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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen Immunkonjugate für diagnostische
und therapeutische Verwendungen bei Krebs. Insbesondere betrifft
die Erfindung rekombinant hergestellte humanisierte monoklonale
Antikörper,
die gegen B-Zellen-Lymphome und Leukämiezellen gerichtet sind, wobei
Antikörper
ohne Verlust der Antikörperbindung
und Verinnerlichung der Funktion mit einer reduzierten Herstellung
von menschlichem Anti-Mäuse-Antikörpern kovalent
an ein diagnostisches oder therapeutisches Reagenz konjugiert werden
können.
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Bei
Lymphomen, die nicht vom Hodgkin-Typ sind (NHL), und chronischer
lymphozytischer Leukämie handelt
es sich um bösartige
B-Zellen-Tumore, die zur Sterblichkeit durch Krebs beitragen. Die
Reaktion dieser bösartigen
Tumore auf verschiedene Behandlungsformen ist uneinheitlich. Sie
reagieren einigermaßen
gut auf Chemotherapie und in Fällen,
in welchen wie für
Patienten mit lokaler Erkrankung eine klinische Behandlung von NHL
möglich
ist kann unter Verwendung von Feldbestrahlungstherapie eine zufrieden
stellende Behandlung bereitgestellt werden (Hall et al., Radiology
for the Radiologist, Lippincott, Philadelphia, 1989, S. 365–376). Jedoch
beschränken
die mit einer Chemotherapie verbundenen toxischen Nebenwirkungen
und die Toxizität
gegenüber
dem Hämopoesesystem
durch lokale sowie ganzkörperliche
Radiotherapie die Verwendung dieser therapeutischen Verfahren. Etwa
die Hälfte
der Patienten sterben an der Erkrankung (Posner et al., Blood, 61:
705 (1983)).
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Die
mit Radionukliden oder anderen zytotoxischen Mitteln verbundene
Verwendung von monoklonalen Ziel-Antikörpern bietet die Möglichkeit
der Abgabe sol cher Mittel direkt an die Tumorstelle, wodurch sie
den Kontakt normalen Gewebes mit toxischen Mitteln beschränken (Goldenberg,
Semin. Nucl. Med., 19: 332 (1989)). In den letzten Jahren wurde
das Potential einer Therapie auf Antikörperbasis und ihre Genauigkeit
bei der Lokalisierung von mit Tumoren verbundenen Antigenen sowohl
im Labor als auch in klinischen Studien aufgezeigt (siehe z.B. Thorpe,
TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg; Scientific American, Science & Medicine, 1: 64
(1994); Baldwin et al., U.S. 4,925,922 und 4,916,213; Young, U.S.
4918163; U.S. 5,204,095; Irie et al., U.S. 5,196,337; Hellstrom
et al., U.S. 5,134,075 und 5,171,665). Im Allgemeinen war die Verwendung
von radiomarkierten Antikörpern
oder Antikörperfragmenten
gegen mit Tumoren verbundene Markierungen teilweise aufgrund der
Geringfügigkeit
der Antikörperaufnahme
von dem Tumor im Allgemeinen im Bereich von nur 0,01% bis 0,001%
der injizierten Gesamtdosis für
die Lokalisierung von Tumoren erfolgreicher als für die Therapie
(Vaughan et al., Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987)). Eine Zunahme
der Konzentration der Radiomarkierung zur Erhöhung der Dosierung für den Tumor
ist im Allgemeinen kontraproduktiv, da dadurch auch der Kontakt von
gesundem Gewebe mit der Radioaktivität erhöht wird.
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Bei
LL2 (EPB2) handelt es sich um ein hochspezifisches Anti-B-Zellen-Lymphom und einen
monoklonalen Mäuse-Antikörper (mAb)
der antilymphozytischen Leukämiezelle,
der leicht von solchen Zellen verinnerlicht wird und einige der
vorstehenden Schwierigkeiten bewältigen
kann (Shih et al., Int. J. Cancer, 56: 538 (1994)). LL2, bei welchem
es sich um den IgG2a-Antikörpertyp
handelt, wurde unter Verwendung der Raji-B-Lymphom-Zellreihe als
Antigenquelle entwickelt (Pawlak-Byczkowska et al., Cancer Res.,
49: 4568 (1989)). Es ist bekannt, dass Mäuse-LL2 (mLL2) mit einem Epitop
von CD22 reagiert (Belisle et al., Proc Amer. Assn. Clin. Res.,
34: A2873 (1993)). CD22-Moleküle
werden in das Vorläufer-Zytoplasma
und in frühe Prä-B-Zellen
exprimiert und erscheinen in der Zelloberfläche von reifen B-Zellen.
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Durch
Immunfärben
von Gewebeabschnitten zeigte es sich, dass mLL2 mit 50 von 51 getesteten B-Zellen-Lymphomen
reagiert. mLL2 stellt, wie bestimmt durch ein Radioimmunnachweisverfahren,
ein hochempfindliches Mittel zum Nachweisen einer B-Zellen-Lymphomzelle
in vitro bereit (Murthy et al., Eur. J. Nucl. Med., 19: 394 (1992)).
Das mit 99mTc markierte Fab'-Fragment von mLL2
ist an 63 von 65 bekannten Läsionen bei
Versuchspatienten der Phase II mit B-Zellen-Lymphom lokalisiert (Mills et
al., Proc., Amer. Assn., Cancer Res., 14: A2857 (1993)). Zudem war
mit 131I-markiertes mLL2 bei Patienten mit
B-Zellen-Lymphomen
therapeutisch wirksam (Goldenberg et al., J. Clin. Oncol., 9: 548
(1991)). Das an das Exotoxin PE38KDEL konjugierte mLL2-Fab' induzierte eine
vollständige
Remission von messbaren menschlichen Lymphom-Xenograften (CA-46),
die in Nacktmäusen
wuchsen (Kreitman et al., Cancer Res., 53: 819 (1993)).
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Die
klinische Verwendung von mLL2 war genau wie mit den meisten anderen
versprechenden Mäuse-Antikörpern durch
die Entwicklung einer menschlichen Anti-Mäuse-Antikörperreaktion (HAMA) beim Menschen
beschränkt.
Während
eine HAMA-Reaktion in Folge einer Injektion von mLL2 nicht ausnahmslos
beobachtet wird, entwickelten Patienten in einer bedeutenden Anzahl
an Fällen
HAMA in Folge einer einzelnen Behandlung mit mLL2. Dies kann die
diagnostische und therapeutische Nützlichkeit der Antikörper-Konjugate nicht
nur aufgrund des möglichen
anaphylaktischen Problems beschränken,
sondern es kann auch ein Hauptteil des zirkulierenden Konjugats
an die zirkulieren Anti-Mäuse-Antikörper komplexiert
und durch diese maskiert werden. Dies ist durch eine Studie veranschaulicht,
in welcher etwa 30% der Patienten infolge einer Einzelinjektion
von etwa 6 mg mLL2 131I-IgG eine geringfügige HAMA-Reaktion
und nahezu alle eine starke HAMA-Reaktion mit zusätzlichen
Injektionen entwickelten. Andererseits wurde mit mit 99mTc
markiertem mLL2 Fab' markiert
keine HAMA-Reaktion
beobachtet. Solche HAMA-Reaktionen stellen im Allgemeinen ein mögliches
Hindernis der Realisierung des vollen diagnostischen und therapeutischen
Potentials des mLL2-Antikörpers
dar.
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Wie
vorstehend angemerkt, verringert/umgeht die Verwendung von mLL2-Fragmenten wie F(ab')2 und Fab' diese Probleme der
Immunogenität
teilweise. Jedoch liegen einige Fälle vor, wie beim Ziel einer
Einbringung von zellulärer
Immunität
zur Therapie oder bei Notwendigkeit von Antikörpern mit verbesserter Überlebenszeit,
in welchen vollständiges
IgG erwünschter
ist.
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Zur
Funktion von monoklonalen Antikörpern
als Freisetzungsvehikeln für
Arzneimittel und Radionuklide ist es von primärer Wichtigkeit, Verfahren
für ihre
stellenspezifischen Konjugationen mit minimaler Störung der
erhaltenen Immunreaktivitäten
zu entwickeln. Am herkömmlichsten
wird die Konjugation von Arzneimitteln und Radionukliden durch ihre
kovalenten Anlagerungen an Seitenketten der Aminosäurereste
erzielt. Aufgrund der nicht-stellenbeschränkten Natur dieser Reste ist
es schwierig, unerwünschte
Kopplungen an innerhalb oder in der engen Umgebung des ABS liegende
Reste zu vermeiden, was zu reduzierter Affinität und heterogenen Antigen-Bindungseigenschaften
führt.
Alternativ dazu kann die Konjugation auf Sulfhydrylgruppen gerichtet
sein. Jedoch ist das direkte Markieren mit dem möglichen Risiko einer Proteinfragmentierung
auf die Reduktion von S-S-Bindungen angewiesen.
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WO
96/04925 offenbart ein humanisiertes mAb mit einer natürlich vorkommenden
N-gebundenen Glykosylierungsstelle, die an den Aminosäurepositionen
18–20
der LL2-VK-Domäne
für stellenspezifische
Arzneimittel zu finden ist, oder Chelatkonjugation. Die angelagerte
Kohlenhydrateinheit wurde davon wegpositioniert und zeigte keine
physikalischen Kontakte mit der Antigen-Bindungsstelle (ABS). Die
Immunreaktivität
des Antikörpers
wurde nicht beeinflusst, als Chelate wie DTPA an das Kohlenhydrat
konjugiert wurden.
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Jedoch
ist die Nützlichkeit
dieses Antikörpers
beschränkt.
Erstens ist es nicht klar, welche Größe und welcher Typ von Chelaten
angelagert werden kann, bevor die Immunreaktivität beeinflusst wird. Wir bestimmten,
dass eine Anlagerung von größeren Chelaten
die Bindungsaffinität
beeinflusst. Folglich reduziert die Anlagerung eines Dox-Dextrans
mit 18 kD an das Kohlenhydrat an Position 18–20 der LL2-VK-Domäne die Immunreaktivität um etwa
50%. Weiterhin wäre
es sehr vorteilhaft, andere Antikörper so umzubauen, dass sie aktive
Glykosylierungsstellen enthalten. Der Umbau von anderen Antikörpern in
der Weise, dass Glykosylierungssequenzen in der variablen Region
vorliegen, ist schwierig, da die Umbauschritte für jeden Antikörper wiederholt
werden müssen.
Weiterhin könnte
die Immunreaktivität
des Konstrukts beeinflusst werden.
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Eine
IgG-Glykosylierung an Asn-297 in der CH2-Fc-Domäne wurde für den Beibehalt von Antikörperstabilität und der
geeigneten Struktur für
genaue Effektor-Funktionen
als wichtig charakterisiert. Siehe Tao und Morrison, J. Immunol.
143: 2595 (1989). Aufgrund der eingeschränkten Lokalisierung von fern
von dem ABS liegenden Immunglobulin-Glykosylierungsstellen wurde
eine Oligosaccharidmodifikation von monokonalen Antikörpern zur
Herstellung von Konjugaten verwendet. Konjugate, die mit an ein
tyrosinhaltiges Peptid gekoppeltem 131I
modifiziert sind, das dann stellenspezifisch an oxidierte Oligosaccharide
angelagert wurde, zeigten verglichen mit den nicht selektiv an Tyrosin
modifizierten Konjugaten eine größere Zieleffizienz.
Da die Verwendung von mit Asn-297 verbundenem Kohlenhydrat die Gegenwart
des Fc-Teils des Antikörpers
erfordert, ist seine Verwendung beschränkt. Es gibt verschiedene Anwendungen,
die Antikörperfragmente
einsetzen, in welchen der Fc-Teil nicht vorliegt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung erstreckt sich auf diejenigen Zugänge durch
Umbau von N-gebundenen Glykosylierungsstellen in die konstant schweren
(CH1) Domänen
von IgG-Antikörpern.
Dies weist die folgenden Vorteile auf:
- 1. Die
Glykosylierung erfolgt an einer anderen Domäne, die physikalisch von der
den das ABS bildenden variierbaren Domänen entfernter ist;
- 2. Es wäre
zu erwarten, dass eine Konjugation mit hoher Dosierung von Chelaten
oder sogar sperrigen Gruppen, die die feine Struktur der CH1-Domäne beeinflussen
könnten,
sehr geringe Wirkungen, wenn überhaupt,
auf die das ABS bildenden VH- und VK-Domänen zeigen;
- 3. Antikörperfragmente,
ein bevorzugtes Format in einigen klinischen Anwendungen, enthalten
sowohl die CH1- und CK-Domänen,
und ihre Konjugationsstelle sollte zur Verwendung in Antikörperfragmenten
(z.B. Fab, F(ab')2) geeignet sein;
- 4. Im Gegensatz zur an VK angehängten Glykosylierungsstelle,
die in verschiedene Antikörper
auf einer Basis des fallweisen Vorgehens (z.B. durch stellengerechte
Mutagenese) eingebracht werden müssten, kann
die die Kohlenhydrat-Additionsstellen enthaltende CH1-Domäne leicht
an verschiedene variierbare Domänen
mit verschiedenen Antigenspezifitäten gebunden werden, wenn sie
erst einmal als effizienter Konjugationsumgang identifiziert wurde.
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Es
ist eine Aufgabe dieser Erfindung, humanisierte Antikörper mit
einer Glykosylierung in der CH1-Domäne bereitzustellen, die Antigen-Bindungsspezifität beibehalten.
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Es
ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, Konjugate der glykosylierten
mAbs bereitzustellen, die therapeutische oder diagnostische Modalitäten enthalten.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Therapie- und Diagnoseverfahren
bereitzustellen, die die humanisierten mAbs der Erfindung verwenden.
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Zum
Erzielen dieser Aufgaben wurde in einem Aspekt der Erfindung ein
monoklonaler IgG-Antikörper oder
ein monoklonales IgG-Antikörperfragment
bereitgestellt, das so umgebaut ist, dass es eine Glykosylierungsstelle
in der nicht-Fc-konstanten
schwerkettigen Region enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt
es sich bei dem Antikörper
oder Antikörperfragment
um einen hu manisierten Antikörper
oder um ein humanisiertes Antikörperfragment.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei dem humanisierten spezifischen monoklonalen Antikörper um
einen Antikörper
oder ein humanisiertes B-Zellen-spezifisches Antikörperfragment.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Glykosylierung
an einer Stelle, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den HCN1-, HCN2-, HCN3-, HCN4- und
HCN5-Stellen von 12 lokalisiert. In besonders
bevorzugten Ausführungsformen
handelt es sich bei der Glykosylierungsstelle um die HCN5-Stelle
oder die HCN1-Stelle
von 12. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Antikörper,
der so umgebaut ist, dass er eine Glykosylierungsstelle enthält, um einen
Antikörper
mit der Spezifität
des hLL2-Antikörpers.
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In
einem anderen Aspekt der Erfindung wurde ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt,
das ein schwerkettiges IgG-Antikörpergen
umfasst, das eine Sequenz in der CH1-Region umfasst, die beim gemeinsamen
Exprimieren des Gens mit einem zweiten Gen für eine leichte Antikörperkette
in einer eine Glykosylierung tragenden Zelle einen in der CH1-Region
glykosylierten Antikörper
herstellt.
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In
noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahren zu
Herstellung eines Antikörpers oder
eines in der IgG-CH1-Region glykosylierten Antikörperfragments bereitgestellt,
das das gemeinsame Exprimieren von leicht- oder schwerkettigen Genen
oder Teilen davon, die mit einer Mutation so umgebaut wurden, dass
eine Glykosylierungsstelle in der CH1-Region des schwerkettigen
Gens oder von Teilen davon in einer Glykosylierung gewährenden
Zelle so gebildet wird, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment
in der CH1-Region hergestellt wird, und Isolieren des Antikörpers oder
Antikörperfragments
umfasst.
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In
noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahrung zur
Diagnose oder Behandlung eines Patienten bereitgestellt, wobei ein
monoklonaler IgG-Antikörper oder
ein monoklonales IgG-Antikörperfragment
zum Zielen auf eine spezifisches Antigen verwendet wird, wobei der
Antikörper
oder das Antikörper fragment
als solches oder in an ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel
konjugierter Form verwendet wird, wobei es sich bei der Verbesserung
des Antikörpers
oder Fragments um einen humanisertern monoklonalen Antikörper oder
ein humanisiertes monoklonales Antikörperfragment handelt, das so
umgebaut wurde, dass es eine Gykosylierungsstelle in der nicht-Fc-konstanten
schweren Kette enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Antikörper
oder Antikörperfragment
um einen B-Zellen-spezifischen Antikörper oder um ein B-Zellen-spezifisches
Antikörperfragment.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt einen Vergleich von Mäuse- und
humanierten LL2-VK-Domänen (1A)
und -VH-Domänen
(1B). Nur hFR-Sequenzen
(bezeichnet als REIHuVK und EUHuVH), die von mFR-Sequenzen (bezeichnet
als Mäuse-)
verschieden sind, sind dargestellt und durch Sternchen gekennzeichnet.
