DE69735112T2

DE69735112T2 - Verfahren zur Analyse und Vorrichtung

Info

Publication number: DE69735112T2
Application number: DE69735112T
Authority: DE
Inventors: Maryanne J. San Diego O'Donnell; Daniel P. Patton Little; Charles R. San Diego Cantor; Hubert KÖSTER
Original assignee: Sequenom Inc
Current assignee: Sequenom Inc
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: DE69727489D1; NO992169D0; DE69727489T2; CA2268740A1; DK0937096T3; JP3516146B2; CA2268740C; ATE316095T1; EP1457496B1; EP1460083A1; WO1998020020A2; WO1998020020A3; ES2215241T3; NO992169L; EP1457496A1; EP0937096B1; ATE259056T1; DE19782096T1; CA2702219A1; DE69735112D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Auf den Gebieten der Molekularbiologie und Biochemie ebenso wie bei der Diagnose von Erkrankungen ist die Nukleinsäurehybridisierung zu einem starken Werkzeug für den Nachweis, die Isolierung und Analyse von spezifischen Oligonukleotidsequenzen geworden. Normalerweise verwenden solche Hybridisierungsassays eine Oligodesoxynukleotidsonde, welche auf einem festen Träger immobilisiert wurde; wie beispielsweise im reversen Dot Blot-Verfahren (Saiki, R. K., Walsh, P.S., Levenson, C.H. und Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230). Kürzlich sind Arrays mit immobilisierten DNA-Sonden, welche an eine feste Oberfläche angeheftet sind, zur Sequenzierung mittels Hybridisierung (SBH, "sequencing by hybridization") entwickelt worden. (Drmanac, R., Labat, I., Bruckner, I., und Crkvenjakov, R. (1989) Genomics, 4, 114-128), Strezoska, Z., Pauneska, T., Radosavljevic, D., Labat, I., Drmanac, R., und Crkvenjakov, R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10089-10093). SBH verwendet einen geordneten Array von immobilisierten Oligodesoxynukleotiden auf einem festen Träger. Eine Probe mit unbekannter DNA wird auf den Array aufgetragen, und es wird das Hybridisierungsmuster beobachtet und analysiert, um gleichzeitig viele kurze Stücke an Sequenzinformation zu erzeugen. Eine verbesserte Version des SBH ist entwickelt worden, die als positionelle SBH (PSBH) bezeichnet wird, welche Doppelproben verwendet, die einzelsträngige 3'-Überhänge enthalten. (Broude, N.E., Sano, T., Smith, C.L., und Cantor, C.R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3072-3076). Es ist nun möglich, einen PSBH-Capture-Ansatz mit einer konventionellen Sanger-Sequenzierung zu kombinieren, um Sequenzierungsleitern zu erzeugen, welche beispielsweise mittels Gelelektrophorese nachweisbar sind (Fu, D., Broude, N.E., Köster, H., Smith, C.L. Und Cantor, C.R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10162-10166).
Für die in diesen Systemen verwendete Arrays gibt es eine Anzahl von Kriterien, welche für eine erfolgreiche Durchführung erfüllt sein müssen. Beispielsweise muss die immobilisierte DNA stabil sein und darf während der Hybridisierung, dem Waschen oder der Analyse nicht desorbieren. Die Dichte des immobilisierten Oligonukleotids muss für die folgenden Analysen ausreichend sein. Es muss eine minimale unspezifische Bindung der DNA an die Oberfläche vorliegen. Außerdem sollte das Immobilisierungsverfahren die Fähigkeit der immobilisierten Sonden nicht stören, zu Hybridisieren und Substrate für eine enzymatische Festphasensynthese zu sein. Für die Mehrzahl der Anwendungen ist es am besten, wenn nur ein Punkt der DNA immobilisiert ist, idealerweise ein Terminus.
In den letzten Jahren ist eine Anzahl von Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von DNA an feste Träger entwickelt worden, welche versuchen, alle der oben angeführten Kriterien zu erfüllen. Geeignet modifizierte DNA ist beispielsweise kovalent an flache Oberflächen angeheftet worden, welche mit Aminosäuren (Running, J.A., und Urdea, M.S. (1990) Biotechniques, 8, 276-277), (Newton, C.R., et al., (1993) Nucl. Acids. Res., 21, 1155-1162), (Nikiforov, T.T. und Rogers, Y.H. (1995) Anal. Biochem., 227, 201-209), Carboxylgruppen (Zhang, Y., et al., (1991) Nucl. Acids. Res., 19 3929-3922), Epoxygruppen (Lamture, J.B. et al., (1994) Nucl. Acids. Res., 22, 2121-2125), (Eggers, M.D. et al., (1994) BioTechniques, 17, 516-624) oder Aminogruppen (Rasmussen, S.R., et al., (1991) Anal. Biochem., 198, 138-142) funktionalisiert waren. Obwohl viele dieser Verfahren für deren entsprechende Anwendungen ziemlich erfolgreich waren, war die Dichte an gebundenem Oligonukleotid (maximal ungefähr 20 fmol DNA pro Quadratmillimeter Fläche) (Lamture, J.B., et al., (1994) Nucl. Acids. Res. 22, 2121-2125), (Eggers, M.D., et al., (1994) BioTechniques, 17, 516-524) viel geringer als die theoretische Packungsgrenze der DNA.
Deshalb wird ein Verfahren zum Erreichen von höheren Dichten der immobilisierten Nukleinsäuren auf einer Oberfläche benötigt. Insbesondere wird ein Verfahren zum Erreichen von höheren Dichten der an Oberflächen immobilisierten Nukleinsäuren benötigt, welches die Verwendung, Manipulation und weitere Reaktion der immobilisierten Nukleinsäuren ebenso wie eine Analyse der Reaktionen erlaubt.
Im Zusammenhang mit dem Bedarf an verbesserten Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäure beispielsweise in analytischen und diagnostischen Systemen, besteht der Bedarf, hochentwickelte Laborhilfsmittel zu entwickeln, welche das Untersuchen und die Analyse von biologischen Proben automatisieren und beschleunigen. An vorderster Front der aktuellen Bemühungen, bessere analytische Werkzeuge zu entwickeln, steht das Ziel, die Analyse von komplexen biochemischen Strukturen zu beschleunigen. Dies trifft besonders auf humane genomische DNA zu, welche mindestens etwa hunderttausend Gene umfasst, welche auf vierundzwanzig Chromosomen lokalisiert sind. Jedes Gen codiert für ein spezielles Protein, das innerhalb einer lebenden Zelle eine spezifische biochemische Funktion erfüllt. Veränderungen in einer DNA-Sequenz sind als Mutationen bekannt und können Proteine mit veränderten oder in manchen Fällen sogar verlorenen biochemischen Wirkungen ergeben; dies wiederum kann eine genetische Erkrankung verursachen. Gegenwärtig sind mehr als 3.000 genetische Erkrankungen bekannt. Darüber hinaus gibt es zunehmend Anhaltspunkte dafür, dass bestimmte DNA-Sequenzen eine Veranlagung eines Individuums für eine beliebige Erkrankung aus einer Zahl von genetischen Erkrankungen, wie etwa Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, bestimmten Autoimmunerkrankungen und Krebs, verursachen können. Entsprechend ist die Analyse von DNA ein schwieriges aber ehrenwertes Bestreben, das den Erhalt von Informationen verspricht, die bei der Behandlung von vielen lebensbedrohenden Erkrankungen grundlegend sind.
Aufgrund der Größe und der Tatsache, dass genomische DNA sowohl codierende als auch nicht-codierende Sequenzen (z.B. Exons und Introns) enthält, ist die Analyse von DNA unglücklicherweise besonders umständlich. Deshalb sind traditionelle Verfahren zur Analyse von chemischen Strukturen, wie etwa das manuelle Pipettieren von Ausgangsmaterial zum Erzeugen von Proben für die Analyse von geringem Wert. Um den Maßstab der notwendigen Analyse zu adressieren, haben Wissenschaftler parallele Verarbeitungsprotokolle für die DNA-Diagnostik entwickelt.
Wissenschaftler haben beispielsweise Robotervorrichtungen entwickelt, welche den Bedarf an manuellem Pipettieren und Betupfen durch Bereitstellung eines Roboterarms beseitigen, welcher an seinem proximalen Ende eine Vorrichtung mit einem Stiftwerkzeug trägt, welches aus einer Matrix mit Stiftelementen besteht. Die einzelnen Stifte der Matrix sind räumlich voneinander getrennt, um zu ermöglichen, dass jeder Stift in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingetaucht wird. Der Roboterarm taucht die Stifte in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte ein, wobei jedes der Stiftelemente mit Probenmaterial benetzt wird. Dann bewegt der Roboterarm die Vorrichtung mit dem Stiftwerkzeug in eine Position über eine Zielfläche und senkt das Stiftwerkzeug auf die Fläche ab, wobei die Stifte mit dem Ziel in Kontakt kommen, um eine Matrix von Punkten darauf zu bilden. Entsprechend beschleunigt das Stiftwerkzeug die Herstellung von Proben durch paralleles Verteilen von Probenmaterial.
Obwohl diese Stiftwerkzeugtechnik zum Beschleunigen der Herstellung von Probenarrays gut geeignet ist, leidet sie unter mehreren Nachteilen. Zunächst kontaktiert das Stiftwerkzeug während dem Verfahren des Auftropfens tatsächlich die Oberfläche des Substrats. Unter der Annahme, dass jedes Stiftwerkzeug eine feine Spitze benötigt, damit eine geringe Größe der Punkte auf das Ziel gedruckt wird, wird der andauernde Kontakt des Stiftwerkzeugs mit der Zielfläche die feinen und empfindlichen Spitzen des Stiftwerkzeugs abtragen und deformieren. Dies führt zu Fehlern, welche die Genauigkeit und Produktivität verringern.
Eine durch Wissenschaftler entwickelte alternative Technik verwendet die chemische Bindung von Probenmaterial an die Substratfläche. In einem bestimmten Verfahren wird DNA in situ auf einer Substratfläche synthetisiert, um eine Anordnung von räumlich getrennten und unterschiedlichen chemischen Produkten zu erzeugen. Solche Techniken sind im Wesentlichen dahingehend photolithographisch, dass sie Festphasenchemie, photolabile Schutzgruppen und eine photoaktivierte Lithographie kombinieren. Obwohl diese Systeme zum Erzeugen von Arrays von Probenmaterial gut geeignet sind, sind sie chemisch intensiv, zeitaufwändig und teuer.
Es ist weiterhin beunruhigend, dass keine der obigen Techniken eine ausreichende Kontrolle über das Volumen des Probenmaterials bereitstellt, welches auf der Fläche des Substrats verteilt wird. Entsprechend kann durch das Scheitern dieser Techniken ein Fehler dabei auftreten Probenarrays mit gut kontrollierten und genau reproduzierten Probenvolumina bereitzustellen. Bei einem Versuch zur Umgehung dieses Problems verteilt das Herstellungsverfahren oft großzügige Mengen an Reagenzienmaterialien. Obwohl dies ausreichende Probenvolumina sicherstellen kann, werden Probenmaterialien verschwendet, welche oft teuer und nur begrenzt verfügbar sind.
Auch wenn die Proben hergestellt worden sind, müssen Wissenschaftler noch immer den Bedarf an hochentwickelten Diagnostikverfahren zur Analyse der hergestellten Proben ins Auge fassen. Dafür verwenden Wissenschaftler mehrere Verfahren zur Identifizierung von Materialien wie etwa DNA. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung mit einer Sonde identifiziert werden, welche zu der zu identifizierenden Sequenz. komplementär ist Normalerweise wird das Nukleinsäurefragment mit einer sensitiven Reporterfunktion markiert, welche radioaktiv, fluoreszent oder chemilumineszent sein kann. Obwohl diese Verfahren gut funktionieren können, leiden sie unter bestimmten Nachteilen. Radioaktive Markierungen können gefährlich sein und die von ihnen erzeugten Signale nehmen mit der Zeit ab. Nicht-isotopische (z.B. fluoreszente) Markierungen leiden unter einem Mangel an Sensitivität und dem Abklingen des Signals, wenn während des Identifizierungsverfahrens Laser mit hoher Intensität verwendet werden. Außerdem ist die Markierung ein umständliches und zeitaufwändiges fehleranfälliges Verfahren. Entsprechend ist das Verfahren zur Herstellung und Analysierung von Arrays eines biochemischen Probenmaterials komplex und anfällig für Fehler.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt werden Verfahren zur Analyse eines Materials bereitgestellt umfassend die Schritte Bereitstellen eines Vesikels, das zur Aufnahme einer Flüssigkeit geeignet ist, wobei sich das Material in der Flüssigkeit befindet, Anordnen des Vesikels neben einer ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats, Steuern des Vesikels, um ein Nanolitervolumen der Flüssigkeit abzugeben, um ein definiertes und gesteuertes Volumen der Flüssigkeit an der ersten Stelle der Oberfläche des Substrats bereitzustellen, Bewegen des Vesikels zu einer zweiten Position neben einer zweiten Stelle auf der Oberfläche des Substrats, um ein definiertes und gesteuertes Volumen des Materials entlang eines Arrays von Stellen auf der Substratoberfläche zu verteilen, und Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse des Materials an jeder Stelle des Arrays. Diese Verfahren können den Schritt Mischen eines Matrixmaterials und eines Analytenmaterials zur Bildung eines flüssigen Materials, das an die Substratoberfläche abzugeben ist umfassen. Alternativ kann diese Ausführungsform die Schritte Befüllen einer Kammer, die im Vesikel enthalten ist, mit einem Matrixmaterial und Verteilen des Matrixmaterials an den Array von Stellen umfassen. Anschließend kann der Analyt verteilt werden. Der Schritt zur Durchführung von Massenspektrometrie kann sowohl den Schritt Durchführung einer Matrix-unterstützen Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie als auch Durchführung einer Flugzeitmassenspektrometrie oder Fouriertransformations-Spektrometrie umfassen.
In einem anderen Aspekt wird eine Vorrichtung zum Bilden eines Arrays von Probenmaterial auf einer Oberfläche eines Substrats bereitgestellt. Eine derartige Vorrichtung umfasst ein Vesikel mit distalem Ende, welches zur Aufnahme einer Flüssigkeit darauf geeignet ist, einen beweglichen Arm, der mit einem distalen Teil an das Vesikel montiert ist, ein Steuerelement zur Bewegung des Arms, um das Vesikel neben einer ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats anzuordnen und um das Vesikel zu steuern ein Nanolitervolumen der Flüssigkeit an der ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats bereitzustellen, und ein diagnostisches Werkzeug zum Analysieren des Materials, um ein Signal der Zusammensetzung zu erzeugen, welches für die chemische Zusammensetzung des Materials repräsentativ ist. In dieser Vorrichtung kann das Vesikel sowohl einen festen Materialschaft umfassen, als auch eine Innenkammer aufweisen, welche zur Aufnahme einer Flüssigkeit geeignet ist, als auch eine Kammer zum Einbringen einer Flüssigkeit in ein Transducerelement zum Ausstoßen von Flüssigkeit aus der Kammer.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Figuren stellen technische Merkmale der Erfindung dar, die für deren Verständnis nützlich sind. Ausführungsformen der Erfindung sind in den 11, 12 und 13 wie in Beispiel 4 beschrieben dargelegt.
1 veranschaulicht ein System zur Herstellung von Arrays von Probenmaterial zur Analyse.
2 veranschaulicht eine Stiftanordnung, welche zur Verwendung bei dem in 1 dargestellten System zur Durchführung eines parallelen Verfahrens zum Verteilen von Material auf einer Oberfläche eines Substrats geeignet ist.
3 stellt einen unteren Teil der in 2 gezeigten Anordnung dar.
4 stellt einen alternativen Blick auf den unteren Teil der in 2 dargestellten Stiftanordnung dar.
Die 5A bis 5D stellen ein Verfahren zum Herstellen eines Arrays von Probenmaterial dar.
Die 6A bis 6B stellen eine alternative Anordnung zum Verteilen von Material auf der Oberfläche eines Substrats dar.
7 ist eine schematische Darstellung, welche die kovalente Bindung von Oligodesoxynukleotiden an eine Siliciumdioxidfläche zeigt, wie es in den Verfahren hierin beschrieben wird. Insbesondere wurde Siliciumdioxid mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, um eine einheitliche Schicht von primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu erzeugen. Anschließend wurde ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel mit dem primären Amin umgesetzt, um eine Jodacetamidgruppe einzubringen. Ein Oligodesoxynukleotid, welches ein 3'- oder 5'-Disulfid (dargestellt als 5'-Disulfid) enthält, wurde mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) behandelt, um das Disulfid zu einem freien Thiol zu reduzieren, welches dann an die Jodacetamidooberfläche gekoppelt wurde.
8 ist ein Diagramm, in dem die Konjugation der Oligodesoxynukleotidsonden an eine Siliciumfläche als Funktion der TCEP-Konzentration, welche bei der Disulfidreduktion verwendet wurde, auftragen ist.
9 ist ein Massenspektrum einer Matrix-unterstützten Laserdesorptions/Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF) eines Siliciumwafers mit der kovalent gebundenen Oligodesoxynukleotidsequenz, welche mit "TCUC" bezeichnet wird (5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG-3'; SEQ ID NO 1), im Wesentlichen wie in 7 beschrieben, und der Oligodesoxynukleotidsequenz, welche mit "MJM6" bezeichnet wird (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEQ ID NO 2), die daran hybridisiert ist.
10 ist eine schematische Darstellung der Immobilisierung von spezifischen Thiol-haltigen DNA-Zielen, erzeugt durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) auf der Oberfläche eines Siliciumwafers. Ein Oligonukleotid [SEQ ID NO 7], komplementär zu einem Teil der DNA-Zielsequenz, wurde mit dem immobilisierten DNA-Ziel hybridisiert und es wurde eine MALDI-TOF MS-Analyse durchgeführt, welche ein vorherrschendes Signal bei einem beobachteten Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618.33 ergab, entsprechend dem hybridisierten Oligonukleotid, welches ein theoretisches Masse-Ladungs-Verhältnis von 3622.4 aufweist.
11 stellt eine Ausführungsform eines Substrats dar, in welches Vertiefungen eingeätzt sind, welche zum Aufnehmen von Material zur Analyse geeignet sind.
12 stellt ein Beispiel eines Spektrums dar, welches aus einem linearen Flugzeit-Massenspektrometerinstrument erhalten wurde und welches für die Materialzusammensetzung des Probenmaterials auf der Oberfläche des in 11 dargestellten Substrats repräsentativ ist.
13 stellt Molekulargewichte dar, welche für das Probenmaterial mit den in 12 identifizierten Spektren bestimmt wurden.
14 ist eine schematische Darstellung eines 4 × 4 (16 Stellen) DNA-Arrays auf der Oberfläche eines Siliciumwafers mit den Thiol-haltigen Oligonukleotidmolekülen, welche als "Oligomer 1", [5'-CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-(S)-3'; SEQ ID NO: 8), Oligomer 2 5'-(S)-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT-3'; SEQ ID NO: 3] und "Oligomer 3" (SEQ ID NO: 1; ein freies Thiolderivat "TCUC" Oligonukleotid aus Beispiel 1) bezeichnet wurden, kovalent gebunden an 16 Stellen der Oberfläche des Siliciumwafers, im Wesentlichen wie es in Beispiel 2 beschrieben wird.
15 ist eine schematische Darstellung der Hybridisierung von spezifischen Oligonukleotiden mit jeder der 16 Stellen des DNA-Hybridisierungsarrays von 14 mit dem zum Oligomer 1 komplementären Oligonukleotid (5'GATGATCCGACGCATCAGAATGT-3'; SEQ ID NO: 9), gebunden an das Oligomer 1, dem zum Oligomer 2 komplementären Nukleotid (5'-AATACTACACAG-3': SEQ ID NO: 7) gebunden an das Oligomer 2 und dem zum Oligomer 3 komplementären Oligonukleotid (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEQ ID NO: 2), gebunden an das Oligomer 3.
16 ist ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum eines 4 × 4 (16 Stellen) DNA-Arrays auf einem Siliciumwafer, welcher in 15 schematisch dargestellt ist. Das Spektrum ergibt ein einzelnes hervortretendes Signal eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses an jeder Stelle, welches den speziellen hybridisierten Oligonukleotiden entspricht. Die 2+ zeigt die Position eines doppelt geladenen Moleküls an, welches als ein Referenzstandard während der MALDI-TOF-Analyse verwendet wurde. Der * bezeichnet restliche Mengen von kontaminierendem Oligonukleotid, welche auf der Oberfläche des Chips nach den Waschverfahren zurückbleiben. Die relative Position des *-Signals zeigt die ungefähre Größe des verunreinigenden Oligonukleotids.
17 ist ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum eines 8 × 8 (64 Stellen) DNA-Arrays. Das Spektrum ergibt ein einzelnes hervortretendes Signal eines experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnisses, welches den vorhergesagten speziellen hybridisierenden Oligonukleotiden entspricht. Der bezeichnet restliche Mengen von kontaminierendem Oligonukleotid, welches nach den Waschverfahren auf der Oberfläche des Wafers zurückbleibt. Die relative Position des *-Signals ergibt die ungefähre Größe des verunreinigenden Oligonukleotids.
18 ist eine Abbildung einer Nukleotidverlängerung eines DNA-Primers, angelagert an ein Thiol-haltiges DNA-Templat, welches auf der Oberfläche eines mit SIAB-derivatisierten Siliciumwafers immobilisiert ist. Ein komplementärer 12-mer Oligonukleotidprimer [SEQ ID NO: 12] wurde an ein Thiol-haltiges 27-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 11] hybridisiert, welches auf einem Siliciumträger durch einen SIAB-Vernetzer immobilisiert wurde. Die Siliciumoberfläche mit dem immobilisierten DNA-Duplex wurde mit DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dCTP, dGTP und ddTTP unter Verlängerungsbedingungen inkubiert und einer MALDI-TOF-MS-Analyse unterzogen. Das Massenspektrum des Siliciumwafers zeigte das Vorliegen von zwei hervortretenden Signalen, eines mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis, welches gleich dem des nicht verlängerten 12-mer Oligonukleotids war, ebenso wie ein Signal, welches einem 15-mer DNA-Molekül entspricht, das auf dem Wafer an der ersten Position in der Sequenz, in die ein ddTTP eingebracht wurde, um 3 Nukleotide verlängert wurde.
19 zeigt ein Diagramm eines Experiments, welches entworfen wurde, um die Wirkung des Abstands zwischen der mit SIAB derivatisierten Oberfläche und dem bei Primerverlängerungsreaktionen gebildeten DNA-Duplex zu untersuchen. Zwei Thiol-haltige Oligonukleotide mit unterschiedlicher Sequenz [SEQ ID NO: 8 & 11] wurden auf einer mit SIAB derivatisierten Siliciumoberfläche immobilisiert und mit speziellen Oligonukleotiden inkubiert, welche einen DNA-Duplex bilden mit 0, 3, 6, 9 und 12 Basen Raum zwischen der SIAB-derivatisierten Oberfläche und dem DNA-Duplex, der gebildet wird durch das Oligonukleotid, welches mit der immobilisierten Thiol-haltigen DNA hybridisiert wird. Das freie 3'-Ende des hybridisierten Oligonukleotids wurde unter Verwendung entweder von Sequenase DNA-Polymerase oder ThermoSequenase DNA-Polymerase in Gegenwart der drei Desoxynukleotidtriphosphate und dem entsprechenden Didesoxynukleotidtriphosphat unter Verlängerungsbedingungen verlängert, und die resultierenden Reaktionsprodukte wurden einer MALDI-TOF-MS-Analyse unterzogen.
20 ist ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum der spezifischen Verlängerungsprodukte des in 19 veranschaulichten Experiments zur Primerverlängerung. Die Spektren in der linken Spalte sind die Spektren, welche aus der MALDI-TOF-MS-Analyse der Verlängerungsreaktionen resultierten, bei denen Sequenase verwendet wurde. Die Spektren in der rechten Spalte sind diejenigen, welche aus der Analyse der Verlängerungsreaktionen resultierten, bei denen ThermoSequenase verwendet wurde. Die ThermoSequenase-DNA-Polymerase konnte das 3'-Ende des hybridisierten DNA-Primers verlängern, wobei der Abstand zwischen dem DNA-Duplex und der Oberfläche des derivatisierten Siliciumwafers zwischen 0 und 12 Nukleotiden variierte. Auch die Sequenase-DNA-Polymerase konnte die hybridisierte DNA verlängern, wobei der Abstand zwischen dem DNA-Duplex und dem Siliciumwafer zwischen 3 und 9 Nukleotiden betrug.
Ausführliche Beschreibung und bevorzugte Ausführungsformen
Herstellung von DNA Arrays
Hierin werden Verfahren und Systeme zur Herstellung von Arrays von Probenmaterial zur Analyse durch ein diagnostisches Werkzeug bereitgestellt. Beispielsweise veranschaulicht 1 ein System zur Herstellung von Arrays von Probenmaterial zur Analyse durch ein diagnostisches Werkzeug. 1 stellt ein System 10 dar, welches einen Datenprozessor 12, eine Bewegungssteuerungsvorrichtung 14, eine Anordnung mit einem Roboterarm 16, ein Monitorelement 18A, eine zentrale Prozessierungseinheit 18B, eine Mikrotiterplatte mit Quellenmaterial 20, ein Gerüstgehäuse 22, einen Roboterarm 24, ein Gerüst 26, eine Drucksteuerung 28, eine Leitung 30, eine Aufbauanordnung 32, eine Stiftanordnung 38 und Substratelemente 34 umfasst. In der in 1 gezeigten Ansicht wird auch veranschaulicht, dass die Roboteranordnung 16 ein beweglich montiertes Element 40 und eine horizontale Gleitrille 42 enthalten kann. Der Roboterarm 24 kann gegebenenfalls um einen Stift 36 kreisen, um den Bewegungsbereich des Arms 24 zu erhöhen, so dass der Arm 24 die Stiftanordnung 38 oberhalb der Quellenplatte 20 anordnen kann.
Der in 1 dargestellte Datenprozessor kann ein konventionelles digitales Datenprozessierungssystem sein, wie etwa ein IBM PC-kompatibles Computersystem, das zur Prozessierung von Daten und zum Ausführen von Programmanweisungen geeignet ist, welches Information für die Steuerung der Bewegung und dem Betrieb der Roboteranordnung 16 bereitstellt. Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, dass die Datenprozessoreinheit 12 eine beliebige Art eines Systems sein kann, welches zum Prozessieren eines Programms von Instruktionssignalen geeignet ist, durch welche die Roboteranordnung, welche in das Robotergehäuse 16 integriert ist, betrieben werden kann. Gegebenenfalls kann der Datenprozessor 12 eine mikrogesteuerte Anordnung sein, welche in das Robotergehäuse 16 integriert ist. In weiteren alternativen Ausführungsformen braucht das System 10 nicht programmierbar zu sein, sondern kann ein Single-Board-Computer mit einem Firmware-Speicher zum Speichern von Instruktionen zum Betreiben der Roboteranordnung 16 sein.
