DE69903346T2

DE69903346T2 - 22s-hydroxycholesta-8,14-dien derivate mit meiose regulierende aktivität

Info

Publication number: DE69903346T2
Application number: DE69903346T
Authority: DE
Inventors: Gerard Hanssen; Dirk Leysen; Jaap Van Der Louw; Anja Wiersma
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: DE69903346D1; US6528501B1; EP1137660B1; AU759344B2; AU4610099A; CA2352337A1; JP2002532511A; ATE225366T1; DK1137660T3; EP1137660A1; ES2185360T3; WO2000035938A1

Description

Die Erfindung betrifft 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivate, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, sowie die Verwendung dieser 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Fruchtbarkeitskontrolle.
Die sexuelle Reproduktion umfasst einen zyklischen Wechsel von diploiden und haploiden Zuständen: diploide Zellen teilen sich im Meioseprozess, um haploide Zellen zu bilden und die haploiden Zellen verschmelzen paarweise bei der Befruchtung, um neue diploide Zellen zu bilden. Der Meioseprozess ist durch zwei meiotische Teilungen gekennzeichnet, die sowohl männlichen wie weiblichen Keimzellen eigen sind. Während des Prozesses erzeugen zwei Zellteilungen, gefolgt von einer DNA-Replikationsrunde vier haploide Zellen aus einer einzigen diploiden Zelle. Chromosomale Crossover-Ereignisse, während denen väterliches und mütterliches, genetisches Material ausgetauscht wird, tragen sich während der Prophase der ersten meiotischen Teilung zu. Am Ende der ersten meiotischen Teilung wird ein Teil jedes Chromosomenpaares, bestehend aus zwei Schwesterchromatiden, auf jede Tochterzelle verteilt. Die zweite meiotische Teilung trennt jedes Schwesterchromatid in eine separate, haploide Zelle. Männliche und weibliche Keimzellen werden ähnlichen, meiotischen Teilungen unterworfen, unterscheiden sich jedoch in der Regulierung dieser Prozesse.
Beim Mann ist die Meiose ein kontinuierlicher Prozess in Keimzellen, die von einer Population von unreifen Keimzellen, den Stammzell-Spermatogonien, hergeleitet wurden. Nach der Geschlechtsreife des Mannes, beginnen die Spermatogonien dieser Stammzellpopulation mit der Meiose. Die erste und zweite meiotische Teilung verlaufen ohne Unterbrechung und ergeben schliesslich vier reife Spermatozoen.
Bei der Frau beginnen die primären Oozyten die erste meiotische Teilung bereits während des embryonalen Stadiums, diese bleiben jedoch in der Prophase (Dictyate Stadium) arretiert bis die Frau die Geschlechtsreife erreicht. Die Meiose setzt zur Zeit der Ovulation wieder ein (Eireifung), nach welcher die erste meiotische Teilung abgeschlossen ist und die zweite meiotische Teilung beginnt. Bei den meisten Wirbeltieren wird die zweite meiotische Teilung in der Metaphase arretiert und erst nach der Befruchtung abgeschlossen. Zum Schluss der ersten und zweiten meiotischen Teilung teilt sich das Zytoplasma asymmetrisch, um zwei sekundäre Oozyten zu bilden, jede mit einer haploiden Zahl von einzelnen Chromosomen, jedoch höchst verschieden in der Grösse: die eine ist ein kleiner Polarkörper, der schliesslich degeneriert und die andere ist eine grosse Zelle, die das gesamte Entwicklungspotential enthält. Schlussendlich wird nur ein reifes Ei gebildet.
Das Stadium, bei welchem die sich entwickelnde Oozyte vom Eierstock freigesetzt wird und zur Befruchtung bereit ist, unterscheidet sich in den verschiedenen Spezies. Bei sowohl den Wirbellosen wie auch den Wirbeltieren sprechen die ovariellen Zusatzzellen auf anderswo im Körper produzierte Polypetide (Gonadotropine) an, um die Reifung der Oozyte und schlussendlich (in den meisten Spezies) die Ovulation zu kontrollieren. Beim Mensch werden die primären Oozyten des weiblichen Neugeborenen in der Proophase der meiotischen Teilung I arretiert und die meisten sind von einer Follikelzellschicht umgeben; solch eine Oozyte mit deren umgebenden Zellen stellt das Primordialfollikel dar. Ein kleiner Teil der Primordialfollikel beginnt nacheinander zu wachsen, um sich entwickelnde Follikel zu bilden. Die Follikelzellen vergrössern sich und proliferieren, um eine mehrschichtige Hülle um die primäre Oozyte zu bilden; die Oozyte selber vergrössert sich und bildet die Zona Pellucida, eine extrazelluläre Matrix, die hauptsächlich aus Glykoproteinen besteht, sowie kortikale Granula, spezialisierte, sekretorische Bläschen direkt unter der Plasmamembran der äusseren Region, dem Kortex, des Eizytoplasmas (bei Aktivierung des Eis durch ein Spermium setzen diese kortikalen Granula ihren Inhalt via Exozytose frei; der Inhalt der Granula hat die Funktion die Eihülle zu verändern, um andere Spermien daran zu hindern, mit dem Ei zu verschmelzen). Die sich entwickelnden Follikel wachsen kontinuierlich und manche von ihnen entwickeln einen mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum oder Antrum, um sogenannte antrale Follikel zu bilden. Die Entwicklung solcher Follikel hängt von Gonadotropinen ab, die von der Hypophyse ausgeschieden werden, sowie von Estrogenen, die von den Follikelzellen selbst ausgeschieden werden. Zu Beginn der Pubertät aktiviert ein Ausscheidungsanstieg eines anderen Gonadotropins, des luteinisierenden Hormons (LH), durch die Hypophyse ein einziges, antrales Follikel, um dessen Entwicklung zu vollenden: die umschlossene Primäroozyte reift, um die meiotische Teilung I zu vollenden, während das stimulierte Follikel sich rasch vergrössert und an der Oberfläche des Eierstockes aufbricht, wobei die darin enthaltene Sekundäroozyte freigesetzt wird. Wie es bei den meisten Säugetieren der Fall ist, wird die Sekundäroozyte nur dazu veranlasst sich der Teilung II der Meiose zu unterziehen, falls sie durch ein Spermium befruchtet wurde.