CDRs sind in Kästchen
dargestellt. Die durch Computermodellieren zum Kontaktieren eines
CDRs dargestellten FR-Reste sind unterstrichen.
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2 zeigt die Nachbarbeziehungen von LL2-CDRs
mit ihren Gitterregionen (FRs). Einzelne Energie-minimierte Modelle
für die
VL- und VH-Domänen
von mLL2 wurden konstruiert und alle FR-Reste innerhalb eines Radius
von 4,5 Å oder
jedes beliebige CDR-Atom wurden als mögliche CDR-FR-Kontakte identifiziert. CDRs
der leichten (L1, L2, und L3, 2A) und
der schweren (H1, H2, und H3, 2B) Ketten
sind als „Kugel-
und Stäbchen"-Darstellungen dargestellt, die ihre
jeweiligen raumfüllenden
FRs überlagern.
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3A zeigt
die leichte Ketten stützenden
Vektoren (VKpBR) der Säugerexpression
(pKH) und 3B zeigt die schwere Ketten
stützenden
Vektoren (VKpBS) der Säugerexpression
(pG1g).
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4 zeigt die Doppelstrang-DNA und Aminosäuresequenzen
der LL2-VK-Domäne (4A)
und die LL2-VH-Domäne
(4B). Durch die entsprechenden DNA-Sequenzen kodierte
Aminosäuresequenzen sind
als einbuchstabige Codes angegeben. CDR-Aminosäuresequenzen sind in Kästchen dargestellt.
Die in FR1 oder LL2VK lokalisierte Asn-Glykosylierungsstelle (4A)
ist als die unterstrichene NVT-Sequenz dargestellt.
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5A zeigt
die Doppelstrang-DNA und entsprechende Aminosäurereste der hLL2-VK-Domäne. CDR-Aminosäuresequenzen
sind in Kästchen
dargestellt. Die entsprechenden Daten für die VH-Domäne sind in 5B dargestellt.
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6 ist
eine schematische Diagrammdarstellung der PCR/Gensynthese der humanisierten
VH-Region und des Subklonens in den Stützvektor VHpBS.
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7 zeigt
die Ergebnisse eines vergleichbaren Raji-Zell-Konkurrenz-Antikörperbindungstests,
der das Konkurrieren von mLL2- und cLL2-Antikörpern für die Bindung an Zellen gegen
Spuren radiomarkiertes mLL2 beinhaltet.
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8 zeigt die Ergebnisse eines vergleichbaren
Raji-Zell-Konkurrenz-Antikörperbindungstests,
in welchem gemischte humanisierte/chimäre LL2s mit cLL2 (8A)
und zwei Versionen von hLL2 mit cLL2 (8B) verglichen
werden.
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9 zeigt
einen Vergleich der Bindungsverhältnisse
von Antikörperverinnerlichung:
Oberfläche
als Zeitfunktion für
cLL2-, cLL2- (Q-zu-V-Mutagenese),
hLL2- und mLL2-Antikörpern.
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10 zeigt
die Wirkung der Deglykosylierung von mLL2 auf seine Bindungsaffinität an Raji-Zellen.
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11 zeigt
einen Konkurrenzbindungstest, wobei eine Peroxidasekonjugierte mLL2-Bindung
an WN gemessen wurde. hLL2 und glykosylierte Derivate in den schwerkettigen
konstanten Regionen mit den angegebenen Konzentrationen wurden zum
Konkurrieren mit mLL2 verwendet.
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12 zeigt
die N-Glycan-Akzeptor-Sequenzen und Positionen, die in die CH1- und CK-Domänen von
hLL2 eingebracht wurden. Stellengerichtete Mutagenesen wurden zum
Bilden der Tripeptid-Akzeptor-Sequenzen (dargestellt in fett gedruckten
Buchstaben) verwendet. Teilpeptid-Sequenzen der CH1-Domänen (H-Kette) und CK-Domänen
(K-Kette) von hLL2 sind dargestellt und auf die Sequenz- und Strukturhomologie zum
Anzeigen der Lokalisierungen von umgebauten möglichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen (HCN1–HCN5 und
KCN1–KCN4)
abgestimmt. Die β-Strang-Sequenzen
(C–F)
sind in Kästchen
dargestellt. Die Reste wurden gemäß dem Kabat-System nummeriert;
Sternchen (*) zeigen diese schwerkettigen aa-Reste an, die diskontinuierlich
vom vorhergehenden aa-Rest
nummeriert wurden. Die aa-Reste, die durch * angegeben sind, sind
von links nach rechts als 156, 162, 171, 182, 203 bzw. 205 nummeriert.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Glykosylierungsstellen
werden in CH1-Immunglobulin-IgG-Domänen zum Bereitstellen von humanisiertem
Immunglobulin mit umgebauten Glykosylierungsstellen umgebaut. Unter
Verwendung von stellengerichteter Mutagenese werden die Glykosylierungsstellen
in die konstanten Regionen der schweren Ketten, insbesondere in
die CH1-Domänen
eingebaut. CH1-Nukleotid-Sequenzen werden dann in leichtkettige
bzw. schwerkettige Expressionsvektoren subgeklont. Der CH1-mutierte
schwerkettige Expressionsvektor wird gemeinsam mit einem leichtkettigen
Expressionsvektor exprimiert, um mutierte, humanisierte Antikörper mit
abgewandelten Glykosylierungsstellen in der CH1-Domäne zu erzeugen.
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Es
sollte angemerkt werden, dass nicht alle möglichen Kohlenhydrat-Additionssequenzen
zur Oligosaccharidanlagerung verwendet werden können. Eine Reihe an Glykosylierungsmutanten
wurde durch Einbringen von neuen N-gebundenen Glykosylierungssequenzen
an die schwerkettige Komplementaritätbestimmende Region 2 (CDR2-Region)
von Anti-Dextran- bzw. Anti-Dansyl-Antikörpern gebildet. Während eine
Glykosylierung an Asn 54 und Asn 60 des Anti-Dextran-Antikörpers gefunden
wurde, wurde jedoch die in einer ähnlichen Position (Asn 55)
im Anti-Dansyl-Antikörper
platzierte Kohlenhydrat-Additionsstelle
nicht verwendet. Dieser „Positions-Effekt" ist nicht gut nachzuvollziehen,
jedoch ist es äußerst wahrscheinlich,
dass er mit der Proteinkonformation und Zugänglichkeit der Kohlenhydrat-Akzeptorsequenz
für Glycolyl-Transferase verbunden
ist.
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In
dieser Beschreibung sollen die Expressionen „hLL2" oder „hLL2-mAb" den monoklonalen Antikörper bedeuten,
der durch Verbinden oder Subklonen der Komplementaritäts-bestimmenden
Regionen (CDRs) von Mäuse-VK
und -VH-Regionen
an menschliche Gitterregionen (FRs) und Verbinden oder Subklonen
dieser mit menschlichen konstanten leichten bzw. schweren Ketten
konstruiert wird.
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Kovalente
Konjugate zwischen den mutierten Antikörpern der Erfindung und einem
diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagenz, das in pharmazeutisch
verträglichen
Vehikeln (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) formuliert
ist, können
hergestellt werden. B-Zellen-Lymphome und Leukämie-spezifische Antikörper, die
glykosylierte CH1-Domänen
umfassen, die an ein zu humanisierten mAbs führendes diagnostisches oder
therapeutisches Reagenz konjugiert sind, weisen weiterhin die Fähigkeit
zum Verinnerlichen in Zielzellen und zur schnellen intrazellulären Abgabe des
diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagenzes auf (wodurch
die Wirksamkeit des Reagenzes erhöht wird), wobei zudem der Vorteil
einer Reduktion der HAMA-Reaktion im menschlichen Patienten erzielt wird.
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Da
die Kohlenhydrateinheit der umgebauten Antikörper der Erfindung nicht an
der Bindung des Antigens beteiligt ist, können Konjugate verwendet werden,
in welchen ein Reagenz durch Kohlenhydrateinheiten an den Antikörper gebunden
ist. Zum Beispiel kann ein Reagenz an ein oxidiertes Kohlenhydratderivat
konjugiert sein. Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate und
deren Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Mitteln sind
z.B. in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313, Shih et al., Int.
J. Cancer 41: 832 (1988), und in der gleichzeitig anhängigen und
auch Hansen et al. zugewiesenen USSN 08/162,912 bereitgestellt. Eine
direkte Bindung eines Reagenzes an oxidiertes Kohlenhydrat ohne
die Verwendung eines polymeren Trägers ist in McKearn et al.,
U.S.-Patent Nr. 5,156,840 beschrieben.
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Eine
breite Vielfalt an diagnostischen und therapeutischen Reagenzien
kann vorteilhaft an die Antikörper
der Erfindung konjugiert werden. Diese schließen ein: chemotherapeutische
Arzneimittel wie Dexorubicin, Methotrexat, Taxol und dergleichen;
Chelatbildner wie DTPA, an welche nachweisbare Markierungen, wie
Fluoreszenzmoleküle
oder zytotoxische Mittel wie Schwermetalle oder Radionuklide komplexiert
werden können; und
Toxine wie Pseudomonas exotoxin und dergleichen. Verschiedene Ausführungsformen
dieser Konjugate sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
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Zusätzliche
oder alternative Glykosylierungsstellen (NXT/S) können aufgebaut
und in die VK-, CK- und CH-Domänen
eines beliebigen erfindungsgemäßen Antikörpers, z.B.
hLL2, eingebracht werden (hier steht X für eine beliebige Aminosäure außer für Prolin
oder Aspartat). Diese Wirkungen auf die Bindungsspezifität, Bioverteilung
in vivo, in Testtieren, und Effizienz der Konjugation von Arzneimitteln
und Chelaten der glykosylierten Einheiten kann zum Bestimmen von
nützlichen
Glykosylierungsstellen getestet werden. Wahrscheinliche Stellen
zur Glykosylierung können
durch Vergleich mit Glykosylierungsstellen von bekanntem Ab von
verschiedenen Spezies oder Isotypen durch Analyse der bekannten Strukturen
von menschlichen CK- und CH1-Domänen
durch Computermodellieren zum Identifizieren von frei gelegten Positionen
oder durch statistische Zielschussmutagenese identifiziert werden.
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In
der vorliegenden Erfindung verwendete Zellreihen und Kulturmedien
schließen
LL2-Hybridomzellen (EPB-2) (Pawlak-Byczkowska et al., 1989, vorstehend),
Sp2/0-Ag12-Myelomzellen (ATCC, Rockville, MD) und Raji-Zellen ein.
Diese Zellen werden vorzugsweise in Dulbeco-modifiziertem Eagle-Medium
(DMEM), ergänzt mit
10% FCS (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), 2 mM L-Glutamin und 75 μg/ml Gentamicin
(vollständiges DMEM)
gezüchtet.
Man lässt
Transfektome in Hybridomserum-freiem Medium, HSFM, (Gibco/BRL, Gaithersburg,
MA), enthaltend 10% FCS und 75 μg/ml
Gentamicin (vollständiges
HSFM) oder, wo angezeigt, in nur Antibiotika enthaltendem HSFM wachsen.
Die Selektion der Transfektome kann in vollständigem HSFM, enthaltend 500 μg/ml Hygromycin
(Calbiochem, San Diego, CA) durchgeführt werden. Alle Zellreihen
werden vorzugsweise bei 37°C
in 5% CO2 gehalten.
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Aufbau von Glyosylierungsstellen
in CH1 und CK
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Ein
wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist es, dass Antikörperkonformationen
durch Computermodellieren (siehe z.B., Dion, in Goldenberg et al.,
Hg., Cancer Therapy With Radiolabelled Antibodies, CRC Press, Boca
Raton, FL, 1994, hier unter Bezugnahme eingebracht) modelliert werden
können.
Im Allgemeinen werden die 3-D-Strukturen am besten durch Homologie
modelliert, die durch die Verfügbarkeit
von kristallographischen Daten von der Proteindatenbank (PDR Code
1REI, Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112: 535 (1977), hier unter
Bezugnahme eingebracht) erleichtert wird. Gleichermaßen können die
Antikörper-EU-(VH)-Sequenzen (Kabat
et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5. Ausg.,
US Dept. of Health und Human Services, US Gov. Printing Office (1991))
als modellierende Gegenstücke
für FR1
bis FR3 der schweren mLL2-Kette ausgewählt werden; FR4 basierte auf
NEWM. Id. Da Röntgenkoordi nationsdaten
gegenwärtig
für das
Fehlen der EU-Sequenz verwendet werden, können NEWM-Strukturdaten (PDR
Code 3FAB) für
die FRs 1 bis 4 verwendet werden, und Aminosäurenebengruppen können ersetzt
werden, dass sie nach Bedarf mLL2 oder EU (hLL2) zu entsprechen.
Das CDR der leichten Kette kann aus der entsprechenden Sequenz der
1MCP-Proteindatenbank (L1 und L2) und 1REI (L3) modelliert werden.
Für schwerkettige
CDRs können
H1 und H2 auf der Basis der 2HFL-Proteindatenbank bzw. 1MCP vorliegen,
während
H3 de novo modelliert werden kann. Wo immer es möglich ist, sollten Nebengruppenersetzungen
so durchgeführt
werden, dass der Drehwinkel zwischen Cα und Cβ beibehalten wird. Eine Energieminimierung
kann durch das AMBER-Kraftfeld (Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc.
106: 765 (1984) unter Verwendung des Konvergenzverfahrens erzielt
werden. Möglicherweise
kritische FR-CDR-Wechselwirkungen können durch anfängliches
Modellieren der leichten und schweren variablen mLL2-Ketten bestimmt werden.
Alle FR-Reste innerhalb eines Radius von 4,5 Å aller Atome innerhalb der
CDRs können
dadurch identifiziert und im letztendlichen Aufbaumodell von hLL2
beibehalten werden.
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Das
homologe Molekülmodell
des Fab-Fragments von hLL2 wurde mit der QUANTA-Protein-Modellierpackung
unter Verwendung der Röntgenstruktur
von humanisierten Anti-p185her2-Antikörperfragmenten (1FVD) als Haupttemplat
gebildet. Siehe Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285 (1992);
Eizenbrot et al., J. Mol. Biol. 229: 969 (1993). Die Sequenzidentität zwischen
den zwei Antikörpern
beträgt
etwa 80%. Die Einfügungsregionen
wurden durch Durchsuchen von verfügbaren Proteindatengenbanken
modelliert. Nachdem alle Koordinaten gebildet und Verbindungsregionen
normalisiert wurden, wurden eine Reihe von Energieminimierungen
auf das Modell angewandt. Dies schließt 100 Stufen steilsten Abfalls
(SD) nur für
die Nebenkettenatome, dann 100 Stufen SD und CG EM für alle außer Cα-Atome und
schließlich
100-stufige SD und EM für
alle Atome ein. Ein mit der dielektrischen Konstante verbundener
Abstand 4r (r ist die Atom-Atom-Abstand in Å) wurde für elektrostatische Wechselwirkungen
verwendet. Der RMS der Atomposition für äquivalente Hauptketten- und
Nebenket tenatome zwischen 1FVD und hLL2 betrug 1,46 Å bzw. 2,11 Å. Punktmutationen wurden
dann auf hLL2 aufgebracht, um die Modelle der Mutant-Antikörpern hLL2HCN1
und hLL2HCN5 zu bilden. Komplexartige Oligosaccharide wurden unter
Verwendung desselben Programms mit den durch das Sequenzieren von
Kohlenhydraten aufgeklärten
Zusammensetzungen und Strukturen modelliert.
-
Jede
gebildete Oligosaccharidkette wurde dann mit der entsprechenden
N-gebundenen Glykosylierungsstelle
verankert, wobei das 01 des terminalen GlcNac das Nd des
Asn und die 01Cl-Bindung des mit einem der Nd-H-Bindungen des Asn
zusammengereihten GlcNac überlagerte.
Die Konformation der angelagerten Oligosaccharidkette wurde sequentiell
so manipuliert, dass die längste
Verzweigung nahe an der variablen Region der schweren Kette von
hLL2 lag. Nach jeder Einstellung wurden 100 Stufen SD und CG EM
an Zuckeratomen mit fixierten Ankeratomen und hLL2-Atomen angewandt.
-
Die
Ausbauten für
die CK- und CH1-Glykosylierungsstellen basieren auf den folgenden
Prinzipien:
- 1. Eine Kohlenhydrat-Additionsstelle
mit der Sequenz NXS/T wurde ausgewählt. Bei X kann es sich um
eine beliebige Aminosäure
außer
Prolin und Aspartat handeln. Wo immer es möglich ist, wurden nur einzelne Aminosäureveränderungen
zum Installieren von möglichen
Glykosylierungsstellen an einer ausgewählten Position getestet, so
dass die Störung
der Domänenstruktur
minimiert wurde.
- 2. Mögliche
CK- oder CH1-verbundene Glykosylierungsstellen können aus einer bekannten Antikörpersequenz
von verschiedenen Spezies oder Isotypen identifiziert werden.