In der in 1 dargestellten Ausführungsform findet sich eine Steuervorrichtung 14, die den Datenprozessor 12 und die Roboteranordnung 16 elektronisch koppelt. Die dargestellte Steuervorrichtung 14 ist eine Bewegungssteuerung, welche die Motorelemente der Roboteranordnung 16 zur Positionierung des Roboterarms 24 an einem ausgewählten Standort betreibt. Außerdem kann die Steuervorrichtung 14 Instruktionen für die Roboteranordnung 16 bereitstellen, um die Drucksteuerung 28 so zu dirigieren, dass das Volumen der Flüssigkeit, welche von den einzelnen Stiftelementen der dargestellten Stiftanordnung 38 ausgestoßen wird, gesteuert wird. Das Design und die Konstruktion der dargestellten Bewegungssteuerung 14 folgt aus Prinzipien, welche im Fachgebiet der Elektrotechnik wohl bekannt sind, und es kann jedes beliebige Steuerelement eingesetzt werden, welches zum Betreiben der Roboteranordnung 16 geeignet ist, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Die in 1 dargestellte Roboteranordnung 16 koppelt elektronisch an die Steuervorrichtung 14. Die dargestellte Roboteranordnung 16 ist ein Gerüstsystem, welches einen XY-Tisch zur Bewegung des Roboterarms über eine XY-Ebene umfasst, und weiterhin ein Z-Achsenstellglied umfasst, um den Roboterarms orthogonal zu dieser XY-Ebene zu bewegen. Die in 1 dargestellte Roboteranordnung 16 umfasst einen Arm 24, welcher an das XY-Gerüst montiert ist, welches den Arm innerhalb einer durch die XY-Achsen definierten Ebene bewegt. In der dargestellten Ausführungsform ist der XY-Tisch an das Z-Stellglied montiert, um den gesamten Tisch entlang der Z-Achse orthogonal zu der XY-Ebene zu bewegen. Auf diese Art und Weise stellt die Roboteranordnung drei Freiheitsgrade bereit, welche es ermöglichen, dass die Stiftanordnung 38 an einer beliebigen Stelle oberhalb der Substrate 34 und der Quellenplatte 20 angeordnet werden kann, welche in 1 so dargestellt werden, dass sie auf dem Gerüst, das an die Roboteranordnung 16 montiert ist, aufsitzen.
Die dargestellte Roboteranordnung 16 folgt aus Prinzipien, welche auf dem Gebiet der Elektrotechnik bekannt sind, und ist lediglich ein Beispiel für eine Roboteranordnung, die zum Bewegen einer Stiftanordnung an Stellen, benachbart zu einem Substrat und einer Quellenplatte, wie beispielsweise das dargestellte Substrat 34, geeignet ist. Entsprechend ist es für einen Fachmann offensichtlich, dass gemäß den hierin bereitgestellten Beschreibungen alternative Robotersysteme verwendet werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
1 stellt eine Ausführungsform einer Roboteranordnung 16 dar, welche eine Drucksteuerung 28 enthält, welche über eine Leitung 30 mit dem Gestell 32 verbunden ist, welches mit der Stiftanordnung 38 verbunden ist. In dieser Ausführungsform besitzt das Gestell 32 einen inneren Kanal für eine flüssige Verbindung der Leitung 30 zu der Stiftanordnung 38. Entsprechend ist die Drucksteuerung 28 durch die Leitung 30 und das Gestell 32 mit der Stiftanordnung 38 flüssig verbunden. Auf diese Art und Weise kann die Steuerung 14 Signale zur Drucksteuerung 28 senden, um selektiv einen Flüssigkeitsdruck zu steuern, welcher zu der Stiftanordnung 38 geleitet wird.
2 stellt eine Ausführungsform einer Stiftanordnung 50 dar, welche für die Betriebsform des in 1 dargestellten Systems geeignet ist, welche die Drucksteuerung 28 enthält. In der dargestellten Ausführungsform enthält die Stiftanordnung 50 ein Gehäuse, welches aus einem oberen Teil 52 und einem unteren Teil 54 gebildet ist, welche durch die Schrauben 56A und 56B miteinander verbunden sind und so ein Innenkammervolumen 58 definieren. 2 zeigt weiterhin, dass für eine Abdichtung des Innenkammervolumens 58 gegenüber Flüssigkeit das Gehäuse ein Dichtungselement enthalten kann, welches in 2 als eine O-Ringdichtung 60 dargestellt ist, welche sich zwischen dem oberen Block und dem unteren Block 54 befindet und den Umfang des Innenkammervolumens 58 vollständig umgibt. 2 zeigt weiterhin, dass die Stiftanordnung 55 eine Vielzahl von Vesikeln 62A bis 62D enthält, wovon jedes eine axiale Bohrung enthält, die sich durch das Vesikel erstreckt und die abgebildeten Haltekammern 64A bis 64D bildet. Jedes der dargestellten Vesikel erstreckt sich durch eine entsprechende Öffnung 68A bis 68D, welche innerhalb des unteren Blocks 54 des Gehäuses angeordnet ist.
Wie weiterhin in der abgebildeten Ausführungsform gezeigt wird, besitzt jedes der Vesikel 62A bis 62D einen oberen Flanschteil, welcher an einem Verschlusselement 70A bis 70D ansitzt und eine gegenüber Flüssigkeit dichte Abdichtung zwischen dem Vesikel und dem unteren Block 54 bildet, um zu verhindern, dass Flüssigkeit durch die Öffnungen 68A bis 68D ausläuft. Um die Abdichtung undurchlässig zu halten, enthält die abgebildete Stiftanordnung 50 weiterhin eine Gruppe von Vorspannungselementen 74A bis 74D, welche in 2 als Federn dargestellt werden, die sich in den dargestellten Ausführungsformen in einem komprimierten Zustand befinden, um das Flanschelement der Vesikel 62A bis 62D gegen ihre entsprechenden Abdichtungselemente 70A bis 70D zu drücken. Wie in 2 gezeigt wird, erstrecken sich die Vorspannungselemente 74A bis 74D zwischen den Vesikeln und dem oberen Block 52. Jede der Federn 74A bis 74D kann starr an eine Gestellplatte 76A bis 76D montiert werden, wo die Federelemente am oberen Block 52 befestigt sein können. Der obere Block 52 enthält weiterhin eine Öffnung 78, welche in 2 als zentral angeordnete Öffnung dargestellt ist, welche eine Gewindebohrung enthält, um ein Swagelok 80 (Verbindungsteil) zu enthalten, welches rotierbar innerhalb der Öffnung 78 montiert werden kann.
Wie in 2 weiterhin dargestellt wird, ist das Swagelok 80 durch eine Leitung mit einem Ventil 82 verbunden, welches das Swagelok 80 mit einer Leitung 84 verbinden kann, die mit einer Druckquelle gekoppelt werden kann oder alternativ das Swagelok 80 mit einer Leitung 86 koppeln kann, welche eine Belüftung der Innenkammer 58 bereitstellt. Eine zentrale Bohrung 88 erstreckt sich durch das Swagelok 80 und koppelt an ein Rohrelement, das weiterhin eine Verbindung mit dem Ventil 82 bereitstellt, wobei das Innenkammervolumen 58 flüssig und selektiv entweder mit einer Druckquelle oder einem Belüftungsauslass gekoppelt wird.
Die oben beschriebene und in 2 abgebildete Stiftanordnung 50 wird oberhalb eines Substratelements 90 angeordnet, welches eine Vielzahl von Vertiefungen 92 enthält, die in die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie in 2 dargestellt ist, ist der Abstand der Vesikel 62A bis 62D so, dass jedes Vesikel bezüglich der benachbarten Vesikeln in einer Entfernung räumlich angeordnet ist, welche ein ganzes Vielfaches der Abstandsdistanz zwischen den Vertiefungen 92 ist, die in die obere Fläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie durch die folgende Beschreibung deutlich wird, erleichtert diese räumliche Anordnung das parallele Verteilen der Flüssigkeit, so dass die Flüssigkeit in einem einzigen Arbeitsschritt in eine Vielzahl von Vertiefungen verteilt werden kann. Jedes der Vesikel kann aus Edelstahl, Silika, polymerem Material oder einem beliebigen anderen Material, welches zum Halten der flüssigen Probe geeignet ist, hergestellt werden. In einem Beispiel werden 16 Vesikel in der Anordnung verwendet, welche aus gehärtetem Berylliumkupfer, vergoldet über einer Nickelplatte hergestellt sind. Sie sind 43,2 mm lang und der Schaft des Vesikels ist mit einer konkaven Spitze auf einen Außendurchmesser von 0,46 mm kalibriert. Solch ein Stift wurde gewählt, da die Einstellgenauigkeit ungefähr 501 Mikrometer sein kann. Es ist jedoch offensichtlich, dass jede geeignete Stiftart für die Vorrichtung verwendet werden kann, einschließlich aber nicht beschränkt auf flache, sternförmige, konkave, feste Spitzen, halbhohle Spitzen, an einer oder beiden Seiten mit Winkeln versehene Stifte oder andere derartiger Geometrien.
3 zeigt von einer seitlichen Perspektive den unteren Block 54 der Stiftanordnung 50, welche in 2 dargestellt wird. 3 zeigt die ungefähren Dimensionen für eine Stiftanordnung. Wie gezeigt wird, besitzt der untere Block 54 eine Bodenplatte 98 und einen umgebenden Rand 100. Die Bodenplatte 98 ist ungefähr 3 mm dick und der Rand 100 ist ungefähr 5 mm dick.
4 zeigt von einer Perspektive von oben die allgemeine Struktur und Dimensionen für einen unteren Block 54, welcher zur Verwendung mit der Stiftanordnung 50 geeignet ist, welcher in 2 gezeigt wird. Wie in 4 gezeigt wird, enthält der untere Block 54 eine vier-mal-vier-Matrix von Öffnungen 68, um 16 Öffnungen bereitzustellen, wovon jede zur Aufnahme eines Vesikels geeignet ist. Wie oben mit Bezug auf 2 beschrieben wird, ist der Abstand zwischen der Öffnung 68 normalerweise ein ganzzahliges Vielfaches des Abstands zwischen den Vertiefungen auf einer Substratoberfläche ebenso wie zwischen den Vertiefungen einer Quellenplatte. Entsprechend kann eine Stiftanordnung mit einem wie in 4 abgebildeten unteren Block 54 Flüssigkeit in bis zu 16 Vertiefungen gleichzeitig verteilen. 4 zeigt auch die allgemeinen Dimensionen eines unteren Blocks 54, so dass jede Seite des Blocks 54 im Allgemeinen 22 mm lang ist und der Abstand zwischen der Öffnung 68 ungefähr 4,5 mm beträgt. Solch ein Abstand ist zur Verwendung mit einem Substrat geeignet, bei welchem die Flüssigkeit an Stellen verteilt werden soll, welche ungefähr 500 μm voneinander entfernt sind, wie es beispielsweise durch das Substrat 90 der 2 veranschaulicht wird. 4 zeigt auch, dass der untere Block 54 gegebenenfalls einen O-Ring-Rille 94 enthalten kann, welche zum Einfügen eines O-Ring-Abdichtungselements angepasst ist, wie beispielsweise das in 2 abgebildete Dichtungselement 60. Es ist verständlich, dass solch ein Rillenelement 94 die Flüssigkeitsabdichtung, die durch das Dichtungselement 60 gebildet wird, verstärken und verbessern kann.
Der Stiftblock kann aus Edelstahl hergestellt werden, da dieses Material auf etwa +25 μm genau gebohrt werden kann, es können aber auch eine Vielzahl von Sondenmaterialien verwendet werden, wie etwa G10-Laminat, PMMA oder ein anderes geeignetes Material. Der Stiftblock kann eine beliebige Anzahl von Öffnungen enthalten, und ist mit 16 Behältern, welche die 16 Stifte an ihrem Platz halten, dargestellt. Um die Einstellgenauigkeit jedes Stiftes zu steigern, kann gegebenenfalls ein Einstellungsplatz unter dem Block platziert werden, so dass etwa 6 mm der Stiftspitze exponiert bleiben, um ein Eintauchen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zu ermöglichen. Die Anordnung der Sonden in dem abgebildeten Werkzeug ist so konzipiert, dass sie mit einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen koordiniert wird, folglich beträgt der räumliche Abstand der Sonden von Zentrum zu Zentrum 4,5 mm. Es wurde ein Array von 4 × 4 Sonden gewählt, da dies einen Array erzeugt, welcher in weniger als ein Quadratzoll passt, was dem Bewegungsbereich eines XY-Gerüsts eines MALDI-TOF-MS entspricht, welches von der Anmelderin verwendet wird. Die Stiftwerkzeuganordnung wird durch eine Edelstahlbedeckung an der oberen Seite der Vorrichtung vervollständigt, welche dann an dem Z-Arm des Roboters befestigt wird.
Unter Bezugnahme auf die 5 verwendet die Roboteranordnung 16 eine Stiftwerkzeuganordnung 38, welche ähnlich wie die Stiftwerkzeuganordnung 50 konfiguriert ist, die in 2 abgebildet ist. Die Drucksteuerung 28 steuert den Druck innerhalb der Kammer 58 selektiv. Bei dieser Ausführungsform arbeitet ein Steuerungsprogramm auf dem Datenprozessor 12, um die Roboteranordnung 16 auf eine Art und Weise zu steuern, dass die Anordnung 16 einen Array von Elementen auf die Substrate 34 druckt.
In einem ersten Schritt, 5A, kann das Programm die Roboteranordnung 16 so leiten, dass die Stiftanordnung 38 oberhalb der Quellenplatte 20 angeordnet wird. Die Roboteranordnung 16 wird anschließend die Stiftanordnung in die Quellenplatte 20, welche eine DNA-Platte mit 384 Vertiefungen sein kann, eintauchen. Wie in 4 gezeigt wird, kann die Stiftanordnung 16 verschiedene Stifte enthalten, so dass die Stiftanordnung 50 16 Stifte in 16 unterschiedliche Vertiefungen der DNA-Quellenplatte mit 384 Vertiefungen 20 eintaucht. Als nächstes wird der Datenprozessor 12 die Bewegungssteuerung 14 so leiten, dass die Roboteranordnung 16 so arbeitet, dass die Stiftanordnung in eine Position oberhalb der Fläche des Substrats 34 bewegt wird. Das Substrat 34 kann ein beliebiges Substrat sein, welches zum Empfangen einer Probe von Material geeignet ist und es kann gebildet sein aus Silicium, Plastik, Metall oder einem beliebigen anderen derartigem geeigneten Material. Gegebenenfalls besitzt das Substrat eine flache Oberfläche, kann aber alternativ eine Oberfläche mit Vertiefungen, eine Oberfläche, in die Vertiefungen eingeätzt sind oder eine beliebige andere geeignete Oberflächentypographie enthalten. Das auf dem Datenprozessor 12 arbeitende Programm kann anschließend die Roboteranordnung durch die Bewegungssteuerung 14 so leiten, dass die Drucksteuerung 28 gesteuert wird, einen positiven Druck im Innenkammervolumen 58 zu erzeugen. Bei dieser Betriebsform wird der positive Innendruck Flüssigkeit aus den Haltekammern der Vesikel 62 herausdrücken, so dass Flüssigkeit aus den Vesikeln und in eine entsprechende Vertiefung 92 des Substrats 90 ausgestoßen wird.
Das auf dem Datenprozessor 12 arbeitende Programm kann die Steuerung 14 auch leiten, die Drucksteuerung 28 zu steuern, um das Füllen der Haltekammern mit Quellenmaterial aus der Quellenplatte 20 zu steuern. Die Drucksteuerung 28 kann im Innenkammervolumen 58 der Stiftanordnung einen negativen Druck erzeugen. Dies verursacht, dass Flüssigkeit in die Haltekammern der Vesikel 62A bis 62D gezogen wird. Die Drucksteuerung 28 kann den Druck entweder durch eine offene oder geschlossene Steuerung regulieren, um zu vermeiden, dass Flüssigkeit über die Haltekammern hinaus aufgezogen wird und in das Innenkammervolumen 58 ausläuft. Regelkreissteuerungssysteme zum Steuern des Drucks sind im Fachgebiet wohlbekannt und jede geeignete Steuerung kann verwendet werden. Solch ein Auslaufen kann eine Kreuzkontamination verursachen, insbesondere wenn das Quellenmaterial, welches von der Quellenplatte 20 aufgenommen wird, sich von Vertiefung zu Vertiefung unterscheidet.
In einer alternativen Betriebsform der Erfindung ist jede der Haltekammern 64A bis 64D ausreichend klein, um zu ermöglichen, dass die Kammern durch Kapillarwirkung gefüllt werden. In einer solchen Betriebsform kann die Stiftanordnung aus einem Array von Nadeln mit einer engen Bohrung wie etwa Edelstahlnadeln bestehen, welche sich durch die Öffnungen des unteren Blocks 54 erstrecken. Die Nadeln, welche in die Quellenlösungen eingetaucht werden, werden durch Kapillarwirkung gefüllt. In einer Betriebsform wird die Länge der Kapillare, welche bei atmosphärischem Druck gefüllt werden soll, ungefähr durch die Gleichung bestimmt:
wobei H die Höhe bedeutet, γ die Oberflächenspannung bedeutet, P die Lösungsdichte bedeutet, G die Gravitationskraft bedeutet und R den Nadelradius bedeutet. Auf diese Art kann das Flüssigkeitsvolumen, welches von jedem Vesikel gehalten wird, durch Auswahl der Dimensionen der inneren Bohrung gesteuert werden. Es ist selbstverständlich, dass bei Raumtemperatur Wasser eine 15 cm lange Kapillare mit 100 μm Radius füllt. Folglich wird eine Nadel mit einem Nanolitervolumen mit kurzer Bohrung zur vollen Kapazität gefüllt, sollte aber nicht überfließen, da die Kapillarkraft zu klein ist, um einen Meniskus am oberen Teil der Nadelöffnung zu bilden. Dies verhindert eine Kreuzkontamination aufgrund von Überlaufen. In einer Ausführungsform können die Vesikel der Stiftanordnung mit unterschiedlich großen Innenkammern zum Halten und Verteilen von unterschiedlichen Flüssigkeitsvolumina bereitgestellt werden.
Um das Flüssigkeitsvolumen zu verringern, welches in die Haltekammern der Vesikel eingezogen wird, kann in einer alternativen Betriebsform durch die Drucksteuerung 28 ein kleiner positiver Druck im Innenkammervolumen 58 bereitgestellt werden. Die durch den positiven Druck erzeugte abwärts gerichtete Kraft kann verwendet werden, um der aufwärts gerichteten Kapillarkraft entgegenzuwirken. Auf diese Art und Weise wird das Flüssigkeitsvolumen, welches durch Kapillarkraft in die Haltekammern der Vesikel gezogen wird, gesteuert.
5B zeigt, dass Flüssigkeit innerhalb der Haltekammern der Nadel durch einen kleinen positiven Druck verteilt werden kann, welcher durch die zentrale Bohrung 88, welche sich durch ein Swagelok 80 erstreckt, eingebracht wird. Durch Regulieren des Druckimpulses, welcher in das Innenkammervolumen 58 eingebracht wird, kann die Flüssigkeit entweder als ein Spray oder durch Tropfenbildung an der Nadelspitze ausgestoßen werden. Es ist verständlich, dass die Rate der Verteilung, Tropfen versus Spray, teilweise von dem durch die Drucksteuerung 28 angelegten Druck abhängt. In einer Betriebsform wird ein Druck im Bereich zwischen 10 und 1000 Torr atmosphärischer Druck angelegt.
Zu diesem Zweck kann der Datenprozessor 12 ein Computerprogramm betreiben, welches das Volumen der verteilten Flüssigkeit steuert und reguliert. Das Programm kann die Steuerung 28 so leiten, dass ein definiertes Flüssigkeitsvolumen ausgestoßen wird, entweder durch Erzeugen eines Sprays oder durch Bilden eines Tropfens, welcher am Ende des Vesikels sitzt, und mit der Substratfläche zum Verteilen der Flüssigkeit darauf in Kontakt gebracht werden kann.
Die 5C und 5D zeigen, dass die in den 5A und 5B gezeigten früheren Schritte erneut durchgeführt werden können, dieses Mal an einer Position der Substratoberfläche, welche gegenüber der früheren Stelle versetzt ist. Im abgebildeten Verfahren ist die Stiftanordnung durch einen Abstand versetzt, welcher dem Abstand zwischen zwei Vertiefungen 92 entspricht. Es ist offensichtlich, dass andere Offset-Drucktechniken verwendet werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Es ist verständlich, dass mehrere Vorteile der in 2 abgebildeten Stiftanordnug erreicht werden. Beispielsweise ist das Spülen zwischen Verteilungsereignissen einfach, wobei nur ein einzelnes oder mehrere Ereignisse hinsichtlich des Stiftfüllens und Leerens mit einer Spüllösung erforderlich sind. Da alle Haltekammern bis zur vollen Kapazität gefüllt werden, variiert außerdem die Genauigkeit der verteilten Volumina nur entsprechend der inneren Nadeldimensionen, welche während der Herstellung der Stifte sorgfältig gesteuert werden können. Weiterhin ist die Vorrichtung kosteneffektiv, wobei die höchsten Ausgaben den Nadeln zukommen, aber da kein Kontakt mit der Oberfläche erforderlich ist, werden die Nadeln einer geringen physikalischen Beanspruchung oder Belastung ausgesetzt, wodurch sie selten ersetzt werden müssen und eine lange Lebensdauer bereitgestellt wird.
Alternativ kann das Auftragen von Probenmaterial auf eine Substratoberfläche Verfahren umfassen, welche Anordnungen des Stiftwerkzeugs verwenden, die feste Stiftelemente besitzen, die sich aus einem Block erstrecken, wobei eine Roboteranordnung die festen Stiftelemente der Stiftanordnung in eine Quelle von Probenmaterial eintaucht, um die distalen Enden der Stifte mit den Probenmaterialien zu benetzen. Anschließend kann die Roboteranordnung die Stiftanordnung an eine Stelle über dem Substrat bewegen und dann die Stiftanordnung in Richtung der Oberfläche des Substrats absenken, um die einzelnen benetzten Stifte mit der Oberfläche in Kontakt zu bringen, um so Material auf die Substratoberfläche aufzutupfen.
Die 6A und 6B zeigen ein anderes alternatives System zum Verteilen von Material auf einer oder zu einer Oberfläche des Substrats. Insbesondere stellt 6A eine Düsendruckvorrichtung 110 dar, welche ein Kapillarelement 112, ein Transducerelement 114 und eine kleine Öffnung (nicht gezeigt) 118, eine Flüssigkeitsleitung 122 und ein Gestell 124 umfasst, welches mit einer Roboterarmanordnung verbunden ist, wie etwa dem in 1 gezeigtem Roboterarm 24. Wie weiterhin in 6A gezeigt wird, ist die Düsenanordnung 110 zum Ausstoßen einer Reihe von Tropfen 120 eines Probenmaterials aus der kleinen Öffnung 118 zur Verteilung von Probenmaterial auf der Oberfläche 128 geeignet.
Die Kapillare 112 der Düsenanordnung 110 kann eine Glaskapillare, eine Kunststoffkapillare oder ein anderes beliebiges geeignetes Gehäuse sein, welches eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann und welches es ermöglicht, dass die Flüssigkeitsprobe durch die Wirkung eines Transducerelements, wie etwa dem Transducerelement 114, ausgestoßen wird. Das Transducerelement 114, welches in 6A dargestellt ist, ist ein piezoelektrisches Transducerelement, welches um den Parameter der Kapillare 112 gebildet ist und einen elektrischen Impuls übertragen kann, welcher von dem Impulserzeuger innerhalb einer Roboteranordnung 16 erhalten wird, um zu verursachen, dass Flüssigkeit aus der kleinen Öffnung 118 der Kapillare 112 ausgestoßen wird. Eine solche Düsenanordnung mit einem piezoelektrischen Transducerelement wird hergestellt von MicroFab Technology, Inc., Deutschland. Aber jede beliebige Düsenanordnung, welche zum definierten und gesteuerten Verteilen der Flüssigkeits volumina geeignet ist, kann hierin verwendet werden, einschließlich solcher Düsenanordnungen, welche piezoelektrische Transducer, elektrische Transducer, elektrorestriktive Transducer, magnetorestriktive Transducer, elektromechanische Transducer oder ein beliebig anderes geeignetes Transducerelement verwenden. In der dargestellten Ausführungsform besitzt die Kapillare 112 eine Flüssigkeitsleitung 122 zur Aufnahme von flüssigem Material. In einer optionalen Ausführungsform kann die Flüssigkeit durch die Wirkung eines Vakuumdrucks in die Kapillare gezogen, wobei der Vakuumdruck die Flüssigkeit durch die kleine Öffnung 118 zieht, wenn die kleine Öffnung 118 in eine Quelle von flüssigem Material eingetaucht wird. Andere Ausführungsformen der Düsenanordnung 110 können erfindungsgemäß betrieben werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
6B veranschaulicht eine weitere alternative Anordnung, welche geeignet ist, auf dem Roboterarm einer Roboteranordnung wie etwa der in 1 abgebildeten Anordnung 16 getragen zu werden. 6B veranschaulicht vier Düsenanordnungen, welche miteinander verbunden sind, 130A-130D. Ähnlich wie die in 2 abgebildete Stiftanordnung kann die in 6B abgebildete Düsenanordnung für das parallele Verteilen von flüssigem Material verwendet werden. Es ist für einen Fachmann auf dem Gebiet der Elektrotechnik offensichtlich, dass jede der Düsenanordnungen 130A bis 130D unabhängig von den anderen betrieben werden kann, was das selektive Verteilen von Flüssigkeit aus ausgewählten Düsenanordnungen der Düsenanordnungen ermöglicht. Außerdem kann jede der Düsenanordnungen 130A bis 130D unabhängig gesteuert werden, um das Flüssigkeitsvolumen auszuwählen, welches von jeder der jeweiligen Düsen der Anordnung 130A bis 130D verteilt wird. Es können an der in 6B dargestellten Anordnung andere Modifikationen und Veränderungen durchgeführt werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Die Erfindung stellt Verfahren zum schnellen Analysieren von Probenmaterialien bereit. Zu diesem Zweck können durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren Probenarrays auf einer Substratoberfläche gebildet werden. Die Probenarrays werden anschließend durch Massenspektrometrie analysiert, um Spektraldaten zu sammeln, welche für die Zusammensetzung der Proben in dem Array repräsentativ sind. Es ist verständlich, dass die obigen Verfahren Prozesse bereitstellen, welche ein schnelles Verteilen von bestimmten und gesteuerten Volumina an Analytenmaterial ermöglichen. Insbesondere ermöglichen diese Verfahren ein Verteilen von Volumina von weniger als einem Nanoliter bis zu wenigen Nanolitern Flüssigkeit. Diese Techniken zum Abgeben eines geringen Volumens erzeugen Probenarrays, welche für eine Analyse mittels Massenspektrometrie gut geeignet sind. Beispielsweise ergeben geringe Volumina eine Reproduzierbarkeit von Punktcharakteristika, wie etwa Verdampfungsraten und eine verringerte Abhängigkeit von atmosphärischen Bedingungen wie beispielsweise Umgebungstemperatur und dem Licht.