Studien über die Mechanismen, die die Initiation und Regulierung des meiotischen Prozesses in männlichen und weiblichen Keimzellen kontrollieren, deuten auf eine Funktion der zyklischen Nukleotide bei der Steuerung der meiotischen Arretierung hin. Eine spontane Reifung der Oozyten kann durch Verbindungen, die erhöhte cAMP Werte aufrechterhalten, verhindert werden [Eppig, J. und Downs, S. (1984) Biol. Reprod. 30: 1-11]. Von den Purinen, wie zum Beispiel Adenosin oder Hypoxanthin, wird angenommen, dass sie in der cAMP-gesteuerten Aufrechterhaltung der meiotischen Arretierung beteiligt sind [Eppig, J., Ward-Bailey, P. und Coleman, D. (1985) Biol. Reprod. 33: 1041-1049]. Die Anwesenheit einer Meiose-regulierenden Substanz in einem Kulturmedium von Gonaden fetaler Mäuse wurde zuerst von Byskov, A. et al (1976) Dev. Biol. 52: 193-200 beschrieben. Es wurde vermutet, dass die Konzentrationen einer Meiose-regulierenden Substanz (MAS) und einer Meiose-hemmenden Substanz (MPS) den meiotischen Prozess gemeinsam regulieren [Byskov, A. et al. (1994). In "The physiology of reproduction", Eds. Knobil, E. and Neill, J., Raven Press, New York]. In neuerer Zeit wurden aus menschlicher Follikelflüssigkeit isoliertes (3β,5α,20R)-4,4-Dimethylcholesta- 8,14,24-trien-3-ol (FF-MAS) und aus Stierhoden isoliertes (3β,5α,20R)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol durch Byskov. A. et al. als endogene, Meiose-regulierenden Substanzen im Mensch, beziehungsweise Rind identifiziert [(1995), Nature 374: 559- 562]. Diese Sterole konnten die Wiederaufnahme der Meiose in kultivierten von Kumulus eingebetteten sowie Nacktmaus-Oozyten bewirken.
Derivate der endogenen Sterole mit entweder einer gesättigten oder einer ungesättigten Cholestan-Seitenkette wurden in den internationalen Patentanmeldungen WO 96/00235, WO 97/00884 und WO 98/28323 (NOVO NORDISK AlS) als Meiose-regulierende Substanzen offenbart. Meiose-regulierende Substanzen sind Verbindungen, die Agonisten oder Antagonisten einer natürlich vorkommenden Meiose-aktivierenden Substanz sind. Demzufolge könnten diese in der Behandlung von Unfruchtbarkeit oder Verhütung verwendet werden.
Ein Nachteil der in den ersten zwei der hierin zuvor erwähnten Patentanmeldungen beschriebenen Verbindungen ist deren begrenzte Membrandurchdringung, die zu einer Akkumulierung in den Zellmembranen und Fettgeweben führt und dadurch deren therapeutisches Potential als Fruchtbarkeits-kontrollierende Wirkstoffe einschränkt. Diese unerwünschte Akkumulierung wird sehr wahrscheinlich durch die physiochemischen Eigenschaften dieser Verbindungen verursacht, die denen von Cholesterol, einem wichtigen Bestandteil der Zellmembrane, ähneln [Norum, K. R. et al (1983) Physiological Rev. 63: 1343; Babiker, A. et al (1998) Biochimica & Biophysica Acta 1392: 333].
Wir haben nun entdeckt, dass gewisse 22S-Hydroxy-substituierte Cholestan Derivate, d. h. 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der unten angegebenen Formel I als Meiose-aktivierende Verbindungen höchst aktiv sind. Formel I
worin
R&sub1; OR, OSO&sub3;H oder =NOR bedeutet, worin R H, (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl oder (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl bedeutet;
R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander je Wasserstoff oder (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl bedeuten;
R&sub4; Wasserstoff, (C&sub1;&submin;&sub6;) alkyl oder (C&sub1;&submin;&sub6;) acyl bedeutet;
R&sub5; Wasserstoff bedeutet; oder R&sub5; zusammen mit R&sub6; eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welchen R&sub5; und R&sub6; angebracht sind, bezeichnet;
R&sub6; Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen bedeutet; oder R&sub6; zusammen mit R&sub5; eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welchen R&sub6; und R&sub5; angebracht sind, bezeichnet;
R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander je Wasserstoff oder gegebenenfalls mit OH, (C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy oder Halogen substituiertes (C&sub1;&submin; &sub6;)alkyl bedeuten;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Ein Vorteil der 22-Hydroxycholestane ist deren Fähigkeit Zellmembrane zu durchqueren, was die oben beschriebenen Probleme umgehen würde, siehe Stocco, D. M. (1997), Endocrine, 6: 99-109.
Die hierin zuvor beschriebenen 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der allgemeinen Formel I sind als Meiose-aktivierende Verbindungen höchst aktiv. In der Tat sind sie im CEO-Assay (siehe unten) aktiv, in welchem sogar die natürlich vorkommende Meiose-aktivierende Substanz FF-Mas nicht ist. Dies ergibt sich überhaupt nicht aus dem nächsten Stand der Technik. Es sei her jedoch in dieser Hinsicht vermerkt, dass übrigens ein gewisses 22R-Hydroxy substituiertes Cholestan Derivat (22R- Hydroxycholesterol) in WO 98/28323 offenbart wurde, dieses jedoch ein Antagonist ist.
Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Verbindung umfassend ein 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivat der allgemeinen Formel I bereit.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung eines 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivates der allgemeinen Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Fruchtbarkeitskontrolle.
