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DE69717117T2 - Komplexreagenzien und komplexe, die eine borsäureverbindung enthalten - Google Patents

Komplexreagenzien und komplexe, die eine borsäureverbindung enthalten

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DE69717117T2
DE69717117T2 DE69717117T DE69717117T DE69717117T2 DE 69717117 T2 DE69717117 T2 DE 69717117T2 DE 69717117 T DE69717117 T DE 69717117T DE 69717117 T DE69717117 T DE 69717117T DE 69717117 T2 DE69717117 T2 DE 69717117T2
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DE
Germany
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acid
alkyl
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J. Kaiser
P. Lund
L. Stolowitz
M. Torkelson
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Systemix Inc
Prolinx Inc
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Systemix Inc
Prolinx Inc
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biokonjugatherstellung und insbesondere eine Klasse an Borverbindungskomplexierungsreagenzien, die zur Konjugation von biologischen Makromolekülen brauchbar sind und ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Reagenzien.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Biokonjugation ist ein beschreibender Ausdruck für die Verbindung von zwei oder mehr unterschiedlichen molekularen Einheiten durch chemische oder biologische Mittel, worin zumindest eine der molekularen Einheiten ein biologisches Makromolekül ist. Dies umfaßt unter anderem die Konjugation von Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Hormonen, Nukleinsäuren, Liposomen und Zellen miteinander oder mit einer anderen Moleküleinheit, die brauchbare Eigenschaften hinzufügt, einschließlich Arzneimittel, Radionuklide, Toxine, Haptene, Inhibitoren, Chromophore, Fluorophore, Liganden usw. Die Immobilisierung von biologischen Makromolekülen wird auch als spezieller Fall einer Biokonjugation betrachtet, worin das Makromolekül, entweder reversibel oder irreversibel, an einen unlöslichen Träger konjugiert wird. Die Biokonjugation wird in der biochemischen, immunochemischen und molekularbiologischen Forschung ausgiebig verwendet. Die Hauptanwendungen der Biokonjugation umfassen die Detektion von Gensonden, enzymgebundene Immunfestphasentests, gezielte Arzneimittelabgabe mittels monoklonaler Antikörper und medizinische Bildgebung.
  • Biokonjugate werden allgemein entweder als direkte oder indirekte Konjugate klassifiziert. Direkte Konjugate umfassen die, worin zwei oder mehr Komponenten durch direkte, kovalente, chemische Bindungen zusammengefügt werden. Alternativ dazu umfassen indirekte Konjugate die, worin zwei oder mehr Komponenten über einen intermediären Komplex verbunden sind, der ein biologisches Makromolekül umfaßt. Das hierin beschriebene System ist das erste, das die Bildung von indirekten Konjugaten ermöglicht, ohne eine Abhängigkeit von einem intermediären, biologischen Makromolekül aufzuweisen.
    • Avidin-Biotin-System
  • Obwohl viele Verfahren zur Herstellung von indirekten Biokonjugaten beschrieben wurden, wurde eine signifikante Anzahl von denen, die in der Literatur beschrieben sind, unter Ausnutzung des Avidin-Biotin-Systems beschrieben, worin die Bindungsspezifität des Proteins Avidin (gereinigt aus Eiweiß) oder Streptavidin (gereinigt aus dem Bakterium Streptomyces avidinii) gegenüber dem Cofaktor Biotin (Vitamin H) verwendet wird, um ein Avidin-konjugiertes Makromolekül mit einem biotinylierten Makromolekül zu verbinden. Sowohl Avidin als auch Streptavidin besitzen vier Biotinbindungsstellen mit sehr hoher Affinität (K = 10¹&sup5; mol&supmin;¹).
  • Das Avidin-Biotinsystem wurde ausgiebig für den enzymgebundenen Immunfestphasentest (ELISA) verwendet, worin ein Enzym-Avidin-Konjugat (brauchbar zur Detektion durch Umsetzung mit dem Substrat des Enzyms unter Bildung eines gefärbten oder chemilumineszenten Produkts) zur Detektion des Vorkommens eines biotinylierten Antikörpers verwendet wird, wobei zuerst der Antikörper an ein immobilisiertes Antigen oder Hapten gebunden wird. Anwendungen des Avidin-Biotin-Systems gehen in die Hunderte uni wurden kürzlich zusammengefaßt (M. Wilchet und E. A. Bayer, (1990), Methods in Enzymology, 184). Obwohl sie ausgiebig verwendet werden, sind einige Beschränkungen bekanntermaßen mit dem Avidin-Biotinsystem assoziiert, die die unspezifische Bindung, die im allgemeinen der Basizität des Avidinmoleküls zugeschrieben wird, die unspezifische Bindung, die dem Vorkommen von Kohlenhydratresten im Avidimnolekül zugeschrieben wird uni die Hintergrundwechselwirkung, die mit dem Vorkommen von endogenem Biotin assoziiert ist, umfassen, das sowohl in eukaryontischen als auch prokaryontischen Zellen vorhanden ist.
    • Digoxigenin-α-Digoxigeninsystem
  • Ein alternatives indirektes Biokonjugationssystem, das zur Überwindung einiger Beschränkungen entworfen wurde, die mit dem Avidin-Biotinsystem assoziiert sind, wurde kürzlich zur Detektion von Gensonden durch ELISA entwickelt (C. Kessler, H.-J. Hôltke, R. Seibl, J. Burg und K. Mühlegger, (1990) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 917-965). Dieses System umfaßt die Verwendung des Steroidhaptens Digoxigenin, ein Alkaloid, das ausschließlich in Digitalispflanzen vorkommt, und Fab Fragmente, die von polyklonalen Schafantikörpern gegen Digoxigenin stammen (α-Digoxigenin). Die hohe Spezifität der verschiedenen α-Digoxigeninantikörper erreicht einen geringen Hintergrund und eliminiert die unspezifische Bindung, die in Avidin-Biotinsystemen beobachtet wird. Digoxigenin-markierte DNA und RNA Sonden können Sequenzen mit einer Kopie in Southern Blots des Humangenoms detektieren. Die Entwicklung des Digoxigenin-α-Digoxigeninsystems wurde kürzlich zusammengefaßt (C. Kessler (1990) in Advances in Mutagenesis Research (Herausgeber G. Obe), Seiten 105-152, Springer Verlag, Berlin/Heidelberg). Das Digoxigenin-α-Digoxigeninsystem ist der jüngste Vertreter von mehreren Hapten- Antikörpersystemen, die jetzt für die Biokonjugation verwendet werden.
    • Immobilisierte Phenylborate
  • Phenylborsäuren interagieren bekanntermaßen mit einer großen Vielzahl an polaren Molekülen, die bestimmte Funktionalitäten aufweisen. Komplexe mit unterschiedlicher Stabilität, die 1,2-Diole, 1,3-Diole, 1,2-Hydroxysäuren, 1,3-Hydroxysäuren, 1,2-Hydroxylamine, 1,3-Hydroxylamine, 1,2-Diketone und 1,3-Diketone umfassen, bilden sich bekanntermaßen entweder mit neutraler Phenylborsäure oder mit dem Phenylboratanion. Daher wurden immobilisierte Phenylborsäuren als chromatographische Träger genutzt, um aus diversen biologischen Proben die Moleküle mit den erforderlichen Funktionalitäten zurückzuhalten. Viele wichtige biologische Moleküle, einschließlich Kohlenhydrate, Katecholamine, Prostaglandine, Ribonukleoside und Steroide enthalten die erforderlichen Funktionalitäten und wurden auf diese Weise entweder analysiert oder gereinigt. Die Verwendung von Chromatographiemedien mit Phenylborsäuren zur Isolierung und Trennung von biologischen Molekülen wurden in mehreren Zusammenfassungen diskutiert (R. P. Singhal und S. S. M. DeSilva (1992) Adv. Chromatog., 31, 293-335, J. R. Mazzeo und I. S. Krull (1989) BioChromatog. 4, 124-130 und A. Bergold und W. H. Scouten (1983) in Solid Phase Biochemistry (Herausgeber W. H. Scouten), Seiten 149-187, John Wiley & Sons, New York).
  • Phenylborsäure ist wie Borsäure eine Lewissäure und ionisiert nicht durch direkte Deprotonierung sondern durch Hydratation unter Bildung des tetraedrischen Phenylboratanions (pKa = 8,86). Phenylborsäure ist eine dreimal so starke Säure wie Borsäure. Die Ionisierung der Phenylborsäure ist ein wichtiger Faktor bei der Komplexbildung, da bei einer Ionisierung das Bor von einer trigonalen Koordination (mit mittleren Bindungswinkeln von 120º und mittleren Bindungslängen von 1,37) zum tetraedrisch koordinerten Anion wechselt (mit mittleren Bindungswinkeln von 109º und mittleren Bindungslängen von 1,48).
  • Molekülspezies mit cis oder coaxialen 1,2-Diol- und 1,3-Diolfunktionalitäten und insbesondere Kohlenhydrate komplexieren bekanntermaßen mit immobilisiertem Phenylboratanion unter Bildung von cyclischen Estern unter alkalischen, wäßrigen Bedingungen (J. P. Lorand und J. O. Edwards (1959) J. Org. Chem., 24, 769).
  • Die Ansäuerung von 1,2-Diol- und 1,3-Diolkomplexen auf einen neutralen pH setzt bekanntermaßen die Diol-enthaltende Spezies vermutlich aufgrund der Hydrolyse des cyclischen Esters frei. Coplanare, aromatische 1,3- Diole, wie 1,8-Dihydroxynaphthalin, komplexieren aufgrund ihrer hydrolytischen Stabilität der sechsgliedrigen, cyclischen Borsäureester bekanntermaßen sogar unter sauren Bedingungen (P. A. Sienkiewicz und D. C. Roberts (1980), J. Inorg. Nucl. Chem. 42, 1559-1571). Molekülspezies mit gebundenen 1,2-Hydroxylamin-, 1,3- Hydroxylamin-, 1,2-Hydroxyamid-, 1,3-Hydroxyamid-, 1,2-Hydroxyoxim- und 1,3-Hydroxyoximfunktionalitäten komplexieren bekanntermaßen mit Phenylborsäure reversibel unter alkalischen, wäßrigen Bedingungen, die zu denen ähnlich sind, die mit der Zurückhaltung der Diol-enthaltenden Spezies ähnlich sind (D. W. Tanner und T. C. Bruice (1967), J. Amer. Chem. Soc., 89 6954).
    • Phenylboratbiokonjugate
  • Ortho-substituierte Acetamidophenylborsäuren wurden als potentielle Linker für die selektive Biokonjugation über die benachbarten Diolreste der Kohlenhydratreste vorgeschlagen, die mit Glycoproteinen assoziiert sind (S. X. Cai und J. F. W. Keana (1991) Biokonjugate Chem., 2, 317-322).
  • Phenylborsäurebiokonjugate, die von 3-Isothiocyanatphenylborsäure abgeleitet sind, wurden erfolgreich zur Anbindung von radioaktiven Technetiumdioximkomplexen an monoklonale Antikörper zur Verwendung bei der medizinischen Bildgebung verwendet (K. E. Linder, M. D. Wen, D. P. Nowotnik, M. F. Malley, J. Z. Gougoutas, A. D. Nunn und W. C. Eckelman (1991) Biokonjugat Chem., 2, 160-170, K. E. Linder, M. D. Wen, D. P. Nowotnik, K. Ramalingam, R. M. Sharkey, F. Yost, R. K. Narra und W. C. Eckelman (1991), Biokonjugat Chem. 2, 407-414).
  • 3-Aminophenylborsäure wurde kovalent an Proteine durch eine Vielzahl an chemischen Verfahren gebunden und die entstehenden Phenylborsäurebiokonjugate wurden auf ihre Bindung an D-Sorbit, D-Mannose und glycosyliertem Hämoglobin (GHb) getestet. Die Wechselwirkungen stellten sich als reversibel heraus und die sehr geringe Affinität beschränkt die Biokonjugate in ihrem praktischen Einsatz. Ähnlich versagte ein Biokonjugat aus alkalischer Phosphatase und Phenylborsäure in einem versuchten enzymgebundenen Test zur Detektion von GHb bei der Detektion des Vorkommens von glycosyliertem Protein (F. Frantzen, K. Grimsud, D. Heggli und E. Sundrehagen (1995), Journal of Chromatographie B, 670, 37-45).
  • Obwohl immobilisierte Phenylborate zur chromatographischen Trennung von biologischen Molekülen mit den erforderlichen Funktionalitäten verwendet wurden und trotz der subtantiellen Menge an Forschung für die Biokonjugation und die substantielle Investitionssumme auf diesem Gebiet wurde die Selektivität der Phenylborsäure bisher nicht erfolgreich ausgenutzt, um die Konjugation von biologischen Makromolekülen miteinander oder mit anderen Molekülarten zu ermöglichen, die brauchbare Eigenschaften hinzufügen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse an Borverbindungskomplexierungsmitteln, die zur Herstellung von Biokonjugaten brauchbar ist, und das Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Reagenzien. In einer Ausführungsform ist die Borverbindung Phenylborsäure oder ein Derivat hiervon, die mit den Komplexierungsmitteln der vorliegenden Erfindung komplexiert. Falls nichts anderes angegeben ist, wird der Ausdruck Phenylborsäurekomplexierungsmittel hierin verwendet, um eine breitere Klasse an Borverbindungskomplexierungsmitteln zu umfassen, und der Ausdruck Phenylborsäure wird hierin verwendet, um eine breitere Klasse an Borverbindungen zu umfassen, die mit den Borverbindungskomplexierungsmitteln komplexieren. In der vorliegenden Erfindung werden anstelle der Avidin-Biotin und Digoxigenin-α-Digoxigennsysteme des Stands der Technik Borverbindungskomplexierungsmittel zusammen mit der Borverbindung, wie Phenylborsäurereagenzien verwendet (von denen viele in der Technik bekannt sind), um die chemische Konjugation ohne der Verwendung von intermediären biologischen Makromolekülen zu erleichtern. Die Herstellung von Biokonjugaten umfaßt oft die Konjugation von mehreren Komponenten, wie unter anderem Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Hormonen, Nukleinsäuren, Liposomen und Zellen miteinander oder mit einer anderen Moleküleinheit, die brauchbare Eigenschaften hinzufügt, einschließlich Arzneimittel, Radionuklide, Toxine, Haptene, Inhibitoren, Fluorophore, Liganden, Festphasenträger, und Konjugate von Borverbindungskomplexierungsreagenzien. Diese verschiedenen Komponenten, die in der Biokonjugatherstellung verwendet werden, werden insgesamt und einzeln als biologisch aktive Spezies oder bioaktive Spezies bezeichnet.
  • Reagenzien, die zur Modifizierung einer bioaktiven Spezies zum Zweck der Einarbeitung eines Phenylborsäurekomplexierungsrests zur anschließenden Konjugation an eine unterschiedliclie (oder die gleiche) bioaktive Spezies mit daran gebundenen Phenylborsäureresten geeignet sind, sind die der allgemeinen Formel I Allgemeine Formel I
  • Die Gruppe R&sub1; steht für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Acrylamid, Amino, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidester, N- Hydroxysulfosuccinimidester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid und Thiolreste, der zur Umsetzung des putativen Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit einer bioaktiven Spezies geeignet ist. Die Formel I umfaßt wahlweise die Gruppe Z, die einen Spacer enthält, ausgewählt aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer ungesättigten oder gesättigten Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe R&sub2; ist ausgewählt aus einem Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl, usw.) und einem Methylen, das einen elektronegativen Substituenten trägt.
  • Die Umsetzung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I mit einer bioaktiven Spezies bildet ein Konjugat mit daran gebundenen putativen Phenylborsäurekomplexierungsresten (einer oder mehrere) der allgemeinen Formel II. Allgemeine Formel II
  • Das mit BAS bezeichnete Symbol steht für eine biologisch wirksame Spezies (oder bioaktive Spezies), die einen Teil eines reaktiven Rests enthalten kann oder auch nicht (der selbst einen Spacer aufweisen kann), welcher zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Reagenz verwendet werden kann.
  • Es wird erkannt, daß in vielen Ausführungsformen mehrere identische Reagenzien der allgemeinen Formel I mit einem einzelnen BAS Molekül reagieren können. Falls beispielsweise BAS für ein Protein steht, reagieren viele Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien mit dem Protein, wobei jedes an einer der mehreren Stellen am Protein reagiert, die mit der R&sub1; Gruppe reagieren. Die allgemeine Formel II umfaßt wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer umfaßt, ausgewählt aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer ungesättigten oder gesättigten Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe R&sub2; wird ausgewählt aus einem Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl, usw.) und einem Methylen, das einen elektronegativen Substituenten trägt.
  • Das Reagenz der allgemeinen Formel II kann weiter unter Bildung einer Konjugatklasse an Borverbindungskomplexierungsreagenzien umgesetzt werden, beispielsweise Reagenzien mit einem oder mehreren daran gebundenen Phenylborsäurekomplexierungsresten der allgemeinen Formel IV: Allgemeine Formel IV
  • Die allgemeine Formel IV umfaßt wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, der ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit etwa 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe R&sub3; ist ausgewählt aus H, einem Alkyl und einem Methyl en oder Ethylen mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Schließlich steht das Symbol BAS, wie es oben definiert ist, für die bioaktive Spezies, die einen Teil eines reaktiven Rests aufweisen kann oder auch nicht (und eventuelle Spacer), der zur Anbindung der bioaktiven Spezies verwendet wird.
  • Die Zusammensetzungen der allgemeinen Formel III und der allgemeinen Formel IV und Verfahren zu ihrer Herstellung werden hierin beschrieben und sind Gegenstand der US 5 744 627 A mit dem Titel Borverbindungskomplexierungsreagenzien und Komplexe, USSN 08/691929 vom 5. August 1996 von Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser, Kevin P. Lund und Steven M. Torkelson.