Mit dem in 5 gezeigten Beispiel fortfahrend, können die Arrays durch Laden von Oligonukleotiden (0,1 bis 50 ng/μl) mit verschiedenen Sequenzen oder Konzentrationen in die Vertiefungen einer Mikrotiterquellenplatte mit 96 Vertiefungen 20 hergestellt werden; die erste Vertiefung kann zum Enthalten einer Matrixlösung reserviert werden. Ein Substrat 34, wie etwa ein mit Vertiefungen versehenes Siliciumchip-Substrat kann auf dem Gerüst 26 der Roboteranordnung 16 platziert werden, und kann manuell so angeglichen werden, dass die Matrix der Vertiefungen an einer Reihe von Referenzachsen orientiert wird. Das Steuerprogramm, welches auf dem Datenprozessor 12 ausgeführt wird, kann die Koordinaten der ersten Vertiefung der Quellenplatte 20 erhalten. Der Roboterarm 12 kann die Stiftanordnung 38 in die Quellenplatte 20 eintauchen, so dass jeder der 16 Stifte in eine der Vertiefungen eingetaucht wird. Jedes Vesikel kann sich durch Kapillarwirkung füllen, so dass das gesamte Volumen der Haltekammer Flüssigkeit enthält. Gegebenenfalls kann das Programm, welches auf dem Datenprozessor 12 ausgeführt wird, die Drucksteuerung so leiten, dass die Innenkammer 58 der Stiftanordnung 38 mit einem positiv beeinflussenden Druck gefüllt wird, welcher teilweise der Kraft der Kapillarwirkung entgegenwirkt, um das Volumen der Flüssigkeit, welches in die Haltekammer gezogen wird, zu beschränken oder zu verringern.
Gegebenenfalls kann die Stiftanordnung 38 in die gleichen 16 Vertiefungen der Quellenplatte 20 eingetaucht werden und auf ein zweites Zielsubstrat aufgetropft werden. Dieser Zyklus auf so vielen Zielsubstraten wie erwünscht kann wiederholt werden. Als nächstes kann der Roboterarm 12 die Stiftanordnung 38 in eine Waschlösung eintauchen, und dann die Stiftanordnung in 16 unterschiedliche Vertiefungen der Quellenplatte 20 eintauchen, und auf das Substratziel aufzutropfen, versetzt um eine Distanz zum anfänglichen Satz der 16 Spots. Wiederum kann dies für so viele Zielsubstrate wie erwünscht wiederholt werden. Der gesamte Zyklus kann wiederholt werden, um einen 2 × 2 Array von jedem Vesikel zu erzeugen, um so einen 8 × 8 Array von Spots (2 × 2 Elemente/Vesikel × 16 Vesikel = 64 aufgetropfte Gesamtelemente) herzustellen. Es ist aber für einen Fachmann offensichtlich, dass ein Verfahren, welches zur Bildung von Arrays geeignet ist, erfindungsgemäß betrieben werden kann, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Es können Oligonukleotide mit unterschiedlichen Sequenzen oder Konzentrationen in die Vertiefungen von bis zu drei unterschiedlichen Mikrotiterquellenplatten mit 384 Vertiefungen geladen werden, wobei ein Satz von 16 Vertiefungen für die Matrixlösung reserviert werden kann. Die Vertiefungen von zwei Platten werden mit Waschlösung gefüllt. Es können fünf Mikrotiterplatten auf das Gerüst der Roboteranordnung 16 geladen werden. Es kann eine Vielzahl von Zielsubstraten platziert werden angrenzend an eine optionale Gruppe von Anordnungsstiften oder Registrierungsstiften, welche auf dem Gerüst 26 angeordnet sind und bereitgestellt sind, um die Zielsubstrate entlang einer Reihe von Referenzachsen auszurichten. Wenn die Matrix und die Oligonukleotide nicht vorgemischt sind, kann die Stiftanordnung verwendet werden, um zuerst Matrixlösung auf alle gewünschten Zielsubstrate aufzutropfen. In einem nachfolgenden Schritt kann die Oligonukleotidlösung im gleichen Muster wie das Matrixmaterial aufgetropft werden, um die Matrix wieder zu lösen. Alternativ kann ein Probenarray hergestellt werden durch vorausgehendes Platzieren der Oligonukleotidlösung auf dem Wafer, gefolgt von der Matrixlösung, oder durch Vormischen der Matrix- und der Oligonukleotidlösungen.
Nach dem Auftragen der Probenarrays auf der Oberfläche des Substrats, können die Arrays unter Verwendung einer Vielzahl von Mitteln analysiert werden (z.B. spekrometrische Techniken wie etwa UV/VIS, IR, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, NMR-Spektrometrie oder Massenspektrometrie). Beispielsweise können mit Probe beladene Substrate nach jedem Verteilungsverfahren auf einer MALDI-TOF-Quellenplatte platziert werden und dort mit einem Satz von abgeflachten, mit Schrauben montierten Polycarbonatträgern gehalten werden. In einer Betriebsform kann die Platte auf das Ende einer Sonde übertragen werden, um im Quellenbereich eines Flugzeit-Massenspektrometers mit 1 μm Auflösung, auf einem 1''-Bewegungs-xy-Gerüst (Newport) gehalten zu werden. Es ist für einen Fachmann offensichtlich, dass jedes geeignete Massenspektrometriewerkzeug mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung mit den hierin beschriebenen Arrays umfassen Ionisations (I)-Techniken, einschließlich aber nicht beschränkt auf Matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI), kontinuierliches oder gepulstes Elektrospray (ESI) und verwandte Verfahren (z.B. Ionspray oder Thermospray), oder Massive Cluster Impact (MCI); solche Ionenquellen können mit Nachweisformaten abgestimmt werden, einschließlich lineare oder nichtlineare Reflexions-Flugzeit (TOF), einfaches oder mehrfaches Quadrupol, einfaches oder mehrfaches Magnetfeld, Fourier-Transformations-Ionencyclotronresonanz (FTICR), Ionenfalle und Kombinationen davon (z.B. Ionenfalle/Flugzeit). Zur Ionisation können zahlreiche Matrix/Wellenlängenkombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden. Proteinspiegel von weniger als einem Mol sind beispielsweise unter Verwendung von ESI (Valaskovic, G. A. et al., (1996) Science 273: 1199-1202) oder MALDI (Li, L. et al., (1996) J. Am. Chem. Soc 118: 1662-1663) Massenspektrometrie nachgewiesen worden.
Folglich ist es selbstverständlich, dass im hierin beschriebenen Verfahren völlig ohne Kontakt, mittels Hochdruckspray oder ein Tropfenbildungsmodus teilweise mit Kontakt, mittels Niedrigdruck verwendet werden kann. Bei dem letzteren ist der einzige auftretende Kontakt der Kontakt zwischen dem Tropfen und den Wänden der Vertiefung oder einer hydrophilen flachen Oberfläche auf dem Substrat 34. In keiner Betriebsform muss ein Kontakt zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche stattfinden.
Substrate mit einer Oberfläche zum Tragen eines Arrays eines Matrixmaterials können gemäß einem Verfahren gebildet werden, welches die Schritte umfasst Bereitstellen eines Vesikels, welches zum Übertragen einer Flüssigkeit, welche ein Matrixmaterial enthält, geeignet ist, Anordnen des Vesikels neben einer ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats, Steuern des Vesikels zum Zuführen der Flüssigkeit an die erste Stelle auf der Oberfläche des Substrats und Bewegen eines Vesikels zu einer Gruppe von Positionen neben der Oberfläche des Substrats und Zuführen von Flüssigkeit an jede dieser Stellen, um einen Array von Matrixmaterial zu bilden. Dieses Substrat selbst kann ein flacher Siliciumchip sein, ebenso wie aus einem beliebigen anderen geeigneten Material, und kann uneben sein, Vertiefungen umfassen, und Vertiefungen aufweisen, welche raue Innenflächen besitzen.
In besonderen Ausführungsformen umfassen die hierin bereitgestellten Verfahren zur Bildung eines Arrays von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche eines Substrats das Inkontaktbringen von vorbestimmten Stellen der Oberfläche eines unlöslichen Trägers mit Lösungen von Thiol-haltigen Nukleinsäuren, welche an die Stellen mit einem Vesikel mit einer Innenkammer verteilt werden, welche die entsprechenden Lösungen enthält, wobei die vorbestimmten Positionen Thiol-reaktive Gruppen enthalten. Alternativ ist die gesamte Oberfläche des Subsrats mit den Thiol-reaktiven Gruppen derivatisiert, und eine Thiol-haltige Nukleinsäure wird an vorher bestimmte Stellen auf der Oberfläche auf eine solche Art und Weise verteilt, dass ein Array gebildet wird. Hierin werden auch Substrate mit einer Oberfläche bereitgestellt, die einen Array von Nukleinsäuren trägt, welcher durch die hierin beschriebenen Verfahren gebildet werden.
Von Nutzen im erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren in einer hohen Dichte auf einer Oberfläche, welche auf der schnellen Reaktion einer freien Thiolgruppe einer modifizierten Oberfläche oder modifizierten Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen mit einer Thiol-reaktiven Funktionalität der anderen Komponente (Oberfläche oder Nukleinsäure) basieren. Diese Reaktion kann direkt oder durch ein bifunktionelles Vernetzungsmittel stattfinden. Bevorzugt umfasst die modifizierte Nukleinsäure eine Thiolgruppe und das Vernetzungsmittel enthält eine Jodacetylgruppe.
Die Oberfläche kann ein fester Träger sein, an welchen "Beads" gebunden sind, die an Nukleinsäuremoleküle gebunden sind. Die Beads sind nicht notwendigerweise kugelförmig, aber betreffen Partikel, welche an den festen Träger konjugiert sind, um dabei die Oberfläche des festen Trägers zu erhöhen und/oder eine alternative Oberfläche zur Konjugation von Nukleinsäuren oder anderen Molekülen bereitzustellen. Die Beads besitzen bevorzugt eine Größe von etwa 1 μm bis 100 μm. Es werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, welche mindestens ein Bead enthalten, das an einen festen Träger konjugiert ist und ferner an mindestens ein Molekül, insbesondere eine Nukleinsäure, konjugiert ist. Das Bead wird aus einem beliebigen geeigneten Matrixmaterial gebildet, welches Fachleuten bekannt ist, einschließlich solchen Matrixmaterialien, welche quellbar und nicht quellbar sind. Der feste Träger ist ein beliebiger Träger, der Fachleuten zur Verwendung als Trägermatrix bei chemischen Synthesen und Analysen bekannt ist. In solchen Fällen ist die Nukleinsäure über ein Schwefelatom an das "Bead" gebunden, wie es hierin beschrieben wird. In bestimmten Ausführungsformen können die Beads an den festen Träger in Vertiefungen oder Gruben auf der Oberfläche konjugiert sein, oder die Beads können in der Form eines Arrays auf dem Träger angeordnet sein.
Bevorzugt ist das Bead aus einem Material hergestellt, ausgewählt aus Materialien, welche als feste Träger für die Synthese und für Assays dienen, einschließlich aber nicht beschränkt auf: Silikagel, Glas, Magnet, Polystyrol/1 Divinylbenzolharze wie etwa Wang-Harze, welche sind Fmoc-Aminosäure-4-(hydroxymethyl)phenoxymethylcopoly(styrol-1 % Divinylbenzol (DVD))-Harz, Chlortrityl-(2-chlortritylchlorid-Copolystyrol-DVB-Harz)-Harz, Merrifield (chlormethyliertes Copolystyrol-DVB)-Harzmetall, Kunststoff, Cellulose, vernetzte Dextrane wie etwa diejenigen, welche unter dem Handelsnamen Sephadex^® (Pharmacia) verkauft werden und Agarosegel, wie etwa Gele, welche unter dem Handelsnamen Sepharose^® (Pharmacia) verkauft werden, welches ein Wasserstoff-gebundenes Agarosegel des Polysaccharidtyps ist, und andere solche Harze sind, und Festphasenträger, welche Fachleuten bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Bead eine Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 500 μm, stärker bevorzugt etwa 1 bis 100 μm im Durchmesser auf.
Der feste Träger liegt in einer beliebigen gewünschten Form vor, einschließlich aber nicht beschränkt auf ein Bead, eine Kapillare, eine Platte, eine Membran, ein Wafer, ein Kamm, ein Stift, ein Wafer mit Gruben, ein Array von Gruben oder Nanolitervertiefungen oder anderen Geometrien und Formen, welche Fachleuten bekannt sind.
Kits für immobilisierte Nukleinsäuren auf einem unlöslichen Träger können mit dem Verfahren oder der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden. Der Kit kann eine geeignete Menge i) eines Thiol-reaktiven Vernetzungsmittels; und ii) eines Oberflächen-modifizierenden Reagenz zur Modifizierung einer Oberfläche mit einer Funktionalität, welche mit dem Thiol-reaktiven Vernetzungsmittel reagieren kann, umfassen. Der Kit kann gegebenenfalls einen unlöslichen Träger, z.B. eine feste Oberfläche, magnetische Mikrobeads oder Silikonwafer zur Verwendung bei der Immobilisierung von Nukleinsäuren enthalten. Das Kit kann gegebenenfalls auch geeignete Puffer ebenso wie Bedienungsvorschriften enthalten.
Die Verwendung dieser Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen auf einem festen Träger ergibt eine mindestens 12,5-fach höhere Immobilisierung als mit früher beschriebenen Verfahren. Die Verfahren sind deswegen besonders nützlich zur Bildung von Startplatten („launching pads") für die Massenspektrometrie.
Die unter Verwendung der hierin bereitgestellten Verfahren auf einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren können in einer Vielzahl von Anwendungen der Festphasennukleinsäurechemie verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Nukleinsäuresynthese (chemisch und enzymatisch), Hybridisierung und/oder Verlängerung und in diagnostischen Verfahren, welche auf dem Nachweis und Polymorphismusanalysen von Nukleinsäuren basieren (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,605,798). Entsprechend werden hierin ferner Verfahren zur Umsetzung von Nukleinsäuremolekülen beschrieben, bei welchen die Nukleinsäuremoleküle auf einer Oberfläche immobilisiert sind, entweder durch Umsetzen eines Thiol-haltigen Derivats des Nukleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger, welcher eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, oder durch Umsetzen eines Thiol-haltigen unlöslichen Trägers mit einem Derivat des Nukleinsäuremoleküls, welches eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, und danach weiterer Umsetzung der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle.
In einer besonderen Ausführungsform der Verfahren zur Umsetzung von immobilisierten Nukleinsäuren wird die immobilisierte Nukleinsäure ferner durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäure umgesetzt, die zu der immobilisierten Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist. Solche Hybridisierungsreaktionen können verwendet werden, um die Anwesenheit einer spezifischen Nukleinsäure in einer Probe nachzuweisen. Dies findet insbesondere beim Nachweis von Pathogenen in einer Probe, wie etwa einer biologischen Probe, welcher bei der Diagnose von Erkrankungen verwendet werden kann, Verwendung.
Deshalb werden hierin auch Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, worin eine Thiol-haltige Nukleinsäure, welche zur Zielnukleinsäure komplementär ist, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren an eine Oberfläche immobilisiert wird, und die Probe mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen die Zielnukleinsäure in der Probe mit der immobilisierten Nukleinsäure hybridisiert. Die hybridisierte Zielnukleinsäure kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden, wobei das bevorzugte Verfahren Massenspektrometrie ist. Weiterhin werden hierin Verfahren zum Nachweis von Veränderungen (z.B. Deletionen, Insertionen und Konversionen) in der Nukleotidsequenz der Zielnukleinsäure bereitgestellt. In diesen Verfahren wird das Molekulargewicht der hybridisierten Zielnukleinsäure, ermittelt durch Massenspektrometrie, mit dem für die Zielnukleinsäuresequenz erwartetem Molekulargewicht verglichen. Abweichungen des gemessenen Molekulargewichts vom erwarteten Molekulargewicht weisen auf eine Veränderung in der Nukleotidsequenz der Zielnukleinsäure hin.
In anderen Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure in einer Probe wie sie hierin bereitgestellt werden, wird die Zielnukleinsäure auf einer Oberfläche, welche Thiol-reaktive Gruppen enthält, immobilisiert. In diesen Verfahren wird die Zielnukleinsäure vor der Immobilisierung in einer Reaktion amplifiziert, bei der ein Oligonukleotidprimer eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält und das resultierende Produkt wird reduziert, um eine Thiol-haltige Nukleinsäure zu erzeugen. Die Thiol-haltige Nukleinsäure wird an eine Oberfläche immobilisiert, welche Thiol-reaktive Gruppen enthält, und wird mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure in Kontakt gebracht, welche zu der immobilisierten Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist. Die Hybridisierung der einzelsträngigen Nukleinsäure kann durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden. Beispielsweise kann die einzelsträngige Nukleinsäure mit einer leicht nachweisbaren Komponente markiert werden, z.B. mit radioaktiven oder chemilumineszenten Markierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die einzelsträngige Nukleinsäure durch Massenspektrometrie nachgewiesen.
In einer anderen Ausführungsform der Verfahren zum Umsetzen immobilisierter Nukleinsäuren, wird die immobilisierte Nukleinsäure weiterhin umgesetzt durch Verlängerung einer Nukleinsäure, welche mit der immobilisierten Nukleinsäure oder einem Teil davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie diese können beispielsweise bei Verfahren verwendet werden zum Sequenzieren von DNA-Molekülen, welche an einen unlöslichen Träger immobilisiert sind, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren. Folglich werden hierin auch Verfahren beschrieben zur Bestimmung der Sequenz eines DNA-Moleküls auf einem Substrat, wobei ein Thiol-haltiges Derivat des DNA-Moleküls auf der Oberfläche eines unlöslichen Trägers immobilisiert wird, welcher Thiol-reaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert wird, welche zu einem Teil der immobilisierten DNA komplementär ist, vor dem Durchführen der DNA-Synthese in Gegenwart von einem oder mehreren Didesoxynukleotiden.
Die Verlängerung eines Nukleinsäureprimers, welcher mit einer Nukleinsäure hybridisiert ist, die an eine Oberfläche immobilisiert ist, wie sie hierin bereitgestellt wird, kann auch verwendet werden beim Nachweis von Veränderungen der Nukleotidsequenz (z.B. Deletionen, Insertionen, Konversionen) einer Zielnukleinsäure. Entsprechend werden hierin Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Zielnukleinsäuresequenz bereitgestellt, worin eine einzelsträngige Nukleinsäure hybridisiert wird mit einer Thiol-haltigen Zielnukleinsäure, welche gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren an einen festen Träger immobilisiert ist, und die hybridisierte einzelsträngige Nukleinsäure durch Anfügen von Nukleotiden an das 3'-Ende des Moleküls verlängert wird. Das Verlängerungsprodukt wird beispielsweise durch Massenspektrometrie charakterisiert, um zu bestimmen, ob seine Charakteristika sich von denjenigen Charakteristika unterscheiden, die von einer Sequenz erwartet werden, welche zu der immobilisierten Zielnukleinsäure komplementär ist. Folglich wird beispielsweise das Molekulargewicht des Verlängerungsprodukts, welches durch Massenspektrometrie bestimmt wird, mit dem erwarteten Molekulargewicht einer Nukleinsäure, welche zu der Zielnukleinsäure komplementär ist, verglichen. Abweichungen vom erwarteten Molekulargewicht weisen auf eine Veränderung in der Sequenz der Zielnukleinsäure hin.
In bestimmten Ausführungsformen der hierin bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Abweichungen in einer Zielnukleinsäuresequenz, kann die Zielnukleinsäure vor der Immobilisierung an eine Thiol-reaktive Oberfläche amplifiziert werden in einer Reaktion, worin ein Oligonukleotidprimer eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält. Das resultierende Produkt wird reduziert, um eine Thiol-haltige Zielnukleinsäure zu erzeugen. Die Thiol-haltige Zielnukleinsäure wird dann an eine Oberfläche immobilisiert, welche Thiol-reaktive Gruppen enthält, und die einzelsträngige komplementäre Nukleinsäure wird daran hybridisiert und verlängert.
In weiteren Ausführungsformen der hierin bereitgestellten Verfahren zum Nachweis von Abweichungen in einer Zielnukleinsäuresequenz, wird eine einzelsträngige Nukleinsäure, welche zu der Zielnukleinsäure komplementär ist, durch eine Bindung, welche eine Bindung einer Thiolgruppe/Thiol-reaktiver Funktionalität und einen spaltbaren Linkeranteil enthält, an eine Oberfläche immobilisiert. Die Probe, welche die Zielnukleinsäure enthält, wird mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, wobei das Ziel mit der immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert. Die immobilisierte einzelsträngige Nukleinsäure wird durch Anfügen von Nukleotiden an das 3'-Ende des Moleküls verlängert. Nach der Verlängerung wird das doppelsträngige Molekül denaturiert und das einzelsträngige immobilisierte Verlängerungsprodukt wird von der Oberfläche an der Stelle des Linkers gespalten. Das Verlängerungsprodukt wird beispielsweise durch Massenspektrometrie charakteristiert, um zu bestimmen, ob sich seine Charakteristika von denjenigen Charakteristika unterscheiden, welche von einer Sequenz erwartet werden, die zu der immobilisierten Zielnukleinsäure komplementär ist.
Es ist verständlich, dass alle Anwendungen der Festphasennukleinsäurechemie, welche auf Nukleinsäuren basieren, die gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren an ein festes Substrat immobilisiert sind, mit Thiol-haltigen Nukleinsäuren und einer Thiol-reaktiven Oberfläche ebenso wie mit Thiol-reaktiven Nukleinsäuren und einem Thiol-haltigen Träger durchgeführt werden können.
Verfahren zum Bilden eines Arrays von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche eines Substrats durch in Kontakt bringen Thiol-haltiger Nukleinsäuren mit einem unlöslichem Träger, welcher Thiol-reaktive Gruppen enthält, die in einer geordneten Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind, werden hierin auch bereitgestellt. In einem alternativen Verfahren zum Bilden eines Arrays von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche eines Substrats, wie es hierin bereitgestellt wird, wird ein unlöslicher Träger, der Thiol-Funktionalitäten enthält, welche in einer geordneten Anordnung auf der Oberfläche des Trägers positioniert sind, mit Nukleinsäuren, welche eine Thiol-reaktive Gruppe enthalten, in Kontakt gebracht.
Weiterhin werden hierin Systeme und Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Analyse bereitgestellt, und insbesondere für Systeme und Verfahren zum Verteilen von geringen Volumina von flüssigem Material auf einer Substrat oberfläche zum Erzeugen eines Arrays von Proben für eine diagnostische Analyse. Die hierin bereitgestellten Systeme und Verfahren zur Herstellung von Arrays von Probenmaterial sind im Allgemeinen weniger kostenintensiv bei der Verwendung und sparen Reagenzienmaterialien ein, während sie eine schnelle Produktion von hochreproduzierbaren Probenarrays ermöglichen.
Im Hinblick auf die Systeme und Verfahren zum Verteilen von geringen Volumina von flüssigem Material auf einer Substratoberfläche werden hierin serielle und parallele Verteilungswerkzeuge bereitgestellt, welche verwendet werden können, um Mehrelementarrays von Probenmaterial auf einer Substratoberfläche zu erzeugen. Die Substratoberflächen können flach oder geometrisch verändert sein, um Vertiefungen für das aufzunehmende Materials zu enthalten.
In einer Ausführungsform ist das Werkzeug ein Werkzeug, welches die parallele Entwicklung eines Probenarrays ermöglicht. Zu diesem Zweck kann das Werkzeug als eine Anordnung von Vesikelelementen oder Stiften verstanden werden, worin jeder der Stifte eine enge Innenkammer enthält, welche zum Halten von Nanolitervolumina der Flüssigkeit geeignet ist. Jeder der Stifte kann in ein Gehäuse passen, welches selbst eine Innenkammer besitzt. Das innere Gehäuse kann mit einer Druckquelle verbunden sein, welche den Druck innerhalb der inneren Gehäusekammer steuert, um den Flüssigkeitsfluss durch die Innenkammer der Stifte zu regulieren. Dies ermöglicht das kontrollierte Verteilen von definierten Volumina an Flüssigkeit aus den Vesikeln.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Werkzeug eine Düsenanordnung, welche einen Kapillarstift mit einer Innenkammer umfassen kann, und ein Trandsucerelement, welches auf den Stift montiert ist und die Flüssigkeit durch die Innenkammer des Stifts leiten kann, um die Flüssigkeit aus dem Stift auszustoßen. Auf diese Art und Weise kann das Werkzeug einen Flüssigkeitspunkt auf einer Substratfläche durch Sprühen der Flüssigkeit aus dem Stift verteilen. Alternativ kann der Transducer verursachen, dass sich ein Flüssigkeitstropfen aus der Kapillare erstreckt, so dass die Flüssigkeit zu dem Substrat geleitet werden kann durch Inkontaktbringen des Tropfens mit der Substratoberfläche.
Weiterhin kann das Werkzeug einen Array von Probenmaterial bilden durch Verteilen des Probenmaterials in einer Reihe von Schritten, während der Stift an verschiedene Stellen oberhalb der Substratoberfläche bewegt wird, um den Probenarray zu bilden. In einer weiteren Ausführungsform werden die hergestellten Probenarrays zu einer Plattenanordnung geleitet, welcher die Probenarrays für eine Analyse mittels Massenspektrometrie anordnet. Zu diesem Zweck wird ein Massenspektrometer bereitgestellt, welcher eine Reihe von Spektrensignale erzeugt, welche als Hinweis auf die Zusammensetzung des zu analysierenden Probenmaterials verstanden werden können.
In einem Aspekt kann die hierin bereitgestellte Verteilungsvorrichtung zur Verteilung definierter Volumina an Flüssigkeit, einschließlich Nanovolumina und Sub-Nanovolumina an Flüssigkeit, in chemischen oder biologischen Verfahren auf der Substratoberfläche ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Teil mit darin ausgebildeten mehreren Öffnungen enthalten, wobei die Wände und der untere Teil des Gehäuses ein Innenvolumen definieren; ein oder mehrere Flüssigkeitsübertragungsvesikel oder Stifte, welche innerhalb der Öffnungen montiert sind, mit einer Flüssigkeitshaltekammer in Nanovolumengröße zum Halten von Nanovolumina an Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeitshaltekammer so angeordnet ist, dass sie in fluider Verbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, und ein Verteilungselement, welches in Verbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, zum selektiven Verteilen von Nanovolumina an Flüssigkeit aus den Flüssigkeitsübertragungsvesikeln in Nanovolumengröße, wenn die Flüssigkeit in die Flüssigkeitshaltekammern der Vesikel geladen wird. Wie hierin beschrieben wird, ermöglicht dies, dass das Verteilungselement Nanovolumina der Flüssigkeit auf die Oberfläche des Substrats verteilt, wenn die Vorrichtung über und in Deckung mit dem Substrat angeordnet wird.
