DE69836321T2

DE69836321T2 - Pflanzenextrakte mit appetitzügelnder Aktivität

Info

Publication number: DE69836321T2
Application number: DE69836321T
Authority: DE
Inventors: Retief Fanie VAN HEERDEN; Robert Vleggaar; Marthinus Roelof HORAK; Alec Robin LEARMONTH; Vinesh Maharaj; Desmond Rory WHITTAL
Original assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: JP2003026591A; EA199900932A1; EP1222927A3; TR199902540T2; AP2003002729A0; DE69836321D1; JP2000510482A; IS5196A; CN1252000A; HK1026373A1; ES2321162T3; SA98190501B1; TW200300094A; DK0973534T3; PE85699A1; ES2363230T3; WO1998046243A2; EP1598054B1; US20040228935A1; NO994992D0

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines aus Pflanzen der Gruppe umfassend die Gattungen Trichocaulon und Hoodia hergestellten Pflanzenextrakts mit appetitzügelnder Wirkung.
Der Extrakt kann aus Pflanzenmaterial wie zum Beispiel den Stängeln und Wurzeln der Pflanzen der Gattungen Trichocaulon und Hoodia hergestellt werden. Die Gattungen Trichocaulon und Hoodia beinhalten in zum Beispiel in Südafrika vorzufindenden Trockengebieten wachsende sukkulente Pflanzen. In einer erfindungsgemäßen Anwendung wird der appetitzügelnde Extrakt aus der Art Trichocaulon piliferum gewonnen. Die Art Trichocaulon officinale kann ebenfalls zur Bereitstellung eines wirksamen appetitzügelnden Extrakts verwendet werden. In einer weiteren erfindungsgemäßen Anwendung kann der wirksame appetitzügelnde Extrakt aus den Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii oder Hoodia lugardii gewonnen werden. Von den Anmeldern bei Ratten durchgeführte Bioassays haben gezeigt, dass bestimmte Extrakte appetitzügelnde Aktivität besitzen.
Das Pflanzenmaterial kann in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels wie zum Beispiel einem Methanol/Methylenchlorid-Lösungsmittel mit Hilfe eines Gerätes wie zum Beispiel einem Mixer der Firma Waring (Waring blender) homogenisiert werden. Die Extraktionslösung kann dann mit geeigneten Trennverfahren, wie zum Beispiel Filtration oder Zentrifugation, vom restlichen Pflanzenmaterial getrennt werden. Das Lösungsmittel kann mit Hilfe eines Rotationsverdampfers vorzugsweise in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 60°C entfernt werden. Der abgetrennte Rohextrakt kann dann weiter mit Methylenchlorid und Wasser extrahiert werden, bevor er in einen Methylenchloridextrakt und einen Wasserextrakt aufgetrennt wird. Aus dem Methylenchloridextrakt kann das Lösungsmittel vorzugsweise mit Hilfe von Verdampfung in einem Rotationsverdampfer entfernt und der resultierende Extrakt kann weiter mittels einer Methanol/Hexanextraktion gereinigt werden. Das Produkt der Methanol/Hexanextraktion kann dann zur Bereitstellung eines Methanol- und eines Hexanextraktes getrennt werden. Der Methanolextrakt kann zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft werden, um einen teilgereinigten wirksamen Extrakt bereitzustellen.
Der teilgereinigte wirksame Extrakt kann in Methanol gelöst und unter Einsatz von Kieselgel als Adsorptionsmittel durch Säulenchromatographie weiter fraktioniert werden. Eine Vielzahl unterschiedlicher Fraktionen kann gewonnen und jede durch geeignete Bioassay-Verfahren zur Bestimmung ihrer appititzügelnden Wirksamkeit bewertet werden.
Eine Fraktion mit appetitzügelnder Wirksamkeit kann vorzugsweise weiter fraktioniert werden, zum Beispiel durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmedium und Chloroform/Methanol (9:1) als Lösungsmittel, und die resultierenden Subfraktionen können hinsichtlich ihrer appetitzügelnden Wirksamkeit einem Bioassay unterworfen werden. Eine appetitzügelnde Wirkung zeigende Subfraktion kann, falls gewünscht, weiter fraktioniert und gereinigt werden, bequemerweise unter Verwendung eines säulenchromatographischen Verfahrens mit Kieselgel als Adsorptionmedium und 9:1 Ethylacetat:Hexan als Lösungsmittel. Die resultierenden gereinigten Fraktionen können erneut durch geeignete Bioassay-Verfahren bezüglich ihrer appetitzügelnden Aktivität bewertet werden.
Die Anmelder haben gefunden, dass mindestens eine solche gereinigte Fraktion gute appetitzügelnde Aktivität hat und das Wirkungsprinzip in der Fraktion wurde durch konventionelle chemische Techniken einschließlich NMR identifiziert und es wurde gefunden, dass es sich um eine Verbindung der Strukturformel
handelt.
Gemäß der SI-Nomenklatur ist das Wirkungsprinzip (1) die Verbindung 3-0-[-β-D-Thevetopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl]-12β-O-tigloyloxy-14-hydroxy-14β-pregn-50-en-20-on (C₄₇H₇₄O₁₅M⁺878).
Verbindung (1) ist eine neue Verbindung und dieses Steroidtrisaccharid hat appetitzügelnde Eigenschaften. Die vorliegende Erfindung stellt damit in einem ersten Ziel die Verwendung eines Extrakts aus einer Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia zur Herstellung eines Arzneimittels mit appetitzügelnder Aktivität zur Behandlung, Verhütung oder Bekämpfung der Fettleibigkeit eines Menschen oder eines Tieres bereit, wobei der Extrakt eine wirksame Menge eines appetitzügelnden Steroidglycosids der Pflanze enthält, worin das Steroidglycosid die Formel
hat.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem zweiten Ziel ein nicht-therapeutisches Verfahren zur Reduktion der Gesamtkalorienaufnahme eines Menschen oder Tieres bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung eines einen Extrakt einer Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia enthaltenden Nahrungsmittels oder Getränks an den Menschen oder das Tier umfasst, wobei der Extrakt eine wirksame Menge eines appetitzügelnden Steroidglycosids der Pflanze enthält, worin das Steroidglycosid die oben angegebene Formel (1) hat.
Der Extrakt kann zum Beispiel durch ein die Schritte Behandlung des Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel zur Extraktion einer Fraktion mit appetitzügelnder Aktivität, Trennung der Extraktionslösung vom Rest des Pflanzenmaterials, Entfernung des Lösungsmittels aus der Extraktionslösung und Rückgewinnung des Extrakts umfassendes Verfahren gewonnen werden.
Der Extrakt kann zum Beispiel durch ein die Schritte Pressen des Pflanzenmaterials zur Trennung des Saftes vom festen Pflanzenmaterial und Rückgewinnung des von festem Pflanzenmaterial freien Saftes zur Darstellung des Extrakts umfassendes Verfahren gewonnen werden.
Die Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia kann zum Beispiel aus den Arten Trichocaulon piliferum und Trichocaulon officinale und die Pflanze der Gattung Hoodia kann zum Beispiel aus den Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt sein.
Die Pflanze kann zum Beispiel aus Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt sein. In einem Beispiel ist die Pflanze Hoodia gordonii.
Der Extrakt aus dieser Pflanze kann zum Beispiel ein Extrakt sein, bei dem im Wesentlichen alle nicht aktiven Verunreinigungen entfernt wurden.
Das Verfahren kann zum Beispiel den Schritt der Aufkonzentrierung des Wirkstoffes in dem extrahierten Material durch weitere Extraktion mit einem Lösungsmittel beinhalten.
Das Lösungsmittel in dem/den Lösungsmittel-Extraktionsverfahrensschritt(en) kann zum Beispiel eines oder mehrere der Lösungsmittel Methylenchlorid, Wasser, Methanol, Hexan, Ethylacetat oder Mischungen davon sein.
Das Verfahren kann zum Beispiel den Schritt der Aufkonzentrierung des Wirkstoffs in dem extrahierten Material durch chromatographische Trennung beinhalten. Bei der chromatographischen Trennung können zum Beispiel eines oder mehrere der Lösungsmittel Chloroform, Methanol, Ethylacetat, Hexan oder Mischungen davon verwendet werden. Das Verfahren kann zum Beispiel die Durchführung der chromatographischen Trennung auf einer Säule, Sammeln des Eluats aus der Säule in Fraktionen, Bewerten der Fraktionen zur Bestimmung ihrer appetitzügelnden Wirkung und Auswählen mindestens einer, den appetitzügelnden Wirkstoff enthaltenden Fraktion beinhalten.
In dem Verfahren zur Gewinnung des Extrakts kann der Extrakt zum Beispiel zur Bildung eines rieselfähigen Pulvers weiterverarbeitet werden. Zum Beispiel kann der Extrakt zur Entfernung der Feuchtigkeit, z.B. durch Sprühtrocknen, Gefriertrocknen oder Trocknen im Vakuum zur Bildung eines rieselfähigen Pulvers getrocknet werden.
Der Extrakt kann zum Beispiel auch in eine weitere pharmazeutisch annehmbare Inhaltsstoffe enthaltende Zusammensetzung oder Formulierung eingebracht werden. Damit kann das Arzneimittel zum Beispiel durch Mischung einer den Extrakt enthaltenden Zusammensetzung mit appetitzügelnder Aktivität mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger hergestellt werden.
Das Arzneimittel wird ggf. in Dosiseinheitsform hergestellt.
Das appetitzügelnde Mittel aus Formel (1) kann zum Beispiel als eine isolierte Verbindung (natürliche Chemikalie) aus der Pflanze gewonnen werden, nämlich einer Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia, zum Beispiel eine Pflanze der Arten Trichocaulon piliferum oder Trichocaulon officinale oder der Arten Hoodia currori, Hoodia gordonii oder Hoodia lugardii. Die isolierte Verbindung kann zur Bereitstellung einer Verbindung (1) mit appetitzügelnder Aktivität durch Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger weiter verarbeitet werden. Eine solche Zusammensetzung kann zum Beispiel in Dosiseinheitsformen hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (1) kann zum Beispiel aus einer Pflanze der Arten Trichocaulon piliferum oder Trichocaulon officinale oder den Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii oder Hoodia lugardii isoliert und/oder gereinigt werden. Die isolierte und/oder gereinigte Verbindung kann durch Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger zur Bereitstellung einer die Verbindung (1) umfassenden Zusammensetzung mit appetitzügelnder Aktivität weiterverarbeitet werden. Eine solche Zusammensetzung kann zum Beispiel in einer Dosiseinheitsform hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (1) kann zum Beispiel aus einem von einer Pflanze der Arten Trichocaulon piliferum oder Trichocaulon officinale oder der Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii oder Hoodia lugardii stammenden Extrakt isoliert und/oder gereinigt werden. Die isolierte und/oder gereinigte Verbindung kann dann durch Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger zur Bereitstellung einer die Verbindung (1) umfassenden Zusammensetzung mit appetitzügelnder Aktivität weiterverarbeitet werden. Eine solche Verbindung kann zum Beispiel in einer Dosiseinheitsform hergestellt werden.
