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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich teilweise auf einen neu entwickelten Assay
zum Diagnostizieren von Endometrium-Krebs, Endometriose und Endometrium-Fibromen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Endometrium-Krebs
tritt mit einer Rate von etwa 44.500 neuen Fällen pro Jahr mit etwa 10.000
Toten pro Jahr auf. Wenn frühzeitig
diagnostiziert und behandelt, wenn sich der Krebs noch abgegrenzt
im Endometrium befindet, kann in etwa 95% der Fälle durch Hysterektomie Heilung
erreicht werden. Abstriche können
Endometrium-Krebs zeigen, aber sind nur in 50% der Fälle wirksam.
Für den
Rest sind abnormale Vaginalblutungen typischerweise das erste klinische
Zeichen von Endometrium-Krebs. Es gibt einen großen Bedarf nach empfindlichen
Verfahren zum Nachweis von Organabgegrenztem Endometrium-Krebs.
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Steroidbindungsproteine,
einschließlich
Uteroglobin und CC10 sind eine Klasse von Proteinen, die Steroide
zusammen mit Methylsulfonylmetaboliten von polychlorierten Biphenylen
binden. Die exakte Funktion von Bestandteilen dieser Protein-Klasse
ist unbestimmt, aber von Uteroglobin wurde gezeigt, dass es PLA2-vermittelte Reaktionen inhibiert. Das Gen
und Genprodukt der vorliegenden Erfindung zeigt Homologie zu Uteroglobin
und CC10, zeigt erhöhte
Expression von mRNA in endometrialen Krebsproben und wird in Säugetiergewebe
exprimiert. Dieses genkodierte Produkt wird als Endometrium-Steroidbindungsprotein
II (ESBPII) bezeichnet und dessen Polypeptid- und Polynucleotid-Sequenzen
sind jeweils in Tabelle 1 und 2 angegeben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Zu
diesem Zweck und anderen ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
ein neues Verfahren zum Diagnostizieren von Endometrium-Krebs, Endometriose
und Endometrium-Fibromen bereitzustellen.
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Entsprechend
noch eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung werden ESBPII-Antagonisten (Inhibitoren)
bereitgestellt. Unter den bevorzugten Antagonisten gibt es jene,
die ESBPII imitieren, um ESBPII-Bindungsmoleküle zu binden, aber keine ESBPII-induzierte
Reaktion oder mehr als eine ESBPII-induzierte Reaktion auszulösen. Auch
unter den bevorzugten Antagonisten gibt es Moleküle, die an ESBPII binden oder
mit diesem wechselwirken, um einen Effekt von ESBPII oder mehr als
einen Effekt von ESBPII zu inhibieren oder die Expression von ESBPII
zu verhindern.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer therapeutisch
wirksamen Menge eines Endometrium-Steroidbindungsproteins II (ESBPII)-Antagonisten
bei Herstel lung eines Arzneimittels zur Behandlung von Endometrium-Krebs,
Endometriose oder Endometrium-Fibromen
bereitgestellt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von
ESBPII oder einem Fragment oder einer Variante hiervon zur Herstellung
eines Arzneimittels zum Schutz gegen Endometrium-Krebs, Brustkrebs,
Endometriose oder Endometrium-Fibromen durch Auslösen einer
immunologischen Reaktion bereitgestellt.
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Nach
noch einem weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung
eines rekombinanten ESBPII-Gens oder dieses kodierendes Proteins
bereitgestellt, umfassend DNA, die ein Antigen des ESBPII-Gens oder
ein dieses kodierendes Protein kodiert und exprimiert, zur Herstellung
eines Arzneimittels zum Schutz gegen Endometrium-Krebs, Endometriose
oder Endometrium-Fibromen durch Induzieren einer immunologischen
Reaktion.
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Bevorzugt
wird das ESBPII oder ein Fragment hiervon mit einem Coprotein fusioniert,
worin das Coprotein an sich keine Antikörper erzeugt, aber in der Lage
ist, das erste Protein zu stabilisieren und ein fusioniertes Protein
zu erzeugen, das immunogene und schützende Eigenschaften aufweist.
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Weiterhin
bevorzugt ist das Coprotein Glutathion-S-Transferase- oder β-Galactosidase.
