DE69834032T2

DE69834032T2 - Verfahren zur erkennung von nucleinsäuremolekülen codierend für (poly)peptide, welche mit zielmolekülen interagieren

Info

Publication number: DE69834032T2
Application number: DE69834032T
Authority: DE
Inventors: Andreas Plückthun; Jozef Hanes; Lutz Jermutus
Original assignee: Universitaet Zuerich
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: US20020115083A1; US6348315B1; CA2289691A1; US6589741B2; DE69834032D1; EP0975748B1; CA2289691C; EP0975748A1; ATE321849T1; WO1998048008A1; JP4086325B2; JP2001521395A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuremolekülen, die (Poly)peptide codieren, welche mit Zielmolekülen in Wechselwirkung treten. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders durch einen in vitro-Translationsschritt unter Bedingungen gekennzeichnet, die die Bildung von Polysomen in Anwesenheit von Antisense-Oligonucleotiden erlauben, welche zur Tag codierenden Sequenz von ssrA-RNA komplementär sind. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Kits, die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung nützlich sind.
Evolutionäre Verfahren können der Proteintechnik die Feinheiten bringen, die über die Möglichkeiten und Präzision des heutigen rationalen Designs hinausgehen. Evolution kann als eine Folge von „Generationen", Kreisläufen genetischer Diversifizierung, gefolgt von Darwinscher Selektion für eine gewünschte phänotypische Eigenschaft definiert werden. In klassischen Experimenten sind Nucleinsäuren hinsichtlich physikalischer Eigenschaften in vitro entwickelt worden (Saffhill, R., Schneider-Bernloehr, H., Orgel, L. E. & Spiegelman, S. (1970) J. Mol. Biol. 51, 531–539), und in diesem Fall war die Substanz, die den Phänotyp ergab, identisch mit dem genetischen Material. Oligonucteotid-Liganden, gewöhnlich Einzelstrang-RNA, sind durch SELEX für viele Ziele entwickelt worden (Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. & Yarus, M. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 763–797; Irvine, D., Tuerk, C. & Gold, L. (1991) J. Mol. Biol. 222, 739–761), bei denen eine synthetische DNA-Bibliothek transkribiert, die RNA hinsichtlich Bindung ausgewählt, revers transkribiert und über mehrere Runden amplifiziert wird. Frühe Experimente mit Proteinen als den Trägern des Phänotyps, eindeutig mit wesentlich breiterem Anwendungsbereich, beruhten auf lebenden Zellen zum Erreichen der Kopplung zwischen Gen und Protein, entweder direkt oder über die Produktion von Phagen oder Viren (Phizicky, E. M. & Fields, S. (1995) Microbiol. Rev. 59, 94–123). Da bei dieser Art von Experiment die DNA-Bibliothek als der Informationsträger für codierte Proteindiversität in bakterielle oder eukaryontische Zellen transformiert oder transfiziert werden muss, wurde die verfügbare Diversität durch die geringe Effizienz der DNA-Aufnahme streng begrenzt (Dower, W. J. & Cwirla, S. E. (1992) in Guide to Electroporation and Electrofusion, Hrsg. Chang, D. C., Chassy, B. M., Saunders, J. A. & Sowers, A. E. (Academic Press, San Diego), S. 291–301). Darüber hinaus musste die DNA-Bibliothek in jeder Generation zunächst in eine replizierbare genetische Verpackung ligiert werden, wodurch die Diversität wiederum verringert wurde. Zusätzlich müssten viele vielversprechende Varianten in der Wirtszellen-Umgebung aussortiert werden. Nur sehr wenige Studien (Yang, W. P., Green, K., Pinz-Sweeney, S., Briones, A. T., Burton, D. R. & Barbas 3., C. F. (1995) J. Mol. Biol. 254, 392–403) haben Proteinoptimierung unter Verwendung von Verfahren wie Phagen-Display durch mehr als eine Generation gebracht, da dies den wiederholten Wechsel zwischen in vitro-Diversifizierung und in vivo-Durchmusterung erfordert – ein aufwendiger Prozess.
Mit dem Ziel, diesen Prozess zu umgehen oder zu verbessern, haben eine Reihe von Labors neue Systeme entwickelt, die auf der unmittelbaren Nachbarschaft und physikalischen Verbindung von mRNA und zugehörigen (Poly)peptiden während der Translation beruhen. Auf diese Weise haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass spezifische mRNAs durch Immunfällung von Polysomen angereichert werden können (Schechter, I. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2256–2260; Payvar, F. & Schimke, R. T. (1979) Eur. J. Biochem 101, 271–282, Kraus, J. P. & Rosenberg, L. E. (1982) Proc. Natl. Acad Sci. USA 79, 4015–4019). Kürzlich berichteten Mattheakis und Mitarbeiter von einer Affinitätsselektion eines kurzen Peptids aus einer Bibliothek unter Verwendung von Polysomen, um Genotyp und Phänotyp in vitro zu verbinden (Mattheakis, L. C. Bhatt, R. R. & Dower, W. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 9022–9026, WO 95/11922).
Dieses System verwendet ein in vitro-Translationssystem, das bevorzugt mit einem in vitro-Transkriptionssystem verbunden ist. Das Translationssystem erlaubt die gleichzeitige Isolierung von mRMA und (Poly)peptid in einem Polysom-Komplex nach einem geeigneten Durchmusterungsschritt auf das (Poly)peptid. Bevorzugt bestehen die (Poly)peptide im Mattheakis-System aus zwei Bestandteilen, wobei der eine das zu durchmusternde Peptid ist und der zweite ein Bindungssegment, welches die mRNA bindet. Gemeinsame Isolierung von mRNA und (Poly)peptid im Polysom-Komplex kann möglicherweise mit Hilfe einer die Translation zum Stillstand bringenden Sequenz verbessert werden, selbst wenn die Existenz solcher Sequenzen für E. coli immer noch unklar ist. Diese Sequenz verstärkt möglicherweise die Gesamtstabilität des Polysom-Komplexes durch Verminderung der Translationsrate und ermöglicht dadurch geeignete Bedingungen für die gemeinsame Durchmusterung und Isolierung von (Poly)peptid und zugehöriger mRNA.
Eine ähnliche Arbeit ist früher von Gold und Kollegen (WO 93/03172) und Kawasaki und Mitarbeitern (WO 91/05058) berichtet worden. Obgleich die vorstehend beschriebenen Systeme ein Mittel geschaffen haben, eine Nucleinsäure über die Erkennung eines von dieser Nucleinsäure codierten Proteins zu charakterisieren, gibt es praktische Begrenzungen im Hinblick auf die Wirksamkeit der Ribosomen-Darstellung des entstehenden (Poly)peptids. Das technische Problem bei der vorliegenden Erfindung bestand daher in der Steigerung der Wirksamkeit von (i) der Synthese einer Auswahl an stabilen RNA-Molekülen und (ii) der Translation dieser RNA-Moleküle und dadurch eine gesteigerte Wirksamkeit bei der Verwendung von Polysomen für die Durchmusterung zu erreichen. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen beschrieben werden.
Dem zufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein (Poly)peptid codiert, welches mit einem Zielmolekül in Wechselwirkung tritt, umfassend die nachstehenden Schritte:

(a) Translation einer Population von mRNA-Molekülen ohne Stop-Codons im korrekten Leserahmen in einem prokaryontischen in vitro- Translationssystem, wobei dieses Translationssystem entweder Antisense-Oligonucleotide umfasst, die komplementär zu der Tag codierenden Sequenz von ssrA-RNA sind, oder frei von ssrA-RNA ist, unter Bedingungen, die die Bildung von Polysomen gestatten;
(b) Inkontaktbringen der auf diese Weise gebildeten Polysomen mit den Zielmolekülen unter Bedingungen, die die Wechselwirkung der (Poly)peptide, die durch diese mRNA-Moleküle codiert werden und durch diese Polysomen dargestellt werden, mit diesen Zielmolekülen zulassen;
(c) Abtrennung der die (Poly)peptide darstellenden Polysomen, die mit diesen Zielmolekülen in Wechselwirkung treten, von solchen Polysomen, die keine solche (Poly)peptide darstellen; und
(d) Identifizierung des Nucleinsäuremoleküls, das ein (Poly)peptid codiert, das in einem Polysom, welches mit diesen Zielmolekülen in Wechselwirkung tritt, dargestellt wird.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „(Poly)peptid" betrifft sowohl Peptide als auch Polypeptide. Diese (Poly)peptide können entweder eine natürliche oder eine rekombinant hergestellte Aminosäuresequenz umfassen. Die letztere Alternative schließt auch Fusionsproteine ein.
Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck „Polysom" einen Komplex, der wenigstens von einem, bevorzugt von mehreren Ribosomen und mRNA während der Translation gebildet wird.
Die Population von mRNA-Molekülen kann von unterschiedlicher Herkunft sein. Zum Beispiel kann sie aus einer cDNA-Bibliothek stammen. In einer anderen Ausführungsform kann sie direkt aus Zellen oder Gewebe stammen. Besonders vorteilhaft ist auch die Verwendung der vorliegenden Erfindung mit mutabgenisierten (Poly)peptiden, um verbesserte Varianten zu finden. Alternativ können synthetische Protein- oder Peptid-Bibliotheken oder Antikörper-Bibliotheken verwendet werden.
Der Ausdruck „Tag codierende Sequenz von ssrA-RNA" betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz AANDENYALAA codiert. Diese Sequenz ist von Keiler et al., Science 221 (1996), 1990–1993, beschrieben worden.
Die antisense-Oligonucleotide, die von dem Translationssystem umschlossen werden, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird, sind von geeigneter Länge, um unter Bedingungen, die die Bildung von Polysomen gestatten, an die Tag codierende Sequenz von ssrA-RNA zu hybridisieren und die Translation hiervon zu blockieren.
Ein Translationssystem, das frei von ssrA-RNA ist, kann zum Beispiel von E. coli-Stämmen erhalten werden, denen ein funktionales ssrA-Gen fehlt, wie etwa X90 ssrA1::cat (Keiler et al., Science 221 (1996), 1990–1993), N2211 oder NM101 (Tu et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 9322–9326), W3110 ΔssrA (Komine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9223–9227), K7823 oder K6676 (Retallack und Friedmann, Cell 83 (1995), 227–235).
Bedingungen, die die Wechselwirkung der (Poly)peptide, die von den translatierten mRNA-Molekülen codiert und von den Polysomen dargestellt werden, mit den zugehörigen Zielmolekülen gestatten, können ohne ungebührlichen Aufwand von Fachleuten auf dem Gebiet geschaffen werden. Solche Bedingungen können zum Beispiel aus den Lehren von WO 95/11922, WO 93/03172 und WO 91/05058 oder aus den anhängenden Beispielen abgeleitet werden. Wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, hängen solche Bedingungen auch von dem Durchmusterungsverfahren ab, das für den Nachweis dieser Wechselwirkungen verwendet wird.
Die Abtrennung der Polysomen, die (Poly)peptide darstellen, die mit den Zielmolekülen in Wechselwirkung treten, von Polysomen, die keine solche (Poly)peptide darstellen, kann im Einklang mit bekannten Verfahren durchgeführt werden. Wiederum kann die verwendete Technik zur Abtrennung sehr von dem Durchmusterungssystem, das verwendet wird, abhängig sein. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Abtrennung der vorstehend genannten Polysomen basiert zum Beispiel auf der Affinitätschromatographie, bei der die Zielmoleküle an das Säulenmaterial gebunden sind.
Die Identifizierung des Nucleinsäuremoleküls, das das ausgewählte (Poly)peptid codiert, kann durch jedes geeignete Verfahren erfolgen und erfolgt am besten durch Sequenzierung des Nucleinsäuremoleküls, zum Beispiel durch Sequenzierung der mRNA oder der DNA, nach Clonierung in einen Vektor. Um die mRNA zu identifizieren, kann sie vom Ribosom getrennt werden, indem eine Behandlung mit EDTA oder eine Säure-Eluierung mit anschließender Standard-RNA-Reinigung unter Verwendung eines Kits (vgl. Beispiel 3) oder durch kompetitive Eluierung unter Verwendung eines löslichen Zielmoleküls mit anschließender Standard-RNA-Reinigung unter Verwendung eines Kits durchgeführt wird.
Bevorzugt und am günstigsten werden die Schritte (a) bis (c) zweimal oder öfter vor dem Identifizierungsschritt (d) durchgeführt. Diese Maßnahme führt zu einer weniger mehrdeutigen Identifizierung der gewünschten Nucleinsäure mit gleichzeitiger Minimierung von falsch positiven Polysomen und somit Nucleinsäuren. Diese Ausführungsform zur Identifizierung der gewünschten Nucleinsäure ist besonders bevorzugt, wenn mehrere Durchläufe zur Abtrennung notwendig sind, um das spezifisch miteinander in Wechselwirkung tretende Paar (Poly)peptid-Zielmolekül zu isolieren.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, dass das Einschließen von Antisense-Oligonucleotiden, die komplementär zur Tag codierenden Sequenz von ssrA-RNA sind, einen vielfachen Anstieg der Wirksamkeit der Polysomen-Darstellung zur Folge hat. Dieses Ergebnis ist umso mehr unerwartet, als die vorstehend genannten vorangegangenen Arbeiten bereits über zahlreiche Wege und Mittel versucht hatten, solche optimalen Bedingungen herzustellen.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein System zur phänotypischen Selektion von Zielmolekülen wie etwa Liganden mit (Poly)peptiden, die bevorzugt vollständige, native Proteinmoleküle sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die mRNA-Moleküle eine Stammschleife an ihrem 3'-Ende auf.
In dieser Ausführungsform der Erfindung wird der Abbau der mRNA durch Exonucleasen in einem signifikanten Ausmaß verhindert.
Am meisten bevorzugt wird ein Spacer in den Leserahmen des (Poly)peptids eingefügt, um das entstehende, gefaltete (Poly)peptid an den mutmaßlichen (Poly)peptid-Kanal des Ribosoms zu binden. Dieser Spacer codiert bevorzugt 57 bis 116 Aminosäuren.
Die Bindung des entstehenden (Poly)peptids an den (Poly)peptid-Kanal des Ribosoms ist ein zusätzliches vorteilhaftes Mittel, um gemeinsame Selektion von (Poly)peptid und zugehöriger mRNA zu ermöglichen, weil sie die Dissoziation des Polysoms signifikant verlangsamen könnte.
In einer weiteren, am meisten bevorzugten Ausführungsform codiert die genannte Stammschleifenregion am 3'-Ende der mRNA-Moleküle diesen Spacer. Auf diese Weise kann die Länge der gesamten 3'-Region auf einem Minimum gehalten werden, wenn sowohl Spacer (auf Proteinebene erforderlich) als auch Stammschleife (auf RNA-Ebene erforderlich) von der selben DNA codiert werden können.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft das vorstehend genannte Verfahren, in dem die genannten mRNA-Moleküle eine Stammschleifenstruktur an ihrem 5'-Ende umfassen.
Wie die Stammschleifenstruktur am 3'-Ende dient die Stammschleife am 5'-Ende der mRNA dem Zweck, einen erfolgreichen Angriff von Exonucleasen auf die mRNA zu verhindern. Es ist besonders bevorzugt, dass die mRNA sowohl eine 5'- als auch eine 3'-Stammschleifenstruktur enthält. In dieser Ausführungsform würde das mRNA-Molekül strukturell an natürliche mRNAs erinnern.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das genannte in vitro-Translationssystem mit Ribonuklease-Inhibitoren ergänzt.
Bevorzugt sind diese Ribonuklease-Inhibitoren Analoga von Übergangsstadien und am meisten bevorzugt sind sie Vanadyl-Ribonuklease-Komplexe.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung fand man heraus, dass besonders die Vanadyl-Ribonucleasekomplexe vorteilhaft verwendet werden können, um die Wirksamkeit der Ribosomen-Darstellung weiter zu verbessern. Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, da diese Komplexe gleichzeitig teilweise die Proteinsynthese hemmen.
Eine darüber hinaus bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, in dem die Polysomen in den Schritten (a) bis (c) stabilisiert werden durch

(a) die Zugabe von Magnesiumsalzen, bevorzugt Magnesiumacetat, nach der Bildung von Polysomen; und/oder
(b) ein Mittel, das eine Brücke zwischen der mRNA und dem zugehörigen (Poly)peptid bildet; und/oder
(c) eine niedrige Temperatur nach der Translation und/oder während des Durchmusterungsvorganges.

Es hat sich gezeigt, dass die vorstehend genannten Maßnahmen die Stabilität der Polysome erhöhten. So stabilisiert eine Magnesiumacetat-Konzentration von 50 mM in der Reaktionspufferlösung die Ribosomen-Komplexe signifikant gegen Dissoziation.
Der Ausdruck „niedrige Temperatur" in vorstehendem Zusammenhang bedeutet eine Temperatur, die die Durchführung einer erfolgreichen Durchmusterung gestattet. Bevorzugt liegt diese niedrige Temperatur im Bereich von 0 bis 5°C.
Bevorzugt wird die Translation in einem prokaryontischen Translationssystem durchgeführt. Besonders bevorzugt ist ein auf E. coli basierendes Translationssystem wie etwa das S-30-Translationssystem von E. coli.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst Schritt (d)

(da) reverses Transkribieren dieser mRNA;
(db) optionales Amplifizieren der entstehenden cDNA;
(dc) optionales Clonieren der optional amplifizierten cDNA, und
(dd) Bestimmen der Sequenz dieser cDNA.

Diese Ausführungsform zur Identifizierung der interessierenden Nucleinsäure ist bevorzugt, wenn die Population von mRNA-Molekülen zu umfangreich ist, um die gewünschten Arten in einem einzigen Durchlauf zu identifizieren. Darüber hinaus erlaubt sie wiederholtes und detailliertes Testen von identifizierten Molekülen, da die Population von mRNA-Molekülen durch Clonierung „unsterblich" wird.
Die reverse Transkription gestattet Sequenzierung unter Verwendung der sehr vorteilhaften DNA-Sequenzierungstechnik, die sowohl von Maxam und Gilbert als auch von Sanger und Mitarbeitern entwickelt wurde (vgl. z.B. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Auflage 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor).
Die Amplifizierung von cDNA, bevorzugt durch PCR, mit oder ohne anschließender Clonierung in einen geeigneten Vektor erleichtert die Identifizierung des gewünschten Nucleinsäuremoleküls weiterhin signifikant. In zahlreichen Fällen wird die Amplifizierung des Nucleinsäuremoleküls für den Forscher eine Vorbedingung zur anschließenden Identifizierung dieses Nucleinsäuremoleküls sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird DNA in Anwesenheit eines Reduktionsmittel, wie etwa β-Mercaptoethanol und/oder DTT vor Schritt (a) in mRNA transkribiert.
Es ist bekannt, dass der Einschluss eines Reduktionsmittels wie etwa β-Mercaptoethanol und/oder DTT in die Reaktionspufferlösung die Stabilität von DNA-Polymerase erhöht. Dem zufolge führt ein Reduktionsmittel in der Pufferlösung zu einem Ansteigen des Erhalts an mRNA, was wiederum zu einer Gesamtverbesserung der Ribosomendarstellung führt.
Besonders bevorzugt ist es, dieses Reduktionsmittel nach der Transkription und vor Schritt (a) zu entfernen. Dieses Verfahren der Erfindung ist am meisten in Fällen bevorzugt, in denen das zu durchmusternde (Poly)peptid Arten enthalten kann, die ihre native Konformation durch Bildung von Disulfid-Brücken erlangen. Ein Beispiel für solche (Poly)peptide sind Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie. Durch Einführung dieser bevorzugten Ausführungsform steht die vorliegende Erfindung in direktem Widerspruch zu dem vorstehend angeführten Stand der Technik, der die Verwendung eines kombinierten Transkriptions/Translationssystems vorschlägt.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Nucleinsäuremoleküls, welches ein (Poly)peptid codiert, das mit einem Zielmolekül in Wechselwirkung tritt, welches die nachstehenden Schritte umfasst:

(a) Transkribieren einer Population von DNA-Molekülen ohne Stop-Codons im korrekten Leserahmen in die zugehörige Population von mRNA-Molekülen in Anwesenheit eines Reduktionsmittels;
(b) Entfernen dieses Reduktionsmittels aus dieser Population von mRNA-Molekülen;
(c) Translatieren dieser Population von mRNA-Molekülen in ein in vitro-Translationssystem unter Bedingungen, die die Bildung von Polysomen gestatten;
(d) Inkontaktbringen der auf diese Weise gebildeten Polysomen mit diesen Zielmolekülen unter Bedingungen, die die Wechselwirkung der (Poly)peptide, die von diesen mRNA-Molekülen codiert werden und von diesen Polysomen dargestellt werden, mit diesen Zielmolekülen zu lassen;
(e) Abtrennen der Polysomen, die (Poly)peptide darstellen, die mit diesen Zielmolekülen in Wechselwirkung treten, von Polysomen, die keine solchen (Poly)peptide darstellen; und
(f) Identifizieren des Nucleinsäuremoleküls, das ein (Poly)peptid codiert, das in einem Polysom, welches mit diesen Zielmolekülen in Wechselwirkung tritt, dargestellt wird.