Das appetitzügelnde Mittel kann zum Beispiel eine isolierte natürliche Chemikalie der Formel
sein.
Die appetitzügelnde Verbindung oder Formulierung kann aus einem mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger vermischten appetitzügelnden Mittel bestehen. Weitere geeignete Zusatzstoffe einschließlich eines Stabilisators und weitere solche möglicherweise gewünschte Inhaltsstoffe können zugesetzt werden.
Ein Verfahren zur Appetitzügelung durch Verabreichung einer wirksamen Dosis einer wie oben beschriebenen Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier wird somit ermöglicht.
Die Erfindung ermöglicht somit die Verwendung eines aus Pflanzenmaterial der Gattungen Trichocaulon oder Hoodia gewonnenen, ein im Wesentlichen reines Steroidglycosid der Formel (1) enthaltenden Extrakts.
Die Erfindung ermöglicht ebenfalls die Verwendung eines eine wirksame Menge eines Steroidglycosids der Formel (1) enthaltenden Nahrungsmittels oder Getränks, das bei Genuss eine appetitzügelnde Wirkung erzielt.
Molekulargenetische Studien haben zu einem erheblichen Anstieg im Verständnis der Regulation von Appetit, Sättigung und Körpergewicht geführt. Diese Studien haben zahlreiche, durch eine Anzahl von Neuropeptiden gesteuerte, zentralregulatorische Stoffwechselwege aufgezeigt. Die Aufrechterhaltung eines normalen Körpergewichts wird durch ein komplexes Gleichgewicht zwischen Energieaufnahme, Genuss von Nahrungsmitteln und Energieverbrauch erreicht. Die Energie-Homeostase ist Gegenstand eines weiten Bereichs von Einflüssen und wird letztlich vom Gehirn kontrolliert. Die verschiedenen Signale beinhalten solche Dinge wie Geruchssinn, Geschmack und gastrointestinale Signale wie zum Beispiel die Ausdehnung des Gastrointestinaltrakts, chemische Signale der Magenschleimhaut und über das Blut transportierte Metaboliten wie zum Beispiel Fettsäuren und Glucose.
Zentral gesehen ist das negativ durch Leptin regulierte Neuropeptid „Y" (NPY) als einer von mehreren positiven Regulatoren des Essverhaltens bekannt. Die Expression des endogenen Antagonisten der Melanocortin-Rezeptoren hat sich in einem bestimmten Modell (das ob/ob-Maus-Modell) als Grundlage der Fettleibigkeit erwiesen. Tatsächlich reproduziert eine Defizienz beim MC4-Melacortin-Rezeptor vollständig das Fettlebigkeits-Syndrom. Weitere Vermittler, für die gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei der Energiebilanz spielen, beinhalten Bombesin, Galonin und das Glucagon-ähnliche Peptid-1.
Die Erfindung und deren Wirksamkeit werden nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen ohne Einschränkung des Schutzumfangs weiter beschrieben.
Bei den Zeichnungen
zeigt 1 ein Flussdiagramm eines allgemeinen Verfahrens der Extraktion eines ersten appetitzügelnden Rohextraktes und eines gereinigten appetitzügelnden Extrakts aus Pflanzenmaterial der Gattungen Trichocaulon oder Hoodia;
zeigt 2 eine graphische Darstellung eines an Ratten unter Verwendung eines bestimmten gereinigten Methanol-Extrakts von Trichocaulon piliferum durchgeführten Bioassays;
zeigen 3 und 4 zusammen eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Extrakts aus Pflanzenmaterial der Gattungen Trichocaulon oder Hoodia und
zeigen 5 und 6 eine graphische Darstellung der prozentualen Änderung der Körpermasse von Ratten für verschiedene Gruppen während der Tage –7 bis 7 bzw. der Tage 0 bis 7 in einer Studie mit wiederholten Dosen unter Verwendung eines Pflanzensaftextraktes und eines sprühgetrockneten Pflanzensaftextraktes aus Pflanzenmaterial der Art Hoodia gordonii.
BEISPIEL 1
Ein allgemeines Verfahren zum Extrahieren eines ersten appetitzügelnden Rohextraktes und eines gereinigten appetitzügelnden Extraktes aus Pflanzenmaterial der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia ist durch das Flussdiagramm gemäß 1 dargestellt.
BEISPIEL 2
An Ratten unter Verwendung eines in der in Beispiel 1 veranschaulichten Weise gewonnenen teilgereinigten Methanolextrakts durchgeführten Bioassays zeigen, dass der Extrakt tatsächlich appetitzügelnde Aktivität zeigt. Die appetitzügelnde Aktivität des aktiven Extrakts kann durch ein typisches Beispiel der Wirkung des Methanolextraktes aus Trichocaulon piliferum auf Ratten durch die graphische Darstellung gemäß 2 veranschaulicht werden.
Es wird aus 2 offensichtlich, dass die mit Extrakt an Tag 5 dosierte Testgruppe der Ratten eine deutlich verringerte Nahrungsaufnahme gegenüber den nächsten beiden Tagen zeigte, während die Kontrollgruppe keine vergleichbare reduzierte Nahrungsaufnahme erkennen ließ. Die Nahrungsaufnahme der Testgruppe ging auf normal zurück, und war tatsächlich von Tag 8 an erhöht.
BEISPIEL 3
Ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes mit appetitzügelnder Aktivität wird beispielhaft in den 3 und 4 schematisch veranschaulicht, wobei die beiden Figuren zusammen das umfangreiche Verfahren veranschaulichen. Wie für den Fachmann verständlich sein wird, können jedoch verschiedene weitere Verfahren verwendet werden.
Mit Bezug auf 3 wird das Pflanzenmaterial der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia über das Zuführband 1 in den Mixer 3, zum Beispiel ein Mixer der Firma Waring (Waring blender) mit einem über die Zuführleitung 2 zugeführten Lösungsmittel in Form einer Methylenchlorid/Methanol-Lösung eingebracht. Das homogenisierte Produkt wird dann über Leitung 4 dem Trennschritt 5, z.B. in Form eines Filters oder einer Zentrifuge zugeführt, und das restliche Pflanzenmaterial wird über Leitung 27 entfernt.
Die Lösungsmittel/Extrakt-Mischung wird über Leitung 6 dem Verdampfungsschritt 7 zugeführt, bei dem das Lösungsmittel zum Beispiel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers entfernt wird. Der getrocknete Rohextrakt wird über Leitung 8 unter Zugabe einer über Zuführleitung 29 eingebrachten Methylenchlorid/Wasserlösung einem weiteren Extraktionsschritt 9 zugeführt und dann über Leitung 11 einem Trennschritt 13, bei dem die Wasserfraktion über Leitung 31 entfernt wird. Die gelöste Extraktfraktion wird über Leitung 15 einem Trocknungsschritt 17 zugeführt, bei dem das Lösungsmittel z.B. mit einem Rotationsverdampfer verdampft wird.
Mit Bezug auf 4 wird der getrocknete Extrakt über Leitung 10 einem Extraktionsschritt 12 zugeführt. Eine Methanol/Hexan-Lösung wird ebenfalls über Leitung 14 in den Extraktionsschritt 12 zur weiteren Reinigung und Extraktion des getrockneten Extrakts eingespeist. Die Extrakt/Methanol-Mischung wird über Leitung 16 dem Trennschritt 18 zugeführt, die Hexan-Fraktion wird über Leitung 20 entfernt und die Methanol/Extrakt-Mischung wird dann über Leitung 22 in den Trocknungsschritt 24 eingespeist. In dem Trocknungsschritt wird das Lösungsmittel z.B. über einen Rotationsverdampfer entfernt.
Der getrocknete, teilgereinigte aktive Extrakt wird über Leitung 26 und unter Zugabe von Methanol über Leitung 28 einem Trennungsschritt und die gelöste Fraktion über Leitung 36 einer Chromatographiesäule 38 zugeführt.
Auf der Säule 38 wird die methanollösliche Fraktion unter Verwendung von Kieselgel und einem Chloroform/30% Methanol-Lösungsmittel in verschiedene, schematisch als Fraktionen I bis V bezeichnete Fraktionen weiter fraktioniert. Gemäß einem gegenwärtig von den Anmeldern durchgeführten Fraktionierungsverfahren ergab das Fraktionierungsverfahren die folgenden Fraktionsgewichte: I (3,9 g); II (2,6 g); III (2,1 g); IV (1,1 g) und V (2,0 g). Diese Fraktionen werden durch ein geeignetes Bioassay-Verfahren (in einem nicht gezeigten Schritt) einzeln bewertet und die eine deutliche appetitzügelnde Aktivität aufweisenden, als Fraktionen I und II identifizierten Fraktionen werden über die Zuführleitungen 40 und 42 in die Säulen 44 bzw. 46 eingespeist, wo sie weiter fraktioniert und durch Säulenschromotographie, wiederum unter Verwendung von Kieselgel und einem 9:1 Chloroform/Methanol-System, weiter fraktioniert und gereinigt werden.
Die aus Säule 44 gewonnenen Subfraktionen II (A)–(C) zeigen beim Assay keine bemerkenswerte appetitzügelnde Aktivität und können zur weiteren Fraktionierung rezykliert werden.
Die aus Säule 46 gewonnenen Subfraktionen I(A)–(L) werden (in einem nicht gezeigten Assay-Schritt) ebenfalls bewertet und für die Subfraktion I(C) wird eine deutliche appetitzügelnde Aktivität gefunden.
Die Subfraktion I(C) wird über Leitung 48 der Säule 50 zur weiteren Fraktionierung und Reinigung unter Verwendung von Kieselgel und einer 9:1 Ethylacetat:Hexan-Elutionslösung zugeführt. Bei den resultierenden gereinigten Fraktionen wird nach einem Testassay für die Fraktion I(C)(ii) gefunden, dass sie merkliche appetitzügelnde Aktivität besitzt.
Das gereinigte Produkt wird durch NMR-Spektroskopie (wie nachfolgend in den Tabellen 1 und 2 angegeben) als Verbindung (1) identifiziert. TABELLE 1 ¹H (300,13 MHz)-NMR-Daten für Verbindung (1) CDCl₃