In einer Ausführungsform besitzt das Flüssigkeitsübertragungsvesikel ein offenes proximales Ende und einen distalen Endenteil, welcher sich über den unteren Teil des Gehäuses erstreckt, wenn er in die Öffnungen montiert ist. Auf diese Art und Weise kann das offene proximale Ende die Flüssigkeitshaltekammer in fluider Verbindung mit dem Innenvolumen anordnen, wenn es mit den Öffnungen montiert ist. Gegebenenfalls sind die mehreren Flüssigkeitsübertragungsvesikel entfernbar und ersetzbar montiert innerhalb der Öffnungen des Gehäuses, oder können alternativ eine Leimverbindung für eine feste Montage der Vesikel innerhalb des Gehäuses aufweisen.
In einer Ausführungsform enthält die Flüssigkeitshaltekammer eine enge Bohrung, welche so angepasst ist, dass sie durch Kapillarwirkung mit der Flüssigkeit gefüllt werden kann, und welche solch eine Größe aufweisen kann, dass sie im Wesentlichen vollständig mit der Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt werden kann.
In einer Ausführungsform umfasst die Vielzahl der Flüssigkeitsübertragungsvesikel einen Array von Flüssigkeitszufuhrnadeln, welche aus Metall, Glas, Silicamaterial, polymerem Material oder einem beliebigen anderen geeigneten Material gebildet sein können.
In einer Ausführungsform kann das Gehäuse einen oberen Teil enthalten, und mechanische Vorspannungselemente für ein mechanisches Vorspannen der Vielzahl der Flüssigkeitsübertragungsvesikel in abdichtenden Kontakt mit dem unteren Teil des Gehäuses. In einer bestimmten Ausführungsform besitzt jedes Flüssigkeitsübertragungsvesikel einen proximalen Endteil, welcher einen Flansch enthält, und weiterhin ein Verschlusselement enthält, welches zwischen dem Flansch und einer Innenfläche des unteren Teils des Gehäuses angeordnet ist, um einen Verschluss zwischen dem Innenvolumen und einer äußeren Umgebung zu bilden. Die Vorspannungselemente können mechanisch sein und können eine Vielzahl von Federelementen enthalten, wobei jedes der Federelemente mit einem Ende mit dem proximalen Ende von jedem der Vielzahl der Flüssigkeitsübertragungsvesikel verbunden ist, und mit dem anderen Ende mit einer innere Fläche des oberen Teils des Gehäuses. Die Federn können eine mechanische Vorspannungskraft auf das proximate Ende des Vesikels ausüben und den Verschluss bilden.
In einer weiteren Ausführungsform enthält das Gehäuse weiterhin einen oberen Anteil und ein Befestigungselement zum Befestigen des oberen Teils des Gehäuses mit dem unteren Teil des Gehäuses. Das Befestigungselement kann eine Vielzahl von Auffangöffnungen für Befestigungselemente umfassen, welche innerhalb eines des oberen und unteren Teils des Gehäuses gebildet sind, und eine Vielzahl von Verbindungselementen zum Montieren innerhalb der Öffnungen, um die oberen und unteren Teile des Gehäuses miteinander zu verbinden.
In einer Ausführungsform kann das Verteilungselement eine Druckquelle umfassen, welche fluid mit den Innenvolumen des Gehäuses verbunden ist zum Anordnen des Innenvolumens bei einer ausgewählten Druckbedingung. Außerdem kann in einer Ausführungsform, in der die Flüssigkeitsübertragungsvesikel durch Kapillarwirkung gefüllt werden, das Verteilungselement eine Drucksteuerung enthalten, welche die Druckquelle variieren kann, um das Innenvolumen des Gehäuses bei variierenden Druckbedingungen anzuordnen. Dies ermöglicht dem Steuerungs-variierenden Element, das Innenvolumen bei einer ausgewählten Druckbedingung anzuordnen, welche ausreicht, um die Kapillarwirkung auszugleichen, um die Flüssigkeitshaltekammer jedes Vesikels bis zu einer vorbestimmten Höhe zu füllen, welche einer vorher bestimmten Flüssigkeitsmenge entspricht. Außerdem kann die Steuerung weiterhin ein Flüssigkeitsauswahlelement zum selektiven Entladen einer ausgewählten Flüssigkeitsmenge im Nanovolumenbereich aus der Kammer jedes Vesikels enthalten. In einer bestimmten Ausführungsform ist eine Drucksteuerung enthalten, welche unter der Steuerung eines Computerprogramms betrieben wird, welches mit einem Datenverarbeitungssystem arbeitet, um eine variable Kontrolle des Drucks bereitzustellen, der auf die Innenkammer des Gehäuses ausgeübt wird.
In einer Ausführungsform kann das Flüssigkeitsübertragungsvesikel ein proximales Ende besitzen, welches sich auf an dem Innenvolumen des Gehäuses öffnet, und die Flüssigkeitshaltekammer der Vesikel besitzt eine solche Größe, dass sie im Wesentlichen vollständig mit der Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt wird, ohne am proximalen offenen Ende einen Meniskus auszubilden. Gegebenenfalls kann die Vorrichtung eine Vielzahl von Vesikeln besitzen, worin ein erster Teil der Vielzahl der Vesikel Flüssigkeitshaltekammern mit einer ersten Größe und ein zweiter Teil Flüssigkeitshaltekammern mit einer zweiten Größe umfasst, wobei eine Vielzahl von Flüssigkeitsvolumina verteilt werden kann.
In einer anderen Ausführungsform kann die Verteilungsvorrichtung ein Flüssigkeitsauswahlelement enthalten, welches eine Druckquelle besitzt, die mit dem Gehäuse verbunden ist und in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, zum Verteilen des Innenvolumens bei einer ausgewählten Druckbedingung, und ein Regulierungselement, welches die Druckquelle zum Variieren des Drucks innerhalb des Innenvolumens des Gehäuses verbindet, um einen positiven Druck in der Flüssigkeitskammer von jedem der Flüssigkeitsübertragungsvesikel anzulegen, um die Menge der daraus verteilten Flüssigkeit zu variieren. Das Auswahlelement und das Regulierungselement können Computerprogramme sein, welche mit einem Datenverarbeitungssystem betrieben werden, welches den Betrieb einer Drucksteuerung, die mit der Innenkammer verbunden ist, steuert.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist die hierin bereitgestellte Vorrichtung zum Verteilen einer Flüssigkeit in chemischen oder biologischen Verfahren in eine oder mehrere Vertiefungen eines Substrats mit mehreren Vertiefungen. Die Vorrichtung kann ein Gehäuse umfassen mit einer Vielzahl von Seiten und einem unteren Teil, in dem eine Vielzahl von Öffnungen ausgebildet ist, wobei die Wände und der untere Teil ein Innenvolumen definieren, einer Vielzahl von Flüssigkeitsübertragungsvesikeln, montiert innerhalb der Öffnungen, mit einer Flüssigkeitshaltekammer, welche in Verbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses angeordnet ist, und Mittel zur Flüssigkeitsauswahl und Verteilung in Verbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses zum variablen Auswählen einer Menge der Flüssigkeit, welche innerhalb der Flüssigkeitshaltekammern der Vesikel enthalten ist, um aus einem einzelnen Satz der Vielzahl von Flüssigkeitsübertragungsvesikeln verteilt zu werden. Entsprechend verteilt das Mittel zum Verteilen eine ausgewählte Menge der Flüssigkeit in die Vertiefungen des Substrats mit mehreren Vertiefungen, wenn die Vorrichtung über und in Deckung mit dem Substrat angeordnet ist.
Von einer Verwendung im Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist eine Flüssigkeit verteilende Vorrichtung zum Verteilen von Flüssigkeit in chemischen oder biologischen Arbeitsschritten in eine oder mehrere Vertiefungen eines Substrats mit vielen Vertiefungen, umfassend ein Gehäuse mit einer Vielzahl von Seiten und oberen und unteren Teilen, wobei im unteren Teil eine Vielzahl von Öffnungen ausgebildet ist, wobei die Wände und die oberen und die unteren Teile des Gehäuses ein Innenvolumen definieren, eine Vielzahl von Flüssigkeitsübertragungsvesikeln, montiert innerhalb der Öffnungen, mit einer Flüssigkeitshaltekammer mit einer Größe um Nanovolumen an Flüssigkeit zu halten, wobei die Flüssigkeitshaltekammer in flüssiger Kommunikation mit dem Volumen des Gehäuses angeordnet ist, und einem mechanischen Vorspannelement zum mechanischen Vorspannen der Vielzahl an Flüssigkeitsübertragungsvesikeln in abdichtendem Kontakt mit dem unteren Teil des Gehäuses.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Probenmaterial auf einer Oberfläche eines Substrats, wie hierin beschrieben, umfassen die Schritte Bereitstellen eines Vesikels mit einer Innenkammer, welche eine Flüssigkeit enthält, Anordnen des Vesikels neben einer ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats, Steuern des Gefäßes zur Lieferung eines Nanolitervolumens einer Flüssigkeit an die erste Stelle der Oberfläche des Substrats und Bewegen des Vesikels zu einer Gruppe von Positionen neben der Oberfläche des Substrats, wobei Flüssigkeit an jeder Stelle der Gruppe der Positionen zur Bildung eines Arrays von Probenmaterial verteilt wird.
Substrate, welche während der hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Probenmaterial verwendet werden, können flache Oberflächen zum Aufnehmen des Probenmaterials umfassen, ebenso wie Oberflächen, welche auf der Oberfläche gebildete Vertiefungen enthalten zur Definition von Stellen zum Aufnehmen der Flüssigkeit, welche aus den Kammern der Vesikel ausgestoßen werden kann. Solche Substrate können sowohl Silicium bzw. Silikon, Metall, Kunststoff, eine Membran, polymeres Material, ein Metallgepfropftes Polymer sein, als auch ein Substrat, welches chemisch funktionalisiert, mit Beads funktionalisiert oder mit Dendritenästen eines Auffangmaterials funktionalisiert ist, oder beliebige Kombinationen der obigen oder anderer ähnlich geeigneter Materialien zum Aufnehmen der verteilten Flüssigkeit.
Es ist verständlich, dass in den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren zur Herstellung eines Arrays von Probenmaterial auf einer Substratoberfläche die Vorrichtung sowohl ein Analytmaterial als auch ein Trägermaterial verteilen kann, wie beispielsweise ein Matrixmaterial, welches die Analyse des Analyten unterstützt. Zu diesem Zweck können die hierin bereitgestellten Verfahren die Schritte Auftragen eines Matrixmaterials auf die Oberfläche des Substrats umfassen. Weiterhin können die Verfahren auch einen Schritt Warten für einen vorbestimmten Zeitraum umfassen, um so zu ermöglichen, dass ein Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampft. Wenn das Lösungsmittel des Matrixmaterials verdampft ist, können die vorliegenden Verfahren einen Schritt Ausstoßen eines Volumens der Analytflüssigkeit in das verdampfte Matrixmaterial zur Lösung mit der Matrix und zur Bildung einer kristallinen Struktur auf der Substratoberfläche umfassen. Es ist verständlich, dass dieser Schritt Wiederlösen des Matrixmaterials mit dem Analytmaterial die Analyse der Zusammensetzung des Materials während bestimmter analytischen Verfahren, wie etwa einer Massenspektrometrie unterstützt.
In einer alternativen Betriebsform können die vorliegenden Verfahren den Schritt Verteilen eines Gemischs umfassen, welches aus dem Analytmaterial und dem Matrixmaterial besteht, ebenso wie andere Materialzusammensetzungen. Auf diese Art und Weise werden die Matrix und der Analyt auf die Oberfläche des Substrats als ein Materialvolumen zugeführt. In einem weiteren Schritt können die hergestellten Arrays an Probenmaterials bereitgestellt werden als ein diagnostisches Werkzeug zur Bestimmung der Information, welche für die Zusammensetzung des Probenmaterials repräsentativ ist.
Ein solches diagnostisches Werkzeug kann ein Massenspektrometer umfassen. Die Massenspektrometer können Flugzeit-Massenspektrometer, Fourier-Transformations-Massenspektrometer oder ein beliebiger anderer geeigneter Typ eines Massenspektrometers sein, welcher die Analyse der Zusammensetzung des Probenarrays ermöglicht.
In einer Betriebsform der Verfahren umfasst der Schritt Bereitstellen eines Vesikels mit einer Innenkammer das Bereitstellen eines Vesikels mit einem piezoelektrischen Element, welches das Austreten der Flüssigkeit aus der Kammer bewirkt. Dieses Verfahren kann auch den Schritt des Bewegens des Vesikels durch Rastern des Vesikels über die Oberfläche des Substrats umfassen, um den Array des Probenmaterials zu bilden.
In einer alternativen Betriebsform der Verfahren können parallele Bearbeitungsprotokolle verwendet werden, worin das während der Bearbeitung verwendete Vesikel eine Vesikelanordnung umfasst, wobei eine Vielzahl von Vesikeln in einer Matrix angeordnet sind zur Verteilung von Flüssigkeit an eine erste Vielzahl von Stellen auf der Substratoberfläche. Auf diese Art und Weise stellt das Verfahren in einem einzigen Vorgang die Bildung einer Matrix aus Probenmaterial auf der Substratoberfläche bereit. Es kann auch Offset-Druck verwendet werden, um eine große Matrix des Probenmaterials zu bilden, durch Verwenden mehrerer Druckschritte mit der Vesikelmatrix. Andere Drucktechniken können erfindungsgemäß verwendet werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
In einer anderen Ausführungsform kann die Flüssigkeit auf die Oberfläche des Substrats verteilt werden durch Inkontaktbringen des Vesikels mit der Oberfläche des Substrats, um die Oberfläche des Substrats mit Probenmaterial zu betupfen. Alternativ stellen die Verfahren einen anderen Druckansatz ohne Kontakt bereit, worin die erfindungsgemäßen Verfahren bewirken, dass ein Flüssigkeitstropfen am distalen Ende des Vesikels gebildet wird. Es ist der Flüssigkeitstropfen, welcher mit der Oberfläche des Substrats in Kontakt gebracht wird zum Zuführen von Probenmaterial auf die Oberfläche des Substrats. Dies stellt eine kontrollierte Bereitstellung des bekannten Flüssigkeitsvolumens bereit, ohne dass sich ein Kontakt des Vesikels mit der Oberfläche des Substrats ergibt.
In weiteren Ausführungsformen werden Vesikel beschrieben mit einer Innenkammer, welche räumlich so angepasst ist, dass ein Füllen der Kammer durch Kapillarwirkung ermöglicht wird.
Die oben beschriebenen Merkmale und Vorteile sowie weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Figuren, der ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen deutlicher.
Definitionen
Soweit nicht anders derfiniert, besitzen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftliche Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen von einem Fachmann des Fachgebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Nukleinsäure" sowohl auf Oligonukleotide oder Polynukleotide wie etwa Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) als auch auf Analoga von entweder RNA oder DNA, beispielsweise hergestellt aus Nukleotidanaloga, wobei jedes davon in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegt. Nukleinsäuremoleküle können synthetisch sein oder können aus einer bestimmten biologischen Probe isoliert sein unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren, welche im Fachgebiet bekannt sind, wobei das betreffende ausgewählte Verfahren für die betreffende biologische Probe geeignet ist.
Wie hierin verwendet, umfassen Nukleotide Nukleosidmono-, -di- und -triphosphate. Nukleotide umfassen auch modifizierte Nukleotide wie etwa Phosphorothioatnukleotide und Deazapurinnukleotide. Ein vollständiger Satz von Ketten-verlängernden Nukleotiden bezieht sich auf vier unterschiedliche Nukleotide, welche jeweils mit einer der vier unterschiedlichen Basen, welche das DNA-Templat umfasst, hybridisieren können.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Nukleinsäuresynthese auf ein beliebiges Verfahren, in dem Oligonukleotide oder Polynukleotide erzeugt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Verfahren, welche chemische oder enzymatische Reaktionen betreffen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Array" auf eine geordnete Anordnung von Mitgliedern oder Positionen. Der Array kann eine beliebige Anzahl von Mitgliedern oder Positionen enthalten und kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Array zweidimensional und enthält n × m Mitglieder, worin m und n ganze Zahlen sind, welche gleich oder verschieden sein können. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind n und m jeweils 4 oder ein Vielfaches davon.
Der Begriff "Vernetzungsmittel" ist im Fachgebiet bekannt, und bezieht sich, wie hierin verwendet, auf Reagenzien, welche eine Nukleinsäure an einen unlöslichen Träger immobilisieren können, bevorzugt durch kovalente Bindungen. Folglich umfassen geeignete "Vernetzungsmittel" für die Verwendung hierin eine Vielzahl von Mitteln, welche mit einer funktionellen Gruppe reagieren können, die auf einer Oberfläche des unlöslichen Trägers vorliegt, und mit einer funktionellen Gruppe, welche im Nukleinsäuremolekül vorhanden ist. Reagenzien, welche zu solch einer Reaktion fähig sind, umfassen homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, wovon viele im Fachgebiet bekannt sind. Heterobifunktionelle Reagenzien sind bevorzugt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Thiol-reaktive Funktionalität" auf eine Funktionalität, welche zu einer schnellen Reaktion mit einer nukleophilen Thiolkomponente fähig ist, um eine kovalente Bindung zu bilden (z.B. eine Disulfid- oder Thioetherbindung). Im Allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nukleophile, und bevorzugte Thiol-reaktive Funktionalitäten sind reaktive Elektrophile. Eine Vielzahl von Thiol-reaktiven Funktionalitäten sind im Fachgebiet bekannt und umfassen beispielsweise Halogenacetyle (bevorzugt Jodacetyl), Diazoketone, Epoxyketone, α,β-ungesättigte Carbonyle (z.B. α,β-Enone) und andere reaktive Michael-Akzeptoren (einschließlich Maleimid), saure Halogenide, Benzylhalogenide und dergleichen. In bestimmten Ausführungsformen kann eine freie Thiolgruppe eines Disulfids mit einer freien Thiolgruppe (d.h. durch Bildung einer Disulfidbindung, einschließlich durch Disulfidaustausch) reagieren. Ein "Thiol-reaktives" Vernetzungsmittel wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Vernetzungsmittel (oder Oberfläche), welche mindestes eine Thiol-reaktive Funktionalität enthält, oder so modifiziert werden kann, dass sie eine enthält. Es ist verständlich, dass eine Reaktion einer Thiolgruppe vorübergehend verhindert werden kann durch Blockieren mit einer geeigneten Schutzgruppe, wie es im Fachgebiet üblich ist (siehe z.B. T.W. Greene and P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", zweite Auflage, John Wiley & Sons, (1991)).
Wie hierin verwendet, ist ein selektiv spaltbarer Linker ein Linker, welcher unter ausgewählten Bedingungen gespalten wird, wie etwa ein photospaltbarer Linker, ein chemisch spaltbarer Linker und ein enzymatisch spaltbarer Linker (d.h. eine Restriktionsendonukleasestelle oder ein Ribonukleotid/RNase-Verdau). Der Linker ist zwischen den Träger und die immobilisierte DNA eingebracht.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe "Protein", "Polypeptid" und "Peptid" austauschbar verwendet, wenn sie sich auf eine translatierte Nukleinsäure (z.B. ein Genprodukt) beziehen.
Wie hierin verwendet, soll sich der Begriff "Probe" auf eine Zusammensetzung beziehen, welche ein nachzuweisendes Material enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine "biologische Probe" (d.h. ein beliebiges Material, welches aus einer lebenden Quelle erhalten wird, z.B. Mensch, Tier, Pflanze, Bakterium, Pilz, Einzeller, Virus). Die biologische Probe kann in beliebiger Form vorliegen, einschließlich fester Materialien (z.B. Gewebe, Zellpellets und Biopsien) und biologischer Flüssigkeiten (z.B. Urin, Blut, Speichel, Amnionflüssigkeit und Mundwasser (welches Wangenzellen enthält)). Bevorzugt werden feste Materialien mit einer Flüssigkeit gemischt.
Wie hierin verwendet, soll "Substrat" einen unlöslichen Träger bedeuten, auf welchen eine Probe aufgebracht wird, gemäß den hierin beschriebenen Materialien. Beispiele für geeignete Substrate umfassen Beads (z.B. Silikagel, pöroses Glasmaterial („controlled pore glass"), Magnetwerkstoffe, Sephadex^®/Sepharose^®), Cellulose), Kapillaren, flache Träger, wie etwa Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium), Plastikmaterialien einschließlich Platten mit mehreren Vertiefungen oder Membranen (z.B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Stifte (z.B. Arrays von Stiften, welche für eine kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind oder Beads in Vertiefungen von flachen Oberflächen wie etwa Wafer (z.B. Silikonwafer) mit oder ohne Platten.
In den besonderen Verfahren zum Immobilisieren von Nukleinsäuren an ein hierin bereitgestelltes Substrat sind bevorzugte Substrate diejenigen Substrate, welche eine Bindung von Nukleinsäuren in hohen Dichten auf das Substrat unterstützen können, bevorzugt so, dass die kovalent gebundenen Nukleinsäuren auf dem Substrat mit einer Dichte von mindestes etwa 20 fmol/mm², mehr bevorzugt mindestens etwa 75 fmol/mm², noch mehr bevorzugt mindestens etwa 85 fmol/mm², noch mehr bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm² und am meisten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm² vorliegen. Unter den am meisten bevorzugten Substraten zur Verwendung in den bestimmten Verfahren zum Immobilisieren von Nukleinsäuren an Substrate, welche hierin bereitgestellt werden, ist Silicium, wohingegen weniger bevorzugte Substrate polymere Materialien wie etwa Polyacrylamid umfassen. Substrate zur Verwendung in den hierin bereitgestellten Verfahren zum Herstellen von Arrays umfassen beliebige einer breiten Vielzahl von unlöslichen Trägermaterialien einschließlich, aber nicht beschränkt auf Silikagel, pöroses Glasmaterial („controlled pore glass"), Cellulose, Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Plastikmaterialien (z.B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyacrylamid, Polyvinylidendifluorid) und Silicium.
Hochdichte Immobilisierung von Nukleinsäuren an feste Träger
Die hierin beschriebenen Verfahren stellen eine Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen in einer hohen Dichte auf einem unlöslichen (z.B. festen) Träger bereit. Im Allgemeinen werden Nukleinsäuremoleküle auf dem unlöslichen Träger entweder direkt oder durch Vernetzungsmittel immobilisiert.
In Ausführungsformen der Verfahren, bei welchen kein Vernetzungsmittel verwendet wird, wird eine modifizierte Nukleinsäure direkt mit einer auf geeignete Art und Weise funktionalisierten Fläche umgesetzt, um eine immobilisierte Nukleinsäure zu erhalten. Folglich kann beispielsweise eine mit Jodacetyl (oder einer anderen Thiol-reaktive Oberflächenfunktionalität) modifizierte Fläche mit einer Thiol-modifizierten Nukleinsäure reagieren, um immobilisierte Nukleinsäuren bereitzustellen.
In Übereinstimmung mit den hierin bereitgestellten Verfahren wird das Vernetzungsmittel so ausgewählt, dass eine hohe Dichte der immobilisierten Nukleinsäuren auf dem unlöslichen Träger bereitgestellt wird. Ohne sich darauf festzulegen, wird angenommen, dass die hierin beschriebene hohe Dichte der immobilisierten Nukleinsäuren zumindest teilweise auf eine relativ schnelle Reaktion zurückzuführen ist, welche zwischen dem Vernetzungsmittel und der Nukleinsäure (z.B. einer Thiol-modifizierten Nukleinsäure) auftritt, im Vergleich mit anderen zuvor verwendeten Reaktionen zur Immobilisierung von Nukleinsäuren. Außerdem kann die hohe Dichte zumindest teilweise zurückzuführen sein auf einen nahen Abstand der reaktiven Gruppen (z.B. Aminogruppen einer anderen reaktiven Funktionalität) auf dem funktionalisierten unlöslichen Träger. Folglich werden die Reagenzien zum Modifizieren der Oberfläche im Allgemeinen so ausgewählt, dass eng benachbarte Funktionalitäten auf dem funktionalisierten Träger bereitgestellt werden. Das Vernetzungsmittel (und andere Reagenzien, welche zur Funktionalisierung der Trägeroberfläche oder des Nukleinsäuremoleküls verwendet werden) kann so ausgewählt werden, dass ein beliebiger gewünschter Abstand der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle von der Trägeroberfläche bereitgestellt wird, und dass ein beliebiger gewünschter Abstand der immobilisierten Nukleinsäuren voneinander bereitgestellt wird. Folglich kann die sterische Behinderung der Nukleinsäuremoleküle verringert oder beseitigt werden durch die Auswahl eines geeigneten Vernetzungsmittels. In bestimmten Ausführungsformen kann das Vernetzungsmittel so ausgewählt werden, dass mehrfache reaktive Funktionalitäten bereitgestellt werden, wie es beispielsweise bei der Dendrimersynthese zum Anheften von mehreren Nukleinsäuren an eine einzelne Vernetzungseinheit verwendet wird. Bevorzugt wird das Vernetzungsmittel so ausgewählt, dass es mit dem Nukleinsäuremolekül höchst reaktiv ist, um eine schnelle, vollständige und/oder selektive Reaktion bereitzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reaktionsvolumen der Reagenzien (z.B. der Thiolgruppe und der Thiol-reaktiven Funktionalität) klein.
