die nicht mit dem Substrat verbunden ist, so wird die Gegenelektrode allgemein nicht leitend verbunden sein mit der Kapillare 1 auf dauerhafte Weise und wird vorzugsweise anpassbar sein mit einem Abstand von der zweiten Spitze 3. Dies vereinfacht die reproduzierbare Auftragung von Flüssigkeit, wenn eine Spannung über die zweite Spitze 3 und die Gegenelektrode angelegt wird.The counter electrode can be a self-contained structure, the center of which, when projected onto the surface, essentially coincides with the part of the surface which is to be supplied with liquid. If the counter electrode is not placed on the surface of the substrate or if it is not supported on it, for this reason it is between the substrate A and the second tip 3 the capillary 1 is placed, the surface of the cross-section of the counter electrode will generally be narrower than the surface area of the selected section. In most cases the counter electrode will be an annular electrode, although other shapes, in particular rectangular counter electrodes, are also possible. If a counter electrode is used which is not connected to the substrate, the counter electrode will generally not be conductively connected to the capillary 1 in a permanent manner and will preferably be adjustable at a distance from the second tip 3 , This simplifies the reproducible application of liquid when a voltage is applied across the second tip 3 and the counter electrode is applied.

Wenn die Flüssigkeit auf nicht runde Teile der Oberfläche aufgetragen werden soll, ist es ratsam, eine Kapillare und/oder eine Gegenelektrode mit einer nicht runden Form zu verwenden. Die Gegenelektrode kann eine nicht flache Gegenelektrode sein. Mit diesem Typ von Gegenelektrode ist der Abstand von irgendeinem Punkt der Elektrode zu der äußersten Spitze 3 der Kapillare 1 im Wesentlichen gleichbleibend.If the liquid is to be applied to non-round parts of the surface, it is advisable to use a capillary and / or a counter electrode with a non-round shape. The counter electrode can be a non-flat counter electrode. With this type of counter electrode, the distance is from any point of the electrode to the extreme tip 3 the capillary 1 essentially constant.

Es ist denkbar, dass es nicht die Kapillare 1 ist, die mit der Stromquelle verbunden ist, sondern die Spannung zwischen der zweiten Spitze 3 und der Gegenelektrode wird in einer unterschiedlichen Art aufgebracht. Eine Möglichkeit besteht beispielsweise darin, dass eine Elektrode (nicht dargestellt) in die aufzubringende Flüssigkeit eingeführt wird, welche als die erste Elektrode mit der Hochspannungsquelle verbunden ist und dass die zweite Elektrode durch das Substrat dargestellt wird.It is conceivable that it is not the capillary 1 which is connected to the power source but the voltage between the second tip 3 and the counter electrode is applied in a different way. One possibility is, for example, that an electrode (not shown) is introduced into the liquid to be applied, which is connected to the high-voltage source as the first electrode and that the second electrode is represented by the substrate.

Eine derartige Ausgestaltung kann insbesondere nützlich sein, wenn eine Anordnung von Kapillaren verwendet wird, wobei jede dieser durch eine individuelle Spannung aktiviert ist. In einem solchen Fall können die Spritzen durch eine Pumpe individuell angetrieben werden. Wenn die Gefahr besteht, dass benachbarte Kapillaren sich gegenseitig beeinflussen, so wird der Abstand zwischen den Kapillaren ebenso vergrößert werden wie etwa verdoppelt, und solche Teile der Oberfläche, die nicht durch eine Kapillare abgedeckt sind, können mit Flüssigkeit versorgt werden, nachdem die Anordnung oder das Substrat geeignet verschoben worden sind.Such an embodiment can particularly useful if an array of capillaries is used, each this is activated by an individual tension. In one in such a case they can Syringes are individually driven by a pump. If the There is a risk that neighboring capillaries influence each other, so the distance between the capillaries will also be increased how about doubled, and those parts of the surface that are not covered by a capillary can be covered with liquid can be supplied after the assembly or substrate is suitable have been moved.