^a,b,c können bei jeder Säule austauschbar sein
^d,e können bei jeder Säule austauschbar sein
^- bezieht sich auf die Atome der Tigloat-Gruppe

¹³

₃

* bezieht sich auf die Atome der Tigloat-Gruppe
IR-Daten: 3440 cm^–1 (OH), 2910 cm^–1 (CH), 1700 cm^–1 (C=0)
[α_D]²⁰ ₅₈₉ = 12,67° (C=3, CHCl₃)
Smp 147°C–152°C

BEISPIEL 4
Die Ergebnisse der folgenden drei Bioassays bezüglich der Appetitzügelung sind unten angeführt, nämlich

a) Irwin-Test
b) Akuter Toxizitätstest und
c) Appetitszügelungs-Test bei oraler Dosisgabe

a) Irwin-Test
Der Zweck dieses Tests war es, den wie hierin zuvor beschriebenen, aus Pflanzenextrakt hergestellten erfindungsgemäßen Appetitzügler nach dem reduzierten Tier-Irwin-Test bezüglich beruhigender und sedierender Wirkung zu bewerten.
Experimentelles Verfahren
Der Appetitzügler wurde von den Anmeldern durch ein hierin zuvor beschriebenes Verfahren aus Pflanzenmaterial extrahiert und zwei von vier Gruppen mit jeweils 3 Tieren verabreicht: eine Gruppe erhielt keine Behandlung, eine Gruppe erhielt Dimethylsulfoxid (DMSO), eine Gruppe erhielt eine Testprobe von 50 mg/kg und eine Gruppe erhielt eine Testprobe von 300 mg/kg. Die Behandlung erfolgte durch intraperitoneale Injektion und es wurden zu speziellen Intervallen bis zu 5 h nach Behandlung Überwachungen durchgeführt. Die einzigen Symptome außer denen bei der mit DMSO-behandelten Gruppe werden bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt.
Ergebnisse
Es war klar, dass das Lösungsmittel DMSO eine deutliche Wirkung auf die Tiere, besonders auf den Wärmeregulationsmechanismus, hatte. Die Körpertemperatur aller mit dem Lösungsmittel allein oder zusammen mit der Testprobe behandelten Tiere zeigte einen merklichen Abfall.
Tiere in der Gruppe mit niedriger Dosis zeigten verringerte Verteilung im Käfig und verringerte Bewegungsaktivität als alle anderen Gruppen einschließlich der Kontrollgruppe. Apathie wurde im selben Ausmaß wie bei der mit DMSO behandelten Gruppe gesehen. Verminderte Atmung wurde 15 bis 60 min nach Behandlung beobachtet. Ptosis (Schließen der Augenlider) wurde ebenfalls in einem höheren Ausmaß als in der DMSO-Gruppe beobachtet. Eine Reaktion der Ohrmuschel wurde ebenso beobachtet wie eine positive Fingerreaktion, was Ängstlichkeit anzeigt. Die Körpertemperatur fiel nach der Behandlung auf 32,7°C.
Die Tiere in der Gruppe mit hoher Dosis zeigten wie die anderen Gruppen eine anfänglich verringerte Verteilung im Käfig und verringerte Bewegungsaktivität, zeigten aber vermehrte Verteilung und Bewegungsaktivität vor dem ca. 1 h nach Behandlung eintretenden Tod. Schwere symmetrische klonische Konvulsionen traten 30 min nach Behandlung auf. Die Atmung nahm anfänglich ab, nahm aber vor dem Tod zu. Eine Ohrmuschelreaktion war verzögert und eine positive Finger-Reaktion wurde beobachtet, was Ängstlichkeit anzeigt, beides war wie bei den Tieren in der Gruppe mit niedriger Dosis beobachtet. Die Körpertemperatur fiel auf 30,7°C nach Behandlung. Erhöhte Passivität bezüglich des Aufenthaltsortes wurde ebenso beobachtet wie verringerter Körpertonus. Abnorme Drehung der Gliedmaßen wurde beobachtet, die Griffstärke nahm ab, es war keine Schmerzreaktion vorhanden und es trat der Verlust ausgleichender Reflexe auf.
Diskussion
Im Vergleich mit der Kontrolle und den DMSO behandelten Tieren zeigten die Tiere, die eine niedrige Dosis (50 mg/kg) erhalten hatten, nur eine verminderte Atmung und ein erhöhtes Ausmaß an Ptosis. Tiere, die die hohe Dosis (300 mg/kg) der Testprobe erhalten hatten, reagierten sehr intensiv, indem sie Konvulsionen zeigten und starben. Alle weiteren bei diesen Tieren gemachten Beobachtungen können den in Konvulsionen befindlichen und sterbenden Tieren zugeschrieben werden. Auf beruhigende und sedierende Wirkungen hinweisende Anzeichen, wie zum Beispiel verringerte Verteilung im Käfig, verringerte Bewegungsaktivität und Apathie in den Testgruppen, die der Testprobe zugeschrieben werden könnten, wurden nicht beobachtet.
Es kann deshalb der Schluss gezogen werden, dass die Testprobe bei 300 mg/kg für die Mäuse letal ist und bei 50 mg/kg Atemsuppressionswirkungen auf Mäuse hat, wenn sie intraperitoneal mit DMSO als Lösungsmittel gegeben wird.
b) Akuter Toxizitätstest
Der Zweck dieses Tests war, Informationen über die Toxizität der Testprobe zu erhalten.
Experimentelles Verfahren
Ein wie hierin beschrieben erfindungsgemäß hergestellter Pflanzenextrakt mit appetitzügelnder Wirkung wurde gereinigt und eine Testprobe in steigender Dosierung bei oraler Behandlung von Mäusen untersucht. Zwei Tiere wurden pro Dosisgruppe eingesetzt, außer in der höchsten Dosisgruppe, in der nur ein Tier behandelt wurde. Die Tiere wurden auf gute Gesundheit hin untersucht und ihre Körpermasse am Tag der Behandlung bestimmt.
Die Dosierungen lagen im Bereich von 100 mg/kg bis zu 3028,5 mg/kg. Die Dosis wurde berechnet und mit vorbereiteter Kartoffelstärke vermischt, so dass jedes Tier eine Gesamtdosis von 0,2 ml erhielt. Tier 13 erhielt 0,25 ml. Die Kartoffelstärke wurde durch Mischen von 20 g Stärke in einem kleinen Volumen kalten Wassers zubereitet und in kochendes Wasser gegeben, um ein Volumen von 1 l zu zu ergeben. Die Suspension wurde zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehengelassen.
Die Tiere in den Gruppen 1 und 2 wurden am selben Tag behandelt. Sie wurden während 24 h beobachtet und falls keine Zeichen von Toxizität auftraten, wurde die nächste Gruppe behandelt. Derselbe Ansatz wurde solange verfolgt, bis alle Tiere behandelt waren. Dieser Behandlungsplan wurde verfolgt, um sicherzustellen, dass Tiere nicht unnötig behandelt wurden, wenn eine akut toxische Dosis in der vorigen Gruppe erreicht worden war.
Die Tiere wurden auf klinische Anzeichen von Toxizität sofort (1 bis 2 h) nach Behandlung und danach täglich überwacht. Die Körpermasse wurde einmal pro Woche bestimmt und die Gesamtfutter- und -wasseraufnahme eines jeden Tieres gemessen.
Die überlebenden Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentabarbital (herkömmlich erhältlich unter dem Handelsnamen Euthanaze, Centaur^R) an Tag 14 des Versuchs getötet. Es wurde an diesen Tieren sowie an dem während des Experiments verstorbenen Tier eine Obduktion durchgeführt. Für die Histopathologie wurden Proben gesammelt.
Ergebnisse
Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Es wurden während der 14tägigen Beobachtungsphase keine klinischen Anzeichen für Toxizität beobachtet. Futter- und Wasseraufnahme waren innerhalb der normalen Parameter. Änderungen der Körpermasse waren ebenfalls innerhalb normaler Parameter. Es waren keine histopathologischen Veränderungen bei den Leberproben zu verzeichnen.
Gruppe 2 (100 mg/kg)
Es wurden während der Beobachtungsphase keine klinischen Anzeichen für Toxizität beobachtet. Futter- und Wasseraufnahme waren normal und Änderungen der Körpermasse waren während der Beobachtungsphase ebenfalls normal. Keine makroskopischen pathologischen Erscheinungen wurden beobachtet und es waren keine histopathologischen oder morphologischen Veränderungen bei den Leberproben zu verzeichnen.