Der Begriff (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl, wie er für die Definition von Formel I gebraucht wird, bedeutet eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Hexyl, Pentyl, Butyl, Isobutyl, tertiäres Butyl, Propyl, Isopropyl, Ethyl und Methyl. Gleichermassen bedeutet der Begriff (C&sub1;&submin; &sub4;)alkyl eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen. Der Begriff (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl bedeutet eine Acylgruppe hergeleitet von einer Carbonsäure mit 1-6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Hexanoyl, Pentanoyl, Pivaloyl, Butyryl, Propanoyl, Acetyl und Formyl. Ebenfalls eingeschlossen in der Definiton von (C&sub1;&submin;&sub6;) acyl sind Acylgruppen hergeleitet von Dicarbonsäuren, wie zum Beispiel hemi-Glutaroyl, hemi-Succinoyl und hemi-Maloyl. Eine bevorzugte (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl-Gruppe ist hemi-Succinoyl.
Der Begriff (C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy bedeutet ein Alkoxy mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wie zum Beiepiel Butyloxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Ethyloxy und vorzugsweise Methyloxy.
Der Begriff Halogen bedeutet F, Cl, Br oder I. Cl und F sind bevorzugt, wobei F am meisten bevorzugt ist.
Es versteht sich, dass die 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der Erfindung die natürlichen Konfigurationen 5α, 10β, 13β und 17β aufweisen. Die Konfiguration an Position 20 der 22S- Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der Erfindung kann entweder R oder S sein. Bevorzugte Verbindungen sind diejenigen mit der 20S-Konfiguration.
Noch mehr bevorzugte Verbindungen gemäss der Erfindung sind die 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der Formel I, worin R&sub1; OR bedeutet, worin R die oben angegebene Bedeutung hat. Unter diesen bevorzugten Verbindungen sind diejenigen mit dem 3-OR- Substituent in der β-Konfiguration besonders bevorzugt. Eine außerordentlich bevorzugte, agonistische Verbindung der Erfindung ist das 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivat (3β,5α,20S,22S)- 4,4-dimethylcholesta-8,14,24-trien-3,22-diol.
Die 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate dieser Erfindung haben die natürlichen Konfigurationen 5α, 10β, 13β, 17β und besitzen ebenfalls ein oder mehrere zusätzliche, chirale Kohlenstoffatome. Die Verbindungen können demzufolge als reines Diasteromer oder als eine Mischung von Diastereomeren erhalten werden. Methoden zur Herstellung der reinen Diastereomere sind einem Fachmann wohlbekannt, z. Bsp. Kristallisation oder Chromatographie.
Die Meiose-aktivierende Aktivität der 22S-Hydroxycholesta-8,14- dien Derivate der Erfindung wird in einem in vitro Oozyten-Assay als Fähigkeit die durch Hypoxanthin aufrecherhaltene, meiotischen Arretierung in denudierten Oozyten (denuded oocytes, DO) oder Kumulus eingebetteten Oozyten (cumulus enclosed oocytes, CEO) zu überwinden.
Die Verbindungen können zur Stimulation der Meiose in sowohl Mann und Frau verwendet werden und können deshalb als Fruchtbarkeits-kontrollierende Wirkstoffe verwendet werden. Die Fruchtbarkeitskontrolle umfasst sowohl Verhütung wie auch Unfruchtbarkeitsbehandlung.
Für die weibliche Verhütung kann ein 22S-Hydroxycholesta-8,14- dien Derivat gemäss Formel I vor dem natürlich eintretenden Gonadotropinimpuls zur Induktion einer verfrühten Reifung der Oozyten, die sich noch innerhalb des Eierstockes befinden, verwendet werden [eine verminderte Fruchtbarkeit mittels Induktion einer verfrühten Reifung von Oozyten wurde in Ratten von Mattheij, J. et al (1993), Gynecol. Obstet. Invest. 36: 129-135 demonstriert]. Nach in vivo Verabreichung beeinflussen die erfindungsgemässen Verbindungen spezifisch die Keimzellen und haben deshalb den Vorteil der Aufrechterhaltung der endogenen Hormonmengen sowie anschliessend der Aufrechterhaltung einer normalen Zykluslänge. Solch eine Verhütungsmethode wird keine unerwünschten Nebenwirkungen, die gelegentlich mit Steroidverhütung verbunden sind, verursachen (z.Bsp. Thrombose, Stimmung, ausserplanmässige Blutung, bösartige Brusterkrankungen).
Ein weiterer Vorteil der 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der Erfindung ist deren Unfähigkeit, eine Reifung in inkompetenten Oozyten (isoliert von präantralen Follikeln) zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen nicht die gesamte Oozyten-Reserve in den Eierstöcken beeinflussen wird. Nur Oozyten von antralen Follikeln (kompetente Oozyten) können durch die Verbindungen der Erfindung zur Reifung induziert werden.
Zur Behandlung der durch das Fehlen reifer Oozyten verursachten, weiblichen Unfruchtbarkeit können die Verbindungen der Erfindungen in vivo verabreicht werden, um rechtzeitig die Reifung kompetenter Oozyten zu stimulieren.
Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls zur Ergänzung von Kulturmedien für in vitro Befruchtungsverfahren verwendet werden, um die Qualität der Oozyten zu verbessern.
Zur Behandlung der durch einen Mangel an der Zahl von reifen Spermatozoen verursachten, männlichen Unfruchtbarkeit können die Verbindungen der Erfindungen in vivo verabreicht werden, um die Reifung der Spermatogonien zu stimulieren.
Für eine therapeutische Anwendung stellen die Salze der Verbindungen der Formel I diejenigen dar, deren Gegenion pharmazeutisch verträglich ist. Die Salze der Säuren gemäss Formel I [i. e. Verbindungen worin R&sub1; OSO&sub3;H ist] finden jedoch ebenfalls Verwendung, zum Beispiel in der Herstellung oder Reinigung einer pharmazeutisch verträglichen Verbindung. Alle Salze, ob pharmazeutisch verträglich oder nicht, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Beispiele von Salzen der Säuren gemäss Formel I sind Mineralsalze, wie zum Beispiel das Natriumsalz, Kaliumsalz und von organischen Basen hergeleitete Salze, wie zum Beispiel Ammoniak, Imidazol, Ethylendiamin, Triethylamin und dergleichen.