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Nach
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches
Verfahren bereitgestellt, das für
Endometrium-Krebs, Endometriose oder Endometrium-Fibromen eine Indikation
liefert, wobei das Verfahren umfasst: Analysieren einer Probe von
Zellen, Gewebe oder Körperflüssigkeiten
auf abnormal hohe Pegel von ESBPII.
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Bevorzugt
umfasst das Verfahren die Verwendung von ELISA und/oder Immunhistochemie.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches
Verfahren bereitgestellt, das eine Indikation von Endometrium-Krebs,
Endometriose oder Endometrium-Fibromen
liefert, wobei das Verfahren umfasst: Analysieren einer Probe von
Zellen, Gewebe oder Körperflüssigkeiten
auf abnormal hohe oder niedrige Transkriptionslevels von ESBPII.
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Bevorzugt
umfasst das Verfahren eine Northem-Blot-Analyse, in situ Hybridisierung,
RT-PCR- und/oder
Rastererstellung.
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Andere
Gegenstände,
Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden
dem Fachmann im Stand der Technik aus der nachfolgenden Beschreibung
offensichtlich. Es ist jedoch verständlich, dass die nachfolgende
Beschreibung und die spezifischen Beispiele, während diese bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung angeben, nur als Veranschaulichungen gegeben werden.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf diagnostische Assays, sowohl
quantitativ als auch qualitativ zur Detektion von ESBPII-Protein-
oder ESBPII-mRNA-Levels in Zellen, Gewebe und Körperflüssigkeiten, einschließlich Bestimmung
von normalen und abnormalen Pegeln. Somit kann beispielsweise ein
erfindungsgemäßer diagnostischer
Assay zum Bestimmen der Überexpression
von ESBPII-Protein, verglichen mit normalen Kontroll-Körperflüssigkeiten
oder Gewebeproben, verwendet werden, um die Gegenwart von Endometrium-Krebs,
Endometriose oder Endometrium-Fibromen festzustellen. Assay-Techniken,
die verwendet werden können,
um die Levels der Genexpression, wie ESBPII der vorliegenden Erfindung,
in einer Probe, die von einem Wirt stammt, zu bestimmen, sind dem
Fachmann wohl bekannt. Derartige Assay-Verfahren umfassen Radioimmunoassays,
Umkehrtranskriptase-PCT(RT-PCR)-Assays, Rastererstellung, Immunhistochemieassays, in
situ-Hybridisierungsassays,
kompetitive Bindungsassays, Western-Blot-Analysen und ELISA-Assays.
Von diesen sind ELISAs häufig
bevorzugt, um ein Gen-exprimiertes Protein in biologischen Flüssigkeiten
zu bestimmen. Ein ELISA-Assay umfasst anfänglich die Herstellung eines
Antikörpers,
wenn nicht ohne weiteres aus einer kommerziellen Quelle erhältlich,
spezifisch für
ESBPII, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. Zusätzlich wird im allgemeinen
ein Reporter-Antikörper
hergestellt, der speziell an ESBPII bindet. Der Reporter-Antikörper wird
mit einem detektierbaren Reagenz verknüpft, wie einem radioaktiven,
fluoreszierenden oder enzymatischen Reagenz, beispielsweise Meerrettich-Peroxidase-Enzym
oder alkalische Phosphatase.
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Um
ELISA auszuführen,
wird ein für
ESBPII spezifischer Antikörper,
der den Antikörper
bindet, auf einen festen Träger
inkubiert, z.B. einer Polystyrol-Platte. Jede freie Protein-Bindungsstelle
auf der Platte wird dann durch Inkubieren mit einem nicht-spezifischen
Protein, wie Rinderserum albumin, bedeckt. Als nächstes wird die zu analysierende
Probe auf der Platte inkubiert, währenddessen ESBPII an den auf
der Polystyrol-Platte haftenden spezifischen Antikörper bindet.