- 3. Analysen der bekannten Strukturen von menschlichen CK- und
CH1-Domänen durch
Computermodellieren zum Identifizieren von frei gelegten Positionen,
in welchen potentielle Asn-Glykosylierungsstellen eingepflanzt werden
können.
-
Auf
der Basis von Computermodellstudien wurde der engste Zugangsabstand
zwischen dem VK-angehängten
Oligosaccharid und dem CDRs als 20 Å bestimmt. Ein Abstand von
größer als
4,1 Å wird
als frei von Wechselwirkungen betrachtet. Folglich sind um 4,1 Å oder weiter
weg von der Antigen-Bindungsstelle
liegende Glykosylierungsstellen wahrscheinliche Kandidaten zur Verwendung
als Konjugationsstellen für
Antikörperfragmente.
Wo immer es möglich
ist, sind die in die CH1- und CK-Domänen eingebrachten Mutationen von
Natur aus bewahrend, so dass die endgültige tertiäre Struktur der Proteindomänen beibehalten
wird. Eine bewahrende Mutation beinhaltet im Allgemeinen die Substitution
von einer durch eine andere mit ähnlicher Größe und klinischen
Eigenschaften. Speziell handelt es sich bei der gewünschten
Sequenz um NXT/S. Zum Beispiel wäre
durch einen Ersatz eines Glutamins (Q) in der ursprünglichen
Sequenz mit Asparagen (N) eine bewahrende Substitution anzunehmen.
Auf diese Weise können
verschiedene CH1- und CK-Domänenmutationen
zur Erzeugung von erfinderischen Glykosylierungsstellen aufgebaut
werden.
-
Nur
freigelegte Stellen haben die Möglichkeit,
glykosyliert zu werden. Deshalb wurde Computermodellieren zur Unterstützung der
Lokalisierung von zusätzlichen
an möglicherweise
vorteilhaften Positionen vorliegenden Stellen eingesetzt. Es wurde
vorhergesagt, dass die Glykosylierungsstelle HCN5 weiter weg von
dem ABS und an der Oberflächenposition
liegt; die HCN5-Stelle ist an der zwischen den E- und F-Strängen gebildeten
unteren Schleife lokalisiert. Andere Stellen, die entlang der CK-
und CH1-Domänensequenzen „gleichmäßig" verteilt sind, wurden
statistisch selektiert. In allen Fällen wurden mögliche Störungen der
endgültigen tertiären Struktur
durch umsichtiges Auswählen
von Sequenzen minimiert, die nur eine einzelne Aminosäuresubstitution
erfordern, um zu einer möglichen
Glykosylierungsstelle zu werden. Insgesamt 5 CH1-,
(HCN1–5) und
vier Ck-, (KCN1–4)-anhängige Stellen wurden an die
CH1- bzw. Ck-Domänen eingebracht.
Keine dieser Stellen schien, wie durch Computermodellanalysen bestimmt, „verdeckt" zu sein oder an
der Grenzfläche
zwischen zwei nebeneinander gestellten Domänen vorzuliegen.
-
Die
N-Glykosylierung wurde nur als Beispiel beschrieben. Die beteiligten
Prinzipien sind gleichermaßen
auf O-Glykosylierung anwendbar. Der Fachmann versteht leicht die
Anwendung des Modellierens, den Aufbau von Glykosylierungsstellen
und die Abwandlung von konstanten K-, CH-, und VK-Regionen zur Gewährung von
O-Glykosylierung. Es ist bekannt, dass die O-Glykosylierung entweder
an Threonin oder an Serin stattfindet. Die Akzeptorsequenz für eine O-gebundene Glykosylierung
ist relativ schlecht definiert (Wilson et al., Biochem. J. 275:
526 (1991). Dies könnte
eine Vorliebe für
einen höheren
Gehalt von Prolin, Serin und Threonin in diesen Regionen darstellen,
jedoch bestimmt eine Zugänglichkeit
eher als die genaue Primärsequenz,
ob ein bestimmter Threonin- oder Serinrest O-glykosyliert wird.
Nichtsdestotrotz können
mögliche O-Glykosylierungssequenzen
wie diejenigen, die in anderen Antikörpern identifiziert sind, von
welchen bekannt ist, dass die O-Glykosylierung aufweisen (Chandrashekarkan
et al., J. Biol. Chem. 259: 1549 (1981); Smyth und Utsumi, Nature
216: 322 (1967); Kim et al., J. Biol. Chem. 269: 12345 (1994)),
als die Standardsequenzen zum Pfropfen in verschiedene Positionen
in den Antikörpern
von Interesse verwendet werden. Diejenigen, von welchen festgestellt
wurde, dass sie extensive O-Glykosylierung enthalten, können dann
als Konjugationsstelle getestet werden.
-
Ein
anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist es, dass nach Identifikation
einer Glykosylierungsstelle eine weitere Identifikation von anderen
möglichen
Glykosylierungsstellen erleichtert wird. Dies erfolgt auf Grund
von zwei Phänomenen.
Erstens bestätigt
und unterstützt
eine erfolgreiche Glykosylierung weiter das Verfeinern des Modellierens
der relevanten Regionen. Zweitens ist es klar, dass die konstanten
K- und CH1-Regionen eine deutliche Symmetrie aufweisen. Deshalb
führt eine
Identifikation einer Stelle, an welcher eine Glykosylierung an dem
CH1 stattfindet, zu der Erwartung, dass die äquivalente CK-Position eine
gute Glykosylierungsstelle wäre.
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Leichtkettige
Mutationen
-
Potentielle
N-gebundene Glykosylierungsstellen wurden in den Kappa-konstanten
Regionen von Kaninchen-Antikörpern
an der aa-Position 161–163
und 174–176
identifziert. Ähnliche
Stellen können
in die CK-Domäne
von hLL2 eingebracht werden. Siehe z.B. 12.
-
Schwerkettige
Mutationen
-
In
CH1 wurde eine Kohlenhydrat-Additionssequenz, Asn-Asn-Ser, an den
a.a.-Positionen
161–163 (Kabat-Numerierung;
Kabat et al., 1991) in einigen der menschlichen IgM-CH1-Domänen identifiziert.
Gleichermaßen
war die Sequenz Asn-Val-Thr in a.a.-Positionen 168–170 in
der CH1-Domäne
von menschlichem IgA positioniert. Beispiele für Sequenzen, die zum Erzeugen
von abgewandelten Glykosylierungsstellen modifiziert werden können, sind:
Mutieren der menschlichen IgG1-Sequenz Asn-Ser-Gly an Asn-Ser-Val
an Positionen 162–164,
Ala-Leu-Thr an Asn-Leu-Thr
an den a.a.-Positionen 165–167
bzw. Leu-Thr-Ser an Asn-Thr-Ser an den a.a.-Positionen 166–168. Diese
3 möglichen
N-gebundenen Glykosylierungsstellen sind zu denjenigen von IgM und
IgA analog und können
mit Ausnahme einer minimalen Störung
der erhaltenen Struktur in die CH1-Domäne
von menschlichem IgG1 eingebracht werden. Solche Glykosylierungsstellen
können
folglich in einer „natürlichen" Position verbleiben.
Der Aufbau von ähnlichen
Mutationen ist dem Fachmann auf der Basis der Lehren in der Beschreibung
bekannt.
-
Stellengerichtete
Mutagenese
-
Detaillierte
Protokolle für
Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese und verwandte Techniken zur
Mutagenese von geklonter DNA sind bekannt. Siehe z.B. Sambrook et
al., vorstehend, und Ausubel et al., vorstehend.
-
Asn-gebundene
Glykosylierungsstellen können
unter Verwendung von herkömmlichen
stellengerichteten Oligonukleotid-Mutagenese-Reaktionen in Antikörper eingebracht
werden. Zum Beispiel kann man zum Einbringen eines Asn in Position
18 eines Kappa-Proteins Kodon 18 von AGG zu AAC abwandeln. Zum Erzielen
dessen wird ein die leichtkettige Antikörpersequenz enthaltendes Einzelstrang-DNA-Templat von einem geeigneten
Stamm von E. coli (z.B. dut– ung–)
hergestellt, um ein DNA-Molekül
zu erhalten, das eine geringe Anzahl an Uracilen anstelle von Thymidin
enthält.
Ein solches DNA-Templat kann durch M13-Klonen oder durch eine Transkription
in vitro unter Verwendung eines SP6-Promoters erhalten werden. Siehe
z.B. Ausubel et al., Hg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,
John Wiley & Sons,
NY, 1987. Ein Oligonukleotid, das zu der Einzelstrang-DNA komplementär ist und
die mutierte Sequenz umfasst, wird herkömmlich synthetisiert, zu dem
Einzelstrangtemplat annealed und das Produkt mit T4-DNA-Polymerase
und T4-DNA-Ligase behandelt, um ein Doppelstrang-DNA-Molekül herzustellen.
Eine Transformation von E. coli vom Wildtyp (dut+ ung+)-Zellen mit Doppelstrang-DNA gewährt die
Gewinnung von mutierter DNA.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle in eine leichte Antikörperkette
unter Verwendung eines die gewünschte
Mutation enthaltenden Oligonukleotids, beliebiges Amplifizieren
des Oligonukleotids durch PCR und dessen Klonen in variable Regionen
für die
VL-Kette oder unter Verwendung
von RNA von den Antikörper
von Interesse als Templat erzeugenden Zellen eingebracht werden. Siehe
auch, Huse, in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, Boenebaeck,
Hg., W. H. Freeman & Co.,
S. 103–120,
1992. Eine stellengerichtete Mutagenese kann z.B. unter Verwendung
des TRANSFORMERTM-Bausatzes (Clontech, Palo
Alto, CA) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt
werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Glykosylierungsstelle durch Synthetisieren einer Antikörperkette
mit mutmaßlich
primierenden Oligonukleotiden, wobei ein solcher die gewünschte Mutation
enthält, eingebracht
werden. Siehe z.B. Uhlmann, Gene 71: 29 (1988); Wosnick et al.,
Gene 60: 115 (1988); Ausubel et al., vorstehend, hier unter Bezugnahme
eingebracht.
-
Obwohl
die vorstehende Beschreibung sich auf die Einbringung einer Asn-Glykosylierungsstelle
in Position 18 der leichten Kette eines Antikörpers bezog, ist es dem Fachmann
klar, dass es möglich
ist, Asn-gebundene Glykosylierungsstellen überall in den leichtkettigen
oder in den schwerkettigen variablen Regionen oder in den konstanten
Regionen einzubringen.
-
Die
Gegenwart einer Glykosylierungsstelle oder die Abwesenheit einer
solchen Stelle in einem humanisierten Ab, in welchem die Stelle
im Mäuse-Gegenstück glykosyliert
wurde, kann die Bindungsaffinität
oder Spezifität
des Antikörpers
beeinflussen oder nicht. Glykosylierungsstellen können deshalb
durch die vorstehend beschriebenen Verfahren eingebracht oder entfernt
werden, jedoch muss ihr Einfluss auf die Aktivität bestimmt werden. Aus den
vorstehend erörterten
Gründen
wird ein Umbau von Glykosylierungsstellen in den CH1- oder CK-Regionen
bevorzugt.
-
Allgemeine Techniken zur
RNA-Isolierug, cDNA-Synthese und Amplifikation
-
Die
RNA-Isolation, cDNA-Synthese und Amplifikation können wie folgt durchgeführt werden.
Gesamt-Zellen-RNA kann aus einer LL2-Hybridom-Zellreihe unter Verwendung
von insgesamt 107 Zellen gemäß Sambrook
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring
Harbor Press, 1989), hier unter Bezugnahme eingebracht, hergestellt
werden. Einzelstrang-cDNA kann aus Gesamt-RNA in herkömmlicher
Weise, wie unter Verwendung des SuperScript-Präamplifikationssystems
(Gibco/BRL., Gaithersburg, MD), umkehrtranskribiert werden. Kurz
gesagt, können
in einem Reaktionsvolumen von 20 μl
50 ng statistische Primer auf 5 μg
RNA in Gegenwart von 2 μl
10X Synthesepuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl, 25 mM
MgCl2, 1 mg/ml BSA], 1 μl 10 mM- dNTP-Gemisch, 2 μl 0,1 M-DTT, und 200 Einheiten
SuperScript-Umkehrtranskriptase
annealed werden. Man lässt
den Erweiterungsschritt anfänglich
bei Raumtemperatur für eine
Dauer von 10 Minuten verlaufen, gefolgt von Inkubation bei 42°C für eine Dauer
von 50 Minuten. Die Reaktion kann durch Erwärmen des Reaktionsgemischs
bei 90°C
für eine
Dauer von 5 Minuten beendet werden.
-
Konstruktion von Antikörpern mit
umgebauten Glykosylierungsstellen in den VL- und VH-Regionen
-
cDNAs,
die die VL- und VH-Regionen des mLL2-mAb kodieren, wurden isoliert
und rekombinant in Säugerexpressionsvektoren,
enthaltend die Kappa- bzw. IgG1-konstante Regionen
kodierenden Gene von menschlichen Körpern, subgeklont. Eine gemeinsame
Transfektion von Säugerzellen
mit diesen zwei rekombinanten DNAs exprimierten ein cLL2-mAb, das
wie das parentale mLL2-mAb schnell daran gebunden und schnell von
B-Lymphomzellen verinnerlicht wurde.
-
Die
CDRs der VK- und VH-DNAs wurden gleichermaßen an die Gerüst-(FR)-Sequenzen der menschlichen
VK- bzw. VH-Regionen rekombinant gebunden, die anschließend jeweils
an die menschlichen Kappa- und IgG1-konstanten
Regionen gebunden wurden und hLL2 in Säugerzellen exprimierten.
-
Nach
dem Aufbau der Sequenzen für
die hLL2-VK- und VH-Domänen
kann ein CDR-Propfen durch Gensynthese unter Verwendung von langen
synthetischen DNA-Oligonukleotiden als Template und Amplifizieren
der langen Oligonukleotide durch PCR unter Verwendung von kurzen
Oligonukleotiden als Primer erzielt werden. In den meisten Fällen ist
die die VK- oder VH-Domänen
kodierende DNA etwa 350 Basenpaare (bp) lang. Durch Vorteilnahme
der Kodon-Degeneration
kann leicht eine einzelne Restriktionsstelle ohne Veränderung
der kodierten Aminosäuren
an Regionen nahe der Mitte der V-Gen-DNA-Sequenz eingebracht werden. Zum
Beispiel kann an den DNA-Nukleotid-Positionen 157– 162 (Aminosäurepositionen
53 und 54) für
die hLL2-VH-Domäne
eine einzelne AvrII-Stelle eingebracht werden, während die ursprünglich aufgebaute
Aminosäuresequenz
(4B) beibehalten werden kann. Zwei lange, nicht überlappende
Einzelstrang-DNA-Oligonukleotide (~ 150 bp) stromaufwärts und
stromabwärts
der AvrII-Stelle (siehe z.B. Oligo A und Oligo B in nachstehendem
Beispiel 3) können
durch eine automatische DNA-Oligonukleotid-Syntheseapparatur (Cyclone
Plus DNA Synthesizer, Milligen-Biosearch) gebildet werden. Es ist
zu erwarten, dass die Ausbeuten von DNA-Nukleotiden mit voller Länge wie
Oligos A und Oligos B gering sind. Jedoch können sie durch zwei Paare von
eingrenzenden Oligonukleotiden in einer PCR-Reaktion amplifiziert
werden. Die Primer können
mit den nötigen
Restriktionsstellen zum Erleichtern von anschließendem Subklonen aufgebaut
werden. Primer für
Oligo A und Oligo B sollten überlappende
Sequenzen an der AvrII-Stelle enthalten, so dass das erhaltene PCR-Produkt für Oligo
A bzw. Oligo B innerhalb des Gerüsts
an der AvrII-Stelle gebunden werden kann, um eine die hLL2-VH-Domäne kodierende
DNA-Sequenz mit voller Länge
(ca. 350 bp) zu bilden. Die Bindung der PCR-Produkte für Oligo
A (restriktionsaufgeschlossen mit PstI und AvrII) und B (restriktionsaufgeschlossen
mit AvrII und BstEII) an der AvrII-Stelle und ihr Subklonen in die
PstII/BstEII-Stellen des Stützvektors
VHpBS kann in einem einzelnen Dreifragment-Bindungsschritt vollendet
werden. Siehe Beispiel 3. Das Subklonen der korrekten Sequenz in
VHpBS kann zuerst durch Restriktionsaufschlussanalyse erfolgen und
dann durch Sequenzreaktion gemäß Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977) bestätigt werden.