Wenn mehr als eine Kapillare verwendet wird, so kann die Spannung zwischen einer ersten Kapillare und dem Substrat eine entgegengesetzte Polarisation zu der zwischen einer benachbarten Kapillare und dem Substrat aufweisen. Insbesondere ist es dann möglich, einen ausgewählten Abschnitt der Oberfläche mit zwei (oder mehreren) Kapillaren zu befüllen. Dies begrenzt weiterhin die Versprühen der Flüssigkeit außerhalb des ausgewählten Bereiches. Dies bezieht sich sowohl auf die Abdeckung mit versprühter Flüssigkeit als auch auf die bereits aufgetragene Flüssigkeit. Die Neutralisierung bedeutet ebenso, dass weniger oder keine Übertragung von Ladung durch das Substrat überhaupt notwendig ist, wodurch weiterhin der Bereich des Substrates vergrößert wird, der verwendet werden kann, ohne separate Elektroden, die gegen die Oberfläche gehalten werden müssen. In der hier beschriebenen Lage kann es vorteilhaft sein, dass die äußersten spitzen der Kapillaren, die dem Substrat gegenüber liegen, sich nicht zueinander parallel erstrecken, sondern unter einem Winkel. Vorzugsweise sind sie beide auf das Zentrum des ausgewählten Bereiches gerichtet. Der Einsatz (vorzugsweise simultan) von zwei (oder mehreren) Kapillaren für die Auftragung von Flüssigkeit auf einen ausgewählten Bereich bietet ebenso verschiedene Möglichkeiten zur Umsetzung von Reaktionen zwischen verschiedenen Flüssigkeiten, die durch die Kapillaren geliefert werden. Es ist insbesondere auf die Tatsache hinzuweisen, dass Flüssigkeiten mit dem Verfahren entsprechend der Erfindung übermäßig gut gemischt werden können.If more than one capillary is used the tension between a first capillary and the A polarization opposite to that between a substrate have adjacent capillary and the substrate. In particular is it then possible a selected one Section of the surface to be filled with two (or more) capillaries. This continues to limit the spraying the liquid outside the selected area. This applies to both the sprayed liquid cover as well as on the already applied liquid. The neutralization also means that there is little or no transfer of charge through the substrate at all is necessary, which further increases the area of the substrate, which can be used without separate electrodes against the surface must be kept. In the situation described here, it may be advantageous that the outermost tips of the capillaries, which lie opposite the substrate, do not face each other extend parallel but at an angle. Are preferred they both point to the center of the selected area. The use (preferably simultaneously) of two (or more) capillaries for the Application of liquid on a selected one The area also offers various options for implementing Reactions between different liquids through the capillaries to be delivered. It is particularly important to note the fact that liquids can be mixed excessively well with the method according to the invention.

Die durch das Verfahren entsprechend der Erfindung aufzutragenden Flüssigkeiten) müssen eine ausreichende Leitfähigkeit erfüllen, wie es im Stand der Technik bereits bekannt ist. Wie oben erwähnt kann die Flüssigkeit Wirkstoffe enthalten, jedoch ebenso Wirkstoffe auf Trägern oder Trägern, auf die Wirkstoffe aufgetragen werden sollen. Mittels des Verfahrens entsprechend der Erfindung ist es beispielsweise möglich, auf einen ausgewählten Bereich des Substrates eine kolloidale Lösung von Gold, Latex oder ähnlichem aufzutragen. Derartige Substanzen sind bekannt dafür, dass sie vortreffliche Träger für Nukleinsäuresensoren und Antikörper sind.The through the procedure accordingly liquids to be applied according to the invention) have to sufficient conductivity fulfill, as is already known in the prior art. As mentioned above the liquid Contain active substances, but also active substances on carriers or carriers, to which active ingredients are to be applied. By means of the procedure according to the invention, it is possible, for example, on a chosen Area of the substrate a colloidal solution of gold, latex or the like apply. Such substances are known for they excellent carriers for nucleic acid sensors and antibodies are.

Zusätzlich zur Veränderung der Spannung oder des Aus/Einschaltens des Spritzvorganges ist es auch möglich, gleichzeitig oder alternativ den Abstand zwischen der Kapillare und dem Substrat zu erhöhen. Dies benötigt vorzugsweise nur eine kurze Zeit, wie einen Bruchteil einer Sekunde. Es hat gezeigt werden können, dass eine Erhöhung des Abstandes die Form des Konus der Flüssigkeit nicht wesentlich verändert und dass die Anwendung der Flüssigkeit reproduzierbar ist.In addition to the change voltage or switching the spraying process on / off also possible, at the same time or alternatively the distance between the capillaries and increase the substrate. This is needed preferably only a short time, such as a fraction of a second. It has been shown that an increase the distance does not significantly change the shape of the cone of the liquid and that the application of the liquid is reproducible.

