-
Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein ein isoliertes Molekül
mit vaskulären,
einem endothelialen Wachstumsfaktor ähnlichen Eigenschaften und
eine genetische Sequenz, die selbiges codiert. Das Molekül wird für die Entwicklung
einer Reihe von Therapeutika und Diagnostika geeignet sein, die
in der Behandlung, Prophylaxe und/oder Diagnose von Zuständen, die
erhöhte
oder verminderte Vaskulatur und/oder vaskuläre Permeabilität erfordern,
nützlich
sind. Das Molekül
der vorliegenden Erfindung ist auch ein nützlicher Effektor von primären und
zentralen Neuronen und ist in der Lage, astrogliale Proliferation
zu induzieren.
-
Bibliographische Details der Veröffentlichungen,
auf die sich der Autor in dieser Beschreibung bezieht, sind am Ende
der Beschreibung gesammelt. Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs.) für die Nukleotid-
und Aminosäuresequenzen,
auf welche in der Beschreibung Bezug genommen wird, sind im Anschluß an die
Bibliographie definiert.
-
In dieser Beschreibung sind, wenn
es der Zusammenhang nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen,
wie "umfaßt" oder "umfassend", so zu verstehen,
daß sie
die Einbeziehung eines angegebenen Elements oder einer ganzen Zahl
oder einer Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen implizieren,
aber nicht den Ausschluß irgendeines
anderen Elements oder einer ganzen Zahl oder einer Gruppe von Elementen oder
ganzen Zahlen.
-
Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor
(nachfolgend als "VEGF" bezeichnet), auch
bekannt als vasoaktiver Permeabilitätsfaktor, ist ein abgesondertes,
kovalent verknüpftes,
homodimeres Glycoprotein, das spezifisch endotheliale Gewebe aktiviert
(Senger et al., 1993). Eine Reihe von Funktionen wurde VEGF zugeordnet,
so wie dessen Beteiligung an normaler Angiogenese, einschließlich der
Bildung des Corpus luteum (Yan et al., 1993) und der Plazentaentwicklung
(Sharkey et al., 1993), der Regulation von vaskulärer Permeabilität (Senger
et al., 1993), inflammatorischer Angiogenese (Sunderkotter et al.,
1994) und Autotransplantation (Dissen et al., 1994) und menschlichen
Erkrankungen, wie tumorfördernde
Angiogenese (Folkman & Shing, 1992),
rheumatoide Arthritis (Koch et al., 1994) und mit Diabetes in Verbindung
stehende Retinopathie (Folkman & Shing,
1992).
-
VEGF ist daher ein wichtiges Molekül, was es
zu einem potentiell wertvollen Ziel für die Erforschung von therapeutischen,
prophylaktischen und diagnostischen Mitteln auf der Grundlage von
VEGF oder dessen Aktivitäten
macht. Es besteht auch ein Bedarf daran, Homologe oder in anderer
Weise verwandte Moleküle
für eine
Verwendung als eine Alternative zu VEGF oder in Verbindung mit VEGF
zu identifizieren.
-
Bei der Arbeit, die zu der vorliegenden
Erfindung führte,
suchten die Erfinder das multiple, endokrine Neoplasie-Typ 1-Suszeptibilitätsgen (MENI). Überraschenderweise
entdeckten die Erfinder, daß eine
genetische Sequenz, die als ein Kandidat für das MENI-Gen ausgeschlossen
wurde, trotzdem ein neuer Wachstumsfaktor mit einiger Ähnlichkeit
zu VEGF war. Darüber
hinaus ist der Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung ein Effektormolekül für primäre und zentrale
Neuronen.
-
Dementsprechend liefert ein Aspekt
der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Polypeptid, welches wenigstens
eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
- (i)
eine Fähigkeit,
Proliferation von vaskulären
Endothelzellen zu induzieren,
- (ii) eine Fähigkeit,
mit Rezeptoren der Familie flt-1/flk-1 in Wechselwirkung zu treten,
und/oder
- (iii) eine Fähigkeit,
Zellmigration, Überleben
von Zellen und/oder eine Erhöhung
intrazellulärer
Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren,
wobei das
Polypeptid folgendes umfaßt:
- (a) eine Aminosäuresequenz,
welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID
NO: 3 angegeben ist, oder eine Nukleotidsequenz, welche über die
volle Länge
von SEQ ID NO: 3 oder dessen komplementäre Form unter hochstringenten
Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1%
w/w SDS bei 60°C
für 1–3 Stunden
hybridisiert, oder
- (b) eine Aminosäuresequenz,
wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder eine verkürzte Form
dieses Polypeptids, welche wenigstens eine der Eigenschaften (i)–(iii) aufweist.
-
Mit "biologisch isoliert" ist gemeint, daß das Molekül wenigstens einer Stufe der
Reinigung aus einer biologischen Quelle unterzogen wurde. Vorzugsweise
ist das Molekül
auch biologisch rein, was bedeutet, daß eine Zusammensetzung wenigstens
etwa 20%, vorzugsweise wenigstens etwa 40%, besonders bevorzugt
wenigstens etwa 65% und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa
80– 90%
oder mehr von dem Molekül, bezogen
auf das Gewicht, die Aktivität
oder andere geeignete Mittel im Verhältnis zu anderen Verbindungen in
der Zusammensetzung aufweist. Ganz besonders bevorzugt ist das Molekül sequenzierbar
rein.
-
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der
vorliegenden Erfindung stellt das Molekül in rekombinanter Form bereit.
-
Die vorliegende Erfindung zieht auch
genomische oder teilweise genomische Klone, welche ein proteinartiges
Molekül
der vorliegenden Erfindung codieren, in Betracht.
-
Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
2 angegeben ist, entspricht humanem VEGF (hierin als "VEGF165" bezeichnet). Dementsprechend
ist das Molekül
der vorliegenden Erfindung VEGF-ähnlich
oder ist ein Homologes von VEGF, aber es umfaßt eine Aminosäuresequenz,
welche ähnlich,
aber nicht identisch zu der Aminosäuresequenz von VEGF ist. Obwohl
die vorliegende Erfindung unter Verwendung eines humanen VEGF-ähnlichen
Moleküls
beispielhaft dargestellt wird, wird dies mit dem Verständnis getan,
daß die
vorliegende Erfindung das homologe Molekül und die codierende Sequenz
aus anderen Säugern
einbezieht, wie Nutztieren (z. B. Schafen, Schweinen, Pferden und
Kühen),
Gesellschaftstieren (z. B. Hunden und Katzen) und Laborversuchstieren
(z. B. Mäusen,
Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen) sowie Nicht-Säugern, wie
Vögeln
(z. B. Geflügel),
Fisch und Reptilien. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist das VEGF-ähnliche
Molekül
von menschlichem Ursprung und wird von einem Gen codiert, das auf
Chromosom 11q13 lokalisiert ist. Die vorliegende Erfindung erstreckt
sich daher auf die genomische Sequenz oder einen Teil davon, welche
das voriegende VEGF-ähnliche
Molekül
codiert.
-
Vorzugsweise beträgt die prozentuale Ähnlichkeit
wenigstens etwa 30%, besonders bevorzugt wenigstens etwa 40%, ganz
besonders bevorzugt wenigstens etwa 50%, noch bevorzugter wenigstens
etwa 60–70%,
und noch bevorzugter wenigstens etwa 80–95% zu der gesamten oder einem
Teil der Aminosäuresequenz,
wie sie in SEQ ID NO: 2 angegeben ist.
-
In einem Aspekt umfaßt das VEGF-ähnliche
Molekül
der vorliegenden Erfindung eine Sequenz von Aminosäuren, wie
sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder sie ist ein Teil, ein Fragment,
ein Derivat oder ein Analoges davon. Eine Bezugnahme hierin auf
Derivate umfaßt
auch Splice-Varianten. Dementsprechend erstreckt sich die vorliegende
Erfindung auch auf Splice-Varianten von SOM175. Beispiele von Splice-Varianten, die
von der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen werden, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Varianten mit einer Aminosäuresequenz,
wie sie im wesentlichen in wenigstens einer von SEQ ID NO: 8 und/oder
SEQ ID NO: 10 angegeben ist, oder Mutanten oder Derivate oder weitere
Splice-Varianten davon.