Die Verbindungen der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, hierin auch als aktiver Bestandteil bezeichnet, können enteral oder parenteral verabreicht werden. Die exakte Dosis und Verabreichungsvorschrift des aktiven Bestandteils oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon, wird notwendigerweise vom erwünschten, therapeutischen Effekt (Verhütung oder Unfruchtbarkeit) abhängig sein und wird je nach der speziellen Verbindung, der Art der Verabreichung sowie des Alters und der Kondition des individuellen Subjektes, an welches das Medikament verabreicht wird, unterschiedlich sein.
Im allgemeinen benötigt eine parenterale Administration geringere Mengen als andere Verabreichungsmethoden, welche mehr von der Adsorption abhängen. Eine Dosis für Menschen enthält jedoch vorzugsweise 0.0001-25 mg pro kg Körpergewicht. Die erwünschte Dosis kann als eine Dosis oder als multiple Subdosen, die in angemessenen Intervallen während des Tages verabreicht werden, oder, im Falle von weiblichen Empfängern, als Dosen, die in angemessenen, täglichen Intervallen während des Menstruationszyklus verabreicht werden, dargestellt werden. Sowohl Dosis wie auch Verabreichungsvorschrift können für einen männlichen und weiblichen Empfänger unterschiedlich sein.
Im Falle von in vitro oder ex vivo Anwendungen sollten die Verbindungen der Erfindung im Inkubationsmedium in einer Konzentration von ungefähr 0.01-5 ug/ml verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivat gemäss Formel I unter Beimischung von pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Wirkstoffen umfassen. Die Hilfsstoffe müssen "verträglich" sein im Sinne von kompatibel mit anderen Bestandteilen der Zusammensetzung und nicht schädlich für die Empfänger davon. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen diejenigen, die für orale, rektale, nasale, topische (einschliesslich transdermale, bukkale und sublinguale), vaginale oder parenterale (einschliesslich subkutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind. Die Zusammensetzungen können mittels jeder auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Methode hergestellt werden, zum Beispiel mittels Methoden wie diejenigen in Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Company, 1990, siehe vor allem Teil 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture) beschrieben. Solche Methoden umfassen den Schritt, in dem der aktive Bestandteil mit jeglichem Hilfsstoff in Assoziation gebracht wird. Der (die) Hilfsstoff(e), ebenfalls als Zusatzstoffe bezeichnet, umfassen die in diesem Fachgebiet Gebräuchlichen (Gennaro, supra) wie zum Beispiel Füller, Bindemittel, Verdünnungsmittel, Sprengmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und Netzmittel.
Für eine orale Verabreichung geeignete, pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form von separaten Dosiseinheiten wie zum Beispiel Pillen, Tabletten oder Kapseln oder in Form eines Pulvers oder Granulates oder in Form einer Lösung oder Suspension dargeboten werden. Der aktive Bestandteil kann ebenfalls als Bolus oder Paste dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können ferner zu einem Zäpfchen oder Einlauf für eine rektale Verabreichung verarbeitet werden.
Für eine parenterale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen umfassen wässrige und nicht-wässrige, sterile Injektionen. Die Zusammensetzungen können in Form eines Behälters für Einheitsdosen oder Multidosen dargeboten werden, wie zum Beispiel versiegelte Fläschchen oder Ampullen, und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand aufbewahrt werden, welcher vor Gebrauch nur die Zugabe von sterilem, flüssigem Träger, zum Beispiel Wasser, erfordert.
Zusammensetzungen oder Formulierungen, die für eine nasale Inhalierung geeignet sind, umfassen feinen Staub oder Sprühnebel, die mittels dosierten Druckaerosolen, Zerstäubern oder Insufflatoren hergestellt werden können.
Die 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivate der Erfindungen können ebenso in Form von implantierbaren, pharmazeutischen Vorrichtungen, die aus einem Kern von aktivem Material bestehen, der von einer Membran, die die Freisetzungsrate reguliert, eingekapselt ist. Solche Implantate sollten subkutan oder lokal angewandt werden und setzen den aktiven Bestandteil bei einer ungefähr konstanten Rate über relativ lange Zeitspannen, wie zum Beispiel über Wochen bis Jahre, frei. Verfahren zur Herstellung von implantierbaren, pharmazeutischen Vorrichtungen sind einem Fachmann wohlbekannt, wie zum Beispiel im Europäischen Patent 0 303 306 beschrieben.
Die Verbindungen der Erfindung können mittels verschiedener, auf dem Gebiet der organischen Chemie im allgemeinen und im speziellen auf dem Gebiet der Steroidchemie wohlbekannter Methoden hergestellt werden (siehe zum Beispiel: Fried, J. und. Edwards, J. A., "Organic Reactions in Steroid Chemistry", Volumina T und II, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1972). Ein geeignetes Ausgangsmaterial zur Herstellung von Verbindungen der Formel I ist eine Verbindung der allgemeinen Formel II, Formel II