Ungebundene Probe wird mit Puffer ausgewaschen. Ein speziell auf
ESBPII gerichteter Reporter-Antikörper, der an Meerrettich-Peroxidase
gebunden ist, wird auf die Platte aufgebracht, was im Binden des
Reporter-Antikörpers an
jeglichen monoklonalen Antikörper,
der an ESBPII gebunden ist, resultiert. Nicht-anhaftender Reporter-Antikörper wird
dann ausgewaschen. Reagenzien auf Peroxidase-Aktivität, einschließlich eines
kolorimetrischen Substrats werden dann zur Platte zugegeben. Immobilisierte
Peroxidase, gebunden an ESBPII-Antikörper, erzeugt ein farbiges
Reaktionsprodukt. Die Menge der entwickelten Farbe in einer vorgegebenen
Zeitdauer ist proportional zur Menge an in der Probe vorhandenem
ESBPII-Protein. Die quantitativen Ergebnisse werden typischerweise
durch Vergleich mit einer Standardkurve erhalten. Ohne Begrenzung
der vorliegenden Erfindung ist typischerweise für einen quantitativen diagnostischen
Assay ein positives Ergebnis, das die Krankheit anzeigt, eines,
in dem die Blutpegel höher
sind als die dreifache Standardabweichung oberhalb des mittleren
Blutwerts für
eine normale gesunde Population von Individuen (99,86% der Population).
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Ein
kompetitiver Assay kann eingesetzt werden, wo für ESBPII-spezifische Antikörper, anhaftend
an einem festen Träger,
und markiertes ESBPII und eine vom Wirt stammende Probe über den
festen Träger
gegeben werden, und die Menge an bestimmter Markierung, die am festen
Träger
anhaftet, kann mit einer Menge ESBPII in der Probe korreliert werden.
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Nulceinsäure-Verfahren
können
verwendet werden, um ESBPII-mRNA als Marker für abnormales Zellwachstum bei
Endometrium-Krebs, Endometriose und Endometrium-Fibromen zu bestimmen.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere Nucleinsäure-Verfahren,
wie Ligase-Kettenreaktion
(LCR) und Nucleinsäure-Sequenz-basierte
Amplifikation (NASABA), kann verwendet werden, um bösartige
Zellen für
Diagnose und Überwachung
verschiedener bösartiger
Tumore fest zustellen. Beispielsweise ist Umkehr-Transkriptase PCR
(RT-PCR) eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden kann,
um die Gegenwart einer spezifischen mRNA-Population in einer komplexen
Mischung von Tausenden von anderen mRNA-Spezies zu bestimmen. In
RT-PCR werden mRNA-Spezies
zunächst
zu komplementärer
DNA (cDNA) unter Verwendung eines Umkehr-Transkriptase-Enzyms umkehrtranskribiert;
die cDNA wird dann wie in einer Standard-PCR-Reaktion amplifiziert.
RT-PCR kann somit durch Amplifikation die Gegenwart einer einzelnen
Spezies von mRNA zeigen. Wenn demgemäß mRNA für die Zelle, die es produziert,
hochgradig spezifisch ist, kann RT-PCR verwendet werden, um die
Gegenwart eines spezifischen Zell-Typs zu identifizieren.
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Hybridisierung
von auf einem Raster angeordneten Klonen kann verwendet werden,
um sowohl die Expression als auch den Expressionslevel des Gens
zu bestimmen (Rastererstellung). In diesem Ansatz wird eine das
ESBPII-Gen kodierende cDNA auf einem Substrat fixiert. Das Substrat
kann irgendein geeigneter Typ, einschließlich, aber nicht begrenzt
auf Glas, Nitrocellulose, Nylon oder Kunststoff sein. Die den ESBPII-Klon
kodierende DNA wird am Substrat befestigt und dann mit dem Analyt
inkubiert, der RNA oder eine komplementäre DNA (cDNA)-Kopie der RNA
sein kann, isoliert vom interessierenden Gewebe. Hybridisierung zwischen
dem an das Substrat gebundenen Klon und dem Analyt können festgestellt
und quantifiziert werden durch mehrere Mittel, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf radioaktive Markierung oder Fluoreszenz-Markierung des Analyten
oder ein Sekundär-Molekül, gestaltet,
um den Hybrid zu bestimmen. Die Quantifizierung des Genexpressions-Levels kann durch
Vergleich der Intensität
des Signals des Analyten, verglichen mit demjenigen, bestimmt aus
verschiedenen Standards, durchgeführt werden. Die Standards können erhalten
werden durch in-vitro-Transkription des Ziel-Gens, Quantifizieren
der Ausbeute und dann Verwendung des Materials, um eine Standardkurve
zu erzeugen.