-
Daher zieht ein weiterer Aspekt der
vorliegenden Erfindung ein Peptidfragment in Betracht, das einem Abschnitt
der Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder einer Splice-Variante davon, wie sie
in SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 angegeben ist, oder einem chemischen Äquivalent
davon entspricht. Das biologisch isolierte oder rekombinante Molekül der vorliegenden
Erfindung kann auf natürliche
Weise glykosyliert sein oder es kann ein verändertes Glykosylierungsmuster
aufweisen, abhängig
von den Zellen, von welchen es isoliert oder synthetisiert wird.
Zum Beispiel wäre
das Molekül
unglykosyliert, wenn es durch rekombinante Mittel in prokaryontischen
Organismen produziert würde.
Das Molekül
kann eine natürlich
vorkommende Form der vollen Länge
sein oder es kann eine verkürzte
oder in anderer Weise derivatisierte Form sein.
-
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist auf ein Nukleinsäuremolekül gerichtet,
welches das hierin beschriebene VEGF-ähnliche Molekül codiert.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit,
welches die in SEQ ID NO: 3 angegebene Nukleotidsequenz umfaßt oder
eine Nukleotidsequenz, welche über
die volle Länge
der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz oder dessen komplementäre Form
unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden
hybridisiert.
-
Zu Zwecken der Definition der Stärke der
Stringenz kann einfach auf Sambrook of al. (1989), S. 9.47–9.51 verwiesen
werden, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden, worin
die offenbarten Waschschritte als hochstringent angesehen werden.
Eine niedrige Stringenz wird hierin als eine solche definiert, die
in 4–6 × SSC/0,1–0,5% w/v
SDS bei 37–45°C für 2–3 Stunden
vorherrscht. Abhängig
von der Quelle und der Konzentration der in die Hybridisierung einbezogenen
Nukleinsäure,
können
alternative Bedingungen der Stringenz verwendet werden, wie mittelstringente
Bedingungen, welche hierin als 1–4 × SSC/0,25–0,5% w/v SDS bei ≥ 45°C für 2–3 Stunden
angesehen werden, oder hochstringente Bedingungen, die hierin als 0,1–1 × SSC/0,1%
w/v SDS bei 60°C
für 1–3 Stunden
angesehen werden.
-
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin
auf das Homologe aus der Maus von humanem VEGF gerichtet (hierin
als "SOM175" bezeichnet). Das
SOM175 besitzt etwa 85% Identität
und 92% Konservierung der Aminosäurereste über den
gesamten codierenden Bereich im Vergleich zum humanem VEGF. Das
SOM175 wird von einem Nukleinsäuremolekül codiert,
das eine Nukleotidsequenz umfaßt,
wie sie im wesentlichen in 9 angegeben
ist.
-
Das VEGF-ähnliche Molekül der vorliegenden
Erfindung wird in der Entwicklung einer Reihe von therapeutischen
und/oder diagnostischen Anwendungen alleine oder in Kombination
mit anderen Molekülen,
wie VEGF, nützlich
sein. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auf pharmazeutische
Zusammensetzungen, die das VEGF-ähnliches
Molekül
oder Teile, Fragmente, Derivate, Homologe oder Analoge davon zusammen
mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägem und/oder Verdünnungsmitteln
umfassen. Darüber
hinaus erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Ribozyme und
Antisense-Moleküle
auf der Grundlage von SEQ ID NO: 3 sowie auf neutralisierende Antikörper gegen
das VEGF-ähnliche
Modul. Solche Moleküle
können
zur Verbesserung der Wirkungen von z. B. Überexpression von VEGF-ähnlichen
Genen, die zu Angiogenese oder Vaskularisierung von Tumoren führen, nützlich sein.
-
Die vorliegende Erfindung erwägt auch
Antikörper
gegen das VEGF-ähnliche
Molekül
der vorliegenden Erfindung oder Nukleinsäuresonden gegen ein Gen, welches
das VEGF-ähnliche
Molekül
der vorliegenden Erfindung codiert, welche als diagnostische Mittel
nützlich
sind.
-
Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein isolierter neutralisierender Antikörper gegen
ein Polypeptid der Erfindung bereitgestellt.
-
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Polypeptid
der Erfindung und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder
Verdünnungsmittel
umfaßt.
-
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein Wirt bereitgestellt, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
-
In noch einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
-
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung eines Polypeptids bereitgestellt,
welches wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
- (i) eine Fähigkeit,
Proliferation von vaskulären
Endothelzellen zu induzieren,
- (ii) eine Fähigkeit,
mit Rezeptoren der Familie flt-1/flk-1 in Wechselwirkung zu treten
und/oder
- (iii) eine Fähigkeit,
Zellmigration, Überleben
von Zellen und/oder eine Erhöhung
intrazellulärer
Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren,
wobei das
Polypeptid folgendes umfaßt:
- (a) eine Aminosäuresequenz,
welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID
NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 angegeben ist, oder eine Nukleotidsequenz,
die in der Lage ist, mit SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 oder deren
komplementärer
Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden
zu hybridisieren, oder
- (b) eine Aminosäuresequenz,
wie sie in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10 angegeben ist, oder eine
Aminosäuresequenz
mit wenigstens 70% Ähnlichkeit
dazu oder eine verkürzte
Form dieses Polypeptids
für die Herstellung eines Medikaments
zur Induzierung astroglialer Proliferation in einem Säuger.
-
Vorzugsweise umfaßt das rekombinante proteinartige
Molekül
die Aminosäuresequenz,
wie sie in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegeben ist.
-
Die vorliegende Erfindung wird weiter
unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Figuren und/oder Beispiele
beschrieben.
-
1 Nukleotidsequenz
[SEQ ID NO: 1] und entsprechende Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 2] von VEGF165.
-
2 Nukleotidsequenz
[SEQ ID NO: 3) und entsprechende Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 4] von SOM175.
-
3 Ergebnisse
der BLAST-Recherche mit der SOM175-Proteinsequenz.
-
4 BESTFIT-Abgleich
von VEGF-cDNA und SOM175-cDNA.
-
5 Mehrfacher
Abgleich von VEGF165 mit SOM175 und dessen
Splice-Varianten auf der Nukleotidebene.
-
6 Mehrfacher
Abgleich von VEGF165 mit SOM175 und dessen
Splice-Varianten auf der Aminosäureebene.
-
7 Schematische
Darstellung von SOM175 und dessen Splice-Varianten.
-
8(a) Schematische
Darstellung der genomischen Struktur des humanen SOM175-Genoms, welche eine
Exon/Intron-Karte zeigt.
-
8(b) Schematische
Darstellung der genomischen Struktur von humanem SOM175, welche Exon/Intron-Grenzen
zeigt.
-
9 Nukleotid-
und vorhergesagte Peptidsequenz, abgeleitet aus mSOM175-cDNA-Klonen. Die Numerierung
von Nukleotiden ist auf der linken Seite angegeben, beginnend von
dem A des Initialisierungs-Codons. Aminosäuren sind auf der rechten Seite
numeriert, beginnend von dem ersten Rest des vorhergesagten reifen
Proteins, nachdem das mutmaßliche
Signalpeptid entfernt wurde. Die alternativ gesplicete Region ist doppelt
unterstrichen, und die von jeder mRNA resultierende Peptidsequenz
ist enthalten. Ein mögliches
Polyadenylierungssignal ist in Fettdruck angegeben. Start- und Stop-Codons
von mSOM175167 und mSOM175186 sind
unterstrichen, und eine polymorphe AC-Wiederholung in dem 3'-UTR ist durch einen
punktiergestrichelten Kasten angegeben. Die Positionen von Intron/Exon-Grenzen
sind durch Pfeilköpfe
angegeben.
-
10 BESTFIT-Abgleiche
von Mensch- und Maus-VRF-Proteinisoformen, A: mSOM175167 und hSOM175167. B: mSOM175186 und
hSOM175186 von dem Punkt, an dem die Se quenzen
von den entsprechenden 167 Aminosäuren langen Isoformen abweichen.
Aminosäureidentitäten sind
mit vertikalen Strichen markiert und konservierte Aminosäuren mit
Doppelpunkten. Ein Pfeil markiert die vorhergesagte Signalpeptidspaltungsstelle
von Mensch- und Maus-SOM175.