-
Das
HindIII/BamHI-Fragment, das den Ig-Promoter, die Leadersequenz und
die hLL2-VH-Sequenz enthält,
kann aus dem Stützvektor
exzidiert und in die entsprechenden Stellen in einem Vektor auf
pSVgpt-Basis, pG1g, der die Genomsequenz der menschlichen IgG-konstanten
Region, einen Ig-Verstärker
und eine gpt-Selektionsmarkierung enthält, unter Bilden des endgültigen Expressionsvektors
hLL2pG1g subgeklont werden. Ähnliche
Strategien können
für die
Konstruktion der hLL2-VK-Sequenz eingesetzt werden. Bei der für die Bindung
der PCR-Produkte für
die langen Oligonukleotide (Oligos C und D, siehe nachstehende Beispiele) ausgewählte Restriktionsstelle
kann es sich in diesem Falle um NruI handeln.
-
Die
DNA-Sequenz, die den Ig-Promoter, die Leadersequenz und die hLL2-VK-Sequenz enthält, kann durch
Behandlung mit BamH1/HindIII aus dem Stützvektor VKpBR exzidiert und
in die entsprechenden Stellen eines Vektors auf pSVhyg-Basis pKh der die
genomische Sequenz von menschlichen Kappa-Ketten-konstanten Regionen, eine Hygromycin-Selektierungsmarkierung,
einen Ig- und einen Kappa-Verstärker
enthält,
unter Bildung des endgültigen
Expressionsvektors hLL2pKh subgeklont werden.
-
Eine
Humanisierung führt
manchmal zu einer Reduktion oder sogar einem Verlust der Antikörperaffinität. Deshalb
kann eine zusätzliche
Modifikation erforderlich sein, um die ursprüngliche Affinität zu bewahren. Siehe
z.B., Tempest et al., Bio/Technology 9: 266 (1991); Verhoeyen et
al., Science 239: 1534 (1988), hier unter Bezugnahme eingebracht.
Unter der Kenntnis, dass cLL2 eine Bindungsaffinität zeigt,
die mit derjenigen seines Mäuse-Gegenstücks vergleichbar
ist (siehe nachstehendes Beispiel 5), können fehlerhafte Aufbauten, wenn überhaupt,
in der ursprünglichen
Version von hLL2 durch Mischen und Abgleichen der leichten und schweren
Ketten von cLL2 mit denjenigen der humanisierten Version identifiziert
werden. Eine SDS-PAGE-Analyse der verschiedenen humanisierten chimären Misch-und-Abgleich-LL2
unter nicht-reduzierenden (die Disulfid-L-H-Kettenverbindungen bleiben intakt) und
reduzierenden Bedingungen (die Ketten trennen sich) gewährt die
Analyse der Beziehungen der verschiedenen Typen von leichten und
schweren Ketten auf die Eigenschaften des Moleküls. Zum Beispiel kann eine
Migration wie multiple Banden oder wie eine höhere sichtbare Molekülgröße aufgrund
einer Glycan-Gruppe an der N-gebundenen Glykosylierungsstelle vorliegen, die
in den FR1-Region der Mäuse-VK-Domäne von LL2
zu finden ist. Eine einzelne Bande, die bei etwa 25 kDa migriert,
ist die erwartete Molekulargröße für eine nicht-glykosylierte
leichte Kette.
-
Im
Allgemeinen können
zur Herstellung von cLL2-mAb-VH- und -VK-Ketten von mLL2 durch PCR-Klonen
unter Verwendung von DNA-Produkten und Primern erhalten werden.
Orlandi et al., vorstehend, und Leung et al., vorstehend. Die VK-PCR-Primer
können
in einen wie vorstehend beschriebenen Stützvektor auf pBR327-Basis (VKpBR)
subgeklont werden. Die VH-PCR-Produkte können in einen ähnlichen
wie vorstehend beschriebenen Stützvektor
auf pBluescript-Basis
(VHpBS) subgeklont werden. Die Fragmente, die die VK- und VH-Sequenzen zusammen
mit den Promoter- und Signalpeptidsequenzen enthalten können unter
Verwendung von HindIII- und BamHI-Restriktionsendonukleasen aus
den Stützvektoren
exzidiert werden. Die etwa 600 bp langen VK-Fragmente können in
einen Säugerexpressionsvektor,
z.B. pKh durch herkömmliche
Verfahren subgeklont werden. Bei pKh handelt es sich um einen Expressionsvektor
auf pSVhyg-Basis, der die Genomsequenz der humanen Kappa-konstanten
Region, einen Ig-Verstärker,
einen Kappa-Verstärker
und das Hygromycin-Resistenzgen enthält. Gleichermaßen können die
VH-Fragmente mit etwa 800 bp in pG1g, einen Expressionsvektor auf
pSVgpt-Basis, der die Genomsequenz der humanen IgG1-konstanten Region,
einen Ig-Verstärker
und das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-(gpt)-Gen
enthält,
subgeklont werden. Die zwei Plasmide können in Säugerexpressionszellen wie Sp2/0-Ag14-Zellen
durch Elektroporation transfektiert und auf Hygromycin-Resistenz
selektiert werden. Man lässt
die Selektion überlebende
Kolonien anwachsen, und überstehende
Fluids zur Herstellung von cLL2-mAb durch ein ELISA-Verfahren werden überwacht.
Eine Transfektionseffizienz von 1–10 × 106 Zellen
ist erwünscht.
Ein Antikörperexpressionsgehalt
zwischen 0,10 und 2,5 μg/ml
ist mit diesem System zu erwarten.
-
Allgemeine Techniken zur
RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und Amplifikation
-
Die
RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und Amplifikation können wie
folgt durchgeführt
werden. Gesamt-Zellen-RNA kann aus einer LL2-Hybridom-Zellreihe
unter Verwendung von insgesamt etwa 107 Zellen gemäß Sambrook
et al., (Mole cular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold
Spring Harbor Press, 1989, hier unter Bezugnahme eingebracht), hergestellt
werden. Einzelstrang-cDNA kann herkömmlich aus Gesamt-RNA, wie
unter Verwendung des SuperScript-Präamplifikationssystems
(Gibco/BRL., Gaithersburg, MD), umkehrtranskribiert werden. Kurz
gesagt, können
in einem Reaktionsvolumen von 20 μl
50 ng statistische Primer auf 5 μg
RNAs in Gegenwart von 2 μl
10 × Synthesepuffer
[200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl, 25 mM MgCl2,
1 mg/ml BSA], 1 μl
10 mM dNTP-Gemisch, 2 μl
0,1 M-DTT, und 200 Einheiten SuperScript-Umkehrtranskriptase annealed werden.
Man lässt
den Erweiterungsschritt anfänglich
bei einer Raumtemperatur von 10 Minuten verlaufen, gefolgt von Inkubation
bei 42°C
für eine
Dauer von 50 Minuten. Die Reaktion kann durch Erwärmen des
Reaktionsgemischs bei 90°C
für eine
Dauer von 5 Minuten beendet werden.
-
Amplifikation
von VH- und VK-Sequenzen
-
Die
VK- und VH-Sequenzen für
cLL2 oder hLL2 können
durch PCR wie von Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
86: 3833 (1989), hier unter Bezugnahme eingebracht, beschrieben,
amplifiziert werden. VK-Sequenzen können unter Verwendung der Primer
CK3BH und VK5-3 (Leung et al., BioTechniques, 15: 286 (1993), hier
unter Bezugnahme eingebracht, amplifiziert werden, während VH-Sequenzen
unter Verwendung des Primers CH1B amplifiziert werden können, der
die CH1-Region von Mäuse-IgG
und VHIBACK annealed (Orlandi et al., 1989, vorstehend). Die PCR-Reaktionsgemische,
enthaltend 10 μl
des Einzelstrang-cDNA-Produkts, 9 μl 10 × PCR-Puffer [500 mM KCl, 100
mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2, und 0,01% (G/V) Gelatine] (Perkin
Elmer Cetus, Norwalk, CT), können
30 PCR-Zyklen unterzogen werden. Jeder PCR-Zyklus besteht vorzugsweise
aus der Denaturierung bei 94°C
für eine
Dauer von 1 Minute, Annealen bei 50°C für eine Dauer von 1,5 Minuten
und Polymerisation bei 72°C
für eine
Dauer von 1,5 Minuten. Amplifizierte VK- und VH-Fragmente können auf
2%iger Agarose (BioRad, Richmond, CA) gereinigt werden. Siehe Beispiel
3 für ein
Verfahren zur Synthese eines Oligos A (149-mers) und eines Oligos
B (140- mers) auf
einer automatischen DNA-Syntheseapparatur des Typs Cyclone Plus
(Milligan-Biosearch).
-
Die
PCR-Produkte für
VK können
in einen Stützvektor
wie einen Stützvektor
auf pBR327-Basis VKpBR, der einen Ig-Promoter, eine Signalpeptidsequenz
und eine günstige
Restriktionsstelle zum Erleichtern einer Bindung innerhalb des Gerüstes VK-PCR-Produkts
enthält,
subgeklont werden. PCR-Produkte für VH können in einen ähnlichen
Stützvektor,
wie dem VHpBS auf pBluescript-Basis subgeklont werden. Einzelne
die jeweiligen PCR-Produkte enthaltende Kolonien können z.B.
durch das Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
74: 5463 (1977), hier unter Bezugnahme eingebracht, sequenziert
werden.
-
Weiterhin
wurde gefunden, dass die Gegenwart von Glykosylierungsstellen und
deshalb von angehängten
Kohlenhydrateinheiten (CHO) eine wirksame und herausragende Konjugation
von Arzneimitteln und Chelaten bewirkt. Dies gilt insbesondere bei
Verwendung von Antikörperfragmenten
ohne CH2-angehängte CHOs.
-
Die
hier beschriebenen DNA-Sequenzen schließen alle Allele, Mutanten und
Varianten davon, egal ob natürlich
vorkommend oder experimentell gebildet, ein.
-
Herstellung von Antikörpern mit
mutiertem CH1- und CK-Regionen
-
Durch
Methoden, die denjenigen für
die VK- und VH-Sequenzen ähneln,
können
CH1- und CK-DNA-Sequenzen isoliert, die Proteinsequenz modelliert
und die DNA mutiert werden. Wurde die CH1- oder CK-Nukleotidsequenz
aus einem leicht- oder schwerkettigen Klon exzidiert und eine Glykosylierungsstelle über Mutagenese
eingefügt,
kann die mutierte CH1- oder CK-Sequenz wieder in den entsprechenden
schwer- oder leichtkettigen Vektor eingefügt werden. Im Falle eines CH1-Mutanten
kann er gemeinsam mit einem Kappa-Ketten-Expressionsvektor wie hLL2pKh in eine
geeignete Zelle, z.B. Sp2/0-Ag14- Myelom
exprimiert werden, und Kolonien können auf Hygromycin-Resistenz
selektiert werden. Die überstehenden
Fluids können
zur Erzeugung von cLL2, hLL2 oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut
mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen,
z.B. durch einen wie nachstehend beschriebenen ELISA-Test überwacht
werden.
-
Die
Transfektion und der Test für
Antikörper-sekretierende
Klone durch ELISA können
wie folgt durchgeführt
werden. Etwa 10 μg
hLL2pKh (leichtkettiger Expressionsvektor) und 20 μg hLL2pG1g
(schwerkettiger Expressionsvektor) können zur Transfektion von 5 × 106 SP2/0-Myelomzellen durch Elektroporation
(BioRad, Richmond, CA) gemäß Co et
al., J. Immunol., 148: 1149 (1992), hier unter Bezugnahme eingebracht,
verwendet werden. Nach der Transfektion kann man die Zellen in Mikrotiterplatten
mit 96 Mulden in vollständigem
HSFM-Medium (Gibco,
Gaithersburg, MD) bei 37°C,
5% CO2 wachsen lassen. Das Selektionsverfahren
kann durch Zugabe von Hygromycin-Selektionsmedium (Calbiochem, San
Diego, CA) mit einer Endkonzentration von 500 μg/ml Hygromycin nach zwei Tagen
initiiert werden. Die Kolonien treten typischerweise 2 bis 3 Wochen
nach der Elektroporation auf. Die Kulturen können dann zur weiteren Analyse
verlängert
werden.
-
Die
Expressionsgehalte eines den Klon enthaltenden Ig-Gens könnten durch
Amplifizieren der Kopiezahl vergrößert werden. Dies wird typischerweise
durch Selektion einer selektierbaren Markierung durchgeführt, die
an das Gen von Interesse, hier das Ig-Gen, gebunden ist. Der Fachmann
ist mit der Verwendung einer solchen Selektion vertraut. Häufig ist
die selektierbare Markierung das Dihydrofolat-Reduktasegen (dhfr). Typischerweise
wird ein Klon, der eine amplifizierte Kopieanzahl des Gens zu enthalten
scheint, durch seine Expression und Amplifikation identifiziert
und durch Nukleinsäure-Hybridisierungs-Experimente
bestätigt. Mehrfache
Selektionstest- und Bestätigungsrunden
durch Hybridisierung werden typischerweise unternommen.
-
Transfektom-Klone,
die für
die Sekretion von cLL2, hLL2, oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut
mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen,
positiv sind, können
durch einen ELISA-Test identifiziert werden. Kurz gesagt, werden überstehende
Proben (100 μl)
von den Transfektom-Kulturen in dreifacher Ausführung den ELISA-Mikrotiterplatten,
beschichtet mit Ziegen-antihumanem (GAH)-IgG, F(ab')2-fragmentspezifischen
Antikörper
(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), zugesetzt. Die Platten werden
für eine
Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene
Proteine werden durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (PBS,
enthaltend 0,05% Polysorbat 20) entfernt. Mit Meerrettich-Peroxidase
(HRP) konjugierte GAH-IgG, Fc-fragmentspezifische
Antikörper
(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) werden den Mulden zugesetzt
(100 μl
Antikörper-Stammlösung, verdünnt ×104, ergänzt
mit den unkonjugierten Antikörper
auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml). Nach der Inkubation für eine Dauer
von einer Stunde werden die Platten typischerweise drei Mal gewaschen.
Eine Reaktionslösung
[100 μl,
enthaltend 167 μg
Orthophenylen-Diamin (OPD) (Sigma, St. Louis, MO), 0,025% Wasserstoffperoxidase
in PBS] wird den Mulden zugesetzt. Man lässt die Farbe im Dunklen für eine Dauer
von 30 Minuten entwickeln. Die Reaktion wird durch die Zugabe von
50 μl 4
N-HCl-Lösung
zu jeder Mulde vor dem Messen der Absorption bei 490 nm in einem
automatischen ELISA-Lesegerät
(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gestoppt. Gebundene Antikörper werden
dann in Bezug auf einen irrelevanten chimären Antikörperstandard (erhältlich von
Scotgen, Ltd., Edinburgh, Schottland) bestimmt.
-
Antikörper können aus
Zellkulturmedien wie folgt isoliert werden. Transfektom-Kulturen werden für serumfreies
Medium angepasst. Zur Herstellung von chimären Antikörpern lässt man Zellen als Kultur mit
500 ml in Rollflaschen unter Verwendung von HSFM wachsen. Die Kulturen
werden zentrifugiert und der Überstand durch
eine Membran mit 0,2 Mikron filtriert. Das filtrierte Medium wird
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min durch eine Protein-A-Säule (1 × 3 cm) geleitet. Das Harz
wird dann mit etwa 10 Säulenvolumen
PBS gewaschen und der Protein-A-gebundene Antikörper aus der Säule mit
0,1 M Glycinpuffer (pH 3,5) enthaltend 10 mM EDTA, eluiert. Fraktionen
mit 1,0 ml werden in Röhrchen,
enthaltend 10 μl
3 M Tris (pH 8,6) aufgefangen und die Proteinkonzentrationen von
den Absorptionen bei 280/260 nm bestimmt. Spitzenfraktionen werden
gepoolt, gegen PBS dialysiert und der Antikörper z.B. mit dem Centricon
30 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Die Antikörperkonzentration wird wie
vorstehend durch ELISA bestimmt und ihre Konzentration auf etwa
1 mg/ml unter Verwendung von PBS eingestellt. Natriumazid, 0,01%
(g/v), wird günstigerweise
der Probe als Konservierungsmittel zugesetzt.
-
Vergleichbare
Bindungsaffinitäten
der so isolierten Antikörper
können
durch einen direkten Radioimmuntest bestimmt werden. Ein cLL2, hLL2
oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut
mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen,
kann verwendet werden. Antikörper
können
unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens mit 131I
oder 125I markiert werden (siehe z.B., Greenwood
et al., Biochem. J., 89: 123 (1963), hier unter Bezugnahme eingebracht).
Die spezifische Aktivität
des iodierten Antikörpers
wird typischerweise auf etwa 10 μCi/ μg eingestellt.