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Die
obigen Tests können
an Proben, die von Patienten-Körperflüssigkeiten
und -Gewebe-extrakten (Homogenaten oder gelöstem Gewebe), wie aus Blut,
Urin, Speichel, Gewebebiopsie und Autopsie-Material, stammen, durchgeführt werden.
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ESBPII-Bindungsmoleküle und -Assays
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ESBPII
könnte
verwendet werden, um Proteine zu isolieren, die mit diesem wechselwirken,
und diese Wechselwirkung könnte
ein Ziel für
Interferenz sein. Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen
zwischen ESBPII und anderen Faktoren könnten zur Entwicklung von pharmazeutischen
Mitteln für
die Modulation der ESBPII-Aktivität führen. Wie hier verwendet, bezieht
sich der Begriff "modulieren' auf Beeinflussung
der ESBPII-Funktion.
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Proteine
kodierende Gene zum Binden von Molekülen an ESBPII können durch
zahlreiche, dem Fachmann im Stand der Technik bekannte Verfahren
identifiziert werden, beispielsweise Liganden-Panning und FACS-Sortieren.
Derartige Verfahren sind in vielen Labor-Journalen beschrieben,
wie beispielsweise Coligan et al., Currettt Protocols in Immunology
1 (Rivett, A. J. Biochem. J., 291: 1–10 (1993)): Kapitel 5 (1991).
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Beispielsweise
liefert das Zwei-Hybrid-Hefe-System Verfahren zum Bestimmen der
Wechselwirkung zwischen einem ersten Test-Protein und einem zweiten
Test-Protein in vivo unter Verwendung einer Rekonstitution der Aktivität eines
transkriptionalen Aktivators. Das Verfahren ist im US-Patent Nr. 5 283
173 offenbart; Reagenzien sind von Clontech und Stratagene erhältlich.
Kurz gesagt wird ESBPII-cDNA mit einem Ga14-Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsbereich
fusioniert und in Hefezellen exprimiert. cDNA-Bibliotheks-Mitglieder,
erhalten aus interessierenden Zellen, werden mit einem transaktivierenden
Bereich von Gal4 fusioniert. cDNA-Klone, die Proteine exprimieren,
die mit ESBPII wechselwirken, führen
zur Rekonstitution der Gal4-Aktivität und Transaktivation der Expression
eines Reporter-Gens, wie Gal1-lacZ.
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Ein
alternatives Verfahren ist Screenen auf λgt1l-λZAP (Stratagene) oder äquivalente
cDNA-Expressions-Bibliotheken
mit rekombinantem ESBPII. Rekombinantes ESBPII-Protein oder Fragmente
hiervon werden mit kleinen Peptid-Anhängen, wie FLAG, HSV oder GST,
fusioniert. Die Peptid-Anhänge können übliche Phosphorylierungsstelien
für eine
Kinase, wie eine Herzmuskel-Kreatin-Kinase, besitzen oder sie können biotinyliert
sein. Rekombinantes ESBPII kann mit 32[P]
phosphoryliert sein oder unmarkiert verwendet werden und mit Streptavidin
oder Antikörpern
gegen die Anhänge
bestimmt werden. λgt11-cDNA-Expressions-Bibliotheken können aus
interessierenden Zellen hergestellt werden und werden mit dem rekombinanten
ESBPII inkubiert, gewaschen und cDNA-Klone isoliert, die mit ESBPII wechselwirken,
siehe z.B. Maniatis et al., oben.
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Ein
weiteres Verfahren ist das Screenen einer Säugetier-Expressions-Bibliothek,
in der die cDNA in einen Vektor zwischen einem Säugetier-Promotor und Polyadenylierungsstelle
kloniert sind, vorübergehend
in COS- oder 293-Zellen transfektiert, gefolgt von der Detektion
des Bindungsproteins 48 Stunden später durch Inkubation von festgehaltenen
und gewaschenen Zellen mit einem markierten ESBPII, bevorzugt iodiert,
und Bestimmung von gebundenem ESBPII durch Autoradiographie. Siehe
Sims et al., Science 241: 585–589 (1988),
und McMahan et al., EMBO J., 10: 2821–2832 (1991). In dieser Art
und Weise werden Pools von cDNA, enthaltend die cDNA, die das interessierende
Bindungsprotein kodiert, ausgewählt,
und die interessierende cDNA kann isoliert werden durch weitere
Aufteilung jeden Pools, gefolgt von Zyklen vorübergehender Transfektion, Binden
und Autoradiographie. Alternativ kann die interessierende cDNA isoliert
werden durch Transfektion der gesamten cDNA-Bibliothek in Säugetierzellen
und Bringen (panning) der Zellen auf einer Schale, die an die Platte
gebundenes ESBPII enthält.