Das in Schritt (a) beschriebene Reduktionsmittel ist β-Mercaptoethanol und/oder DTT.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfassen die (Poly)peptide Domänen der Immunglobulin-Überfamilie und bevorzugt der Immunglobulin-Familie.
Zum Beispiel können diese (Poly)peptide den vollständigen T-Zellrezeptor oder Antikörperketten oder Teile hiervon wie etwa Domänen von Antikörpern, zum Beispiel die V_H- oder V_L-Regionen, umfassen.
Es ist besonders bevorzugt, dass die (Poly)peptide Einzelketten-Antikörper oder Fusionsproteine sind, die solche Einzelketten-Antikörper umfassen. In letzterer Alternative ist der Fusionspartner dieser Antikörperketten bevorzugt ein Tag, das für die Bindung des entstehenden (Poly)peptids an die zugehörige mRNA verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch bevorzugt ein Verfahren, in dem das Translationssystem mit wenigstens einer Verbindung versetzt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteindisulfid-Isomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, E. coli-Protein DsbA und molekularen Chaperonen wie etwa DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL oder GroES besteht.
Die vorstehenden Verbindungen können, allein oder in Kombination, die Stabilität, Solubilität und/oder nativen Fähigkeiten zur Faltung des entstehenden (Poly)peptids verstärken.
Die Proteindisulfid-Isomerase kann bakterieller oder eukaryontischer Herkunft sein. Die Verbindung/das Enzym, welche/welches in das System eingeschlossen wird, würde von Fachleuten auf dem Gebiet nach dem Proteintyp, der durchmustert wird, ausgesucht werden. Wenn zum Beispiel eine Bibliothek, die Antikörper-Domänen umfasst, durchmustert wird, würde in Übereinstimmung mit den Lehren aus der vorliegenden Erfindung eine eukaryontische Proteindisulfid-Isomerase eingeschlossen werden. Wie durch die vorliegende Erfindung gezeigt werden konnte (vgl. die anhängenden Beispiele), wird das System zur Darstellung der Polysomen durch Einbeziehung dieses Enzyms in das Translations-Reaktionssystem signifikant verbessert.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden nicht spezifische Wechselwirkungen zwischen den Polysomen und/oder Polysomen und den Zielmolekülen und/oder optional den Polysomen und der Matrix, auf der die Zielmoleküle immobilisiert sind, gebildet während des Schrittes des Inkontaktbringens der Polysomen mit diesen Zielmolekülen, durch die Zugabe einer blockierenden Verbindung gehemmt oder reduziert.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist diese blockierende Verbindung eine polyanionische Verbindung wie Heparin. Es wurde vorgeschlagen, Heparin als RNase-Inhibitor einzuschließen (WO 91/05058), es hat sich aber überraschenderweise im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung herausgestellt, dass es zusätzlich nicht spezifische Bindung vermindert. Es kann angenommen werden, dass Heparin als polyanionische Verbindung mit der polyanionischen mRNA als Teil des Polysom-Komplexes um nicht spezifische Bindungsstellen konkurriert, was die Zugabe von polyanionischen Verbindungen wie etwa Heparin zur Polysomen-Darstellung zu einem allgemein anwendbaren Verfahren zur Verminderung nicht spezifischer Bindung macht.
In einer anderen sehr bevorzugten Ausführungsform ist diese blockierende Verbindung sterilisierte Milch. Die Zugabe von fettfreier Milch ist für die Polysom-Darstellung schon vorgeschlagen worden (WO 95/11922). Es stellte sich jedoch im Einklang mit der vorliegenden Erfindung heraus, dass keine RNA isoliert werden konnte, wenn Milch während der Affinitätsselektion verwendet wurde. Überraschenderweise war die RNA-Isolierung wieder möglich, wenn sterilisierte Milch verwendet wurde, und der Umfang an nicht spezifischer Bindung wurde wesentlich gesenkt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, umfassend

(a) Antisense-Oligonucleotide, die komplementär zu der Tag codierenden Sequenz von ssrA-RNA sind; und wenigstens eine Verbindung ausgewählt aus der Liste
(b) ein Vektor, der zur Clonierung von Nucleinsäuren, die die zu durchmustemden (Poly)peptide codieren, geeignet ist;
(c) Ribonuclease-Inhibitoren, bevorzugt Analoga von Übergangsstadien und am meisten bevorzugt Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe;
(d) mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der aus einer Proteindisulfid-Isomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, E. coli-DsbA und molekularen Chaperonen bestehenden Gruppe; und
(e) Oligonucleotide, die 5'- oder 3'-Stammschleifen, Spacer oder Terminatoren ohne Stop-Codons codieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Kit im Einklang mit der Erfindung darüber hinaus umfassen:

(f) S-30-Translationsextrakt;
(g) PCR-Bestandteile;
(h) reverse Transkriptase;
(i) einen RNA-Sequenzierungskit;
(j) einen DNA-Sequenzierungskit, entweder allein oder in Kombination.

Schließlich betrifft die Erfindung einen Kit, umfassend

(a) einen prokaryontischen zellfreien in vitro Translationsextrakt, frei von ssrA-RNA; und mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Liste
(b) einen Vektor, der zur Clonierung von Nucleinsäuren, die die zu durchmusternden (Poly)peptide codieren, geeignet ist;
(c) Ribonuclease-Inhibitoren, bevorzugt Analoga von Übergangsstadien und am meisten bevorzugt Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe;
(d) mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der aus einer Proteindisulfid-Isomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, DsbA von E. coli und molekularen Chaperonen bestehenden Gruppe; und
(e) Oligonucleotide, die 5'- oder 3'-Stammschleifen, Spacer oder Terminatoren ohne Stop-Codons codieren.

(f) PCR-Bestandteile;
(g) reverse Transkriptase;
(h) einen RNA-Sequenzierungskit;
(i) einen DNA-Sequenzierungskit, entweder allein oder in Kombination.