Nukleinsäuren und Linker
Bevorzugte Nukleinsäuren zur Verwendung hierin sind "Thiol-modifizierte Nukleinsäuren", d.h. Nukleinsäuren, welche so derivatisiert sind, dass sie mindestens eine reaktive Thiolkomponente enthalten. Wie es ausführlicher in Beispiel 1 weiter unten beschrieben wird, werden Nukleinsäuren, welche mindestens ein reaktives Thiol enthalten, bevorzugt hergestellt durch Behandeln einer Nukleinsäure, welche ein 3'- oder 5'-Disulfid enthält, mit einem Reduktionsmittel, welches bevorzugt bei den nachfolgenden Reaktionen nicht konkuriert, (d.h. nicht mit einer Jodacetimidofunktionalität reagieren wird). Disulfid-derivatisierte Nukleinsäuren können synthetisiert werden durch eine Vielzahl von Verfahren. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure am 3'- oder 5'-Terminus modifiziert werden durch Reaktion mit einem Disulfid-haltigen modifizierenden Mittel. Alternativ kann ein mit Thiol behandelter Primer enzymatisch oder nicht enzymatisch an die Nukleinsäure angeheftet werden. Eine 5'-Phosphoramidatfunktionalität kann ebenso einen Anheftungspunkt für ein Thiol- oder ein Disulfid-haltiges Cytosin oder Desoxycytosin bereitstellen. Beispiele für Reduktionsmittel, welche für eine Reduktion einer Disulfid-modifizierten Nukleinsäure geeignet sind, umfassen: Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 1 bis 100 mM (am meisten bevorzugt etwa 10 mM)) wird bei einem pH im Bereich von 3 bis 6 (am meisten bevorzugt etwa 4,5), einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45°C (am meisten bevorzugt etwa 37°C) für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Stunden (am meisten bevorzugt für ungefähr 5 Stunden) umgesetzt; Dithiotreitol (bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 25 bis 100 mM (in Abhängigkeit davon, ob der Reaktionspartner isoliert wird) wird bei einem pH im Bereich von 6 bis 10 (am meisten bevorzugt etwa 8) und einer Temperatur im Bereich von 25 bis 45°C (am meisten bevorzugt etwa 37°C)) für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 1 bis 10 Stunden (am meisten bevorzugt etwa 5 Stunden) umgesetzt. TCEP stellt einen Vorteil im niedrigen pH-Bereich bereit, bei welchem es reaktiv ist. Dieser geringe pH protoniert Thiole auf wirksame Art, wobei nukleophile Reaktionen der Thiole unterdrückt werden und wobei weniger Nebenreaktionen erhalten werden als mit anderen Disulfidreduktionsmitteln, welche bei höherem pH verwendet werden.
Wie weiterhin in Beispiel 1 weiter unten beschrieben wird, ist ein bevorzugtes bifunktionelles Vernetzungsmittel N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (SIAB). Andere Vernetzungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Dimaleimid, Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiolpropionat) (SPDP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und 6-Hydrazinonicotinamid (HYNIC) kann auch in dem neuen Verfahren verwendet werden. Für weitere Beispiele für Vernetzungsmittel siehe z.B. Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991) und Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press (1995).
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nukleinsäure immobilisiert unter Verwendung der photospaltbaren Linkerkomponente, welche während der Massenspektrometrie gespalten wird. Beispielhafte photolabile Vernetzer umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 3-Amino-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al. (1995) Molecular Diversity, Seiten 4-12 und Rothschild et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 361-66).
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einer Zielnukleinsäuresequenz, welche hierin bereitgestellt werden, und Verfahren zur Immobilisierung, wird eine einzelsträngige Nukleinsäure, welche zur Zielnukleinsäure komplementär ist, auf einer Oberfläche durch eine Verbindung immobilisiert, welche eine Bindung zwischen einer Thiolgruppe und Thiol-reaktiver Funktionalität und eine spaltbare, bevorzugt eine selektiv spaltbare Linkerkomponente umfasst.
Linker
Eine als Zielstruktur gesetzte Nachweisstelle kann über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') am Zielnukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) am Einfangmolekül direkt mit einem festen Träger verbunden sein. Eine reversible Bindung kann derart sein, dass sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten wird (d.h. eine photospaltbare Bindung wie etwa ein Ladungsübertragungs-Komplex oder eine labile Bindung, welche zwischen relativ stabilen organischen Radikalen gebildet wird).
Photospaltbare Linker sind Linker, welche bei Exposition gegenüber Licht gespalten werden (siehe z.B. Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107), wobei das als Zielstruktur gesetzte Mittel bei Exposition gegenüber Licht freigesetzt wird. Es sind photospaltbare Linker bekannt, welche bei Exposition gegenüber Licht gespalten werden, (siehe z.B. Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16., Brunfeldt, K. (Hrsg.), Seiten 105-110, welche die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschreiben; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69-82, welche wasserlösliche photospaltbare Copolymere beschreiben, einschließlich Hydroxypropylmethacrylamid-Copolymer, Glycin-Copolymer, Fluorescein-Copolymer und Methylrhodamin-Copolymer; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, welche ein Vernetzungsmittel und ein Reagenz beschreiben, welches bei Exposition gegenüber Licht nahe des UV-Bereichs (350 nm) eine photolytische Degradation durchläuft; und Senter et al. (1985) Photochem. Photobil. 42: 231-237, welche Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Vernetzungsmittel beschreiben, welche photospaltbare Verbindungen erzeugen), wobei das als Zielstruktur gesetzte Mittel bei Exposition gegenüber Licht freigesetzt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nukleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linkerkomponente, welche während der Massenspektrometrie gespalten wird, immobilisiert.
Weiterhin kann die Bindung gebildet werden, wobei L' eine quartäre Ammoniumgruppe ist, in diesem Fall trägt die Fläche des festen Trägers bevorzugt negative Ladungen, welche das negativ geladene Nukleinsäurerückgrat abstossen und folglich die Desorption erleichtern, welche für die Analyse mittels Massenspektrometer erforderlich ist. Die Desorption kann entweder durch die durch den Laserimpuls erzeugte Hitze und/oder in Abhängigkeit von L' durch spezifische Absorption der Laserenergie auftreten, welche in Resonanz mit dem L'-Chromophor ist.
Folglich kann die L-L'-Chemie eine Art einer Disulfidbindung (chemisch spaltbar, beispielsweise durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), ein Biotin/Streptavidin-System, ein heterobifunktionelles Derivat einer Tritylethergruppe (siehe z.B. Köster et al. (1990) "A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters 31: 7095), welches unter milden sauren Bedingungen ebenso wie unter den Bedingungen einer Massenspektrometrie gespalten werden kann, eine Levulinylgruppe, welche unter fast neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetat-Puffer spaltbar ist, eine Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Bindung, welche durch ein Endopeptidaseenzym wie etwa Trypsin spaltbar ist, oder eine Pyrophosphatbindung, welche durch eine Pyrophosphatase spaltbar ist, oder eine Ribonukleotidbindung in zwischen der Oligonukleotidsequenz, welche beispielsweise durch eine Ribonuklease oder Alkali gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L' können auch einen Ladungsübertragungs-Komplex bilden und dabei die temporäre L-L'-Bindung bilden. Da in vielen Fällen das "Ladungsübertragungs-Band" durch UV/VIS-Spektrometrie nachgewiesen werden kann (siehe z.B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Ladungsübertragungs-Wellenlänge abgestimmt werden und folglich kann eine spezifische Desorption vom festen Träger weg initiiert werden. Fachleute werden erkennen, dass mehrere Kombinationen diesem Zweck dienen können und dass sich die Donorfunktionalität entweder am festen Träger befinden kann, oder an das nachzuweisende Nukleinsäuremolekül gekoppelt sein kann oder umgekehrt.
In noch einem anderen Ansatz kann durch homolytisches Bilden von relativ stabilen Radikalen eine reversible L-L'-Bindung erzeugt werden. Unter dem Einfluss des Laserimpulses findet eine Desorption (wie oben beschrieben) ebenso wie eine Ionisation an der Radikalposition statt. Fachleute werden erkennen, dass andere organische Radikale ausgewählt werden können und dass in Verbindung mit den Dissoziationsenergien, welche für eine homolytische Spaltung der Bindung zwischen ihnen benötigten werden, eine entsprechende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z.B. Reactive Molecules von C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
Beim Durchführen einer Exonukleasesequenzierung unter Verwendung einer MALDI-TOF MS wird ein einzelsträngiges DNA-Molekül, welches über sein 5-Ende an einen festen Träger immobilisiert ist, einseitig mit einer schrittweise arbeitenden 3'-Exonuklease abgebaut und das Molekulargewicht des abgebauten Nukleotids wird sequenziell bestimmt. Eine reverse Sänger-Sequenzierung ergibt die Nukleotidsequenz der immobilisierten DNA. Durch Zufügen eines selektiv spaltbaren Linkers kann nicht nur die Masse der freien Nukleotide bestimmt werden, sondern es kann auch beim Entfernen der Nukleotide durch Waschen die Masse des verbleibenden Fragments nachgewiesen werden mittels MALDI-TOF beim Spalten der DNA vom festen Träger. Unter Verwendung von selektiv spaltbaren Linkern wie etwa die hierin bereitgestellten photospaltbaren und chemisch spaltbaren Linker kann diese Spaltung so gewählt werden, dass sie während der Schritte Ionisation und Verdampfung der MALDI-TOF auftritt.
Die gleichen Hintergründe treffen bei einem 5'-immobilisierten Strang einer doppelsträngigen DNA zu, welche abgebaut wird, während sie als Duplex vorliegt. Ebenso trifft dies auch zu, wenn eine schrittweise arbeitende 5'-Exonuklease verwendet wird und die DNA durch das 3'-Ende an den festen Träger immobilisiert ist.
Wie angemerkt, werden hierin mindestens drei Versionen der Immobilisierung in Erwägung gezogen: 1) Die Zielnukleinsäure wird amplifiziert oder erhalten (die Zielsequenz oder umgebende DNA-Sequenz muss bekannt sein, um Primer zur Amplifikation oder Isolierung herzustellen); 2) Die Primernukleinsäure wird an den festen Träger immobilisiert und die Zielnukleinsäure wird daran hybridisiert (dies wird verwendet zum Nachweis der Anwesenheit einer Zielsequenz in einer Probe oder zum Sequenzieren einer Zielsequenz in einer Probe); oder 3) Eine doppelsträngige DNA (amplifiziert oder isoliert) wird durch eine Bindung an einen vorher bestimmten Strang immobilisiert, die DNA wird denaturiert, um den Duplex zu beseitigen und dann wird eine hohe Konzentration eines komplementären Primers oder DNA mit einem identischen Bereich stromaufwärts von der Zielstelle zugegeben und es tritt ein Austausch des Strangs auf, und der Primer wird an den immobilisierten Strang hybridisiert.
In den Ausführungsformen, bei denen die Primernukleinsäure an den festen Träger immobilisiert wird und die Zielnukleinsäure daran hybridisiert wird, ermöglicht der Einschluss des spaltbaren Linkers, dass die Primer-DNA am 5'-Ende immobilisiert wird, sodass das freie 3'-OH für die Nukleinsäuresynthese (Verlängerung) verfügbar sind und die Sequenz der "hybridisierten" Ziel-DNA bestimmt werden kann, da das hybridisierte Templat durch Denaturierung entfernt werden kann und die verlängerten DNA-Produkte von dem festen Träger für eine MALDI-TOF MS abgespalten werden können. In ähnlicher Weise kann für 3) der immobilisierte DNA-Strang verlängert werden, wenn er mit dem Templat hybridisiert ist und vom Träger gespalten werden. Somit können die Verlängerungsreaktionen der Sänger-Sequenzierung und "primer oligo base extension" (PROBE), weiter unten erläutert, durchgeführt werden unter Verwendung eines immobilisierten Primers für eine bekannte, stromaufwärts liegende DNA-Sequenz, welche zu einer nicht variablen Region einer Zielsequenz komplementär ist. Die Nukleinsäure von der Person wird erhalten und die DNA-Sequenz einer variablen Region (Deletion, Insertion, „Missense"-Mutation, welche eine genetische Veranlagung oder Erkrankungen verursacht, oder das Vorliegen von viraler/bakterieller oder Pilz-DNA) wird nicht nur nachgewiesen, sondern es wird auch die tatsächliche Sequenz und Position der Mutation bestimmt.
In anderen Fällen muss die Ziel-DNA immobilisiert sein und der Primer wird angeheftet. Dies erfordert das Amplifizieren einer größeren DNA basierend auf einer bekannten Sequenz und anschließend das Sequenzieren der immobilisierten Fragmente (d.h. die verlängerten Fragmente werden hybridisiert, aber nicht wie oben beschrieben an den Träger immobilisiert). In diesen Fällen ist es nicht erwünscht, einen Linker einzubringen, da das MALDI-TOF -Spektrum das der hybridisierten DNA ist; es ist nicht nötig, das immobilisierte Templat zu spalten.
Hierin kann jeder beliebige Linker, welcher Fachleuten zum Immobilisieren von Nukleinsäuren an einen festen Träger bekannt ist, verwendet werden, um die Nukleinsäure an einen festen Träger zu binden. Die bevorzugten Linker sind hierin die selektiv spaltbaren Linker, insbesondere diejenigen, welche hierin beispielhaft erläutert werden. Andere Linker umfassen Säure-spaltbare Linker, wie etwa Bismaleimideothoxypropan, Säure-labile Trityllinker.
Säure-spaltbare Linker, photospaltbare und wärmeempfindliche Linker können auch verwendet werden, insbesondere wenn es notwendig sein kann, das als Zielstruktur gesetzte Mittel zu spalten, um zu ermöglichen, dass es für die Reaktion leichter zugänglich ist.
Säure-spaltbare Linker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Bismaleimideothoxypropan und Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z.B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589) und Säure-labile Transferrinkonjugate, welche eine Transferrinkomponente enthalten, die ausreicht, dass das Eintreten in den intrazellulären Transferrinzyklusstoffwechselweg ermöglicht wird (siehe z.B. Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314).
Photospaltbare Linker
Es werden photospaltbare Linker bereitgestellt. Insbesondere werden photospaltbare Linker als ihre Phosphoramiditderivate bereitgestellt zur Verwendung bei der Festphasensynthese von Oligonukleotiden. Die Linker enthalten o-Nitrobenzylkomponenten und Phosphatbindungen, welche eine vollständige photolytische Spaltung der Konjugate innerhalb von Minuten bei UV-Bestrahlung ermöglichen. Die verwendeten UV-Wellenlängen werden so ausgewählt, dass die Bestrahlung die Oligonukleotide nicht schädigt und betragen bevorzugt etwa 350 bis 380 nm, mehr bevorzugt 365 nm. Die hierin bereitgestellten photospaltbaren Linker besitzen im Vergleich zu gewöhnlich verwendeten Phosphoramiditmonomeren vergleichbare Kopplungseffizienzen (siehe Sinha et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24: 5843-5846; Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 4539-4557; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49: 6123-6194; und Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191).
In einer Ausführungsform, besitzen die photospaltbaren Linker die Formel I:
worin R²⁰ ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl oder ω-Hydroxyalkyl ist; R²¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy; R²² Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; t 0 bis 3 ist und R⁵⁰ Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die photospaltbaren Linker die Formel II:
worin R²⁰ ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl, ω-Hydroxyalkyl oder Alkyl ist; R²¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy; R²² Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; und X²⁰ Wasserstoff, Alkyl oder OR²⁰ ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R²⁰ 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 3-Hydroxypropyl oder Methyl; R²¹ ist ausgewählt aus Wasserstoff, Methyl und Carboxy; R²² ist Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X²⁰ ist Wasserstoff, Methyl oder OR²⁰. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist R²⁰ 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl; R²¹ ist Methyl; R²² ist (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X²⁰ ist Wasserstoff. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist R²⁰ Methyl; R²¹ ist Methyl; R²² ist (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X²⁰ ist 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
In einer anderen Ausführungsform besitzen die photospaltbaren Linker die Formel III:
worin R²³ Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; und R²⁴ ausgewählt ist aus ω-Hydroxyalkoxy, ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkoxy, ω-Hydroxyalkyl und ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl, und an der Alkyl- oder Alkoxykette nicht substituiert ist oder substituiert ist mit einer oder mehreren Alkylgruppen; r und s jeweils unabhängig 0 bis 4 sind und R⁵⁰ Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist. In bestimmten Ausführungsformen ist R²⁴ ω-Hydroxyalkyl oder ω- (4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl und ist an der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist R²³ Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und R²⁴ ist ausgewählt aus 3-Hydroxypropoxy, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-Hydroxybutyl, 3-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-propyl, 3-Hydroxy-2-methyl-1-propyl, 2-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-1-propyl; 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytriyloxy)-2-methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl.
In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist R²³ (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; r und s sind 0; und R²⁴ ist ausgewählt aus 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytriyloxy)-2-methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl. R²⁴ ist am stärksten bevorzugt 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
Herstellung von photospaltbaren Linkern
A. Herstellung von photospaltbaren Linkern mit den Formeln I oder II
Photospaltbare Linker mit den Formel I oder II können hergestellt werden durch die weiter unten beschriebenen Verfahren, durch eine kleinere Modifikation der Verfahren, durch Auswahl der geeigneten Ausgangsmaterialien oder durch beliebige andere Verfahren, welche Fachleuten bekannt sind.
Bei den photospaltbaren Linkern mit der Formel II, worin X²⁰ Wasserstoff ist, können die Linker auf die folgende Art und Weise hergestellt werden. Alkylierung von 5-Hyddroxy-2-nitrobenzaldehyd mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, z.B. 3-Hydroxypropylbromid, gefolgt vom Schützen des resultierenden Alkohols beispielsweise als ein Silylether, stellt ein 5-(ω-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd bereit. Die Zugabe einer organometallischen Verbindung zum Aldehyd ergibt einen benzylischen Alkohol. Organometalle, welche verwendet werden können, umfassen Trialkylaluminium-Verbindungen (bei Linkern, bei denen R²¹ Alkyl ist) wie etwa Trimethylaluminium, Borhydride (bei Linkern, bei denen R²¹ Wasserstoff ist) wie etwa Natriumborhydrid, oder Metallcyanide (bei Linkern, bei denen R²¹ Carboxy oder Alkoxycarbonyl ist) wie etwa Kaliumcyanid. Im Falle der Metallcyanide wird das Produkt der Reaktion, ein Cyanohydrin, dann hydrolysiert, um die gewünschten Verbindungen zu erhalten, entweder unter sauren oder basischen Bedingungen, in Gegenwart entweder von Wasser oder eines Alkohols.
Die Silylgruppe der Seitenkette der resultierenden benzylischen Alkohole kann dann durch Desilyierung beispielsweise mit Tetrabutylammoniumfluorid gegen eine 4,4'-Dimethoxytriylgruppe ausgetauscht werden, um den entsprechenden Alkohol zu erhalten, gefolgt von einer Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Die Reaktion beispielsweise mit 2-Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit ergibt die Linker, bei denen R²² (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel für eine Synthese eines photospaltbaren Linkers mit der Formel II wird im folgenden Schema gezeigt, welches auch die Verwendung des Linkers bei der Oligonukleotidsynthese demonstriert. Dieses Schema soll lediglich veranschaulichen und auf keine Weise den Umfang der Erfindung beschränken. Experimentelle Einzelheiten dieser synthetischen Umwandlungen werden in den Beispielen bereitgestellt.
Bei der Synthese der Linker mit der Formel II, worin X²⁰ OR²⁰ ist, wird 3,4-Dihydroxyacetophenon selektiv am 4-Hydroxyl geschützt durch Reaktion beispielsweise mit Kaliumcarbonat und einem Silylchlorid. Anstelle des Acetophenons können Benzoatester, Propiophenone, Butyrophenone usw. verwendet werden. Das resultierende 4-Silyloxy-3-hydroxyacetophenon wird dann mit einem Alkylhalogenid (bei Linkern, bei denen R²⁰ Alkyl ist) am 3-Hydroxyl alkyliert und beispielsweise mit Tetrabutylammoniumfluorid desilyliert, um 3-Alkoxy-4-hydroxyacetophenon zu erhalten. Diese Verbindung wird dann am 4-Hydroxyl durch Reaktion mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, z.B. 3-Hydroxypropylbromid alkyliert, um ein 4-(ω-Hydroxyalkoxy)-3-alkoxyacetophenon zu ergeben. Der Seitenkettenalkohol wird dann geschützt als ein Ester, z.B. ein Acetat. Diese Verbindung wird dann an der 5-Position beispielsweise mit konzentrierter Salpetersäure nitriert, um die entsprechenden 2-Nitroacetophenone bereitzustellen. Die Verseifung des Seitenkettenesters beispielsweise mit Kaliumcarbonat und die Reduktion des Ketons beispielsweise mit Natriumborhydrid in beliebiger Reihenfolge ergibt einen 2-Nitro-4-(ω-hydroxyalkoxy)-5-alkoxybenzyl-Alkohol.
Der selektive Schutz des Seitenkettenalkohols als entsprechender 4,4'-Dimethoxytritylether wird dann ausgeführt durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxtritylchlorid. Eine weitere Reaktion beispielsweise mit 2-Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit ergibt die Linker, bei denen R²² (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel der Synthese eines photospaltbaren Linkers mit der Formel II wird in dem folgenden Schema gezeigt. Dieses Schema soll lediglich eine Veranschaulichung sein und auf keinen Fall den Umfang der Erfindung beschränken. Ausführliche experimentelle Verfahren für die gezeigten Umwandlungen sind in den Beispielen zu finden.
B. Herstellung von photospaltbaren Linkern mit der Formel III
Photospaltbare Linker mit der Formel III können durch die weiter unten beschriebenen Verfahren hergestellt werden, durch kleinere Modifikationen der Verfahren, durch Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien oder durch andere Verfahren, welche Fachleuten bekannt sind.
Im Allgemeinen werden photospaltbare Linker mit der Formel III hergestellt aus ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyarylverbindungen, insbesondere ω-Hydroxyalkyl oder Alkoxybenzole. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich oder können aus einem ω-Hydroxyalkylhalogenid (z.B. 3-Hydroxypropylbromid) und entweder Phenyllithium (für die ω-Hydroxyalkylbenzole) oder Phenol (für die ω-Hydroxyalkoxybenzole) hergestellt werden. Die Acylierung der ω-Hydroxylgruppe (z.B. als ein Acetatester) gefolgt von einer Friedel-Craft-Acylierung des aromatischen Rings mit 2-Nitrobenzoylchlorid ergibt ein 4-(ω-Acetoxyalkyl oder alkoxy)-2-nitrobenzophenon. Die Reduktion des Ketons beispielsweise mit Natriumborhydrid und die Verseifung des Seitenkettenesters werden in beliebiger Reihenfolge durchgeführt, um ein 2-Nitrophenyl-4-(hydroxyalkyl oder -alkoxy)phenylmethanol zu erhalten. Der Schutz der terminalen Hydroxylgruppe als entsprechender 4,4'-Dimethoxytritylether wird erreicht durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Die benzylische Hydroxylgruppe wird dann beispielsweise mit 2-Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit umgesetzt, um Linker mit der Formel II zu erhalten, bei denen R²³ (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
Andere photospaltbare Linker mit der Formel III können hergestellt werden durch Substitution der ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxybenzole in der obigen Synthese mit 2-Phenyl-1-propanol oder 2-Phenylmethyl-1-propanol. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich, können aber auch durch Reaktion von beispielsweise Phenylmagnesiumbromid oder Benzylmagnesiumbromid mit dem erforderlichen Oxiran (d.h. Propylenoxid) in Gegenwart von katalytischen Kupferionen hergestellt werden.
Chemisch spaltbare Linker
Es kann eine Vielzahl von chemisch spaltbaren Linkern verwendet werden, um eine spaltbare Bindung zwischen der immobilisierten Nukleinsäure und dem festen Träger einzubringen. Säurespaltbare Linker sind gegenwärtig die bevorzugten chemisch spaltbaren Linker für eine Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF MS, da die säurelabile Bindung während der Vorbehandlung der Nukleinsäure bei der Zugabe der 3-HPA-Matrixlösung gespalten wird. Die säurelabile Bindung kann als eine getrennte Linkergruppe eingebracht werden, z.B. können die säurelabilen Tritylgruppen in einen synthetischen Nukleinsäurelinker eingefügt werden, durch Einbringen einer oder mehreren Silylinternukleosidbrücken unter Verwendung von Diisopropylsilyl, wobei durch Diisopropylsilyl verbundene Oligonukleotidanaloga gebildet werden. Die Diisopropylsilylbrücke ersetzt die Phosphodiesterbindung im DNA-Rückgrat und milde saure Bedingungen wie etwa 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/1% TFA MALDI-TOF-Matrixlösung, bewirken die Einführung von einem oder mehreren Zwischenstrangbrüchen im DNA-Molekül. Verfahren für die Herstellung von mit Diisopropylsilyl verbundenen Oligonukleotidvorläufern und Analoga sind Fachleuten bekannt (siehe z.B. Saha et al. (1993) J. Org. Chem. 58: 7827-7831). Diese Oligonukleotidanaloga können leicht hergestellt werden unter Verwendung von Oligonukleotidsyntheseverfahren im Festzustand unter Verwendung von mit Diisopropylsilyl derivatisierten Desoxyribonukleosiden.
Modifikationen der Masse von Nukleinsäuren
In bestimmten Ausführungsformen können Nukleinsäuren verwendet werden, welche an anderen Positionen als am 3'- oder 5'-Terminus modifiziert sind. Die Modifikation der Zuckerkomponente eines Nukleotids an anderen Positionen als der 3'- und 5'-Position ist möglich durch konventionelle Verfahren. Es können auch Nukleinsäurebasen modifiziert werden, z.B. durch Modifikation des C-5-Atoms von dT mit einem Linkerarm, beispielsweise wie es beschrieben wird von F. Eckstein, Hrsg., in "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach" IRL Press (1991). Solch ein Linkerarm kann so modifiziert werden, dass eine Thiolkomponente enthalten ist. Alternativ können am Rückgrat modifizierte Nukleinsäuren (z.B. Phosphoramidat-DNA) verwendet werden, so dass die Thiolgruppe an das Stickstoffzentrum, welches durch das modifizierte Phosphatrückgrat bereitgestellt wird, angeheftet werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Modifikation einer Nukleinsäure, beispielsweise wie weiter oben beschrieben, die Fähigkeit der Nukleinsäure oder Nukleinsequenz, mit ihrem Komplement zu hybridisieren, nicht wesentlich beeinträchtigen. Folglich sollte bei jeder Modifikation bevorzugt vermieden werden, dass die Funktionalitäten der Nukleinsäure, welche für die Watson-Crick-Basenpaarung verantwortlich sind, wesentlich modifiziert werden. Die Nukleinsäure kann so modifiziert werden, dass eine nicht-terminale Thiolgruppe vorliegt und die Nukleinsäure kann bei Immobilisierung an den Träger eine selbst-komplementäre Basenpaarung unter Bildung einer "Haarnadel"-Struktur mit einer Duplexregion bilden.
Feste Träger und Substrate
Beispiele für unlösliche Träger und Substrate zur Verwendung hierin umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Beads (Silikagel, pöroses Glasmaterial („controlled pore glass"), magnetische Beads, Sephadex/Sepharose-Beads, Cellulose-Beads usw.), Kapillaren, flache Träger wie etwa Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Plastikmaterialien einschließlich Platten mit mehreren Vertiefungen, oder Membranen (z.B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Wafer, Kämme, Stifte (z.B. Arrays von Stifte, welche für eine kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind) oder Beads in Vertiefungen von flachen Oberflächen wie etwa Wafern (z.B. Siliciumwafer), mit oder ohne Filterplatten.
