DE69908805T2

DE69908805T2 - Meningokokkus multikomponentimpfstoff

Info

Publication number: DE69908805T2
Application number: DE69908805T
Authority: DE
Inventors: Andrew Salisbury ROBINSON; Andrew R. Salisbury GORRINGE; Michael John Salisbury HUDSON; Karen M. Salisbury REDDIN
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Health Protection Agency
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: PT1126874E; JP2002528515A; JP2012025774A; DE69908805T3; EP2248535A1; BR9914946A; GB9823978D0; DK1126874T3; ES2197688T3; ATE242640T1; DK1126874T4; EP1297844A2; WO2000025811A2; EP1126874B1; ES2197688T5; AU760858B2; EP1126874B2; CA2349331A1; DK1126874T5; EP1297844A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Multikomponentenvakzin und Verfahren zur Herstellung eines Multikomponentenvakzins, das schützende Immunität gegenüber einem breiten Spektrum von Infektionen durch Gram negative Pathogene verleiht. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Multikomponentenvakzin, das sowohl passive als auch aktive schützende Immunität gegen Meningococcenerkrankungen bereitstellt.
Die Meningococcenmeningitis ist ein großes Problem weltweit und in vielen Ländern steigt die Häufigkeit der Infektionen. Neisseria Meningitidis ist das ursächliche Mittel der Erkrankung und ist auch für die Meningococcen-Septicaemie verantwortlich, die mit schnellem Anfang und hoher Mortalität einhergeht, wobei etwa 22% der Fälle sich als tödlich erweisen.
Gegenwärtig stellen Vakzine, die auf das Bereitstellen schützender Immunität gegen Meningococcenerkrankungen gerichtet sind, nur einen eingeschränkten Schutz bereit, und zwar aufgrund der vielen verschiedenen Stämme von N. Meningitidis. Vakzine auf Basis der Serogruppenantigene, der Kapselpolysaccharide bieten nur kurzlebigen Schutz gegen die Infektion und schützen nicht gegen viele Stämme, die sich üblicherweise in Nordamerika und Europa finden. Ein weiterer Nachteil dieser Vakzine besteht darin, dass sie nur einen geringen Schutzgrad für Kinder unterhalb von 2 Jahren bieten, einer der am meisten verwundbaren Gruppen, die üblicherweise gegenüber der Infektion empfänglich sind.
Der Meningococcen-Transferrinrezeptor besteht aus zwei Proteinkettenkomponenten, dem Transferrinbindungsprotein A (TbpA) und TbpB. Von dem Rezeptorkomplex wird angenommen, dass er sich aus einem Dimer des TbpA bildet, das mit einem einzelnen TbpB assoziiert (Boulton et al. (1998)). Von den in TbpA vorhandenen Epitopen ist bekannt, dass sie im Inneren des Proteins maskiert sind (Ala'Aldeen (1996)). Vakzine gegen die Meningococcenmeningitis auf Basis von TbpB eines Stammes alleine zeigen einige Kreuzreaktivität und es gibt Hinweise auf eine kreuzreaktive Immunantwort in Kaninchen, die nur mit TbpB immunisiert worden sind (Feirreros et al. (1998)).
Gomez et al. (Vaccine, Band 16 (1998), Nr. 17, S. 1633–1639) beschreiben eine Untersuchung der Auswirkungen einer Anzahl verschiedener Adjuvanszubereitungen in Vakzinen, umfassend einen TbpA + TbpB-Komplex. Die Immunisierungsraten gegen Meningococcenangriffe waren in Zubereitungen, umfassend TbpA + TbpB sowie das RAS-Adjuvans, am höchsten.
Ala'Aldeen (J. Med. Microbiol., Band 44 (1996), S. 237–243) gibt eine Übersicht über die Tbp's von N. Meningitidis und deren mögliche Verwendung als potentielle Vakzinantigene. Ala' Aldeen behauptet, dass die Kreuzreaktivität und ein Breitbandschutz hauptsächlich mit der TbpB-Untereinheit assoziiert ist (S. 240, dritter Absatz).