Der Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Die Abbildungen zeigen:
1 Prinzip der Ribosomen-Darstellung in vitro zur Durchmusterung von nativen Protein-(scFv)-Bibliotheken auf Ligand-(Antigen-)Bindung. 1, eine DNA-scFv-Bibliothek wird zunächst durch PCR amplifiziert, wobei ein T7-Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle und Stammschleifen eingeführt werden, und wird dann zu RNA transkribiert. 2, nach Reinigung wird mRNA in vitro in einem S30-System von E. coli in Anwesenheit von verschiedenen Faktoren transkribiert, die die Stabilität von ribosomalen Komplexen erhöhen und die Faltung der scFv-Antikörper auf den Ribosomen verbessern. Die Translation wird durch Kühlen auf Eis gestoppt, und die Ribosomen-Komplexe werden durch Erhöhung der Magnesiumkonzentration stabilisiert. 3, die gewünschten Ribosomen-Komplexe werden durch Affinitätsselektion vom Translationsgemisch getrennt, indem das native scFv an das immobilisierte Antigen gebunden wird. Unspezifische Ribosomen-Komplexe werden durch intensives Waschen entfernt. 4, die gebundenen Ribosomen-Komplexe können dann durch EDTA dissoziiert werden (4b), oder ganze Komplexe können mit Antigen spezifisch eluiert werden (4a). 5, RNA wird aus den Komplexen isoliert. 6, isolierte mRNA wird zu cDNA revers transkribiert, und cDNA wird dann durch PCR amplifiziert. Diese DNA wird dann für die nächste Anreicherungsrunde verwendet, und ein Teil kann durch Clonieren und Sequenzieren und/oder durch ELISA- oder RIA-Tests analysiert werden.
2(A) Schematische Zeichnung der scFv-Konstruktion, die für die Ribosom-Darstellung verwendet wurde. T7 kennzeichnet den T7-Promotor, SD die Ribosomen-Bindungsstelle, F die 3 Aminosäuren lange FLAG-Sequenz (Knappik, A. & Plückthun, A. (1994) Bio Techniques 17, 754–761) mit N-terminalem Methionin, V_L und V_H die variablen Domänen des scFv-Fragmentes, L den Linker, Spacer den Teil der Proteinkonstruktion, der das gefaltete scFv mit dem Ribosom verbindet, 5'sl und 3'sl die Stammschleifen an den 5'- und 3'-Enden der mRNA. Der Pfeil kennzeichnet den Beginn der Transkription. Die Vorgehensweise der PCR-Amplifizierung wird gezeigt.
(B) Die Menge der scFvhag-mRNA, die an die Polysomen-Komplexe gebunden ist, wird durch die Sekundärstruktur ihrer Enden und die Länge des Spacers, der das gefaltete scFv mit dem Ribosom verbindet, beeinflusst. Unterschiedliche Konstruktionen von scFvhag-mRNA wurden für eine Runde der Ribosomen-Darstellung verwendet (Konstruktionen c1–c9). Keine von ihnen enthielt ein Stop-Codon. Jede Art wurde getrennt untersucht. Nach der Affinitätsselektion der Ribosomen-Komplexe aus jeweils 100 μl Translationsgemischen wurden die mRNAs isoliert und durch Northern-Hybridisierung analysiert. Die Anwesenheit der 5'-Stammschleife wurde mit (+) oder (–) markiert, die der 3'-Stammschleife wurde mit (–) markiert, wenn sie fehlte, (l) wenn sie vom lpp-Terminator stammte, oder (t), wenn sie vom T3Te-Terminator stammte. Die Länge des Spacers zeigt die Anzahl der Aminosäuren an, die dem scFv folgen und es mit dem Ribosom verbinden, einschließlich der translatierten Stammschleife. Die Längen der RNA in kb stammen von der RNA-Molekulargewichtsmarkierung III (Boehringer Mannheim). Das Balkendiagramm zeigt die quantifizierten Mengen an mRNA aus der Fluoroimager-Analyse.
(C) Wirkung von Zusätzen auf die Menge an mRNA, die an die Ribosomen-Komplexe gebunden ist. Die mRNA der scFvhag-Konstruktion c7 wurde für eine Runde der Ribosomen-Darstellung verwendet. Die Proben in 2B Bande c7 und 2C Bande 6 sind identisch. Wenn angegeben, waren 3,5 mM anti-ssrA-Oligonucleotid ON10
35 mg/ml Proteindisulfid-Isomerase (PDI) oder 1 mg/ml Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe (VCR) in die Translationslösungen eingeschlossen. Die Translationen wurden durch Zugabe von Mg(Ac)₂ zur angegebenen Endkonzentration (in mM) und durch Kühlen auf Eis gestoppt. Nach Affinitätsselektion der Ribosomen-Komplexe aus 100 μl Translationsgemischen wurden die mRNAs isoliert und durch Northern-Hybridisierung analysiert. Das Balkendiagramm zeigt die quantifizierten Mengen an mRNA aus der Fluoroimager-Analyse.
3 Das anti-ssrA-Antisense-Oligonucleotid ON10 (2C) vermindert die Molekülmasse der längsten Proteinarten (Pfeile). In vitro-Translation wurde unter Verwendung von ³⁵S-Methionin und scFvhag c7-mRNA durchgeführt. Die Reaktionen wurden in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von 3,5 mM Oligonucleotid ON10 durchgeführt. Eine SDS-PAGE-Analyse der Translationsprodukte wird gezeigt.
4(A) Anreicherung des scFvhag-Ribosomen-Komplexes aus Gemischen mit scFvAL2 durch Ribosomen-Darstellung. mRNA von scFvhag c5 wurde 10⁸-fach mit mRNA von scFvAL2 verdünnt, und das Gemisch wurde zur Ribosomen-Darstellung verwendet. Nach Affinitätsselektion von scFvhag-Ribosomen-Komplexen wurde mRNA isoliert, unter Verwendung von Oligonucleotid ON5 in cDNA revers transkribiert, die cDNA wurde unter Verwendung der Oligonucleotide ON3 und ON7 durch PCR amplifiziert und durch Agarose-Elektrophorese analysiert. Banden 1–5 sind PCR-Produkte, die nach den 1. bis 5. Zyklen (in dieser Reihenfolge aufgetragen) der Ribosomen-Darstellung amplifiziert worden sind. M ist die 1 kB umfassende DNA-Leiter (Gibco BRL), die als MG-Markierung verwendet wurde. Die zu scFvhag und scFvAL2 gehörenden PCR-Produkte sind markiert.
(B) Anreicherung von entweder scFvhag-c5 oder scFvAL2-Ribosomen-Komplexen durch Ribosomen-Darstellung als eine Funktion von immobilisiertem Antigen. Die mRNAs von scFvhag und scFvAL2 wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und für eine Runde der Ribosomen-Darstellung verwendet. Nach Affinitätsselektion wurde mRNA isoliert, revers transkribiert, durch PCR amplifiziert und durch Agarose-Elekrtophorese analysiert, wie in 4A. Dasselbe 1:1-Gemisch wurde einer Affinitätsselektion auf immobilisiertem Transferrin (tr) als Kontrolle unterzogen. Ampicillin-Transferrin-Konjugat (amp) oder hag-Peptid-Transferrin-Konjugat (hag). Zu scFvhag und scFvAL2 gehörende PCR-Produkte sind markiert.
5(A) Analyse des RNA-Pools nach der 3. Runde der Polysomen-Darstellung: in vitro-Translation des RNA-Pools und RIA-Test von markierten Polysomen-Komplexen in Anwesenheit von 2% Milch: (a) Bindung an BSA; (b) Bindung an BSA-GCN4(7P14P); (c) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM GCN4(7P14P); (d) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM hag-Peptid; (e) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM Fluorescein.
(B) Analyse des RNA-Pools nach der 3. Runde der Polysomen-Darstellung: in vitro Translation des RNA-Pools und RIA-Test von markierten Polysomen-Komplexen bei Abwesenheit von 2% Milch; (a) Bindung an BSA; (b) Bindung an BSA-GCN4(7P14P); (c) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM GCN4(7P14P); (d) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM hag-Peptid; (e) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM Fluorescein.
(C) RIA-Analyse des RNA-Pools nach der 3. Runde der Polysomen-Darstellung: RNA- Pool nach 3 Runden Affinitätsselektion, die in Abwesenheit von Milch (A) oder in Anwesenheit von Milch (B) durchgeführt wurden:
in vitro-Translation des RNA-Pools und Bindungstest mit markierten Polysomen-Komplexen in Anwesenheit von 2% Milch: (a) Bindung an BSA-GCN4(7P14P); (b) Bindung an BSA-GCN4(7P14P) bei Hemmung mit 1 μM GCN4(7P14P).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In den anhängenden Beispielen wird gezeigt, dass ein scFv-Fragment eines Antikörpers, welches seine korrekt zusammengesetzte dreidimensionale Struktur benötigt, um das Antigen (ein hydrophiles Peptid) zu binden, durch Ribosomen-Darstellung 10⁸-fach angereichert werden kann, und seine Sequenz wird während des Prozesses „weiterentwickelt".
Beispiel 1: Konstruktion von scFv-Antikörperfragmenten
Die scFvhag-Konstruktion c7 wurde in zwei Schritten durch PCR von einem fd-Phagen amplifiziert, der das scFv 17/9 darstellte, (Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A. (1993) J. Mol. Biol. 234, 1098–1118; Krebber, C., Spada, S., Desplancq, D. & Plückthun, A. (1995) FEBS Lett. 377, 227–231) welches einen (Gly4Ser)₃-Linker umfasste, indem im ersten Schritt das Oligonucleotid ON1
das eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) einführt, und ON2
verwendet wurden. Im zweiten Schritt wurden ON3
welches den T7-Promotor und die 5'-Schleife einführt, und ON4
welches eine modifizierte lpp-Terminator-Schleife mit entferntem Stop-Codon einführt, verwendet. Der Spacer, der C-terminal an das scFv fusioniert wurde, stammt von den Aminosäuren 211 bis 299 von Gen III des filamentösen Phagen M13mp19 (Krebber, C., Spada, S., Desplancq, D. & Plückthun, A. (1995) FEBS Lett. 377, 227–231), und der translatierte lpp-Terminator steuert weitere 24 Aminosäuren bei.
Die anderen Konstruktionen wurden durch PCR von c7 unter Verwendung der nachstehenden Primer-Paare hergestellt: c1, ON5
welches den T7-Promotor und RBS ohne die 5'-Stammschleife einführt, der Spacer stammt von den Aminosäuren 211–294 von Gen III; c2, ON4 und ON6, der gleiche Spacer wie c7; c3, ON6 und ON7
der Spacer stammt von den Aminosäuren 211–294 von Gen III im Anschluss an 7 Aminosäuren des translatierten T3Te-Terminators; c4, ON3 und ON5, der gleiche Spacer wie in c1; c5, ON3 und ON7, der gleiche Spacer wie in c3; c6, ON2 und ON3, der Spacer stammt von den Aminosäuren 211–299 von Gen III im Anschluss an die ersten 4 Aminosäuren des lpp-Terminators; c8, ON3 und ON8