Zellen, die nach dem Waschen noch anhaften, werden lysiert, und
die Plasmid-DNA isoliert, in Bakterien amplifiziert, und der Zyklus
von Transfektion und Aufbringung (panning) wiederholt, bis ein einzelner
cDNA-Klon erhalten wird. Siehe Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84: 3365 (1987), und Aruffo et al., EMBO J., 6: 3313 (1987).
Wenn das Bindungsprotein sekretiert wird, kann dessen cDNA erhalten
werden durch einfache Pool-Strategie, wenn einmal ein Bindungs-
oder Neutralisierungs-Assay zum Testen von Überstand von vorübergehend
transfektierten Zellen aufgebaut wurde. Allgemeine Verfahren zum
Screening von Überständen sind
offenbart in Wong et al., Science, 228: 810–815 (1985).
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Ein
weiteres alternatives Verfahren ist die Isolierung von Proteinen,
die mit ESBPII direkt aus Zellen wechselwirken. Fusionsproteine
von ESBPII mit GST oder kleinen Peptid-Anhängen werden hergestellt und auf
Kugeln immobilisiert. Biosynthetisch markierte oder unmarkierte
Protein-Extrakte aus den interessierenden Zellen werden hergestellt,
mit den Kugeln inkubiert und mit Puffer gewaschen. Die mit ESBPII
wechselwirkenden Proteine werden spezifisch von den Kugeln eluiert
und durch SDS-PAGE analysiert. Primäre Aminosäure-Sequenz-Daten der Bindungspartner
werden durch Mikrosequenzieren erhalten. Optional können die
Zellen mit Mitteln behandelt werden, die eine funktionelle Reaktion
induzieren, wie Tyrosinphosphorylierung von Zellproteinen. Ein Beispiel
eines derartigen Agens wäre
ein Wachstumsfaktor oder Cytokin, wie Interleukin-2.
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Ein
weiteres alternatives Verfahren ist eine Immunoaffinitäts-Reinigung.
Rekombinantes ESBPII wird mit markierten oder unmarkierten Zellextrakten
inkubiert und mit Anti-ESBPII-Antikörpern immun-abgeschieden.
Der Immun-Niederschlag wird mit Protein A-Sepharose gewonnen und
mit SDS-PAGE analysiert. Unmarkierte Proteine werden mit Biotinylierung
markiert und auf SDS-Gelen mit Streptavidin bestimmt. Bindungspartner-Proteine
werden durch Mikrosequenzieren analysiert. Weiterhin können biochemische
Reinigungsschritte, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt
sind, vor dem Mikrosequenzieren verwendet werden.
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Noch
ein weiteres alternatives Verfahren ist das Screening von Peptid-Bibliotheken
nach Bindungspartnern. Rekombinant angehängt oder markiertes ESBPII
wird verwendet, um Peptide, die mit ESBPII wechselwirken, aus einem
Peptid oder einer Phosphopeptid-Biobliothek auszuwählen. Sequenzieren
der Peptide führt
zur Identifikation von übereinstimmenden
Peptid-Sequenzen, die in wechselwirkenden Proteinen gefunden werden
können.
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Durch
irgendeines dieser Verfahren oder andere Verfahren identifizierte
ESBPII-Bindungspartner, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt
wären,
genauso wie oben diskutierte vermeintliche Bindungspartner, können in
Assay-Verfahren verwendet werden.
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Das
Testen auf die Gegenwart eines ESBPII/Bindungspartner-Komplexes
wird vervollständigt
durch beispielsweise das Zwei-Hybrid-Hefe-System, ELISA oder Immunoassays,
unter Verwendung von für
den Komplex spezifischen Antikörpern.
In Gegenwart von Testsubstanzen, die die Bildung einer ESBPII/Bindungspartner-Wechselwirkung
unterbrechen oder inhibieren, wird die abnehmende Komplexmenge relativ
zu einer Kontrolle, der die Testsubstanz fehlt, bestimmt.