-
11 BESTFIT-Abgleich
der Peptidsequenzen mSOM175167 und mVEGF188 (Breier et al., 1992). Ein Pfeil markiert
die Signalpeptidspaltungsstelle von mVEGF. Identische Aminosäuren sind
durch vertikale Striche angegeben und konservative Substitutionen
durch Doppelpunkte. Die Numerierung von Aminosäuren ist so, wie es in der
Legende zu 9 beschrieben
ist.
-
12 Vergleich
der Genstruktur zwischen SOM175 (es ist ein generisches SOM175-Gen
gezeigt, da die Intron/Exon-Organisation der Maus- und Mensch-Homologen
fast identisch ist) und anderen Mitgliedern der humanen VEGF/PIGF/PDGF-Genfamilie.
Exons sind durch Kästchen
wiedergegeben. Proteincodierende Bereiche und nicht translatierte
Bereiche sind durch gefüllte
bzw. leere Abschnitte gezeigt. Der schraffierte Bereich in SOM175
zeigt die zusätzliche
3'-UTR-Sequenz,
die durch alternatives Splicen der SOM175186-Isoform gebildet
wird. Potentielle alternative Splice-Produkte jedes Gens sind gezeigt.
-
13 Autoradiogramm
eines Northern-Blot von Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben von
erwachsener Maus (wie angegeben), hybridisiert mit einem mVRF-cDNA-Klon.
In allen Proben wurde ein Haupttranskript von 1,3 kb detektiert.
-
14 Filmautoradiogramme
(A–C)
und Dunkelfeldmikrofotografien (D–E), welche das Expressionsmuster
von mVRF und mRNA in der Maus zeigen. In dem E14-Mausembryo (A) sind positive Signale
in dem sich entwickelnden Herzen (Ha) und dem zerebralen Kortex
(Cx) vorhanden. Ein niedriges Hintergrundsignal ist auch in anderen
Geweben in dem Schnitt vorhanden. In dem E17-Embryo (B) ist das
Herz (Ha) aufgrund eines starken Hybridisierungssignals deutlich
sichtbar. Ein gleichermaßen
starkes Signal ist in braunem Fettgewebe (Fa) in dem Rücken und
um den Brustkäfig
herum vorhanden. Ein mäßiges Hybridisierungssignal
ist in dem Rückenmark
(SC) und in der Zunge (T) vorhanden. Das Hintergrundsignal ist im
Vergleich mit dem E14-Embryo vermindert. In der jungen erwachsenen
Maus (C–D)
sind positive Signale in dem Herzen (Ha) und dem Fettgewebe (Fa)
um den Brustkäfig
herum vorhanden, wogegen z. B. die Lungen (Lu) unmarkiert sind. Das
Hybridisierungssignal in dem Herzen ist gleichmäßig über das gesamte linke Ventrikel,
einschließlich
dem Papillarmuskel (D), verteilt. In dem E17-Herz, das mit einem Überschuß an kal ter
Sonde hybridisiert wurde, ist kein positives Signal vorhanden (E).
Maßstabsbalken
= 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm (E).
-
15 Dunkel-
(A und C) und Hellfeld- (B und D) Mikrofotografien, welche mSOM175-mRNA-Expression in
Maus-Fettgewebe (A–B)
und -Rückenmark
(C–D)
zeigen. Ein starkes Hybridisierungssignal ist im Fett vorhanden
(A), wie es durch die starke Markierung in mit Sudan-Schwarz gefärbten Schnitten
(B) gezeigt ist. Ein schwaches Signal ist auch in Skelettmuskel
(M in A–B)
vorhanden. In dem erwachsenen Rückenmark
(C) lieferten die mSOM175-Sonden ein neuronales Färbungsmuster
in der grauen Substanz. Toloudin-Gegenfärbung zeigt, daß motorische
Neuronen in dem Vorderhorn (D), zwischen Neuronen in dem tiefen
Teil des Hinterhorns und um den zentralen Kanal (nicht gezeigt)
weitestgehend positiv hinsichtlich mSOM175-mRNA waren. Maßstabsbalken
= 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm (D).
-
16 Wirkung
von VEGF auf sensorische Neuronen von Küken am Embryonaltag 8 (E8),
bestimmt durch % Überleben,
% Neuritenauswuchs und durchschnittliche Neuritenlänge (μm).
-
17 Wirkungen
von VEGF und SOM175 auf Kükenglia.
Getestet wurden zur Glia gehörige,
periphere CNS-Glia und CNS-Oligodendrozyten.
-
18 Wirkung
von verschiedenen SOM175-Proteinen auf astrogliale Zellen der Maus. ∎ 3H (cpm)
- 1. FGF-1 (10
ng/ml) Positivkontrolle
- 2. SOMΔX6
1 ng/ml
- 3. SOMΔX6
10 ng/ml
- 4. SOMΔX6
100 ng/ml
- 5. SOMΔX6
1000 ng/ml
- 6. SOMΔX6
1000 ng/ml, kein Heparin
- 7. SOMX6
1 ng/ml
- 8. SOMX6 10 ng/ml
- 9. SOMX6 100 ng/ml
- 10. SOMX6 1000 ng/ml
- 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
-
19 Wirkung
von verschiedenen SOM175-Proteinen auf oligodendrogliale Zellen
der Maus. ∎ 3H (cpm)
- 1. FGF-2 (10 ng/ml) Positivkontrolle
- 2. SOMΔX6
1 ng/ml
- 3. SOMΔX6
10 ng/ml
- 4. SOMΔX6
100 ng/ml
- 5. SOMΔX6
1000 ng/ml
- 6. SOMΔX6
1000 ng/ml, kein Heparin
- 7. SOMX6
1 ng/ml
- 8. SOMX6 10 ng/ml
- 9. SOMX6 100 ng/ml
- 10. SOMX6 1000 ng/ml
- 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
-
20 Wirkung
von verschiedenen SOM175-Proteinen auf Vorderhirnneuronen der Maus. ∎ Überleben.
- 1. FGF-2 (10 ng/ml) Positivkontrolle
- 2. SOMΔX6
1 ng/ml
- 3. SOMΔX6
10 ng/ml
- 4. SOMΔX6
100 ng/ml
- 5. SOMΔX6
1000 ng/ml
- 6. SOMΔX6
1000 ng/ml, kein Heparin
- 7. SOMX6
1 ng/ml
- 8. SOMX6 10 ng/ml
- 9. SOMX6 100 ng/ml
- 10. SOMX6 1000 ng/ml
- 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
-
TABELLE
1
ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZIDENTITÄTSNUMMERN
-
BEISPIEL 1
-
Humane cDNA-Klone
-
Die ursprüngliche SOM175-cDNA wurde isoliert,
indem man eine humane fötale
Himbibliothek (λzapII, Stratagene)
mit dem Cosmid D11S750 (Larsson et al., 1992) durchmusterte. Das
Plasmid wurde "in
vivo" ausgeschnitten,
und man erhielt eine einzelne 1,1 kb lange cDNA. Drei unabhängige SOM175-cDNA-Klone
wurden auch aus einer humanen fötalen
Milzbibliothek (Stratagene, Uni-zap) unter Verwendung des oben genannten
SOM175-Inserts als eine Sonde isoliert. Man erhielt drei Klone:
SOM175-4A, -5A und -6A. SOM175-5A ist ein alternativ gespliceter
Klon, dem Exon 4 fehlt (SOM175-E4). Diese Bibliotheksdurchmusterungen
wurden unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, die von dem
Hersteller der Bibliothek (Stratagene) empfohlen wurden, und einem
zufällig
initiierten (random primed) Insert von SOM175 durchgeführt.
-
Zwei partielle humane SOM175-cDNAs
wurden auch aus einer Bibliothek einer λGT11 humanen Melanomzellinie
A2058 (Clontech) isoliert. cDNA-Bibliothekdurchmustenangen wurden
unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, wie sie von Church
und Gilbert, 1984, beschrieben wurden, durchgeführt. In jedem Fall wurde die
Sonde durch zufällige
Initiierung (random priming) eines PCR-Produkts, das aus SOM175 (18f-700r)
erhalten wurde, erzeugt.
-
Maus-cDNA-Klone
-
Humanes SOM175 wurde auch dazu verwendet,
eine neonatale Gesamthirn-cDNA-Bibliothek der Maus (Unizap, Stratagene)
zu durchmustern. Es wurden vier nicht-chimäre Klone isoliert: M175-A,
B, C, D. Alle Klone waren partielle cDNAs, und M175-C enthielt mehrere
Introns. Dreien dieser cDNAs fehlte das Exon 6.