Gorringe et al. (Vaccine, Band 13 (1995), Nr. 13, S. 1207–1212) beschreibt die menschliche Antikörperantwort auf Tbp's und bewertet ihren Wert als Vakzinantigene über das Austesten von Humanseren auf Anti-Tbp-Antikörper. Gorringe et al. beschreiben nicht die Komponenten eines solchen Vakzins, sondern untersuchen das Ausmaß der Antikörperkreuzreaktivität zwischen gereinigten TbpA- und TbpB-Untereinheiten sowie dem TbpA + B-Komplex.
Boulton et al. (Biochem. J. (1998) 334, S. 269–273) beschreiben die Isolierung und Charakterisierung des TbpB aus N. Meningitidis und postulierten außerdem den Aufbau des Tbp-Komplexes in vivo als TbpA-Dimer plus TbpB-Monomer.
Es wäre trotzdem vorteilhaft, ein Vakzin bereitzustellen, das einen breiteren Bereich schützender Immunität gegen die Infektion aus einem weiteren Spektrum an Stämmen von N. Meningitidis bereitstellt. Es wäre ein weiterer Vorteil, ein Vakzin bereitzustellen, das schützende Immunität an Kinder wie auch Erwachsene verleiht und dessen Schutz langandauernd ist. Es wäre außerdem von Vorteil, ein Vakzin bereitzustellen, das gegen eine subklinische Infektion schützt, d. h. bei der Symptome der Meningococceninfektion nicht unmittelbar offensichtlich sind, so dass das infizierte Individuum als Träger des Pathogens fungieren kann.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zubereitungen bereitzustellen, enthaltend Tbp's, und Vakzine auf Basis derselben, die die Nachteile und Probleme im Stand der Technik lösen oder mindestens lindern. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Vakzinzubereitung oder -zusammensetzung bereitzustellen, die schützende Immunität gegen Meningococceninfektionen beständig und verlässlich induziert.
Dementsprechend stellt ein erster Aspekt der Erfindung eine Zubereitung bereit, umfassend Vesikel der äußeren Membran bzw. Außenmembranvesikel von N. Meningitidis, die mit einem Transferrinbindungs-protein (Tbp) angereichert wurden.
Die Zubereitung oder Zusammensetzung kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert werden, beispielsweise dem Adjuvans Alum, obwohl jeder andere für die orale, intravenöse, subkutane, intraperitoneale oder jede andere Route der Verabreichung geeignete Träger ebenfalls geeignet ist, um eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung einer Meningococcenerkrankung herzustellen.
Das Vakzin kann sowohl TbpA + B-Proteine umfassen, vorzugsweise mit einem Molverhältnis zwischen 1,8 und 2,2 Molekülen an TbpA auf ein Molekül an TbpB, stärker bevorzugt zwei Moleküle TbpA auf ein Molekül TbpB. Diese spezielle Kombination von Komponenten kann überraschenderweise eine höhere schützende Immunität gegen Meningococceninfektionen im Vergleich zum Impfen mit nur TbpB alleine bereitstellen. Eine 1 : 1-Kombination von A : B schützt stärker gegen Herausforderungen als B alleine. Dies ist überraschend, da von TbpA zuvor angenommen wurde, dass es nicht schützend ist. Die vorliegenden Ergebnisse unterscheiden sich von dieser etablierten Ansicht mit einigen Experimenten (unten detaillierter beschrieben), die zeigen, dass dann, wenn es als Vakzin verabreicht wird, TbpA ebenfalls in der Lage ist, schützende Immunität gegen Meningococceninfektionen bereitzustellen. Die vorliegenden Ergebnisse belegen jedoch am eindrücklichsten die beständige Leistung von Vakzinen, die sowohl TbpAs als auch Bs enthalten im Vergleich zu solchen, die nur TbpA oder B allein enthalten. Es ist dieses Fehlen der Variabilität zwischen Zubereitungen und dem beständig hohen Maß an Schutz gegen Infektionen, das in Antwort auf die Impfung mit TbpA + B induziert wird, das es den Zubereitungen der Erfindung ermöglicht, signifikante Vorteile über die Vakzine des Standes der Technik zu zeigen.