worin R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C&sub1;&submin; &sub6;)alkyl bedeuten, R&sub9; eine Hydroxyl-Schutzgruppe, wie zum Beispiel eine Acylgruppe, beispielsweise eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe oder eine Pivaloylgruppe, oder eine Alkoxyalkylgruppe, beispielsweise eine Ethoxyethylgruppe oder eine Tetrahydropyranylgruppe (THP) bedeutet, deren Herstellung in WO-09852965 und WO-09855498 beschrieben ist. Geeignete Schutzgruppen sind einem Fachmann wohlbekannt [zum Beispiel von Greene, T. W. und Wuts, P. G. M.: Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991].
Ausgehend von diesem Schlüsselzwischenprodukt wird die Seitenkette mittels einem Fachmann wohlbekannter Verfahren gebildet [siehe: Redpath, J. et al., Chem. Soc. Rev. 12, 75 (1983); Zhu, G.-D, et al., Chem.Rev. 95, 1877 (1995); Apfel, M. A., J. Org.Chem. 44, 643 (1979); Kircher, H. W. et al., J. Org.Chem. 52, 2586 (1987); Takeshita, T. et al., Chem. Pharm. Bull. 24, 1928 (1976); Dasgupta, S. K. et al., J. Org. Chem. 39, 1658 (1974); Dolle, R. E. et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 278 (1989); Poyser, J. P, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 2061 (1974)].
Zum Beispiel können Verbindungen der Formel I (R&sub1; = OH, R&sub4; = H, R&sub5; = H) mittels Reaktion der Verbindung der Formel II mit einem geeignet substituierten, alkylmetallischen Reagens der Formel III Formel III
hergestellt werden, worin M Li, MgX, ZnX oder CeX (X = Cl, Br, I) bedeutet, R&sub7;, und R&sub8; die hierin zuvor angegebene Bedeutung haben, wobei jegliche in R&sub7;, oder R&sub8; vorhandene Hydroxylgruppe auf geeignete Weise geschützt ist, und R&sub1;&sub0; H, geschütztes OH oder Halogen bedeutet, was oft zu der vorwiegenden Bildung des 22S- Hydroxycholestan Derivates führt [siehe zum Beispiel Poyser, J. P. et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 2061 (1974)]. Die 22S-Hydroxy und 22R-Hydroxy Derivate können abgetrennt werden oder, falls nötig, wird das 22R-Hydroxy-Tsomer zu der 22S- Hydroxy-Verbindung epimerisiert. Epimerisierung am C-22 kann zum Beispiel mittels einer Mitsunobu Reaktion [siehe Hughes, D. L., Organic Reactions, 42, 335 (1992)] oder mittels Behandlung mit Methansulfonylchlorid oder p-Toluolsulfonylchlorid, gefolgt von einer Reaktion mit einem Sauerstoffnukleophil, erzielt werden [z. Bsp. Kaliumsuperoxid, siehe Corey, E. J. et al. Tetrahedron Lett. 3183, (1975) und Larock, R. C., "Comprehensive Organic Transformations", VCH Publishers, Inc., 1989, p. 479)]. In beiden Fällen ergibt dann die Entfernung von jeglichen, restlichen Schutzgruppen die Verbindungen der Formel I (R&sub1; = OH; R&sub4;, R&sub5; = H).
Verbindungen der Formel I (R&sub1; = OH; R&sub4; = H; R&sub5; und R&sub6; bilden zusammen eine zusätzliche Bindung, i. e. eine Δ²&sup4; Doppelbindung) können ausgehend vom Aldehyd II wiefolgt erhalten werden: der Letztere wird mit dem Anion von Acetonitril [MCH2C N, M = Li, Na, K, MgX, ZnX; siehe: Arseniyadis, S. et al., Org. React. 31, 1 (1984)] reagiert, um ein diasteroisomeres Paar von 22R und 22S-Hydroxycholan-24-nitril Derivaten zu ergeben. Nach Isolierung des 22S-Hydroxy-Epimers wird die 22S-Hydroxygruppe in Form eines Silylethers oder eines Alkoxyalkylethers geschützt. Falls notwendig wird die 3-Hydroxygruppe nochmals auf die gleiche Weise oder mit einer orthogonalen Schutzgruppe geschützt. Die Cyanogruppe wird zur entsprechenden Carboxaldehydgruppe reduziert mittels Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie zum Beispiel Diisobutylaluminumhydrid, oder anderen Reduktionsmitteln, die fähig sind eine Carbonitrilgruppe in eine Carboxaldehydgruppe umzuwandeln. Anschliessend ergibt eine Wittig Reaktion mit einem geeignet substituierten Wittig Reagens und Entfernung der Schutzgruppen die Cholest-24-ene der Formel I (R&sub1; = OH; R&sub4; = H; R&sub5; und R&sub6; bilden zusammen eine Δ²&sup4; Doppelbindung).
Für die für die Wittig Olefinierungsreaktion verwendeten Verfahren siehe Maercker, A. Org.React. 14, 270 (1965). Andernfalls können Peterson-Reaktionen verwendet werden, siehe Ager, D. J. Org. React. 38, 1 (1990).
Die Wittig Reaktion kann auch in die entgegengesetzte Richtung durchgeführt werden. In diesem Fall wird das hierin zuvor erwähnte Cholan-24-al Derivat unter Verwendung von Reduktionsmitteln wie zum Beispiel Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborohydrid oder anderen, wohlbekannten Reduktionsmitteln zum entsprechenden Cholan-24-ol Derivat reduziert. Die 24-Hydroxygruppe wird zu einer Abgangsgruppe umgewandelt, z. Bsp. Br, I, Mesyloxy oder Tosyloxy. Reaktion mit einem geeigneten Phosphin (z. Bsp. Triphenylphosphin), Wittig Reaktion mit einem passend substituierten Keton und schliesslich Entfernung der Schutzgruppen führt dann zur Bildung von Verbindungen der Formel I (R&sub1; = OH; R&sub4; = R&sub5; und R&sub6; bilden zusammen eine Δ²&sup4; Doppelbindung).
Herstellung von Δ²&sup4;-Cholestanen I von Aldehyden II kann ebenso mittels einer analogen Reaktionssequenz, die von Essigsäureanionen oder Essigsäureesteranionen Gebrauch macht, erreicht werden [siehe: Petragnani, N. et al., Synthesis, 521 (1982)]. Methoden zur Homologisierung sind wohlbekannt, siehe zum Beispiel Mathieu, J. et al., Formation of C-C Bonds, Vol. I-III, Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1973.
Ein selektives Entschützen von 3-OH und 22-OH ermöglicht unter Verwendung wohlbekannter Methoden eine unabhängige Umwandlung von 3-OH zu 3-OR, OSO&sub3;H oder =NOR (R wie zuvor definiert) beziehungsweise von 22-OH zu 22-OR&sub4; (R&sub4; wie zuvor definiert).
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