-
Ein weiterer Klon, der als M1 bezeichnet
wird, wurde vollständig
sequenziert, und man fand, daß er das
vollständige
offene Leseraster und einen Teil des 5'-UTR und den gesamten 3'-UTR enthielt.
-
BEISPIEL 2
-
DNA-SEQUENZANALYSE
-
Die gesamte Sequenz des cDNA-Klons
(SOM175) wurde zusammengestellt und ist in 2 mit ihrer entsprechenden Aminosäuresequenz
gezeigt. Diese Sequenz wurde hinsichtlich offener Leseraster unter
Verwendung des MAP-Programms (GCG, University of Wisconsin) durchmustert.
Ein einzelnes offenes Leseraster von 672 bp Länge wurde beobachtet (siehe 2). Es scheinen wenig 5'-untranslatierte
Sequenzen (2 bp) vorhanden zu sein. Der 3'-untranslatierte Bereich scheint vollständig zu
sein, da er ein Polyadenylierungssignal und einen Poly-A-Schwanz
umfaßt.
-
Datenbankhomologierecherchen wurden
unter Verwendung des BLAST-Algorithmus (durchgeführt beim NCBI, USA) durchgeführt. Diese
Analyse offenbarte Homologie zu mehreren Säugerformen von VEGF (siehe 3). Das Ausmaß an Homologie
zwischen SOM175 und humanem VEGF165 wurde
unter Verwendung des BESTFIT-Programms (GCG, University of Wisconsin;
siehe 4 und 5) bestimmt. Die Nukleotidhomologie
wurde auf 69,7% eingeschätzt,
und die Proteinhomologie wurde auf wenigstens 33,3% Identität und 52,5%
Konservierung unter Anwendung von BESTFiT-Analyse eingeschätzt. BLAST-Analyse von Nukleotidsequenzen
offenbarte die fast vollständige Übereinstimmung
mit einer humanen exprimierten Sequenzmarkierung EST06302 (Adams
of al., 1993).
-
Diese Daten zeigen, daß SOM175
einen Wachstumsfaktor codiert, der strukturelle Ähnlichkeiten zu VEGF besitzt.
Beide Gene zeigen Start- und Stop-Codons an ähnlichen Positionen und teilen
diskrete Homologieblöcke.
Alle acht Cysteine sowie eine Anzahl anderer VEGF-Reste, von denen
man annimmt, daß sie
in Dimerisierung involviert sind, sind konserviert. Diese Reste
sind Cystein-47, Prolin-70, Cystein-72, Valin-74, Arginin-77, Cystein-78,
Glycin-80, Cystein-81, Cystein-82, Cystein-89, Prolin-91, Cystein-122 und Cystein-124 und
sind in 6 gezeigt. Unter
der gegebenen strukturellen Konservierung zwischen VEGF und dem SOM175-Genprodukt
ist es auch möglich,
daß sie
funktionale Ähnlichkeiten
gemeinsam haben. Es wird vorgeschlagen, daß SOM175 ein VEGF-ähnliches Molekül codiert,
das einige Eigenschaften mit VEGF gemeinsam hat, aber auch selbst einzigartige
Eigenschaften besitzt. Die Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz
von VEGF165 sind in 1 gezeigt.
-
BEISPIEL 3
-
Die prozentuale Ähnlichkeit und Abweichung zwischen
der VEGF165-Familie und der SOM175-Familie (Protein)
wurde unter Verwendung der Clustal-Methode, MegAlign-Software, DNASTAR,
Wisconsin, analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2.1 und
2.2 gezeigt. Die alternativ gespliceten Formen von SOM175 sind auf
SOM175-e6 verkürzt,
wo das gesamte Exon 6 entfernt ist, auf SOM175-e6 und 7, wo die
gesamten Exons 6 und 7 entfernt sind, und SOM175-e4, wo das gesamte
Exon 4 entfernt ist. Die gesplicete Form von SOM175 ist in 7 gezeigt. Genomkarten von
SOM175, welche Intron/Exon-Grenzen zeigen, sind in 8a und 8b dargestellt.
-
Tabelle
2.1
A Prozent Nukleotidähnlichkeit
zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF
165
-
B
Prozent Nukleotidabweichung zwischen Splice-Varianten von SOM175
und humanem VEGF
165
-
Tabelle
2.2
A Prozent Aminosäureidentität zwischen
Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF
165
-
B
Prozent Aminosäureabweichung
zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF
165
-
BEISPIEL 4
-
BIOLOGISCHE TESTS ZUR
BESTIMMUNG DER FUNKTION VON SOM175
-
Es werden Tests durchgeführt, um
zu bestimmen, ob SOM175 ähnliche
Aktivitäten
wie VEGF in Bezug auf Endothelzellfunktion, Angiogenese und Wundheilung
besitzt. Andere Tests werden auf der Grundlage der Ergebnisse von
Rezeptorbindungsverteilungsstudien durchgeführt.
-
Tests der Endothelzellfunktion
-
Endothelzellproliferation. Endothelzellwachstumstests
werden bei Ferrara & Henzel
(1989) und bei Gospodarowicz et al. (1989) beschrieben.
-
Gefäßpermeabilitätstest.
Dieser Test, welcher den Miles-Test in Meerschweinchen verwendet,
wird durchgeführt,
wie er bei Miles & Miles
(1952) beschrieben wird.
-
Zelladhäsionstest. Der Einfluß von SOM175
auf die Adhäsion
von polymorphkernigen Leukozyten an Endothelzellen wird analysiert.
-
Chemotaxis. Diese wird unter Verwendung
des Standard-Boyden-Kammer-Chemotaxistests durchgeführt.
-
Plasminogenaktivatortest. Endothelzellen
werden hinsichtlich Plasminogenaktivator- und Plasminogenaktivatorinhibitorproduktion
nach Gabe von SOM175 getestet (Pepper et al. (1991)).
-
Endofhelzellmigrafionstesf. Die Fähigkeit
von SOM175 zur Stimulation von Endothelzellen zu migrieren und Röhrchen auszubilden,
wird getestet, wie es bei Montesano of al. (1986) beschrieben wird.
-
Angiogenesetest
-
SOM175-Induktion einer angiogenen
Reaktion in Hühnchen-Chorioaliantoinmembran
wird bestimmt, wie es bei Leung et al. (1989) beschrieben wird.
-
Mögliche
neurotrophe Aktionen von SOM175 werden unter Verwendung der folgenden
Tests untersucht:
-
Neuritenauswuchstest und
Geninduktion (PC12-Zellen)
-
PC12-Zellen (einer Phaeochromocytoma-Zellinie)
reagieren auf NGF und andere neurotrophe Faktoren durch Ausbildung
der Charakteristika von sympathetischen Neuronen, einschließlich der
Induktion von frühen
und späten
Genen und der Verlängerung
von Neuriten. Diese Zellen werden SOM175 ausgesetzt und ihre Reaktion
aufgezeichnet (Drinkwater of al. (1991), und Drinkwater et al. (1993)).
-
Kultivierte Neuronen aus
dem peripheren Nervensystem (PNS)
-
Primäre Kulturen der folgenden PNS-Neuronen
werden SOM175 ausgesetzt und hinsichtlich irgendeiner Reaktion beobachtet:
- – Sensorische
Neuronen von der Neuralleiste und Rückenwurzelganglien
- – sympathetische
Neuronen von sympathetischen Kettenganglien
- – von
Plakode abgeleitete sensorische Neuronen von nodösen Ganglien
- – motorische
Neuronen vom Rückenmark.
-
Die Tests sind bei Suter et al. (1992)
und bei Marinou of al. (1992) beschrieben.
-
Wo eine in vitro Reaktion beobachtet
wird, werden in vivo Tests hinsichtlich von Eigenschaften, wie Aufnahme
und Rücktransport,
durchgeführt,
wie es bei Hendry et al. (1992) beschrieben ist.
-
Nervenregeneration (PNS)
-
Wo neurotrophe Effekte von SOM175
beobachtet werden, wird dessen mögliche
Rolle bei der Regeneration von axotomisierten sensorischen Neuronen,
sympathetischen Neuronen und motori schen Neuronen nach den Verfahren
von Otto et al. (1989), Yip et al. (1984) und Hendry et al. (1976)
analysiert.