Von Transferrinbindungsproteinen ist bekannt, dass sie sich auf der äußeren Membran bzw. Außenmembran einer Anzahl Gram negativer Bakterien wie N. Meningitidis befinden. Formulierungen der Zubereitung der vorliegenden Erfindung mit herkömmlichen Trägern oder Adjuvantien stellen eine Zubereitung zur Behandlung von Infektionen durch diese Bakterien bereit.
Es ist ein Vorteil, dass nach Verabreichung einer Zubereitung Antikörper gegen Epitope gezogen oder ausgelöst werden können, die aus Sequenzen von TbpA und TbpB in Nachbarschaft bestehen. Somit kann die Immunantwort, die unter Anwendung einer solchen Zubereitung erhältlich ist, im Vergleich mit derjenigen durch Vakzinzubereitungen des Standes der Technik verbessert werden, die nur eine Komponente des Tbp-Komplexes enthalten und in denen der volle Bereich möglicher Tbp-Epitope nicht verfügbar ist. Eine Tbp-Untereinheitskomponente des TbpA + B-Komplexes kann aus einem ersten Stamm von N. Meningitidis stammen und eine andere von einem zweiten Stamm, der sich von dem ersten unterscheidet. Beispielsweise wird das TbpA-Dimer aus dem ersten Stamm und des TbpB aus dem zweiten Stamm entnommen. Die TbpA- und TbpB-Proteine können unabhängig voneinander aus den Stämmen K454, H44/76 und B16B6 gewählt werden. Die Tbp's können direkt aus der Bakerienquelle isoliert oder können über im Stand der Technik allgemein bekannt rekombinante Verfahren erzeugt werden. Kombinationen von Proteinen aus anderen Stämmen werden auch in Betracht gezogen, und die Kombination von Komponenten aus verschiedenen Bakterienstämmen bietet das Potential, ein Individuum mit einem breiteren Spektrum an Schutz gegen Meningococceninfektionen zu versorgen. Eine Zubereitung oder Vakzin kann zusätzlich wahlweise eine Mischung von A-Proteinen aus verschiedenen Stämmen oder eine Mischung von B-Proteinen aus verschiedenen Stämmen enthalten, was das mögliche Spektrum des Schutzes noch weiter verbreitert. Noch eine weiter Option besteht in dem Erhalt der Tbp's oder deren Ableitung aus anderen Bakterien, eingeschlossen N. Gonorrhoeae, N. Lactamica und Moraxella Catarrhalis.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Transferrinbindungsprotein" oder „Tbp" auf ein Protein, das entweder alleine an Transferrin bindet oder Teil eines Komplexes aus Proteinen sein kann, der Transferrin bindet. Der Ausdruck umfasst auch Fragmente, Varianten und Derivate eines solchen Proteins, vorausgesetzt, dass gegen das Fragment, die Variante oder das Derivat gezogene Antikörper das Protein binden. Somit werden sowohl dissoziierte als auch in einen Komplex assoziierte TbpA und TbpB als Tbp betrachtete. Darüber hinaus werden auch Mutanten, Fusionsproteine oder Fragmente von TbpA oder B oder andere Derivate des TbpA + B-Komplexes mit gemeinsamer antigenischer Identität als durch den Ausdruck „Tbp" in der vorliegenden Erfindung dargestellt bzw. repräsentiert betrachtet.
Eine Zubereitung kann einen Komplex aus zwei TbpA's und einem TbpB umfassen. Die Proteine werden somit in dem im nativen Rezeptor zu sehenden Verhältnis zusammengehalten. Die einzelnen Proteine können beispielsweise über Wasserstoffbrückenbindungen oder kovalente Bindungen verbunden sein. Im letzteren Falle ist jedes TbpA kovalent an das TbpA gebunden, und zwar entweder direkt oder indirekt. In einer bevorzugten Ausführungsform nimmt der Komplex von TbpA und TbpB eine native Konfiguration an.