Unmarkierte und markierte Antikörper
werden unter Verwendung von Reaktionsmedium (HSFM, ergänzt mit
1% Pferdeserum und 100 μg/ml
Gentamicin) auf die entsprechenden Konzentrationen verdünnt. Die
geeigneten Konzentrationen sowohl von markierten als auch von unmarkierten Antikörpern werden
zusammen den Reaktionsröhrchen
mit einem Gesamtvolumen von 100 μl
zugesetzt. Eine Kultur von Raji-Zellen wird als Probe verwendet
und die Zellkonzentration bestimmt. Die Kultur wird zentrifugiert
und die aufgefangenen Zellen ein Mal in Reaktionsmedium gewaschen,
gefolgt von Resuspension in Reaktionsmedium auf eine Endkonzentration
von etwa 107 Zellen/ml. Alle Verfahren werden
in der Kälte
bei 4°C durchgeführt. Die
Zellsuspension, 100 μl,
wird dann den Reaktionsröhrchen
zugesetzt. Die Reaktion wird bei 4°C für eine Dauer von 2 Stunden
unter periodischem sanftem Schütteln
der Reaktionsröhrchen
zum Resuspendieren der Zellen durchgeführt. Nach der Reaktionsdauer
werden jedem Röhrchen
5 ml Waschpuffer (PBS, enthaltend 1% BSA) zugesetzt. Die Suspensi on
wird zentrifugiert und das Zellpellet zwei Mal mit weiteren 5 ml Waschpuffer
gewaschen. Nach der Zentrifugation wird die Menge von im Zellpellet
verbliebener Radioaktivität in
einem Gammazähler
(Minaxi, Packard Instruments, Sterling, VA) bestimmt.
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Die
Antigenbindungseigenschaft der Antikörper der Erfindung kann durch
Konkurrenzbindung mit markiertem mLL2 für einen LL2-Anti-Iod-Typ-Antikörper (WN)
bewertet werden.
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Die
Antigenbindungsaffinitäten
der Raji-Zelloberiläche
von Misch-und-Abgleich- und
voll humanisierten Antikörpern
kann unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von mLL2
F(ab')2-Fragmenten ohne
den Fc-Teil als Konkurrenzpartner, wie bewertet durch Fließzytometrietest,
mit derjenigen von cLL2 verglichen werden. Restliche oberflächengebundene
LL2-Antikörper,
die die humanen Fc-Teile (cLL2 und Misch-und-Abgleich-LL2) tragen,
können
durch einen FITC-markierten anti-humanen Fc-spezifischen Antikörper in
einem Fließzytometrietest
nachgewiesen werden. Wo Misch-und-Abgleich-LL2-Antikörper Antigenbindungsaffinitäten zeigen,
die denjenigen von cLL2 ähneln,
kann gefolgert werden, dass die ursprünglichen Aufbauten für die Humanisierung
sowohl der leichten als auch der schweren Ketten die mLL2-Immunreaktivität beibehalten.
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Die
Verinnerlichung von cLL2, hLL2 oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut
mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen in
Zielzellen kann durch Fluoreszenzmarkieren im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Pirker et al., J. Clin. Invest., 76: 1261 (1985), hier unter
Bezugnahme eingebracht, durchgeführt
werden. Gezüchtete
Raji-Zellen werden zentrifugiert und die Zellen in frischem Medium
auf eine Konzentration von etwa 5 × 106 Zellen/ml
resuspendiert. Jeder Mulde einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden
werden 100 μl
der Zellsuspension zugesetzt. Die Antikörper, 40 μg/ml, in einem Volumen von 100 μl werden
dem Reaktionsmulden mit zeitlichen Intervallen so zugesetzt, dass
alle Reaktionen gleichzeitig beendet sind. Die Platte wird bei 37°C in einem
CO2- Zellkulturinkubator
inkubiert. Ungebundene Antikörper
werden durch dreimaliges Waschen der Zellen mit kaltem 1%igem FCS/PBS
am Ende der Inkubation entfernt. Die Zellen werden dann mit 1 ml
Formaid-Fresh (10% Formalin-Lösung
(Fisher, Fair Lawn, NJ)) für
eine Dauer von 15 Minuten bei 4°C
behandelt. Nach dem Waschen werden entweder auf der Zelloberfläche oder
innerhalb der Zellen vorliegende Antikörper durch Behandlung mit FITC-markiertem
Ziege-Anti-Mäuse-Antikörper (Tago,
Burlingame, CA) oder FITC-markiertem Ziege-Antihumanem Antikörper (Jackson
ImmunoResearch, West Grove, PA), abhängig davon, ob der Antikörper auf
mäuseartig,
chimär
beziehungsweise humanisiert getestet wird, nachgewiesen. Fluoreszenzverteilungen
werden unter Verwendung eines BH-2-Fluoreszenz-Mikroskops (Olympus, Lake
Success, NY) bewertet.
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Die
Geschwindigkeit der Antikörperverinnerlichung
kann gemäß Opresko
et al., (J. Biol. Chem., 262: 4116 (1987)) unter Verwendung von
radioiodiertem Antikörper
als Tracer bestimmt werden. Kurz gesagt, werden radiomarkierte Antikörper (1 × 104 cpm) mit den Raji-Zellen (1 × 106 Zellen/ml) bei 4°C für eine Dauer von 2 Stunden
in 0,5 ml DMEM-Medium, enthaltend 1% humanes Serum, inkubiert. Nach
der Reaktionsdauer werden nicht-spezifisch gebundene Antikörper durch
dreimaliges Waschen mit 0,5 ml DMEM-Medium entfernt. Jedem der Reaktionsröhrchen werden
0,5 ml DMEM-Medium zugesetzt, und die Suspension wird bei 37°C zur Bestimmung
der Verinnerlichung inkubiert. Zu zeitlichen Intervallen werden
dreifache Ausführungen
von Zellen entfernt und unmittelbar in einem Eisbad zum Stoppen
von weiterer Verinnerlichung abgekühlt. Zellen werden bei 1000 × g für eine Dauer
von 5 Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wird entfernt und auf Radioaktivität gezählt. Die oberflächengebundene
Radioaktivität
wird durch Behandlung mit 1 ml 0,1 M-Acetat/0,1 M-Glycinpuffer bei
pH 3,0 für
eine Dauer von 8 Minuten in der Kälte entfernt. Die Radioaktivität wird durch
Säurebehandlung
entfernt und diejenige, die mit den Zellen verbunden blieb, bestimmt.
Das Verhältnis
des CPMVerinnerlichung/CPMOberfläche wird
gegenüber
der Zeit graphisch dargestellt, um die Geschwindigkeit der Verinnerlichung
aus der Neigung zu bestimmen.
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Die
nachstehend beschriebenen repräsentativen
Ausführungsformen
werden einfach zur Veranschaulichung der Erfindung verwendet. Der
Fachmann erkennt, dass Abweichungen von den vorliegenden Materialien
in den breiten allgemeinen Umfang der beanspruchten Erfindung fallen.
Die Inhalte aller hier erwähnten Literaturangaben
sind hier unter Bezugnahme eingebracht.
-
Beispiel 1
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Wahl eines menschlichen
Gerüsts
und Sequenzaufbau für
die Humanisierung von LL2-monoklonalem Antikörper
-
Durch
Vergleich von Mäuse-variierbaren
(V) Sequenzen des Regiongerüsts
(FR) von LL2 mit denjenigen von menschlichen Antikörpern in
der Kabat-Datenbank (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5. Ausg., U.S. Department of Health and Human Services,
U.S. Government Printing Office, Washington, D. C.), hier unter
Bezugnahme eingebracht, wurde gefunden, dass die menschlichen REI-Sequenzen
(1A) und EU-Sequenzen (1B) mit
den FRs von VK- bzw. VH-Domänen
von LL2 den höchsten
Grad an Sequenzhomologie zeigen. Deshalb wurden die REI- und EU-FRs
als das menschliche Gerüst
ausgewählt,
auf welches die CDRs für
LL2-VK bzw. -VH gepfropft wurden. Die FR4-Sequenz von NEWM wurde
jedoch eher als diejenige von EU zum Ersetzen der EU-FR4-Sequenz
für die
Humanisierung von LL2-schweren Ketten verwendet. Auf der Basis der
Ergebnisse von Computermodellstudien (2A und 2B)
wurden Mäuse-FR-Reste
mit möglichen
CDR-Kontakten, die
die Affinität
und Spezifität
des erhaltenen Antikörpers
beeinflussen könnten,
beim Ausbau der humansierten FR-Sequenzen (1)
beibehalten.
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Zwei
Versionen von humanisierten schweren Ketten wurden konstruiert.
In der ersten Version (hLL2-1) wurde das Glutamin (Q) an Aminosäureposition
5 (Kabat-Nummerierung) eingebracht, um zum Erleichtern ihres Klonens
in den Stütz vektor
(3) eine PstI-Restriktionsstelle einzuschließen. Dieser
Mäuse-Rest wurde durch
Oligo-gerichtete Mutagenese zu dem menschlichen EU-Rest Valin (V)
in hLL2-2 umgewandelt. Es sollte angemerkt werden, dass die ursprüngliche
variable Sequenz der Mäuse-Kappa-Ketten
eine mögliche
N-gebundene Glykosylierungsstelle
an den Positionen 18–20
identifiziert und zur Kohlenhydrataddition verwendet wurde. Diese
Glykosylierungsstelle war nicht in der zur Humanisierung der leichten
LL2-Ketten verwendeten REI-FR-Sequenz eingeschlossen.
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Beispiel 2
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PCR-Klonen und Sequenzaufklärung für schwer-
und leichtkettige variable LL2-Regionen
-
Die
variablen Regionen für
sowohl schwere (VH) als auch leichte (VK) Ketten von mLL2 (IgG2a)
wurden durch PCR-Klonen unter Verwendung von wie im allgemeinen
vorstehend und in größerem Detail
in nachstehendem Beispiel 3 beschriebenen DNA-Primern erhalten.
Da eine PCR für
Mutationen anfällig
ist, wurde die variable Regionsequenz von multiplen einzelnen Klonen
entweder für
die schweren oder die leichten Ketten für sechs Klone bestimmt, und
es wurde bestätigt,
dass sie vor der Verwendung für
die Konstruktion des chimären
Antikörpers
identisch sind.
-
Die
PCR-Produkte für
VK wurden in einen Stützvektor
auf pBR327-Basis, VKpBR, der einen Ig-Promoter, eine Signalpeptidsequenz
und günstige
Restriktionsstellen zum Erleichtern einer Bindung innerhalb des Gerüsts des
VK-PCR-Produkte
(3A) enthielt, subgeklont. Die PCR-Produkte für VH wurden
in einen ähnlichen
Stützvektor
auf pBluescript-Basis, VHpBS, (3B) subgeklont.
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Wie
vorstehend angemerkt, wurden mindestens sechs einzelne die jeweiligen
PCR-Produkte enthaltende Klone gemäß dem Verfahren von Sanger
et al., 1977, vorstehend, sequenziert. Es zeigte sich, dass alle identische
Sequenzen tragen, und ihre jeweiligen Sequenzen wurden, wie in 4A für LL2-VK
und in 4B für LL2-VH dargestellt, aufgeklärt. Keine
fehlerhaften Mutationen wurden in dem die VK- und VH-Regionen kodierenden
Sequenzen identifiziert. Ein Vergleich der PCR-amplifizierten variablen
Regionssequenzen von LL2 mit der Kabat-Datenbank (Kabat et al.,
vorstehend) legte nahe, dass die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zu der Untergruppe
5 bzw. 2B gehören.
Wichtige Reste wie Cys für
die Intradomän-Disulfid-Bindung wurden
an geeigneten Positionen zurückgehalten.
-
In
der FR1-Gerüstregion
von VK wurde eine N-gebundene Kohlenhydrat-Anlagerungsstelle, Asn-Val-Thr, an Position
18–20
(4A) identifiziert, was nahe legte, dass das VK
von LL2 glykosyliert sein könnte.
Wie nachstehend detailliert beschrieben, zeigte eine SDS-PAGE-Analyse
unter reduzierenden Bedingungen, dass diese als N-Glykosylierungsstelle
tatsächlich
zur Kohlenhydrat-Addition
verwendet wird. Die Gegenwart der Glykosylierungsstelle in der variablen
Region scheint jedoch die Immunreaktivität des Antikörpers nicht zu beeinflussen.
Ein Vergleich der Immunreaktivität
von mLL2 mit derjenigen von cLL2 in einer Konkurrenz-RIA zeigte,
dass die beiden Antikörper
nahezu identische Aktivitäten
aufweisen.
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Beispiel 3
-
PCR/Gen-Synthese der humanisierten
V-Gene
-
Die
aufgebaute Sequenz für
die hLL2-VH-Domäne,
die Konstruktion der hLL2-VH-Domäne durch
lange Oligonukleotide und PCR und der Stützvektor VHpBS, enthaltend
die hLL2-VH-Domäne,
sind in der in 6 dargestellten Umrisszeichnung
zusammengefasst.
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Für die Konstruktion
der hLL2-VH-Domäne
wurden Oligo A (149-mer) und Oligo B (140-mer) auf einer automatischen
DNA-Syntheseapparatur des Typs CYCLONE PLUS (Milligen Bioresearch)
synthetisiert.
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Oligo
A stellt den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne komplementär zu den
Nukleotiden 24 bis 172 dar: 5'-TAT
AAT CAT TCC TAG GAT TAA TGT ATC CAA TCC ATT CCA GAC CCT GTC CAG
GTG CCT GCC TGA CCC AGT GCA GCC AGT AGC TAG TAA AGG TGT AGC CAG
AAG CCT TGC AGG AGA CCT TCA CTG ATG ACC CAG GTT TCT TGA CTT CAG
CC-3' dar.
-
Oligo
B stellt den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne komplementär zu nt
180 bis 320 dar:
5'-CCC
CAG TAG AAC GTA GTA ATA TCC GCA CAA AAA TAA AAT GCC GTG TCC TCA
GAC CTC AGG CTG CTC AGC TCC ATG TAG GCT GTA TTG GTG GAT TCG TCT
GCA GTT ATT GTG GCC TTG TCC TTG AAG TTC TGA TT-3' dar.
-
Die
Oligos A und B wurden von dem Träger
abgespalten und durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid
entschützt.
Nach Vakuumtrocknen (SpeedVac, Savant, Farmingdale, NY) der Proben
und Resuspendieren in 100 μl
Wasser wurden durch Zentrifugation durch eine CHROMOSPIN-100TM-Säule
(Clontech, Palo Alto, CA) vor dem Amplifizieren durch PCR der DNA-Oligomere unvollständige Oligomere
(weniger als 100-mer) entfernt. Alle eingrenzenden Primer für die getrennten
Amplifikationen und das PCR-Klonen von Oligos A und B wurden durch
SDS-PAGE im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Sambrook et al., 1988, vorstehend, gereinigt. Von den mit CHROMASPIN
gereinigten Oligo A wurde 1 μl
Probestammlösung
in einem Reaktionsvolumen von 100 μl durch Zugabe von 5 μl 5 μM Oligo:
5'-CCA GCT GCA GCA
ATC AGG GGC TGA AGT CAA GAA ACC TG-3' und von Oligo: 5'-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA
TTA ATG-3' in Gegenwart
von 10 μl
10 × PCR-Puffer
(500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 15 mM MgCl2)
und 5 Einheiten AMPLITAQTM-DNA-Polymerase
(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct.) PCR-amplifiziert. Dieses Reaktionsgemisch
wurde 30 Zyklen PCR-Reaktion, bestehend aus der Denaturierung bei
94°C für eine Dauer
von 1 Minute, Annealen bei 50°C
für eine
Dauer von 1,5 Minuten und Polymerisation bei 72°C für eine Dauer von 1,5 Minuten,
unterzogen.
-
Oligo
B wurde durch die Primerpaare: 5'-TAA
TCC TAG GAA TGA TTA TAC TGA GTA CAA TCA GAA CTT CAA CGA CCA G-3' und: 5'-GGA GAC GGT GAC
CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GAA CGT AGT AA-3' unter ähnlichen Bedingungen PCR-amplifiziert.
-
Doppelstrang-PCR-amplifizierte
Produkte für
Oligos A und B wurden gelgereinigt, mit PstI/AvrII (PCR-Produkt
von Oligo A) und BstEII/AvrII (PCR-Produkt von Oligo B) restriktionsaufgeschlossen,
und in die komplementären
PstI/BstEII-Stellen
des schwerkettigen Stützvektors
VHpBS geklont. Die humanisierte VH-Sequenz wurde in den pG1g-Vektor subgeklont,
was zu dem endgültigen
humanen IgG1 schwerkettigen Expressionsvektor hLL2pG1g führte.
-
Zur
Konstruktion der DNA mit voller Länge der humanisierten VK-Sequenz
wurden Oligo E (150-mer) und Oligo F (121-mer), wie vorstehend beschrieben,
synthetisiert. Oligo E umfasst:
5'-CCT AGT GGA TGC CCA GTA GAT CAG CAG
TTT AGG TGC TTT CCC TGG TTT CTG GTG GTA CCA GGC CAA GTA GTT CTT
GTG ATT TGC ACT GTA TAA AAC ACT TTG ACT GGA CTT ACA GCT CAT AGT GAC
CCT ATC TCC AAC AGA TGC GCT CAG-3'. Er stellt den Minusstrang der humanisierten
VK-Domäne komplementär zu nt
31 bis 180 dar und diese Sequenz wurde durch Oligo: 5'-GAC AAG CTT CAG
CTG ACC CAG TCT CCA TCA TCT CTG AGC GCA TCT GTT GGA G-3' und Oligo: 5'-AGA GAA TCG CGA
AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CCA GTA-3' PCR-amplifiziert.