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Assays
für freies
ESBPII oder einen Bindungspartner werden vervollständigt durch
beispielsweise ELISA oder Immunoassays unter Verwendung spezifischer
Antikörper
oder durch Inkubierung von radiomarkiertem ESBPII mit Zellen oder
Zellmembranen, gefolgt von Zentrifugieren oder Filterseparationsschritten.
In Gegenwart von Testsubstanzen, die die Bildung einer ESBPII/Bindungspartner-Wechselwirkung
unterbrechen oder inhibieren, wird eine erhöhte Menge an freiem ESBPII
oder freiem Bindungspartner relativ zu einer Kontrolle, der die
Testsubstanz fehlt, festgestellt.
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Polypeptide,
wie oben identifiziert, können
verwendet werden, um ESBPII-Bindungskapazität von ESBPII-Bindungsmolekülen in Zellen
oder in zellfreien Präparationen
zu bestimmen.
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Agonisten
und Antagonisten – Assays
und Moleküle
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Das
ESBPII kann in einem Verfahren zum Screening von Verbindungen verwendet
werden, die die Aktivität
von ESBPII inhibieren, fördern
oder modulieren.
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Beispiele
von potentiellen ESBPII-Antagonisten sind kleine Moleküle, wie
organische Moleküle
oder Peptide, Antikörper
oder in einigen Fällen
ein Oligonucleotid, das an ESBPII bindet und Aktivität verhindert.
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Potentielle
Antagonisten umfassen ebenfalls kleine Moleküle oder Proteine, die mit den
Bindungsmolekülen
des ESBPII eng verwandt sind, z.B. einem Fragment der Bindungsmoleküle, die
die biologische Funktion verloren haben, und wenn diese an das ESBPII-Polypeptid
binden, dessen Aktivität
inhibieren. "Bindungsmoleküle", wie hier verwendet,
bezieht sich auf Moleküle,
die spezifisch an ESBPII-Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden
oder mit diesem wechselwirken. Enthalten in der Definition der Bindungsmoleküle sind andere
Faktoren, Co-Faktoren, Einheiten oder Subeinheiten, die die ESBPII-Aktivität erhöhen oder
herabsetzen. Bindungsmoleküle
können
ebenfalls nicht natürlich
auftreten, wie Antikörper
und Antikörper-abgeleitete Reagenzien,
die speziell an ESBPII binden.
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Ein
potentieller Antagonist umfasst ebenfalls ein Antisense-Konstrukt,
hergestellt durch die Verwendung von Antisense-Technologie. Antisense-Technologie
kann verwendet werden, um die Genexpression durch Dreifach-Helix-Bildung
oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Verfahren
auf einem Binden eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren.
Beispielsweise wird ein 5'-kodierender
Bereich der Polynucleotid-Sequenz, der das voll entwickelte ESBPII
kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa
10 bis 40 Basenpaaren Länge
zu entwickeln. Ein DNA-Oligonucleotid wird entwickelt, um zu einem
Bereich des in die Transkription einbezogenen Gens komplementär zu sein
(Dreifach-Helix, siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979);
Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science,
251: 1360 (1991)), wodurch eine Transkription und die Erzeugung
von ESBPII-Polypeptid verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert
an die mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das
ESBPII-Polypeptid (Antisense, Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,
CRC, Press, Boca Raton, FL (1988)). Die oben beschriebenen Oligonucleotide
können
ebenfalls an Zellen derart freigesetzt werden, dass die Antisense-RNA
oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Erzeugung des ESBPII-Polypeptids
zu inhibieren. Enthalten in dieser Freisetzung ist die Gentherapie.
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Ein
weiterer potentieller Antagonist ist ein kleines Molekül, das an
das ESBPII bindet, indem es dieses für Bindungsmoleküle (z.B.
Substrate) unzugänglich
macht, derart, dass normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele
von kleinen Molekülen
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf kleine Peptide oder Peptid-ähnliche
Moleküle
und organische Verbindungen. Inhibitorverbindungen (Antagonisten),
wie zuvor beschrieben, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger
in einer Menge, die wirksam ist, um ESBPII-Aktivität direkt
oder durch Blockieren der Bindung von Bindungsmolekülen an ESBPII-Polypeptid
zu inhibieren, können
einem Subjekt verabreicht werden, um einen abnormalen Zustand in
Zusammenhang mit einem Überschuss
an ESBPII-Aktivität,
nämlich
Endometrium- und Brustkrebs, Endometriose und Endometrium-Fibromen
zu behandeln.