Ein nativer TbpA + B-Komplex kann aus N. Meningitidis isoliert und gereinigt werden. Alternativ wird auch die Synthese von rekombinantem Tbp-Protein, gefolgt von dem Zusammensetzen des TbpA + B-Komplexes in vitro bereitgestellt. Der TbpA + B-Komplex kann durch Mischen gebildet werden oder kann über physikalische (beispielsweise UV-Bestrahlung) oder chemische Methoden quervernetzt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, was zu einer Kombination von Tbp's führt, die zusammenbleiben werden und nicht voneinander dissoziieren können. In einem weiteren Beispiel wird ein einzelkettiges rekombinantes Protein, umfassend zwei TbpA-Sequenzen, vorzugsweise in der Form des TbpA-Dimeren, anschließend kovalent an ein TbpB-Protein gebunden, um einen vollständigen TbpA + B-Komplex in vitro zu bilden. Ein anderes Beispiel sorgt dafür, dass das TbpA und B so mutiert sind, dass Cysteinreste eingeführt werden, die die Bildung von Disulphidbrücken zwischen den TbpA- und TbpB-Untereinheiten erleichtern, um einen kovalent gebundenen Komplex zu erhalten.
Bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen TbpA und TbpB können Gene auch so trunkiert werden, dass nur diejenigen Domänen, von denen bekannt ist, dass sie zur Antigenizität des Proteins beitragen, in den Tbp-Komplex eingebracht werden.
In einigen Zubereitungen ist der TbpA + B-Komplex in der Lage, als Transferrinrezeptor zu wirken und bindet an humanes Transferrin. In anderen Zubereitungen der Erfindung ist der TbpA + B-Komplex in dem Sinne nicht funktional, dass er nicht an Transferrin bindet, er stellt jedoch nichtsdestotrotz eine antigenische Komponente bereit, die eine angemessene Immunantwort auslöst.
Die Erfindung stellt eine Zubereitung bzw. Zusammensetzung bereit, umfassend ein Tbp und Vesikel der Außenmembran von N. Meningitidis. Ein Vorteil dieser Zubereitung besteht darin, dass dann, wenn sie an einen zu Impfenden oder Patienten verabreicht wird, sie eine unterschiedliche Kombination von N. Meningitidis-Antigenen und insbesondere Antigenen bereitstellt, die sich im Wesentlichen in einer Formation befinden, wie sie auf der Membran des lebenden infizierenden Organismus vorliegt. Die Kombination bietet das Potential für einen effektiveren Schutz gegen die Infektion oder ein breiteres Spektrum an Schutz als vorhandene Vakzine. Bekannte Verfahren der Isolierung von Außenmembranvesikeln wie über die Desoxycholat-Behandlung sind für die Herstellung der Zubereitungen der Erfindung geeignet. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Tbp um TbpA, TbpB oder TbpA + B entweder in einem nativen Komplex oder in dissoziierter Form.
Die Außenmembranvesikel können weiterhin in vitro mit Tbp vorbehandelt werden, um die Vesikelmembran mit Tbp anzureichern. Mit „Anreichern" und ähnlichen Ausdrücken weisen wir auf einen Außenmembranvesikel hin, zu dem Tbp's so zugesetzt worden sind, dass die Konzentration oder die Dichte der Tbp's in demjenigen Vesikel erhöht ist. Vorzugsweise führt die Anreicherung zu einem Außenmembranvesikel mit einer gesteigerten Anzahl an Transferrinrezeptoren in der Membran aufgrund einer erhöhten Konzentration von TbpA und TbpB nach deren Zusatz zum Vesikel und deren Assoziation in Rezeptoren oder rezeptorähnliche Strukturen. Ein spezieller Vorteil einer solchen Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die Tbp's, die als antigenische Schlüsselkomponenten des Vakzins betrachtet werden, in einer hoch antigenen Umgebung vorhanden sind, die die Umgebung, in der die Transferrinrezeptoren auf lebenden, infizierenden Bakterien präsentiert werden, eng nachahmt.