Gruppe 3 (200 mg/kg)
Die Tiere in dieser Gruppe zeigten während des Experiments keine klinischen Toxizitätsanzeichen. Futter- und Wasseraufnahme waren ebenso normal wie die Veränderung der Körpermasse. Es wurden keine makroskopischen pathologischen Befunde beobachtet, aber die Lebern zeigten histopathologische Veränderungen bei der Untersuchung. Wolkige Schwellung der Hepatocyten waren mild bei Tier 6, aber moderat bei Tier 5. Bei Tier 5 trat ebenfalls eine moderate hydropische Degeneration der Hepatocyten auf.
Gruppe 4 (400 mg/kg)
Es wurden während des Beobachtungszeitraums keine klinischen Toxizitätsanzeichen und keine makroskopischen pathologischen Befunde während der Obduktion beobachtet. Moderate wolkige Schwellung und milde hydropische Veränderungen der Hepatocyten wurden bei der histologischen Untersuchung beobachtet.
Wasser- und Futteraufnahme und die Zunahme der Körpermasse waren bei Tier 7 normal. Tier 8 verzehrte fast das Doppelte der Gesamtnahrungsmenge von Tier 7 (144,6 g bzw. 73,9 g), aber die Zunahme an Körpermasse betrug nur 0,81 g im Vergleich zu 2,7 g.
Gruppe 5 (800 mg/kg)
Ein Tier (Tier 10) starb 3 h nach Dosisgabe, ohne besondere Anzeichen zu zeigen. Das andere Tier (Tier 9) überlebte den gesamten Beobachtungszeitraum ohne jedes Anzeichen von Toxizität. Die Wasseraufnahme war bei dem überlebenden Tier normal (42,2 ml), während die Nahrungsaufnahme hoch war (134,2 g). Die Körpermasse stieg um 2,85 g, was der höchste Anstieg bei allen Tieren in diesem Experiment war.
Bei der Obduktion von Tier 10, das kurz nach der oralen Dosisgabe verstarb, waren die Lungen gestaut. Es war keine Fremdkörperreaktion vorhanden, die inhaliertes Testmaterial angezeigt hätte. Keine makroskopischen, pathologischen Befunde wurden bei Tier 9 beobachtet. Milde cytoplasmatische Vakuolenbildung (hydropische Degeneration) war bei Tier 10, aber moderate bei Tier 9 vorhanden. Die glanduläre cyctoplasmatische Erscheinung der Leber wurde bei beiden Tieren als moderat eingestuft.
Gruppe 6 (1600 mg/kg)
Keines der Tiere wies während der Dauer des Experiments klinische Toxizitätsanzeichen auf. Keine makroskopischen pathologischen Befunde wurden bei der Obduktion beobachtet, aber moderate degenerative Veränderungen in der Leber der Tiere bei der histopathologischen Untersuchung. Tier 12 zeigte moderate wolkige Schwellung und milde hydropische Veränderungen der Hepatocyten. Futter- und Wasseraufnahme waren während der Versuchsphase ebenso normal wie der Anstieg der Körpermasse.
Gruppe 7 (3028,5 mg/kg)
Nur ein Tier wurde bei dieser Dosis getestet. Dieses Tier zeigte während des Beobachtungszeitraums keine Toxizitätsanzeichen und es wurden keine makroskopischen pathologischen Befunde beobachtet. Bei der histopathologischen Untersuchung wurden moderate, wolkige Schwellung und hydropische Degeneration der Hepatocyten beobachtet. Das Tier zeigte einen Verlust an Körpermasse während des Beobachtungszeitraums (–0,82 g), aber Futter- und Wasseraufnahme waren normal.
Diskussion
Da eine sehr kleine Anzahl von Tieren für jede Dosisgruppe eingesetzt wurde, ist es schwierig Schlüsse zu ziehen. Die Tatsache, dass nur ein Tier ohne Symptome zu zeigen bei einer niedrigen Dosis starb, könnte ein Anzeichen dafür sein, dass der Tod nicht mit der Testprobe zusammenhing, sondern aufgrund von Stress während und/oder nach der Behandlung eintrat. Keines der Tiere aus den Gruppen mit höherer Dosisierung starb oder zeigte Toxizitätsanzeichen, was diese Annahme weiter unterstützt.
Die bei Tier 8 beobachtete vermehrte Nahrungsaufnahme könnte einem übermäßigen Verstreuen von Futter zugeschrieben werden, was sich in der geringen Zunahme der Körpermasse widerspiegelt. Es sollte beachtet werden, dass alle Tiere in diesem Experiment nur einmal behandelt wurden und dass es unwahrscheinlich ist, dass ein Appetitzügler während eines 14tägigen Zeitraums, wie es in diesem Versuch der Fall war, einen merklichen Einfluss sowohl auf die Nahrungs- als auch auf die Wasseraufnahme oder die Körpermasse hat
Aus der histopathologischen Untersuchung der Leberproben ist es klar, dass die pathologischen Veränderungen dosisabhängig waren, wobei die Tiere, die höhere Dosierungen erhielten, umfassendere Veränderungen zeigten. Die beobachteten pathologischen Befunde waren nicht metabolischer Natur, aber möglicherweise durch die Testprobe induziert. Die Veränderungen waren nur degenerativ und daher reversibel. Es wurden keine Anzeichen für irreversible Leberzellveränderungen beobachtet.
Es kann daher geschlossen werden, dass nur ein Tier an einer niedrigen Dosis (800 mg/kg) verstarb, aber dass dieser Todesfall möglicherweise keinen Bezug zur Testprobe hatte. Keines der anderen Tiere aus einer der Dosisgruppen zeigte irgendwelche Anzeichen von Toxizität während der 14tägigen Beobachtungsphase nach dem Experiment oder verstarb als Folge der Behandlung. Eine einzige orale Dosis der Testprobe induzierte reversible dosisabhängige Leberzellveränderungen.
c) Appetitzügelungs-Test mit oraler Dosisgabe
Der Zweck dieses Tests war es, die Aktivität eines erfindungsgemäß hergestellten Pflanzenextraktes und das Minimum an wirksamer Dosis zu bestimmen und gleichzeitig mögliche Nebenwirkungen, wie die im Irwin-Test (oben angeführt) aufgetretene Atemsuppression, zu untersuchen.
Experimentelles Vorgehen
Die Tiere wurden unter Verwendung von Randomisierungstabellen in Behandlungsgruppen eingeteilt. Jede Behandlungsgruppe bestand aus drei Tieren, mit 6 Tieren in der Kontrollgruppe. Eine Dosis der Testprobe wurde jungen weiblichen Ratten mit einem Körperwicht von 100 bis 150 g bei der Eingewöhnung an drei aufeinander folgenden Tagen gegeben. Die Tiere wurden mit Hilfe metallischer Ohrmarken und mit KMnO₄-Hautmarkierungen zur leichten Identifizierung kenntlich gemacht. Die Tiere wurden einzeln in Polycarbonat-Standard-Nagerkäfigen untergebracht und Wasser und herkömmlich erhältliche, pulverisierte Nagerpellets standen ad libitum zur freien Verfügung. Die Wasser- und Futteraufnahme wurde gemessen und für jeden Tag berechnet. Um eine wirksame Minimaldosis der Testprobe zu finden, wurden fünf Dosierungen getestet. Die Behandlung erfolgte durch orale Sondenfütterung, wobei die Testprobe in Kartoffelstärke suspendiert war.
Die Testsubstanz war Verbindung (1), ein aus einem Extrakt aus Pflanzenmaterial erfindungsgemäß hergestelltes weißes gekörntes Pulver, und die gemessene Menge der Testprobe wurde mit der vorbereiteten Kartoffelstärke suspendiert und dosiert. Das Mischen mit der Kartoffelstärke fand jeden Tag unmittelbar vor der Dosisgabe statt. Die Suspensionen wurden vor jeder Entnahme eines Dosierungsvolumens für ein Tier unter Verwendung eines Vortex gründlich durchmischt.
Ein Bereich von 5 Dosierungen wurde getestet, wobei die Kontrollgruppe nur die Arzneimittelträgersubstanz erhielt. Die Dosierungen wurden auf der Basis der im zuvor beschriebenen Irwin-Test beobachteten Wirkungen ausgewählt und waren:

Gruppe 1: 0,00 mg/kg (Kontrollgruppe)

Gruppe 2: 6,25 mg/kg

Gruppe 3: 12,50 mg/kg

Gruppe 4: 25,00 mg/kg

Gruppe 5: 37,50 mg/kg

Gruppe 6: 50,00 mg/kg
Ergebnisse
Die Behandlung wirkte sich während der Studiendauer nicht auf Gesundheit der Tiere aus. In allen Dosisgruppen zeigten die mit der Testprobe behandelten Tiere während der gesamten Studiendauer eine signifikant verringerte mittlere Zunahme der Körpermasse und in drei von fünf Behandlungsgruppen verloren die Tier sogar Körpermasse.
Die mittlere Nahrungsaufnahme war bei allen Behandlungsgruppen während der Studiendauer reduziert. Die Tiere in den Gruppen mit höherer Dosis zeigten eine erhöhte Wasseraufnahme.
Die Atemfrequenz war bei keinem der Tiere in irgendeiner der Dosisgruppe signifikant betroffen.
Die Tiere zeigten bei der Obduktion in allen Dosisgruppen bröcklige Lebern, es wurden aber keine makroskopischen pathologischen Befunde beobachtet.
Diskussion
Die während der Eingewöhnungsphase gesammelten Daten bestätigten, dass alle in das Experiment eingeschlossenen Tiere gesund waren und die Zunahme der Körpermasse bei den Tieren vergleichbar war.
Die Reduktion und bei einigen Tieren sogar die Einbuße an Zunahme der Körpermasse in Kombination mit der reduzierten Nahrungsaufnahme weist stark auf eine Suppression des Appetitzentrums hin.
Reduzierte Nahrungsaufnahme und reduzierte Zunahme der Körpermasse wurden sogar in der Gruppe mit der niedrigsten Dosis (6,25 mg/kg) wahrgenommen. Tatsächlicher Verlust an Körpermasse wurde in der Gruppe mit 12,50 mg/kg wahrgenommen.
Es ist wichtig anzumerken, dass alle Behandlungsgruppen eine erhöhte Wasseraufnahme hatten, wenn die Nahrungsaufnahme abnahm (2). Dies könnte an einer diuretischen Wirkung der Testprobe oder an einer Stimulierung des Durstzentrums im Gehirn liegen.
Die Tatsache, dass keine Atemsuppression auftrat wie sie in dem oben erwähnten akuten Toxizitätstest für den peritonealen Verabreichungsweg beobachtet worden war, wird als positiver Aspekt gesehen. Dies könnte an einer reduzierten Absorption über den Gastrointestinaltrakt mit nachfolgender reduzierter Bioverfügbarkeit liegen. Die Bioverfügbarkeit der oralen Dosierungen war jedoch für eine Wirksamkeit der Testproben ausreichend. Die leichte Reduktion der Atemfrequenz in den meisten Gruppen 1 h nach der Behandlung könnte der Füllung des Magens mit dem Dosisvolumen und der anschließenden Passivität der Tiere zugeschrieben werden.
Die bei den Behandlungsgruppen beobachteten bröckligen Lebern könnten in einem Wechsel des Energiemetabolismus zusätzlich zu der reduzierten Nahrungsaufnahme begründet sein, was einen erhöhten Fettstoffwechsel und eine Überlastung der Leber bewirkt. Falls dies tatsächlich der Fall ist, könnten diese Änderungen möglicherweise als vorübergehend betrachtet werden, die sich mit der Zeit, wenn ein stabiles Gleichgewicht erreicht wurde, oder nach Absetzen der Testprobe wieder ausgleichen könnten. Die mögliche Auswirkung auf die Leber erfordert ebenfalls weitere Untersuchung.
Da diese Studie zunächst als Screening-Test geplant war, wurden kleine Gruppen von Versuchstieren eingesetzt. Dies macht die statistische Interpretation der Daten schwierig, insbesondere da, wo einzelne Tiere völlig verschieden reagieren. Die Daten zeigen jedoch, dass die Testprobe appetitzügelnde Wirkung hat, sogar in der niedrigsten getesteten Dosis (6,25 mg/kg). Bei den getesteten Dosen traten keine klinischen Anzeichen von Atemsuppression auf.
BEISPIEL 5
Aus ihrer natürlichen Umgebung oder aus Anbauprogrammen erhaltene, geerntete Hoodia-Pflanzen wurden zuerst für maximal 48 h bei 4°C gelagert. Die Pflanzen werden in Leitungswasser gewaschen und danach in ±1 cm Streifen geschnitten. Die geschnittenen Stücke werden alle vereinigt und dann während mindestens 0,5 h bei einem Druck von 300 bar durch eine hydraulische Presse gepresst. Während des Pressens wird der Pflanzensaft getrennt gesammelt. Der Saft wird bei –18°C gelagert, bis die Weiterverarbeitung erforderlich ist.
Der Saft wird unter geeigneten Bedingungen zur Gewinnung eines rieselfähigen Pulvers sprühgetrocknet. Der Feuchtigkeitsgehalt in dem Pulver ist vorzugsweise geringer als 5% nach Sprühtrocknen und es wird, falls erforderlich, in einem Vakuumofen oder unter Verwendung eines Wirbelschichttrockners weiter getrocknet.
Sowohl für den Saft als auch für das sprühgetrocknete Material wurde in biologischen Assays mit Ratten Wirksamkeit als Appetitzügler gezeigt.
Experimenteller Teil
50 kg Hoodia gordonii-Pflanzen wurden mit Leitungswasser gewaschen und danach in 1 cm Streifen geschnitten. Die in Streifen geschnittenen Pflanzen wurden dann pro Ansatz für mindestens 0,5 h bei einem Druck von 300 bar durch eine hydraulische Presse gepresst. Der Saft wurde gesammelt und es wurde herausgefunden, dass die Masse 10 kg betrug, wenn die Hoodia gordonii-Pflanzen aus der natürlichen Umgebung stammten und 20 kg, wenn die Hoodia gordonii-Pflanzen aus einem Anbauprogramm verwendet wurden. Der Saft (500 g) wurde unter Anwendung der folgenden Bedingungen sprühgetrocknet:

Durchfluss: 2,85 ml/min

Einlasstemperatur: 110°C

Auslasstemperatur: 70°C

Kammertemperatur: 78°C
Das sprühgetrocknete Pulver wurde als rieselfähiges Pulver (22 g) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 6,9% gewonnen.
Das sprühgetrocknete Pulver wurde bezüglich der Konzentration des wirksamen Inhaltsstoffs unter Verwendung von HPLC analysiert. Die Konzentration des aktiven Inhaltsstoffs wurde mit 13 g/kg des sprühgetrockneten Pulvers bestimmt. HPLC Analyse-Verfahren