(3β,5α,20S,22S)-4'4-Dimethylcholesta-8,14-dien-3,22-diol.

(i) -Eine Lösung von 3-Methylbutylmagnesiumiodid (12 ml), hergestellt von 1-Iodo-3-methylbutan (2.36 ml) und Magnesium (0.48 g), aktiviert mit 1,2-Dibromomethan (0.040 ml), in Diethylether (10 ml beziehungsweise 10 ml) bei Rückflusstemperatur wurde tropfenweise zu (3β,5α,20S)-3-(benzoyloxy)-4,4-dimethylpregna- 8,14-dien-20-carboxaldehyd (WO-09852965; 1.55 g) in THF (20 ml) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 45 Min gerührt und dann in gesättigte, wässrige Ammoniumchloridlösung gegossen. Das Produkt wurde in Ethylacetat extrahiert: die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Ammoniumchloridlösung und mit gesättigter Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt. Säulenchromatographie ergab (3β,5α,20S,22S)-4,4-dimethylcholesta-8,14-dien-3,22-diol-3- benzoat (1.1 g).
ii) - Eine Lösung des unter I erhaltenen Produktes (0.35 g) in trockenem Tetrahydrofuran (5 ml) wurde tropfenweise zu einer eisgekühlten Suspension von Lithiumaluminumhydrid (0.075 g) in trockenem Tetrahydrofuran (5 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0ºC gekühlt und dann mit einer gesättigten, wässrigen Natriumsulfatlösung gequencht. Danach wurde es über Dicalite filtriert und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingeengt, um nach Säulenchromatographie (3β,5α,20S,22S)-4,4- Dimethylcholesta-8,14-dien-3,22-diol (0.18 g), Schmp. 142-143 ºC, zu ergeben.