Wie zuvor erwähnt, braucht es sich bei den Tbp-Komponenten der Zubereitung nicht um Wildtyp-Tbp's handeln. Sie können rekombinant hergestellt werden, und dabei können Sequenzänderungen eingeführt werden. In einem typischen Beispiel der Erfindung ist das rekombinante Tbp so modifiziert, dass es eine Membranbindungsdomäne umfasst. Eine bevorzugte, die Membran überspannende Domäne ist ein hydrophober, alphahelikaler Bereich, der entweder am N- oder C-Terminus des TbpB-Proteins angefügt wird. Bei einem Membran verankernden Bereich muss es sich jedoch nicht um eine Alphahelix handeln, der Zusatz einer Fettsäure oder einer Lipidkette würde ebenfalls die Membranverankerung erleichtern. Tatsächlich wird vom Wildtyp-TbpB angenommen, dass es in der bakteriellen Außenmembran über eine solche Lipidkette als Anker verankert ist. In einem weiteren Beispiel der Erfindung in ihrer Anwendung werden die Außenmembranvesikel in vitro mit Membran bindendem, rekombinanten TbpB vorbehandelt, um die Vesikelmembran mit TbpB anzureichern. Außenmembranvesikel (outer membrane vesicle = OMV), angereichert mit Tbp's, werden zusätzlich durch Einführen hoher Tbp- Expressionslevel in N. Meningitidis und anschließendes Isolieren der Außenmembranvesikel über eines der zuvor beschriebenen Verfahren erzeugt. Das letztere Verfahren wird typischerweise durch Transformieren des N. Meningitidis-Wirts mit einem geeigneten Expressionsvektor erzielt, in den ein Gen oder Gene insertiert worden sind, die das oder die gewählten Tbp's kodieren. Geeignete Expressionsvektoren zur Anwendung in Neisseria-Spezies schließen das Plasmid pMGC10 (Nassif et al. (1991)) ein.
Es ist bevorzugt, dass die Zubereitung der vorliegenden Erfindung Außenmembranvesikel und TbpA + B-Komplexe umfasst, die aus einem Bereich verschiedener Stämme von N. Meningitidis isoliert wurden. Andere bevorzugte Zubereitungen der Erfindung umfassen andere N. Mengingitidis-Proteine, eingeschlossen Oberflächenantigene, periplasmatische Proteine, Superoxid-Dismutase und Glycoproteine.
Die Zubereitungen eines anderen Aspekts der Erfindung können anstelle oder zusätzlich zu Außenmembranvesikeln eines oder mehrere Liposomen umfassen, wobei jedes Liposom TbpA und/oder TbpB umfasst, und vorzugsweise TbpA und TbpB, assoziiert in einen Rezeptor oder einen Rezeptor-ähnlichen Komplex, umfasst. Somit wird ein weiteres Mittel zum Präsentieren der transferrinen Rezeptor-Antigene bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Zubereitung ein 22kD Antigen (das Neisseria-Oberlächenprotein A (NspA)) wie auch Außenmembranvesikel. NspA und dessen Herstellung sind von Martin et al., 1997, beschrieben worden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Vakzin bereit, umfassend eine Zubereitung der Erfindung, wie oben beschrieben. Ein Vakzin der Erfindung kann auch Antikörper gegen Tbp umfassen und kann somit ein Maß an passiver Immunität gegen bakterielle Infektion bereitstellen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sorgt für ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, das das Kombinieren von TbpA, TbpB und N. Meningitidis-Außenmembranvesikeln mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Es ist bevorzugt, dass das Molverhältnis von TbpA zu TbpB etwa 2 : 1 beträgt. Die Außenmembranvesikel können in vitro mit nativem TbpA + B so vorbehandelt werden, dass die Vesikelmembran mit Tbp-Komplex angereichert ist. Die Außenmembranvesikel können aber außerdem mit anderen Proteinkomponenten vorbehandelt werden, um diese bezüglich dieser antigenischen Komponenten ebenfalls anzureichern. Die Außenmembranvesikel können außerdem mit antigenischem Proteinen und Proteoglycanen aus zahlreichen unterschiedlichen Stämmen von N. Meningitidis vorbehandelt werden.
Somit wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung bereitgestellt, umfassend:

(a) Extrahieren eines Tbp aus einer Außenmembran eines Bakteriums und Herstellen einer wässrigen Lösung des Tbp;
(b) Extrahieren von Außenmembranvesikeln aus einer Kultur von N. Meningitidis und herstellen einer wässrigen Lösung dieser Außenmembranvesikel;
(c) Erhalt eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers; und
(d) Vereinigen der in Schritt (a) hergestellten Lösung, der in Schritt (b) hergestellten Lösung und des in Schritt (c) enthaltenen Trägers.