-
Aktionen von SOM175 auf
CNS-Neuronen
-
Die Fähigkeit von SOM175, das Überleben
von Neuronen des zentralen Nervensystems zu fördern, wird analysiert, wie
es bei Hagg et al. (1992), Williams et al. (1986), Hefti (1986)
und Kromer (1987) beschrieben ist.
-
Wundheilung
-
Die Fähigkeit von SOM175, die Wundheilung
zu unterstützen,
wird in dem klinisch besonders relevanten verfügbaren Modell getestet, wie
es bei Shilling et al. (1959) beschrieben und von Hunt et al. (1967)
verwendet wird.
-
Das hämopoietische System
-
Eine Vielzahl von in vitro und in
vivo Tests auf spezifische Zellpopulationen des hämopoietischen
Systems ist verfügbar
und nachfolgend angegeben:
Stammzellen
Maus
-
Eine Vielzahl neuer in vitro Maus-Stammzelltests
wurde unter Verwendung von FACS-gereinigten Zellen entwickelt:
-
(a) Wiederbesiedelnde
Stammzellen
-
Dies sind Zellen, die in der Lage
sind, das Knochenmark von tödlich
bestrahlten Mäusen
wiederzubesiedeln, und sie besitzen den Phänotyp Lin–,
Rhhi, Ly-6A/E+,
c-kit+. Die Testsubstanz wird auf diese
Zellen entweder alleine oder durch gemeinsame Inkubation mit mehreren
Faktoren, gefolgt von Messung der zellulären Proliferation durch 3N-Thymidin-Aufnahme, getestet.
-
(b) Spätstufenstammzellen
-
Dies sind Zellen, die eine vergleichsweise
geringe Knochenmarkswiederbesiedelungsfähigkeit besitzen, die aber
D13 CFU-S erzeugen können.
Diese Zellen besitzen den Phänotyp
Lin–,
Rhhi, Ly-6A/E+, c-kit+. Die Testsubstanz
wird mit diesen Zellen für
einen Zeitraum inkubiert, in tödlich
bestrahlte Empfänger
injiziert und die Anzahl an D13-Milzkolonien gezählt.
-
(c) Vorläuferangereicherte
Zellen
-
Dies sind Zellen, die in vitro auf
einzelne Wachstumsfaktoren reagieren und den Phänotyp Lin–,
Rhhi, Ly-6A/E+,
c-kit+ besitzen. Dieser Test wird zeigen,
ob SOM175 direkt auf hämopoietische
Vorläuferzellen
wirken kann. Die Testsubstanz wird mit diesen Zellen in Agar-Kulturen
inkubiert und die Anzahl an Kolonien nach 7–14 Tagen gezählt.
-
Arteriosklerose
-
Glatte Muskelzellen spielen eine
entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Initiation von Arteriosklerose,
was eine Veränderung
ihres Phänotyps
von einem kontraktilen zu einem synthetischen Zustand erfordert.
Makrophagen, Endothelzellen, T-Lymphozyten und Blutplättchen spielen
alle eine Rolle bei der Entwicklung von arteriosklerotischen Plaques,
indem sie das Wachstum und phänotypische
Veränderungen
von glatten Muskelzellen beeinflussen. Ein in vitro Test, der die
proliferative Rate und phänotypische
Veränderungen
von glatten Muskelzellen in einer multizellulären Umgebung mißt, wird
zur Untersuchung der Wirkung von SOM175 auf glatte Muskelzellen
verwendet. Das System verwendet eine modifizierte Rose-Kammer, in
welcher verschiedene Zelltypen auf gegenüberliegende Deckgläschen ausgesät werden.
-
Wirkungen von SOM175 auf
Knochen
-
Die Fähigkeit von SOM175, die Proliferation
von Osteoblasten zu regulieren, wird untersucht, wie es bei Lowe
of al. (1991) beschrieben ist. Alle Wirkungen auf die Knochenresorption
werden untersucht, wie es bei Lowe et al. (1991) beschrieben ist.
Wirkungen auf Osteoblastenmigration und Veränderungen in intrazellulären Molekülen (z.
B. cAMP-Ansammlung, Mengen an alkalischer Phosphatase) werden analysiert,
wie es bei Midy et al. (1994) beschrieben ist.
-
Wirkungen auf Skelettmuskelzellen
-
Wirkungen von SOM175 auf die Proliferation
von Myoblasten und die Entwicklung von Myotuben kann bestimmt werden,
wie es von Ewton et al. (1980) und von Gospodarowicz et al. (1976)
beschrieben wird.
-
BEISPIEL 5
-
KLONIERUNG VON MAUS-SOM175-DNA
-
Isolierung von cDNAs
-
Maus-SOM175- (mSOM175-) Klone wurden
aus einer Lambda Zap-neugeborenen Gesamthirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene) selektiert.
Primärer
Phage von hochgradig dichten Filtern (5 × 104 pfu/Platte)
wurden durch Hybridisierung mit einer 682 bp langen, mit 32P markierten Sonde identifiziert, die mittels
PCR aus einer hVRF-cDNA (pSOM175) erzeugt wurde, wie es oben beschrieben
ist. Hybridisierung und stringentes Waschen von Nylonmembranen (Hybond-N)
wurden bei 65°C
unter Bedingungen, die von Church und Gilbert (1984) beschrieben
werden, durchgeführt.
Positive Plaques wurden abgenommen, gereinigt und in vivo ausgeschnitten,
um bakterielle Kolonien zu erzeugen, die cDNA-Klone in pBluescript
SK- enthielten.
-
Isolierung von genomischen
Klonen
-
Genomische Klone wurden aus einer
Bibliothek des Mausstamms SV/129, kloniert in den Lambda Fix II-Vektor
(Stratagene), isoliert. Hochgradig dichte Filter (5 × 104 pfu/Filter) wurden mit einer 563 bp langen,
mit 32P markierten Sonde durchmustert, die
mittels PCR-Vervielfältigung
des Bereichs der Nukleotide 233–798
der mSOM175-cDNA erzeugt worden war (siehe 9). Positive Klone wurden gepfropft und
erneut mit Filtern, die 400–800
pfu enthielten, durchmustert. Phagenpräparationen in großem Maßstab wurden
unter Verwendung des QIAGEN Lambda-Kit oder durch ZnCl2-Reinigung (Santos,
1991) hergestellt.
-
Nukleotidsequenzierung
und -analyse
-
cDNAs wurden auf beiden Strängen unter
Verwendung einer Vielzahl von vektorbasierten und internen Primern
mit Applied Biosystems Incorporated (ABI) Farbstoffterminator-Sequenzierungskits
gemäß den Beschreibungen
des Herstellers sequenziert. Sequenzen wurden auf einem automatisierten
DNA-Sequenzierer ABI Modell 373A analysiert. Peptidhomologieabgleiche
wurden unter Verwendung des Programms BESTFIT (GCG, Wisconsin) durchgeführt.
-
Identifizierung von Intron/Exon-Grenzen
-
Identifizierung von Exon-Grenzen
und flankierenden Bereichen wurde unter Verwendung von PCR mit genomischer
Maus-DNA oder genomischen Lambda-Klonen mSOM175 als Matrizen durchgeführt. Die
in der PCR zur Identifizierung von Introns verwendeten Primer waren
von der hSOM175-Sequenz
abgeleitet, und um mögliche
Mensch-Maus-Sequenzfehlpaarungen zuzulassen, wurden Annealingtemperaturen
von 5–10°C unterhalb
der bestimmten Tm eingesetzt. Alle PCR-Produkte
wurden mittels Agarosegelelektroforese hinsichtlich der Größe untersucht
und unter Verwendung von QIAquick spin-Säulen (Qiagen) gelgereinigt,
und die Intron/Exon-Grenzen wurden direkt von diesen Produkten sequenziert.
Darüber
hinaus wurden einige Splice-Verbindungen von subklonierten genomischen
Fragmenten von mSOM175 sequenziert. Intron/Exon-Grenzen wurden durch
Vergleichen von cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen identifiziert.