-
Die
Oligo-F-Sequenz lautet 5' CCA
GCT TGG TCC CTC CAC CGA ACG TCC ACG AGG AGA GGT ATT GGT GAC AAT
AAT ATG TTG CAA TGT CTT CTG GTT GAA GAG AGC TGA TGG TGA AAG TAA
AAT CTG TCC CAG ATC CGC TGC C-3'.
Sie stellt den Minusstrang der humanisierten LL2-VK-Domäne komplementär zu nt
208 bis 328 dar. Sie wurde durch Oligo: 5'-GAC AAG CTT TCG CGA TTC TCT GGC AGC
CGA TCT GGG ACA G-3' und
Oligo: 5'-GAC CGG
CAG ATC TGC ACC TTG GTC CCT CCA CCG-3' PCR-amplifiziert.
-
Gelgereinigte
PCR-Produkte für
Oligos E und F wurden mit PvuII/NruI bzw. NruI/BglIII restriktionsaufgeschlossen.
Die zwei PCR-Fragmente E und F wurden dann an die NruI-Stelle gebunden
und an die komplementären
PvuI/BcII-Stellen
des leichtkettigen Stützvektors
VKpBR gebunden. Die humanisierte VK-Sequenz wurde in Vektor pKh subgeklont,
um den endgültigen
humanen Kappa-Ketten-Expressionsvektor
hLL2pKh zu bilden.
-
Zum
Exprimieren der humanisierten Antikörper wurden etwa 10 μg linearisiertes
hLL2pKh und 20 μg linearisiertes
hLL2pG1g zum Transfektieren von 5 × 106 SP2/0-Zellen
durch Elekroporation verwendet. Die Transfektome wurden mit Hygromycin
mit 500 μg/ml
selektiert und der sekretierte Antikörper auf einer Säule mit
1 × 3
cm von Protein A gereinigt. Nach Konzentrieren des gereinigten Antikörpers durch
Zentrifugation mit Centricon 30 wurde die Antikörperkonzentration durch ELISA
bestimmt. Die Endkonzentration des Antikörpers wurde in PBS-Puffer,
enthaltend 0,01% (G/V) Natriumazid als Konservierungsmittel, auf
1 mg/ml eingestellt.
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1 vergleicht die Aminosäuresequenz
zwischen Mäuse-
und humanisierten LL2-VK-Domänen (1A)
und zwischen Mäuse-
und humanisierten LL2-VH-Domänen
(1B). In der VK-Kette wurden REI-Gerüstsequenzen
für alle
FRs verwendet. In der VH-Kette wurden humane EU-Gerüstsequenzen
für FR 1–3 verwendet,
und NEWM-Sequenzen wurden für
FR-4 verwendet. Nur humane FR-Sequenzen, die von denjenigen der
Maus verschieden waren, sind dargestellt. Die Sternchen zeigen Mäuse-FR-Sequenzen
an, die sich von derjenigen der humanen FR an den entsprechenden
Positionen unterscheiden. Mäuse-Reste
an diesen Positionen wurden in der humanisierten Struktur beibehalten.
CDRs sind in Kästchen
dargestellt.
-
In 4A sind
die Doppelstrang-DNA und entsprechenden Aminosäuresequenzen (dargestellt durch einzelne
Buchstabencodes) der Mäuse-LL2-VK-Domäne dargestellt.
Aminosäuresequenzen
der CDR 1–3 sind
in Kästchen
dargestellt. Die entsprechende Anzeige für VH ist in 4B dargestellt.
-
In 5A und 5B sind
Doppelstrang-DNA-Sequenzen und Aminsäuresequenzen von humanisiertem
LL2-VK bzw. LL2-VH dargestellt. Aminosäuresequenzen sind durch einzelne
Buchstabencodes und CDR-Aminosäuresequenzen
in Kästchen
dargestellt.
-
Beispiel 4
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Konstruktion, Expression
und Reinigung von chimären
LL2-Antikörpern
-
Die
die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zusammen mit den Promoter- und
Signalpeptidsequenzen enthaltenden Fragmente wurden von LL2VKpBR
bzw. LL2VHpBS durch Doppelrestriktionsaufschluss mit HindIII und
BamHI exzidiert. Die VK-Fragmente mit etwa 600 bp wurden dann in
die HindIII/BamHI-Stelle eines Säugerexpressionsvektors,
pKh, (3A) subgeklont. pKh ist ein
Expressionsvektor auf pSVhyg-Basis, enthaltend die Genomsequenz
der humanen Kappa-konstanten Region, einen Ig-Verstärker, einen
Kappa-Verstärker
und das Hygromycin-Resistenzgen. Gleichermaßen wurden die VH-Fragemente
mit ca. 800 bp in die entsprechende HindIII/BamHI-Stelle von pG1g
(3B), einem Expressionsvektor auf pSVgpt-Basis,
der die Genomsequenz der humanen IgG1-konstanten Region, einen Ig-Verstärker und
das Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase-(gpt)-Gen
trägt,
subgeklont. Die endgültigen
Expressionsvektoren werden als LL2pKh bzw. LL2pG1g bezeichnet.
-
Die
zwei Plasmide wurden gemeinsam durch Elektorporation in Sp2/0-Ag14-Zellen transfektiert
und auf Hygromycin-Resistenz selektiert. Der Überstand von die Selektion überlebenden
Kolonien wurde zur chimären
Antikörpersekretion
durch einen ELISA-Test (siehe vorstehend) überwacht. Die Transfektionseffizienz betrug
etwa 1–10 × 106 Zellen. Es wurde gefunden, dass der Antikörperexpressionsgrad
in einer endgültigen Kultur
als im Bereich zwischen < 0,10
und 2,5/μg/ml
variierte.
-
Durch
Protein A gereinigtes mLL2 und cLL2 wurden durch SDS-PAGE unter
reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Die
leichten Ketten sowohl von mLL2 als auch von cLL2 zeigten ein höheres als
zu erwartendes scheinbares Molekulargewicht. Da es bekannt ist,
dass die humane Kappa-konstante
Region von cLL2 keine mögliche
Glykosylierungsstelle enthält,
kann gefolgert werden, dass die mögliche in der FR1-Region von
LL2-VK-Domäne
identifizierte Glykosylierungsstelle verwendet wurde. Verschiedene
Versionen von hLL2- und cLL2-Antikörpern wurden durch SDS-PAGE
unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert.
Bei einer hLL2-Version handelte es sich um hLL2-1 (mit sieben Mäuse-FR-Resten
in der VH-Domäne).
Bei einer anderen hLL2-Version handelte es sich um hLL2-2 mit sechs Mäuse-FR-Resten in der VH-Domäne. Die
humanisierten leichten Ketten migrierten schneller, und die Banden waren
verglichen mit den chimären
leichten Ketten stärker
getrennte Banden.
-
Misch-und-Abgleich-cLL2-
und -hLL2-Antikörper
wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden
Bedingungen analysiert. Bei den analysierten Misch-und-Abgleich-Versionen
handelte es sich um das (hL/cH)LL2, das (cL/hH)LL2-1, und das (cL/hH)LL-2.
(cL/hH)LL2-1 und (cL/hH)LL-2 enthalten 7 bzw. 6 Mäuse-Reste
in den FR-Regionen der schweren Kette. Die für das (hL/cH)LL2 beobachtete
Migation legte nahe, dass sich die humanisierte leichte LL2-Kette
keiner Glykosylierung unterzog.
-
Beispiel 5
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Bindung von cLL2-Antikörper an
Raji-Zelloberflächen-Antigene
-
Ein
Konkurrenz-Zellbindungstest wurde zum Testen der Immunreaktivität von cLL2
in Bezug auf das parentale mLL2 durchgeführt. Unter Verwendung von 131I-markiertem
mLL2 (0,025 μg/ml)
als Sonde, wurden Raji-Zellen mit den Antikörpern inkubiert und die relative
Bindung an die Zellen aus der Menge an zellgebundenem markiertem
mLL2 bestimmt (siehe vorstehend). Wie durch die in 7 beschriebenen
Konkurrenz-Tests dargestellt, zeigten sowohl mLL2- als auch cLL2-Antikörper ähnliche
Bindungsaktivitäten.
-
Die
Ergebnisse wurden durch einen zweiten Konkurrenz-Test auf der Basis
von Fließzytometrie
bestätigt.
Kurz gesagt, wurde unter Verwendung von Raji-Zellen wie vorstehend
und unter Variieren der Konzentration eines Antikörpers in
Bezug auf einen anderen, wie vorstehend, die Menge an gebundenem
mLL2 oder cLL2 mit FITC-markiertem Anti-Mäuse-Fc oder Anti-Human-Fc-Antikörpern, gefolgt
von Analyse unter Verwendung von Fließzytometrie bestimmt.
-
Beispiel 6
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Bindung von hLL2-Antikörpern an
Raji-Zellen
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In
Experimenten, die denjenigen von Beispiel 5 ähnelten, wurden die Antigenbindungsaffinitäten der drei
verschiedenen Kombinationen von Misch-und-Abgleichoder humanisiertem
LL2 mit denjenigen von cLL2 im Fließzytometrietest verglichen.
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Kurz
gesagt, wurde 1 μg
cLL2-, Misch-und-Abgleich-LL2-, hLL2-1- oder hLL2-2-Antikörper mit
108 Raji-Zellen in Gegenwart von variierenden
Konzentrationen von mLL2-F(ab')2-Fragmenten als Konkurrenzpartner in einem
Endvolumen von 100 μl
PBS-Puffer, ergänzt
mit 1% FCS und 0,01% Natriumazid, inkubiert. Das Gemisch wurde für eine Dauer
von 30 Minuten bei 4°C
inkubiert und drei Mal mit PBS zum Entfernen von ungebundenen Antikörpern gewaschen.
Durch Vorteilziehen aus der Gegenwart von humanen Fc-Teilen in den
Antikörpern
wurden die Bindungsgrade der Antikörper durch Zugabe von 20 × verdünnten FITC-markierten Ziegen-Anti-humanen
IgG1-, Fc-Fragment-spezifischen Antikörpern (Jackson ImmunoResearch,
West Grove, PA) getestet. Die Zellen wurden drei Mal mit PBS gewaschen
und die Fluoreszenzintensitäten
durch eine Fluoreszenzaktivierte Zell-Sortierapparatur des Typs
FACSAN (Becton-Dickinson, Bedford, MA) gemessen. Die Ergebnisse
sind in 8A dargestellt. Unter Verwendung
desselben Verfahrens wurde cLL2 mit zwei Versionen von hLL2 verglichen
(8B).
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Die
in den 8A und 8B dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass die Immunreaktivität von cLL2 mit denjenigen von
humanisierten oder Misch-und-Abgleich-Antikörpern ähnlich oder
identisch ist. Zusammen mit dem Vergleich von cLL2 mit mLL2 (7)
wird die Authentizität
der Sequenzen für
erhaltenes chimäres und
humanisiertes VK und VH festgestellt und die Funktionalität von cLL2
und hLL2 bestätigt.
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Beispiel 7
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Verinnerlichung von mLL2-
und cLL2 durch Raji-Zellen
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Bei
einer der einzigartigen Eigenschaften des LL2-Antikörpers handelt
es sich um seine schnelle Verinnerlichung durch Bindung an Raji-Zellen
(Shih et al., 1994, vorstehend). Mäuse-LL2 wird nach der Verinnerlichung
wahrscheinlich schnell in den Golgi-Apparat und von dort aus zu
dem Lysosom, die Organelle, die für die Degradierung einer breiten
Vielzahl von Biochemikalien verantwortlich ist, transferiert (Keisari
et al., Immunochem., 10: 565 (1973)).
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Die
Geschwindigkeiten der Antikörper-Verinnerlichung
wurden gemäß Opresko
et al., 1987, vorstehend, bestimmt. Das Verhältnis von CPMintracellulär/CPMOberfläche wurde
als Zeitfunktion bestimmt.
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Die
Geschwindigkeiten der LL2-Antikörper-Verinnerlichung
wurden durch Inkubieren von radiomarkiertem LL2-Antikörper (1 × 106 cpm) mit 0,5 × 106 Raji-Zellen in 0,5 ml
DMEM-Puffer, enthaltend 1% humanes Serum, für eine Dauer von zwei Stunden
bei 4°C
bestimmt. Überschüssiges humanes
Serum war eingeschlossen, um die Raji-Zelloberflächen-Fc-Rezeptoren zu sättigen,
um eine durch die Fc-Rezeptoren vermittelte nicht-Antigen-spezifische
Verinnerlichung auszuschließen
oder zu minimieren. Ungebundene, radio-markierte LL2-Antikörper wurden
durch dreimaliges Waschen mit Portionen von 0,5 ml DMEM bei 4°C von den
Zellen entfernt. Die Zellen wurden dann bei 37°C inkubiert, und zu zeitlichen
Intervallen wurden Aliquote der Zellsuspension auf Eis überführt, um
die Verinnerlichung zu stoppen. Die Zellen in diesen Aliquoten wurden
durch Zentrifugation bei 1.000 × g
für eine
Dauer von 5 Minuten bei 4°C
isoliert und das oberflächengebundene,
radio-markierte LL2 mit 1 ml 0,1 M-Glycin-Acetat-Puffer, pH 3, für eine Dauer
von 8 Minuten bei 4°C
von den Zellen abgezogen. Die so erhaltene Radioaktivität (CPMOberfläche)
und die in den Zellen verbliebene Radioaktivität (CPMintracellulär)
wurden bestimmt. Die Verinnerlichungsgeschwindigkeiten wurden aus
der Neigung der graphischen Darstellung der Verhältnisse der Radioaktivität von intrazellulär : Oberflächen als
Zeitfunktion berechnet.
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Wie
in 9 dargestellt, wurden mLL2-, cLL2-, cLL2Q- und
hLL2-Antikörper mit ähnlicher
Geschwindigkeit (Ke = 0,107 (mLL2) bis 0,1221 (cLL2Q, NVT zu QVT-Mutation)
verinnerlicht. Diese Zahlen legen nahe, dass etwa 50% des oberflächengebundenen
Antikörpers
innerhalb von 10 Minuten verinnerlicht werden konnte. Die Ergebnisse
zeigen, dass weder eine Chimärisierung
noch eine Humanisierung noch eine Deglykosyrlierung durch Mutagenese
von mLL2-Antikörpern
die Verinnerlichungsgeschwindigkeiten verschlechtern.
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Das
Verinnerlichungsmuster für
mLL2, cLL2 und hLL2 wurde ebenso durch Fluoreszenzmikroskopie auf
Zeitverlaufsbasis unter Verwendung einer wie in der Beschreibung
beschriebenen FITC-markierten zweiten Antikörpersonde überwacht. Die Verinnerlichung
von beiden Antikörpern
wurde zum frühesten
messbaren Zeitpunkt beobachtet. Nach 5 Minuten waren Antikörper sowohl
auf der Zelloberfläche
als auch in den unmittelbar zu der Membran als zytoplasmische Mikrovesikel
benachbarten Bereichen zu sehen. 15 Minuten nach der Inkubation
begannen sich die um die Zwischenmembran verteilten feinen Punkte
zu einer Gruppe von Körnchen
an Lokalisierungen, von welchen angenommen wurde, dass sie der Golgi-Apparat
sind, zusammenzuschließen.
Da mehrere Antikörper
nach 30-minütiger
Inkubation verinnerlicht waren, wurde eine Wiederverteilung der
gruppierten Antikörper
zu gestreuten Lokalisierungen, möglicherweise
dem Lysosom, in welchem die Antikörper zersetzt wurden, beobachtet.
Zwei Stunden nach der Inkubation waren die meisten der Antikörper innerhalb
der Zelle zu finden. Nur ein starkes Oberflächenfärben wurde beobachtet, als
LL2 für
eine Dauer von 20 Minuten auf Eis inkubiert wurde. Sowohl mLL2 als
auch cLL2 wurden mit einem ähnlichen
Muster verinnerlicht. Die Verinnerlichung von LL2 war spezifisch
mit der Antigen-Antikörper-Bindung
verbunden, da der irrelevante Kontroll-humanisierte Antikörper nur
eine bedeckte Oberflächenfärbung zeigte.
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Der
A103-Antikörper
(ein IgG2a-Antikörper,
der an die Oberfläche
von allen humanen Epithelial-Zellen bindet, jedoch nicht effizient
verinnerlicht wird (Mattes et al., Hybridoma, 2: 253 (1983)) zeigte
ein starkes Membranfärben
innerhalb bis zu zwei Stunden, während
der Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper (5F9) genauso schnell
verinnerlicht wurde wie LL2.