Massenspektrometrie
Wenn sie einmal immobilisiert sind, können die Nukleinsäuren durch ein beliebiges aus einer Vielzahl von Mitteln analysiert werden, einschließlich beispielsweise spektrometrischer Verfahren wie etwa UV/VIS, IR, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie oder andere im Fachgebiet bekannte Verfahren oder Kombinationen davon. Bevorzugte Massenspektrometerformate umfassen die Ionisierungs- (I) Verfahren, wie etwa eine Matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI), kontinuierlicher oder gepulster Elektrospray (ESI) und verwandte Verfahren (z.B. Ionenspray oder Thermospray), oder „Massive Cluster Impact" (MCI); diese Ionenquellen können mit Nachweisformaten abgestimmt werden einschließlich linearer oder Reflektron-Flugzeit (TOF, „time of flight"), einfachem oder mehrfachem Quadrupol, einfachem oder mehrfachem Magnetfeld, Fourier-Transformations-Ionencyclotronresonanz (FTICR), Ionenfalle und Kombinationen davon, um einen gemischten Detektor zu erhalten (z.B. Ionenfalle/Flugzeit). Für Ionisation können zahlreiche IVIatrix/Wellenlängenkombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Nukleinsäuremolekül kovalent auf einen Silicamaterialträger immobilisiert werden durch Funktionalisierung des Trägers mit einer Aminofunktionalität (z.B. durch Derivatisieren des Trägers mit einem Reagenz wie etwa 3-Aminopropyltriethoxysilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI; siehe 7). Andere funktionalisierte Oxysilane oder Orthosilikate können verwendet werden und sind kommerziell erhältlich (z.B. von Gelest, Inc., Tullytown, PA). Beispielsweise kann 3-Mercaptopropyltriethoxysilan verwendet werden, um eine Siliciumoberfläche mit Thiolgruppen zu funktionalisieren. Das Amino-funktionalisierte Silicium kann dann umgesetzt werden mit einem heterobifunktionellen Reagenz wie etwa N-Succinimidyl(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB) (Pierce, Rockford, IL). Andere homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, welche verwendet werden können, sind kommerziell erhältlich, z.B. von Pierce. Schließlich wird eine mit einer Thiolgruppe funktionalisierte Nukleinsäure (z.B. am 5'-Terminus) kovalent an den derivatisierten Siliciumträger gebunden, durch Reaktion der Thiolfunktionalität des Nukleinsäuremoleküls mit der Jodacetylfunktionalität des Trägers.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Nukleinsäure mit dem Vernetzungsmittel umgesetzt werden, um ein Konjugat aus Vernetzungsmittel/Nukleinsäure zu bilden, welches dann mit einem funktionalisierten Träger umgesetzt wird, um eine immobilisierte Nukleinsäure bereitzustellen. Alternativ kann das Vernetzungsmittel mit der Nukleinsäure und einem funktionalisierten festen Träger in einem Topf vereinigt werden, um eine im Wesentlichen gleichzeitige Reaktion des Vernetzungsmittels mit der Nukleinsäure und dem festen Träger bereitzustellen. In dieser Ausführungsform ist es im Allgemeinen notwendig, ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel zu verwenden, d.h. ein Vernetzungsmittel mit zwei unterschiedlichen reaktiven Funktionalitäten, welche jeweils mit der Nukleinsäure und dem funktionalisierten festen Träger selektiv reagieren können.
Die hierin bereitgestellten Verfahren sind nützlich zum Herstellen von räumlich adressierbaren Arrays von Nukleinsäuren, welche auf unlöslichen Trägern immobilisiert sind. Beispielsweise können die Verfahren verwendet werden, um Arrays von unterschiedlichen Nukleinsäuren bereitzustellen, welche auf Stiften immobilisiert sind, die in einem Array angeordnet sind. In einer anderen Ausführungsform kann eine photospaltbare Schutzgruppe auf dem unlöslichen Träger selektiv gespalten werden (z.B. durch Photolithographie), um eine teilweise für die Immobilisierung einer Nukleinsäure aktivierte Oberfläche bereitzustellen. Beispielsweise kann eine Siliciumoberfläche, modifiziert durch Behandlung mit 3-Mercaptopropyltriethoxysilan zum Bereitstellen von Thiolgruppen mit einer photospaltbaren Schutzgruppe (beispielsweise durch photospaltbare Schutzgruppen, siehe z.B. PCT-Veröffentlichung WO 92/10092 oder McCray et al., (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18: 239-270) blockiert werden, und selektiv durch Bestrahlung von ausgewählten Bereichen der Oberfläche entblockt werden, z.B. durch Verwendung einer photolithographischen Maske. Dann kann eine Nukleinsäure, welche so modifiziert ist, dass sie eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, direkt an den Träger angeheftet werden oder alternativ kann ein Thiol- reaktives Vernetzungsmittel mit dem mit Thiol-modifizierten Träger umgesetzt werden, gefolgt von (oder im Wesentlichen gleichzeitig mit) einer Reaktion mit einer Nukleinsäure, um immobilisierte Nukleinsäuren bereitzustellen. Eine Nukleinsäurebase oder -sequenz, die einmal gemäß den hierin beschriebenen Verfahren an einen Träger immobilisiert ist, kann weiterhin durch bekannte Verfahren modifiziert werden. Beispielsweise kann die Nukleinsäuresequenz verlängert werden mittels Durchführung einer Festphasennukleinsäuresynthese gemäß konventioneller Verfahren, einschließlich kombinatorischer Verfahren.
Es werden unlösliche Träger bereitgestellt, welche Nukleinsäuren umfassen. Bevorzugt sind die Nukleinsäuren zumindest durch ein Schwefelatom kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers gebunden, d.h. die Nukleinsäuren sind kovalent an die Oberfläche durch eine Linkerkomponente gebunden, welche mindestens ein Schwefelatom enthält. Solche kovalent gebundenen Nukleinsäuren können leicht durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die unlöslichen Träger können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Anwendungen, welche eine Hybridisierung und Sequenzierung umfassen.
Beispielhafte Anwendungen werden in den Beispielen veranschaulicht.
In bevorzugten Ausführungsformen liegen die kovalent gebundenen Nukleinsäuren auf der Oberfläche des unlöslichen Trägers mit einer Dichte von mindestens etwa 20 fmol/mm², stärker bevorzugt mindestens etwa 75 fmol/mm², noch stärker bevorzugt mindestens etwa fmol/mm², noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm² und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm² vor.
Von Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind kombinatorische Bibliotheken von immo bilisierten Nukleinsäuren, welche wie oben beschrieben kovalent an einen festen Träger gebunden sind.
Kits für immobilisierte Nukleinsäuren auf einem festen Träger können in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden. Der Kit umfasst eine geeignete Menge von: i) einem Thiol-reaktiven Vernetzungsmittel; und ii) einem Oberflächenmodifizierenden Mittel zur Modifikation einer Oberfläche mit einer Funktionalität (bevorzugt einer anderen Funktionalität als Thiol), welche mit dem Thiol-reaktiven Vernetzungsmittel reagieren kann. Der Kit kann gegebenenfalls einen unlöslichen Träger, z.B. eine feste Oberfläche, z.B. magnetische Mikrobeads zur Verwendung bei immobilisierten Nukleinsäuren umfassen. Der Kit kann auch ein Mittel zum Modifizieren einer Nukleinsäure mit einer Thiolfunktionalität umfassen.
Die Kits können ein Mittel zum Modifizieren der Oberfläche eines Trägers mit einer Thiolkomponente, und ein Thiol-reaktives Vernetzungsmittel, welches mit einer Thiolkomponente eines Trägers reagieren kann, umfassen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Kit auch einen unlöslichen Träger, z.B. eine feste Fläche, z.B. magnetische Mikrobeads zur Verwendung bei der Immobilisierung von Nukleinsäuren.
Die hierin beschriebenen Kits können gegebenenfalls auch geeignete Puffer, Behälter zum Aufnehmen der Reagenzien und/oder eine Gebrauchsanweisung enthalten.
Die unlöslichen Träger, welche kovalent mit den Nukleinsäuren verbunden ist, beispielsweise die gesamte Oberfläche oder räumlich adressierbare oder zuvor adressierbare Arrayformate, können bei einer Vielzahl von Anwendungen der Festphasennukleinsäurechemie verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Nukleinsäuresynthese (chemisch und enzymatisch), Hybridisierung und/oder Verlängerung, und bei diagnostischen Verfahren, basierend auf einem Nukleinsäurenachweis und bei Polymorphismusanalysen (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,605,798). Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist ein Verfahren zum Umsetzen von Nukleinsäuremolekülen, bei welchen die Nukleinsäuremoleküle an eine Oberfläche immobilisiert werden, entweder durch Reaktion eines Thiol-haltigen Derivats des Nukleinsäuremoleküls mit einem unlöslichen Träger, welcher eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, oder durch Umsetzen eines Thiol-haltigen unlöslichen Trägers mit einem Derivat des Nukleinsäuremoleküls, welches eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, und danach weiterem Umsetzen der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle.
Die immobilisierte Nukleinsäure kann weiterhin umgesetzt werden durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäure, welche zu der immobilisierten Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist. Die immobilisierte Nukleinsäure wird weiterhin umgesetzt durch Verlängerung einer Nukleinsäure, welche mit der immobilisierten Nukleinsäure oder einem Teil davon hybridisiert ist. Verlängerungsreaktionen wie diese können beispielsweise verwendet werden bei Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen, welche an einen unlöslichen Träger immobilisiert sind, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren. Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines DNA-Moleküls auf einem Substrat, bei welchem ein Thiol-haltiges Derivat des DNA-Moleküls an die Oberfläche eines unlöslichen Trägers immobilisiert wird, welcher Thiol-reaktive Gruppen enthält, und mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert wird, welche zu einem Teil zu der immobilisierten DNA komplementär ist, vor dem Durchführen einer DNA-Synthese in Gegenwart von einem oder mehreren Didesoxynukleotiden.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die im Folgenden beschriebenen Beispiele veranschaulicht. Von diesen Beispielen stellt Beispiel 4 eine Ausführungsform dieser Erfindung dar und die verbleibenden Beispiele veranschaulichen den technischen Kontext, in welchem eine mögliche Verwendung der Erfindung beabsichtigt ist.
Beispiel 1
Anheftung von DNA in hoher Dichte an Siliciumwafer
Material und Verfahren
Solange es nicht anders angegeben ist, wurden alle Reagenzien von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI erhalten.
Präparation der Siliciumoberfläche
Die Siliciumwafer wurden mit Ethanol gewaschen, über einem Bunsenbrenner abgeflammt und in eine wasserfreie Lösung von 25% (Volumen) 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol für 3 Stunden eingetaucht. Dann wurde die Silanlösung entfernt und die Wafer wurden dreimal mit Toluol und dreimal mit Dimethylsulfoxid (DMSO) gewaschen. Die Wafer wurden dann in einer 10 mM wasserfreien Lösung von N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (SIAB) (Pierce Chemical, Rockford, IL) in wasserfreiem DMSO inkubiert. Nach der Reaktion wurde die SIAB-Lösung entfernt und die Wafer wurden dreimal mit DMSO gewaschen.
Da es unmöglich war, die Kondensation von SIAB und der Aminogruppe zu kontrollieren, während sie auf dem festen Träger des Wafers vorlagen, wurde die Reaktion in Lösung durchgeführt, um die optimale Reaktionszeit zu bestimmen. Es wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC, "thin layer chromatography") (Platten aus Silicamaterial mit einem Glasrücken mit einem Fluoreszenzindikator bei 254 nm) (Baker, Phillipsburg, NF) verwendet unter Verwendung von 95:5 Chloroform : Methanol (Baker, Phillipsburg, NJ), welche eine Auftrennung der zwei Ausgangsmaterialien ermöglichte. Es war möglich, das SIAB-Ausgangsmaterial unter langwelligem ultraviolettem Licht (302 nm) sichtbar zu machen; 3- Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, deswegen wurde die Platte mit einer Lösung von Ninhydrin besprüht, welches mit primären Aminen reagiert und beim Erhitzen einen purpurfarbenen Punkt ergibt. Eine Reaktion im Mikromaßstab wurde in Chloroform/DMSO unter Verwendung eines leichten molaren Überschusses an SIAB im Vergleich zu 3-Aminopropyltriethoxysilan durchgeführt und wurde mit den oben beschriebenen TLC-Bedingungen überwacht.
Oligonukleotidmodifikationen
Die Reduktion des Disulfids von 3'- oder 5'-Disulfid-haltigen Oligodesoxynukleotiden (Operon Technologies, Alameda, CA oder Oligo Etc., Wilsonville, OR) wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ) kontrolliert; hinsichtlich der Retentionszeit des Oligodesoxynukleotids kann bei der Spaltung des Disulfids eine Verschiebung gesehen werden. Es wurden verschiedene Reduktionsverfahren untersucht, um die optimalen Bedingungen zu bestimmen. In einem Fall wurde das Disulfid-haltige Oligodesoxynukleotid (31,5 nmol, 0,5 mM) mit Dithiothreitol (DTT) (Pierce, Chemical, Rockford, IL) (6,2 mmol, 100 mM) bei pH 8,0 und 37°C inkubiert. Als die Spaltungsreaktion im Wesentlichen vollständig war, wurde das frei Thiol-haltige Oligodesoxynukleotid unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert, da das DTT in der nachfolgenden Reaktion konkurrieren kann. Alternativ wurde Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Pierce Chemical, Rockford, IL) verwendet, um das Disulfid zu spalten. Das Disulfid-haltige Oligodesoxynukleotid (7,2 nmol, 0,36 mM) wurde mit TCEP in einem Puffer bei pH 4,5 bei 37°C inkubiert. Es ist nicht notwendig, das Produkt nach der Reaktion zu isolieren, da TCEP mit der Jodacetamidofunktionalität nicht kompetitiv reagiert. Es wurden verschiedene Konzentrationen an TCEP für die Spaltungsreaktion verwendet, um die optimalen Bedingungen für die Konjugationsreaktion zu bestimmen.
Kopplung der Sonde
Zu jedem Wafer, welcher so derivatisiert wurde, dass er die Jodacetamidofunktionalität besaß, wie oben beschrieben, wurden eine wässrige 10 mM Lösung des freie Thiol-Gruppen aufweisenden Oligodesoxynukleotids in 100 mM Phosphatpuffer, pH 8 zugegeben; die Reaktion wurde für mindestens fünf Stunden bei Raumtemperatur bei einer relativen Feuchtigkeit von 100% fortgeführt. Nach der Reaktion wurde die Oligodesoxynukleotidlösung entfernt und die Wafer wurden zweimal in 5 × SSC-Puffer (75 mM Natriumcitrat, 750 mM Natriumchlorid, pH 7) mit 50% Formamid (USB, Cleveland, OH) bei 65°C jeweils für 1 Stunde gewaschen.
Radiochemische Bestimmung der Probendichte
Um die Menge an DNA zu bestimmen, welche kovalent an die Oberfläche angeheftet war, oder um die Menge einer hybridisierten komplementären Sequenz zu bestimmen, wurden radiomarkierte Sonden verwendet. In Fällen, bei denen ein 5'-Disulfid-haltiges Oligodesoxynukleotid immobilisiert werden sollte, wurde der 3'-Terminus unter Verwendung des Enzyms „Terminale Transferase" und eines radiomarkierten Didesoxynukleotidtriphosphats radiomarkiert; in einer Standardreaktion wurden 15 pmol (0,6 μM) des 5'-Disulfid-haltigen Oligodesoxynukleotids mit 50 μCi (16,5 pmol, 0,66 μM) [α-³²P]-Didesoxyadenosin-5'-triphosphat (ddATP) (Amersham, Arlington Height, IL) in Gegenwart von 0,2 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Nach Zugabe von 40 Units des Enzyms „Terminale Desoxynukleotidyltransferase" (USB, Cleveland, OH) wurde die Reaktion für 1 Stunde bei 37°C fortgeführt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion durch Eintauchen des Gefäßes in ein 75°C Wasserbad für 10 Minuten gestoppt und das Produkt wurde unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert. Auf ähnliche Art und Weise wurde ein 5'-Disulfid-haltiges Oligodesoxynukleotid mit ³⁵S radiomarkiert.
In Fällen, bei denen ein 3'-Disulfid-haltiges Oligodesoxynukleotid immobilisiert werden sollte, wurde der 5'-Terminus unter Verwendung der T4-Poly nukleotidkinase und einem radiomarkierten Nukleosidtriphosphat radiomarkiert. Beispielsweise wurden 15 pmol (0,6 μM) des 3'-Disulfid-haltigen Oligodesoxynukleotids mit 50 μCi (16,5 pmol, 0,66 μM) von (λ³²P]-Adenosin-5'-triphosphat (ATP) (Amersham, Arlington Height, IL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Nach der Zugabe von 40 Units T4-Polynukleotidkinase wurde die Reaktion für eine Stunde bei 37°C fortgeführt. Die Reaktion wurde durch Eintauchen des Gefäßes in ein 75°C Wasserbad für 10 Minuten gestoppt, dann wurde das Produkt unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert.
Um die Dichte der kovalent immobilisierten Sonde zu bestimmen, wurde das ausgewählte Disulfid-haltige Oligodesoxynukleotid zu einer geringen Menge der gleichen Art, welche wie oben beschrieben radiomarkiert wurde, zugegeben. Das Disulfid wurde gespalten, die Sonde wurde auf mit Jodacetamido funktionalisierten Wafern immobilisiert, die Wafer wurden gewaschen und dann gegenüber einem Phosphorimagerschirm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) exponiert. Für jedes verwendete unterschiedliche Oligodesoxynukleotid wurden Referenzpunkte auf Polystyrol hergestellt, bei denen die molaren Menge des Oligodesoxynukleotids bekannt war; diese Referenzpunkte wurden ebenso gegenüber dem Phosphorimagerschirm exponiert. Beim Scannen des Schirms wurde die Menge (in Mol) des an jeden Chip gebundenen Oligodesoxynukleotids durch Vergleich der Zählimpulse mit den spezifischen Aktivitäten der Referenzen bestimmt.
Hybridisierung und Effizienz
Zu einem Wafer, welcher mit einer immobilisierten Sonde funktionalisiert worden war, wurde eine Lösung einer komplementären Sequenz (10 μM) in 1 M NaCl und TE-Puffer zugegeben. Der Wafer und die Lösung wurden auf 75°C erhitzt und über 3 Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dieser Zeit wurde die Lösung entfernt und der Wafer wurde zweimal mit TE-Puffer gewaschen.
Um die Menge des hybridisierten Oligonukleotides zu bestimmen, wurde die Immobilisierung der Sonde zuerst wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass die Sonde anstelle von ³²P mit ³⁵S markiert war. Die Dichte der immobilisierten Sonde wurde mit dem Phosphorimager bestimmt. Danach wurde der gleiche Wafer in TE-Puffer, 1M NaCl und dem komplementären Strang (10 μM), welcher mit ³²P radiomarkiert worden war, inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt wie zuvor beschrieben. Nach einem Waschen zur Entfernung der unspezifischen Bindung wurden der Wafer und die Referenz gegenüber einem Phosphorimagerschirm exponiert, wobei sich ein Stück Kupferfolie zwischen der Scheibe und dem Wafer befand. Die Kupferfolie dient dazu, das Signal von ³⁵S zu blockieren, während das ³²P-Signal frei hindurchtreten kann. Die molare Menge des hybridisierten Oligonukleotids wird dann bestimmt, was den Prozentanteil der kovalent immobilisierten Sonde ergibt, welche für eine Hybridisierung verfügbar ist.
MALDI-TOF-Massenspekrometrieanalyse
Wie oben beschrieben, wurden Wafer mit einem nicht radiomarkierten immobilisierten Oligodesoxynukleotid (Name: TCUC; Sequenz: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; Molekulargewicht 6455 Da; SEQ ID NO. 1) synthetisiert und es wurde eine komplementäre Sequenz (Name: MJM6; Sequenz: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; Molekulargewicht: 6415 Da; SEQ ID NO. 2) hybridisiert. Die Wafer wurden in 50 mM Ammoniumcitratpuffer zum Kationenaustausch zur Entfernung von Natrium- und Kaliumionen aus dem DNA-Rückgrat gewaschen (Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res., 21:3191-3196). Eine Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA, 0,7 M in 50% Acetonitril, 10% Ammoniumcitrat; Wu, K.J., et al. (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom., 7:142-146) wurde auf dem Wafer aufgetropft und bei Umgebungstemperatur getrocknet. Die Wafer wurden direkt an die Probensonde eines Vision 2000 Reflektron TOF-Massenspektrometers von Finnigan MAT (Bremen, Deutschland) unter Verwendung eines leitenden Bandes befestigt. Der Reflektron besitzt eine 5 keV-Ionenquelle und 20 keV Nachbeschleunigung; es wurde ein Stickstofflaser verwendet; und alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen.
Ergebnisse
Oberflächenchemie
Unter Verwendung von Standardchemie zur Modifikation von Siliciumdioxid wurde ein Siliciumwafer mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, um eine einheitliche Schicht von primären Aminogruppen auf der Oberfläche zu erzeugen. Wie in 7 gezeigt wird, wurde die Oberfläche dann gegenüber einem heterobifunktionellen Vernetzer exponiert, was Jodacetamidgruppen auf der Oberfläche ergab. Es war unter Verwendung von TLC möglich, die optimale Reaktionszeit dieser Reaktion in Lösung zu bestimmen. Der SIAB-Vernetzer wurde unter langwelligem ultraviolettem Licht (302 nm) sichtbar gemacht, um einen Punkt mit einem R_f-Wert von 0,58 zum Vorschein zu bringen. 3-Aminopropyltriehoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, deswegen wurde Ninhydrin verwendet, um einen purpurnen Punkt zum Vorschein zu bringen, welcher die Anwesenheit eines primären Amins an der Basislinie anzeigte. Es wurde eine Reaktion im Mikromaßstab durchgeführt unter Verwendung eines leichten molaren Überschusses an SIAB im Vergleich zu 3-Aminopropyltriethoxysilan; eine TLC-Analyse nach ungefähr einer Minute brachte einen neuen Punkt zum Vorschein, welcher unter langwelligem ultraviolettem Licht sichtbar war mit einem R_f-Wert von 0,28. Es gab kein Anzeichen für einen purpurnen Punkt beim Besprühen mit Ninhydrin, folglich war das gesamte 3-Aminopropyltriethoxysilanausgangsmaterial in der Reaktion verbraucht worden. Das UV-Licht zeigte auch das überschüssige SIAB, welches nach der Reaktion verblieb. Aus diesen Ergebnissen wurde bestimmt, dass die Reaktion nach ungefähr einer Minute vollständig war. In allen Fällen wurden die mit Jodacetamido funktionalisierten Wafer sofort verwendet, um die Hydrolyse der labilen Jodacetamidofunktionalität zu minimieren. Außerdem wurden alle weiteren Manipulationen der Wafer im Dunkeln durchgeführt, da die Jodacetamidofunktionalität lichtempfindlich ist.
Die Disulfidreduktion des modifizierten Oligonukleotids wurde kontrolliert durch Beobachtung einer Verschiebung der Retentionszeit bei der Umkehrphasen-FPLC. Es wurde bestimmt, dass nach fünf Stunden in Gegenwart von DTT (100 mM) oder TCEP (10 mM) das Disulfid vollständig zu einem freien Thiol reduziert war. Wenn die DTT-Reaktion für einen längeren Zeitraum fortgeführt wurde, bildete sich ein Oligonukleotiddimer, bei dem Paare der freien Thiole reagiert hatten. Solch eine Dimerisierung wurde auch beobachtet, wenn das DTT nach Abschluss der Spaltungsreaktion entfernt wurde. Diese Dimerisierung wurde nicht beobachtet, wenn TCEP als das Spaltungsreagenz verwendet wurde, da diese Reaktion bei pH 4,5 durchgeführt wird, und die freien Thiole damit vollständig protoniert waren, was die Dimerisierung hemmt.
Unmittelbar nach der Disulfidspaltung wurde das modifizierte Oligonukleotid mit den Jodacetamido-funktionalisierten Wafern inkubiert. Um eine vollständige Thioldeprotonierung sicherzustellen, wurde die Kopplungsreaktion bei pH 8,0 durchgeführt. Die durch diese Chemie erreichte Oberflächendichte der Sonde auf Siliciumwafern wurde unter Verwendung von radiomarkierten Sonden und einem Phosphorimager analysiert. Die Oberflächendichte der Sonde wurde auch als Funktion der TCEP-Konzentration, welche bei der Disulfidspaltungsreaktion verwendet wurde (8) kontrolliert. Unter Verwendung von 10 mM TCEP zum Spalten des Disulfids und der anderen oben beschriebenen Reaktionsbedingungen war es möglich, reproduzierbar eine Oberflächendichte von 250 fmol pro Quadratmillimeter Oberfläche zu erhalten. Identische Experimente wie oben beschrieben wurden durchgeführt, außer, dass die Oligonukleotidsonde keine Thiolmodifikation aufwies; Oberflächendichten von weniger als 5 fmol pro Quadratmillimeter Oberfläche belegten, dass die nicht-spezifische Bindung minimal ist und dass eine Kopplung der Sonde am wahrscheinlichsten auftrat, wie in 7 vorgeschlagen.
Hybridisierung
Nach dem Anheften von ³⁵S-markierten Sonden an die Oberfläche von Wafern und dem Bestimmen der Konjugationsdichte wie oben beschrieben, wurde die Hybridisierung von mit ³²P-markierten Oligonukleotiden durchgeführt; die Hybridisierungseffizienz und Dichte wurden bestimmt unter Verwendung des Phosphorimagers und Kupferfolie. Es wurde experimentell bestimmt, dass die Kupferfolie 98,4% eines ³⁵S-Signals blockiert, während ein ³²P-Signal vollständig nachgewiesen werden konnte. Die komplemenäre Sequenz hybridisierte reproduzierbar und ergab 105 fmol pro Quadratmillimeter Oberfläche; dies entspricht ungefähr 40% der konjugierten Sonden, welche zur Hybridisierung verfügbar waren. Auf ähnliche Art und Weise wurde eine nicht-komplementäre Sequenz in diesem Schema verwendet, was weniger als 5 fmol pro Quadratmillimeter Oberfläche nicht-spezifische Bindung ergab.
Es wird angenommen, das sterische Wechselwirkung zwischen dem dicht gepackten Nukleotid auf der flachen Oberfläche Hydridisierungseffizienzen von mehr als 40% verhindert. Angesichts dieser Tatsache wurde ein Spacermolekül zwischen dem Terminus der Hybridisierungsregion des Oligonukleotids und dem Träger eingebracht. Die ausgewählten Spacer waren eine Reihe von Poly-dT-Sequenzen mit einer Länge im Bereich von 3 bis 25. Bei der Untersuchung dieser Proben mit Radiomarkierungen und dem Phosphorimager wurde bestimmt, dass 40% noch immer die maximale Hybridisierung war, welche erreicht werden konnte.