  • Phenylborsäurereagenzien, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind, wie auch die, die detaillierter in US 5 594 111 A mit dem Titel Phenylborsäurekomplexe zur Biokonjugatherstellung vom 28. Januar 1994, Anmeldenummer 08/188 958 beschrieben sind, können unter Bildung eines Konjugats an eine biologisch aktive Spezies mit daran gebundenen Phenylborsäureresten (einen oder mehrere) der allgemeinen Formel V angebunden werden: Allgemeine Formel V
  • worin das mit BAS* bezeichnete Symbol für eine zweite bioaktive Spezies stell, die einen Linkerteil umfassen kann, und die sich von der mit BAS bezeichneten bioaktiven Spezies unterscheiden kann. BAS* kann auch einen Teil eines reaktiven Rests umfassen, der zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Phenylborsäurereagenz verwendet wird.
  • Ein Konjugat der allgemeinen Formel IV mit mindestens einer biologisch aktiven Spezies und mit daran gebundenen Phenylborsäurekomplexierungsresten (einer oder mehrere) kann mit einem Konjugat der allgemeinen Formel V komplexiert werden, das aus einer zweiten bioaktiven Spezies BAS* mit daran gebundenen Phenylborsäureresten (einer oder mehrere) hergestellt wurde, um ein Biokonjugat der allgemeinen Formel VI zu erhalten Allgemeine Formel VI
  • worin die mit BAS und BAS* bezeichneten Symbole und die Gruppen Z und R&sub3; wie vorher definiert sind. Auf diese Weise können biologische Makromoleküle miteinander oder mit anderen Funktionalitäten konjugiert werden, die brauchbare Eigenschaften verleihen.
  • Biokonjugate der allgemeinen Formel VI können in gepufferter wäßriger Lösung oder organischen Lösemitteln hergestellt werden. Das Biokonjugat wird innerhalb weniger Minuten über einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis 70ºC gebildet. Die Stabilität des Biokonjugats in wäßriger Lösung bei gegebenem pH und gegebener Temperatur wird signifikant durch die Substituentengruppe R&sub3; beeinflußt. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel VI sind in wäßrigen Lösungen mit einem pH von mehr als 3,5 und weniger als 10,5 stabil.
  • Die Biokonjugatreaktion (Phenylborsäurekomplexierung) ist gegenüber signifikanten Variationen der Ionenstärke, des Vorkommens von organischen Lösemitteln, des Vorkommens von Detergenzien und des Vorkommens von chaotropen Mitteln (Proteindenaturierungsmitteln) unempfindlich, die mit den indirekten Markierungssystemen des Stands der Technik nicht kompatibel sind, bei denen die Struktur eins biologischen Makromoleküls erhalten bleiben muß, um die erforderlichen Bindungseigenschaften aufrechtzuerhalten. In den meisten Fällen sind die Zwänge, die die Bildung von Biokonjugatkomplexen durch das hierin beschriebene System begleiten, auf die limitiert, die durch die Bedingungen hervorgerufen werden, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der bioaktiven Spezies erforderlich sind.
  • Zusammengefaßt werden Borverbindungskomplexienrungsreagenzien und Verfahren zur Synthese der Reagenzien beschrieben. Diese Reagenzien, einschließlich die, die als allgemeine Formel I und allgemeine Formel II gezeigt sind, können nach weiteren hierin beschriebenen Reaktionen zur Komplexierung mit Borverbindungen verwendet werden, wie Phenylborsäure oder Derivaten hiervon.
  • Andere Reagenzien, die zur Modifizierung einer bioaktiven Spezies zum Zweck des Einbaus eines Phenylborsäurekomplexierungsrests zur anschließenden Konjugation an eine unterschiedliche (oder die gleiche) bioaktive Spezies mit daran gebundenen Phenylborsäureresten geeignet sind, sind die der allgemeinen Formel III: Allgemeine Formel III
  • Die Gruppe R&sub1; steht für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rat, der zur Umsetzung des Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit einer bioaktiven Spezies geeignet ist, wie sie oben definiert ist. Die Formel III umfaßt wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, ausgewählt aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe R&sub3; ist ausgewählt aus Wasserstoff, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Die Gruppe R&sub3; ist vorzugsweise ausgewählt aus H, CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;. Wenn die Gruppe R&sub3; für H steht, dann ist die Gruppe R&sub1; ausgewählt aus einem Acrylamid, Amino, Dithiopyridyl, Hydrazid, Imidatester, Maleimid und Thiolresten. Die Gruppe Z steht vorzugsweise für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 6 steht.
  • Die Umsetzung eines Reagenzes der allgemeinen Formel III mit einer bioaktiven Spezies ergibt ein Konjugat mit daran gebundenen Phenylborsäurekomplexierungsresten (einer oder mehrere) der allgemeinen Formel IV Allgemeine Formel IV
  • Das mit BAS bezeichnete Symbol steht für eine biologisch aktive Spezies (oder bioaktive Spezies), die einen Teil eines reaktiven Rests enthalten kann oder auch nicht (der selbst einen Spacer aufweisen kann), welcher zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Reagenz verwendet werden kann. Es wird erkannt, daß in vielen Ausführungsformen mehrere identische Reagenzien der allgemeinen Formel III mit einem einzelnen BAS Molekül reagieren können. Falls beispielsweise BAS für ein Protein steht, reagieren viele Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien mit dem Protein, wobei jedes an einer der mehreren Stellen am Protein reagiert, die mit der R&sub1; Gruppe reagieren. Die allgemeine Formel IV umfaßt wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, ausgewählt aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe R&sub3; wird ausgewählt aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Die Zusammensetzungen der allgemeinen Formeln I und II und Verfahren zu ihrer Herstellung sind hierin beschrieben und sind Gegenstand der US 5 744 627 A mit dem Titel Borverbindungskomplexierungsreagenzien und Komplexe vom 5. August 1996 von Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser, Kevin P. Lund und Steven M. Torkelson.
  • Phenylborsäurereagenzien, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind, wie auch die, die detaillierter in US 5 594 111 A mit dem Titel Phenylborsäurekomplexe zur Biokonjugatherstellung vom 28. Januar 1994 beschrieben sind, können unter Bildung eines Konjugats an eine biologisch aktive Spezies angebunden werden, die daran gebundene Phenylborsäurereste (einen oder mehrere) und die allgemeine Formel V aufweist: Allgemeine Formel V
  • worin das mit BAS* bezeichnete Symbol für eine zweite bioaktive Spezies steht, die einen Linkerteil umfassen kann, und die sich von der mit BAS bezeichneten bioaktiven Spezies unterscheiden kann. BAS* kann auch einen Teil eines reaktiven Rests umfassen, der zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Phenylborsäurereagenz verwendet wird.
  • Ein Konjugat der allgemeinen Formel IV mit mindestens einer biologisch aktiven Spezies und mit daran gebundenen Phenylborsäurekomplexierungsresten (einer oder mehrere) kann mit einem Konjugat der allgemeinen Formel V hergestellt werden, das aus einer zweiten bioaktiven Spezies BAS* mit daran gebundenen Phenylborsäureresten (einer oder mehrere) hergestellt wurde, um ein Biokonjugat der allgemeinen Formel VI zu erhalten Allgemeine Formel VI
  • worin die mit BAS und BAS* bezeichneten Symbole und die Gruppen Z und R&sub3; wie vorher definiert sind. Auf diese Weise können biologische Makromoleküle miteinander oder mit anderen Funktionalitäten konugiert werden, die brauchbare Eigenschaften verleihen.
  • Zusammengefaßt werden Borverbindungskomplexierungsreagenzien, Borverbindungskomplexe und Verfahren zur Synthese dieser Reagenzien und Komplexe beschrieben. Diese Reagenzien und Komplexe umfassen die, die in den allgemeinen Formeln III, IV und VI gezeigt sind. In einer Ausführungsform können die Reagenzien der allgemeinen Formel III nach der Kondensation mit einer bioaktiven Spezies (BAS) rur Bildung eines Reagenzes der allgemeinen Formel IV verwendet werden. Das Reagenz der allgemeinen Formel IV kann zzur Bildung eines Komplexes mit einer Borverbindung verwendet werden, wie einem in der allgemeinen Formel VI gezeigten Komplex.
  • Biokonjugate der allgemeinen Formel VI können in gepufferter wäßriger Lösung oder organischen Lösemitteln hergestellt werden. Das Biokonjugat wird innerhalb weniger Minuten über einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis 70ºC gebildet. Die Stabilität des Biokonjugats in wäßriger Lösung bei gegebenem pH und gegebener Temperatur wird signifikant durch die Substituentengruppe R&sub3; beeinflußt. Die Biokonjugate der allgemeinen Formel VI sind in wäßrigen Lösungen mit einem pH von mehr als 3,5 und weniger als 10,5 stabil. Die Biokonjugatreaktion (Phenylborsäurekomplexierung) ist gegenüber signifikanten Variationen der Ionenstärke, des Vorkommens von organischen Lösemitteln, des Vorkommens von Detergenzien und des Vorkommens von chaotropen Mitteln (Proteindenaturierungsmitteln) unempfindlich, die mit den indirekten Markierungssystemen des Stands der Technik nicht kompatibel sind, bei denen die Struktur eines biologischen Makromoleküls erhalten bleiben muß, um die erforderlichen Bindungseigenschaften aufrechtzuerhalten. In den meisten Fällen sind die Zwänge, die die Bildung von Biokonjugatkomplexen durch das hierin beschriebene System begleiten, auf die limitiert, die durch die Bedingungen hervorgerufen werden, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der bioaktiven Spezies erforderlich sind.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die Fig. I erläutert die Verwendung von putativen Phenylborsäurekomplexierungsmitteln der allgemeinen Formel I und Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel III zur Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel IV, die wiederum zur Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI verwendet werden können.
  • Die Fig. 2 faßt die Herstellung von Alkyl-4- und -5-aminomethylsalicylaten zusammen, synthetischen Zwischenprodukten, die zu Reagenzien der allgemeinen Formel I führen, worin R&sub2; für eine Alkylgruppe steht, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl usw. Alkyl-4- und -5-aminomethylsalicylate sind auch als synthetische Zwischenprodukte brauchbar, die zu Reagenzien der allgemeinen Formel III führen.
  • Die Fig. 3 faßt die Herstellung von Alkyl-4- und -5-aminomethylsalicylaten zusammen, synthetischen Zwischenprodukten, die zu Reagenzien der allgemeinen Formel I führen, worin R&sub2; für eine Methylengruppe steht, die einen elektronegativen Rest trägt, beispielsweise Carboxymethyl, Cyanomethyl, Methoxymethyl usw.
  • Die Fig. 4 faßt die Herstellung von 4- und -5-aminomethylsalicylhydraxamsäuren zusammen, synthetischen Zwischenprodukten, die zu den Reagenzien der allgemeinen Formel III führen, worin R&sub2; entweder für eine Alkylgruppe oder eine Methylen- oder Ethylengruppe steht, die einen elektronegativen Rest trägt.
  • Die Fig. 5 faßt die Synthese von Reagenzien der allgemeinen Formeln I und III zusammen, worin R&sub2; entweder für eine Alkylgruppe oder eine Methylengruppe steht, die einen elektronegativen Rest trägt, und worin R&sub1; ausgewählt ist aus Imidazolid-, Hydrazid- und N-Hydroxysuccinimidylesterresten.
  • Die Fig. 6 faßt die Synthese von Reagenzien der allgemeinen Formeln I und III zusammen, worin R&sub2; entweder für eine Alkylgruppe oder eine Methylengruppe steht, die einen elektronegativen Rest trägt, und worin R&sub1; ausgewählt ist aus Brom-, Chlor-, Iod-, Maleimid-, Dithiopyridyl- und Imidatesterresten.
  • Die Fig. 7 faßt die Synthese der Reagenzien der allgemeinen Formeln I und III zusammen, worin R&sub1; für einen N-Hydroxysuccinimidylester steht und worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten Länge mit mindestens einem aus einem Zwischenproduktamid oder einem Disulfidrest steht.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Ein Dreistufenverfahren, das die Reagenzien der allgemeinen Formel I zur Herstellung der Biokonjugate verwendet, ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Zu Beginn wird ein Reagenz der allgemeinen Formel I ausgewählt, das sich aus einer geeignet reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Gruppe R&sub1; zusammensetzt, die zur Umsetzung mit der gewünschten biologisch aktiven Spezies geeignet ist. Allgemeine Formel I
  • Die Gruppe R&sub1; steht für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest, der zur Umsetzung des putativen Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit einer bioaktiven Spezies geeignet ist. Die Gruppe R&sub1; wird ausgewählt aus Resten, wie Acrylamid, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxysulfosuccinimidylester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid, Amino und Thiol.
  • Die Verbindungen der Formel I umfassen wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, der ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten, vorzugsweise unverzweigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe Z steht vorzugsweise für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n, worin n bis 1 bis 6 steht.
  • Die Gruppe R&sub2; wird ausgewählt aus einem Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl, usw.) und einem Methylen, das einen elektronegativen Substituenten trägt. Ein elektronegativer Substituent ist ein Substituent mit einem negativen Dipolmoment, beispielsweise CN, COOH, usw. Die Gruppe R&sub2; ist vorzugsweise ausgewählt aus CH&sub3;, CH&sub2;CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2; und CH&sub2;OCH&sub3;.
  • Der nächste Schritt in einem Dreistufenverfahren zur Herstellung von Biokonjugaten ist die Kondensierung des geeigneten Reagenzes mit der bioaktiven Spezies unter Bildung eines Konjugats der allgemeinen Formel II: Allgemeine Formel II
  • In der allgemeinen Formel II sind Z und R&sub2; wie oben definiert und BAS steht für eine biologisch aktive Spezies, die einen Teil eines reaktiven Rests (und jeden Spacer) enthalten kann oder auch nicht, der zur Anbindung der biologisch aktiven Spezies an das Reagenz verwendet wird.
  • Als nächstes wird das Konjugat mit einem Hydroxylaminderivat der allgemeinen Formel NH&sub2;OR&sub3; umgesetzt, worin R&sub3; ausgewählt wird aus einem von H, Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl usw.) oder einem Methylen oder Ethylen mit einem elektronegativen Rest. Geeignete Hydroxylaminderivate sind unter anderem NH&sub2;OH, NH&sub2;OCH&sub3;, NH&sub2;OCH&sub2;CN, NH&sub2;OCH&sub2;COOH, NH&sub2;OCH&sub2;CONH&sub2; und NH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;OH. Das entstehende Konjugat hat die allgemeine Formel IV: Allgemeine Formel IV
  • In der allgemeinen Formel IV sind die Gruppen Z und BAS wie oben definiert und R&sub3; ist ausgewählt aus einem von H, einem Alkyl und einem Methylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Das Konjugat der allgemeinen Formel IV wird dann mit einer Phenylborsäure mit der allgemeinen Formel V komplexiert: Allgemeine Formel V
  • worin das mit BAS* bezeichnete Symbol für eine zweite biologisch aktive Spezies steht, die einen Linkerteil umfassen kann und sich von der mit BAS bezeichneten biologisch aktiven Spezies des Komplexierungsmittels unterscheidet. BAS* kann auch einen Teil eines reaktiven Rests umfassen, der zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Phenylborsäurereagenz verwendet wird. Die Komplexierung ergibt den stereoisommeren Komplex (tetraedrisches Bor) der allgemeinen Formel VI: Allgemeine Formel VI
  • Ein Zweistufenverfahren, das die Reagenzien der allgemeinen Formel III zur Herstellung von Biokonjugaten verwendet, ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Zu Beginn wird ein Reagenz der allgemeinen Formel III ausgewählt, das aus einer geeigneten reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Gruppe R&sub1; besteht, die zur Umsetzung mit der gewünschten biologisch aktiven Spezies geeignet ist. Allgemeine Formel VI
  • Die Gruppe R&sub1; ist ein reaktiver elektrophiler oder nukleophile Rest, der zur Umsetzung des Phenylborsäurekomplexierungsmittels mit einer bioaktiven Spezies geeignet ist. Die Gruppe R&sub1; ist ausgewählt aus Resten wie Acrylamid, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxysulfosuccinimidylester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid, Amino uni Thiol.
  • Die Verbindungen der Formel III umfassen wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, der ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten, vorzugsweise unverzweigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit zumindest einem Zwischenproduktamid oder Dilsulfidresten und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe Z steht vorzugsweise für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 6 steht.
  • Die Gruppe R&sub3; wird ausgewählt aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten. Ein elektronegativer Substituent ist ein Substituent mit einem negativen Dipolmoment, beispielsweise CN, COOH usw.
  • Die Gruppe R&sub3; ist vorzugsweise ausgewählt aus H, CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;. Wenn die Gruppe R&sub3; für H steht, ist die Gruppe R&sub1; ausgewählt aus Resten, wie Acrylamid, Amino, Dithiopyridyl, Hydrazid, Imidatester, Maleimid und Thiol.
  • Das Reagenz der allgemeinen Formel III wird mit der bioaktiven Spezies unter Bildung eines Konjugats der allgemeinen Formel IV kondensiert: Allgemeine Formel IV
  • worin die Gruppen Z und BAS wie oben definiert sind und R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Das Konjugat der allgemeinen Formel IV wird dann mit einem Phenylborsäurekonjugat der allgemeinen Formel V komplexiert: Allgemeine Formel V
  • worin das mit BAS* bezeichnete Symbol eine zweite biologisch aktive Spezies darstellt, die einen Linkerteil umfassen kann und sich von der biologisch aktiven Spezies des Komplexierungsmittels unterscheidet, die mit BAS bezeichnet ist. BAS* kann auch einen Teil eines reaktiven Rests umfassen, der zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Phenylborsäurereagenz verwendet wird. Die Komplexierung ergibt den stereoisomeren Komplex (tetraedrisches Bor) der allgemeinen Formel VI: Allgemeine Formel VI
  • Ein alternatives Dreistufenverfahren, das die Reagenzien der allgemeinen Formel I zur Herstellung der Biokonjugate verwendet, ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Zu Beginn wird ein Reagenz der allgemeinen Formel I ausgewählt, das sich aus einer geeigneten reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Gruppe R&sub1; zusammensetzt, die zur Reaktion der gewünschten biologisch aktiven Spezies geeignet ist. Allgemeine Formel I
  • Die Gruppe R&sub1; steht für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest, der zur Umsetzung des putativen Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit einer bioaktiven Spezies geeignet ist. Die Gruppe R&sub1; wird ausgewählt aus Resten, wie Acrylamid, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxysulfosuccinimidylester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid, Amino und Thiol.