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Beispiel 8
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Rolle der Glykosylierungsstelle
in der FR1-Region der LL2-VK-Sequenz
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Ein
besonders erfinderisches Interesse stellt die Identifikation einer
Asn-Glykosylierungsstelle
an Position 18–20
innerhalb der FR1-Region der leichten LL2-NVT-Kettensequenz (4A)
dar. Wie vorstehend dargestellt, legt eine SDS-PAGE-Analyse unter
reduzierenden Bedingungen nahe, dass die Asn-Glykosylierungsstelle zur Kohlenhydrat-Addition
verwendet wird. In diesem Beispiel wurde der Einfluss der Kohlenhydrat-Einheit
an Position 18–20
an den funktionellen Aktivitäten
der leichten Ketten geprüft.
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Mäuse- und
chimäre
leichte LL2-Ketten, mit Endoglycosidase F behandelt oder unbehandelt,
wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden
Bedingungen geprüft.
Es lag kein Unterschied zwischen den Antikörpern wie im elektrophoretischen
Verhalten vor. In beiden Fällen
reduzierte die Deglykosylierung die Geschwindigkeit der Migration
der leichten Kette.
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Die
Wirkung der Deglykosylierung auf die Bindungsaffinität an Raji-Zellen
des mLL2-Antikörpers
ist in 10 dargestellt. Eine Entfernung
des Kohlenhydrats durch Endoglycosidase F beeinflusste die Bindungsaktivität nicht.
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Eine
Mutation wurde an Position 18 der leichten Kette so eingebracht,
dass das Asn mit Gln zur Erzeugung von LL2Q-VK-FR1 ersetzt wurde.
SDS-PAGE-Analysen
zeigten, dass die NVT-zu-QVT-Mutation eine Glykosylierung des Antikörpers beseitigte.
Ein Vergleich der Raji-Zell-Bindungsaffinität für cLL2 mit und ohne leichtkettiger
VK-Glykosylierung zeigte, dass die Kohlenhydrat-Einheit die Bindung
des Antikörpers
an diese Zellen nicht beeinflusste.
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Es
kann gefolgert werden, dass die Gegenwart von Kohlenhydratstellen
in der variablen Region die Immunreaktivität des Antikörpers nicht beeinflusst. Computermodellstudien
legten nahe, dass die VK-Kohlenhydrat-Einheit in LL2 am entferntesten
von den CDRs positioniert ist und eine „Abdeckung" über
den Bodenschlingen der FR-verbundenen β-Zylinder, die die CDRs tragen,
bildet. Eine Humanisierung ohne Einschluss der ursprünglichen
Glykosylierungsstelle führte
zu einem CDR-gepfropften LL2-Antikörper mit einer Immunreaktivität, die mit
derjenigen seines Mäuse-Gegenstücks vergleichbar
ist. Diese Eigenschaften zei gen an, dass die Glykosylierungsstelle
zum Konjugieren von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln
an LL2 ohne Beeinträchtigen
der Fähigkeit
des Antikörpers,
an B-Lymphom oder Leukämiezellen
zu binden oder von ihnen verinnerlicht zu werden, verwendet werden
kann.
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Beispiel 9
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Konjugation von LL2 an
seiner VK-Region-Kohlenhydrat-tragenden Stelle
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Der
offensichtliche Mangel an Beteiligung der variable-Region-Kohlenhydrat-Einheit in den funkionellen
Aktivitäten
von mLL2, cLL2 und hLL2-mAbs zeigt an, dass diese Einheit als die
Anlagerungsstelle von zytotoxischen Mitteln oder Nachweismitteln
wie Radionuklide oder Toxine profitabel verwendet werden könnten und
dadurch die mögliche
Störung
der Bindung des Konjugats an eine Zelloberfläche vermeiden.
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Unter
Verwendung der in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313 (hier unter
Bezugnahme eingebracht) beschriebenen Verfahrens zur Herstellung
von Antikörper-Konjugaten
durch eine oxidierte Kohlenhydrat-Einheit des Antikörpers und
einer primären
Alkylamingruppe eines polymeren Trägers, an welche ein oder mehrere
einer Vielzahl an Arzneimitteln, Toxinen, Chelatbildnern und Nachweismarkierungen
gebunden ist, wurde ein Doxorubicin-Dextran-LL2-Antikörperfragment ohne angehängtes Glycan
hergestellt, das mehrfache Kopien des Arzneimittels enthielt. Die
beteiligten Kohlenhydrateinheiten der cLL2-VK-FR1-Region waren diejenigen, die kovalent
an die Asn-Glykosylierungsstelle gebunden sind.
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In
einer Synthese wurde Dextran (18–40 kDa) durch Oxidation des
Dextrans durch NaIO4, Schiffsche-Basebitdung
mit NH2-CH2-CHOH-CH2-NH2 und Reduktion
mit NaBH4 zu einem Aminodextran umgewandelt.
Das Aminodextran wurde dann mit Doxorubicin (DOX) in Gegenwart von
Bernsteinsäureanhydrid
und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid zur Herstellung
von DOX- Aminodextran
kondensiert. Letzteres wurde dann mit einer Aldehydgruppe an LL2-VK-FR-1,
hergestellt durch Oxidieren der Kohlenhydrat-Einheit des Antikörperfragments
mit NaIO4, kondensiert.
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Bei
einer Herstellung von DOX-LL2 betrug die Molzahl von an das Dextran
angelagertem DOX 14 Mol pro Mol Dextran und die Molzahl an Doxorubicin
pro Mol F(ab')2 8,9. Die Immunreaktivität im vorstehenden Raji-Zell-Bindungstest
betrug etwa 80% der Kontrollwerte. Dieses Konjugationssystem ist
auf den mLL2-Antikörper
nicht beschränkt.
In einer vergleichbaren Studie wurden 15–19 Mol DOX pro Mol cLL2 gebunden.
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Die
Konjugationsmöglichkeiten
sind auf die Verwendung eines Dextranträgers, wie im vorstehenden Beispiel,
nicht beschränkt.
Zum Beispiel kann die Kohlenhydrateinheit der LL2-VK-FR1-Region
zur Herstellung von Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese können wiederum
mit einer Aminogruppe auf einem beliebigen Arzneimittel zur Herstellung
einer Schiffschen Base umgesetzt werden, die über Reduktion mehrfache Kopien des
Arzneimittels erzeugt, das stabil an den Antikörper über Alkylamin-Gruppen gebunden
ist.
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Zum
Beispiel wird, wenn es sich bei dem Arzneimittel um Aminohexyl DTPA
(einen Chelatbildner) handelt, ein LL2 kovalent an einen Chelatbildner
gebunden. Der Chelatbildner kann zum Freisetzen von Zielgeweben,
z.B. eines Radionuklids oder von paramagnetischen Metallionen mit
einem Potential für
diagnostische und therapeutische Verwendungen verwendet werden.
DTPA-LL2-Konjugate wurden hergestellt, die 5,5 Mol des Chelatbildners
pro Mol Antikörper
enthielten, die wiederum 47,3% Y-90 und 97,4% In-111 chelatierten.
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Beispiel 10
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Verbesserte Herstellung
eines humanisierten Anti-B-Zellen-Lymphom- Antikörpers
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Trotz
einer gezeigten Effizienz für
Mäuse-LL2
bei der Behandlung und Diagnose von B-Zell-Lymphomen, die nicht
vom Hodgkin-Typ sind, war jedoch eine gründliche Studie der klinischen
Bedeutung seiner humanisierten Version (hLL2) aufgrund der geringen
hLL2-Produktivität
des ursprünglichen
Transfektoms (ca. 1 mg/Liter in einer endgültigen Kultur) erschwert. Durch
Wiederbinden der schwer- und
leichtkettigen hLL2-Sequenzen in einen Expressionsvektor, enthaltend
ein amplifizierbares Dihydrofolat-Reduktasegen, (dhfr)(hLL2pdHL2),
war es uns möglich,
den Vektor durch Elektroporation in SP2/0-Zellen zu transferieren
und ein Methotrexat(MTX)-resistentes und hLL2-produzierendes Klon
zu bilden. Mit einer MTX-Konzentration von 0,1 μM wurden 1,4 mg hLL2 von einer
Endkultur mit einem Liter gereinigt. Der Grad der hLL2-Herstellung
stieg mit stufenweiser Erhöhung
der Konzentration von MTX im Kulturmedium an und erreichte ein Produktionsplateau
von 70 +/– 5
mg/Liter bei 3 μM
MTX. Der so gereinigte hLL2 zeigte einen PI von 10,3 mit bewahrter
Immunreaktivität.
Weiterhin schien die vollständige
Entfernung von MTX-Selektion und Einfrieren und Auftauen den hohen
Produktivitätsgrad
des aufgebauten Klons nicht zu beeinflussen, was nahe legte, dass
die amplifizierten Gene stabil in das Chromosom integriert waren.
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Beispiel 11
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Konstruktion von N-gebundenen
Glykosylierungsstellen in die konstante Region eines hLL2-Antikörpers
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1. Aufbau von N-gebundenen
Glykosylierungsstellenmutationen
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(1) Leichtkettige Mutationen
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Mögliche N-gebundene
Glykosylierungssequenzen wurden in den Kappa-konstanten Regionen von Kaninchen-Antikörpern an
a.a.-Position 161–163
und 174–176
identifiziert. Ähnliche
Stellen können
in die CK-Domäne
von hLL2, bezeichnet als die Stellen KCNI bzw. KCN2, eingebracht
werden. Zudem wurden drei andere CK-Mutanten, nämlich KCN3, KCN4 und KCN5,
wie in 12 aufgelistet, aufgebaut.
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(2) Schwerkettige Mutationen
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Humanes
IgM enthält
die mögliche
Kohlenhydrat-Additionssequenz NNS in der CH1-Domäne an Aminosäureposition
161–163.
Gleichermaßen
wurde die Sequenz NVT an den Resten 168–170 in der CH-Domäne von humanem
IgA positioniert. Durch dasselbe Prinzip, das bei den Aufbauten
von leichtkettigen Mutationen verwendet wurde, wurden auch schwerkettige
Mutationen eingebracht (12).
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Die
Kohlenhydrat-Additionssequenz Asn-Asn-Ser wurde an den a.a.-Positionen
161–163
(Kabat-Numerierung; Kabat et al., 1991) in einigen der humanen IgM-CH1-Domänen identifiziert.
Gleichermaßen
war die Sequenz Asn-Val-Thr in den a.a.-Positionen 168–170 in
der CH1-Domäne
von humanem IgA positioniert. Durch Mutieren der humanen IgG1-Sequenz
Asn-Ser-Gly zu Asn-Ser-Val an den a.a.-Positionen 162–164, Ala-Leu-Thr
zu Asn-Leu-Thr an den a.a.-Positionen 165–167, bzw. Leu-Thr-Ser zu Asn-Thr-Ser
an den a.a.-Positionen 166–168
wurden drei mögliche
N-gebundene Glykosylierungsstellen, die zu derjenigen von IgM und
IgA besonders analog waren, in die CH1-Domäne von humanem Igel mit einer
minimalen Störung
der erhaltenen Struktur eingebracht. Solche Glykosylierungsstellen
können
in einer „natürlichen" Position verbleiben.
Andere Glykosylierungsakzeptorsequenzen wurden auf der Basis ihrer
Oberflächenzugänglichkeit
wie durch Computermodellieren vorhergesagt (z.B. HCM5), eingebracht.
Noch andere Stellen wurden durch Erleichtern der Mutation der Sequenz
ohne Modellieren statistisch ausgewählt.
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2. Umbau von Mutationskonstrukten
zur Expression
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(1) Aufbau und Synthese
von Primern zur Mutagenese
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Eine
Oligonukleotid-gerichtete stellenspezifische Mutagenese wurde zum
Einbringen der bestimmten möglichen
N-gebundenen Glykosylierungsstellen in hLL2-Antikörper verwendet.
Die jeweils einer CK- und CHI-Mutation entsprechenden Oligonukleotidprimer
wurden synthetisiert und zur Mutagenese in vitro verwendet. Jeder
dieser Primer brachte auch in das Ziel-DNA-Fragment eine Restriktionsspaltungsstelle
(Tabelle 1, unterstrichene Sequenzen) ein, um das anschließende Screening-Verfahren
zu erleichtern. In Tabelle 1 geben die fett gedruckten Buchstaben
die mutierten Basen an.
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(2) Konstruktion von Expressionsvektoren
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Durch
stellenspezifische Mutagenese in vitro wurden mögliche N-gebundene Glykosylierungssequenzen
in die die leichten und schweren Ketten von hLL2 kodierende Gene
gebunden. Die Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Jedes
mutierte Gen wurde dann in den entsprechenden Expressionsvektor
(hLL2pKh für
die Kappa-Kette und hLL2pG1g für
die schwere Kette) subgeklont.
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Die
CH1-Domäne
von humanem IgG1 wurde zuerst aus dem Expressionsvektor LL2pG1g,
enthaltend die menschliche Genom-IgG1-konstante Regionsequenz (Leung
et al., 1994b), durch Aufschluss mit den Restriktionsenzymen BamHI
und BstXI, exzidiert und in die entsprechenden Stellen des pBluescript-SK-Vektors (Stratagene,
La Jolla, CA) zur weiteren Manipulationen subgeklont. Der erhaltene
Vektor wird als CH1pBS bezeichnet.
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Mutationen
wurden unter Verwendung des Bausatzes für stellengerichteten Mutagenese
TransformerTM (CLONTECH, Palo Alto, CA)
gemäß den Anweisungen
des Hersteller erzielt. Der Selektionsprimer MutKS (5'-ACG GTA TCG ATA
TGC ATG ATA TCG AAT T-3')
ist in allen Fällen
zur Verbindung mit den jeweiligen Mutationsprimern bestimmt. Er
wurde ausgewählt,
um die HindIII-Restriktionsstelle
in der Klonsequenz von pBluescript zu einer NsiI-Restriktionsstelle (unterstrichen) umzuwandeln.
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Zum
Mutieren von Asn-Ser-Gly zu Asn-Ser-Thr an den a.a.-Positionen 162 – 164 wurde
der Selektionsprimer MutKS und der Primer CHO162 (5'-GTG TCG TGG AAT
TCA ACC GCC CTG ACC AGC GGC-3') zum
Ersetzen des Gly an Position 164 zum Mutieren zu Thr verwendet.
Eine EcoRI-Stelle (unterstrichen) ist ebenso in dem mutagenen Primer
als diagnostische Stelle eingeschlossen.
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Zum
Mutieren von Ala-Leu-Thr zu Asn-Leu-Thr an den a.a.-Positionen 165–167 werden
der Selektionsprimer MutKS und der Mutationsprimer CHO165 (5'-GTG TCG TGG AAT TCA GGC AAC CTG ACC
AGC GGC -3') zum
Ersetzen des Ala-165 in Asn-165 verwendet. Eine EcoRI-Stelle (unterstrichen)
ist in dem mutagenen Primer als diagnostische Stelle eingeschlossen.
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Zum
Mutieren von Leu-Thr-Ser zu Asn-Thr-Ser an den a.a.-Positionen 166–168 werden
der Selektionsprimer MutKS und der Mutationsprimer CHO166 (5'-TGG AAC TCA GGC
GCG AAT ACC AGC GGC GTG CAC-3')
zum Ersetzen des Leu-166 zu Asn-166 verwendet. Die KasI-Stelle (GGC
GCC) in der ursprünglichen CH1-Sequenz
von humanem IgG1 wird freisetzbar durch Ersetzen des 3'C mit einem G für diagnostische
Zwecke eliminiert.
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Die
phosphorylierten Primerpaare (Selektions- und die entsprechenden
Mutationsprimer) mit 100 ng werden jeweils an 100 ng des Stützvektors
CH1pBS in 20 mM Tris-CH1 (pH 7,5), 10 mM MgCl2,
50 mM NaCl in einem Endvolumen von 20 μl durch Inkubation bei 95°C für eine Dauer
von 3 Minuten, und dann Abkühlen auf
Eis für
eine Dauer von 5 Minuten annealed. Dem Gemisch werden 2 bis 4 Einheiten
T4-DNA-Polymerase, 4 bis 6 Einheiten T4-DNA-Ligase zusammen mit
3 l 10 × Synthesepuffer
(CLONTECH, Palo Alto, CA) zugesetzt. Nach einer Inkubationsdauer
von 2 Stunden bei 37°C
werden die Polymerisations- und Bindungsreaktionen durch Erwärmen bei
65°C für eine Dauer
von 5 Minuten in Gegenwart von 3 l vorgewärmter Stopplösung (0,25%
SDS, 5 mM EDTA) beendet. DNA aus dem Gemisch wird zum Transformieren
von elektrokompetenten Zellen von E. coli, BMH71-18 mutS (Reparieren
von Fehlerstellen) durch das Elektroporationsverfahren verwendet.