der Spacer stammt von den Aminosäuren 211–264 von Gen III, im Anschluss an die ersten 4 Aminosäuren des lpp-Terminators; c9, ON3 und ON4, der Spacer stammt von den Aminosäuren 211–299 von Gen III, im Anschluss an 24 Aminosäuren des lpp-Terminators, wobei die Konstruktion c8 als eine Matrize verwendet wurde.
Die Konstruktion scFvAL2 (V_L-(Gly4Ser)₄-V_H) wurde durch PCR in zwei Schritten vom Plasmid pAK202 amplifiziert (Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H. R. & Plückthun, A. (1997) J. Immunol. Meth. 201, 35–55), wobei erst die Oligonucleotide ON1 und ON7 und in dem zweiten Schritt ON3 und ON7 verwendet wurden. Der Spacer stammt von den Aminosäuren 240–294 von Gen III des filamentösen Phagen M13mp19 (Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H. R. & Plückthun, A. (1997) J. Immunol. Meth. 201, 35–55), und der translatierte T3Te-Terminator steuert weitere 7 Aminosäuren bei.
Beispiel 2: RT-PCR und in vitro-Transkription
Reverse Transkription wurde unter Verwendung der reversen Transkriptasesuperscript (Gibco BRL) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. PCR wurde unter Verwendung von Taq-Polymerase (Gibco BRL) in Anwesenheit von 5% DMSO (4 min bei 94°C, gefolgt von 3 Zyklen mit 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 37°C, 2 min bei 72°C, gefolgt von 10 ähnlichen Zyklen bei 60°C statt bei 37°C, 20 ähnlichen Zyklen bei 60°C statt bei 37°C mit Elongation bei 72°C, verlängert um 15 sec pro Zyklus und beendet durch 10 min bei 72°C). Die PCR-Produkte wurden mit Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert und aus dem Gel gereinigt und reamplifiziert, wenn Menge und Qualität nicht ausreichend waren, oder direkt ohne weitere Reinigung für die Transkription verwendet. In vitro-Transkription wurde, wie beschrieben, durchgeführt (Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V. (1994) Anal. Biochem. 220, 420–423).
Beispiel 3: Modellsystem und Quantifizierung von Erträgen aus der Affinitätsselektion
Als ein Modellsystem verwendeten wir Einzelketten-Fv (scFv)-Fragmente von Antikörpern (Huston, J. S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M. S., Novotny, J., Margolies, M N., Ridge, R. J., Bruccoleri, R. E., Haber, E., Crea, R. & Oppermann, H. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85, 5879–5883), in denen die variable Domäne der leichten Kette (V_L) über einen flexiblen Linker mit der variable Domäne der schweren Kette (V_H) verbunden ist. Um das gefaltete Protein an das Ribosom zu binden und die Faltung nicht zu beeinflussen, fusionierten wir einen Spacer an den C-Terminus des scFv-Fragmentes. Da die Antikörperdomänen Disulfidbrücken bilden, und die RNA-Polymerase β-Mercaptoethanol für maximale Stabilität erfordert, wurde die Auswirkung der Durchführung der Transkription in einer gesonderten Reaktion untersucht. Darüber hinaus wurden die Bedingungen für oxidative Proteinfaltung während der Translation (Ryabova, L., Desplancq, D., Spirin, A. & Plückthun, A. (1997) Nature Biotechnology, 15, 79–84) optimiert (vgl. nachstehend).
Die Freisetzung des Polypeptids ist ein aktiver Prozess, der bei E. coli drei Polypeptid-Freisetzungsfaktoren (Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue-Hamard, V. & Buckingham, R. H. (1995) J. Biol. Chem. 270, 10595–10600; Tuite, M. F & Stansfield, I. (1994) Mol. Biol. Rep. 19, 171–181; Tate, W. P. & Brown, C. M. (1992) Biochemistry 31, 2443–2450) und einen Ribsomen-Recycling-Faktor erfordert, welcher die mRNA freisetzt (Janosi, L., Shimizu, I. & Kaji, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4249–4253). Die Folge der Bindung von Freisetzungsfaktoren ist normalerweise die Hydrolyse der Peptidyl-tRNA zwischen der Ribose und der letzten Aminosäure durch das Peptidyl-Transferase-Zentrum des Ribosoms (Tate, W. P. & Brown, C. M. (1992) Biochemistry 31, 2443–2450). Unserem System fehlen die Stop-Codons, und daher kann es vorkommen, dass ein Abschnitt des Polypeptids nicht durch Hydrolyse von der tRNA getrennt wird und an das Ribosom gebunden bleibt und auf diese Weise für die Affinitätsselektion verfügbar ist.
In vitro-Translation in einem S-30-System von E. coli wurde nach Chen und Zubay (Chen, H. Z. & Zubay, G. (1983) Methods Enzymol. 101, 674–690) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Die Translation wurde über 10 min bei 37°C in einer Reaktionslösung von 110 μl durchgeführt, welche die nachstehenden Bestandteile enthielt: 50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 30 mM NH4Ac, 12,3 mM Mg(Ac)2, 0,35 mM von jeder Aminosäure, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 1 mM cAMP, 0,5 mg/ml tRNA von E. coli, 20 μg/ml Folsäure, 100 mM KAc, 30 mM Acetylphosphat (Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhotsova, E. A., Alakhov, Y. B. & Spirin, A. S. (1995) Anal. Biochem. 226, 184–186), 1,5% PEG 8000, 33 μg/ml Rifampicin, 1 mg/ml Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe (VRC), 23 μl MRE600-Extract von E. coli (Chen, H. Z. & Zubay, G. (1983) Methods Enzymol. 101, 674–690) und 90 μg/ml mRNA.
Die Translation wird durch Kühlen auf Eis gestoppt, und die Ribosomen-Komplexe werden mit 50 mM Magnesiumacetat weiter gegen Dissoziation stabilisiert (Holschuh, K. & Gassen, H. G. (1982) J. Biol. Chem. 257, 1987–1992). Chloramphenicol in einer Konzentration von 50 μM, das gleichfalls ein Stoppen der Ribosomen auszulösen schien (Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022–9026; Moazed, D. & Noller, H. F. (1987) Nature 327, 389–394), verbesserte die Selektionseigenschaften nicht (Daten nicht dargestellt). Der gesamte Komplex, bestehend aus synthetisiertem Protein, Ribosom und mRNA, wurde dann an die Affnitätsmatrix gebunden, gewaschen und mit konkurrierendem Ligand eluiert, oder die Ribosomen wurden mit EDTA dissoziiert (1). Im Einzelnen wurden die Proben viermal mit eisgekühlter Waschpufferlösung (50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM Mg(Ac)₂ und 0,1% Teeen-20) gespült und über 5 min bei 4°C und 10.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Mikrotiterplatten, die mit hag-Transferrin-Konjugat überzogen waren, wurden mit eisgekühlter Waschpufferlösung vorgewaschen, und der Überstand aus dem zentrifugierten Translationsgemisch wurde aufgebracht (200 μl pro Mikrotiter-Vertiefung), und die Platte wurde über 1 Stunde im gekühlten Raum sanft geschwenkt. Nach 5 Waschgängen mit eisgekühlter Waschpufferlösung wurden die zurückgehaltenen Ribosomen-Komplexe mit eisgekühlter Eluierungspufferlösung (100 μl pro Vertiefung; 50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 50 μg/ml tRNA von E. coli) über 10 min im gekühlten Raum dissoziiert, und die freigesetzte mRNA wurde durch Ethanol-Fällung oder durch Isolierung unter Verwendung des Rneasy-Kits (Qiagen) gewonnen.
Wir fanden es zu keinem Zeitpunkt notwendig, Polysomen präparativ zu isolieren. Es stellte sich heraus, dass die Wirksamkeit der Ribosomen-Darstellung um zwei Größenordnungen geringer war, wenn ein gekoppeltes in vitro-Transkriptions-Translationssystem verwendet wurde (Daten nicht dargestellt).
Wir entwickelten das System der Ribosomen-Darstellung in zwei Schritten, zuerst durch Herstellung der Genstruktur zur in vitro-Transkription, Translation und Faltung, dann durch Optimierung der Translationsreaktion selbst. Jeder Test startete mit 10 μg eingesetzter mRNA; dies entspricht ~1,5 × 10¹³ Molekülen. Die eingesetzte mRNA wurde einer einzelnen Runde der Affinitätsselektion unterworfen: Translation in vitro, Einfangen von Ribosom-Komplexen auf immobilisiertem Ziel-Ligand und Freisetzung von mRNA. Die freigesetzte mRNA wurde dann durch Northern-Analyse quantifiziert.
Für die Northern-Analyse wurden RNA-Elektrophorese und -Transfer auf eine Nytran-Membran (Schleicher & Schuell), wie beschrieben (Goda, S. K. & Minton, N. P. (1995) Nucleic Acids Res. 23 3357–3358), mit einem Turboblotter (Schleicher & Schuell) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über 12 Stunden bei 60°C durchgeführt (Church, G. M. Gilbert, W. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991–1995). Die Hybridisierung wurde mit den Oligonucleotid ON9
durchgeführt, welches sich an die V_L-Region der scFvhag-mRNA anheftet. Dieses Oligonucleotid wurde durch Anhängen von Digoxigenin-11-dUTP/dATP am 3'-Ende unter Verwendung des DIG Oligonucleotide Tailing Kit (Boehringer Mannheim) markiert. Die Waschbedingungen waren wie folgt: 2 × SSC, 0,5% SDS über 5 min bei Zimmertemperatur; 2 × SSC, 0,5% SDS über 2 × 30 min bei 60°C; 0,1 × SSC über 10 min bei Raumtermperatur. Die hybridisierte Oligonucleotid-Sonde wurde nachgewiesen, indem der DIG DNA Labeling and Detection Kit mit dem chemolumineszierenden Substrat CSPD (Boehringer Mannheim) verwendet wurde, wobei die Membran und einem Röntgenfilm ausgesetzt wurde, oder mit dem fluorimetrischen Substrat Attophos (Boehringer Mannheim) verwendet wurde, wobei die Analyse unter Verwendung eines Fluoroimagers (Molecular Dynamics) erfolgte.
Beispiel 4: Einfluss der mRNA-Struktur auf den Ertrag