In einer weiteren spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung bereit, umfassend:

(a) rekombinantes Exprimieren eines Tbp in N. Meningitidis;
(b) Extrahieren von Außenmembranvesikeln, umfassend das rekombinant exprimierte Tbp, aus diesen N. Meningitidis und Herstellen einer wässrigen Lösung der Außenmembranvesikel;
(c) Erhalt eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers; und
(d) Kombinieren der in Schritt (b) hergestellten Lösung mit dem in Schritt (c) erhaltenen Träger.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Zubereitung bereit, umfassend Tbp's und Außenmembranvesikel, worin die Außenmembranvesikel von verschiedenen Stämmen von N. Meningitidis abstammen.
Noch ein weiterer Aspekt stellt bereit die Anwendung von TbpA's und TbpB's in der Herstellung eines Medikaments für die Humanvakzinierung. Es ist bevorzugt, dass ein solches Medikament für die Vakzinierung gegen Meningococceninfektionen geeignet ist, obwohl einige Zubereitungen der Erfindung einen Breitbandschutz gegen Infektionen aus einem breiteren Bereich bakterieller Pathogene bereitstellen.
Die Ausführungsformen der Erfindung sind genauer mit Hilfe des unten beschriebenen Beispiels diskutiert. Die in dem Beispiel in Bezug genommenen Ergebnisse werden durch die angefügten Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
1 die Immunisierung von Mäusen mit TbpA + B und Außenmembranvesikeln zeigt;
2 die Immunisierung von Mäusen von TbpA + B zeigt;
3 den Schutz von Mäusen gegen IP-Infektion nach Immunisierung mit TbpA + B, isoliertem TbpA oder isoliertem TbpB zeigt;
die 4A und 4B den Schutz von Mäusen gegen Meningococceninfektionen nach Immunisierung mit entweder Neisserien-TbpA + B, TbpB oder TbpA (nTbp's) oder rekombinanten Tbp's (rTbp's) zeigen;
die 5A und 5B den Schutz von Mäusen gegen Immuntests mit 10⁶ und 10⁷ Organismen /Maus des N. Meningitidis-Stammes K454 zeigen, und zwar nach Immunisierung mit rekombinantem TbpA + B, TbpB oder TbpA;
6 den Schutz gegen Immuntests mit heterologen Serogruppen zeigt; und
7 den Schutz gegen Immuntests mit B16B6 zeigt.
Beispiel
Schutzdaten für Maus
Mäuse (CAMR-NIH) wurden mit Tbp's und/oder Außenmembranvesikeln immunisiert und mit entweder dem homologen oder einem heterologen Meningococcenstamm immungetestet. Überlebende pro Mäusegruppe, immunisiert mit Tbp's aus Stamm K454 und den Außenmembranvesikeln als Vakzin, nach Immuntesten mit dem Stamm K454 sind in 1 gezeigt. Im Vergleich zu den Tbp's gab das Vakzin aus Außenmembranvesikeln nur einen verringerten Schutz, dies kann jedoch sein, weil diese aus einem anderen Gruppe B-Stamm hergestellt wurden (H44/76). Mit aus dem Stamm K454 isoliertem TbpA + B immunisierte Tiere waren auch gegen die Herausforderung mit anderen Serogruppe B-Organismen geschützt (1), wobei ein stärkerer Schutz mit dem homologen Stamm und gegen Stämme zu sehen war, die ein TbpB mit einem vergleichbaren Molekulargewicht exprimieren. Wenig oder kein Schutz wurde gegen Herausforderungen mit Meningococcen beobachtet, die ein TbpB mit einem sehr unterschiedlichen Molekulargewicht besitzen (Stamm B16B6). Mit der Herausforderung durch heterologe Stämme ist eine leicht erhöhte Anzahl an Überlebenden in den Gruppen zu sehen, die mit der Kombination von Tbp's und Außenmembranvesikeln geimpft wurden. Die involvierten Zahlen sind jedoch klein und eine abschließende Schlußfolgerung kann nicht erreicht werden. Es ist jedoch interessant zu beobachten, dass mit TbpA + B aus dem Stamm K454 immunisierte Mäuse auch gegen Infektionen mit einer Serogruppe C, nicht jedoch mit Serogruppe A als Stamm geschützt waren (2).