Transformanten werden dann gepoolt, und man lässt sie über Nacht in SOC (20 mg/ml
Bacto-Trypton, 5 mg/ml Bacto-Hefe-Extrakt, 8,6 mM NaCl, 2,5 mM KCl,
20 mM Glucose) mit 50 g/ml Ampicillin bei 37°C wachsen. Mini-plasmid-DNA-Präparate von
den gepoolten Transformanten werden mit HindIII zum Linearisieren von
nicht mit den Selektionsprimern mutierter DNA aufgeschlossen. Nach
Entfernen der Enzyme durch Phenolextraktion wird die DNA für eine zweite
Transformation mit kompetenten DH5-Zellen verwendet. Plasmid-DNA,
die beim Aufschluss mit HindIII versagt, wird auf die Gegenwart
von diagnostischer ecoRI- Stelle (im Fall von Gly-zu-Thr- und Ala-zu-Asn-Mutationen) oder
die Abwesenheit der diagnostischen KasI-Stelle (im Fall von Leu-zu-Asn-Mutation)
geprüft.
Eine Endbestätigung
der Mutation wird durch Dideoxy-Sequenzieren von Sauger (Sauger
et al., 1977) erzielt. Die CH1-Region, von welcher bestätigt wurde,
dass sie die gewünschten Mutationen
aufweist, wird dann mit BamHI/BstXI-Enzymen exzidiert und in die
entsprechende Stelle der endgültigen
schwerkettigen Expressionsvektoren für hLL2, hLL2pG1g geklont.
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(3) Expressionsvektor
zur Genamplifikation
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Zum
Erleichtern des Stromabwärts-Verfahrens
der Antikörperherstellung
ist es erwünscht,
ein Genamplifikations-System zur Antikörperexpression zu verwenden.
Nachdem es sich erwies, dass eine Antikörpervariante ein industrielles
Potential aufweist, könnte
eine hochgradige Herstellung durch Genamplifikation erzielt werden.
Unter dieser Voraussetzung planten wir, diese Mutanten mit N-gebundener Glykosylierungsstelle
in dem hochgradigen Expressionsvektor hLL2pdHL2, einem Amplifikationssystem
auf dhfr-mini-Gen-Basis, zu konstruieren. Die schwerkettigen Mutationen
HCN3, HCN4 und HCN5 wurden in diesem Vektor zur Expression subgeklont.
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Die
endgültigen
Expressionskonstrukte für
diese Mutationen wurden als hLL2HCN3pdHL2, hLL2HCN4 bzw. hLL2HCN5pdHL2
bezeichnet.
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3. Expression von Mutant-hLL2
und Glykosylierung an umgebauten Stellen
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Die
die umgebauten Glykosylierungsstellen enthaltenden konstanten Domänen wurden
an die jeweiligen variablen (V) Regionen von hLL2 gebunden. Die
verschiedenen Glykosylierungsmutanten wurden in Mäuse-SP2/0-Myelomzellen
exprimiert, die mit den schwer- und leichtkettigen Expressionsvektoren
durch Elektroporation transfektiert wurden. Die umgebauten Antikörper wurden
aus dem Kulturüberstand
der stabilen Antikörper-herstellenden
Zellen durch Protein-A-Säulen gereinigt
und die gereinigten Proteine auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen
analysiert. Die schweren Ketten der Glykosylierungsmutanten migrierten verglichen
mit denjenigen des Kontroll-Antikörpers hLL2, dessen CHI-Domäne keine
möglichen
Glykosylierungsstellen enthielt, mit verschiedenen Geschwindigkeiten.
Da die SDS-PAGE-Migrationsgeschwindigkeit umgekehrt proportional
zu der Molekülgröße der umgebauten
Oligosaccharide ist, sollte der Glykosylierungsgrad an den verschiedenen
Stellen in der Ordnung von HCN5 > HCN1 > HCN3 > HCN2 > HCN4 liegen, wobei hLL2HCN5
und hLL2HCN1 die zwei am höchsten
glykosylierten Abs sind. Im Gegensatz dazu schlossen wir aus dem
Bewerten des Fehlens der Migrationsverzögerung in den leichten Ketten
für die
Mutanten KCN1–4, dass
diese CK-verbundenen Stellen entweder insgesamt nicht glykosyliert
oder nur mit einem unbedeutenden Grad glykosyliert waren.
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4. hLL2HCN1 und hLL2HCN5
sind in der CH1-Domäne
N-glykosyliert
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Die
Antikörper
hLLHCN1, hLL2HCN5 und hLL2 wurden mit N-Glycosidase F (PNGase F),
die spezifisch alle Typen von Asn-gebundenem Glycan von Peptiden
abspaltet, behandelt, und durch reduzierende SDS-PAGE analysiert.
Die höhere
scheinbare Molekülmasse
für die
schweren Ketten von hLL2HCN1 und hLL2HCN5 reduzierten wir zu derjenigen
von hLL2 nach PNGase F-Aufschluss, was anzeigte, dass der Größenunterschied
zwischen diesen Abs den mit den schweren Ketten verbundenen N-gebundenen
CHOs zugeschrieben wurde. Es sollte angemerkt werden, dass alle
humanen IgG1-Abs in der CH2-Domäne an Asn297 natürlich glykosyliert
sind. Die beobachteten Größenunterschiede
können
aufgrund der unterschiedlichen Glykosylierung an der CH2-Stelle
eher als an den umgewandelten Stellen als Ergebnis von Variationen
in den Kulturbedingungen vorliegen. Wir stellten deshalb F(ab')2-Fragmente von
hLL2HCN1, hLL2HCN5 und hLL2 her und analysierten diese Fragmente
durch reduzierende SDS-PAGE.
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Es
zeigte sich, dass die Größenunterschiede
zwischen den Abs mit den ohne den Fc-Teil und die anhängigen Oligosaccharide
vorliegenden Fd-Fragmenten (VH-CH1) verbunden sind, wobei die Molekülgröße für Fd-Fragmente
von hLL2HCN5 größer als
diejenige von hLL2HCN1 ist. Wurden Fragmente durch Behandlung mit
PNGcase F deglykosyliert, wurden diese Größenunterschiede eliminiert
und alle Fd-Fragmente migkierten an dieselbe Position wie das unglykosylierte
hLL2, was nahe legt, dass die umgebauten Stellen tatsächlich zur Glykosylierung
verwendet wurden und der Glykosylierungsgrad für die HCN5-Stelle größer als
derjenige für HCN1
war.
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Die
N-gebundenen Oligosaccharid-Einheiten in der CH1-Domäne von hLL2HCN1
wurden direkt durch CHO-spezifisches Markieren visualisiert. Die
daran angelagerten Oligosaccharid-Einheiten wurden zuerst durch
Periodat oxidiert. Die gebildeten Aldehyd-Gruppen wurden dann kovalent
mit Biotin konjugiert, das als Probe verwendet und durch Streptavidin-Peroxidase
in einer Western-Blot-Analyse visualisiert wurde. Wie wir erwarteten,
waren nur die schweren Ketten, jedoch nicht die leichten Ketten
sowohl von hLL2 und hLL2HCN1 mit CHO-Markierung sichtbar. Bei der
densidometrischen Quantifizierung betrug die Intensität der markierten CHOs
in hLL2HCN1 etwa das 2,5-fache von derjenigen in hLL2. Die Proteingehalte
der verschiedenen analysierten Abs waren vergleichbar, wie durch
Coomassie-blaugefärbte
SDS-PAGE dargestellt. Wir schrieben diesen Unterschied in der Intensität als das
Ergebnis von zusätzlicher
Glykosylierung in der umgebauten HCN1-Stelle zu. Dies wurde bestätigt, als
die F(ab')2-Fragmente
derselben Analyse unterzogen wurden: nur das Fd-Fragment von hLL2HCN1,
jedoch nicht das von hLL2 zeigte eine CHO-spezifische Markierung.
Im Gegensatz dazu wurde keine möglichen
CK-Glykosylierungsstellen als glykosyliert befunden.
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Es
sollte angemerkt werden, dass im Gegensatz zur VK-anhängigen Glykosylierungsstelle,
die Heterogenität
im Glykosylierungsgrad zeigte, nur eine einzelne Bande in der SDS-PAGE-Analyse
für hLL2(HCN1) Fd-Fragment
beobachtet wurde. Es wird vermutet, dass fast alle der Fd-Fragmente
von hLL2(HCN1) glykosyliert wurden und der Glykosylierungsgrad relativ
homogen war, eine erwünschte
Eigenschaft, die ihre anschließenden
Charakterisierungen und Anwendungen erleichtern könnten.
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5. WN-konkurrierender
Bindungstest
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Die
Antigenbindungseigenschaft dieser zwei Antikörper wurde durch Konkurrenzbindung
mit mLL2 an einen LL2-Anti-Idiotyp-Antikörper (WN) bewertet. Dieser
Test zeigt, dass die Bindungsaktivität von hLL2HCN1 und hLL2HCN2
an WN von derjenigen von hLL2 unterscheidbar ist (11).
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Beispiel 12
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Stellenspezifische Konjugation
von Aminobenzyl-DTPA und Dextran-Doxorubicin
an hLL2HCN1 und hLL2HCN5
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Die
stellenspezifische Modifizierung der F(ab')2-Fragmente
von Antikörpern
mit DTPA erfolgte wie beschrieben. Siehe Leung et al., J. Immunol.
154: 5919 (1995). Das F(ab')2-Fragment (~ 1 mg/ml) wurde mit 15 mM Natriummetaperiodat
bei 4°C
für eine
Dauer von 1 Stunde oxidiert. Das oxidierte Material wurde gereinigt, mit
einem 545-fachen molaren Überschuss
an Aminobenzyl-DTPA gemischt und der pH-Wert auf 5,97 eingestellt.
Das Gemisch wurde im Dunklen bei Umgebungstemperatur für eine Dauer
von 5 Stunden inkubiert und dann bei 4°C für eine Dauer von 18 Stunden
aufbewahrt. Die Konjugate wurden mit 10 mM Natriumcyanoborhydrid
stabilisiert, gereinigt und konzentriert. Das Verhältnis von
Chelatbildner : F(ab')2 wurde durch Metallbindungstests und Verwendung
von Indiumacetat, befestigt an 111In bestimmt.
Siehe Meares et al., Anal. Biochem., 142: 68 (1984). Das Radiomarkieren
wurde wie beschrieben durchgeführt.
Siehe Leung et al., 1995, vorstehend. Die Anzahl von an das F(ab')2-Fragment
konjugierten DTPA-Molekülen
wurde durch Metallbindungstest unter Verwendung des In/In-111-Systems
bestimmt. Kurz gesagt, wurden 40 μg
der Konjugate für eine Dauer
von 30 Minuten mit einem bekannten Überschuss an Indiumacetat,
befestigt an In-111-Acetat inkubiert. Die Lösung wurde in EDTA auf 10 mM
eingestellt und für
eine Dauer von weiteren 10 Minuten inkubiert. Die Markierung wurde
durch ITLC unter Verwendung von 10 mM EDTA zur Entwicklung analysiert.
DOX-Dextran-Konjugat wurde wie von Shih et al., Cancer Res. 51:
4192 (1991) unter Verwendung von Aminodextran mit 18 kDa als Zwischenträger hergestellt.
Das Zwischenkonjugat besaß einen
Substitutionsgrad von 10,5 DOX-Molekülen pro
Dextranpolymer. DOX-Dextran wurde dann mit dem F(ab')2-Fragment von hLL2HCN1 oder
hLL2HCN5 konjugiert. Kurz gesagt, wurde das Antikörperfragment
auf 10 mg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, konzentriert
und mit 20 mM Natriummetaperiodat im Dunklen bei 4°C für eine Dauer
von 60 Minuten behandelt. Der oxidierte Antikörper wurde auf einer Bio-Spin-Säule (Bio-Rad), die mit in 0,05
M-HEPES-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1 M NaCl, voräquilibriert
war, gereinigt und dann mit DOX-Dextran (4 Äquivalenten) bei Raumtemperatur
für eine
Dauer von 24 Stunden behandelt. Nach Reduktion mit Natriumborhydrid
wurde das konjugierte Produkt auf einer Bio-Gel-A-Gel-Säule mit 0,5 m (Bio-Rad) gereinigt.
Die Protein-Fraktionen wurden gepoolt und in einer Konzentrationsapparatur
des Typs Centricon-50 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Die Spurenmenge
an Zwischenverbindungen in den Proteinkonjugaten wurde durch wiederholtes
Waschen mit dem Konjugationspuffer, wie durch HPLC über einer
Bio-Sil-Sec-Größenausschlusssäule (Bio-Rad)
bewertet, entfernt.
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Beispiel 13
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CH1-anhängige Oligosaccharide
können
als ausreichende Konjugationsstellen für Chelate und/oder Arzneimittel
verwendet werden
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Unter
milden chemischen Bedingungen wurden ein Mittelwert von 1,6 und
2,97 Molekülen
von DTPA an jedes F(ab')2-Fragment
von hLL2HCN1 bzw. hLL2HCN5 konjugiert (Tabelle 2). Beide Konjugate
zeigten hohe Effizienzen bei der 111In-Einbringung
(92% für
hLL2HCN1, 91% für
hLL2HCN5). Keine deutli chen Veränderungen
in den Immunreaktivitäten
wurden vor und nach der DTPA-Konjugation
für die
Glykosylierungsmutant-Fragmente, wie bewertet in einem WN-Konkurrenz-Blocktest,
beobachtet. HCN5-anhängiges
CHO schien verglichen mit dem HCN1-anhängigen CHO für die Chelatbildung
reaktiver zu sein; nahezu zwei Mal so viel DTPA-Moleküle konnten
in die HCN5-Stelle eingebracht werden.
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Leung
et al., (1995) vorstehend, zeigte, dass das in Mäuse-LL2 zu findende VK-anhängige CHO
als eine stellenspezifische Konjugationsstelle für kleine Chelate ohne Reduzieren
der Ag-Bindungseigenschaft des Ab verwendet werden kann. Die Wirkung
des Konjugierens dieses VK-anhängigen
CHO mit Dextran-DOX-Komplex über Immunreaktivität wurde
geprüft.
Der Dextran-DOX-Komplex wurde durch chemisches Einbringen von durchschnittlich
10 DOX-Molekülen
auf einem Amino-Dextran-Polymer mit 18 kDa gebildet. Unter Verwendung
des Aminodextrans als Träger
für DOX
wurden etwa 5,1 DOX-Moleküle
im Durchschnitt auf dem VK-anhängigen
CHO von Mäuse-LL2
eingebracht und eine Reduktion von nahezu 60% der Immunreaktivität, wie bewertet
durch Zellbindung und ELISA-Tests, wurde beobachtet. Siehe Tabelle
3. Die Konjugation von einer leicht höheren Anzahl an DOX-Molekülen (6,8)
auf dem HCN1-CHO war jedoch in Bezug auf ihre Wirkung auf die Immunreaktivität vergleichsmäßig weniger
nachteilig, eine Reduktion von nur 30% in der erhaltenen Bindungsaffinität war zu
bemerken. Im Gegensatz dazu waren keine deutlichen Veränderungen
in der Ag-Bindungseigenschaft (weniger als eine 5%ige Reduktion)
ersichtlich, als eine ähnliche
Anzahl an DOX-Molekülen
(7,2) an die HCN5-CHO konjugiert wurde. Siehe Tabelle 3.
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Die
Molekülmassen
der F(ab')2-Fragmente von hLL2, hLL2HCN1 und hLL2HCN5,
bestimmt durch Massenspektronomieanalyse (Mass Consortium, San Diego,
CA) betrugen 99.000, 102.400 bzw. 103.800, da diese Fragmente in
den Sequenzen identisch sind, außer an der umgebauten Stelle
(ein Aminosäureunterschied)
und die Fragmente trugen nicht den glykosylierten Fc-Teil, der Molekül massenunterschied
zwischen dem F(ab')2 von hLL2 und dem Glykosylierungsmutanten
sollte die Molekulargewichte der verschiedenen CH1-anhängigen CHOs,
d.h., 3,4 bzw. 4,8 kD für
die CHOs an den HCN1- bzw. den HCN5-Stellen darstellen.
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Durch
PNGase-F-Aufschluß wurden
die CH1-anhängigen
CHOs von hLL2HCN1 und hLL2HCN5 für Profilierungs-
und Sequenzierungsanalysen unter Verwendung von Fluorpor-assistierter
Kohlenhydrat-Elektrophorese (FACE) freigesetzt. Heterogene Populationen
von CHI-anhängigen
CHO-Spezies wurden identifiziert. Etwa 60% der Oligosaccharide der
HCN5-Stelle waren von größerer tri-antennären Struktur,
während diejenige
von HCN1 hautpsächlich
bi-antennär
(> 90%) war. Diese
Ergebnisse stimmen mit den Massenspektrometriestudien überein,
was verglichen mit derjenigen von HCN1 auf eine größere mittlere
Molekulargröße des CHOs
an den HCN5-Stellen hinweist.
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Es
sollte betont werden, dass die vorstehend beschriebenen Beispiele
nur verschiedene spezifische Ausführungsformen der Erfindung
beschreiben und die Anmelder nicht beabsichtigen, den Umfang der
Ansprüche
durch diese spezifischen Beispiele zu beschränken. Tabelle
2
Stellenspezifische Konjugation von DTPA und Radiomarkieren
Tabelle
3
Stellengerichtete Konjugation von Doxorubicin
- ND
- nicht bestimmt
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