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Zusammensetzungen und
Kits
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Die
Verbindungen, die derartiges ESBPII inhibieren, können in
Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet
werden. Derartige Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame
Menge des Polypeptids oder der Verbindung und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
oder Wirkstoff. Ein derartiger Träger umfasst, aber ist nicht
beschränkt
auf Salzlösung,
gepufferte Salzlösung,
Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen hiervon. Die
Formulierung sollte der Verabreichungsform entsprechend sein.
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Verabreichung
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Polypeptide
und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein
oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie therapeutischen
Verbindungen, verwendet werden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder wirksamen, passenden
Art und Weise verabreicht werden, einschließlich beispielsweise Verabreichung
durch die Haut, oral, anal, vaginal, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan,
intranasal oder intradermal unter anderem.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einer
Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine spezifische Indikation
oder Indikationen zu behandeln oder vorzubeugen. Im allgemeinen werden
die Zusammensetzungen in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht
verabreicht. In den meisten Fällen
werden sie in einer Menge nicht über
etwa 8 mg/kg Körpergewicht
pro Tag verabreicht. Bevorzugt liegt die Dosis in den meisten Fällen bei
etwa 10 μg/kg
bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht
täglich.
Es ist empfohlen, dass die optimale Dosierung durch Standardverfahren
für jede
Behandlungsmodalität
und Indikation bestimmt wird unter Berücksichtigung der Indikation,
deren Schwere, Verabreichungsweg, Komplikationsbedingungen und dergleichen.
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Vakzin
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Eine
immunologische Reaktion kann in einem Tier erzeugt werden, insbesondere
einem Säugetier, durch
Impfen des Tiers mit ESBPII oder einem Fragment oder einer Variante
hiervon, die geeignet ist, um Antikörper zu erzeugen, um das Tier
von Krankheiten, abnormalem Zellwuchses, wie Endometrium- und Brustkrebs,
Endometriose und Endometrium-Fibromen, zu schützen. Eine immunologische Antwort
kann in einem Tier durch Gentherapie, durch Freisetzen von ESBPII-kodierendem
Gen oder einem Fragment oder einer Variante hiervon erzeugt werden,
um ESBPII oder ein Fragment oder eine Variante hiervon in vivo zu
exprimieren, um eine immunologische Reaktion zu induzieren, um Antikörper zu
erzeugen und das Tier vor der Krankheit zu schützen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine immunologische
Zusammensetzung, die, wenn in ein Tier eingebracht, insbesondere
einem Säugetier-Wirt,
eine immunologische Reaktion in dem Tier für ein vorgegebenes ESBPII-Gen
oder dieses kodierendes Protein erzeugt, worin die Zusammensetzung
ein rekombinantes ESBPII-Gen oder ein hierfür kodierendes Protein umfasst,
umfassend DNA, die ein Antigen des ESBPII-Gens oder ein hierfür kodierendes
Protein kodiert und exprimiert.
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Das
ESBPII oder ein Fragment hiervon können mit einem Coprotein fusioniert
werden, das nicht an sich Antikörper
erzeugen kann, aber in der Lage ist, das erste Protein zu stabilisieren,
und ein fusioniertes Protein erzeugt, das immunogene und schützende Eigenschaften
aufweist. Ein derart fusioniertes rekombinantes Protein umfasst
ferner bevorzugt ein antigenes Coprotein, wie Glutathion-S-Transferase (GST)
oder β-Galactosidase,
relativ große
Coproteine, die das Protein löslich
machen und die Erzeugung und Reinigung hiervon vereinfachen. Darüber hinaus
kann das Coprotein als Hilfsstoff agieren im Sinne der Bereitstellung
einer allgemeinen Stimulation des Immunsystems. Das Coprotein kann
entweder an das Amino- oder Carboxy-Ende des ersten Proteins binden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls eine Vakzin-Formulierung,
die das immunogene rekombinante Protein zusammen mit einem geeigneten
Träger
umfasst. Da das Protein im Magen aufgebrochen werden kann, wird
es bevorzugt parenteral verabreicht (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser, intradermaler
etc. Injektion). Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung
geeignet sind, umfassen wässerige
und nicht-wässerige
sterile Injektionslösungen,
die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Lösungsmittel
enthalten können,
die die Formulierung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen; und wässerige
und nicht-wässerige
sterile Suspensionen, die suspendierende Mittel oder verdickende
Mittel enthalten können.