  • Die Verbindungen der Formel I enthalten wahlweise eine Gruppe Z, die einen Spacer enthält, der ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten, vorzugsweise unverzweigten Keift mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Ketb mit etwa 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenamidrest oder Disulfidresten und einer Polethylenglycolkette mit einer Länge von etwa 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten. Die Gruppe Z steht vorzugsweise für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 6 steht.
  • Die Gruppe R&sub2; wird ausgewählt aus einem Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl, usw.) und einem Methylen oder Ethylen, das einen elektronegativen Substituenten trägt. Ein elektronegativer Substituent ist ein Substituent mit einem negativen Dipolmoment, beispielsweise CN, COOH, usw. Die Gruppe R&sub2; ist vorzugsweise ausgewählt aus CH&sub3;, CH&sub2;CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2; und CH&sub2;OCH&sub3;.
  • Der nächste Schritt in einem Dreistufenverfahren zur Herstellung von Biokonjugaten ist die Kondensierung des geeigneten Reagenzes mit der bioaktiven Spezies unter Bildung eines Konjugats der allgemeinen Formel II: Allgemeine Formel II
  • In der allgemeinen Formel II sind Z und R&sub2; wie oben definiert und BAS steht für eine biologisch aktive Spezies, die einen Teil eines reaktiven Rests (und eines Spacers) enthalten kann oder auch nicht, der zur Anbindung der biologisch aktiven Spezies an das Reagenz verwendet wird.
  • Als nächstes wird das Konjugat mit einem Hydroxylaminderivat der allgemeinen Formel NH&sub2;OR&sub3; umgesetzt, worin R&sub3; ausgewählt wird aus H, Alkyl (beispielsweise Methyl, Ethyl usw.) oder einem Methylen oder Ethylen mit einem elektronegativen Rest. Geeignete Hydroxylaminderivate sind unter anderem NH&sub2;OH, NH&sub2;OCH&sub3;, NH&sub2;OCH&sub2;CN, NH&sub2;OCH&sub2;COOH, NH&sub2;OCH&sub2;CONH&sub2; und NH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;OH. Das entstehende Konjugat hat die allgemeine Formel IV: Allgemeine Formel IV
  • worin die Gruppen Z und BAS wie oben definiert sind und R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
  • Das Konjugat der allgemeinen Formel IV wird dann mit einer Phenylborsäure der allgemeinen Formel V komplexiert: Allgemeine Formel V
  • worin das mit BAS* bezeichnete Symbol eine zweite biologisch aktive Spezies darstellt, die einen Linkerteil umfassen kann und sich von der biologisch aktiven Spezies des Komplexierungsmittels unterscheidet, die mit BAS bezeichnet ist. BAS* kann auch einen Teil eines reaktiven Rests umfassen, der zur Anbindung der bioaktiven Spezies an das Phenylborsäurereagenz verwendet wird. Die Komplexierung ergibt den stereoisomeren Komplex (etwa tetraedrisches Bor) der allgemeinen Formel VI: Allgemeine Formel VI Synthese von putativen Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel I Allgemeine Formel I
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel I werden von 4- oder 5-Methylsalicylsäure abgeleitet. In jedem Fall wird das Reagenz letztlich aus einem synthetischen Zwischenprodukt hergestellt, das entweder ein Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylat ist.
  • Die Fig. 2 faßt die Herstellung von Alkyl-4- und -5-aminomethylsalicylaten zusammen, synthetischen Zwischenprodukten, die zu Reagenzien der allgemeinen Formel I führen, worin R&sub2; für eine Alkylgruppe steht, beispielsweise Methyl, Ethyl, usw. Die Fig. 2 zeigt ein Beispiel, worin R&sub2; für eine Methylgruppe steht. Zu Beginn wird in Schritt 1 entweder eine 4- oder 5-Methylsalicylsäure unter Bildung des entsprechenden 4- oder 5-Methylsalicylats verestert. In Schritt 2 wird der Ester mit N-Bromsuccinimid ung d Benzoylperoxidkatalysator unter Bildung des entsprechenden Benzylbromids bromiert. In Schritt 3 wird das Benzylbromid mit Natriumazid unter Bildung des entsprechenden Benzylazids alkyliert. Schließlich wird in Schritt 4 das Benzylazid einer Palladiumkatalysierten Hydrierung in Gegenwart von HCl unter Bildung des entsprechenden Benzylaminhydrochlorids unterzogen.
  • Die Fig. 3 faßt die Herstellung der synthetischen Zwischenprodukte zusammen, die zu den Reagenzien der allgemeinen Formel I führen, worin die Gruppe R&sub2; für ein Methylen steht, die einen elektronegativen Rest trägt, beispielsweise Carboxymethyl-, Acetamidomethyl- und Cyanomethyl-4- oder -5-aminomethylsalicylat. Es ist ersichtlich, daß andere umfaßte Substituenten für die Gruppe R&sub2; durch eine ähnliche Synthese hergestellt werden können. Anfänglich wird in Schritt 1 von Fig. 3 das wie in Fig. 2 zusammengefaßt hergestellte Alkyl-4- oder - 5-aminomethylsalicylat mit Di-tert-butyldicarbonat und Triethylamin in Methanol unter Bildung des entsprechend geschützten Methyl-N-(tert-butoxycarbonyl)aminomethylsalicylats umgesetzt. In Schritt 2 wird der Methylester duch die Umsetzung mit Kaliumtrimethylsilanolat gespalten und in einer wäßrigen. Säure unter Bildung der entsprechenden Salicylsäure aufgearbeitet. In Schritt 3 wird die Salicylsäure durch die Umsetzung mit einer α- Halogensäure, einem α-Halogenacetamid oder einem α-Halogenacetonitril und Triethylamin unter jeweiliger Bildung des entsprechenden Carboxymethyl-, Acetamidomethyl- oder Cyanomethylesters alkyliert. Schließlich wird in Schritt 4 die N-(tert-Butoxycarbonyl)-Schutzgruppe durch die Umsetzung mit wasserfreiem Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran unter Bildung des entsprechenden Benzylaminhydrochlorids entfernt.
  • Ein weiteres Reagenz der vorliegenden Erfindung, das das Acrylsäureamid des Aminomethylsalicylats ist, kann in einem einzigen Schritt mittels des Endprodukts von Fig. 3 durch die Kondensation von Acrylsäureanhydrid oder Acryloylchlorid mit Aminomethylsalicylat hergestellt werden.
  • Die Fig. 5 faßt die Synthese von Reagenzien der allgemeinen Formel I zusammen, worin die Gruppe R&sub2; entweder für eine Alkyl- oder Methylengruppe steht, die einen elektronegativen Res t trägt, und worin die Gruppe R&sub1; ausgewählt ist aus Imidazolid-, Hydrazid- und N-Hydroxysuccinimidylesterresten. Diese Reagenzien werden jeweils in einem Zweistufenverfahren hergestellt, worin ein aliphatisches Säureanhydrid im ersten Schritt verwendet wird. Zu Beginn wird ein Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylat, das wie in Fig. 2 oder Fig. 3 zusammengefaßt hergestellt wurde, mit einem aliphatischen Säureanhydrid kondensiert, das vorzugsweise unter anderem ausgewählt ist aus Bernsteinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid und Glycolsäureanhydrid, in einem aprotischen organischen Lösemittel, das zur Einführung eines Spacers (Gruppe Z) führt, der einen freien terminalen Carbonsäurerest aufweist. Wenn das aliphatische Säureanhydrid in dieser Kondensationsreaktion Maleinsäureanhydrid ist, ist die entstehende Z Gruppe ungesättigt, da sie eine Alkengruppe enthält. Anschließend wird der Carbonsäurerest weiter durch die Umsetzung entweder mit N,N-Carbonyldiimidazol, Isobutylchlorformiat und tert-Butylcarbazat oder N,N-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid unter Bildung jeweils des entsprechenden Imidazolids, des geschützten Hydrazids und N-Hydroxysuccinimidylesters funktionalisiert. Im Fall des geschützten Hydrazids wird die N-(tert-Butoxycarbonyl)-Schutzgruppe durch das Zusammenbringen des Reagenzes mit wasserfreier Chorwasserstoffsäure entfernt.
  • Die Fig. 6 faßt die Synthese der Reagenzien der allgemeinen Formel I zusammen, worin R&sub2; entweder für eine Alkyl- oder Methylengruppe steht, die einen elektronegativen Rest trägt, und worin die Gruppe R&sub1; aus Resten, wie Brom, Chlor, Maleimid, Dithiopyridyl und Imidatestern ausgewählt ist. Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe R&sub1; aus Brom- und Chlorresten ausgewählt ist, werden durch Kondensation eines Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylats, das wie in Fig. 2 oder 3 zusammengefaßt hergestellt wird, jeweils entweder mit Bromessigsäureanhydrid oder Chloressigsäureanhydrid hergestellt. Das homologe Iodreagenz wird durch Halogenaustausch des Chlorreagenzes mit Natriumiodid hergestellt. Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin R&sub1; ausgewählt ist aus Resten wie Brom, Chlor, Iod, Bromacetamid, Chloracetamid und Iodacetamid könnten aufgrund des Potentials für eine intermolekulare Alkylierung des ungeschützten Hydroxamats nicht bequem hergestellt werden, wenn R&sub3; für H steht. Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe R&sub1; entweder aus Maleimid- oder Dithiopyridylresten ausgewählt ist, werden durch die Kondensation eines Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylats, das wie in Fig. 2 oder Fig. 3 zusammengefaßt hergestellt wird, mit einem N-Hydroxysuccinimidylester eines aliphatischen Carbonsäureesters hergestellt, der entweder einen terminalen Maleimid- oder Dithiopyridylrest trägt. Ein Reagenz der allgemeinen Formel I, worin R&sub1; für einen Imidatesterrest steht, wird durch ein Zweistufenverfahren hergestellt, worin ein Alkyl-4- oder -5-aminomethylbenzoat, das wie in Fig. 2 oder Fig. 3 zusammengefaßt hergestellt wird, zuerst mit einem N-Hydroxysuccinimidylester eines aliphatischen Carbonsäureesters kondensiert wird, der einen terminalen Nitrilrest trägt. Anschließend wird der Nitrilrest durch die Umsetzung mit wasserfreier Chlorwasserstoffsäure in Methanol bei 0ºC in den Methylimidatester umgewandelt.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe R&sub1; entweder aus N-Hydroxysuccinimidylester- (Fig. 5), Imidazolid- (Fig. 5) und Dithiopyridylesterresten (Fig. 6) ausgewählt ist, können als Synthesezwischenprodukte zur Herstellung der Reagenzien der allgemeinen Formel I verwendet werden, die Spacer aufweisen, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem aus Zwischenproduktamid oder Disulfidresten steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe R&sub1; für ein Imidazolid oder einen N-Hydroxysuccinimidylesterrest steht, können mit Verbindungen mit primären aliphatischen Aminresten der allgemeinen Formel R&sub1;-Z&sub2;-NR&sub2; kondensiert werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise etwa 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, um Reagenzien der allgemeinen Formel I zu erhalten, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem der Zwischenproduktamidreste steht.
  • Alternativ dazu können die N-Hydroxysuccinimidylesterreagenzien der allgemeinen Formel I, die vorzugsweise von einer Dicarbonsäure abgeleitet sind, welche ausgewählt ist aus Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Acetylendicarbonsäure und Glutarsäure, mit Verbindungen mit primären aliphatischen Aminresten der allgemeinen Formel HO&sub2;C-Z&sub2;-NH&sub2; kondensiert werden, worin 22 für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, vorzugsweise ausgewählt aus Glycin, β-Alanin, Aminopropiolsäure, 4-Aminobuttersäure und 6-Aminocapronsäure, um Verbindungen mit freien terminalen Carbonsäureresten zu erhalten, die weiter gemäß Fig. 5 funktionalisiert werden können, um Reagenzien der allgemeinen Formel I zu erhalten, worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktamidrest steht. Dieses Verfahren ist in Fig. 7 für die Synthese eines Reagenzes der allgemeinen Formel I zusammengefaßt, worin R&sub1; für einen N-Hydroxysuccinimidylester steht und worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktamidrest steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe R&sub1; für einen Dithiopyridylrest steht, können mit Verbindungen mit terminalen Thiolresten der allgemeinen Formel R&sub1;-Z&sub2;-SH umgesetzt werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, um Reagenzien der allgemeinen Formel I zu erhalten, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem der Zwischenproduktdisulfidreste steht.
  • Alternativ dazu können Dithiopyridylreagenzien der allgemeinen Formel I, die vorzugsweise von einer Mercaptocarbonsäure abgeleitet sind, ausgewählt aus Mercaptoessigsäure, β-Mercaptopropionsäure, Mercaptopropiolsäure, 4-Mercaptobuttersäure und 6-Mercaptocapronsäure, mit Verbindungen mit einem Thiolrest der allgemeinen Formel HO&sub2;C-Z&sub2;-SH kondensiert werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, vorzugsweise ausgewählt aus Mercaptoessigsäure, β-Mercaptopropionsäure, Mercaptopropiolsäure, 4-Mercaptobuttersäure und 6-Mercaptocapronsäure, um Verbindungen mit freien terminalen Carbonsäureresten zu erhalten, die gemäß Fig. 5 unter Bildung von Reagenzien der allgemeinen Formel I weiter funktionalisiert werden, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktdisulfidrest steht. Das Verfahren ist in Fig. 7 zur Synthese eines Reagenzes der allgemeinen Formel I zusammengefaßt, worin R&sub1; für einen N-Hydroxysuccinimidylester steht, und worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktdisulfidrest steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel I, worin die Gruppe Z für eine Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten steht, werden durch die Kondensation eines Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylats, das wie in Fig. 2 oder Fig. 3 zusammengefaßt hergestellt wird, mit einem Polyethylenglycolreagenz mit sowohl einem N-Hydroxysuccinimidylesterrest als auch entweder einem reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest (oder einem geschützten Vorläufer hiervon), von denen viele im Handel erhältlich sind, unter Bildung von Reagenzien der allgemeinen Formel I hergestellt, worin die Gruppe Z für eine Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten steht.
    • Herstellung von Phenylborsäurekomplexierungskonjugaten der allgemeinen Formel IV
  • An dieser Stelle können die putativen Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel I mit einer geeigneten biologisch aktiven Spezies unter Bildung des Konjugats der allgemeinen Formel II umgesetzt werden: Allgemeine Formel II
  • Das Konjugat der allgemeinen Formel 11 wird als nächstes mit einem Hydroxylaminderivat unter Bildung des entsprechenden Phenylborsäurekomplexierungskonjugats der allgemeinen Formel IV kondensiert: Allgemeine Formel IV
  • Geeignete Hydroxylaminderivate werden vorzugsweise ausgewählt aus NH&sub2;OH, NH&sub2;OCH&sub3;, NH&sub2;OCH&sub2;CN, NH&sub2;OCH&sub2;COOH, NH&sub2;OCH&sub2;CONH&sub2;, NH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;OH und NH&sub2;OCH&sub2;OCH&sub3;. Wenn die Gruppe R&sub2; in der allgemeinen Formel II für eine Alkylgruppe steht, wird vorzugsweise NH&sub2;OH verwendet, um eine Umwandlung der Verbindung der allgemeinen Formel II in die Verbindung der allgemeinen Formel IV auszuführen.
  • Alternativ dazu können Konjugate der allgemeinen Formel IV auch auf dem Weg hergestellt werden, der in Fig. 1 beschrieben ist, der ein Reagenz der allgemeinen Formel III verwendet Allgemeine Formel III
  • Die Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel III können mit einer geeigneten biologisch aktive Spezies unter Bildung des Konjugats der allgemeinen Formel IV umgesetzt werden Allgemeine Formel IV
    • Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI
  • Biokonjugate der allgemeinen Formel VI können in gepufferten wäßrigen Lösungen oder organischen Lösemitteln hergestellt werden. Bevorzugte Puffer umfassen Acetat, Citrat, Phosphat, Carbonat und Diglycin. Boratpuffer sollten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Komplexierung mit dem Phenylborsäurekomplexierungsrest vermieden werden. Tris-β-hydroxyamin und β-Hydroxysäurepuffer sollten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Komplexierung mit der Phenylborsäure vermieden werden. Das Biokonjugat bildet sich innerhalb weniger Minuten über einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis 70ºC. Die Stabilität des Biokonjugats in wäßriger Lösung bei einem gegebenen pH und einer gegebenen Temperatur wird in gewissem Maß durch die Substituentengruppe R&sub3; beeinflußt. Biokonjugate der allgemeinen Formel VI sind in wäßrigen Lösungen mit einem pH von mehr als 34 und weniger als 10,5 stabil. Die Biokonjugatreaktion (Phenylborsäurekomplexierung) ist unempfindlich gegenüber signifikanten Variationen der Ionenstärke über einen Bereich von 0,01 bis 1 M, der Gegenwart von organischen Lösemitteln, einschließlich Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, der Gegenwart von Detergenzien und der Gegenwart von chaotropen Mitteln (Proteindenaturierungsmitteln) einschließlich Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat und Formamid, die mit indirekten Markierungssystemen des Stands der Technik nicht kompatibel sind, worin die Struktur des biologischen Makromoleküls erhalten bleiben muß, um die erforderlichen Bindungseigenschaften zu erhalten. Nach der Bildung sind die Biokonjugate nach der Entfernung von Wasser stabil und können zur Lagerung lyophilisiert werden.
  • Die Stabilität des Biokonjugats bei einem gegebenen pH wird in gewissem Ausmaß durch die Substituentengruppe R&sub3; bestimmt. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für H steht, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 3,5 bis 10,5 stabil. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für CH&sub3; steht, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 4,5 bis 10,5 stabil. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; einen elektronegativen Rest umfaßt, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von weniger als 3,5 bis 10,5 stabil.