Um ein reproduzierbares Anfangsverhalten zu erzielen und all- gemein die Regelung der Auftragung zu maximieren, kann es ratsam sein, Informationen über den Flüssigkeitsmeniskus der zweiten Spitze 3 zu erhalten. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, beispielsweise durch Messen der Kapazität (durch Verwendung eines Wechselstromes, der einem Hochspannungsgleichstrom überlagert ist), oder durch optische Mittel. In letzterem Fall kann eine Veränderung der Form des Flüssigkeitsmeniskus vorteilhaft eingesetzt werden. Beispielsweise ist es möglich, Licht über die erste Spitze 2 in die Kapillare 1 einzukoppeln, wobei die Kapillare 1 als Wellenleiter dient. Der Betrag an reflektiertem Licht durch den Meniskus wird gemessen, um als Parameter für den Betrieb der Pumpe zu dienen und zur Ermittlung des Anfangsverhaltens (der ersten Ausbildung von Mikrotröpfchen). Dieses Verhalten wird von der verwendeten Flüssigkeit und den Substanzen abhängen, die sie enthält, wie etwa Salze.In order to achieve a reproducible initial behavior and generally to maximize the regulation of the application, it can be advisable to obtain information about the liquid meniscus of the second tip 3 to obtain. This can be accomplished in several ways, for example by measuring capacitance (using an alternating current superimposed on a high voltage direct current) or by optical means. In the latter case, a change in the shape of the liquid meniscus can be used advantageously. For example, it is possible to light over the first tip 2 into the capillary 1 couple with the capillary 1 serves as a waveguide. The amount of reflected light through the meniscus is measured to serve as a parameter for the operation of the pump and to determine the initial behavior (the initial formation of microdroplets). This behavior will depend on the liquid used and the substances it contains, such as salts.

Eine geeignete Ausführung der Vorrichtung zur Anwendung der vorliegenden Erfindung wird in 3 dargestellt. In einem Kunststoffblock 7 werden Kapillaren 1 bereitgestellt. An diesem Ende ist beispielsweise eine flache Seite des ersten Kunststoffteiles mit Schlitzen ausgestattet, hinter diesem ist ein zweiter Teil an der Seite mit den Schlitzen angebracht, womit die Kapillaren 1 ausgebildet werden. Die Kunststoffteile können verbunden sein, beispielsweise unter Verwendung von Klebstoffen oder anderen bekannten Techniken. Die Leiter können mit Behältern 8 ausgestattet sein, die in ein drittes Kunststoffteil vertieft sind, wobei jedes davon, an einer naheliegenden Seite der Kapillaren 1, in Verbindung mit einer Kapillare steht. Die Kunststoffteile können auf irgendeine bekannte geeignete Art hergestellt werden, wie durch Spritzgießen oder Heißprägen. Die Flüssigkeit kann von einem Behälter 8 mittels (Gas)Druck, mit dem sämtliche Behälter 8, oder jeder Behälter einzeln bedient werden, verlagert werden.A suitable embodiment of the device for applying the present invention is disclosed in 3 shown. In a plastic block 7 become capillaries 1 provided. At this end, for example, a flat side of the first plastic part is provided with slots, behind which a second part is attached to the side with the slots, with which the capillaries 1 be formed. The plastic parts can be connected, for example using adhesives or other known techniques. The ladder can with containers 8th be equipped, which are recessed into a third plastic part, each of which, on an adjacent side of the capillaries 1 , is connected to a capillary. The plastic parts can be made in any known suitable manner, such as by injection molding or hot stamping. The liquid can be from a container 8th by means of (gas) pressure with which all containers 8th , or each container can be operated individually.

An ihrem äußeren Ende sind die Kapillaren 1 ausgestattet mit Ausflussöffnungen. Diese wird vorzugsweise mittels eines Chips gefertigt, der ausgestattet ist mit Öffnungen unter Einsatz von Techniken, die aus der Halbleiterindustrie bekannt sind. Herkömmlicher Weise ist dieser Chip ebenso mit Elektroden ausgestattet.The capillaries are at their outer end 1 equipped with outflow openings. This is preferably produced by means of a chip which is equipped with openings using techniques which are known from the semiconductor industry. Conventionally, this chip is also equipped with electrodes.

Entsprechend der Erfindung kann die Gegenelektrode die ausgewählte Oberfläche, auf welche Flüssigkeit aufzubringen ist, abdecken, während die die ausgewählte Oberfläche umgebende Oberfläche nur geringfügig leitet oder überhaupt nicht leitet. Ebenso ist es möglich, dass die ausgewählte Oberfläche grundlegend eine Oberfläche ist, die geringfügig oder überhaupt nicht leitet und dass sie mit einer großen Anzahl von kleinen Elektroden ausgestattet ist, die über die ausgewählte Oberfläche verteilt sind. Solche Ausgestaltungen können mittels allgemein bekannter Herstellungstechniken für Halbleiter gefertigt werden.According to the invention, the counter electrode can cover the selected surface on which liquid is to be applied, while the surface surrounding the selected surface can only be used leads slightly or does not lead at all. It is also possible that the selected surface is basically a surface that conducts little or not at all and that it is equipped with a large number of small electrodes which are distributed over the selected surface. Such configurations can be manufactured using generally known semiconductor manufacturing techniques.