Elutionsflüssigkeit: Acetonitril:Wasser (7:3), isokratisch

Säule: Reverse Phase C-18

UV-Absorption: 225 nm

Durchfluss: 1 ml/min

Injektionsvolumen: 10 μl
Verfahren
Sprühgetrocknetes Pulver (10 mg) wurde in Wasser (0,5 ml) und Acetonitril (0,5 ml) gelöst. 10 μl dieser Lösung wurden in die HPLC injiziert und die Konzentration der aktiven Verbindung (1) unter Verwendung einer für die reine Verbindung (1) erstellten Kurve bestimmt.
BEISPIEL 6
Die Ergebnisse einer zur Bewertung der möglichen appetitzügelnden Wirkungen der Verbindung (1) bei Ratten entwickelten Studie sind nachfolgend dargestellt. Im Folgenden werden die Proben als reiner Saft (Probe 1), als sprühgetrockneter Saft (Probe 2) und als aktiver Anteil (Probe 3) getestet. Die Proben 1 und 2 sind Saft bzw. sprühgetrockneter Saft wie oben in Beispiel 5 beschrieben. Probe 3 ist die Lösungsmittel-extrahierte Verbindung (1) mit ≥95% Reinheit.
Probe 1 und 3 wurden jeweils als orale Einzeldosis männlichen Wistar-Ratten verabreicht. Zwei zusätzliche Kontrollgruppen erhielten den Arzneimittelträger (destilliertes Wasser oder DMSO). Oral verabreichtes Fenfluramin (7,5 mg/kg) wurde als Referenzstandard eingeschlossen.
Die oral verabreichte Probe 1 (reiner Saft) bewirkte im Vergleich zu den mit dem Arzneimittelträger behandelten Kontrollen dosisabhängige Reduktionen der Nahrungsaufnahme bei Dosen von 1600 mg/kg und darüber. Gleichzeitige Reduktionen des Körpergewichts (oder des Wachstumsausmaßes) wurden ebenfalls aufgezeichnet. Am Tag der Dosisgabe wurden signifikante Zunahmen der Wasseraufnahme 3 h nach Dosisgabe (6400 und 10000 mg/kg) und 6 h nach Dosisgabe (10000 mg/kg) verzeichnet. Zwischen 24 h und 48 h nach Dosisgabe wurden signifikante Reduktionen der Wasseraufnahme bei Dosisgaben von 3200 mg/kg und darüber verzeichnet.
Die oral verabreichte Probe 2 (sprühgetrockneter Saft) bewirkte mit 76 mg/kg im Vergleich zu den mit dem Arzneimittelträger behandelten Tieren ebenfalls signifikante Reduktionen der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts. Es wurden keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf die Wasseraufnahme verzeichnet.
Probe 3 (aktiver Anteil) bewirkte statistisch signifikante Reduktionen der Nahrungsaufnahme bei einer oralen Dosis von 5,0 mg/kg. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf das Körpergewicht durch den aktiven Anteil, obwohl die Untersuchung der Daten eine leichte Wachstumsverzögerung im Vergleich zu den mit Arzneimittelträger behandelten Kontroll-Tieren erkennen ließ. Es wurden keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf die Wasseraufnahme verzeichnet.
Fenfluramin (7,5 mg/kg), der Referenzstandard, bewirkte im Vergleich zu der mit dem relevanten Arzneimittelträger behandelten Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Reduktion der Nahrungsaufnahme 6 und 24 h nach der Dosisgabe. Es wurden keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf die Wasseraufnahme oder das Körpergewicht verzeichnet.
Es wurden keine behandlungsbedingten Auswirkungen auf die Leber verzeichnet. TESTSUBSTANZ

* = Raumtemperatur

Experimentelles Verfahren
55 männliche Wistar-Ratten wurden in der Studie eingesetzt.
Körpergewicht, Nahrungsaufnahme (Gewicht des Futterbehälters) und Wasseraufnahme (Gewicht der Trinkflasche) wurden täglich zur gleichen Zeit an jedem Tag von der Ankunft der Tiere bis zur Beendigung der Studie protokolliert.
Am Tag 1 erhielten die Ratten eine orale Einzeldosis (Sondenfütterung) gemäß der folgenden Tabelle:
Den Gruppen 1 bis 8 wurden die Dosen mit einem konstanten Dosisvolumen von 10 ml/kg und den Gruppen 9 bis 12 die Dosen unter Verwendung eines Dosisvolumens von 1 ml/kg verabreicht.
Futter- und Wasseraufnahme wurden ebenfalls 1, 3 und 6 h nach Dosisgabe am Tag 1 gemessen.
Nach den Messungen am Tag 8 wurden die Tiere durch Ersticken mit Kohlendioxid getötet, die Lebern operativ entfernt und vor der histologischen Untersuchung in 10% gepuffertem Formalin gelegt. Von jeder Leber wurden Paraffinwachs-Schnitte von 4 bis 5 μm genommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Zusätzliche Schnitte von 12 μm wurden in einem Kryostat angefertigt und zum Lipidnachweis mit Oil Red O (ORO) gefärbt.
Daten-Analyse
Die Messungen der Futter- und Wasseraufnahme nach Dosisgabe und die Körpergewichte zu jedem Zeitpunkt wurden für die P57-behandelten Tiere mit denen der relevanten, ähnlich behandelten Tiere der Arzneimittelträger-Kontrollgruppe unter Verwendung der Varianzanalyse gefolgt vom Williams-Test für Vergleiche mit Kontrollen verglichen.
Die Daten für die mit Fenfluramin behandelten Tiere wurden mit denen der mit Arzneimittelträger behandelten Kontrollgruppe unter Verwendung des Student-t-Tests verglichen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in den Tabellen zusammengefasst.
Die oral verabreichte Probe 1 (reiner Saft) bewirkte merkliche, dosisabhängige Reduktionen der täglichen Nahrungsaufnahme. Die Dauer und der Umfang dieser Reduktionen bei der Nahrungsaufnahme waren dosisabhängig. 24 h nach der Dosisgabe bewirkte Probe 1 (reiner Saft) im Vergleich zu den mit Arzneimittelträger behandelten Kontrollen eine statistisch signifikante Reduktion der Nahrungsaufnahme bei Dosen von 1600 kg/kg und darüber. Die höchste Dosis von Probe 1 (Saft) (1000 mg/kg) bewirkte auf täglicher Basis bis zu 5 Tagen nach Dosisgabe statistisch signifikante Reduktionen bei der Nahrungsaufnahme.
Probe 2 (sprühgetrockneter Saft) und Probe 3 (aktiver Anteil) bewirkte merkliche und statistisch signifikante Reduktionen bei der Nahrungsaufnahme bei oralen Dosen von 76 bzw. 5,0 mg/kg. In beiden Fällen dauerten die Wirkungen für 48 h nach Dosisgabe an.
Der Referenzstandard Fenfluramin (7,5 mg/kg, per os) bewirkte im Vergleich zu der relevanten mit Träger behandelten Kontrollgruppe (Gruppe 12) statistisch signifikante Reduktionen bei der Nahrungsaufnahme 6 h und 24 h nach Dosisgabe.
Probe 2 (sprühgetrockneter Saft) und Probe 3 (aktiver Anteil) bewirkten keine merklichen, dosisabhängigen Wirkungen auf die Wasseraufnahme. Am Tag der Dosisgabe bewirkte der reine Saft 3 h nach Dosisgabe (6400 und 10000 mg/kg) und 6 h nach Dosisgabe (10000 mg/kg) statistisch signifikante Erhöhungen bei der Wasseraufnahme. Jedoch wurden zwei Tage nach Dosisgabe statistisch signifikante Abnahmen der Wasseraufnahme bei Tieren verzeichnet, die Probe 1 (Saft) mit 3200, 6400 und 10000 mg/kg erhielten. Diese Reduktionen waren jedoch nicht klar dosisbezogen und traten nur zwischen den Tagen 1 und 2 nach Dosisgabe auf. Die biologische Bedeutung dieser Auswirkungen bleibt deshalb unklar.
Probe 1 (reiner Saft) erzeugte dosisbezogene, im Vergleich zur mit Träger behandelten Kontrollgruppe (Gruppe 1) statistisch signifikante Auswirkungen auf die Körpergewichte. Probe 1 (reiner Saft) bewirkte bei oraler Verabreichung bei Dosen von 3200 mg/kg und darüber im Vergleich zu mit Arzneimittelträger behandelten Tieren statistisch signifikante Reduktionen des Körpergewichts oder vermindertes Wachtumsausmaß. Diese Auswirkungen waren von 48 h nach Dosisgabe bis zum Ende der Studie statistisch signifikant.
Mit 76 mg/kg oral verabreichte Probe 2 (sprühgetrockneter Saft) bewirkte im Vergleich zu der mit Arzneimittelträger behandelten Kontrollgruppe (Gruppe 1) statistisch signifikante Reduktionen im Wachstum der Tiere. Diese Auswirkungen waren zwischen den Tagen 3 (48 h nach Dosisgabe) und einschließlich 5 statistisch signifikant.
Obwohl Probe 3 (aktiver Anteil) das Wachstum der Tiere im Vergleich zur relevanten, mit Träger behandelten Kontrollgruppe (Gruppe 12) bei der höchsten Dosis (5,0 mg/kg) zu verzögern schien, war dieser Effekt nicht statistisch signifikant.
Fenfluramin (7,5 mg/kg) bewirkte im Vergleich zur mit Arzneimittelträger behandelten Kontrollgruppe (Gruppe 12) keine merklichen oder statistisch signifikanten Auswirkungen auf die Wasseraufnahme oder das Körpergewicht.
Es wurden keine behandlungsbedingten Auswirkungen auf die Lebern verzeichnet. TABELLE 1a Auswirkungen oraler Verabreichung auf die Nahrungsaufnahme bei Ratten (tägliche Daten vor Dosisgabe)
TABELLE 1b Auswirkungen der oralen Verabreichung auf die Nahrungsaufnahme bei Ratten (tägliche Daten nach Dosisgabe)