Bei dem Entwurf des Systems der Ribosomen-Darstellung erzeugten wir zunächst die flankierenden Regionen des scFv-Gens (2A). Das Gen sollte sehr wirksam vom PCR-Produkt transkribiert werden, und seine mRNA sollte stabil gegenüber Nucleasen sein. Für das 5'-Ende verwendeten wir den T7-Promotor und die natürliche, stromaufwärts von T7-Gen 10 gelegene Region, die eine Stammschleifenstruktur direkt zu Beginn der mRNA codiert (Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W. (1990) Methods Enzymol. 185, 60–89). Am 3'-Ende fusionierten wir eine Spacer-Region von 57–116 Aminosäuren an den Leserahmen des scFv, um das entstehende, gefaltete Polypeptid an den mutmaßlichen Polypeptid-Kanal des Ribosoms zu binden und ihm genug Abstand zu geben, um die Faltung nicht zu beeinflussen. Dieser Spacer codiert auf der RNA-Ebene eine 3'-Stammschleife, entweder den Terminator des Lipoproteins von E. coli (Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W. (1990) Methods Enzymol. 185, 60–89) (lpp-Term) oder den frühen Terminator des Phagen T3 (Reynolds, R., Bermudez-Cruz, R. M. & Chamberlin, M. J. (1992) J. Mol. Biol. 224, 31–51) (T3Te), um die Stabilität der mRNA gegenüber Exonucleasen zu erhöhen. In einem direkten Vergleich von flankierenden Regionen (2B) nach einer Runde von Translation und Selektion erhielten wir das beste Ergebnis für Konstruktionen, die eine 5'-Schleife (von T7-g10), eine 3'-Schleife (vom lpp-Terminator) und den längsten Spacer mit 116 Aminosäuren besaßen. Der Ertrag an mRNA nach einer Runde Ribosomen-Darstellung verbesserte sich von weniger als 0,001% der eingesetzten mRNA auf 0,015% (15-fach).
Beispiel 5: Einfluss von Translationsbedingungen auf den Ertrag
Wir untersuchten dann den Einfluss von verschiedenen Verbindungen, die während der Translation anwesend waren. Es stellte sich heraus, dass Nucleasen wirksam durch Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) gehemmt werden, die als Analoga zu Übergangsstadien dienen sollten (Berger, S. L. (1987) Methods Enzymol. 152, 227–234). VRC zu 1 mg/ml maximierte den Ertrag an isolierter mRNA von Ribosomenkomplexen nach einer Runde der Affinitätsselektion, wenn es während der Translation anwesend war (20), obgleich die Proteinsynthese zum Teil gehemmt wurde (Daten nicht dargestellt), und das Weglassen von VRC führte zu einer mehrfach geringeren Wirksamkeit der Ribosomen-Darstellung (20). Im Gegensatz dazu hatte Rnasin (Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R. & Dower, W. J. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 9022–9026) keinen Einfluss auf die Wirksamkeit des Systems. Wir fanden kein Anzeichen für signifikanten proteolytischen Abbau des unter diesen Bedingungen synthetisierten scFv, denn verlängerte Inkubation des freigesetzten Produktes (bis zu 300 min) änderte das elektrophoretische Muster nicht (Daten nicht dargestellt).
Mit einer systematischen Untersuchung der in vitro-Translation von löslichen scFv-Fragmenten in Anwesenheit von molekularen Chaperonen und Disulfid bildenden Katalysatoren (Ryabova, L., Desplancq, D., Spirin, A. & Plückthun, A. (1997) Nature Biotechnology, 15, 79–84) fanden wir heraus, dass man Bindungsaktivität erhält, wenn und nur wenn ermöglicht wird, dass Disulfid-Bildung und Neuordnung während der Translation und Faltung stattfinden kann. Der sehr vorteilhafte Einfluss von Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) wurde für das System der Ribosomen-Darstellung bestätigt, in dem das Protein nicht freigesetzt wird. Man kann sehen, dass PDI die Leistung der Ribosomen-Darstellung für scFv-Fragmente um das Dreifache verbessert (2C), und auf diese Weise die Bildung und Isomerisierung von Disulfid-Brücken in dem an das Ribosom gebundenen Protein katalysiert.
Kürzlich wurde bei E. coli ein System zum Markieren von Peptid entdeckt, mit dem Proteine, die von mRNA translatiert worden sind und denen ein Stop-Codon fehlt, modifiziert und aus den Ribosomen freigesetzt werden, indem eine C-terminate Markierung bzw. ein C-terminates Tag angefügt wird, die von ssrA-RNA codiert wird und sie auf diese Weise zum Abbau markiert (Keiler, K. C., Waller, P. R. & Sauer, R. T. (1996) Science 271, 990–993). Es wird in der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass dieser Abbau durch ein Antisense-Oligonucleotid gehemmt werden könnte, welches komplementär zu der die Markierung codierenden Sequenz der ssrA-RNA ist. Es war darüber hinaus überraschend zu beobachten, dass eine solche mögliche Hemmung einen Einfluss auf die Ribosomen-Darstellung hatte. Tatsächlich ist bei der Anwesenheit eines anti-ssrA-Oligonucleotides eine vierfach höhere Wirksamkeit der Ribosom-Darstellung sichtbar (2C), und das MG des längsten Proteinproduktes ist verringert, vermutlich dadurch, dass das Anhängen der Markierung zum Abbau verhindert wird (3). Die Kombination von PDI und dem anti-ssrA-Oligonucleotid führte zu einer um das Zwölffache erhöhten Wirksamkeit des Systems der Ribosomen-Darstellung (2C).
Durch die Kombination der richtigen Sekundärstruktur der mRNA und verschiedener Verbindungen, die während der Translation anwesend sind, konnten wir den Ertrag an mRNA nach einer Runde der Affinitätsselektion um das 200-fache steigern – von weniger als 0,001% auf 0,2% der eingesetzten mRNA. Dieser Faktor zeigt die kombinierte Wirksamkeit von kovalenter Bindung an das Ribosom, Proteinfaltung, Liganden-Bindung, Ribosomen-Fang und RNA-Freisetzung und -Amplifizierung.
Beispiel 6: Spezifische Anreicherung von Ziel-mRNA durch mehrfache Selektionsrunden
In einem Test mit dem optimierten System untersuchten wir, wie gut ein Gemisch aus zwei Proteinen zur Funktion angereichert werden kann. Zwei scFv-Antikörper-mRNAs, nach 2A identisch konstruiert, beide in Besitz der 5'- und der 3'-T3Te-Schleife, die eine das anti-Hämagglutinin-scFv 17/9 codierend (Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A. (1993) J. Mol. Biol. 234, 1098–1118) (scFvhag), die andere den anti-beta-Lactam-Antikörper AL2 (Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H. R. & Plückthun, A. (1996) J. Immunol. Meth., in Druck) (scFvAL2), wurden in einem Verhältnis von 1:10⁸ gemischt. Ihre PCR-Produkte unterscheiden sich etwas in der Länge, im Wesentlichen auf Grund von Unterschieden in der Länge der Spacer, und können daher leicht voneinander unterschieden werden (4A). Nach 5 Zyklen nach 1 enthielten bei der Selektion auf immobilisiertem hag-Peptid 90% der Ribosomen-Komplexe scFvhag. Wir können daher schließen, dass die Anreicherung unter diesen Bedingungen etwa 2 Größenordnungen pro Zyklus beträgt.
Um zu sicherzustellen, dass die Anreicherung wirklich während der Affinitätsselektion stattfand, untersuchten wir die Anreicherung eines 1:1-Gemisches beider mRNAs auf einer irrelevanten Oberfläche und stellten keine Abweichung vom Ausgangsverhältnis fest (4B). Darüber hinaus konnte von dem identischen 1:1-mRNA-Gemisch einer der beiden Antikörper angereichert werden, in Abhängigkeit davon, welches Antigen immobilisiert worden war (4B).
Beispiel 7: Analyse von scFv-Antikörper-Fragmenten nach Affinitätsselektion
Nach der 5. Selektionsrunde wurden die PCR-Produkte in einen Vektor ligiert, in E. coli transformiert, und einzelne Clone wurden analysiert. Das experimentelle Protokoll war wie folgt: Nach der 5. Runde der Ribosomen-Darstellung wurden die PCR-Produkte in den Vektor pTFT74 cloniert (Ge, L., Knappik, A., Pack, P., Freund, C. & Plückthun, A. (1995) in Antibody Engineering, Hrsg. Borrebaeck, C. A. K. (Oxford University Press, New York). Gekoppelte in vitro-Transkription-Translation im S-30-System von E. coli wurde unter Verwendung von 50 μg/ml Plasmid-DNA unter ähnlichen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Eine gekoppelte Transkription-Translation wurde über 30 min bei 37°C durchgeführt, und dem Reaktionsgemisch wurden 2000 U/ml T7-RNA-Polymerase und 0,5 mM UTP und TTP zugegeben. Das Gemisch enthielt 50 μCi/ml 35S-Methionin und 0,35 mM von jeder Aminosäure außer Methionin. Nach der Translation wurden das Reaktionsgemisch vierfach mit PBS verdünnt und in einer Mikrotiterplatten-Vertiefung an immobilisiertes hag-Peptid gebunden. Nach Inkubation über 60 min bei sanftem Schwenken wurden die Mikrotiterplatten- Vertiefungen fünfmal mit PBST gewaschen und gebundenes radioaktives Protein wurde mit 0,1 M Triethylamin eluiert. Das eluierte Protein wurde in einem Szintilationszähler quantifiziert. Von 20 sequenzierten Clonen wiesen 18 die scFvhag-Sequenz auf, und 2 wiesen die scFvAL2-Sequenz auf, wodurch gezeigt wurde, dass die 10⁸-fache Anreicherung erfolgreich war. Von den 18 scFvhag-Clonen gaben 13 ELISA-Signale innerhalb von 43–102% des Wildtyps, hemmbar durch lösliches hag-Peptid, 2 waren auf 14 und 18% reduziert, und 3 wurden signifikant bei der Bindung reduziert (weniger als 10%), möglicherweise ein Ergebnis von Fehlern, die während der letzten Runde der PCR-Amplifizierung eingebracht worden waren (Tabelle 1). Auf diese Weise ist der selektive Druck, Antigen-Bindung zu erhalten, durchgeführt durch Bindung und Eluierung von immobilisiertem Antigen, deutlich wirksam, sogar im Zusammenhang einer fortlaufenden genetischen Diversifizierung durch PCR-Fehler.
Die Sequenzanalyse ergab, dass die Clone zwischen 3 und 7 Änderungen von Basen enthielten, davon 90% Transitionen und 10% Transversionen, was sich in guter Übereinstimmung mit den bekannten Fehlereigenschaften von Taq-Polymerase befindet (Keohavong, P. & Thilly, W. G. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 9253–9257). Jeder Clon hat im Ganzen 165 PCR-Zyklen durchlaufen, unterbrochen durch 5 phänotypische Selektionen für die Bindung, und unter diesen Bedingungen kann eine Fehlerrate von 3,3 × 10^–5 berechnet werden, wenn nur Mutationen gezählt werden, die die Selektion überlebt haben.