Beispiel 2

(3β,5α,20S,22S)-4,4-Dimethylcholesta-8,14,24-trien-3,22-diol

i) -Tetrapropylammoniumperruthenat (0.180 g) wurde zu einer Lösung von (3β,5α,20S)-4,4,20-Trimethylpregna-8,14-dien-3,21- diol-3-benzoat (WO-09852965; 4.62 g) und 4-Methylmorpholin N- oxid (3.50 g) in Aceton (80 ml) gegeben. Nach 30 Min Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch über Dicalite und Silica filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingeengt um (3β,5α,20S)-3-(Benzoyloxy)-4,4-dimethylpregna-8,14- dien-20-carboxaldehyd (4.28 g) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
ii) - Eine Lösung von Diisopropylamin (8.4 ml) in trockenem THF (100 ml) wurde auf -30ºC gekühlt. N-BuLi (1.6 M Lösung in Hexan, 37.6 ml) wurde tropfenweise hinzugegeben, wobei man die Temperatur auf -5ºC ansteigen liess. Man liess für weitere 10 Min rühren, wonach das Reaktionsgemisch auf -78ºC gekühlt wurde. Acetonitril (3.14 ml) wurde tropfenweise wahrend 5 Min hinzugegeben und man liess für weitere 30 Min rühren. Eine Lösung des im vorausgehenden Schritt erhaltenen Aldehyds (4.28 g) in THF (60 ml) wurde tropfenweise hinzugegeben und das Gemisch wurde bei -78ºC für 2 h gerührt. Danach wurde es in eine gesättigte, wässrige Ammoniumchloridlösung gegossen und das Produkt wurde in Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt. Säulenchromatographie ergab (3β,5α,20S,22R)-3,22-Dihydroxy-4,4- dimethylchola-8,14-dien-24-nitril (1.23 g) und
(3β,5α,20S,22S)-3,22-Dihydroxy-4,4-dimethylchola-8,14-dien-24- nitril (0.85 g).
(iii) - Pyridin p-toluolsulfonat (0.20 g) wurde zu einer Lösung von (3β,5α,20S,22S)-3,22-Dihydroxy-4,4-dimethylchola-8,14-dien- 24-nitril (0.70 g) in Dichloromethan (8 ml) und Ethylvinylether (4 ml) gegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Gemisch in eine gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen. Das Produkt wurde in Diethylether extrahiert, die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt um (3β,5α,20S,22S)-3,22-Bis[(1-ethoxyethyl)oxy]-4,4- dimethylchola-8,14-dien-24-nitril (1.0 g) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
(iv) - Diisobutylaluminiumhydrid (20% Lösung in Toluol, 8 ml) wurde auf -78ºC gekühlt. Eine Lösung der im vorausgehenden Schritt erhaltenen Verbindung (1.0 g) in trockenem THF (10 ml) wurde tropfenweise hinzugegeben und man liess für 15 Min bei - 78ºC und danach für 1.5 h bei 0 C weiterrühren. Die Reaktion wurde mit einer wässrigen Essigsäurelösung (20%, 0ºC) gequericht. Das Reaktionsgemisch wurde in eine gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen und das Produkt wurde in Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen Wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt um (3β,5α,20S,22S)-3,22-Bis[(1-ethoxyethyl)oxy]-4,4-dimethylchola- 8,14-dien-24-al (0.96 g) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
(v) - Eine Suspension von i-Propyltriphenylphosphoniumbromid (4.57 g) in trockenem THF (20 ml) wurde auf -30ºC gekühlt. n- BuLi (1.6 M Lösung in Hexan, 6.50 ml) wurde tropfenweise hinzugegeben, wonach man die Temperatur über 30 Min auf 0ºC ansteigen liess. Man liess für 30 Min bei 0ºC und danach für weitere 30 Min bei Raumtemperatur rühren. Nachdem auf -30ºC gekühlt wurde, wurde eine Lösung des im vorangehenden Schritt erhaltenen Aldehyds (0.96 g) in THF (15 ml) hinzugegeben und das Gemisch wurde für 1 h gerührt, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen liess. Dann wurde sie in gesättigte, wässrige Ammoniumchloridlösung gegossen und das Produkt wurde in Ethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt um ein Gemisch von (3β,5α,20S,22S)-3,22-bis[(1-ethoxyethyl)oxy]-4,4- dimethylcholesta-8,14,24-trien Phosphoniumsalz und Triphenylphosphinoxid (1.86 g) zu erhalten, welches ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
(vi) - Ein Gemisch von Silica (12 g), eine gesättigte, wässrige Oxalsäurelösung (2 ml) und Dichloromethan (20 ml) wurden bei Raumtemperatur für 10 Min gerührt. Eine Lösung des im vorangehenden Schritt erhaltenen Produktes (1.86g) in Dichloromethan (10 ml) wurde hinzugegeben und man liess für 3 h rühren. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck eingeengt. Säulenchromatographie des Rohproduktes ergab (3β,5α,20S,22S)-4,4-dimethylcholesta-8,14,24-trien-3,22-diol (0.25 g), Scbinp. 106-108ºC).

Beispiel 3

DER OOZYTENASSAY

Allgemein:

In der Meiose arretierte Oozyten enthalten diffuse Chromosomen, die von einer intakten nuklearen Hülle bekannt als Germinalvesikel (GV) umgeben sind. Nach Wiedereinsetzung der Meiose durch den Midzyklus Gonadotropin Anstieg, rekondensieren die Chromosomen und das GV wird abgebaut (Germinal Vesicle Breakdown, GVBD). In vivo ist die Oozyte Hypoxanthin (HX) ausgesetzt, das die Arretierung der Oozyte in der meiotischen Prophase aufrecht erhält. Dieser meiotische Arrest kann in vitro durch Zugabe von Hypoxanthin zum Kulturmedium nachgeahmt werden. Die agonistische Aktivitat der meiose-aktivierenden Substanzen wird als Fähigkeit die durch Hypoxanthin aufrecherhaltene, meiotischen Arretierung in denudierten Oozyten (denuded oocytes, DO) oder Kumulus-eingebetteten Oozyten (cumulus enclosed oocytes, CEO) zu überwinden, i. e. als Fähigkeit die meiotische Wiedereinsetzung in vitro zu induzieren.

Isolation der Kumulus eingebetteten Oozyten

Ovarien wurden von unreifen, weiblichen Mäusen (B6D2-F1, C57BL x DBA Stamm) erhalten. Im Alter von 19, 20 oder 21 Tagen wurden die Mäuse subkutan mit einer einzigen Dosis von 20 IU Follikelstimulierendem Hormon (Humegon, Organon, Niederlande) in Sälzlösung iniziiert.
Actundvierzig Stunden nach der Follikelstimulierenden Hormon Injektion wurden die Mäuse mittels Zervixdislozierung getötet. Die Ovarien wurden entfernt, von Fremdgewebe befreit und in ein Multidish, der 0.5 ml Präparationsmedium bei 37ºC enthielt, gegeben. L-15 Leibowitz Medium (Gibco, pH 7.3 + 0.1), angereichert mit Bovinem Serum-Albumin (3 mgml-1), L-Glutamin (0.23 mM), Natriumpyruvat (2mM) und Hypoxanthin (4 mM), wurde als Präparationsmedium verwendet. Die antralen Follikel der Ovarien wurden unter einem Präpariermikroskop mit zwei an zwei 1 ml Spritzen befestigten 27-Kaliber Nadeln punktiert. Die Kumuluseingebetteten Oozyten (CEO) von einheitlicher Grösse wurden mit einer mundkontrolllierten Pipette ausgewählt und in 0.5 ml frischem Präparationsmedium gewaschen. Ungefähr 20 CEO wurden von einem Eierstock erhalten.