  • Die Stabilität des Phenylborsäurekomplexes gegenüber der säurekatalysierten Hydrolyse hängt mit dem pKa der Hydroxamsäure zusammen, die im Komplex beteiligt ist. Je niedriger der pKa des Hydroxamsäurerests ist, desto stabiler ist der Komplex. Demnach zeigen Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für einen elektronegativen Rest steht, eine größere Stabilität gegenüber einer säurekatalysierten Hydrolyse, als die, worin R&sub3; entweder für H oder CH&sub3; steht. Synthese der Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel III Allgemeine Formel III
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel III werden entweder von 4- oder 5-Methylsalicylsäure abgeleitet. In jedem Fall wird das Reagenz letztlich aus einem Synthesezwischenprodukt gebildet, das ein Alkyl-4- oder - 5-aminomethylbenzoat ist.
  • Die Fig. 2 faßt die Herstellung der Alkyl-4- und -5-aminomethylbenzoate zusammen, Synthesezwischenprodukte, die zu den Reagenzien der allgemeinen Formel III führen, worin R&sub2; für eine Alkylgruppe steht, wie beispielsweise Methyl, Ethyl usw. Die Fig. 2 zeigt ein Beispiel, worin R&sub2; für eine Methylgruppe steht. Zu Beginn wird in Schritt 1 entweder eine 4- oder 5-Methylsalicylsäure unter Bildung des entsprechenden Alkyl-4- oder -5-methylsalicylats verestert. In Schritt 2 wird der Ester mit N-Bromsuccinimid und Benzoylperoxidkatalysator unter Bildung des entsprechenden Benzylbromids bromiert. In Schritt 3 wird das Benzylbromid mit Natriumazid unter Bildung des entsprechenden Benzylazids alkyliert. In Schritt 4 wird schließlich das Benzylazid einer Palladium-katalysierten Hydrierung in Gegenwart von HCl unter Bildung des entsprechenden Benzylaminhydrochlorids unterzogen.
  • Die Fig. 4 faßt die Herstellung von 4- und 5-Aminosalicylhydroxamsäuren zusammen, synthetischen Zwischenprodukten, die zu den Reagenzien der allgemeinen Formel III fuhren, worin die Gruppe R&sub3; entweder für ein Alkyl oder ein Methylen oder Ethylen steht, das einen elektronegativen Substituenten trägt. Zu Beginn wird in Schritt 1 ein Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylat, das wie in Fig. 2 zusammengefaßt hergestellt wird, mit einem N-(Benzyloxycarbonyl)oxysuccinimid unter Bildung des Alkyl-N-benzyloxycarbonyl-geschützten 4- oder 5-Aminomethylsalicylats kondensiert. In Schritt 2 wird der phenolische Hydroxylrest mit Benzylbromid unter Bildung des weiterhin geschützten Benzyletherzwischenprodukts kondensiert. In Schritt 3 wird der Alkylester selektiv durch die Umsetzung mit LiOH unter Bildung der entsprechenden Carbonsäure gespalten. In Schritt 4 wird die Carbonsäure durch die Umsetzung mit Isobutylchlorformiat unter Bildung eines gemischten Anhydrids aktiviert, das dann anschließend mit einem Hydroxylaminderivat umgesetzt wird, das vorzugsweise ausgewählt ist aus NH&sub2;OH, NH&sub2;OCH&sub3;, NH&sub2;OCH&sub2;CN, NH&sub2;OCH&sub2;COOH, NH&sub2;OCH&sub2;CONH&sub2;, NH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;OH und NH&sub2;OCH&sub2;OCH&sub3;, um die entsprechend geschützte Hydroxamsäure zu erhalten. Schließlich werden in Schritt S sowohl das Amin als auch die phenolischen Hydroxylreste gleichzeitig durch eine Palladium-katalysierte Hydrierung in Gegenwart von HCl unter Bildung des entsprechenden 4- oder 5-Aminomethylsalicylhydroxamsäurehydrochlorids einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen.
  • Die Fig. 5 faßt die Synthese von Reagenzien der allgemeinen Formel III zusammen, worin die Gruppe R&sub3; vorzugsweise ausgewählt ist aus H, CH&sub3; und einem Methylen- oder Ethylenrest, der einen elektronegativen Substituenten trägt, und worin die Gruppe R&sub1; ausgewählt ist aus Resten wie Imidazolid, Hydrazid und N-Hydroxysuccinimidylester (in diesem Fall darf R&sub3; nicht für H stehen). Diese Reagenzien werden jeweils in einem Zweistufenverfahren hergestellt, worin ein aliphatisches Säureanhydrid im ersten Schritt verwendet wird. Zu Beginn wird eine 4- oder 5-Aminomethylsalicylhydroxamsäure, die wie in Fig. 4 zusammengefaßt hergestellt wurde, mit einem aliphatischen Säureanhydrid kondensiert, das vorzugsweise unter anderem ausgewählt ist aus Bernsteinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid und Glycolsäureanhydrid, in einem aprotischen organischen Lösemittel, das zur Einführung eines Spacers (Gruppe Z) führt, der einen freien terminalen Carbonsäurerest aufweist. Falls das aliphatische Anhydrid in dieser Kondensationsreaktion Maleinsäureanhydrid ist, ist die entstehende Z Gruppe ungesättigt, da sie eine Alkengruppe enthält. Anschließend wird der Carbonsäurerest weiter durch die Umsetzung entweder mit N,N-Carbonyldiimidazol, Isobutylchorformiat und tert-Butylcarbazat oder N,N-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid unter Bildung jeweils des entsprechenden Imidazolids, des geschützten Hydrazids und N-Hydroxysuccinimidylesters funktionalisiert. Im Fall des geschützten Hydrazids wird die N-(tert- Butoxycarbonyl)-Schutzgruppe durch das Zusammenbringen des Reagenzes mit wasserfreier Chorwasserstoffsäure entfernt.
  • Die Fig. 6 faßt die Synthese der Reagenzien der allgemeinen Formel III zusammen, worin die Gruppe R&sub3; vorzugsweise ausgewählt ist aus H, CH&sub3; und einem Methylen- oder Ethylenrest, der einen elektronegativen Substituenten trägt, und worin die Gruppe R, aus Resten, wie Brom, Maleimid, Dithiopyridyl und Imidatestern ausgewählt ist. Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe R&sub1; aus Brom- und Chlorresten ausgewählt ist, werden durch Kondensation einer 4- oder 5-Aminomethylsalicylhydroxamsäure, die wie in Fig. 4 zusammengefaßt hergestellt wird, jeweils entweder mit Bromessigsäureanhydrid oder Chloressigsäureanhydrid hergestellt. Das homologe Iodreagenz wird durch Halogenaustausch des Chlorreagenzes mit Natriumiodid hergestellt. Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin R&sub1; ausgewählt ist aus Resten wie Brom, Chlor, Iod, Bromacetamid, Chloracetamid und Iodacetamid könnten aufgrund des Potentials für eine intermolekulare Alkylierung des ungeschützten Hydroxamats nicht bequem hergestellt werden, wenn R&sub3; für H steht. Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe R&sub1; entweder aus Maleimid- oder Dithiopyridylresten ausgewählt ist, werden durch die Kondensation einer 4- oder 5-Aminomethylsalicylhydroxamsäure, die wie in Fig. 4 zusammengefaßt hergestellt wird, mit einem N-Hydroxysuccinimidylester eines aliphatischen Carbonsäureesters hergestellt, der entweder einen terminalen Maleimid- oder Dithiopyridylrest trägt. Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin R&sub1; für einen Imidatesterrest steht, werden durch ein Zweistufenverfahren hergestellt, worin eine 4- oder 5-Aminomethylsalicylhydroxamsäure, die wie in Fig. 4 zusammengefaßt hergestellt wird, zuerst mit einem N-Hydroxysuccinimidylester eines aliphatischen Carbonsäureesters kondensiert wird, der einen terminalen Nitrilrest trägt. Anschließend wird der Nitrilrest durch die Umsetzung mit wasserfreier Chlorwasserstoffsäure in Methanol bei 0ºC in den Methylimidatester umgewandelt.
  • Ein weiteres Reagenz der vorliegenden Erfindung, das das Acrylsäureamid der Aminomethylsalicylhydroxamsäure ist, kann in einem einzigen Schritt mittels des Endprodukts von Fig. 4 durch die Kondensation von Acrylsäureanhydrid oder Acryloylchlorid mit Aminomethylsalicylhydroxamsäure hergestellt werden, mit der Maßgabe, daß R&sub3; nicht für H steht. Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe R&sub1; aus N-Hydroxysuccinimidylester- oder Dithiopyridylresten ausgewählt ist, können als Synthesezwischenprodukte zur Herstellung der Reagenzien der allgemeinen Formel III verwendet werden, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem aus Zwischenproduktamid oder Disulfidresten steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe R&sub1; für einen N-Hydroxysuccinimidylesterrest steht, können mit Verbindungen mit primären aliphatischen Aminresten der allgemeinen Formel R&sub1;-Z&sub2;-NH&sub2; kondensiert werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise etwa 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, um Reagenzien der allgemeinen Formel III zu erhalten, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem der Zwischenproduktamidreste steht.
  • Alternativ dazu können die N-Hydroxysuccinimidylesterreagenzien der allgemeinen Formel III, die vorzugsweise von einer Dicarbonsäure abgeleitet sind, welche ausgewählt ist aus Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Acetylendicarbonsäure und Glutarsäure, mit Verbindungen mit primären aliphatischen Aminresten der allgemeinen Formel HO&sub2;C-Z&sub2;-NH&sub2; kondensiert werden, worin 4 für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, vorzugsweise ausgewählt aus Glycin, β-Alanin, Aminopropiolsäure, 4-Aminobuttersäure und 6-Aminocapronsäure, um Verbindungen mit freien terminalen Carbonsäureresten zu erhalten, die weiter gemäß Fig. 5 funktionalisiert werden können, um Reagenzien der allgemeinen Formel III zu erhalten, worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktamidrest steht. Dieses Verfahren ist in Fig. 7 für die Synthese eines Reagenzes der allgemeinen Formel III zusammengefaßt, worin R&sub1; für einen N-Hydroxysuccinimidylester steht und worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktamidrest steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe R&sub1; für einen Dithiopyridylrest steht, können mit Verbindungen mit terminalen Thiolresten der allgemeinen Formel R&sub1;-Z&sub2;-SH umgesetzt werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, um Reagenzien der allgemeinen Formel III zu erhalten, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem der Zwischenproduktdisulfidresten steht.
  • Alternativ dazu können Dithiopyridylreagenzien der allgemeinen Formel III, die vorzugsweise von einer Mercaptocarbonsäure abgeleitet sind, ausgewählt aus Mercaptoessigsäure, β-Mercaptopropionsäure, Mercaptopropiolsäure, 4-Mercaptobuttersäure und 6-Mercaptocapronsäure, mit Verbindungen mit einem terminalen Thiolrest der allgemeinen Formel HO&sub2;C-Z&sub2;-SH kondensiert werden, worin Z&sub2; für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit einer Länge von vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffäquivalenten steht, vorzugsweise ausgewählt aus Mercaptoessigsäure, β-Mercaptopropionsäure, Mercaptopropiolsäure, 4-Mercaptobuttersäure und 6-Mercaptocapronsäure, um Verbindungen mit freien terminalen Carbonsäureresten zu erhalten, die gemäß Fig. 5 unter Bildung von Reagenzien der allgemeinen Formel III weiter funktionalisiert werden, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktdisulfidrest steht. Das Verfahren ist in Fig. 7 zur Synthese eines Reagenzes der allgemeinen Formel III zusammengefaßt, worin R&sub1; für einen N- Hydroxysuccinimidylester steht, und worin Z für eine unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kette mit mindestens einem Zwischenproduktdisulfidrest steht.
  • Die Reagenzien der allgemeinen Formel III, worin die Gruppe Z für eine Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten steht, werden durch die Kondensation eines Alkyl-4- oder -5-aminomethylsalicylats, das wie in den Fig. 2 und 3 zusammengefaßt hergestellt wird, mit einem Polyethylenglycolreagenz mit sowohl einem N-Hydroxysuccinimidylesterrest als auch entweder einem reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest (oder einem Vorläufer hiervon), von denen viele im Handel erhältlich sind, unter Bildung von Reagenzien der allgemeinen Formel III hergestellt, worin die Gruppe Z für eine Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten steht.
    • Herstellung von Phenylborsäurekomplexierungskonjugaten der allgemeinen Formel IV
  • An dieser Stelle können Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel III mit einer geeigneten biologisch aktiven Spezies unter Bildung des Konjugats der allgemeinen Formel IV umgesetzt werden: Allgemeine Formel IV
  • Alternativ dazu können Konjugate der allgemeinen Formel IV auch auf dem Weg hergestellt werden, der in Fig. 1 beschrieben ist, der ein Reagenz der allgemeinen Formel I verwendet Allgemeine Formel I
  • Putative Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel I können mit einer geeigneten biologisch aktiven Spezies unter Bildung des Konjugats der allgemeinen Formel II umgesetzt werden: Allgemeine Formel II
  • Das Konjugat der allgemeinen Formel II wird als nächstes mit einem Hydroxylaminderivat unter Bildung des entsprechenden Phenylborsäurekomplexierungskonjugats der allgemeinen Formel IV kondensiert: Allgemeine Formel IV
  • Geeignete Hydroxylaminderivate werden vorzugsweise ausgewählt aus NH&sub2;OH, NH&sub2;OCH&sub3;, NH&sub2;OCH&sub2;CN, NH&sub2;OCH&sub2;COOH, NH&sub2;OCH&sub2;CONH&sub2;, NH&sub2;OCH&sub2;CH&sub2;OH und NH&sub2;OCH&sub2;OCH&sub3;. Wenn die Gruppe R&sub2; in der allgemeinen Formel II für eine Alkylgruppe steht, wird vorzugsweise NH&sub2;OH verwendet, um eine Umwandlung der Verbindung der allgemeinen Formel II in die Verbindung der allgemeinen Formel IV auszuführen.
    • Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI
  • Biokonjugate der allgemeinen Formel VI können in gepufferten wäßrigen Lösungen oder organischen Lösemitteln hergestellt werden. Bevorzugte Puffer umfassen Acetat, Citrat, Phosphat, Carbonat und Diglycin. Boratpuffer sollten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Komplexierung mit dem Phenylborsäurekomplexierungsrest vermieden werden. Tris-β-hydroxyamin und β-Hydroxysäurepuffer sollten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Komplexierung mit der Phenylborsäure vermieden werden. Das Biokonjugat bildet sich innerhalb weniger Minuten über einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis 70ºC. Die Stabilität des Biokonjugats in wäßriger Lösung bei einem gegebenen pH und einer gegebenen Temperatur wird in gewissem Maß durch die Substituentengruppe R&sub3; beeinflußt. Biokonjugate der allgemeinen Formel VI sind in wäßrigen Lösungen mit einem pH von mein als 3,5 und weniger als 10,5 stabil. Die Biokonjugatreaktion (Phenylborsäurekomplexierung) ist unempfindlich gegenüber signifikanten Variationen der Ionenstärke über einen Bereich von 0,01 bis 1 M, der Gegenwart von organischen Lösemitteln, einschließlich Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, der Gegenwart von Detergenzien und der Gegenwart von chaotropen Mitteln (Proteindenaturierungsmitteln) einschließlich Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat und Formamid, die mit indirekten Markierungssystemen des Stands der Technik nicht kompatibel sind, worin die Struktur des biologischen Makromoleküls erhalten bleiben muß, um die erforderlichen Bindungseigenschaften zu erhalten. Nach der Bildung sind die Biokonjugate nach der Entfernung von Wasser stabil und können zur Lagerung lyophilisiert werden.
  • Die Stabilität des Biokonjugats bei einem gegebenen pH wird in gewissem Ausmaß durch die Substituentengruppe R&sub3; bestimmt. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für H steht, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 3,5 bis 10,5 stabil. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für CH&sub3; steht, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 4,5 bis 10,5 stabil. Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; einen elektronegativen Rest umfaßt, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von weniger als 3,5 bis 10,5 stabil.
  • Die Stabilität des Phenylborsäurekomplexes gegenüber der säurekatalysierten Hydrolyse hängt mit dem pKa der Hydroxamsäure zusammen, die im Komplex beteiligt ist. Je niedriger der pKa des Hydroxamsäurerests ist, desto stabiler ist der Komplex. Demnach zeigen Phenylborsäurekomplexe der allgemeinen Formel VI, worin die Gruppe R&sub3; für einen elektronegativen Rest steht, eine größere Stabilität gegenüber einer säurekatalysierten Hydrolyse, als die, worin R&sub3; entweder für H oder CH&sub3; steht.
  • Die folgenden Beispiele liefern eine detaillierte Beschreibung der Synthese der Reagenzien der allgemeinen Formel I, III, IV und VI. Beispiel I Herstellung von Ethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid Ethyl-4-methylsalicylat
  • 4-Methylsalicylsäure (20,0 g, 131 mmol) wird in Ethanol (300 ml) gelöst und konzentrierte Schwefelsäure (2,0 ml) wird zugegeben. Das Gemisch wird für 40 Stunden am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsvolumen wird auf 100 ml verringert, es wird in einen Trenntrichter überführt und mit Chloroform (250 ml) und Wasser (200 ml) verdünnt. Es wird festes Natriumbicarbonat in kleinen Portionen zugegeben bis der pH der wäßrigen Phase etwa 8 beträgt (pH Papier). Das Gemisch im Trichter wird geschüttelt und die Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird zuerst mit Wasser (150 ml) und dann gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (150 ml) gewaschen.
  • Schließlich wird die organische Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel unter Bildung von 14,0 g (59% Ausbeute) an flüssigem Ethyl-4-methylsalicylat eingedampft.
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 1,40 (Triplett, J = 7 Hz, 3H, CH&sub2;CH&sub3;), 2,33 (Singulett, 3H, ArCH&sub3;), 4,38 (Quartett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 6,67 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,78 (Singulett, 1H, ArH), 7,72 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,81 (Singulett, 1H, OH), ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 14,0, 21,7, 61,1, 110,1, 117,7, 120,4, 129,7, 146,9, 161,7, 170,3.