Auf der Protein-Ebene tragen die selektierten Clone zwischen 0 und 4 ausgetauschte Aminosäuren, verteilt über V_L, V_H und den Linker. Alle Mutationen sind unabhängig voneinander (Tabelle 1) und geben damit einen Hinweis auf einen weiten Bereich an neutralen Mutationen, die mit der Funktion im Einklang stehen, und vielleicht sogar auf Verbesserungen, die das System selektiert hat. Während die genauen Eigenschaften der selektierten Moleküle weitere Analyse erfordert, stellen wir die Selektion eines Prolin am Anfang des Linkers fest, das die erforderliche Bildung der Kehre (Tang, Y., Jiang, N., Parakh, C & Hilvert, D. (1996) J. Biol. Chem. 271, 15682–15686) und die Selektion von sauren Resten, von denen bekannt ist, dass sie die Löslichkeit erhöhen, (Dale, C. E., Broger, C., Langen, H., D'Arcy, A. & Stüber, D. (1994) Protein Eng. 7, 933–939; Knappik, A. & Plückthun, A. (1995) Protein Eng. 8, 81–89) ermöglichen kann.
Beispiel 8: Konstruktion einer Bibliothek der Polysomen-Darstellung
Wir konstruierten eine Bibliothek von scFvs in der Ausrichtung VL-VH, wobei die beiden Domänen durch einen (Gly₄Ser)₄-Linker verbunden sind. Um einen Spacer einzuführen, ein Protein, das ein scFv an das Ribosom bindet und gestattet, dass ein scFv sich auf ihm falten kann, ligierten wir zuerst die Bibliothek in den Vektor pAK200 (Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H. R. & Plückthun, A. (1997) J. Immunol Meth. 201, 35–55), was auf der Protein-Ebene dazu führte, dass scFvs an den C-terminalen Teil von Gen III des filamentösen Phagen M13mp19 fusionierten. Im zweiten Schritt führten wir Stammschleifen, welche mRNA gegen RNAsen stabilisieren, und die anderen wichtigen Eigenschaften durch PCR ein. Die endgültige Bibliothekskonstruktion enthielt einen T7-Promotor, eine 5'-Stammschleife und eine Shine-Dalgarno-Sequenz stromaufwärts der scFv codierenden Sequenz und einen Spacer, der aus 129 Basen aus Gen III des filamentösen Phagen M13mp19 bestand (Aminosäuren 250–293), gefolgt von 21 Basen des translatierten frühen Terminators des Phagen T3 (T3Te), der auch eine 3'-Stammschleife stromabwärts von scFv einführte.
Die Clonierung der Bibliothek folgte den in der Literatur beschriebenen Verfahren (Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H. R. & Plückthun, A. (1997) J. Immunol. Meth. 201, 35–55). In Kürze, mRNA wurde aus Milzzellen von 6 Mäusen extrahiert, die entweder mit GCN4(7P14P)-Peptid (RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER), das an KLH gekoppelt war, oder mit biotinyliertem GCN4(7P14P), das an Avidin gekoppelt war, immunisiert worden waren, und wurde unter Verwendung von zufälligen hexameren Primern in cDNA transkribiert. Nach PCR-Amplifizierung von VL und VH, gefolgt von einer Zusammensetzungs-PCR, wurden die PCR-Produkte direkt 3 × in SfiI-Reaktionspufferlösung verdünnt, gespalten und unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt. Mit SfiI gespaltene DNAs wurden durch Amicon-Spin- Säulen aus dem Agarose-Gel extrahiert, durch Isopropanol-Fällung konzentriert und in sterilem Wasser gelöst.
Die gereinigten PCR-Produkte (jeweils 150 ng) wurden über Nacht bei 16°C in die SfiI-Stelle des Vektors pAK200 ligiert (Molares Verhältnis Insertion:Vektor = 1:2).
Die Ligierung der Bibliothek in den Vektor pAK200 war sehr wirksam: durch Agarose-Gel-Elektrophorese und Restriktionsanalyse fanden wir heraus, dass 100% der scFv-DNA aus der Bibliothek mindestens an eine Stelle in den Vektor ligiert worden waren und mehr als 50% wurden mit dem Spacer-Abschnitt des Plasmids verbunden, waren.
Um die für die Polysomen-Darstellung notwendigen Eigenschaften einzuführen, wurden Ligierungsgemische in zwei Schritten durch PCR amplifiziert, wobei im ersten Schritt die Oligonucleotide SDA
welches eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) einführt, und ON7 (vgl. Beispiel 1), welches einen translatierten T3Te-Terminator einführt, und im zweiten Schritt die Oligonucleotide T7B
welches den T7-Promotor und die 5'-Schleife einführt, und Oligonucleotid ON7 verwendet wurden. Die PCR-Produkte wurden direkt ohne zusätzliche Reinigung zur in vitro-Transkription verwendet, und die RNA wurde durch LiCl-Fällung gereinigt (Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V. (1994) Anal. Biochem. 220, 420–423). Die RNAs aus beiden Mini-Bibliotheken wurden in gleichen Verhältnissen zusammengegeben und für die Polysomen-Darstellung verwendet.
Beispiel 9: In vitro-Translation einer Bibliothek aus scFv-Antikörperfragmenten
In vitro-Translation in einem S-30-System von E. coli wurde mit kleinen Modifikationen, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. In Kürze, die in vitro-Translation wurde über 8 min bei 37°C in 220 μl Reaktionslösung durchgeführt, die die folgenden Bestandteile enthielt: 50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 30 mM NH4Ac, 12,3 mM Mg(Ac)₂, 0,35 mM von jeder Aminosäure, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 1 mM cAMP, 0,5 mg/ml tRNA von E. coli, 20 μg/ml Folsäure, 100 mM KAc, 30 mM Acetylphosphat, 1,5% PEG 8000, 33 μg/ml Rifampicin, 1 mg/ml Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe (VRC), 3,5 mM anti-ssrA-Oligonucleotid, 0,3 μM PDI, 51,4 μl MRE600-Extrakt von E. coli und 90 μg/ml mRNA.
Beispiel 10: Durchmusterung der scFv-Bibliothek
Affnitätsselektion von Polysomen-Komplexen und RNA-Isolierung
In einem ersten Ansatz wurde die Affinitätsselektion, wie in Beispiel 6 beschrieben, mit der Verbesserung der Verwendung von Heparin während der Selektion durchgeführt. Wir beobachteten, dass Heparin die unspezifische Bindung von Polysomen-Komplexen an spezifische (GCN4(7P14P)-BSA) als auch an unspezifische Oberfläche (Milch oder BSA) verringert.
Die Translation (vgl. Beispiel 9) wurde durch Zugabe von Mg(Ac)₂ auf eine Endkonzentration von 50 mM gestoppt, und das Translationsgemisch wurde auf Eis gekühlt. Die Proben wurden vierfach mit eisgekühlter Waschpufferlösung (50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM Mg(Ac)₂, 2,5 mg/ml Heparin und 0,1% Tween-20) verdünnt und über 5 min bei 4°C bei 10.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Mikrotiterplatten, die mit GCN4(7P14P)-BSA-Konjugat überzogen waren, wurden mit eisgekühlter Waschpufferlösung vorgewaschen, und der Überstand aus dem zentrifugierten Translationsgemisch wurde aufgetragen (200 μl pro Mikrotiterplatten-Vertiefung), und die Platte wurde über 1 h im kalten Raum sanft geschwenkt. Nach 5 Waschgängen mit eisgekühlter Waschpufferlösung ohne Heparin wurden die zurückgehaltenen Polysomen-Komplexe mit eisgekühlter Eluierungspufferlösung (100 μl pro Vertiefung; 50 mM Tris-Ac, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 50 μg/ml tRNA von E. coli) über 10 min im kalten Raum dissoziiert, und freigesetzte mRNA wurde durch Isolierung unter Verwendung des RNeasy-Kit-1 (Qiagen) gewonnen und zur RT-PCR verwendet.
Nach in vitro-Transkription von PCR-Produkten wurde RNA durch LiCl-Fällung gereinigt (Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V. (1994) Anal. Biochem. 220, 420–423) und entweder für die RIA-Analyse (vgl. nachstehend) oder für die nächste Runde der Polysomen-Darstellung verwendet.
Um die Affinitätsselektion weiter zu verbessern, wurde die Verwendung von kompetitiven Proteinen während der Selektion untersucht. Die Verwendung von Milch während der Affinitätsselektion von Polysomen-Komplexen auf GCN4(7P14P)-Peptid ergab keine isolierte RNA nach einer Runde der Polysomen-Darstellung, wahrscheinlich auf Grund der RNase-Aktivität von Milch. Reine Proteine (z.B. BSA, Casein oder Transferrin) verminderten unspezifische Bindung nicht. Überraschenderweise beobachteten wir, dass Milch während der Affinitätsselektion von Polysomen-Komplexen verwendet werden konnte, wenn sie sterilisiert war. Auf diese Weise hatte sie keinen Einfluss auf RNA-Stabilität und verminderte unspezifische Bindung an die Oberfläche wesentlich.
In diesem zweiten Ansatz wurden die vorstehend beschriebenen Bedingungen mit der Modifikation verwendet, dass sich während der Affinitätsselektion 2% sterilisierte Milch in der Pufferlösung befanden.
Radioimmun-Test (RIA)
Nach jeder Runde der Polysomen-Darstellung wurde RNA aus dem gesamten rückgewonnenen Pool in vitro in dem S-30-System von E. coli translatiert, wobei ähnliche Bedingungen, wie vorstehend für die Bibliothek beschrieben, mit den nachstehenden Modifikationen verwendet wurden: die Translation wurde über 30 min bei 37°C durchgeführt, das Reaktionsgemisch enthielt 50 μCi/ml 35S-Methionin und 0,35 mM von jeder Aminosäure außer Methionin, und anti-ssrA-Oligonucleotid sowie PDI fehlten. Nach der Translation wurde das Reaktionsgemisch vierfach mit PBST/Milch auf eine Endkonzentration von 2% Milch verdünnt und in einer Mikrotiterplatten-Vertiefung an immobilisiertes GCN4(7P14P)-Peptid gebunden. Nach Inkubation über 30 min unter sanftem Schwenken wurden die Mikrotiterplatten-Vertiefungen fünfmal mit PBST gewaschen und das gebundene radioaktive Protein wurde mit 0,1 M Triethylamin eluiert. Das eluierte Protein wurde in einem Szintillationszähler quantifiziert. Inhibitions-RIA wurde durchgeführt, indem das Translationsgemisch, das mit PBST/Milch verdünnt war, mit dem GCN4(7P14P)-Peptid bei unterschiedlichen Konzentrationen mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert wurde, bevor die Bindung an immobilisiertes Antigen erfolgte.
ELISA-Test von einzelnen Clonen