MALDI-TOF-MS-Analyse
Es wurden Wafer mit Sonden funktionalisiert, komplementäre Sequenzen wurden hybridisiert und die Proben wurden unter Standard-MALDI-Bedingungen wie oben beschrieben analysiert. Die Analyse zeigte, dass nur der angeheftete Strang (MJM6) im Massenspektrum beobachtet wurde mit einem experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 6415,4; das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis beträgt 6415 (9). Da kein Signal bei einem Masse-Ladungs- Verhältnis von 6455 vorlag, wurde bestimmt, dass der Wafer-konjugierte Strang (TCUC) nicht desorbiert war und folglich die Jodacetamidobindung stabil genug war, um dem Laser zu widerstehen und intakt zu bleiben. Es gab ein zusätzliches Signal, welches bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 6262,0 beobachtet wurde. Dieses Signal ergibt sich aus einer Purinabspaltung von Guanosinen, da bekannt ist, dass die DNA anfällig ist für einen Verlust von Purinbasen während des MALDI-Verfahrens (Nordoff, E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776). Die Probenkristalle auf dem Wafer waren nicht homogen verteilt, somit war es notwendig, nach einem guten Punkt zu suchen. Aufgrund dieser mangelnden Homogenität variierte die Massenauflösung, lag aber im Allgemeinen im Bereich von 200 bis 300 für die desorbierten Oligonukleotide in den Massenspektren. In einer Reihe von Experimenten wurden nicht komplementäre Sequenzen an den Wafer hybridisiert; nach einem Waschen wie zuvor beschrieben zeigte eine Analyse durch MALDI-TOF-MS, dass minimales nicht spezifisches Anheften stattgefunden hatte, da kein Signal nachgewiesen wurde.
Beispiel 2
Immobilisierung der amplifizierten DNA-Ziele an Siliciumwafer
Die mit SIAB konjugierten Siliciumwafer wurden auch verwendet, um spezifische freie Thiol-haltige DNA-Fragmente einer bestimmten amplifizierten DNA-Zielsequenz zu analysieren.
Wie in 10 gezeigt ist, wurde ein 23-mer Oligodesoxynukleotid mit einer 5'-Disulfidbindung [bezogen von Operon Technologies; SEQ ID NO: 3], welches komplementär ist zur 3'-Region eines Templats von humaner genomischer DNA von 112 Basenpaaren [Genebank Acc. No.: Z52259; SEQ ID NO: 4], als Primer in PCR-Reaktionen verwendet in Verbindung mit einem kommerziell erhältlichen 49-mer Primer, welcher zu einem Teil des 5'-Endes der genomischen DNA komplementär ist [bezogen von Operon Technologies; SEQ ID NO: 5], um ein DNA-Produkt mit 135 Basenpaaren zu amplifizieren, welches eine 5'-Disulfidbindung enthält, angeheftet an nur einen Strang des DNA-Duplex [SEQ ID NO: 6].
Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung des Amplitaq^® Goldkits^® [Perkin Elmer Cataloag No. N808-0249]. Kurz zusammengefasst, 200 ng eines humanen genomischen DNA-Templats mit 112 Basenpaaren wurden mit 10 μM eines 23-mer Primers und 8 μM des kommerziell erhältlichen 49-mer Primers, 10 mM dNTPs, 1 Unit Amplitaq Gold DNA-Polymerase in vom Hersteller bereitgestellten Puffer inkubiert, und eine PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt.
Die 5'-Disulfidbindung des resultierenden PCR-Produkts wurde vollständig reduziert unter Verwendung von 10 mM TCEP wie in Beispiel 1 beschrieben, um eine freie 5'-Thiolgruppe zu erzeugen. Der DNA-Strang mit der freien Thiolgruppe wurde durch den SIAB-Linker an die Oberfläche des Siliciumwafers konjugiert, im Wesentlichen wie in 7 skizziert.
Der mit der Thiol-haltigen DNA mit 135 Basenpaaren konjugierte Siliciumwafer wurde mit einem komplementären 12-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 7] inkubiert und spezifische hybridisierte DNA-Fragmente wurden unter Verwendung der MALDI-TOF-MS-Analyse nachgewiesen. Das Massenspektrum zeigte ein Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618,33; das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis der 12-mer Oligomersequenz beträgt 3622.4 Da.
Folglich kann ein spezielles DNA-Zielmolekül, welches eine 5'-Disulfidbindung enthält, amplifiziert werden. Die Moleküle werden unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren an einen mit SIAB derivatisierten Siliciumwafer immobilisiert und spezifische komplementäre Oligonukleotide können an diese Zielmoleküle hybridisiert werden und unter Verwendung einer MALDI-TOF-MS-Analyse nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Spectrochip-Mutantennachweis im ApoE-Gen
Dieses Beispiel beschreibt die Hybridisierung eines immobilisierten Templats, Primerverlängerung und Massenspektrometrie zum Nachweis des Wildtyps und einer Mutante des Apolipoprotein E-Gens für diagnostische Zwecke. Dieses Beispiel zeigt, dass immobilisierte DNA-Moleküle, welche eine spezifische Sequenz enthalten, unter Verwendung einer Primerverlängerung von nicht markierten Allel-spezifischen Primern und Analyse der Verlängerungsprodukte unter Verwendung von Massenspektrometrie nachgewiesen und unterschieden werden können.
Ein synthetisches DNA-Template mit 50 Basen, welches komplementär ist zur codierenden Sequenz des Allels 3 des Wildtyp-Apolipoprotein E-Gens:
5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-3' [SEQ ID NO: 17] oder komplementär zum mutanten Apolipoprotein E-Gen mit einer G → A Transition an Codon 158:
5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-3' [SEQ ID NO: 18], welches eine 3'-freie Thiolgruppe enthält, wurde an getrennte mit SIAB-derivatisierte Siliciumwafer gekoppelt, im Wesentlichen wie in 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Ein 21-mer Oligonukleotidprimer: 5'-GATGCCGATGACCTGCAGAAG-3' [SEQ ID NO: 19] wurde mit jedem der immobilisierten Template hybridisiert und der Primer wurde verlängert unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits [z.B. Sequenase^® oder Thermosequenase^®, U.S. Biochemical Corp.]. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder Thermosequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart von drei Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dTTP) und Didesoxyribonukleosidcytosintriphosphat (ddCTP) in Puffer entsprechend den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen ergab eine Einbasen-Verlängerung des 21-mer Primers, welcher an das immobilisierte Templat gebunden war, welches für das Wildtyp-Apolipoprotein E-Gen codiert und eine Dreibasen-Verlängerung des 21-mer Primers, welcher an das immobilisierte Templat gebunden war, welches für die mutante Form des Apolipoprotein E-Gens codiert.
Die Wafer wurden wie hierin beschrieben durch Massenspektrometrie analysiert. Die Wildtyp-Apolipoprotein E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, welches den Primer mit einer Einbasen-Verlängerung (22-mer) mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 6771.17 Da (das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis beträgt 6753,5 Da) von dem ursprünglichen 21-mer Primer mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet. Die mutante Apolipoprotein E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, welches den Primer mit der Dreibasen-Verlängerung (24-mer) mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 7386,9 (die theoretische Masseladung beträgt 7386,9) vom ursprünglichen 21-mer Primer mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet.
Beispiel 4
Herstellung von DNA-Arrays unter Verwendung von Werkzeugen zur seriellen und parallelen Verteilung
Es wurden Roboter-gesteuerte serielle und parallele pL-nL-Verteilungswerkzeuge verwendet, um DNA-Arrays mit 10 bis 10³ Elementen auf < 1" Square Chips mit flachen oder geometrisch veränderten (z.B. mit Vertiefungen) Oberflächen für eine Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrieanalyse zu erzeugen. Bei den Ersteren verteilt eine "piezoelektrische Pipette" (70 μm Ø Kapillare) einzelne oder mehrere ~0,2 nl Tropfen der Matrix und anschließend des Analyten auf den Chip; Es sind unter Verwendung dieses Verfahrens Spektren von so geringen Mengen wie etwa 0,2 fmol einer 36-mer DNA erhalten worden. Trotz der schnellen (< 5 sec) Verdampfung werden routinemäßig Mikrokristalle der 3-Hydroxypicolinsäurematrix, welche den Analyten enthält, erzeugt, was eine höhere Reproduzierbarkeit ergibt als sie routinemäßig mit größeren Volumenpräparationen erhalten wird; alle der 100 Punkte mit 5 fmol eines 23-mers in Vertiefungen von 800 μm ergaben leicht ausgewertete Massenspektren, wobei 99/100 Signale des Ausgangsions ein Signal/Hintergrundverhältnis von > 5 aufweisen. In einem zweiten Ansatz werden Sonden von einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen, 16 zu einem Zeitpunkt, in Chipvertiefungen oder auf flache Oberflächen verteilt unter Verwendung eines Arrays von mit Federn geladenen Stiften, welche ~20 nl durch Oberflächenkontakt auf den Chip übertragen; die MS-Analyse der Arrayelemente, welche mit dem parallelen Verfahren aufgetragen wurden, sind im Hinblick auf die Empfindlichkeit und die Auflösung vergleichbar mit den Arrayelementen, welche mit dem seriellen Verfahren gemacht wurden.
Beschreibung des piezoelektrischen seriellen Verteilers
Das experimentelle System wurde aus einem System entwickelt, welches von der Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland entwickelt wurde, und einen Antrieb für ein piezoelektrisches Element enthalten kann, welcher ein gepulstes Signal an ein piezoelektrisches Element sendet, gebunden an und umgebend eine Glaskapillare, welches die zu verteilende Lösung enthält; einen Drucktransducer zum Beladen (durch negativen Druck) oder Leeren (durch positiven Druck) der Kapillare; ein Roboter-xyz-Gerüst und einen Roboterantrieb zum Manövrieren der Kapillare zum Beladen, Entladen, Verteilen und Reinigen, ein Stroboskop und Antrieb, gepulst mit der Frequenz des Piezoelelements, um eine Betrachtung der "suspendierten" Tropfencharakteristika zu ermöglichen; getrennte Gerüste für Quellenplatten und Bestimmungsplatten oder Probenziele (d.h. einen Si-Chip); eine Kamera, welche auf den Roboterarm montiert ist, um das Beladen der Bestimmungsplatte zu betrachten; und eine Datenstation, welche die Druckeinheit, den xyz-Roboter und den piezoelektrischen Antrieb steuert.
Beschreibung des parallelen Verteilers
Das Roboterstiftwerkzeug besteht aus 16 Sonden, untergebracht in einem Sondenblock und montiert auf eine X Y, Z-Robotergerüst. Das Robotergerüst war ein Gerüstsystem, welches das Platzieren der Probengefäße unterhalb der Arme des Roboters ermöglicht. Die Gerüsteinheit selbst ist zusammengesetzt aus X- und Y-Armen, welche sich 250 bzw. 400 mm bewegen, geführt von bürstenlosen linearen Stellmotoren mit einem Positionsfeedback, bereitgestellt durch lineare optische Codiereinrichtungen. Eine durch eine Antriebsspindel betriebene Z-Achse (50 mm vertikale Bewegung) wird auf den xy-Achsenschieber der Gerüsteinheit montiert und wird durch einen Reihenrotationsstellmotor mit Positionsfeedback durch eine auf den Motor montierte optische Codiereinrichtung gesteuert. Die Arbeitsfläche des Systems ist mit einer herausziehbaren Werkzeugplatte ausgestattet, welche fünf Mikrotiterplatten hält (am häufigsten 2 Platten der Waschlösung und 3 Platten einer Probe für maximal 1152 unterschiedliche Oligonukleotidlösungen) und bis zu zehn Wafer von 20 × 20 mm. Die Wafer werden genau in die Platte gegen zwei Anschlagstifte platziert und durch ein Vakuum sicher gehalten. Das gesamte System ist zur Sicherheit in einem Plexiglasgehäuse eingeschlossen und auf einen Stahlträgerrahmen montiert zur thermischen Dämpfung und Vibrationsdämpfung. Die Bewegungssteuerung wird ausgeführt durch Anwenden einer kommerziellen Bewegungssteuerung, welche eine 3-Achsen-Servosteuerung ist und in einen Computer integriert ist; wobei der Programmiercode für spezielle Anwendungen wie benötigt geschrieben wird.
Die Proben werden mit dem seriellen System auf mehrere Oberflächen verteilt, welche als Ziele bei der MALDI-TOF-Analyse dienten, einschließlich [1] einem flachen Edelstahlprobenziel, wie es zur routinemäßigen Verwendung in einem Thermo Bioanalysis Vision 2000 verwendet wird; [2] das gleiche Design des Edelstahlziels mit mikro-materialbearbeiteten Nanostiften; [3] flachen Silicium (Si)-Wafern; [4] polierte flache Si-Wafer; [5] Si-Wafer mit rauen Vertiefungen (3 bis 6 pLm Merkmale); [6](a) 12 × 12 oder ((b) 18 × 18) mm Si-Chips mit (a) 10 × 10 (oder (b) 16 × 16) Arrays von chemisch geätzten Vertiefungen, jeweils 800 × 800 μm auf einer Seite mit Tiefen im Bereich von 99 bis 400 (oder (b) 120) Mikrometer, Abstand (a) 1,0 (oder (b) 1,125) mm; [7] 15 × 15 mm Si-Chips mit 28 × 28 Arrays von chemisch geätzten Vertiefungen, jeweils 450 × 450 Mikrometer auf einer Seite mit Tiefen im Bereich von 48 bis 300 Mikrometer, Abstand 0,5 mm; [8] flachem Polycarbonat oder anderen Kunststoffen; [9] Gold und anderen Metallen; [10] Membranen; [11] Kunststoffoberflächen, bestäubt mit Gold oder anderen leitenden Materialien. Das verteilte Volumen wird gesteuert von 10^-10 bis 10^–6 l durch Anpassen der Anzahl von verteilten Tropfen.
Probenpräparation und Verteilung
1. Seriell
Oligonukleotide (0,1 bis 50 ng/Mikroliter) mit einer unterschiedlichen Sequenz oder Konzentrationen wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geladen; die erste Vertiefung wurde für die Matrixlösung reserviert. Ein unebener Chip (Ziel 6a im Abschnitt MALDI-Ziele) wurde auf dem Gerüst platziert und manuell ausgerichtet. In die (auf Windows basierende) Steuersoftware des Roboters wurden die Koordinaten der ersten Vertiefung, die Arraygröße (d.h. Anzahl von Punkten in x und y) und der Abstand zwischen den Elementen und die Anzahl von 0,2 nl-Tropfen pro Arrayelement eingegeben. Die Kapillare wurde gefüllt mit ~10 μl Spülwasser, automatisch bewegt im Blick einer Blitzlicht beleuchteten Kamera zum Überprüfen der Integrität und Sauberkeit der Spitze, während sie im kontinuierlichen Impulsmodus war, und geleert. Die Kapillare wurde dann mit Matrixlösung gefüllt, erneut an dem Stroboskop überprüft und dann verwendet, um einen Array auf flache oder unebene Oberflächen aufzutropfen. Für Untersuchungen der Reproduzierbarkeit bei unterschiedlichen MS-Modi wurde normalerweise ein 10 × 10 Array von 0,2 bis 20 nl-Tröpfchen verteilt. Die Kapillare wurde geleert durch Anlegen eines positiven Drucks, gegebenenfalls mit H₂O gespült und zur Quellenoligoplatte geführt, wo ~5 μl 0,05 bis 2,0 μM synthetisches Oligo aufgezogen wurden. Dann wurde die Kapillare in Reihen über jeden der Matrixpunkte gerastert, wobei zu jedem 0,2 bis 20 nl wässrige Lösung zugegeben wurde.
2. Parallel
Parallele Programme wurden geschrieben, um die Arrayherstellung durch Offset-Druck zu steuern; um einen Array mit 64 Elementen auf 10 Wafern herzustellen, wurde beispielsweise das Werkzeug in 16 Vertiefungen einer DNA-Quellenplatte mit 384 Vertiefungen eingetaucht, auf das Ziel bewegt (z.B. Si, Kunststoff, Metall) und die Probe durch Oberflächenkontakt aufgetropft. Das Werkzeug wurde dann in die gleichen 16 Vertiefungen eingetaucht und auf das zweite Ziel aufgetropft; dieser Zyklus wurde auf allen zehn Wafern wiederholt. Als nächstes wurde das Werkzeug in Waschlösung eingetaucht, dann in 16 unterschiedliche Vertiefungen der Quellenplatte eingetaucht und auf das Ziel aufgetropft, um 2,25 mm versetzt von der anfänglichen Gruppe von 16 Punkten; dies wurde erneut auf allen 10 Wafern wiederholt; der gesamte Zyklus wurde wiederholt, um einen 2 × 2 Array von jedem Stift zu herzustellen, um einen 8 × 8 Array von Punkten zu erzeugen (2 × 2 Elemente/Stift × 16 Stifte = 64 aufgetropfte Gesamtelemente).
Um Arrays für eine MS-Analyse herzustellen, wurden Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen oder Konzentrationen in die Vertiefungen von bis zu drei verschiedenen Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen geladen, eine Gruppe von 16 Vertiefungen wurde für die Matrixlösung reserviert. Die Vertiefungen von zwei Platten wurden mit Waschlösung gefüllt. Die fünf Mikrotiterplatten wurden auf die ausziehbare Werkzeugplatte geladen. Es wurden zehn Wafer platziert, anstoßend an die Anschlagstifte der Werkzeugplatte, und das Vakuum wurde angelegt. In Fällen, bei denen Matrix und Oligonukleotid nicht vorgemischt waren, wurde das Stiftwerkzeug verwendet, um zuerst die Matrixlösung auf alle gewünschten Arrayelemente der zehn Wafer aufzutropfen. Für dieses Beispiel wurde ein 16 × 16 Array erzeugt, folglich musste das Werkzeug jeden der zehn Wafer 16-mal betupfen, mit einer Versetzung von 1,125 mm. Als nächstes wurde die Oligonukleotidlösung im gleichen Muster aufgetropft, um die Matrix wieder zu lösen. Auf ähnliche Art und Weise konnte ein Array hergestellt werden durch Platzieren der Oligonukleotidlösung auf den Wafer als erstes, gefolgt von der Matrixlösung, oder durch Vormischen der Matrix- und Oligonukleotidlösungen.
Massenspektrometrie
Anschließend an jedes Verteilungsschema wurden die beladenen Chips mit einem Satz von abgeflachten mit Schrauben montierten Polycarbonatträgern auf einer MALDI-TOF-Quellenplatte gehalten. Die Platte wurde auf das Ende einer Sonde übertragen, um in der Quellenregion eines Flugzeit-Massenspektrometers mit 1 μm Auflösung-, auf einem 1 "-Bewegungs-xy-Gerüst (Newport) gehalten zu werden. Das Instrument, welches normalerweise mit einer Ausschleusung von 18 bis 26 kV betrieben wird, kann im Reflectron-Modus im linearen oder gekrümmten Feld, und in einem Modus mit kontinuierlicher oder verzögerter Extraktion betrieben werden. Ergebnisse
Serielle Verteilung mit der piezoelektrischen Pipette
Während ein Auftragen einer gesättigten 3HPA-Lösung eine Verstopfung der Spitze ergeben kann, da das Lösungsmittel an der Grenzfläche von Kapillare und Luft verdampft, verdünnt ein Vormischen von DNA und Matrix die Matrix ausreichend, so dass sie in Lösung bleibt, während stabile Sprays erhalten werden, welche beibehalten werden können, bis die Kapillare geleert ist; mit einer 1:1 verdünnten (in H₂O) Matrixlösung war ein kontinuierliches Sprühen für » 10 Minuten möglich. Ein Ausschalten des Piezoelements, so dass die Kapillare für > 5 Minuten inaktiv war, und erneutes Aktivieren des Piezoelements führte ebenso zu keiner verstopften Kapillare.
Anfangsexperimente unter Verwendung von Edelstahlprobenzielen, wie bereitgestellt durch das im Reflectron-Modus betriebene Finnigan Vision 2000 MALDI-TOF-System verwendeten, eine vorgemischte Lösung der Matrix und der DNA vor dem Verteilen auf dem Probenziel. In einer einzigen Mikrotitervertiefung wurden 50 μl gesättigte Matrixlösung, 25 μl einer 51 μl Lösung des 12-mers (ATCG) 3 und 25 μl einer 51 μl Lösung des 28-mers (ATCG) 7 gemischt. Eine Gruppe von 10 × 10 Arrays der 0,6 μl-Tropfen wurde direkt auf eine Finnigan Vision 2000 Probenzielplatte verteilt; es wurde ein MALDI-TOF-Massenspektrum von einem einzelnen Arrayelement erhalten, welches 750 Attomol von jedem der zwei Oligonukleotide enthielt. Interpretierbare Massenspektren sind unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten worden für DNAs mit einer Größe bis zu einem 53-mer (350 amol geladen, nicht gezeigt).
Es wurden auch Massenspektren erhalten von DNAs, welche in den Vertiefungen eines Siliciumchips fein verteilt waren. 11 zeigt einen 12 × 12 mm Siliciumchip mit 100 chemisch geätzten Vertiefungen; die Dimensionen der Maske und die Ätzzeit wurden so festgesetzt, dass Vertiefungen mit einer stumpfen Geometrie (d.h. invertierte Pyramiden mit flacher Spitze) mit 800 × 800 μm (obere Fläche) und einer Tiefe von 100 μm erhalten wurden. Gegebenenfalls können die Vertiefungen angeraut oder uneben sein. Wie oben beschrieben, wurde die Chipkante gegenüber einer erhobenen Fläche auf dem Gerüst angeordnet, um die x- und y-Koordinatensysteme im Hinblick auf die Kapillare zu definieren. (Alternativen umfassen eine optische Anordnung, Mustererkennungsroutine durch künstliche Intelligenz und auf manuelles Anordnen, basierend auf Führungsstiften). In jede Vertiefung wurden 20 Tröpfchen (~5 nl) einer 3-HPA-Matrixlösung ohne Analyt verteilt; bei der verwendeten 50% CH₃CN-Lösung lagen die Verdampfungszeiten für jedes Tröpfchen im Größenbereich von 5 bis 10 Sekunden. Bei der Lösungsmittelverdampfung erschien jedes feinverteilte Matrixtröpfchen bei Betrachtung unter einem 120-fach Stereomikroskop im Allgemeinen als eine amorphe und "milchige" flache Scheibe; solche Erscheinungsbilder stimmten überein mit denjenigen von Tröpfchen, von denen das Spektrum der 3b erhalten wurde. Beim Leeren, Spülen und Wiederbefüllen der Spitze mit 1,4 μm einer wässrigen Lösung einer 23-mer DNA (M_r(berechnet) = 6967 Da), wurde die Kapillare über jeden der 100 Punkte der Matrix gerichtet, wobei 5 nl der wässrigen DNA-Lösung direkt oben auf die Matrixtröpfchen verteilt wurden. Bei Verwendung einer Visualisierung über eine CCD-Kamera schien es, dass die wässrige Analytenlösung sich mit der Matrix mischte und die Matrix wieder löste (die vollständige Verdampfung benötigte ~10 Sekunden bei Umgebungstemperatur und Umgebungsluftfeuchtigkeit). Die amorphen Matrixoberflächen wurden zu echten mikrokristallinen Oberflächen umgewandelt, mit kristallinen Merkmalen im Bereich von < 1 μm.
In Übereinstimmung mit der verbesserten Kristallisation, welche durch das Verfahren des Wiederlösens der Matrix geleistet wurde, erschien die Erfassung des Massenspektrums reproduzierbarer als mit einer vorgemischten Matrix plus Analytlösungen; jeder der 100 Punkte mit 5 fmol des 23-mers ergab interpretierte Massenspektren (12), wobei 99/100 Ausgangsionensignale Signal-Hintergrundverhältnisse von > 5 besaßen; solch eine Reproduzierbarkeit wurde auch erhalten mit den ausgetesteten flachen Siliciumoberflächen und metallischen Oberflächen (nicht gezeigt). Die Spektren der 12 wurden erhalten auf einem linearen TOF-Instrument, betrieben bei 26 kV. Bei der internen Kalibrierung des oberen linken Spektrums (Vertiefung 'k1') unter Verwendung von einzeln und doppelt geladenen Molekularionen und Anwendung dieser Kalibrierungsreihe auf alle anderen 99 Spektren als externe Kalibrierung (13) wurde eine Standardabweichung von < 9 Da vom durchschnittlichen Molekulargewicht erhalten, was einer relativen Standardabweichung von ~0,1% entspricht.
Paralleles Verteilen mit dem Roboterstiftwerkzeug
Es wurden Arrays hergestellt mit dem Offset-Druck wie oben beschrieben. Die Geschwindigkeit des X- und Y-Gerüsts beträgt 35 Zoll/Sekunde und die Geschwindigkeit des Z-Gerüsts beträgt 5,5 Zoll/Sekunde. Es ist möglich, die X- und Y-Gerüste bei maximaler Geschwindigkeit zu bewegen, um die Zykluszeiten zu verringern, aber die Geschwindigkeit des Z-Gerüsts muss vor dem Kontakt mit der Oberfläche des Wafers verringert werden, um eine Schädigung der Oberfläche zu vermeiden. Bei solchen Achsengeschwindigkeiten beträgt die ungefähre Zyklusdauer zum Auftragen von 16 Elementen (ein Werkzeugabdruck von den gleichen Lösungen) auf allen zehn Wafern 20 Sekunden, so dass die Herstellung eines Arrays mit 256 Elementen ~5,3 Minuten dauert. Beim Platzieren von unterschiedlichen Oligonukleotidlösungen auf dem Array muss ein zusätzlicher Waschschritt eingefügt werden, um die Spitze des Stifts vor dem Eintauchen in eine andere Lösung zu reinigen, folglich erhöht sich die Zyklusdauer auf 25 Sekunden, oder auf 6,7 Minuten zum Herstellen von 10 Wafern.
Das Zuführen der Probe durch das Werkzeug wurde untersucht unter Verwendung von radiomarkierten Lösungen und dem Phosphorimager, wie es zuvor beschrieben wurde; es wurde bestimmt, dass jeder Stift ungefähr 1 nl Flüssigkeit zuführt. Die Reproduzierbarkeit von Punkt zu Punkt ist hoch. Ein Array von 256 Oligonukleotidelementen mit variierender Sequenz und Konzentration wurde hergestellt auf flachen Siliciumwafern unter Verwendung des Stiftwerkzeugs, und der Wafer wurde durch MALDI-TOF-MS analysiert.
Beispiel 5
Verwendung der Immobilisierung von Nukleinsäuren in hoher Dichte zum Erzeugen von Nukleinsäurearrays
Durch Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens zur hochdichten Anheftung wurde ein Array von DNA-Oligomeren, welche durch MALDI-TOF-Massenspektrometrieanalyse untersucht werden können, auf einem Siliciumwafer mit einer Vielzahl von Stellen, z.B. Vertiefungen oder Flecken auf der Oberfläche erzeugt. Um den Array zu bilden, wurde ein freier Thiol-haltiger Oligonukleotidprimer nur an den ausgewählten Stellen des Wafers (siehe z.B. 14) immobilisiert. Jede Stelle des Arrays enthielt eines von drei unterschiedlichen Oligomeren. Um zu zeigen, dass die unterschiedlichen immobilisierten Oligomere einzeln nachgewiesen und unterschieden werden können, wurden drei verschiedene Oligonukleotide mit unterschiedlichen Längen, welche zu einem der drei Oligomere komplementär sind, an den Array auf dem Wafer hybridisiert und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
Oligonukleotide
Drei Gruppen von komplementären Oligodesoxynukleotidpaaren wurden synthetisiert, wobei ein Mitglied des komplementären Oligonukleotidpaars eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält [bezogen von Operon Technologies oder Oligos, Etc.]. Oligomer 1[d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS); SEQ ID NO: 8] enthält beispielsweise eine 3'-Disulfidbindung, wohingegen Oligomer 2[d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT); ein 5'-Disulfidderivat von SEQ ID NO: 3] und Oligomer 3[d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG); ein 5'-Disulfidderivt von SEQ ID NO:1] jeweils eine 5'-Disulfidbindung enthalten.