Schutz gegen die Herausforderung mit Stamm K454 bei Mäusen, immunisiert mit cogereinigtem TpbA + B und isoliertem TbpA und TbpB, ist in 3 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass es sich bei TbpB um das prädominante Antigen handelt, das für den Schutz verantwortlich ist, wobei wenig Schutz von TbpA alleine bereitgestellt wird.
Rekombinantes TbpA und TbpB
TbpA und TbpB aus N. Meningitidis-Stamm K454 wurden kloniert und in E. Coli überexprimiert. Die Proteine wurden unter Anwendung der Affinitätschromatographie gereinigt und zur Bestimmung ihrer schützenden Potenz in einem Mausmodell einer Meningococcenerkrankung eingesetzt. Rekombinante Tbp's zeigten äquivalenten Schutz zu demjenigen, der durch Tbp's bereitgestellt wurde, die aus mit Eisen gestressten N. Meningitidis isoliert worden waren (4A und 4B). Diese rekombinanten Tbp's wurden auch in zwei weiteren, größer angelegten IP-Immuntestexperimenten genutzt (5A–B).
Die starke und beständige schützende Potenz der Tbp's gegen IP-Infektionen der Maus mit N. Meningitidis ist wahrscheinlich der schlagendste Beweis für ihr Vakzin-Potential.
Interessanterweise zeigen die in den 4B und 5A–B gezeigten Ergebnisse, obwohl sie aus Experimenten ähnlichen Designs entstanden sind, die überraschende Variabilität, die mit Vakzinzubereitungen assoziiert ist, die nur auf entweder TbpA oder TbpB alleine beruhen. In 4B zeigte die rekombinante TbpA-Zubereitung nur geringes Schutzausmaß im Vergleich zu TbpB oder TbpA + B. In den 5A und 5B zeigte die rekombinante TbpA-Vakzinzubereitung jedoch hohe Schutzausmaße, vergleichbar dem TbpA + B-Komplex, und die TbpB-Zubereitung alleine zeigte schlechten Schutz gegen Infektionen. Dieses letztere Ergebnis steht vollständig im Gegensatz zu den Lehren des Standes der Technik.
Humane Immunantworten auf TbpA und TbpB in Reconvaleszenten-Seren
Wir haben eine Anzahl von Untersuchungen durchgeführt, die die Antikörperantwort in Menschen auf TbpA und TbpB nach Meningococcenerkrankungen betrachteten. Die allgemeinen Schlußfolgerungen sind, dass sowohl TbpA als auch TbpB während der Meningococcenerkrankung exprimiert werden und dass eine Immunantwort gegen diese ausgelöst wird. Die Antwort ist funktional (opsonisch) und ist zwischen verschiedenen Meningococcenstämmen stärker kreuzreaktiv als die Antwort, die durch Immunisierung von Tieren mit Tbp's induziert wird. Die Immunantwort gegen TbpA scheint stärker und stärker kreuzreaktiv als diejenige gegen TbpB zu sein, was die Bedeutung des Vakzin-Potentials von TbpA bestätigt.
TbpA und TbpB bilden einen Transferrinrezeptor
Unsere Strukturuntersuchungen weisen darauf hin, dass der Transferrinrezeptor auf der Meningococcenoberfläche aus zwei TbpA-Molekülen und einem TbpB-Molekül besteht, die zusammenwirken.
Wirkung eines Vakzins, enthaltend A + B Tbp's
Wir haben weitere Tests zur Wirksamkeit rekombinanter TbpB vs rekombinantes TbpA + B enthaltende Vakzinzubereitungen gegen Immuntests mit N. Meninigitidis-Stämmen L91 7095 und B16B6 durchgeführt, deren Ergebnisse in den 6 bzw. 7 dargestellt sind. In beiden Fällen wurde ein etwas verbesserter Schutz durch A + B im Vergleich zu B alleine verliehen.