Isolierung der denudierten Oozyten:

Die von Kumuluszellen befreiten Oozyten, i. e. denudierte Oozyten (DO), wurden erhalten, indem man vorsichtig die CEO durch eine kleinkalibrige, mundkontrollierte Pipette wusch. DO wurden in frischem MEM alpha Medium, das Bovines Serum-Albumin (3 mg ml- 1), L-Glutamin (0.23 mM), Natriumopyruvat (2 mM) und Hypoxanthin (4 mM) enthielt, gesammelt und vor dem Transfer zum Testmedium zweimal gewaschen.

Experimentelles Design

Der Oozytenassay wird in 3 Blocks durchgeführt, wobei jeder Block die Eierstöcke einer Maus darstellt (Randomized Blockdesign). Bei t = 0 werden die DO oder CEO des ersten Eierstocks der ersten Maus über die Vertiefungen 1 und 3 und die Oozyten des zweiten Eierstocks über die Vertiefungen 2 und 4 einer Multiplatte mit 4 Vertiefungen verteilt, wobei diese 0.5 ml Kulturmedium enthält, zu welchem ein 22S-Hydroxycholesta-8,14-dien Derivat hinzugegeben wird [erster Block]. Das Kulturmedium wurde als Kontrolle verwendet. Das gleiche Verfahren wird bei der zweiten und dritten Maus angewandt [Block 2 und 3]. Das verwendete Kulturmedium ist MEM alpha Medium (Gibco, pH 7.3 ± 0.1), gesättigt mit CO&sub2; und angereichert mit Bovinem Serum-Albumin (3 mgml-1), L-Glutamin (0.23 mM), Natriumpyruvat (2 mM) und Hypoxanthin (4 mM). Im Ganzen wird jede Kontroll- oder Testverbindung an 30 Oozyten (10 Oozyten pro Block) getestet. Bei t = 0 wird die Oozytenzahl mit intakten Germinalvesikeln (GV) oder Germinalvesikel Abbau (GVBD) unter einem invertierten Mikroskop mit Differential-Interferenz-Kontrast Ausrüstung gezählt. Nur Oozyten mit einem intakten GV wurden im Experiment verwendet. Die Oozyten wurden für 22 Stunden bei 37ºC in 100% befeuchtetere Atmosphere mit 5% CO&sub2; in der Luft kultiviert. Am Ende der Kultivierungszeit wurde die Oozytenzahl mit GV oder GVBD pro Gruppe gezählt. Für die statistische Analyse wurde der prozentuale Anteil an Germinalvesikel Abbau für jede Gruppe in einem Block berechnet. Diese Prozentzahlen wurden einer arcsin Transformation unterworfen und die Unterschiede zwischen Kontroll- und Testverbindungen wurden mittels eines ANOVA Tests für einen Randomized Blockdesign analysiert. Die Resultate werden in Tabelle I dargestellt. TABELLE 1 Prozent Germinalvesikel Abbau (GVBD) in Oozyten nach Kultivierung in Gegenwart von Testverbindungen in agonistischen Tests.
¹ Jede Verbindung wurde bei einer Konzentration von 5 pH getestet.
² Bei einer Konzentration von 10 uM getestet.

Claims

1. Ein 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivat der allgemeinen Formel I.

Formel I

worin

R&sub1; OR, OSO&sub3;H oder =NOR bedeutet r worin R H, (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl oder (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl bedeutet;

R&sub2; und R&sub3; je unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C&sub1;&submin; &sub6;)alkyl bedeuten;

R&sub4; Wasserstoff, (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl oder (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl bedeutet;

R&sub5; Wasserstoff bedeutet; oder R&sub5; zusammen mit R&sub6; eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welchen R&sub5; und R&sub6; angebracht sind, bezeichnet;

R&sub6; Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen bedeutet; oder R&sub6; zusammen mit R&sub5; eine zusätzliche Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, an welchen R&sub6; und R&sub5; angebracht sind, bezeichnet;

R&sub7; und R&sub8; je unabhängig voneinander Wasserstoff oder gegebenenfalls mit OH, (C&sub1;&submin;&sub4;) alkoxy oder Halogen substituiertes (C&sub1;&submin;&sub6;)alkyl bedeuten;

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Ein 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass C-20 die 20S Konfiguration

3. Ein 22S-hydrocycholesta-8,14-dien Derivat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R&sub1; OR bedeutet, worin R H oder (C&sub1;&submin;&sub6;)acyl bedeutet und die Konfiguration des 3-OR Substituenten die β-Konfiguration ist.

4. Ein 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (3β,Sα,20S,22S)-4,4- dimethylcholesta-8,14-dien-3,22-diol und (3β,5α,20S,22S)- 4,4-dimethylcholesta-8,14,24-trien-3,22-diol.

5. Ein 22S-hydroxycholesta-8,14-dien Derivat der allgemeinen Formel 1 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung in einer Therapie.

6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein 22S- hydroxycholesta-8,14-dien Derivat der allgemeinen Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon unter Beimischung von pharmazeutisch verträglichen Hiltsstoffen.

7. Verwendung eines 22S-hydtoxycholesta-8,14-dien Derivates der allgemeinen Formel T oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Fruchtbarkeitskontrolle.