-
Northern-Analyse
-
Zelluläre Gesamt-RNA wurde von einer
Gruppe von frischen, normalen Geweben von erwachsener Maus (Gehirn,
Niere, Leber, Muskel) unter Verwendung des Verfahrens von Chomczynski
und Sacchi (1987) hergestellt. 20 μg Gesamt-RNA wurden Elektroforese
unterzogen, auf eine Nylonmembran (Hybond N, Amersham) überführt und
unter Standardbedingungen hybridisiert (Church & Gilbert, 1984). Die Filter wurden bei
65°C in
0,1 × SSC
(20 × SSC
in 3 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat), 0,1% SDS gewaschen und Röntgenfilm mit
Intensivierungsschirmen bei –70°C für 1–3 Tage
exponiert.
-
Charakterisierung von
mSOM175-cDNAs
-
Maus-SOM175-Homologe wurden durch
Durchmusterung einer Maus-cDNA-Bibliothek mit einem hSOM175-cDNA-Klon
isoliert. Fünf
Klone mit Größen, die
von 0,8–1,5
kb variierten, wurden gewonnen und sequenziert. Die cDNA-Sequenzen
wurden unter Erhalt einer 1041 bp langen cDNA-Sequenz der vollen Länge zusammengestellt, welche
das gesamte offene Leseraster (621 bp oder 564 bp, abhängig von
der Splice-Form, siehe unten) und den 3'-UTR (379 bp) sowie 163 bp des 5'-UTR abdeckte (9).
-
Das vorhergesagte Initiations-Codon
paßte
zu der Position des Start-Codons in hSOM175. Ein anderes, außerhalb
des Rasters liegendes ATG wurde bei Position -47 lokalisiert, und
zwei Terminierungs-Codons wurden aufstromig (Positionen -9 bzw.
-33) und im Raster mit dem mutmaßlichen Initiations-Codon beobachtet.
-
Das vorhergesagte N-terminale Signalpeptid
von hSOM175 scheint in mSOM175 mit 81% Identität (17/21 Aminosäuren) vorhanden
zu sein. Man erwartet, daß eine
Peptidspaltung in mSOM175 nach Rest 21 stattfindet (10). Diese Daten legen nahe, daß reifes
mSOM175 ausgeschieden wird und daher vorstellbar als ein Wachstumsfaktor
funktionieren könnte.
-
Wie bei hSOM175 wurden zwei offene
Leseraster (ORFs) in cDNAs, die durch Bibliothekdurchmusterung isoliert
wurden, festgestellt. Für
vier von fünf
Klonen wurde gefunden, daß sie
alternativ gesplicet werden und ihnen ein zu Exon 6 von hSOM175
homologes, 101 bp langes Fragment fehlt. Die vorhergesagte Peptidsequenz
der zwei Isoformen von mSOM175 wurde bestimmt und mit den entsprechenden
humanen Isoformen abgeglichen (10).
-
Die Botschaft, die mSOM175186 codiert, enthält einen 621 bp langen ORF
mit codierenden Sequenzen, die bei Position +622 in Richtung des
Endes von Exon 7 enden (9).
Die kleinere Botschaft, die mSOM175167 codiert,
endet abstromig zu der +622 TAG-Stelle aufgrund einer Rasterverschiebung,
die aus dem Heraussplicen des 101 bp langen Exon 6 und die Einfügung eines
Stop-Codons (TGA)
an Position +666 in der Nähe
des Anfangs von Exon 8 resultiert (9).
-
Das mSOM175186-Protein
besitzt starke Homologie zu den aminoterminalen und zentralen Abschnitten
von VEGF, wogegen das Carboxylende vollständig abweicht und reich an
Alanin ist. mSOM175167 zeigt diese Ähnlichkeiten
und behält
auch Homologie zu mVEGF bis über
den C-Terminus bei
(11). Die Gesamthomologie
von mSOM175167 zu hSOM175167 betrug
85% Identität
bzw. 92% Ähnlichkeit
(10). In gleicher Weise
betrug die Homologie zwischen mSOM175167 und
mVEGF (Breier et al., 1992) 49% Identität bzw. 71% konservativer Aminosäureaustausch
(11).
-
Ein kanonisches Vertebratenpolyadenylierungssignal
(AATAAA) (Birnstiel et al., 1986) war in der mSOM175-cDNA nicht
vorhanden, jedoch ist die eng übereinstimmende
Sequenz GATAAA an gleichen Positionen sowohl in Maus- als auch Mensch-SOM176-cDNAs
vorhanden (9). Im Gegensatz
zu hSOM175 hat man gefunden, daß mSOM175
eine AC-Dinukleotidwiederholung an dem äußersten 3'-Ende des 3'-UTR (Nukleotidpositionen 998–1011, 9) enthält. Ein Polymorphismus dieser
Wiederholungsregion wurde zwischen einigen der mSOM175-cDNAs beobachtet,
wobei die Anzahl an Dinukleotiden von 7–11 variierte.
-
Genomische Charakterisierung
von mSOM175
-
Intron/Exon-Grenzen (Tabelle 3) wurden
unter Verwendung von Primern, welche Sequenzen flankierten, die
zu den entsprechenden hSOM175-Grenzen homolog waren, kartiert. Introns
I, III, IV und VI von mSOM175 (Tabelle 3, 12) waren kleiner als die hSOM175-Zwischensequenzen.
Die vollständige
genomische Sequenz wurde von dem 5'-UTR von mSOM175 über das Intron VI, den größten dazwischen
liegenden Bereich (2,2 kb), durch Sequenzierung von vervielfältigten
Introns und klonierten genomischen Bereichen von mSOM175 zusammengestellt.
Es gab nur einen Hauptunterschied in der genomischen Struktur zwischen mSOM175
und hSOM175, und das war, daß die
Exon 7/Intron VI-Grenze von mSOM175 10 bp weiter abstromig in Bezug
auf die cDNA-Sequenz lokalisiert war, da Exon 7 in mSOM175 10 bp
länger
ist als das entsprechende Exon in hSOM175.
-
Exons 6 und 7 sind in mSOM175 benachbart,
und es wurde gefunden, daß sie
in dem humanen Homologen vorkommen. Die starke Sequenzhomologie
zwischen Exon 6 von mSOM175 und hSOM175 (10) legt nahe, daß diese Sequenz keine zurückbehaltene
Intron-Sequenz ist, sondern eher einen funktionalen Teil der SOM175186-Isoform codiert.
-
Eine allgemeine Intron/Exon-Struktur
ist zwischen den verschiedenen Mitgliedern der VEGF-Genfamilie (VEGF,
PIGF, hSOM175) konserviert, und daher ist es nicht überraschend,
daß die
gesamte genomische Organisation des mSOM175-Gens zu diesen Genen
sehr ähnlich
ist (12).
-
Frühere vergleichende Kartierungsstudien
haben gezeigt, daß der
Bereich, welcher den Lokus für
humane multiple Endokrinneoplasie-Typ I-Erkrankung auf Chromosom
11q13 umgibt, mit dem proximalen Abschnitt des Maus-Chromosoms 19
vergleichbar ist (Rochelle et al., 1992). Da die Erfinder das hSOM175-Gen innerhalb
von 1 kb des humanen MEN1-Lokus (siehe oben) kartiert haben, ist
es sehr wahrscheinlich, daß das Maus-SOM175-Gen
in der Nähe
des Zentromers von Chromosom 19 kartiert.
-
Expressionsstudien von
mSOM175
-
Northern-Analyse von RNA von Geweben
von erwachsener Maus (Muskel, Herz, Lunge und Leber) zeigte, daß Expression
ubiquitär
zu sein scheint und in erster Linie als eine Hauptbande mit einer
Größe von etwa
1,3 kb auftritt (14).
Dies ist etwas unterschiedlich zu dem Muster, das man für hSOM175
beobachtet, in welchem zwei Hauptbanden von 2,0 und 5,5 kb in allen
untersuchten Geweben identifiziert wurden. Die 1,3 kb Botschaft
der Maus entspricht voraussichtlich dem kürzeren der humanen Transkripte,
und die Größenvariation
davon ist mit höchster
Wahrscheinlichkeit auf einen Unterschied in der Länge der
entsprechenden 5'-UTRs
zurückzuführen.
-
BEISPIEL 6
-
EXPRESSION VON MAUS-SOM175
IN PRÄ-
UND POSTNATALER MAUS
-
Tiere
-
Zeitlich angepaßte (n = 4) und junge erwachsene
(n = 2) Mäuse
(C57 Zuchtstamm, ALAB, Schweden) wurden mit Kohlendioxid getötet, und
die relevanten Gewebe wurden entnommen und an einem Wurf eingefroren.