    • Ethyl-4-brommethylsalicylsäure
  • Ethyl-4-methylsalicylat (13,1 g, 72,5 mmol) wird in Tetrachlorkohlenstoff (150 ml) gelöst und N- Bromsuccinimid (13,1 g, 73,2 mmol) und Benzoylperoxid (0,2 g, 0,8 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird für 3,5 Stunden am Rückfluß gekocht und kann dann auf Raumtemperatur abkühlen. Die Feststoffe werden durch Filtration entfernt und das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Das feste Rohprodukt wird aus Hexan (100 ml) unter Bildung von 5,0 g (27% Ausbeute) an Ethyl-4-brommethylsalicylsäure kristallisiert (Smp. 64-66ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d), δ 1,41 (Triplett, J = 7 Hz, 3H, CH&sub2;CH&sub3;), 4,40 (Quartett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 4,40 (Singulett, 2H, CH&sub2;Br), 6,90 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,99 (Singulett, 1H, ArH), 7,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,88 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 14,0, 31,9, 61,5, 112,4, 117,9, 119,8, 130,5, 145,5, 161,8, 169,9.
    • Ethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid
  • Ethyl-4-brommethylsalicylat (4,8 g, 18,6 mmol) wird in trockenem N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst und Natriumazid (1,2 g, 18,9 mmol) wird zugegeben. Die Suspension wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Dichlormethan (150 ml) verdünnt und mit 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) verdünnt. Schließlich wird die Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung von Ethyl-4-azidomethylsalicylat als Öl verdampft.
  • Dann wird Palladium auf Kohle (0,5 g, 10% [w/w]) unter Stickstoffatmosphäre in einen 1 l Hydrierungskolben gegeben. Das rohe Ethyl-4-azidomethylsalicylat wird in Ethanol (200 ml) gelöst und in den Hydrierungskolben überführt. Dann wird konzentrierte wäßrige Chlorwasserstoffsäure (2 ml) zugegeben und der Kolben wird auf einen Parr Hydrierapparat angebracht. Das Reaktionsgemisch wird unter 35 psi an Wasserstoff für 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gemisch wird dann zur Entfernung des Katalysators durch Celite filtriert und das Filtrat wird unter Bildung eines schmutzig weißen Feststoffs zur Trockne verdampft. Schließlich wird dieser Feststoff aus EtOH unter Bildung von 3,1 g (71% Ausbeute) an Ethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (Smp: 240- 241ºC) kristallisiert.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,30 (Triplett, J = 7 Hz, 3H, CH&sub2;CH&sub3;), 3,99 (Singulett, 2H, CH&sub2;NH&sub3;), 4,33 (Quartett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 7,06 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH). 7,15 (Singulett, 1H, ArH), 7,77 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,71 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;), 10,62 (breites Singulett, 1H. OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 14,0, 38,7, 41,6, 61,5, 112,9, 117,7, 119,8, 130,3, 142,2, 160,2, 168,9. Beispiel II Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Ethyl-N-Iodacetyl-4-aminomethylsalicylat
    • Ethyl-N-chloracetyl-4-aminomethylsalicylat
  • Ethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (0,50 g, 2,17 mmol) wird in trockenem N,N-Dimethylformamid (25 ml) suspendiert und N,N-Diisopropylethylamin (0,38 ml, 2,18 mmol) wird zugegeben. Das Aminsalz Iöst sich sofort und Chloressigsäureanhydrid (0,39 g, 2,25 mmol) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch wird für 4, 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt und diese Lösung wird mit 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (50 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) extrahiert. Die Ethylacetatlösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung eines weißen Feststoffs zur Trockne eingedampft. Schließlich wird der Feststoff aus Ethylacetat : Hexan (8 : 2, 10 ml) unter Bildung von 0,13 g (22% Ausbeute) an Ethyl-N-chloracetyl-4-aminomethylsalicylat (Smp. 120-121ºC) kristallisiert.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,31 (Triplett, J = 7 Hz, 3H, CH&sub2;CH&sub3;), 4,14 (Singulett, 2H, ClCH&sub2;), 4,29 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 4,34 (Quartett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 6,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,84 (Singulett, 1H, ArH), 7,73 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,78 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,58 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6; δ 13,9, 42,1, 42,6, 61,3, 111,6, 115,6, 118,4, 130,1, 147,6, 160,6, 166,5, 169,1.
    • Ethyl-N-Iodacetyl-4-aminomethylsalicylat
  • Ethyl-N-chloracetyl-4-aminomethylsalicylat (0,11 g, 0,40 mmol) wird in Aceton (5 ml) gelöst und Natriumiodid (0,06 g, 0,40 mmol) wird zugegeben. Die Lösung wird für 2,5 Stunden am Rückfluß erhitzt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird unter Bildung eines weißen Feststoffs aus Ethyl-N-iodacetyl-4- aminomethylsalicylat (0,19 g, 100% Ausbeute) (Smp. 105-108ºC) zur Trockne eingedampft.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,31 (Triplett, J = 7 Hz, 3H, CH&sub2;CH&sub3;), 3,68 (Singulett, 2H, ICH&sub2;), 4,26 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 4,33 (Quartett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 6,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,84 (Singulett, 1H, ArH), 7,72 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,79 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,58 (Singulett, 1H, OH), ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 0,41, 13,9, 42,0, 61,3, 111,4, 115,5, 118,3, 130,1, 147,9, 160,6, 168,3, 169,1. Beispiel III Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Ethyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylattrifluoracetat
    • Ethyl-(N-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylat
  • Ethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (0,52 g, 1,28 mmol) wird in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (25 ml) gelöst und N,N-Diisopropylethylamin (0,79 ml, 4,53 mmol) wird gefolgt von N-tert-Butoxycarbonyl- 6-aminohexansäuresuccinimidylester (0,74 g, 2,26 mmol) zugegeben. Das Gemisch wird unter Stickstoff für 18 Stunden gerührt, wobei sich alle Feststoffe lösen. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt und mit 1 N wäßriger Chlorwasserstoffsäure (100 ml) extrahiert. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird mit Wasser (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (500 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung eines amorphen, nicht ganz weißen Feststoffs eingedampft. Schließlich wird der Feststoff aus Ethylacetat kristallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 0,67 g (73% Ausbeute) an Ethyl(N-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylat getrocknet (Smp 120-121ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,19 (Multiplett, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO), 1,34 (Multiplett, 5H, CH&sub2;CH&sub2;CO und CH&sub2;CH&sub3;), 1,34 (Singulett, 9H, C(CH&sub3;)&sub3;), 1,49 (Multiplett, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;), 2,12 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,87 (Quartett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;), 4,23 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 4,32 (Quartett, J = 7 Hz, CH&sub2;CH&sub3;), 6,74 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;CH&sub2;), 6,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,81 Sigulett, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,34 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;Ar), 10,58 (Singulett, 1H, OH), ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 14,0, 25,1, 26,3, 28,3, 29,7, 36,3, 40,2, 42,9, 61,4, 79,0, 111,6, 116,0, 118,3, 130,4, 146,9, 156,2, 161,9, 170,1, 173,0.
    • Ethyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylattrifluoracetat
  • Ethyl-(N-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylat (0,58 g, 1,41 mmol) wird in Dichlormethan (5 ml) gelöst und die Lösung wird in einem Eiswasserbad gekühlt. Es wird Trifluroessigsäure (5 ml) zugegeben und die Reaktion kann sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 2 Stunden wird das Reaktionsgemsch unter Bildung des Produkts als Öl eingedampft, das dann im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Bildung von 0,59 g (99% Ausbeute) an Ethyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylattrifluoracetat getrocknet wird.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,28 (Multiplett, 5H, H&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO und CH&sub2;CH&sub3;), 1,53 (Multiplett, 4H, NH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,15 (Triplett, J = 8 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,71 (Multiplett, 2H, NH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;), 4,21 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 4,30 (Quartett, J = 8 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub3;), 6,79 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,81 (Singulett, 1H, ArH), 7,68 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,18 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;), 8,60 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;Ar), 10,58 (breites Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;), δ 14,0, 24,8, 25,6, 26,7, 35,1, 38,6, 41,7, 61,3, 111,5, 115,5, 118,3, 130,1, 148,6, 160,6, 169,2, 172,6. Beispiel IV Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Methyl-4-succinylaminomethylsalicylatsuccinimidylester
    • Methyl-4-methylsalicylat
  • 4-Methylsalicylsäure (100 g, 658 mmol) wird in wasserfreiem Methanol (500 ml) gelöst und es wird vorsichtig konzentrierte Schwefelsäure (25 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 18 Stunden am Rückfluß gekocht und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wird auf etwa 150 ml konzentriert und Ethylacetat (250 ml) wird zugegeben. Die Ethylacetatlösung wird zweimal mit gesättigtem Natriumbicarbonat (250 ml Portionen) und dann mit gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einer klaren, rotbraunen Flüssigkeit eingedampft. Dieses Rohprodukt wird unter Bildung einer klaren viskosen Flüssigkeit vakuumdestilliert (Ölpumpe), die sich beim Stehen unter Bildung von 98,1 g (90% Ausbeute) an Methyl-4-methylsalicylat verfestigt.
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 2,32 (Singulett, 3H, ArCH&sub3;), 3,91 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 6,67 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,78 (Singulett, 1H, ArH), 7,69 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,71 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 21,8, 52,1, 110,0, 117,9, 120,6, 129,9, 147,3, 161,9, 170,9.
    • Methyl-4-brommethylsalicylat
  • Methyl-4-methylsalicylat (98,1 g, 590 mmol) wird in Tetrachlorkohlenstoff (600 ml) gelöst und N- Bromsuccinimid (105,0 g, 590 mmol) und Benzoylperoxid (0,7 g, 3 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird unter Stickstoff eingedampft. Nach 2 Stunden wird eine zusätzliche Portion (0,7 g) N-Bromsuccinimid zugegeben. Der Rückfluß wird für 16 Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und der Feststoff wird durch Filtration entfernt. Das gelbe Filtrat wird dann unter Bildung eines dicken gelben Sirups eingedampft, der sich beim Stehen verfestigt. Hexan (500 ml) wird zum Feststoff gegeben und das Gemisch wird gekocht bis sich fast alle Feststoffe aufgelöst haben. Die heiße Hexanlösung wird filtriert und konzentriert bis sich ein Niederschlag zu bilden beginnt. Das Gemisch wird erhitzt, um den Feststoff aufzulösen und die Lösung kann sich langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Es bilden sich langsam blaßgelbe Kristalle. Das Gemisch wird dann für 2 Stunden auf Eis gekühlt, um die Kristallisation zu vervollständigen. Schließlich wird der Feststoff filtriert, mit kaltem Hexan (100 ml) gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 83,5 g (58% Ausbeute) an Methyl-4- brommethylsalicylat getrocknet (Smp. 73-75ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 3,95 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,40 (Singulett, 2H, CH&sub2;), 6,90 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,00 (Singulett, 1H, ArH), 7,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,78 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 32,1, 52,5, 112,4, 118,2, 120,1, 130,7, 145,8, 162,0, 170,5.
    • Methyl-4-azidomethylsalicylat
  • Methyl-4-brommethylsalicylat (83,5 g, 341 mmol) wird in trockenem N,N-Dimethylformamid (150 ml) gelöst und Natriumazid (25,0 g, 380 mmol) wird zugegeben. Die gelbe Suspension wird bei Raumtemperatur gerührt und die Feststoffe lösen sich schnell auf. Die Lösung wird braun und es bildet sich ein Niederschlag aus Natriumbromid. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Stunden gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird zu einem braunen Öl eingedampft, das in einem Gemisch aus Hexan und Ethylacetat (1 : 1 [V/V], 100 ml) gelöst wird. Silicagel (25 g, Blitzchromatographiequalität) wird zur braunen Lösung gegeben und das Gemisch wird gut aufgerührt. Das Kieselgel wird durch Filtration durch eine Glasfritte entfernt und dreimal mit Hexan: Ethylacetat (1 : 1 [V/V], 50 ml Portionen) gewaschen. Das Silicagel wird auf der Fritte getrocknet und die vereinigten Filtrate werden unter Bildung einer dunkelgelben Flüssigkeit zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt (das für die folgende Reaktion verwendet wird) enthält etwas N,N-Dimethylformamid.
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 3,94 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,32 (Singulett, 2H, CH&sub2;), 6,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,93 (Singulett, 1H, ArH), 7,83 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,80 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 52,5, 54,3, 112,3, 117,0, 118,7, 130,8, 143,9, 162,1, 170,5.
    • Methyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid
  • Rohes Methyl-4-azidomethylsalicylat wird in Methanol (750 ml) in einem 2 l fassenden Parr- Hydrierkolben gelöst. Palladium auf Kohle Katalysator (10% [G/G], 3,8 g) in Wasser (25 ml) wird gefolgt von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (35 ml) zugegeben. Der Kolben wird an ein Parr-Hydriergerät angeschlossen und das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter 40 psi Wasserstoff für 16 Stunden geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wird dann durch ein 0,45 nun Nylonfilter filtriert. Der zurückgehaltene Feststoff wird dann mit Methanol (150 ml), Wasser (100 ml) und erneut Methanol (150 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter Bildung eines hellbraunen Feststoffs zur Trockne eingedampft. Der Feststoff wird dann in heißem, vergälltem Ethanol (150 ml) gelöst und die Lösung kann sich auf Raumtemperatur abkühlen. Es bilden sich schnell weiße Kristalle. Schließlich wird das Gemisch dann für 16-18 Stunden auf 4ºC gekühlt, um die Kristallisation zu vervollständigen. Der Feststoff wird filtriert, mit etwas kaltem Ethanol (50 ml) und dann Diethylether (150 ml) gewaschen und im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Bildung von 51,5 g (65% Ausbeute auf der Grundlage von Methyl-4- brommethylsalicylat) an Methyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid getrocknet (Smp. 225-227ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 3,87 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,00 (Singulett, 2H, CH&sub2;), 7,06 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,13 (Singulett, 1H, ArH), 7,77 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,59 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;Cl), 10,55 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 41,6, 52,6, 113,0, 117,7, 119,8, 130,4, 142,1, 160,0, 169,1.
    • Methyl-4-succinylaminomethylsalicylat
  • Methyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (3,00 g, 13,8 mmol) wird in trockenem Pyridin (25 ml) suspendiert und N,N-Diisopropylethylamin (2,7 ml, 15,5 mmol) wird zugegeben. Die Suspension wird für 15 Minuten in einem Eiswasserbad gerührt und dann wird Bernsteinsäureanhydrid (1,36 g, 13,6 mmol) zugegeben. Das Gemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen, wobei sich die Ausgangsfeststoffe auflösen. Nach dem Rühren für 2 Stunden wird das Gemisch zur Trockne eingedampft und der entstehende Feststoff wird zwischen Ethylacetat (300 ml) und 1 M wäßriger Chlorwasserstoffsäure (100 ml) aufgeteilt. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird mit 1 M Chlorwasserstoffsäure (100 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung eines weißen Feststoffs zur Trockne eingedampft. Schließlich wird der Feststoff aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 3,02 g (87% Ausbeute) an Methyl-4-succinylaminosalicylat getrocknet (Smp. 161-163ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 2,43 (Triplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;CONH), 2,49 (Triplett, J = 6 Hz, 2H, HO&sub2;CCH&sub2;), 3,87 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,27 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,83 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,86 (Singulett, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,43 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,54 (Singulett, 1H, OH), 12, 12 (Singulett, 1H, CO&sub2;H). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 29,1, 30,1, 41,9, 52,5, 111,3, 115,6, 118,4, 130,1, 148,7, 160,7, 169,7, 171,7, 174,2.
    • Methyl-4-succinylaminomethylsalicylatsuccinimidylester
  • Methyl-4-succinylaminomethylsalicylat (2,60 g, 10,2 rnmol) wird in trockenem Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und N-Hydroxysuccinimid (1,29 g, 11,2 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (2,10 g, 10,2 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter trockenem Stickstoff gerülurt und die Feststoffe lösen sich schnell auf. Nach etwa 20 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wird für 16-18 Stunden gerührt und dann für mehrere Stunden bei -20ºC gekühlt. Das Gemisch wird kalt filtriert und der Feststoff wird mit etwas Tetrahydrofuran (25 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird aus Ethylacetat (Hexan kristallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 2,39 g (62 % Ausbeute) an Methyl-4-succinylaminomethylsalicylatsuccinimidylester getrocknet (Smp. 133-135ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 2,56 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONH), 2,80 (Singulett, 4H, COCH&sub2;CH&sub2;CO), 2,91 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, NO&sub2;CCH&sub2;), 3,87 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,27 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,83 (Duplett, J = 9 Hz, 1H, ArH), 6,84 (Singulett, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 9 Hz, 1H, ArH), 8,51 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,50 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 25,4, 25,9, 29,2, 41,8, 52,4, 111,4, 115,6, 118,4, 130,2, 148,2, 160,4, 168,9, 169,4, 170,2, 170,4. Beispiel V Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Methyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylathydrochlorid
    • Methyl-(N-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylat
  • Methyl-4-aminosalicylathydrochlorid (2,25 g, 10,3 mmol) wird in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (30 ml) suspendiert und N,N-Diisopropylethylamin (3,6 ml, 20,7 mmol) wird gefolgt von N-tert-Butoxycarbonyl-6- aminohexansäuresuccinimidylester (3,38 g, 10,3 mmol) zugegeben. Das Gemisch wird für 18 Stunden unter trockenem Stickstoff gerührt, wobei sich alle Feststoffe auflösen. Das Lösemittel wird dann verdampft und läßt einen hellbraunen Sirup zurück, der zwischen Ethylacetat (100 ml) und wäßriger 1 M Chlorwasserstoffsäure (100 ml) aufgeteilt wird. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat (100 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem amorphen, nicht ganz weißen Feststoff getrocknet. Der Feststoff wird aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 3,25 g (80% Ausbeute) an Methyl-(n-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)-aminomethylsalicylat getrocknet (Smp. 120-121ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,22 (Multiplett, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO), 1,36 (Multiplett, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 1,36 (Singulett, 9H, C(CH&sub3;)&sub3;), 1,51 (Multiplett, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;), 2,13 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,87 (Quartett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;CH&sub2;), 3,87 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,24 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 6,75 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;CH&sub2;), 6,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,82 (Singulett, 1H, ArH), 7,72 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,35 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;Ar), 10,53 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) 825,0, 26,0, 28,2, 29,3, 35,3, 41,7, 52,4, 77,4, 111,2, 115,5, 118,3, 130,1, 148,7, 155,8, 160,5, 169,5, 172,6.
    • Methyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylathydrochlorid
  • Methyl-(N-tert-butoxycarbonyl-6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylat (3,00 g, 7,60 mmol) wird in Ethylacetat (100 ml) gelöst und trockener Chlorwasserstoff wird langsam durch die Lösung geblasen. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich, wenn sich das Gas löst. Nach 5 Minuten wird das Gas abgeschalten und die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Es bildet sich ein weißer Niederschlag in der Lösung. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch für 2 Stunden auf Eis gekühlt und dann wird der Feststoff filtriert, mit Diethylether (50 ml) gewaschen und im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Bildung von 2,50 g (99% Ausbeute) an Methyl-(6-aminohexanoyl)aminomethylsalicylathydrochlorid getrocknet (zersetzt sich unter Gasentwicklung bei 158-160ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,28 (Multiplett, 2H, H&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO), 1,54 (Multiplett, 4H, NH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,16 (Triplett, J = 8 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 2,71 (Multiplett, 2H, NH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;), 3,85 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,22 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 6,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,83 (Singulett, 1H, ArH), 7,70 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,10 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;), 8,54 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, CONHCH&sub2;Ar), 10,35 (breites Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 24,8, 25,6, 26,7, 35,1, 41,7, 111,5, 115,6, 118,4, 130,2, 148,6, 160,4, 169,4. Beispiel VI Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylatsuccinimidylester
    • Methyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat
  • Methyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (10,9 g, 50 mmol) wird in wasserfreiem Methanol (200 ml) suspendiert und Di-tert-Butyldicarbonat (10,9 g, 50 mmol) und Triethylamin (7,0 ml, 50 mmol) werden zugegeben. Der Feststoff löst sich schnell unter einer langsamen Gasentwicklung auf. Das Reaktionsgemisch wird für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter trockenem Stickstoff gerührt und dann unter Bildung einer weißen, amorphen Masse eingedampft. Diese Masse wird zwischen Ethylacetat (200 ml) und Wasser (100 ml) aufgeteilt. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird filtriert und zu einem weißen Feststoff eingedampft. Dieser Feststoff wird aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 13,7 g (97% Ausbeute) an Methyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat getrocknet (Smp. 95-96ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 1,42 (Singulett, 9H, C(CH&sub3;)&sub3;), 3,90 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,26 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 4,99 (Triplett, J = 6 H, 1H, NH), 6,75 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,84 (Singulett, 1H, ArH), 7,73 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, AsH), 10,72 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 28,5, 44,4, 52,4, 80,0, 111,5, 115,9, 118,2, 130,5, 150,0, 156,3, 162,1, 170,8.
    • N-tert-Butoxycarbonylaminomethylsalicylsäure
  • Methyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat (8,7 g, 30,9 mmol) wird in trockenem Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und Kaliumtrimethylsilanolat (4,4 g, 30,9 mmol, 90% rein) wird zugegeben. Die gelbe Lösung wird für 24 Stunden am Rückfluß gekocht, wobei sich mit der Zeit ein hellbrauner Niederschlag bildet und das Lösemittel hellbraun wird. Das Gemisch wird zur Trockne eingedampft und der Feststoff wird in kaltem Wasser (100 ml) gelöst. Die braune Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und es wird gesättigte, wäßrige Kaliumhydrogensulfatlösung verwendet, um die gerührte Lösung auf pH 2-3 zu titrieren. Es bildet sich während der Titration ein nicht ganz weißer Feststoff. Der Feststoff wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Natriumhydroxid unter Bildung von 6,7 g (81% Ausbeute) an roher N-tert-Butoxycarbonylaminomethylsalicylsäure getrocknet (Smp. 141-144ºC, zersetzt sich unter Gasentwicklung beim Schmelzen, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 1,47 (Singulett, 9H, C(CH&sub3;)&sub3;), 4,33 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 5,07 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 6,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,88 (Singulett, 1H, ArH), 7,81 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,72 (breites Singulett, 2H, OH und CO&sub2;H). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 28,5, 44,4, 80,5, 111,1, 115,9, 118,3, 131,5, 148,5, 156,6, 162,6, 174,1.
    • Cyanomethyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat
  • N-tert-Butoxycarbonylaminomethylsalicylsäure (8,2 g, 30,6 mmol) wird in Chloracetonitril (25 ml) suspendiert und Triethylamin (4,3 ml, 30,6 mmol) wird zugegeben. Das Gemisch wird unter trockenem Stickstoff bei 50ºC gerührt und die Feststoffe lösen sich auf. Die Lösung wird für 18 Stunden gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösemittel wird verdampft und die Rückstand wird zwischen Ethylacetat (250 ml) und Wasser (250 ml) aufgeteilt. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatphase wird mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat (100 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der verbleibende hellbraune Feststoff wird in Ethylacetat (100 ml) gelöst und Silicagel (10 g, Blitzchromatographiequalität) wird zugegeben. Das Gemisch wird gut gerührt und kann sich für 5 Minuten bei Raumtemperatur absetzen. Das Silicagel wird durch Filtration auf einer Glasfritte entfernt und mit Ethylacetat (100 ml) gewaschen. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird unter Bildung von 7,9 g (88% Ausbeute) an Cyanomethyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert (Smp. 144-146ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 1,45 (Singulett, 9H, C(CH&sub3;)&sub3;), 4,30 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, CH&sub2;Ar), 5,00 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 5,05 (Triplett, J = 6 H, 1H, NH), 6,83 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,91 (Singulett, 1H, ArH), 7,77 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 10,12 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, CHCl&sub3;-d) δ 28,4, 44,3, 49,0, 80,1, 109,6, 114,2, 116,1, 118,7, 130,5, 149,7, 156,2, 162,5, 168,5.
    • Cyanomethylaminomethylsalicylathydrochlorid
  • Cyanomethyl-N-tert-butoxycarbonylaminomethylsalicylat (7,7 g, 26,2 mmol) wird in Tetrahydrofuran (150 ml) gelöst und trockener Chlorwasserstoff wird langsam durch die Lösung geblasen. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich, wenn sich das Gas löst. Nach 5 Minuten wird das Gas abgeschalten und die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Es bildet sich in der Lösung ein dicker, cremiger, weißer Niederschlag. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch für 2 Stunden auf Eis gekühlt, dann wird der Feststoff mit Diethylether (100 ml) gewaschen und im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Bildung von 5,8 g (91% Ausbeute) an Cyanomethylaminomethylsalicylathydrochlorid getrocknet (Smp. wird dunkel bei 210ºC, zersetzt sich bei 228ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 4,00 (Singulett, 2H, CH&sub2;Ar), 5,20 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 7,05 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,15 (Singulett, 1H, ArH), 7,75 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,62 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;), 10,38 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 41,6, 49,7, 113,0, 116,1, 118,0, 119,7, 131,1, 142,3, 159,5, 166,1.
    • Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylat
  • Cyanomethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (1,22 g, 5,0 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (100 ml) suspendiert und die Suspension wird in einen Eiswasserbad gerührt. Eine Lösung aus Glutarsäureanhydrid (0,57 g, 5,0 mmol) und Triethylamin (0,7 ml, 50 mmol) in trockenem Dichlormethan (25 ml) wird dann tropfenweise über 15 Minuten zugegeben. Das Gemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen und die Reaktion wird für 18 Stunden gerührt. Das Gemisch wird zur Trockne eingedampft und der entstehende Feststoff wird mit kalter, wäßriger 0,1 M Chlorwasserstoffsäure (50 ml) behandelt. Der Feststoff wird durch Filtration gewonnen, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Natriumhydroxidpellets unter Bildung von 1,43 g (89% Ausbeute) an Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylat getrocknet (Smp. 125-126ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,75 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,19 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONH), 2,22 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, HO&sub2;CCH&sub2;), 4,24 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 5,17 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 6,81 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,85 (Singulett, 1H, ArH), 7,70 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,39 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,5 (sehr breites Singulett, 1H, OH), 11,7 (sehr breites Singulett, 1H, CO&sub2;H). ¹³C NMR (75 MHZ, DMSO-d&sub6;) δ 20,7, 33,1, 34,5, 41,8, 49,7, 111,2, 115,9, 116,2, 118,5, 130,9, 149,1, 160,2, 166,6, 172,3, 174,5.
    • Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylatsuccinimidylester
  • Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylat (1,00 g, 3,1 mmol) wird in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und N-Hydroxysuccinimid (0,36 g, 3,1 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (0,64 g, 3,1 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter trockenem Stickstoff gerührt und die Feststoffe lösen sich schnell auf. Nach etwa 60 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wird für 24 Stunden gerührt und dann für mehrere Stunden auf -20ºC gekühlt. Das Reaktionsgemisch wird kalt filtriert und der Feststoff wird mit etwas Tetrahydrofuran (10 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Filtrate werden zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird aus Ethylacetat/Hexan kistallisiert, filtriert und im Vakuum unter Bildung von 1,04 g (80% Ausbeute) an Cyanomethyl-4-glutarylaminomethylsalicylatsuccinimidylester getrocknet (Smp. 116-119ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,88 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,30 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONH), 2,71 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, NO&sub2;CCH&sub2;), 2,80 (Singulett, 4H, COCH&sub2;CH&sub2;CO), 4,26 (Duplett J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 5,18 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 6,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,86 (Singulett, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,44 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,18 (breites Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 20,4, 25,5, 29,7, 33,6, 41,8, 49,6, 111,2, 115,9, 116,2, 118,4, 130,9, 148,9, 160,1, 166,5, 169,0, 170,5, 171,7. Beispiel VII Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Cyanomethyl-4-(6-maleimidohexanoyl)aminomethylsalicylat
    • Cyanomethyl-4-(6-maleimidohexanoyl)aminomethylsalicylat
  • Cyanomethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (79 mg, 0,32 mmol) und 6-Maleimidocapronsäure-N- hydroxysuccinimidester (100 mg, 0,32 mmol) werden in trockenem N,N-Dimethylformamid (5,0 ml) suspendiert und die Suspension wird bei Raumtemperatur gerührt. N,N-Diisopropylethylamin (87 ul, 0,50 mmol) wird zugegeben. Die Feststoffe lösen sich schnell unter Bildung einer klaren, blaßgelben Lösung auf. Nach 30 Minuten wird das Gemisch zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird zwischen Ethylacetat (25 ml) und kalter wäßriger 0,1 M Chlorwasserstoffsäure (25 ml) aufgeteilt. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat (25 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (25 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem weißen Feststoff eingedampft. Der Feststoff wird aus Ethylacetat/Hexan unter Bildung von 108 mg (84% Ausbeute) an Cyanomethyl-4- (6-maleimidohexanoyl)aminomethylsalicylat kristallisiert (Smp. 141-144ºC).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,20 (Multiplett, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 1,53 (Multiplett, 4H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,13 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, NCH&sub2;CH&sub2;), 3,38 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 4,26 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 5,02 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 6,68 (Singulett, 2H, CH=CH), 6,76 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,80 (Singulett, 1H, ArH), 7,69 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,99 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,04 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;), δ 24,5, 25,7, 27,6, 35,2, 36,9, 41,9, 48,8, 109,1, 114,3, 115,6, 118,2, 129,8, 133,8, 149,2, 161,2, 167,6, 170,4, 172,7. Beispiel VIII Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel I Cyanomethyl-4-(3-(2-pyridyldithio)propionyl)aminomethylsalicylat
    • Cyanomethyl-4-(3-(2-pyridyldithio)propionyl)aminomethylsalicylat
  • Cyanomethyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (79 mg, 0,32 mmol) und 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (100 ing, 0,32 mmol) werden in trockenem N,N-Dimethylformamid (5,0 ml) suspendiert und die Suspension wird bei Raumtemperatur gerührt. N,N-Diisopropylethylamin (87 ul, 0,50 mmol) wird zugegeben. Die Feststoffe lösen sich schnell unter Bildung einer klaren, hellbraunen Lösung auf. Nach 30 Minuten wird das Gemisch zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird zwischen Ethylacetat (25 ml) und kalter wäßriger 0,1 M Chlorwasserstoffsäure (25 ml) aufgeteilt. Die Phasen werden getrennt und die Ethylacetatlösung wird mit gesättigtem, wäßrigem Natriumbicarbonat (25 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (25 ml) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem klaren Öl eingedampft. Die Behandlung mit kaltem Hexan ergibt 64 mg (48% Ausbeute) eines Gummis aus Cyanomethyl-4-(3-(2- pyridyldithio)propionyl)aminomethylsalicylat.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 2,60 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, SCH&sub2;CH&sub2;), 3,05 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CO), 4,27 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 5,19 (Singulett, 2H, OCH&sub2;CN), 6,84 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,88 (Singulett, 1H, ArH), 7,23 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,74-7,82 (Multiplett, 2H, ArH), 8,44 (Duplett, J = 6 Hz, 1H, ArH), 8,56 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,13 (breites Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 34,0, 34,5, 41,8, 49,6, 54,9, 111,2, 115,9, 116,0, 118,4, 119,3, 121,3, 130,8, 137,9, 148,6, 149,7, 159,4, 160,0, 166,4, 170,3. Beispiel IX Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel III 4-Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäurehydrazid
    • Methyl-4-glutarylaminomethylsalicylat-N-tert-butyloxycarbonylhydrazid
  • Methyl-4-glutarylaminomethylsalicylatsuccinimidylester (2,57 g, 6,8 mmol) [hergestellt wie das obige Succinylderivat, wobei das Bernsteinsäureanhydrid durch Glutarsäureanhydrid ausgetauscht wird] wird in trockenem Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und tert-Butylcarbazat (0,90 g, 6,8 mmol) wird zugegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 60 Stunden gerührt. Die Lösung wird dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird in Ethylacetat (100 ml) gelöst. Die Ethylacetatlösung wird mit gesättigtem wäßrigem Kaliumbicarbonat (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen. Sie wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocket, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird durch Auflösen in Ethylacetat (50 ml) unter leichtem Erwärmen, der Zugabe von Hexan (50 ml) zur warmen Lösung und dem Kühlen auf -20ºC gelöst. Wenn die Kristallisation beginnt, wird eine weitere Portion Hexan (50 ml) zugegeben und das Gemisch wird für 18 Stunden bei -20ºC gekühlt. Schließlich wird der Feststoff filtriert, mit Hexan : Ethylacetat (2 : 1 [V/V], 90 ml) gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 2,51 g (90% Ausbeute) an Methyl-4-glutarylaniinomethylsalicylat-N-tert- butyloxycarbonylhydrazid getrocknet (Smp. 68-72ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,37 (Singulett, 9H, (CH&sub3;)&sub3;C), 1,74 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,07 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONHCH&sub2;), 2,17 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, HNHNOCCH&sub2;), 3,86 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,23 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,80 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,82 (Singulett, 1H, ArH), 7,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,37 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 8,65 (Singulett, 1H, NHNHCOCH&sub2;), 9,48 (Singulett, 1H, OCONHNH), 10,50 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 21,2, 28,0, 32,6, 34,6, 41,7, 52,4, 79,1, 111,4, 115,5, 118,3, 130,2, 148,5, 155,5, 160,4, 169,4, 171,7, 172,1.
    • 4-Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäure-N-tert-butyloxycarbonylhydrazid
  • Methyl-4-glutarylaminomethylsalicylat-N-tert-butyloxycarbonylhydrazid (2,00 g, 4,9 mmol) wird zu einer gekühlten Lösung (Eiswasserbad) aus Hydroxylaminsulfat (0,82 g, 5,0 mmol), Natriumhydroxid (1,00 g, 25,0 mmol) und Natriumsulfit (0,20 g, mmol) in Wasser (25 ml) gegeben. Die Suspension wird für 18 Stunden im Dunkeln gerührt und kann sich auf Raumtemperatur erwärmen. Die Lösung wird dann filtriert, um etwas unlösliches Material zu entfernen und die blaßgelbe Lösung wird in einem Eiswasserbad gekühlt. Das kalte Reaktionsgemisch wird langsam auf pH 3-4 mit kalter Schwefelsäure (25% [V/V] wäßrig) behandelt, wobei ein gummiartiges Material ausfällt. Das Gemisch wird dann mehrmals in Eis gekühlt und die Flüssigkeit wird dekantiert. Der verbleibende amorphe Feststoff wird in Methanol (25 ml) gelöst, filtriert und zu einem weißen Schaum eingedampft. Der Schaum wird im Vakuum zu 1,86 g (94% Ausbeute) an rohem 4-Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäure-N-tert- butyloxycarbonylhydrazid getrocknet.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,37 (Singulett, 9H, (CH&sub3;)&sub3;C, 1,74 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,10 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONHCH&sub2;), 2,16 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, HNHNOCCH&sub2;), 4,20 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,71 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,74 (Singulett, 1H, ArH), 7,60 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,32 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 8,65 (Singulett, 1H, NHNHCOCH&sub2;), 9,29 (breites Singulett, 1H, NHOH, 9,48 (Singulett, 1H, OCONHNH), 11,37 (breites Singulett, 1H, ArOH), 12,32 (breites Singulett, 1H, NHOH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 21,2, 28,0, 32,6, 34,6, 41,7, 79,1, 112,4, 115,6, 117,6, 127,1, 145,9, 155,6, 159,8, 166,5, 171,7, 172,1.