SD = Standardabweichung
Gruppen 2–8 wurden mit dem Träger aus Gruppe 1 verglichen: * p < 0,05, ** p < 0,01
Gruppen 9–11 wurden mit dem Träger aus Gruppe 12 verglichen: ^✝ p < 0,05, ^✝✝ p < 0,01

SD = Standardabweichung
Gruppen 2–8 wurden mit dem Träger aus Gruppe 1 verglichen: * p < 0,05
Gruppen 9–11 wurden mit dem Träger aus Gruppe 12 verglichen: keine Signifikanzen

SD = Standardabweichung
Gruppen 2–8 wurden mit dem Träger aus Gruppe 1 verglichen: * p < 0,05, ** p < 0,01
Gruppen 9–11 wurden mit dem Träger aus Gruppe 12 verglichen: keine Signifikanzen

Histopathologischer Bericht
Die histopathologische Untersuchung war auf die Leber beschränkt. Es wurden keine behandlungsbedingten Veränderungen für Probe 1 (Flüssigkeit), Probe 2 (sprühgetrockneter Saft), Probe 3 (aktiver Anteil), Fenfluramin oder die DMSO-Kontrolle nachgewiesen.
Die hier berichteten Befunde traten mit ähnlicher Inzidenz bei der Kontrolle und bei den behandelten Gruppen auf. TABELLE Zusammenfassung der mikroskopischen pathologischen Inzidenzen
TABELLE (Fortsetzung)
BEISPIEL 7
Ein weiterer Bioassay, bei dem dieselben Testproben wie in Beispiel 6 beschrieben eingesetzt wurden, ist nachfolgend beschrieben. Die Tiere in dieser Studie erhielten eine eingeschränkte Fütterung, d. h. die Tiere erhielten täglich nur zwischen 12.00 und 15.00 h Futter. Dies unterscheidet sich von allen bisher ausgeführten biologischen Assays, bei denen das Futter den Ratten zur freien Verfügung stand. Die Tiere wurden über eine 7tägige Phase eingewöhnt (Tage –7 bis –1), die Dosisgabe erfolgte zwischen den Tagen 0 bis 6 um 9.00 h durch orale Sondenfütterung. Die Erholungsphase fand zwischen den Tagen 7 bis 13 statt. Die Dosisgruppen waren wie nachfolgend in Tabelle 1 beschrieben. Es sollte angemerkt werden, dass die tatsächliche Kontrollgruppe mit Gruppe 09 bezeichnet ist. Gruppe 5 ist eine Kontrollgruppe, die eine der Gruppe 4 entsprechende Fütterung erhielt. Der Zweck dieser Gruppe ist es, zu bewerten, welche Auswirkung eine eingeschränkte Fütterung auf das Leben der Tiere hat.
Ergebnisse
Die während dieser Studie entstandenen Ergebnisse zeigen, dass die Eingewöhnungsphase zu kurz war. Ratten fressen vorwiegend während der Nacht und die plötzliche Umstellung auf einen eingeschränkten Zugang zum Futter für 3 h während des Tages führte zu niedriger täglicher Aufnahme. Die tägliche Nahrungsaufnahme war in den meisten Gruppen noch am Ende der Eingewöhnungszeit, als die Dosierung mit den Testobjekten begann, ansteigend. Das Ergebnis davon war, dass sich die Wirkung des Testmaterials während der Dosierungsphase nicht signifikant auf die Nahrungsaufnahme der Ratten auswirkte.
Die mittlere Körpermasse für die verschiedenen Gruppen von Tag –7 bis -1 und den Tagen 0 bis 6 sind in den Tabellen D1 und D2 gezeigt. Die Wirkung der verschieden Dosierungen des Saftes und des sprühgetrockneten Saftes ist in den begleitenden Graphiken als % Änderung der Körpermasse von Tag 0 bis Tag 7 (5) und als % Änderung der Körpermasse von Tag –7 bis Tag 7 (6) gezeigt. Der Verlust an Körpermasse ist insbesondere bei höheren Dosen klar dosisabhängig.
Die histopathologische Untersuchung der Lebern zeigte keine signifikanten pathologischen Befunde bei den die Testobjekte enthaltenden Gruppen.
Futter
Die Futteraufnahme wurde täglich während der Eingewöhnungsphase und während der Studie täglich gemessen. Das Futter war während einer dreistündigen täglichen Fütterungsphase verfügbar, die um 12.00 begann und um 15.00 h endete. Die Tiere waren während der restlichen Zeit nüchtern. Die Tiere in Gruppe 6 erhielten eine abgemessene Futtermenge am Tag 1, entsprechend der durchschnittlichen Nahrungsaufnahme von Gruppe 4 am Tag 0. Dieses kontrollierte Fütterungsmuster, wie durch die durchschnittliche Nahrungsaufnahme der Gruppe 4 am Vortag festgelegt, wurde an den Tagen 1 bis 7 weiter verfolgt.
Wasser
Wasser wurde in Standardbehältern zur Verfügung gestellt. Das Wasser (Magalies Water Board-Leitungswasser, geeignet für die menschliche Ernährung) stand zur freien Verfügung. Die Wasseraufnahme wurde einmal täglich jeweils zur gleichen Zeit nach der Bestimmung der Futteraufnahme gemessen.
Eingewöhnung
Die Tiere wurden vor Studienbeginn während 7 Tagen eingewöhnt, wobei während dieser Zeit die Futter- und Wasseraufnahme wie oben beschrieben bestimmt wurde. Die Körpermassen wurden während dieser Zeit auf täglicher Basis bestimmt. Studiendesign und -verfahren TABELLE 1 Studiendesign
Verabreichungsweg
Die Testobjekte wurden auf täglicher Basis während 7 Tagen unter Verwendung einer intragastrischen Kanüle verabreicht. Die Tiere blieben 18 h vor der Verabreichung des Testobjekts nüchtern (Beginn um 9.00 h).
Behandlungsdauer
Die Tiere wurden während sieben aufeinander folgenden Tagen (von Tag 0 bis Tag 6) behandelt. Drei Tiere jeder Gruppe wurden 24 h nach der letzten Dosisgabe (Tag 7) getötet. Die verbleibenden 3 Tiere wurden 7 Tage nach der letzten Behandlung (Tag 13) getötet. Diesem Verfahren wurde bei allen Gruppen außer Gruppe 5 gefolgt, bei der 3 Tiere 24 h nach der letzten kontrollierten Fütterung (Tag 8) getötet wurden, die verbleibenden Tiere 7 Tage nach der letzten Behandlung (Tag 13).
Körpermassen
Die Körpermassen wurden täglich in etwa zur selben Zeit an jedem Tag während der Dauer der Studie, einschließlich während der Eingewöhnungsphase, bestimmt.
Tötung
Drei Tiere einer jeden Gruppe wurden 24 h nach der letzten Dosisgabe (Tag 7) getötet.
Die verbleibenden 3 Tiere wurden 7 Tage nach der letzten Behandlung getötet. Diesem Verfahren wurde für alle Gruppen außer Gruppe 5 gefolgt, bei der 3 Tiere 24 h nach der letzten kontrollierten Fütterung (Tag 8) getötet wurden, die verbleibenden 3 Tiere 7 Tage nach der letzten Behandlung (Tag 13). Die Tiere wurden am Ende der Studiendauer mit CO₂-Gas getötet.
Ophthalmoskopische Untersuchungen
Unter Verwendung eines Ophthalmoskops wurden ophthalmoskopische Untersuchungen vor der ersten Verabreichung des Testobjekts und bei Beendigung bei allen Tieren in allen Gruppen durchgeführt.
Makroskopische Pathologie
Eine vollständige Obduktion wurde an jedem am Ende der Studiendauer getöteten Tier vorgenommen.
Histopathologie
An der Leber eines jeden Tiers wurde eine histopathologische Untersuchung vorgenommen. TABELLE D1 Mittlere Körpermasse/Gruppe/Woche
TABELLE D2 Mittlere Körpermassen/Gruppe/Woche -Fortsetzung-
TABELLE D3 Mittlere Körpermassen/Gruppe/Woche -Fortsetzung-
TABELLE 1 Histologische Bewertung der Leberschnitte männlicher Ratten Probe 1
Gruppe 5: über ELGA Option 4 gereinigtes Wasser: einschränkte Nahrungsaufnahme
Legende:

C = Stauung
DHS = diffuse hydropische Zellschwellung
FHS = fokale hydropische Zellschwellung
NPL = keine parenchymalen Läsionen
MLC = minimale Lymphocytenmanschetten
1+ = mild
2+ = moderat
3+ = schwer

TABELLE 2 Histologische Bewertung der Leberschnitte männlicher Ratten Probe 2
Gruppe 9: über ELGA Option 4 gereinigtes Wasser
Legende:

Bei den Versuchsratten, die sowohl den gefrorenen Saft als auch den sprühgetrockneten Saft erhalten hatten, waren keine speziellen Leberläsionen zu verzeichnen, die auf die orale Verabreichung der obigen Chemikalien zurückgeführt werden konnten. Die bei beiden Kontrollen und bei den Versuchsratten verzeichnete hydropische Zellschwellung kann Anzeichen einer normalen metabolischen Zellschwellung und von Veränderungen infolge Sauerstoffmangels sein. Minimale Herde lymphocytischer perivaskulärer Manschetten wurden bei einigen Tieren gefunden und dies war höchstwahrscheinlich eine zufällige Beobachtung. Bei einigen Ratten war eine Stauung milden Ausmaßes in den hepatischen Sinusoiden vorhanden und sollte als zufällige Beobachtung betrachtet werden.
Ein wichtiges, durch die Ergebnisse dieser Studie gezeigtes Merkmal der Erfindung ist, dass sich im Testzeitraum keine Toleranz gegenüber einer der Proben entwickelte. Dies kann einen beträchtlichen Vorteil darstellen, insbesondere in Bezug auf die Behandlung der Fettleibigkeit.
Während die Verbindungen und Zusammensetzungen hauptsächlich in Bezug auf ihre Eigenschaften als Appetitzügler beschrieben wurden, sollte angemerkt werden, dass dieser Ausdruck „Appetitzügler" hierin verwendet wird, um eine Aktivität zu beschreiben, die dazu tendiert, Appetit zu limitieren und/oder das Sättigungsgefühl zu verstärken und damit dazu tendiert, die Gesamtkalorienaufnahme zu reduzieren, was wiederum dazu tendiert, der Fettleibigkeit entgegenzuwirken. Dementsprechend stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung, Verhütung und Bekämpfung der Fettleibigkeit bei einem Menschen oder einem Tier zur Verfügung, das die Verabreichung einer die Fettleibigkeit behandelnden, verhütenden oder bekämpfenden Menge einer eine Verbindung der Formel (1) enthaltenden Zusammensetzung oder eines Extraktes an den Menschen oder das Tier umfasst.
Der Begriff „Tier" wie hierin verwendet erstreckt sich, ohne darauf beschränkt zu sein, auf Tiere, die im Umfeld des Menschen sind, z.B. Haustiere und domestizierte Tier, wobei nicht einschränkende Beispiele Rinder, Schafe, Frettchen, Schweine, Kamele, Pferde, Geflügel, Fische, Kaninchen, Ziegen, Hunde und Katzen beinhalten.
Als ein appetitzügelndes Mittel oder bei der Behandlung oder Verhütung der Fettleibigkeit bei einem Menschen wird eine Verbindung der Formel (1) oder die in einem der nachfolgenden Ansprüche definierte Zusammensetzung dem Menschen vorteilhafterweise in eine Dosismenge von etwa 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag verabreicht. Ein bevorzugter Dosisbereich ist 0,05 mg/kg/Tag bis 0,5 mg/kg/Tag. Wenn es in Form des sprühgetrockneten Pulvers des Extraktes verwendet wird, ist ein bevorzugter Dosisbereich 0,1 mg/kg/Tag bis 20 mg/kg/Tag, insbesondere bevorzugt ist 0,5 mg/kg/Tag bis 5 mg/kg/Tag.

Claims

Verwendung eines Extrakts aus einer Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia zur Herstellung eines Arzneimittels mit appetitzügelnder Wirkung zur Behandlung, Verhütung oder Bekämpfung der Fettleibigkeit bei einem Menschen oder Tier, der eine wirksame Menge eines appetitzügelnden Steroidglycosids aus der Pflanze enthält, worin das Steroidglycosid die Formel
hat.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Extrakt durch ein die Schritte der Behandlung des Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel zur Extraktion einer Fraktion mit appetitzügelnder Aktivität, Trennung der Extraktionslösung vom Rest des Pflanzenmaterials, Entfernung des Lösungsmittels aus der Extraktionslösung und Rückgewinnung des Extraktes beinhaltendes Verfahren erhaltbar ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Extrakt durch ein die Schritte des Pressens des Pflanzenmaterials zur Trennung des Pflanzensaftes vom festen Pflanzenmaterial und Rückgewinnung des vom festen Pflanzenmaterial freien Pflanzensaftes zur Bildung des Extraktes beinhaltendes Verfahren erhaltbar ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia aus den Arten Trichocaulon piliferum und Trichocaulon officinale und die Pflanze der Gattung Hoodia aus den Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das Verfahren den Schritt der Wirkstoffanreicherung in dem extrahierten Material durch weitere Extraktion mit einem Lösungsmittel beinhaltet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2, 4 oder 5, worin das Lösungsmittel in dem Lösungsmittelextraktionsschritt oder in den Verfahrensschritten eines oder mehrere der Lösungsmittel Methylenchlorid, Wasser, Methanol, Hexan, Ethylacetat oder Mischungen davon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin das Verfahren den Schritt der Wirkstoffanreicherung in dem extrahierten Material durch chromatographische Trennung beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die chromatographische Trennung eines oder mehrere der Lösungsmittel Chloroform, Methanol, Ethylacetat, Hexan oder Mischungen davon als Elutionslösung einsetzt.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, worin das Verfahren die Durchführung der chromatographischen Trennung über eine Säule, das Sammeln des fraktionierten Eluats aus der Säule, die Auswertung der Fraktionen zur Bestimmung ihrer appetitzügelnden Aktivität und das Auswählen mindestens einer den appetitzügelnden Wirkstoff enthaltenden Fraktion beinhaltet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, worin der Extrakt bei der Verarbeitung zur Bildung eines rieselfähigen Pulvers verarbeitet ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin ein Arzneimittel in Form von Dosiseinheiten hergestellt ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Pflanze aus Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Pflanze Hoodia gordonii ist.
Nicht-therapeutisches Verfahren zur Reduktion der Gesamtkalorienaufnahme eines Menschen oder eines Tieres, wobei das Verfahren die Verabreichung eines einen Extrakt aus einer Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia umfassenden Lebensmittels oder Getränks an den Menschen oder das Tier umfasst, wobei der Extrakt eine wirksame Menge eines appetitzügelnden Steroidglycosids aus der Pflanze enthält, wobei das Steroidglycosid die Formel
hat.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der Extrakt durch ein die Schritte der Behandlung des Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel zur Extraktion einer Fraktion mit appetitzügelnder Aktivität, Trennung der Extraktionslösung vom Rest des Pflanzenmaterials, Entfernung des Lösungsmittels aus der Extraktionslösung und Rückgewinnung des Extraktes beinhaltendes Verfahren erhaltbar ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der Extrakt durch ein die Schritte des Pressens des Pflanzenmaterials zur Trennung des Pflanzensaftes vom festen Pflanzenmaterial und Rückgewinnung des vom festen Pflanzenmaterial freien Pflanzensaftes zur Bildung des Extraktes beinhaltendes Verfahren erhaltbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Pflanze der Gattung Trichocaulon oder der Gattung Hoodia aus den Arten Trichocaulon piliferum und Trichocaulon officinale und die Pflanze der Gattung Hoodia aus den Arten Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin das Verfahren den Schritt der Wirkstoffanreichung in dem extrahierten Material durch weitere Extraktion mit einem Lösungsmittel beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15, 17 oder 18, worin das Lösungsmittel bei dem Lösungsmittelextraktionsschritt oder bei den Verfahrensschritten eines oder mehrere der Lösungsmittel Methylenchlorid, Wasser, Methanol, Hexan, Ethylacetat oder Mischungen davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin das Verfahren den Schritt der Wirkstoffanreicherung in dem extrahierten Material durch chromatographische Trennung beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die chromatographische Trennung eines oder mehrere der Lösungsmittel Chloroform, Methanol, Ethylacetat, Hexan oder Mischungen davon als Elutionsmittel einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin das Verfahren die Durchführung der chromatographischen Trennung über eine Säule, das Sammeln des fraktionierten Eluats aus der Säule, die Auswertung der Fraktionen zur Bestimmung ihrer appetitzügelnden Aktivität und das Auswählen mindestens einer den appetitzügelnden Wirkstoff enthaltenden Fraktion beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, worin der Extrakt bei der Verarbeitung zur Bildung eines rieselfähigen Pulvers verarbeitet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 23, worin die Pflanze aus Hoodia currorii, Hoodia gordonii und Hoodia lugardii ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24, worin die Pflanze Hoodia gordonii ist.