Die zu den Oligomeren 1 bis 3 komplementären Oligonukleotide wurden so konzipiert, dass sie verschiedene Längen besaßen, welche während der MALDI-TOF-MS-Analyse leicht untereinander auflösbar waren. Es wurde beispielsweise ein 23-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 9] synthetisiert, welches komplementär zu einem Teil des Oligomers 1 war, ein 12-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 7] wurde synthetisiert, welches komplementär zu einem Teil des Oligomers 2 war und ein 21-mer [SEQ ID NO: 2, Sequenz in Beispiel 1 als "MFM6" bezeichnet] wurde synthetisiert, welches komplementär zu einem Teil von Oligomer 3 war. Außerdem wurde ein viertes 29-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 10] synthetisiert, welches keine Komplementarität zu einem der drei Oligomere aufweist. Dieses vierte Oligonukleotid wurde als Negativkontrolle verwendet.
Siliciumoberflächenchemie und DNA-Immobilisierung
(a) 4 × 4 (16 Stellen) Array
Ein 2 × 2 cm² Siliciumwafer mit 256 einzelnen Mulden oder Vertiefungen in Form eines Arrays mit 16 × 16 Vertiefungen wurde von einem kommerziellen Anbieter bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Vertiefungen waren 800 × 800 μm², 120 μm tief mit einem Abstand von 1,125. Der Siliciumwafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, um eine einheitliche Schicht von primären Aminen auf der Oberfläche zu erzeugen und wurde dann gegenüber dem heterobifunktionellen Vernetzer SIAB exponiert, was Jodacetamidofunktionalitäten auf der Oberfläche ergab [siehe beispielsweise 7].
Um die Oligomere zum Koppeln an die verschiedenen Stellen des Siliciumarrays herzustellen, wurde die Disulfidbindung jedes Oligomers unter Verwendung von 10 mM TCEP vollständig reduziert, wie in Beispiel 1 dargestellt, und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 10 μM in einer Lösung von 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert. Unmittel nach der Reduktion der Disulfidbindung wurde die freie Thiolgruppe des Oligomers an die Jodacetamidofunktionalität an 16 Stellen auf dem Wafer gekoppelt unter Verwendung der Bedingungen der Sondenkopplung, im Wesentlichen wie in 7 beschrieben. Um die getrennte Kopplung an 16 verschiedenen Stellen des Wafers zu erreichen, wurde nicht die gesamte Oberfläche des Wafers mit einer Oligonukleotidlösung gespült, sondern anstatt dessen wurde ein ~30 nl Aliquot eines vorher bestimmten modifizierten Oligomers parallel zu jeder der 16 Stellen (d.h. Vertiefungen) der 256 Vertiefungen auf dem Wafer zugegeben, um einen 4 × 4 Array von immobilisierter DNA unter Verwendung eines hierin beschriebenen Stiftwerkzeugs (siehe beispielsweise die hierin bereitgestellte ausführliche Beschreibung und das Beispiel 4) zu erzeugen.
Wie in 14 gezeigt ist, wurde folglich eines der modifizierten Oligomere 1 bis 3 kovalent an jede der 16 getrennten Vertiefungen der 256 Vertiefungen auf dem Siliciumwafer immobilisiert, wobei ein 4 × 4 Array von immobilisierter DNA erzeugt wurde. Beispielsweise wurde Oligomer 1 an einer Vertiefungsstelle in der oberen linken Ecke des 4 × 4 Arrays konjugiert und Oligomer 2 wurde an die benachbarte Stelle konjugiert usw. Eine Abbildung des fertigen Arrays ist in 14 gezeigt.
Beim Durchführen der Hybridisierungsreaktion wurden die drei komplementären Oligonukleotide und das Oligonukleotid der Negativkontrolle mit einer Endkonzentration von 10 μM für jedes Oligonukleotid in 1 ml TE-Puffer [10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA], ergänzt mit 1 M NaCl, gemischt und die Lösung wurde für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. Unmittelbar danach wurde die gesamte Oberfläche des Siliciumwafers mit 800 μl der erwärmten Oligonukleotidlösung gespült. Die komplementären Oligonukleotide wurden an die immobilisierten Oligomere angelagert durch Inkubation des Siliciumarrays bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C für mindestens 10 Minuten. Alternativ kann die Oligonukleotidlösung zu dem Wafer zugegeben werden, welcher dann erwärmt wird und zur Hybridisierung abgekühlt wird. Eine Veranschaulichung der an die spezifischen, kovalent an jeder Stelle immobilisierten Oligomere angelagerten komplementären Oligonukleotide ist in 15 gezeigt.
Der hybridisierte Array wurde dann mit einer Lösung von 50 mM Ammoniumcitratpuffer zum Kationenaustausch gewaschen, um Natrium- und Kaliumionen aus dem DNA-Rückgrat zu entfernen (Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res., 21:3191-3196). Ein 6 nl-Aliquot einer Matrixlösung von 3-Hydroxypicolinsäure [0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure-10% Ammoniumcitrat in 50% Acetonitril; siehe Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 142-146 (1993)] wurde zu jeder Stelle des Arrays unter Verwendung einer hierin beschriebenen piezoelektrischen Pipette zugegeben.
Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur getrocknet und danach wurde ein Aliquot von 6 nl Wasser zu jeder Stelle zugegeben unter Verwendung einer piezoelektrischen Pipette, um den getrockneten Matrix-DNA-Komplex zu resuspendieren, so dass beim Trocknen bei Umgebungstemperatur der Matrix-DNA-Komplex eine einheitlich kristalline Fläche auf der Bodenfläche jeder Stelle bildet.
MALDI-TOF-MS-Analyse
Die MALDI-TOF-MS-Analyse wurde seriell durchgeführt an jeder der 16 Stellen des in 15 dargestellten Hybridisierungsarrays, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Massenspektrum der Oligonukleotide, welche spezifisch mit jedem der 16 Stellen des DNA-Hybridisierungsarrays hybridisierten, ist in 16 gezeigt. Das Massenspektrum zeigte ein spezifisches Signal an jeder Stelle, welches repräsentativ war für das beobachtete experimentelle Masse-Ladungs-Verhältnis, welches der speziellen komplementären Nukleotidsequenz entspricht.
An den Stellen, an welchen nur Oligomer 1 konjugiert war, zeigte das Massenspektrum beispielsweise ein vorherrschendes Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-Ladungs-Verhältnis von 7072,4, welches ungefähr gleich ist mit dem des 23-mers; das theoretische Masse-Ladungs-Verhältnis des 23-mers beträgt 7072,6 Da. Auf ähnliche Art und Weise wurde eine spezifische Hybridisierung des 12-mer Oligonukleotids an den Array -beobachtetes experimentelles Masse-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 Da (theoretisch 3622,4 Da)- nur an denjenigen Stellen nachgewiesen, welche mit dem Oligomer 2 konjugiert waren, wohingegen eine spezifische Hybridisierung von MJM6 (beobachtetes experimentelles Masse-Ladungs-Verhältnis von 6415,4) nur an den Stellen des Arrays nachgewiesen wurde, welche mit dem Oligomer 3 konjugiert waren [theoretisch 6407,2 Da].
Keine der Stellen des Arrays zeigte ein Signal, welches der Negativkontrolle des 29-mer Oligonukleotids entsprach (theoretisches Masse-Ladungs-Verhältnis von 8974,8), was anzeigt, dass spezifische Ziel-DNA-Moleküle an Oligomere hybridisiert werden können, welche kovalent an spezifischen Stellen auf der Oberfläche des Siliciumarrays immobilisiert sind, und eine Vielzahl von Hybridisierungsassays einzeln überwacht werden kann unter Verwendung einer MALDI-TOF-MS-Analyse.
(b) 8 × 8 (64 Stellen)-Array
Ein 2 × 2 cm² Siliciumwafer mit 256 einzelnen Mulden oder Vertiefungen, welche einen Array mit 16 × 16 Vertiefungen bilden, wurde von einem kommerziellen Anbieter bezogen [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Die Vertiefungen waren 800 × 800 μm², 120 μm tief, mit einer Entfernung von 1,125. Der Siliciumwafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, um eine einheitliche Schicht von primären Aminen auf der Oberfläche zu erzeugen und wurde dann gegenüber dem heterobifunktionellen Vernetzer SIAB exponiert, was in Jodacetamidfunktionalitäten auf der Oberfläche resultierte [siehe beispielsweise 7].
Nach den oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung des 16 Stellen-DNA-Arrays wurden die Oligomere 1 bis 3 an 64 Stellen immobilisiert unter Bildung eines 8 × 8 Arrays auf dem Siliciumwafer mit 256 Vertiefungen, hybridisiert mit komplementären Oligonukleotiden und durch MALDI-TOF-MS-Analyse analysiert. 17 zeigt das Massenspektrum des seriell durch MALDI-TOF-Analyse analysierten DNA-Arrays mit 64 Stellen. Wie bei dem Array mit 16 Stellen gezeigt, wurde eine spezifische Hybridisierung des komplementären Oligonukleotids an jedes der immobilisierten Thiol-haltigen Oligomere an jeder der Stellen des DNA-Arrays beobachtet.
Beispiel 6
Verlängerung der hybridisierten DNA-Primer, welche an die auf einem Siliciumwafer immobilisierten DNA-Template gebunden sind
Die mit SIAB derivatisierten Siliciumwafer können auch verwendet werden für Primerverlängerungsreaktionen des immobilisierten DNA-Templats unter Verwendung der Verfahren, welche im Wesentlichen im U.S. Patent Nr. 5,605,798 beschrieben werden.
Wie in 18 gezeigt wird, wurde ein 27-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 11], mit einer freien 3'-Thiolgruppe an einen mit SIAB derivatisierten Siliciumwafer gekoppelt, wie oben beschrieben, beispielsweise in Beispiel 1. Ein 12-mer Oligonukleotidprimer [SEQ ID NO: 12] wurde mit dem immobilisierten Oligonukleotid hybridisiert und der Primer wurde verlängert unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits [z.B. Sequenase oder ThermoSequenase, U.S. Biochemical Corp.]. Die Zugabe der Sequenase-DNA-Polymerase oder ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart der drei Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP) und dem Didesoxyribonukleosidthymidintriphosphat (ddTTP) in Puffer gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anleitungen resultierte in einer 3-Basen-Verlängerung des 12-mer Primers, während er noch immer an den Siliciumwafer gebunden war. Der Wafer wurde dann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie wie oben beschrieben analysiert. Wie in 18 gezeigt, unterscheiden die Ergebnisse des Massenspektrums klar das 15-mer [SEQ ID NO: 13] von dem originalen nicht verlängerten 12-mer, wodurch angezeigt wird, dass eine spezifische Verlängerung auf der Oberfläche eines Siliciumwafers durchgeführt werden kann, und unter Verwendung einer MALDI-TOF-Analyse nachgewiesen werden kann.
Beispiel 7
Wirkung der Länge des Linkers auf die Polymeraseverlängerung von hybridisierten DNA-Primern, welche an DNA-Template, die auf einem Siliciumwafer immobilisiert sind, gebunden sind
Die Wirkung des Abstands zwischen der mit SIAB konjugierten Siliciumoberfläche und der durch Hybridisierung der Ziel-DNA an das immobilisierte Oligomer-Template gebildete Duplex-DNA wurde untersucht, ebenso wie die Auswahl des Enzyms [siehe beispielsweise 19].
Zwei mit SIAB derivatisierte Siliciumwafer wurden an das 3'-Ende von zwei freien Thiol-haltigen Oligonukleotiden konjugiert, welche eine identische DNA-Sequenz aufwiesen, außer, dass eine poly-dT-Spacersequenz mit 3 Basen am 3'-Ende eingefügt wurde [SEQ ID NO: 8 & 11]. Diese zwei Oligonukleotide wurden synthetisiert und jedes wurde getrennt auf die Oberfläche eines Silikon-Wafers durch den SIAB-Vernetzer immobilisiert [siehe beispielsweise 7]. Jeder Wafer wurde inkubiert mit einem 12-mer Oligonukleotid [SEQ ID NO: 12, 14 und 15], welches komplementär war zu Teilen der Nukleotidsequenzen, welche beiden Oligonukleotiden gemeinsam waren, durch Denaturierung bei 75°C und langsamen Abkühlen des Siliciumwafers. Dann wurden die Wafer durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie wie oben beschrieben analysiert.
Wie zuvor in 18 gezeigt wurde, wurde eine spezielle 3-Basen-Verlängerung des gebundenen 12-mer Oligonukleotids beobachtet unter Verwendung des Oligomerprimers, bei dem sich ein Spacer von 9 Basen zwischen dem Duplex und der Oberfläche [SEQ ID NO: 12] befand. Wie in 19 gezeigt wird, wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn die DNA-Spacerlängen zwischen der SIAB-Komponente und dem DNA-Duplex 0, 3, 6 und 12 betrugen. Die Ergebnisse der MALDI-TOF-Massenspektrometrieanalyse der Wafer sind in 20 gezeigt. Außerdem zeigt 19 auch, dass die Verlängerungsreaktion unter Verwendung einer Vielzahl von DNA-Polymerasen durchgeführt werden kann. Folglich kann der SIAB-Linker direkt an das DNA-Templat gekoppelt werden oder kann eine Linkersequenz enthalten, ohne dass die Primerverlängerung der hybridisierten DNA beeinflusst wird.
Beispiel 8
Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen durch Strangaustausch und Hybridisierung an eine immobilisierte komplementäre Nukleinsäure
Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung eines 24-mer Primers und die spezifische Hybridisierung von einem Strang eines Duplex-DNA-Moleküls, wobei die Amplifikation eines ausgewählten Zielmoleküls in der Lösungsphase ermöglicht wird und der Nachweis des doppelsträngigen Moleküls ermöglicht wird.
Ein 24-mer DNA-Primer CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT [SEQ ID NO: 8], welcher eine 3'-freie Thiolgruppe enthält, wurde an einen mit SIAB derivatisierten Siliciumwafer gekoppelt, im Wesentlichen wie in 7 skizziert und in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Ein synthetisches 18-mer Oligonukleotid 5'-CTGATGCGTCGGATCATC-3' [SEQ ID NO: 16] wurde mit einem 12-mer Oligonukleotid 5'-GATGATCCGACG-3' [SEQ ID NO: 12] vorgemischt, welches eine Sequenz besitzt, die zu dem Teil der 12 Basen des 18-mer Oligonukleotids komplementär ist. Das Oligonukleotidgemisch wurde auf 75°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Bildung eines Duplexmoleküls zu erleichtern:
5'-CTGATGCGTCGGATCATC-3' [SEQ ID NO: 16]
3'-GCAGCCTAGTAG-5' [SEQ ID NO: 12].
Die spezifische Hybridisierung des 12-mer Strangs des Duplexmoleküls an den immobilisierten 24-mer Primer wurde durchgeführt durch Mischen von 1 μM des Duplexmoleküls unter Verwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen.
Die Wafer wurden durch Massenspektrometrie wie oben beschrieben analysiert. Eine spezifische Hybridisierung wurde in einem Massenspektrum des 12-mers mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 3682,78 Da nachgewiesen.
Beispiel 9
1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan
A. 2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd
3-Brom-1-propanol (3,34 g, 24 mmol) wurde unter Rückfluss in 80 ml wasserfreiem Acetonitril mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34 g, 20 mmol), K₂CO₃ (3,5 g) und KI (100 mg) über Nacht (15 Stunden) erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und es wurden 150 ml Methylenchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde zur Trockene verdampft und in 100 ml Methylenchlorid wieder gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. 4,31 g (96%) des gewünschten Produkts wurden nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum erhalten.
R_f = 0,33 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol) Maximum: 313, 240 (Schulter), 215 nm; Minimum: 266 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10,28 (s, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,22 (s, 1H), 4,22 (t, 2H), 3,54 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
B. 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd
2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g (5,3 mmol) tBDMSCI zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Es wurde Methanol (1 ml) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der feste Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid wieder gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Des rohe Gemisch wurde einer schnellen Silikalgelsäule mit Methylenchlorid unterzogen, und ergab 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd.
R_f = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H); 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)ethanol
Im Hochvakuum getrocknetes 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd (1,02 g, 3 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. 2 M Trimethylaluminium in Toluol (3 ml) wurde tropfenweise innerhalb von 10 Minuten zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gehalten. Es wurde weiterhin für 10 Minuten gerührt und das Gemisch wurde in 10 ml eiskaltes Wasser geschüttet. Die Emulsion wurde von der Wasserphase getrennt und über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um das restliche Wasser zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Gemisch wurde auf eine Silikalgelsäule mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid aufgetragen. Es wurden 0,94 g (86%) des gewünschten Produkts isoliert.
R_f = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
D. 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurde in 30 ml THF gelöst und 0,5 mmol nBu₄NF wurde unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde auf eine Silikagelsäule aufgetragen mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid. Es wurde 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,6 g (99%)) erhalten.
R_f = 0,17 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d,1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
E. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g, 2 mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal verdampft und in 20 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt und es wurden 750 mg (2,2 mmol) DMTCI zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und es wurden 0,5 ml Methanol zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal verdampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der letzte Rückstand wurde auf eine Silikagelsäule aufgetragen mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid, enthaltend Tropfen von Triethylamin, und ergab 0,96 g (89%) des gewünschten Produkts 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol.
R_f = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8,00 (d, 1H), 6,82-7,42 (ArH), 5,52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
F. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)diisopropylaminophosphino)ethan
1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol (400 mg, 0,74 mmol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und wurde in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml (1,34 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und es wurden 0,5 ml Methanol zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Gemisch wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen und wurde über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und eine schnelle Silikagelsäule mit 1 % Methanol in Methylenchlorid, enthaltend Tropfen von Triethylamin ergab 510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
R_f = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Beispiel 10
1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan
A. 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
3-Brom-1-propanol (53 ml, 33 mmol) wurde in 100 ml wasserfreiem Acetonitril mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (5 g, 30 mmol), K₂CO₃ (5 g) und KI (300 mg) über Nacht (15 Stunden) unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Methylenchlorid (150 ml) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde zur Trockene verdampft und in 100 ml Methylenchlorid wieder gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. 6,5 g (96,4%) des gewünschten Produkts wurde nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum erhalten.
R_f = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 273, 227, 210 nm; Minimum: 291, 244, 214 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12 (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26,3.
B. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Dieses Gemisch, 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid wurden zugegeben. Nach 4 Stunden wurden 6 ml Methanol zugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde mit einer verdünnten Natriumbicarbonatlösung gewaschen, dann mit Wasser. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der feste Rückstand wurde auf eine Silikagelsäule mit Methylenchlorid aufgetragen und ergab 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (98,6%).
R_f = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nm; Minimum: 290, 243, 214 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 196,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
C. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mmol) wurde portionsweise zu 15 ml einer 70%-igen HNO₃ in einem Wasserbad zugegeben und die Reaktionstemperatur wurde bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und es wurden 30 g zerkleinertes Eis zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die organische Phase wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das rohe Gemisch wurde auf eine Silikagelsäule aufgetragen mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid und ergab 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon und 0,38 g (8%) des ipsosubsitutierten Produkts 5-(3-Acetoxypropoxy)-4.methoxy-1,2-Dinitrobenzol. Das seitlich ipso-substituierte Produkte 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-1,2-dinitrobenzol:
R_f = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum: 310, 282, 263, 223 nm.
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
¹³C NMR (CDCl₃) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Das gewünschte Produkt 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon:
R_f = 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,62 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,96, (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
¹³C NMR (CDCl₃) δ 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0, 108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
D. 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
Zu 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon (3,73 g, 12 mmol) wurden 150 ml Ethanol und 6,5 g K₂CO₃ zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und eine TLC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die Vollendung der Reaktion. Zu diesem gleichen Reaktionsgemisch wurden 3,5 g NaBH₄ zugegeben und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde Aceton (10 ml) zugegeben, um mit dem verbleibenden NaBH₄ zu reagieren. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 50 g Silikagel aufgenommen. Das Silikagelgemisch wurde oben auf eine Silikagelsäule aufgetragen mit 5% Methanol in Methylenchlorid und ergab 3,15 g (97%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
Zwischenprodukt 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon nach dem Entschützen:
R_f = 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Endprodukt 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol:
R_f = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317, 264, 233 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,54 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 5,47 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55 (q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1, 68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
E. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrphenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mmol) wurde zusammen mit wasserfreiem Pyridin zweimal verdampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt und es wurden 450 mg (1,33 mmol) DMTCI zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und es wurden 0,5 ml Methanol zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zusammen mit Toluol zweimal verdampft, um die Spuren des Pyridins zu entfernen. Der letzte Rückstand wurde auf eine Silikagelsäule aufgetragen mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid, enthaltend Tropfen von Triethylamin und ergab 605 mg (88%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol.
R_f = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol/Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
¹³C NMR (DMSO-d₆) δ 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
F. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)diisopropylaminophosphino)ethan
1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol (200 mg, 3,5 mmol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und wurde in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,2 ml (0,89 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und es wurden 0,5 ml Methanol zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und wurde über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und eine schnelle Silikagelsäule mit 1 Methanol in Methylenchlorid, enthaltend Tropfen von Triethylamin ergab 247 mg (91,3%) des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan.
R_f = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Beispiel 11
Oligonukleotidsynthese
Die Oligonukleotidkonjugate, welche photospaltbare Linker enthalten, wurden durch Festphasenukleinsäuresynthese (siehe Sinha et al. Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5843-5846; Sinha et al. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539-4557; Beaucage et al. Tetrahedron 1993, 49, 6123-6194; und Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3185-3191) unter Standardbedingungen hergestellt. Außerdem wurde eine längere Kopplungszeitdauer für das Einbringen einer photospaltbaren Einheit und der 5'-terminalen Aminogruppe verwendet. Die Kopplungseffizienz wurde nachgewiesen durch Messung der Extinktion des freigesetzten DMT-Kations und die Ergebnisse zeigten eine vergleichbare Kopplungseffizienz des Phosphoramidits (1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan oder 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan mit der Kopplungseffizienz von gewöhnlichen Nukleosidphosphoramiditen. Die Entschützung des Basenschutzes und die Freisetzung der Konjugate von dem festen Träger wurde durchgeführt mit konzentriertem Ammonium bei 55°C über Nacht. Die Entschützung des Basenschutzes von anderen Konjugaten wurde durch ein schnelles Entschützen mit AMA-Reagenzien durchgeführt. Die Reinigung der MMT-on-Konjugate wurde durchgeführt durch HPLC (Trityl-on) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0 und einem Gradienten von Acetonitril (5% bis 25% in 20 Minuten). Das gesammelte mit MMT oder DMT geschützte Konjugat wurde im Volumen verringert, mit 80%-iger wässriger Essigsäure detrityliert (40 Minuten, 0°C), entsalzt, bei –20°C gelagert.
Beispiel 12
Photolysestudie
In einem typischen Fall wurden 2 nmol eines Oligonukleotidkonjugats, welches einen photospaltbaren Linker enthält, in 200 μl destilliertem Wasser mit einer langwelligen UV-Lampe (Blak Ray XX-15 UV Lampe, Ultraviolet products, San Gabriel, CA) mit einem Abstand von 10 cm (Emissionspeak 365 nm, Lampenintensität = 1,1 mW/cm² bei einem Abstand von 31 cm) bestrahlt. Das resultierende Gemisch wurde durch HPLC (Trityl-off) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumaceat, pH 7,0 und einem Gradienten von Acetonitril analysiert. Die Analyse zeigte, dass das Konjugat bei UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten vom Linker gespalten wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Analyse eines Materials, umfassend: Bereitstellen eines Vesikels, das zur Aufnahme einer Flüssigkeit geeignet ist, wobei sich das Material in der Flüssigkeit befindet, Anordnen des Vesikels neben einer ersten Stelle auf einer Oberfläche eines Substrats, Steuern des Vesikels, um ein Nanolitervolumen der Flüssigkeit abzugeben, um ein definiertes und gesteuertes Volumen der Flüssigkeit an der ersten Stelle der Oberfläche des Substrats bereitzustellen, Bewegen des Vesikels zu einer zweiten Position neben einer zweiten Stelle auf der Oberfläche des Substrats, um ein definiertes und gesteuertes Volumen des Materials entlang eines Arrays von Stellen auf der Substratoberfläche zu verteilen, und Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse des Materials an jeder Stelle des Arrays.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bereitstellens eines Vesikels, den Schritt des Mischens eines Matrixmaterials und eines Analytenmaterials zur Bildung eines flüssigen Materials umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, einschließlich der Schritte des Bereitstellens eines Vesikels mit einer zur Aufnahme einer Flüssigkeit geeigneten Innenkammer, und Befüllen der Kammer mit einem Matrixmaterial und Verteilen des Matrixmaterials an den Array von Stellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt zur Durchführung der Massenspektrometrie den Schritt zur Durchführung einer Matrix-unterstützen Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt zur Durchführung der Massenspektrometrie den Schritt zur Durchführung einer Flugzeitmassenspektrometrie-Analyse umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt zur Durchführung der Massenspektrometrie den Schritt zur Durchführung einer Fouriertransformations-Massenspektrometrie-Analyse umfasst.
Vorrichtung zum Bilden eines Arrays von Probenmaterial auf einer Oberfläche eines Substrats, umfassend: ein Vesikel mit distalem Ende, welches zur Aufnahme einer Flüssigkeit darauf geeignet ist, einen beweglichen Arm, der durch einen distalen Teil an das Vesikel montiert ist, ein Steuerelement zur Bewegung des Arms, um das Vesikel neben einer ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats anzuordnen und um das Vesikel zu steuern ein Nanolitervolumen der Flüssigkeit an der ersten Stelle auf der Oberfläche des Substrats bereitzustellen, und ein diagnostisches Werkzeug zum Analysieren des Materials, um ein Signal der Zusammensetzung zu erzeugen, welches für die chemische Zusammensetzung des Materials repräsentativ ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei das Vesikel einen festen Materialschaft umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei das Vesikel eine Innenkammer, welche zur Aufnahme eines flüssigen Materials geeignet ist, umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei das Vesikel eine Kammer und ein Transducerelement zum Ausstoßen aus der Kammer umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei das diagnostische Werkzeug ein Massenspektrometer ist.