Die Gewebe wurden bei –70°C bis zur
weiteren Verwendung aufbewahrt. Zwei Schwangerschaftsalter wurden
in dieser Untersuchung verwendet; Embryonaltag 8 (E8), 14 und E17.
-
In situ Hybridisierungshistochemie
-
In situ Hybridisierung wurde durchgeführt, wie
es zuvor beschrieben wurde (Dagerlind et al., 1992). Kurzgefaßt wurden
Querschnitte (14 μm)
in einem Cryostaten (Microm, Deutschland) geschnitten, auf Probe-On-Trägern (Fisher
Scientific, USA) aufgetaut und in schwarzen abgedichteten Behältern bei –70°C gelagert,
bis sie verwendet wurden. Die Sequenzen der synthetischen 42-meren
Oligonukleotide, die zu mSOM175 codierender mRNA komplementär waren,
waren ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID NO: 11]
(komplementär
zu nt 120–161)
und AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID NO: 12] (komplementär zu nt
162–203).
Zur Detektion der zwei alternativen Splice-Formen wurden die Oligonukleotide
GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID NO: 13] (komplementär zu nt
xxx-xxx) und GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID NO:
14] verwendet. Die Sonden wurden an dem 3'-Ende mit Desoxyadenosin-alpha-[thiojtriposphat-[35S] (NEN, USA) unter Verwendung von terminaler
Desoxynukleotidyltransferase (IBI, USA) bis zu einer spezifischen
Aktivität
von 7–10 × 108 cpm/μg
markiert und an die Abschnitte ohne Vorbehandlung für 16–18 Stunden
bei 42°C
hybridisiert. Das Hybridisierungsgemisch enthielt folgendes: 50%
v/v Formamid, 4 × SSC
(1 × SSC
= 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), 1 × Denhardts-Lösung Qeweils
0,02% Polyvinylpyrrolidon, BSA und Ficoll), 1% v/v Sarcosyl (N-lauroylsarcosin;
Sigma), 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), 10% w/v Dextransulfat (Pharmacia,
Schweden), 250 μg/ml
Hefe-tRNA (Sigma), 500 μg/ml
gescherte und hitzedenaturierte Lachssperma-DNA (Sigma) und 200
mM Dithiothreitol (DTT; LKB, Schweden). In Kontrollabschnitten wurde
die Spezifität
beider Sonden durch Zugabe eines 20-fachen Überschusses an unmarkierter Sonde
zu dem Hybridisierungsgemisch überprüft. Zusätzlich wurden
benachbarte Abschnitte mit einer zu dieser Untersuchung nicht in
Zusammenhang stehenden Sonde hybridisiert, welche ein unterschiedliches
Expressionsmuster lieferte. Nach der Hybridisierung wurden die Abschnitte
mehrere Male in 1 × SSC
bei 55°C gewaschen,
in Ethanol dehydratisiert und in NTB2 Nuclear Track-Emulsion (Kodak,
USA) eingetaucht. Nach 3–5
Wochen wurden die Abschnitte in D-19-Entwickler (Kodak, USA) entwickelt
und mit Deckgläsern
versehen. In einigen Fällen
wurden die Abschnitte vor dem Eintauchen in Emulsion einem autoradiographischen Film
(Beta-max Autoradiographiefilm, Amersham Ltd., UK) ausgesetzt.
-
Die vier verschiedenen Sonden lieferten
in allen untersuchten Geweben identische Hybridisierungsmuster.
Maus-SOM175-Expression wurde bereits in dem E8-Embryo detektiert,
in welchem ein positives Signal in Strukturen aufgezeichnet wurde,
die höchstwahrscheinlich
der neuronalen Röhre
entsprechen. In sagittalen Abschnitten von E14-Mausembryo war das
stärkste
Hybridisierungssignal im Herzen und in dem Nervensystem, insbesondere
der cerebralen Hirnrinde vorhanden (14A).
Ein niedriges Expressionsniveau war in allen anderen Geweben vorhanden.
Bei einem späteren
Schwangerschaftsalter, E17, war ein hohes mSOM175-mRNA-Signal auf
das Herz und braunes Fettgewebe im Rücken und um den Nacken herum
begrenzt (14B). Deutlich
positive Hybridisierungssignale waren in dem Grauen des Rückenmarks
und in der Zunge vorhanden (14B).
Expression in der cerebralen Hirnrinde war deutlich reduziert gegenüber Tag
14. Die schwache Hintergrundexpression, die man in dem E14-Embryo
z. B. im Muskel sah, hatte zu diesem Schwangerschaftsalter abgenommen.
Ein starkes mSOM175-mRNA-Hybridisierungssignal war alleine im Herzen
und in dem braunen Fett in den jungen erwachsenen Mäusen vorhanden
(14C). Das Signal in
dem Herzen war gleichmäßig über die
gesamte Ventrikelwand, einschließlich den Papillarmuskeln verteilt (14D). In Schnitten von Herzgewebe,
das mit einem Überschuß an kalter
Sonde hybridisierte, wurde keine spezifische Markierung über dem
Hintergrundsignal aufgezeichnet (14E).
-
Neben dem Herzen war das mSOM175-mRNA-Signal
in verschiedenen Geweben an der Außenseite des Brustkorbs, welches
braunem Fett morphologisch ähnlich
war, vorhanden. Dies wurde durch Sudan-Schwarz-Gegenfärbung verifiziert,
welche eine starke Färbung
in den gleichen Bereichen zeigte (15A und 15B). In Querschnitten von
Rückenmark
von erwachsener Maus lieferten die mVRF-Sonden ein neuronales Färbungsmuster
in der grauen Substanz (15C).
Gegenfärbung
mit Toluidin (15D) zeigte,
daß motorische
Neuronen in dem Vorderhorn (15C und 15D), zwischen Neuronen (15C) in dem tiefen Teil
des Hinterhorns und um den zentralen Kanal herum in einem großen Ausmaß positiv
hinsichtlich mSOM175-mRNA waren.
-
BEISPIEL 7
-
WIRKUNGEN VON VEGF UND
SOM175-PROTEINEN AUF SENSORISCHE NEURONEN VON HÜHNCHEN
-
Die Wirkungen von VEGF und SOM175-Proteinen
auf embryonische sensorische Neuronen von Hühnchen am Tag 8 wurden unter
Verwendung der Methode von Nurcombe et al. (1992) bestimmt. Der
neuronale Test wurde nach 48 Stunden unter Verwendung von 2000 Zellen
pro Testgefäß ausgewertet.
Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von 3H-Thymidinzählern erhalten.
Der Prozentsatz des Überlebens
von Neuronen, Neuritenauswuchs und durchschnittlicher Neuritenlänge in μm wurde unter
Verwendung von NGF als Positivkontrolle und verschiedenen Konzentrationen
an VEGF, VEGF in der Gegenwart von Heparin und VEGF in der Gegenwart
von Heparin und 5 μM
5'-Fluorouracil (5FU)
bestimmt. 5FU tötet
Gliazellen.
-
Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Die Ergebnisse
zeigen, daß VEGF
für die
Förderung
von neuronalem Überleben
wirksam ist, daß dies
aber die Gegenwart von Gliazellen erfordert. 17 zeigt die Ergebnisse der Wirkung von
VEGF und SOM175 auf drei Typen von Hühnchenglia. Die getesteten
Glia waren CNS-Glia, periphere Glia und CNS-Oligodendrozyten. Heparin
wurde mit 10 μg/ml
in sämtlichen
Kulturen eingesetzt, und der Test wurde nach 24 Stunden ausgewertet.
Ergebnisse wurden in 3H-Thymidinzählern unter Verwendung
von 2000 Zellen pro Gefäß gemessen.
-
Die Ergebnisse zeigen, daß für zentrale
und periphere Neuronen von Hühnchen
Astroglia durch SOM175 in der Gegenwart von Heparin deutlich zur
Proliferation stimuliert wurden, aber daß Hühnchenoligodendrozyten eine
vernachlässigbare
Zunahme in der Teilungsrate zeigten.