    • 4-Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäurehydrazidhydrochlorid
  • 4-Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäure-N-tert-butyloxycarbonylhydrazid (1,86 g, 4,6 mmol) wird in trockenem Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und trockenem Chlorwasserstoff wird langsam durch die Lösung geblasen. Das Reaktionsgemisch erwärmt sich, wenn sich das Gas löst. Nach 5 Minuten wird das Gas abgeschalten und die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. Es bildet sich ein weißer Niederschlag in der Lösung. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch für 2 Stunden auf Eis gekühlt und dann wird der Feststoff filtriert, mit Diethylether (50 ml) gewaschen und im Vakuum über Kaliumhydroxidpellets unter Bildung von 1,51 g (95% Ausbeute) an 4- Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäurehydrazidhydrochlorid getrocknet (Smp. schrumpft bei 65ºC, zersetzt sich unter Gasentwicklung bei 100ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,72 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,17 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONHCH&sub2;), 2,23 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, H&sub3;NHNOCCH&sub2;), 4,17 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,69 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,74 (Singulett, 1H, ArH), 7,66 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 8,49 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 10,49 (breites Singulett, 4H, NH&sub3;NHCOCH&sub2;), 11,08 (breites Singulett, 1H, ArOH), 11,43 (breites Singulett, 2H, NHOH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 21,0, 25,2, 32,3, 34,4, 41,8, 67,2, 112,6, 115,7, 117,7, 127,4, 145,9, 159,8, 166,5, 171,7, 172,1. Beispiel X Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel III 4-Glutarylaminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäuresuccinimidylester
    • Methyl-N-(benzyloxycarbonyl)-4-aminomethylsalicylat
  • Methyl-4-aminomethylsalicylathydrochlorid (5,04 g, 23,2 mmol) wird in Chloroform (80 ml) suspendiert und N,N-Diisopropylethylamin (4,10 ml, 23,5 mmol) und N-(Benzyloxycarbonyloxy)succinimid (6,48 g, 26,0 mmol) werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt, wobei sich alle Feststoffe auflösen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit wäßriger 1 N Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (75 ml) und gesättigtem., wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) extrahiert. Die Chloroformlösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Bildung eines weißen Feststoffs zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird aus Ethylacetat : Hexan unter Bildung von 6,17 g (84% Ausbeute) an Methyl-N-(benzyloxycarbonyl)4- aminomethylsalicylat kristallisiert (Smp. 91-92ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 3,86 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,21 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 5,05 (Singulett, 2H, CH&sub2;O), 6,82 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,86 (Singulett, 1H, ArH), 7,27-7,36 (Multiplett, 5H, ArH), 7,72 (Duplett, 1 = 8 Hz, 1H, ArH), 7,90 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 1053 (Singulett, 1H, OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 43,5, 52,4, 65,6, 111,5, 115,4, 118,2, 127,9, 128,0, 128,5, 130,2, 137,3, 148,6, 156,7, 160,5, 169,5.
    • Methyl-N-(benzyloxycarbonyl)-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicylat
  • Methyl-N-(benzyloxycarbonyl)-4-aminomethylsalicylat (6,06 g, 19,2 mmol) wird in Aceton (150 ml) gelöst und Benzylbromid (2,60 ml, 21,9 mmol) und wasserfreies Kaliumcarbonat (13,28 g, 96,1 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird gerührt und für 22 Stunden am Rückflull erhitzt. Das Gemisch wird konzentriert, um das meiste Aceton zu entfernen und es wird Ethylacetat (100 ml) zugegeben. Wäßrige Chlorwasserstoffsäure (1 N, 200 ml) wird langsam zugegeben, wobei oft umgerührt wird, uni das feste Carbonat zu lösen. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert. Die Ethylacetatlösungen werden vereinigt und mit Wasser (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumssulfat getrocknet, filtriert und auf etwa 50 ml konzentriert. Die Lösung wird bis zum Sieden erhitzt und Hexan (150 ml) wird zugegeben. Die Lösung wird in Eis gekühlt und es bilden sich langsam Kristalle. Die Kristalle werden durch Filtration gewonnen, mit Hexan gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 6,97 g (89% Ausbeute) an Methyl-N-benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicylat getrocknet (Smp. 106-107ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 3,78 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,27 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 5,07 (Singulett, 2H, CH&sub2;OCO), 5,15 (Singulett, 2H, CH&sub2;O), 6,94 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,16 (Singulett, 1H, ArH), 7,26- 7,42 (Multiplett, 8H, ArH), 7,49-7,51 (Multiplett, 2H, ArH), 7,68 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,90 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 43,8, 51,8, 65,6, 69,7, 112,5, 112,6, 118,9, 119,0, 127,2, 127,9, 128,0, 128,5 (2 Kohlenstoffe), 131,3, 137,0, 137,3, 146,2, 156,7, 157,8, 166,1.
    • N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicylsäure
  • Methyl-N-benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-20-benzylsalicylat (6,81 g, 16,8 mmol) wird in Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst. Eine Lösung aus Lithiumhydroxidmonohydrat (0,78 g, 18,5 mmol) in Wasser (25 ml) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch wird gerührt und für 24 Stunden auf 75ºC erhitzt. Die Lösung wird gekühlt und wäßrige 1 N Chlorwasserstoffsäure (50 ml) wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit Ethylacetat (150 ml dann 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden mit Wasser (75 ml) und gesättigtem, wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und auf 150 ml konzentriert. Die Ethylacetatlösung wird bis zum Sieden erhitzt und Hexan (150 ml) wird zugegeben. Die Lösung wird auf Eis gekühlt und es bilden sich Kristalle. Die Kristalle werden durch Filtration gewonnen, mit Hexan gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 5,92 g (90% Ausbeute) an N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2- O-benzylsalicylsäure getrocknet (Smp. 139-140ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;), δ 4,23 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 5,06 (Singulett, 2H, CH&sub2;OCO), 5,13 (Singulett, 2H, CH&sub2;O), 6,90 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,11 (Singulett, 1H, ArH), 7,28-7,40 (Multiplett, 8H, ArH), 7,48-7,51 (Multiplett, 2H, ArH), 7,64 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,88 (Triplett, J = 6 H&sub2;, 1H, NH), 12,57 (Singulett, 1H, COOH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 43,8, 65,6, 69,8, 112,5 (2 Kohlenstoffe), 118,9, 120,4, 127,4, 127,9, 128,0, 128,5 (2 Kohlenstoffe), 131,2, 137,1, 137,4, 145,6, 156,7, 157,5, 167,4.
    • N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicyl-O-methylhydroxamsäure
  • N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicylsäure (3,07 g, 7,84 mmol) wird in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (75 ml) unter trockenem Stickstoff gelöst. Nach dem Kühlen der Lösung in einem Eiswasserbad wird Triethylamin (2,20 ml, 15,8 mmol) gefolgt von Isobutylchlorformiat (1,10 ml, 8,48 mmol) zugegeben. Die Reaktion wird in Eis für 1,5 Stunden gerührt. Methoxylaminhydrochlorid (0,67 g, 8,02 mmol) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 3 Stunden wird die Reaktion mit Ethylacetat (150 ml) verdünnt und mit wäßriger 1 N Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) extrahiert. Die Ethylacetatlösung wird ü ber wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und auf etwa 50 ml konzentriert. Die Lösung wird gekocht und es wird Hexan (100 ml) zugegeben. Nach dem Abkühlen in einem Eisbad bilden sich schnell Kristalle. Sie werden durch Filtration gewonnen und mit Hexan unter Bildung von 2,87 g (87% Ausbeute) an N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicyl-O- methylhydroxamsäure gewaschen (Smp. 116-117ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 3,63 (Singulett, 3H, NHOCH&sub3;), 4,20 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 5,04 (Singulett, 2H, CH&sub2;OCO), 5,13 (Singulett, 2H, CH&sub2;O), 6,90 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,08 (Singulett, 1H, ArH), 7,29-7,49 (Multiplett, 11H, ArH), 7,88 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 11,13 (Singulett, 1H, NHOCH&sub3;). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 43,7, 63,2, 65,5, 69,8, 111,8, 119,2, 121,7, 127,6, 127,9, 128,0, 128,1, 128,5 (2 Kohlenstoffe), 129,8, 136,8, 137,3, 144,3, 155,9, 156,6, 163,3.
    • 4-Aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäurehydrochlorid
  • N-Benzyloxycarbonyl-4-aminomethyl-2-O-benzylsalicyl-O-methylhydroxamsäure (1,42 g, 3,38 mmol) und Palladium auf Kohle (0,10 g, 10% [G/G]) werden in einem 1 l Hydrierkolben unter trockenem Stickstoff gegeben. Ethanol (150 ml) wird gefolgt von konzentrierter wäßriger Chlorwasserstoffsäure (0,30 ml) zugegeben. Der Kolben wird an das Parr-Hydriergerät angeschlossen und unter 35 psi Wasserstoff für 7 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wird dann durch Celite filtriert, um den Katalysator zu entfernen und das Filtrat wird konzentriert, bis sich ein Niederschlag zu bilden beginnt. Das Gemisch wird auf Eis gekühlt, der Feststoff wird durch Filtration gewonnen, mit Hexan gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,65 g (83% Ausbeute) an 4- Aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäurehydrochlorid getrocknet (Smp. > 250ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 3,71 (Singulett, 3H, NHOCH&sub3;), 3,95 (Singulett, 2H, NH&sub3;CH&sub2;), 7,00 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,05 (Singulett, 1H, ArH), 7,72 (Duplett, J = 8 Hz, H, ArH), 8,53 (breites Singulett, 3H, NH&sub3;), 12,01 (breites Singulett, 2H, NHOCH&sub3; und OH). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 41,7, 63,6, 114,2, 117,6, 119,3, 128,2, 140,0, 159,4, 166,1.
    • 4-Glutarylaminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäuresuccinimidylester
  • 4-Aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäurehydrochlorid (0,57 g, 1,82 mmol) wird in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst und N,N-Diisopropylethylamin (0,35 ml, 2,01 mmol) und Glutarsäureanhydrid (0,23 g, 2,02 mmol) werden zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 26 Stunden gerührt und dann werden N-Hydroxysuccinimid (0,23 g, 2,00 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (0,42 g, 2,01 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann filtriert und mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt. Die Ethylacetatlösung wird mit wäßriger 1 N Chlorwasserstoffsäure (100 ml), Wasser (100 ml) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid (50 ml) gewaschen. Die Lösung wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Das rohe gummiartige Produkt wird unter Bildung eines Feststoffs mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Diethylether behandelt, der filtriert und im Vakuum unter Bildung von 0,15 g (20% Ausbeute) an 4-Glutarylaminomethylsalicyl-Omethylhydroxamsäuresuccinimidylester getrocknet wird (Smp. 121-124ºC, offene Kapillare, nicht korrigiert).
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 1,85 (Quintett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;), 2,27 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CONHCH&sub2;), 2,69 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, NOCCH&sub2;), 2,80 (Singulett, 4H, COCH&sub2;CH&sub2;CO), 3,70 (Singulett, 3H, NHOCH&sub3;), 4,21 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, NHCH&sub2;), 6,75 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,77 (Singulett, 1H, ArH), 7,57 (Duplett, J = 8 Hz, H, ArH), 8,39 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NHCH&sub2;), 11,75 (Singulett, 1H, OH), 11,78 (Singulett, 1H, NHOCH&sub3;). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 20,4, 25,4, 29,7, 33,4, 33,6, 41,7, 112,8, 115,6, 117,8, 127,8, 146,2, 159,3, 166,3, 169,0, 170,5, 171,5. Beispiel XI Herstellung eines Reagenzes der allgemeinen Formel III 4-(3-(2-Pyridyldithio)propionylaminomethylsalicyl-O-methyl)hydroxamsäure
    • 4-(3-(2-(Pyridyldithio)propionyl)aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäure
  • 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (100 mg, 0,32 mmol) wird in trockenem N,N-Dimethylformamid (5,0 ml) gelöst und N,N-Diisopropylethylamin (65 ul, 0,36 mmol) gefolgt von 4-Aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäurehydrochlorid (82 mg, 0,35 mmol) werden zugegeben. Die Reaktion wird für 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Dichlormethan/Methanol/Essigsäure (95 : 5 : 1 [V/V/V]) eluiert wird. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Bildung von 44 mg (35% Ausbeute) an 4-(3-(2-Pyridyldithio)propionyl)aminomethylsalicyl-O-methylhydroxamsäure zu einem Öl eingedampft.
  • ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 2,58 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, CH&sub2;CH&sub2;S), 3,04 (Triplett, J = 7 Hz, 2H, COCH&sub2;CH&sub2;), 3,70 (Singulett, 3H, OCH&sub3;), 4,23 (Duplett, J = 6 Hz, 2H, ArCH&sub2;NH), 6,76 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 6,79 (Singulett, 1H, ArH), 7,23 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, ArH), 7,57 (Duplett, J = 8 Hz, 1H, ArH), 7,73-7,82 (Multiplett, 2H, ArH), 8,44 (Duplett, J = 6 Hz, 1H, ArH), 8,48 (Triplett, J = 6 Hz, 1H, NH), 11,80 (breites Singulett, 2H, OH und NHO). ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d&sub6;) δ 34,1, 34,5, 41,8, 63,5, 112,7, 115,7, 117,8, 119,3, 121,3, 127,7, 138,0, 145,9, 149,8, 159,4, 166,3, 170,2, 172,8.
    • Beispiel XII Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel IV Synthese von 5'-PBA-markierten Oligodesoxyribonukleotidkonjugaten
  • Oligodesoxyribonukleotid 7172 (Sequenz 5'-GATTACGCCAGTTGTACGGAC-3) wird im Maßstab von 1 umol mittels automatisierter Standardphosphoramiditchemie synthetisiert (Beckman Instruments Oligo 1000 und assoziierte Reagenzien). Ein geschütztes Amin-enthaltendes Phosphoramidit (Aminolink 2, Applied Biosystems oder UniLink Amino Modifier, Clontech) wird auf demselben Gerät verwendet, um 1 bis 4 reaktive, primäre Amine am 5'-Ende des Oligodesoxyribonukleotids mittels Standardchemie einzuführen. Das fertiggestellte Oligodesoxyribonukleotid wird dann vom Träger abgespalten und die Nukleobasen werden mittels eines UltraFast Deprotection Kits (Beckman Instruments) und dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll von den Schutzgruppen befreit.
  • Die Aminonukleotide werden durch Ethanolfällung gereinigt, in 0,8 ml 0,1 M NaHCO&sub3; gelöst und mit Phenylborsäurereagenz (PBA-Z-NHS) mit einem reaktiven N-Hydroxysuccinimidylesterrest (5 mg pro mmol an primären Aminogruppen am Aminooligonukleotid in 0,2 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid) für 2-18 Stunden bei Raumtemperatur kondensiert.
  • Das rohe PBA-modifizierte Oligonukleotid wird aus dem Reaktionsgemisch durch Gelflitration auf einer KwikSep Dextransäule (Pierce Chemical) in 0,1 M wäßrigem Triethylammoniumacetat pH 6,5 isoliert. Das PBA- modifizierte Oligonukleotid wird dann in einer Vakuumzentrifuge auf 1 ml konzentriert und durch Umkehrphasen HPLC auf einer 4,6 mm · 250 mm C18 Säule mit einem Triethylammoniumacetat-Acetonitrilgradienten gereinigt. Der gewünschte Produktpeak wird gewonnen und in einer Vakuumzentrifuge zu einem kleinen Pellet eingedampft, das in 0,5 ml Wasser gelöst und gefroren gelagert wird.
    • Herstellung von Salicylhydroxamsäuremagnetkügelchen
  • Zehn Milliliter unmodifizierte M280 oder M450 Magnetkügelchen (Dynal) werden schrittweise in Acetonitril dehydriert und zu Aldehyd-modifizierten Kügelchen mittels Oxalylchlorid aktiviertem N,N-Dimethylsulfoxid und Triethylamin in Dichlormethan bei -78ºC umgewandelt. Die entstehenden Aldehyd-tragenden Kügelchen werden schrittweise rehydriert und in 5 ml 0,1 M Natriumacetat pH 5,5 suspendiert. Die Aldehydgruppen werden mit 4- Glutarylaminomethylsalicylhydroxamsäurehydrazid (SHA-Z-NHNH&sub2;) durch die Zugabe von 15-25 mg, das in 200 ul N,N-Dimethylsulfoxid gelöst ist, und die Fortsetzung der Kupplungsreaktion über Nacht bei Raumtemperatur gekuppelt. Die Kügelchen werden dann ausgiebig mit Wasser gewaschen und in 5 ml 10% Ethanol gelagert.
    • Herstellung von Salicylhydroxamsäure (SHA)-Sepharose 4B
  • SHA-Sepharose 4B wird durch Mischen von 130 mg (6-Aminohexanoyl)-4-aminomethylsalicylhydroxamsäure (SHA-Z-NH&sub2;), die in 30 ml 0,2 M NaHCO&sub3; gelöst sind, mit 6,5 g HCl-gewaschener, mit CNBr aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) über Nacht bei Raumtemperatur hergestellt. Nach der Kupplungsreaktion werden 2 ml 0,5 M Tris pH 8,5 zugegeben und die Gelaufschlämmung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt und mit Wasser, 0,5 M NaCl und erneut Wasser gewaschen. Die entstehende SHA-Sepharose 4B wird in 30 ml 20% Ethanol suspendiert und bei 4ºC gelagert.
    • Herstellung eines Phenylborsäure-α-Biofin-Antikörperkonjugats
  • Ein Milliliter eines monoklonalen α-Biotin IgGl Antikörpers (6,5 mg/ml in 0,1 M NaHCO&sub3;) wird mit 440 umol PBA-Z-NHS (7,4 ul an 60 mM PBA-Z-NHS, gelöst in N,N-Dimethylsulfoxid) für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Unkonjugiertes PBA-Z-NHS und dessen Hydrolyseprodukte werden durch Dialyse entfernt. Das ultraviolette Absorptionsspektrum des entstehenden Konjugats (PBA-α-Biotin) zeigt eine Zunahme von A&sub2;&sub6;&sub0; relativ zu A&sub2;&sub8;&sub0;, die mit einer Phenylborsäuremodifikation einhergeht.
    • Herstellung eines Konjugats aus Phenylborsäure und alkalischer Phosphatase
  • Ein Milliliter alkalischer Phosphatase (Sigma, 6 mg/ml) wird gegen 1 Liter 0,1 M NaHCO&sub3; dialysiert und mit 700 nmol PBA-Z-NHS (10 ul einer 70 mM Stammlösung in N,N-Dimethylformamid) für 2 Stunden auf Eis konjugiert. Unkonjugiertes PBA-Z-NHS und dessen Hydrolyseprodukte werden durch Dialyse in 0,1 M NaHCO&sub3; entfernt. Das ultaviolette Absorptionsspektrum des entstehenden Konjugats (PBA-AP) zeigt eine Zunahme der A&sub2;&sub6;&sub0; relativ zu A&sub2;&sub8;&sub0;, die mit der Phenylborsäuremodifikation einhergeht. Das Konjugat wird bei 4ºC gelagert.