Literaturzitate:
Ala'Aldeen, (1996) J. Med. Microbiol., Band 44, S. 237–243
Boulton et al., (1998) J. Biochem., Band 334, S. 269–273
Feirreros et al., (1998) Rev. in Med. Microbiol., Band 9, Nr. 1, S. 29–37
Gorringe et al., (1996), 10. Pathogenic Neisseria Conference, Poster 46, Zusammenfassung
Martin et al., (1997), J. Exp. Med., Band 185, Nr. 7, S. 1173–1181
Nassif et al., (1991), J. Bacteriol., Band 173, Nr. 7, S. 2147–54.

Claims

Eine Zusammensetzung, die Vesikel der äußeren Membran von N. meningitidis enthält, die angereichert wurden mit einem Transferrin-Bindeprotein (Tbp).
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher das Tbp TbpA, TbpB oder TbpA und TbpB enthält.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 1 und 2, in welcher die Vesikel der äußeren Membran angereichert sind mit Tbps aus unterschiedlichen Stämmen von N. meningitidis.
Eine Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 3, in welcher die Tbps rekombinant erzeugt wurden.
Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welcher die Vesikel der äußeren Membran angereichert sind mit anderen Proteinen von N. meningitidis als Tbp.
Eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in welcher die Vesikel der äußeren Membran aus unterschiedlichen Stämmen von N. meningitidis stammen.
Ein Vakzin, das eine Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, das das Hinzufügen eines Tbp zu einem Vesikel der äußeren Membran von N. meningitidis umfasst, um die Konzentration oder Dichte der Tbps in dem Vesikel zu erhöhen.
Ein Verfahren nach Anspruch 8, umfassend: a) Extrahieren eines Tbps von der äußeren Membran von Bakterien und Herstellen einer wässrigen Lösung dieses Tbps; b) Extrahieren von Vesikeln der äußeren Membran aus einer N. meningitidis-Kultur und Zubereiten einer wässrigen Lösung dieser Vesikel der äußeren Membran; c) Gewinnen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers; und d) Kombinieren der in Schritt (a) hergestellten Lösung mit der in Schritt (b) hergestellten Lösung und dem in Schritt (c) gewonnenen Träger.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, in welchem das Tbp in diesen Bakterien rekombinant exprimiert wird.
Ein Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 10, in welchem diese Bakterien N. meningitidis sind.
Ein Verfahren nach Anspruch 8, umfassend: a) rekombinantes Exprimieren eines Tbp in N. meningitidis; b) Extrahieren von Vesikeln der äußeren Membran, die dieses rekombinant exprimierte Tbp enthalten, aus diesen N. meningitidis und Herstellen einer wässrigen Lösung dieser Vesikel der äußeren Membran; c) Gewinnen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers; und d) Kombinieren der in Schritt (b) hergestellten Lösung mit dem in Schritt (c) gewonnenen Träger.
Ein Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 12, welches weiterhin umfasst den Schritt des Extrahierens eines anderen Proteins, als Tbp, aus N. meningitidis und Kombi-nieren dieses extrahierten Proteins mit der Mischung aus Schritt (d).
Ein Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 13, in welchem das Tbp TbpA, TbpB oder TbpA und TbpB enthält.
Ein Verfahren der Anreicherung eines Vesikels der äußeren Membran mit einem Tbp, welches umfasst das Induzieren der Tbp-Expression in hohem Maße in N. meningitidis und Isolieren eines Vesikels der äußeren Membran daraus.
Ein Verfahren nach Anspruch 15, das das Transformieren von N. meningitidis mit einem Expressionsvektor, in welchen ein Gen oder Gene, die das Tbp codieren, insertiert worden sind.
Verwendung von Vesikeln der äußeren Membran von N. meningitidis, die angereichert wurden mit einem Tbp, für die Herstellung eines Medikaments für die Vakzination gegen Meningokokkenerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 17, in welcher das Tbp TbpA, TbpB oder TbpA und TbpB enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikamentes für die Vakzination gegen Meningokokkenerkrankungen.