-
BEISPIEL 8
-
WIRKUNGEN VON SOM175-PROTEINEN
AUF PRIMÄRE
UND ZENTRALE NEURONEN DER MAUS
-
Die Ergebnisse in Beispiel 7 zeigen,
daß die
VEGF-Isoform eine Wirkung auf primäre und zentrale Neuronen des
Hühnchens
durch die Wirkung der astroglialen Zellen hatte. Ähnliche
Experimente wurden in Mauszellen wiederholt.
-
Kulturbedingungen
-
Neuronale und Gliazellen wurden für alle in
vitro Experimente präpariert
und kultiviert gemäß den Techniken,
die in "Methods
in Neurosciences (Band 2): Cell Culture" Ed. P. M. Conn, Academic Press, San Diego,
1990, S. 33–46
für Astrogliazellen,
S. 56–74
für Oligodendrogliazellen
und S. 87– 102
für zentrale
Neuronen beschrieben sind.
-
Zellen wurden auf 24-Well Kulturbereiche
(Nunc) plattiert, die mit Poly-L-omithin (0,1 mg/ml, 1 h) beschichtet
waren, mit einer Dichte von 2000 Zellen/Well. Nach 48 Stunden in
Kultur wurden die Neuronen in den Wells unter Inversionsphasenlicht
gezählt,
wobei gut etablierte Techniken verwendet wurden (Maruta et al., 1993),
und Gliazellen mit [3H]-Thymidinaufnahme
zur Aufzeichnung von Zellteilungsraten untersucht, wie nachfolgend
beschrieben. Heparin (10 μg/ml,
Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht, Sigma Chemical Corp.) war
zu jeder Zeit in den Kulturmedien vorhanden, wenn es nicht anders
angegeben ist. Die neuronalen Kulturen waren mit 5 mM 5-Fluoro-2-desoxyuridin (Sigma)
zur Unterdrückung
von glialem Hintergrundwachstum versetzt.
-
3H-Thymidin-Einbautest
für Gliazellproliferation
-
Die Zellen wurden für 14 Stunden
mit 3H-Thymidin (spezifische Aktivität: 103 μCi/μg) aus einer
Stammkonzentration von 0,1 mCi/ml in Standardmedium unter Erhalt
eines Inkubationsendvolumens von 20 μl/Well gepulst. Die Inhalte
der Wells wurden geerntet und auf Nitrozellulosepapier (Titertek,
Flow) absorbiert. Restliche anhaftende Zellen wurden durch Inkubation
mit Trypsin/Versen (CSL Limited, Victoria, Australien) für 5 Minuten
entfernt. Dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt. Die
Nitrozellulosescheiben wurden in einem Standard-Titertek-Ernter
(Flow) unter Verwendung von zuerst destilliertem Wasser und dann
Methanol gewaschen. Die Nitrozellulosescheiben wurden getrocknet,
Szintillationsflüssigkeit
(enthaltend 5% v/v Triton-X) wurde hinzugegeben, und die Scheiben
wurden auf einem Szintillationszähler
ausgezählt.
-
Die größte Aktivität fand man bei Präparationen
von SOM175, dem Exon 6 fehlte (SOMΔX6), auf Maus-Astrogliazellkulturen,
wo es eine signifikante Stimulation ihrer Proliferation gab, wenn
es in Verbindung mit Heparin verabreicht wurde (16). Wenig Stimulation wurde der Proliferation
von Oligodendrogliazellen verliehen (17),
und eine sehr gering wahrnehmbare Potenzierung der Überlebensreaktion
von isolierten Vorderhirnneuronen (18).
Die Standardabweichung in allen drei Diagrammen für jeden
Punkt betrug weniger als 8%.
-
Die Überlebensfähigkeit von Neuronen kann aufrechterhalten
werden, indem man Gliazellproliferation fördert. Darüber hinaus ist SOMΔX6 ein guter
Induktor für
Astrogliaproliferation und kann in Verbindung mit der Ausbildung
von Astrogliaendknöpfen
an Endothelzellen des zentralen Nervensystems exprimiert werden.
-
TABELLE
3
Splice-Verbindungen des Maus-SOM175-Gens
-
Groß- und Kleinbuchstaben bezeichnen
Exon- bzw. Intron-Sequenzen.
-
BIBLIOGRAPHIE
-
Adams MD, Soares MB, Kerlavage AR,
Fields C, Venter JC, (1993) Nature Genet, 4, 373–380.
-
Birnstiel ML, Busslinger M und Strub
K (1985) Cell 41, 349–359.
-
Breier G, Albrecht U, Sterrer S und
Risau W (1992) Development 114, 521–532.
-
Chomcrynski P und Sacchi N (1987)
Analyt. Biochem. 162, 156–159.
-
Church G und Gilbert W (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991–1995.
-
Dagerlind A, Friberg K, Bean AJ und
Hokfelt T (1992) Histochemisfry 98, 39–49.
-
Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH,
Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology 134, 1146–1154.
-
Drinkwater CC, Barker PA, Suter U
und Shooter EM (1993) J. Biol. Chem., 268, 23202–23207.
-
Drinkwater CC, Suter U, Angst C und
Shooter EM (1991) Proc. Roy. Soc. Lond. (Series 8), 246, 307–313.
-
Ewton DZ & Florini JR (1980) Endocrinology,
106: 577–583.
-
Ferrara N & Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 161, 851–858.
-
Folkman J & Shing Y (1992) J. Biol. Chem. 267,
10931–10934.
-
Gospodarowicz D, Abraham JA & Schilling J (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 7311–7315.
-
Gospodarowicz D, Weseman J, Morgan
JS & Lindstrom
J (1976) J. Cell Biol., 70: 395–405.
-
Hagg T, Quon D, Higaki J & Varon S (1992)
Neuron, 8, 145–158.
-
Hefti S (1986) J. Neurosci, 6, 2155–2162.
-
Hendry IA & Campbell J (1976) J. Neurocytol.,
5, 351–360.
-
Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola
NA & Bartlett
PF (1992) J. Neurosci. 12, 3427–3434.
-
Hunt et al., (1967) Am. J. Surgery,
114: 302–307.
-
Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento
EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM, Ferrara N, (1994) J. Immunol.
152, 4149–4156.
-
Kromer AF (1987) Science, 235, 214–216.
-
Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis
C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G, Nordenskjold M, (1992)
Hum. Genet. 89, 187–193.
-
OZUS Leung DW, Cachianes G, Kuang
W-J, Goeddel DV & Ferrara
N (1989) Science 246: 1306– 1309.
-
Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin
TJ & Reid IR
(1991) J. Bone Mineral Res., 6, 1277–1283.
-
Lowe C, Cornish J, Martin TJ & Reid IR (1991)
Calcif. Tissue Int., 49, 394–397.
-
Martinou JC, Martinou I & Kato AC (1992)
Neuron, 8, 737–744.
-
Maruta et al. (1993) Growth Factors
8: 119–134.
-
Midy V & Plouet J (1994) Biochem. Biophys.
Res. Commun., 199: 380–386.
-
Miles AA & Miles EM (1952) J. Physiol. (Lond)
118: 228–257.
-
Montesano R, Vassalli JD, Baird A,
Guillemin R & Orci,
L (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83, 7297–7301.
-
Nurcombe et al. (1992) Development
116: 1175–1183.
-
Otto D., Frotscher M & Unsicker K (1989)
J. Neurosci. Res., 22, 83–91.
-
Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano
R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 902– 906).
-
Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ and
Seldin MF (1992) Genomics 14, 26–31.
-
Roth S & Weston J (1967) Proc. Natl. Acad.
Sci USA, 58: 974–980.
-
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis
T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
-
Santos MA (1991) Nucleic Acids Res.
19, 5442.
-
Schilling et al., (1959) Surgery,
46: 702–710.
-
Senger DR, Van De Water L, Brown
LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak
HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303–324.
-
Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock
CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod. Fertil. 99, 609–615.
-
Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler
M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyt. Biol. 55, 410– 422.
-
Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater
CC, Lindsay RM and Shooter EM (1992) J. Neurosci., 12, 306–318.
-
Tischer E, Mitchell R, Hartman T,
Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC, & Abraham J (1991) J. Biol. Chem.
266, 11947–11954.
-
Williams LR, Varon S, Peterson GM,
Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A & Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83, 9231–9235.
-
Yan Z, Weich HA, Bernart W, Breckwoldt
M, Neulen J, (1993) J Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1723– 1725.
-
Yip NK, Rich KM, Lampe PA & Johnson EM Jr
(1984) J. Neurosci., 4, 2986–2992.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-