    • Herstellung eines Salicylhydroxamsäure-Ziege-α-Maus-Antikörperkonjugats
  • Zwei Milliliter eines Ziege-α-Maus-Antikörpers (Rockland, 8,8 mg/ml in 0,1 M NaHCO&sub3;) werden mit 2,35 umol Methyl-4-glutarylaminomethylsalicylatsuccinimidylester [SA(OMe)-Z-NHS] für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Der Methylester des Konjugats wird durch die Zugabe von 2 ml 2 M NH&sub2;OH pH 10, der Einstellung des pH mit 1 N NaOH auf 10 und der Inkubation der Reaktion bei Raumtemperatur für 3 Tage in eine Hydroxamsäure umgewandelt. NH&sub2;OH und unkonjugiertes SA(OMe)-X-NHS und dessen Hydrolyseprodukte werden durch Gelflltration auf einer G-25 Sephadex-Säule (Pharmacia) in 0,1 M NaHCO&sub3; entfernt und das Konjugat (SHA-Ziege- α-Maus) wird bei 4ºC gelagert.
    • Protokoll der Polymerasekettenreaktion (PCR)
  • Eine Region der Lambda DNA (801 bp) wird durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Die PCR Reaktion enthält 200 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP zusätzlich zu Biotin- und PBA-modifizierten Oligonukleotidprimern mit 1 uM in 1 · PCR Puffer II (Perkin Elmer), Lambda DNA (1 ng/ul) und 1E Thermus aquaticus DNA Polymerase. Das Reaktionsgemisch wird bei 92ºC für 1 Minute denaturiert und durch 35 PCR Zyklen bei 95ºC für 10 Sekunden, 62ºC für 20 Sekunden und 72ºC für 30 Sekunden mit einer schließlichen Verlängerung bei 72ºC für 5 Minuten amplifiziert. Die Reaktion bildet 50-100 ng eines amplifizierten Produkts (801 bp), das eine verzögerte Mobilität relativ zum ummodifizierten PCR Produkt während einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 50 mM Tris, 100 mM Borat, 2 mM EDTA bei pH 8,3 zeigt.
    • Beispiel XIII Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI Detektion des PBA-markierten PCR Produkts Detektion von PBA-markiertem PCR Produkt auf SHA-Magnetkügelchen
  • PBA-markiertes PCR Produkt (0,02 ul-5 ul) wird in 25-100 ul an 1,5 M NaCl, 150 mM Natriumcitrat mit pH 7 (10x SSC) verdünnt und zu einer Polypropylenmikrotiterplattenvertiefung gegeben, die SHA-Magnetpartikel enthält (10-50 ul). Die Partikel und das PCR Produkt werden für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die Magnetpartikel werden am Boden der Vertiefungen mit einer Magnetplatte festgehalten und fünfmal mit 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, Tween 20, pH 8 (ELISA Waschpuffer) gewaschen. 100 ul Strepavidin-alkalische Phosphatase (Boehringer Mannheim, 0,2 E/ml in 1 mg/ml BSA, NaCl, Tris-HCl, pH 8) werden zugegeben und mit den Magnetpartikeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die Magnetpartikel werden am Boden der Vertiefungen mit einer Magnetplatte festgehalten und fünfmal mit ELISA Waschlösung gewaschen. Es wird Substrat für die alkalische Phosphatase zugegeben (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 10,4) und die Farbe entwickelt sich bei 37ºC für 10-60 Minuten. Das untere Detektionslimit beträgt 50 pg an PCR Produkt.
    • Beispiel XIV Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI Detektion eines PBA-markierten Oligonukleotidhybrids Detektion eines PBA-markierten Oligonukleotids, das an ein Biotin-markiertes Oligonukleotid gebunden ist
  • Ein 42-mer Oligonukleotid wird mit zwei 21-mer Oligonukleotiden, die 5'-PBA und Biotinmarkierungen aufweisen, in 1,5 M NaCl, 150 mM Natriumcitrat, pH 7 bei 45ºC für 10 Minuten hybridisiert. 25 ul des Hybridisierungsgemisches werden mit 1-50 ul SHA-Magnetpartikeln (Dynal, M450) in einer Polypropylenmikrotiterplatte gemischt. Nach 30 Minuten werden die magnetischen Partikel am Boden der Vertiefung mit einer magnetischen Platte festgehalten und fünfmal mit 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,02% Tween 20 mit pH 8 gewaschen.
  • 100 ul SHA-AP (1 ug/ml in 1 mg/ml BSA, 140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8) werden zu den Magnetpartikeln gegeben und gut gemischt. Nach 30 Minuten werden die magnetischen Partikel am Boden der Vertiefung mit einer magnetischen Platte festgehalten und sechsmal mit 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,02% Tween 20 mit pH 8 gewaschen. Die Partikel werden mit Substrat für die alkalische Phosphatase (1 mg/ml p- Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, pH 10,4) gemischt und bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert. Die A&sub4;&sub0;&sub5; wird mit einem ELISA Plattenlesegerät gemessen (Molecular Devices). Es werden bis zu 45 pg des 42-mer Oligonukleotids detektiert. Experimentelle Kontrollen, denen entweder das 42-mer oder die mit PBA- oder Biotin markierten Oligonukleotide fehlen, bilden keine signifikante A&sub4;&sub0;&sub5;.
    • Beispiel XV Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI Immobilisierung eines PBA-α-Biotinkonjugats auf SHA-Sepharose 4B
  • 1 mg PBA-α-Biotin, das mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung auf 1 ml verdünnt ist, wird auf eine kleine Säule mit SHA-Sepharose 4B (1,0 · 2,0 cm) aufgetragen und ausgiebig mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Größe des A&sub2;&sub8;&sub0; peaks des Materials, das nicht an die Säule bindet, zeigt an, daß fast das gesamte PBA- Konjugat auf der Säule immobilisiert wird.
  • Die Biotinbindungsaktivität der Säule wird durch das Auftragen von 5 ml einer 1 ug/ml biotinylierten alkalischen Phosphatase in Tris-gepufferter Kochsalzlösung getestet, die 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Eine Probe des Peaks des Materials, das durch die Säule fließt, wird zum Vergleich der enzymatischen Aktivität mit einer Probe der alkalischen Phosphataseverdünnung gesammelt, die auf die Säule aufgetragen wurde. Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 20 ml Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wird eine sehr kleine Probe an Säulenmaterial (25 ul Flüssigkeit, die etwa 1 ul Gel enthält) gesammelt, um die enzymatische Aktivität zu messen, die das Ergebnis der Bindung an das Gel durch den immobilisierten α-Biotin-Antikörper ist.
  • Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird durch die Inkubation von 25 ul der Enzymproben in 250 ul 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer, 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; mit pH 10,4 für 20 Minuten und einer anschließenden Zugabe von 650 hl an 0,1 M NaHCO&sub3; mit 10 mM EDTA gemessen. Relativ zu einer Pufferkontrolle beträgt die A&sub4;&sub0;&sub5; der auf die Säule aufgetragenen Probe 1,57, während die A&sub4;&sub0;&sub5; des Peaks des Materials, das nicht von der Säule zurückgehalten wird, nur 0,042 beträgt, was anzeigt, daß im wesentlichen das gesamte Enzymkonjugat von der Säule gebunden wird. Die kleine Menge an getestetem Gel bildet eine A&sub4;&sub0;&sub5; von 1,30, was zeigt, daß das Enzym in der Tat von der Säule gebunden wurde.
    • Beispiel XVI Herstellung von Biokonjugaten der allgemeinen Formel VI Immobilisierung eines Konjugats aus PBA und alkalischer Phosphatase auf SHA-Mgnetkügelchen
  • PBA-konjugierte alkalische Phosphatase wird in Tris-gepufferter Kochsalzlösung auf 5 ug/nil verdünnt, die 5 mg/ml Rinderserumalbumin enthält. 200 ul an verdünntem PBA-konjugiertem Enzym werden mit 5, 10 oder 20 ul SHA-Magnetkügelchen gemischt (Dynal, M280). Das Enzym wird auch mit 40 ul unmodifizierten Kügelchen als Kontrolle gemischt. Die Kügelchen werden für 10 Minuten sanft auf Eis gemischt, wonach die Kügelchen mit einem Magnet aus seltenen Erden festgehalten und viermal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen werden. Die Kügelchen werden dann in 250 ul 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer, 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; mit pH 10,4 suspendiert und für 10 Minuten bei 37ºC gemischt. Die Reaktionen werden mit 750 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 5 mM EDTA beendet. Die A&sub4;&sub0;&sub5; relativ zu einer Puüerkontrolle wird gemessen, um die Aktivität der alkalischen Phosphatase zu bestimmen, die an die Magnetkügelchen gebunden ist. Die Kontrollkügelchen bilden eine A&sub4;&sub0;&sub5; von nur 0,15, während die SHA-Magnetkügelchen eine A&sub4;&sub0;&sub5; von 0,62, 0,97 und 1,33 bei jeweils 5, 10 und 20 ul Kügelchen bilden, was die Immobilisierung von signifikanten Mengen an PBA-AP Konjugat an die Oberfläche der Kügelchen zeigt.

Claims (35)

1. Reagenz der allgemeinen Formel I
Allgemeine Formel I
worin die Formel I wahlweise die Gruppe Z enthält, die einen Spacer umfaßt, welcher ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenproduktamid- oder Disulfidrest und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten,
worin die Gruppe R&sub1; für einen elektrophilen oder nukleophilen Rest steht, ausgewählt aus der Gruppe an Resten, die besteht aus Acrylamid, Amino, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidester, N- Hydroxysulfosuccinimidester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid und Thiol, die zur Umsetzung des Reagenzes mit einer biologisch aktiven Spezies geeignet sind, und
worin die Gruppe R&sub2; für eine Alkylgruppe oder eine Methylengruppe mit einem elektronegativen Rest steht.
2. Reagenz nach Anspruch 1, worin die Gruppe R&sub2; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2; und CH&sub2;OCH&sub3;.
3. Reagenz nach Anspruch 1, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
4. Reagenz mit der folgenden Formel
worin die Gruppe R&sub2; für eine Alkylgruppe oder eine Methylengruppe mit einem elektronegativen Rest steht.
5. Konjugat einer biologisch aktiven Spezies mit einem Reagenz, wobei das Konjugat die allgemeine Formel II aufweist
Allgemeine Formel II
worin die Formel II wahlweise die Gruppe Z enthält, die einen Spacer umfaßt, welcher ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenproduktamid- oder Disulfidrest und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten,
worin die Gruppe R&sub2; für eine Alkylgruppe oder eine Methylengruppe mit einem elektronegativen Rest steht, worin BAS für eine biologisch aktive Spezies steht.
6. Konjugat nach Anspruch 5, worin die Gruppe R&sub2; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2; und CH&sub2;OCH&sub3;.
7. Konjugat nach Anspruch 5, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Allcylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
8. Konjugat nach Anspruch 5. worin die Gruppe R&sub2; für CH&sub3; steht.
9. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats der allgemeinen Formel II nach Anspruch 5, wobei das Vefahren die Kondensation des Reagenzes der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 mit einer bioaktiven Spezies umfaßt.
10. Verfahren zur Herstellung des Reagenzes der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, worin die Gruppe R&sub2; für eine unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffen steht, gekennzeichnet durch
Veresterung einer 4-Methylsalicylsäure und 5-Methylsalicylsäure unter Bildung eines Alkyl-4-methylsalicylats oder eines Alkyl-5-methylsalicylats, worin die Gruppe R&sub2; eine unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffen ist
Halogenierung des Alkyl-4-methylsalicylats oder eines Alkyl-5-methylsalicylats unter Bildung eines Benzylhalogenids, worin die Gruppe Y für ein Halogen steht
Alkylierung des Benzylhalogenids mit einem Azidsalz unter Bildung eines Benzylazids
Hydrierung des Benzylazids unter Bildung eines Benzylamins
und Kondensation des Benzylamins mit einer aktivierten Carbonsäure.
11. Verfahren zur Herstellung des Reagenzes der allgemeinen Formel 1 nach Anspruch 1, worin die Gruppe R&sub2; ihr eine Methylengruppe mit einem elektronegativen Rest steht, gekennzeichnet durch
Veresterung einer 4-Methylsalicylsäure und 5-Methylsalicylsäure unter Bildung eines Alkyl-4-methylsalicylats oder eines Alkyl-5-methylsalicylats, worin die Gruppe X eine unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffen ist
Halogenierung des Alkyl-4-methylsalicylats oder eines Alkyl-5-methylsalicylats unter Bildung eines Benzylhalogenids, Worin die Gruppe Y für ein Halogen steht
Alkylierung des Benzylhalogenids mit einem Azidsalz unter Bildung eines Benzylazids
Hydrierung des Benzylazids unter Bildung eines Benzylamins
Kondensation des Benzylamins mit einer geeigneten Schutzgruppe Q zum Schutz des Amins unter Bildung eines geschützten Alkylaminomethylbenzoats
Spaltung des Alkylesters unter Bildung einer Salicylsäure
Alkylierung der Salicylsäure unter Bildung eines aktivierten Alkylesters
worin die Gruppe R&sub2; für eine Methylengruppe mit einem elektronegativen Rest steht,
Entfernung der Schutzgruppe Q unter Bildung eines Benzylamins
und Kondensation des Benzylamins mit einer aktivierten Carbonsäure.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Gruppe R&sub2; ausgewählt ist aus CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2; und CH&sub2;OCH&sub3;.
13. Verfahren nach Anspruch 12, das ferner den Schritt der Kondensation des Reagenzes der allgemeinen Formel I mit einer bioaktiven Spezies unter Bildung des Reagenzes der in Anspruch 5 definierten allgemeinen Formel II umfaßt.
14. Reagenz der allgemeinen Formel III
Allgemeine Formel III
worin die Formel III wahlweise die Gruppe Z enthält, die einen Spacer umfaßt, welcher ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenproduktamid- oder Disulfidrest und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten,
worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten, und
worin die Gruppe R&sub1; für einen elektrophilen oder nukleophilen Rest steht, ausgewählt aus der Gruppe an Resten, die besteht aus Acrylamid, Amino, Brom, Dithiopyridyl, Bromacetamid, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidester, N- Hydroxysulfosuccinimidester, Imidatester, Imidazolid, Iod, Iodacetamid, Maleimid und Thiol, die zur Umsetzung des Reagenzes mit einer biologisch aktiven Spezies geeignet sind,
und ferner wenn die Gruppe R&sub3; für H steht, die Gruppe R&sub1; dann ausgewählt ist aus Resten wie Acrylamid, Amino, Dithiopyridyl, Hydrazid, Imidatester, Maleimid und Thiol.
15. Reagenz nach Anspruch 14, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;.
16. Reagenz nach Anspruch 14, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
17. Reagenz mit der folgenden Formel
worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
18. Konjugat einer biologisch aktiven Spezies mit einem Reagenz, wobei das Konjugat die allgemeine Formel IV aufweist
Allgemeine Formel IV
worin die Formel IV wahlweise die Gruppe Z enthält, die einen Spacer umfaßt, welcher ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenproduktamid- oder Disulfidrest und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten,
worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten, und
worin BAS für eine biologisch aktive Spezies steht.
19. Konjugat nach Anspruch 18, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH.
20. Konjugat nach Anspruch 18, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
21. Konjugat nach Anspruch 18, worin die Gruppe R&sub3; für H steht.
22. Biokonjugat, das ein Phenylborsäurekomplexierungsreagenzkonjugat kovalent über einen Phenylborsäurekomplex an ein Phenylborsäurekonjugat gebunden aufweist, wobei das Biokonjugat die allgemeine Formel VI aufweist
Allgemeine Formel VI
worin die Formel VI wahlweise die Gruppe Z enthält, die einen Spacer umfaßt, welcher ausgewählt ist aus einer gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von maximal 6 Kohlenstoffäquivalenten, einer unverzweigten gesättigten oder ungesättigten Kette mit einer Länge von 6 bis 18 Kohlenstoffäquivalenten mit mindestens einem Zwischenproduktamid- oder Disulfidrest und einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von 3 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten,
worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten, und
worin BAS und BAS* für eine biologisch aktive Spezies stehen.
23. Konjugat nach Anspruch 22, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;.
24. Biokonjugat nach Anspruch 22, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
25. Biokonjugat nach Anspruch 22, worin BAS und BAS* unterschiedliche biologisch aktive Spezies sind.
26. Verfahren zur Herstellung des Reagenzes der allgemeinen Formel IV nach Anspruch 18, wobei das Verfahren die Kondensation des Reagenzes der allgemeinen Formel III nach Anspruch 14 mit einer biologisch aktiven Spezies umfaßt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;.
28. Verfahren nach Anspruch 26, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
29. Verfahren zur Herstellung eines Biokonjugats der allgemeinen Formel VI nach Anspruch 22, wobei das Verfahren die Schritte der Komplexierung des Konjugats der Formel IV nach Anspruch 18 mit einem zweiten Konjugat umfaßt, das eine zweite biologisch aktive Spezies und eine Phenylborsäure enthält.
30. Verfahren nach Anspruch 29, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;.
31. Verfahren nach Anspruch 29, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
32. Verfahren nach Anspruch 29, worin BAS und BAS* unterschiedliche bioaktive Spezies sind.
33. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats der allgemeinen Formel IV nach Anspruch 18, wobei das Verfahren die Kondensation eines Reagenzes der allgemeinen Formel 11 nach Anspruch 5 mit einem Hydroxylaminderivat der allgemeinen Formel NH&sub2;OR&sub3; umfaßt, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus H, einem Alkyl und einem Methylen- oder Ethylenrest mit einem elektronegativen Substituenten.
34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die Gruppe R&sub3; ausgewählt ist aus CH&sub3;, CH&sub2;CH&sub3;, CH&sub2;CN, CH&sub2;COOH, CH&sub2;CONH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;OH und CH&sub2;OCH&sub3;.
35. Verfahren nach Anspruch 33, worin die Gruppe Z für eine unverzweigte Alkylkette der allgemeinen Formel (CH&sub2;)n steht, worin n für 1 bis 6 steht.
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