Eine Gegenelektrode kann ebenso unterhalb der ausgewählten Oberfläche eingesetzt werden, wobei die ausgewählte Oberfläche geringfügig leitet oder überhaupt nicht. Die Stärke des dünn aufgebrachten Filmes bestimmt jedoch weitgehend den Betrag der Flüssigkeit, der auf die ausgewählte Oberfläche aufgebracht werden kann. Im Allgemeinen wird die Stärke nominell sein. Entsprechend einem besonderen Aspekt der Erfindung kann diese Beschränkung, die von einer Ladungsanhäufung auf der ausgewählten Oberfläche her resultiert, vorteilhaft genutzt werden, um den Betrag von auf der ausgewählten Oberfläche aufgebrachter Flüssigkeit ökonomisch zu gestalten.A counter electrode can also be underneath the selected one surface be used, the selected surface conducts slightly or at all Not. The strenght the thin applied film largely determines the amount of liquid, the selected one surface can be applied. In general, the strength becomes nominal his. According to a particular aspect of the invention, this can restriction that of a cargo accumulation on the selected one surface forth results, used advantageously to the amount of on the selected one surface applied liquid economically to design.

Das Verfahren entsprechend der Erfindung kann ebenso für die Anwendung einer Flüssigkeit verwendet werden, die bei tiefe ren Temperaturen erstarrt (etwa wie Agarose oder ähnliches) oder die aushärtet (beispielsweise Acrylamid), ein fließendes wasserhaltiges Gel, welches einen bestimmten Betrag an Formstabilität aufweist. Optional kann das Verfahren entsprechend der Erfindung angewandt werden, um nachfolgend eine oder mehrere weitere Flüssigkeiten aufzutragen, wie Flüssigkeiten, die einen Wirkstoff enthalten.The method according to the invention can also be used for the application of a liquid can be used, which solidifies at lower temperatures (such as Agarose or the like) or that hardens (e.g. acrylamide), a flowing water-containing gel, which has a certain amount of dimensional stability. Optionally, that can Processes according to the invention are applied in the following one or more other liquids to apply like liquids, that contain an active ingredient.

Claims

A method of dosing a liquid onto a surface of a substrate, wherein the liquid is supplied to an outer tip of a capillary at a flow rate between 0.01 pl / s and ml / s, wherein the outer tip is an orifice directed towards the surface of the substrate has and a voltage for electro-spraying is applied between the outflow opening and a counter electrode until the desired amount of liquid is applied to the selected area of the surface, characterized in that the inner diameter of the capillary is less than 150 microns and the distance between the Outflow opening and the surface is less than 2 mm.

A method according to claim 1, characterized in that an object is used as a substrate for carrying out an analysis becomes.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that that the liquid has a biological particle which is selected from a single-cell organism, an enzyme, a sensor for detection a nucleic acid sequence, an enzyme, a receptor and a lignand.

A method according to claim 3, characterized in that an antibody as a receptor is used.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the throughput fluctuates between 1 pl / s and 1 nl / s, and preferably between 10 n and 100 pl / s.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the distance between the orifice and he surface between 200 and 1000 μm lies.

Method according to one of the preceding claims, characterized marked that the selected area the surface by means of restriction the spread of the liquid over the surface is limited.

A method according to claim 7, characterized in that a substrate is used, the surface of which is a borehole with the selected area which is present at the bottom of the borehole wherein a wall of the borehole limits the spread of the surface.

A method according to claim 7 or 8, characterized in that the means of preventing the liquid from spreading over the surface is a barrier that under i) a hydrophilic barrier and ii) selected a hydrophobic is.

Method according to one of claims 7 to 9, characterized in that that a charged barrier with a Charging whose sign is the same as that of the liquid to the surface is applied.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the application is carried out in an atmosphere which is essentially saturated is with vapor of the liquid.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the application is carried out in an atmosphere the compared to the atmospheric Air the possibility the discharge is reduced.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that after applying the liquid to the selected area the surface the substrate and the orifice relative to be moved to each other in a plane that is essentially extends perpendicular to the axis of the capillary, and that a second chosen Area of the surface liquid supplied the second selected Area does not overlap with the first selected area with liquid.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that an arrangement of capillaries is used wherein the capillaries are spaced from each other so that the selected one surface on which the liquid to be applied through two adjacent capillaries do not overlap.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the counter electrode is represented by the substrate is.

Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that an electrode as a counter electrode is used, this electrode essentially covering the selected area the surface surrounds and which is present near the surface.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the amount of liquid applied is measured by means of current and / or voltage properties.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that a gelling liquid is applied to the selected one Area of the surface.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the counter electrode is provided below the selected one surface and is covered with a substantially insulating thin film.