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Die
Formulierungen können
in Einzeldosis- oder Multi-Dosis-Behältern, beispielsweise versiegelten Ampullen
und Phiolen, vorliegen und können
in gefriergetrocknetem Zustand gelagert werden, die nur die Zugabe
des sterilen flüssigen
Trägers
unmittelbar vor dem Gebrauch erfordern. Die Vakzin-Formulierung
kann ebenfalls Hilfssysteme enthalten, um die Immunogenität der Formulierung
zu erhöhen,
wie Öl-in-Wasser-Systeme
und andere im Stand der Technik bekannte Systeme. Die Dosierung
hängt von
der spezifischen Aktivität des
Vakzins ab und kann ohne weiteres durch routinemäßiges Experimentieren bestimmt
werden.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter
beschrieben. Die Beispiele sind nur zur Veranschaulichung der Erfindung
anhand spezifischer Ausführungsformen
bereitgestellt. Diese erläuternden
Beispiele stellen keine Begrenzungen oder Umschreibungen des Schutzumfangs
der offenbarten Erfindung dar, sondern veranschaulichen bestimmte
spezifische Aspekte der Erfindung.
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Alle
Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die
dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sind und Routine darstellen,
außer,
wo dies im Detail anders beschrieben wird. Routinemäßige molekularbiologische
Techniken der nachfolgenden Beispiele können durchgeführt werden, wie
beschrieben in den Standard-Labor-Journalen, wie Sambrook et al.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe; Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), hier bezeichnet
als "Sambrook".
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Alle
Teile oder Mengen, die in den nachfolgenden Beispielen angegeben
sind, sind auf das Gewicht bezogen, außer dies wird anders angegeben.
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Wenn
nicht anders angegeben, wird die Größenseparation von Fragmenten
in den nachfolgenden Beispielen durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken
mit Agarose und Polyacrylamid-Gelelektrophorese ("PAGE") in Sambrook und
zahlreichen anderen Referenzen, wie beispielsweise von Goeddel et
al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
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Beispiel 1
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Um
den Pegel an ESBPII in normalem und endometrialem Tumorgewebe zu
beurteilen, wurde mRNA aus zwei endometrialen Tumoren und passendem
normalen Gewebe extrahiert. Daraufhin wurde durch Umkehr-Transkriptase
ein Strang cDNA hergestellt, und die Polymerase-Kettenreaktion wurde
unter Verwendung von für
ESPBII-spezifischen Primern durchgeführt. Die Ergebnisse wurden
unter Verwendung derselben Menge an Ausgangs-cDNA in jeder Probe
normalisiert. Wenn die resultierenden Produkte durch Gelelektrophorese,
gefolgt von Ethidiumbromid-Bestimmung analysiert wurden, wurde von
ESBPII festgestellt, dass es im endometrialen Tumorgewebe in endometrialen
Tumoren mindestens fünfmal
stärker
exprimiert wurde, verglichen mit normalem angrenzenden Gewebe.
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Beispiel 2
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Um
die Gewebeverteilung der ESBPII-Expression zu bestimmen, wurden
mRNA und cDNA aus einer Vielzahl von Geweben hergestellt, und die
Polymerase-Kettenreaktion wurde unter Verwendung der ESBPII-Primer
durchgeführt.
Die Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:
| Endometrium | + |
| Endometrium-Krebs | +++++ |
| Brust | ++ |
| Prostata | Nicht
aufgetreten |
| Darm | Nicht
aufgetreten |
| Darmkrebs | Nicht
aufgetreten |
| Lunge | Nicht
aufgetreten |
| Lungenkrebs | Nicht
aufgetreten |
| Leber | Nicht
aufgetreten |
| Leberkrebs | Nicht
aufgetreten |
| Pankreas | Nicht
aufgetreten |
| Herz | Nicht
aufgetragen |
| Skelettmuskel | Nicht
aufgetreten |
| Periphere
Blutzellen | Nicht
aufgetreten |