Nach der dritten Runde der Polysomen-Darstellung wurden die PCR-Produkte in den Vektor pTFT74 cloniert (Ge, L., Knappik, A., Pack, P., Freund, C. & Plückthun, A. (1995) Antibody Engineering, Hrsg. Borrebaeck, C. A. K. (Oxford University Press, New York)). Plasmide von einzelnen Clonen wurden isoliert, in vitro transkribiert (3), RNA wurde durch LiCl-Fällung gereinigt (3) und für in vitro-Translation im S-30-System von E. coli verwendet, wobei ähnliche Bedingungen, wie vorstehend für die Bibliothek beschrieben, mit den nachstehenden Modifikationen verwendet wurden: die Translation wurde über 30 min bei 37°C durchgeführt, und anti-ssrA-Oligonucleotid, VRC sowie PDI fehlten. Nach der Translation wurde das Reaktionsgemisch vierfach mit PBST/Milch auf eine Endkonzentration von 2% Milch verdünnt, wobei das Gemisch GCN4(7P14P)-Peptid in unterschiedlichen Konzentrationen enthielt, und über 1 Stunde bei Zimmertemperatur vorinkubiert. Die Bindung an immobilisiertes GCN4(7P14P)-Peptid in einer Mikrotiterplatten-Vertiefung wurde über 30 min unter sanftem Schwenken durchgeführt, und gebundenes scFv-Protein wurde unter Verwendung des monoclonalen anti-Myc-Tag-Antikörpers 9E10 und eines polyclonalen anti-Maus/Peroxidase-Konjugats (Pierce) nachgewiesen.
Ergebnisse
Nach der dritten Runde der Polysomen-Darstellung ohne Zugabe von Milch analysierten wir den Pool der Bindungsmoleküle für die Bindung an das GCN4(7P14P)-Peptid durch einen RIA-Test (unter Verwendung von 2% Milch) und fanden heraus, dass der Pool bindet und nahezu vollständig durch 1 μM Peptid gehemmt werden kann. Keine Hemmung wurde sowohl für hag-Peptid als auch für Fluorescein beobachtet (5A). Jedoch zeigte die Analyse von einzelnen Clonen aus dem Pool durch den ELISA-Test (unter Verwendung von 2% Milch), dass von 24 Clonen nur 3 GCN4(7P14P)-Peptid banden und durch es gehemmt werden konnten (positive Clone). Die anderen 21 Clone banden das Zielpeptid nicht und waren wahrscheinlich unspezifisch an die Oberfläche gebunden. Weitere 2 Runden der Polysomen-Darstellung erhöhten das RIA-Signal des Pools nicht, was darauf hin deutet, dass es keine weitere Anreicherung der Bindemoleküle gab. Weil wir keine Milch während der Affinitätsselektion von Polysomen-Komplexen verwendet hatten und es aus Experimenten zur Phagen-Darstellung bekannt ist, dass Milch unspezifische Bindungen von Phagen an Oberflächen vermindert, wiederholten wir sowohl RIA-Tests der Pools als auch ELISA-Tests von einzelnen Clonen in Abwesenheit von Milch. Der RIA-Test des Pools in Abwesenheit einer Milch ergab, dass der Pool auch unspezifische Bindemoleküle enthielt (5B). Die Analyse von einzelnen Clonen zeigte, dass die Bindungseigenschaften der drei positiven Clone während des ELISA-Tests nicht durch die Anwesenheit von 2% Milch beeinflusst wurden, jedoch banden unspezifische Bindemoleküle in Abwesenheit von Milch an die Oberfläche, banden aber nicht in Anwesenheit von 2% Milch.
Die Affinitätsselektion wurde mit Zugabe von 2% Milch wiederholt. Nach der 3. Runde analysierten wir den Pool wiederum durch RIA-Test auf Bindung an das GCN4(7P14P)-Peptid. In diesem Fall ergab der Pool etwa viermal mehr gebundenes Protein als der Pool, der ohne Milch erhalten worden war, und wurde nahezu vollständig durch 1 μM Peptid gehemmt (5C). Die Analyse von einzelnen Clonen aus diesem Pool durch den ELISA-Test ergab, dass nahezu 75% der Clone positiv waren.
Tabelle 1: Mutationen in scFvhag-Fragmenten, die durch Ribosomen-Darstellung in vitro selektiert wurden.
Mutationen im scFv des Antikörpers 17/9 (Schulze-Gahmen, U., Rini, J. M. & Wilson, I. A. (1993) J. Mol. Biol. 234, 1098–1118) sind nach Kabat, E. A., Wu, T. I., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interesf, Bd. I. (US Department of Health and Human Services, 5. Aufl.), S. 151 und 464, in den variablen Domänen und sequentiell im Linker nummeriert. Die Clone sind nach ihrem relativen RIA-Signal geordnet. Die Wildtyp-Clone 2 und 6 sind durch ein Sternchen gekennzeichnet. Die RIA-Tests wurden auf die gleiche Menge an Protein in voller Länge normiert und durch 0,1 mM hag-Peptid (als +hag gekennzeichnet) gehemmt, um Bindungsspezifität zu bestätigen.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein (Poly)Peptid codiert, das mit einem Zielmolekül wechselwirkt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Translation einer Population von mRNA-Molekülen ohne Stop-Codons im korrekten Leserahmen in einem prokaryontischen in vitro-Translationssystem, wobei das Translationssystem entweder Antisense-Oligonucleotide umfasst, die komplementär zu der Tag-codierenden Sequenz aus ssrA-RNA sind, oder frei von ssrA-RNA ist, unter Bedingungen, die eine Bildung von Polysomen zulassen; (b) Inkontaktbringen der so gebildeten Polysomen mit den Zielmolekülen unter Bedingungen, die die Wechselwirkung der (Poly)Peptide, die von den mRNA Molekülen codiert und durch die Polysomen dargestellt werden, mit den Zielmolekülen zulassen; (c) Abtrennen der Polysomen, die (Poly)Peptide darstellen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken, von Polysomen, die keine solchen (Poly)Peptide darstellen; und (d) Identifizieren des Nucleinsäuremoleküls, das ein (Poly)Peptid codiert, das in einem Polysom, das mit den Zielmolekülen wechselwirkt, dargestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mRNA-Moleküle eine Stammschleife an ihrem 3'-Ende umfassen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Spacer, der bevorzugt 57 bis 116 Aminosäuren codiert, an den Leserahmen des (Poly)Peptids fusioniert ist, um das entstehende, gefaltete (Poly)Peptid an den putativen (Poly)Peptidkanal des Ribosoms anzubinden.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Stammschleife am 3'-Ende des mRNA-Moleküls den Spacer codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mRNA-Moleküle eine Stammschleifen-Struktur an ihrem 5'-Ende umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das in vitro-Translationssystem durch Ribonuclease-Inhibitoren ergänzt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Ribonuclease-Inhibitoren Übergangszustand-Analoga sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Übergangszustand-Analoga Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Polysomen in den Schritten (a) bis (c) stabilisiert werden durch (a) Hinzufügen von Magnesiumsalz, bevorzugt Magnesiumacetat, nach der Bildung der Polysomen; und/oder (b) ein Mittel, das eine Brücke zwischen der mRNA und dem korrespondierenden (Poly)Peptid bildet; und/oder (c) eine niedrige Temperatur nach der Translation und/oder während des Screening-Prozesses.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt (d) umfasst (da) reverse Transkription der mRNA; (db) fakultative Amplifikation der entstehenden cDNA; (dc) fakultatives Clonieren der fakultativ amplifizierten cDNA; und (dd) Bestimmen der Sequenz der cDNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei, vor dem Schritt (a) DNA in mRNA in Gegenwart eines Reduktionsmittels transkribiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Reduktionsmittel vor dem Schritt (a) entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die (Poly)Peptide Domänen der Immunglobulin-Superfamilie und bevorzugt der Immunglobulin-Familie umfassen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die (Poly)Peptide Einzelketten-Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Translationssystem mit wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteindisulfidisomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, E. coli-Dsb A und molekularen Chaperonen ergänzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei unspezifische Wechselwirkungen zwischen den Polysomen und/oder den Polysomen und den Zielmolekülen und oder, gegebenenfalls, den Polysomen und der Matrix, an welcher die Zielmoleküle immobilisiert sind, die während des Schrittes des Inkontaktbringens der Polysomen mit den Zielmolekülen ausgebildet wurden, durch Zugabe einer blockierenden Verbindung inhibiert oder reduziert werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die blockierende Verbindung Heparin oder sterilisierte Milch ist.
Kit, umfassend (a) Antisense-Oligonucleotide, die komplementär zu der Tag-codierenden Sequenz der ssrA-RNA sind; und mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Liste (b) Vektor, der geeignet ist für die Clonierung von Nucleinsäuren, die zu screenende (Poly)Peptide codieren; (c) Ribonuclease-Inhibitoren, bevorzugt Übergangszustand-Analoga und am meisten bevorzugt Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe; (d) mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteindisulfidisomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, E. coli-Dsb A und molekularen Chaperonen; und (e) Oligonucleotiden, die 5'- oder 3'-Stammschleifen, Ribosomenbindestellen, Spacer und/oder Terminatoren ohne Stop-Codons codieren.
Kit nach Anspruch 18 weiterhin umfassend (f) S-30 Translations-Extrakt; (g) PCR-Bestandteile; (h) Reverse Transkriptase; (i) RNA-Sequenzierungs-Kit; (j) DNA-Sequenzierungs-Kit entweder allein oder in Kombination.
Kit, umfassend (a) einen prokaryontischen, in vitro zellfreien Translations-Extrakt, der frei ist von ssrA-RNA; und mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Liste (b) Vektor, der geeignet ist zur Clonierung von Nucleinsäuren, die zu screenende (Poly)Peptide codieren; (c) Ribonuclease-Inhibitoren, bevorzugt Übergangszustand-Analoga und am meisten bevorzugt Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe; (d) mit mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteindisulfidisomerase, oxidiertem oder reduziertem Glutathion, E. coli-Dsb A und molekularen Chaperonen; und (e) Oligonucleotiden, die 5'- oder 3'-Stammschleifen, Ribosomenbindestellen, Spacer und/oder Terminatoren ohne Stop-Codons codieren.
Kit nach Anspruch 20, weiterhin umfassend (f) PCR-Bestandteile; (g) Reverse Transkriptase; (h) RNA-Sequenzierungs-Kit; (i) DNA-Sequenzierungs-Kit entweder allein oder in Kombination.