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DE69630442T2 - Ein neuartiger wachstumsfaktor und eine genetische sequenz, die für diesen codiert - Google Patents

Ein neuartiger wachstumsfaktor und eine genetische sequenz, die für diesen codiert Download PDF

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DE69630442T2
DE69630442T2 DE69630442T DE69630442T DE69630442T2 DE 69630442 T2 DE69630442 T2 DE 69630442T2 DE 69630442 T DE69630442 T DE 69630442T DE 69630442 T DE69630442 T DE 69630442T DE 69630442 T2 DE69630442 T2 DE 69630442T2
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DE
Germany
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
som175
isolated
Prior art date
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Application number
DE69630442T
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English (en)
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DE69630442D1 (de
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Kim Nicholas HAYWARD
Gunther Weber
Sean Grimmond
Magnus Nordenskjold
Catharina Larsson
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CSL IP Investments Pty Ltd
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Amrad Operations Pty Ltd
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Publication date
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Priority claimed from AUPN7274A external-priority patent/AUPN727495A0/en
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein isoliertes Molekül mit vaskulären, einem endothelialen Wachstumsfaktor ähnlichen Eigenschaften und eine genetische Sequenz, die selbiges codiert. Das Molekül wird für die Entwicklung einer Reihe von Therapeutika und Diagnostika geeignet sein, die in der Behandlung, Prophylaxe und/oder Diagnose von Zuständen, die erhöhte oder verminderte Vaskulatur und/oder vaskuläre Permeabilität erfordern, nützlich sind. Das Molekül der vorliegenden Erfindung ist auch ein nützlicher Effektor von primären und zentralen Neuronen und ist in der Lage, astrogliale Proliferation zu induzieren.
  • Bibliographische Details der Veröffentlichungen, auf die sich der Autor in dieser Beschreibung bezieht, sind am Ende der Beschreibung gesammelt. Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs.) für die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, auf welche in der Beschreibung Bezug genommen wird, sind im Anschluß an die Bibliographie definiert.
  • In dieser Beschreibung sind, wenn es der Zusammenhang nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen, wie "umfaßt" oder "umfassend", so zu verstehen, daß sie die Einbeziehung eines angegebenen Elements oder einer ganzen Zahl oder einer Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen implizieren, aber nicht den Ausschluß irgendeines anderen Elements oder einer ganzen Zahl oder einer Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen.
  • Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (nachfolgend als "VEGF" bezeichnet), auch bekannt als vasoaktiver Permeabilitätsfaktor, ist ein abgesondertes, kovalent verknüpftes, homodimeres Glycoprotein, das spezifisch endotheliale Gewebe aktiviert (Senger et al., 1993). Eine Reihe von Funktionen wurde VEGF zugeordnet, so wie dessen Beteiligung an normaler Angiogenese, einschließlich der Bildung des Corpus luteum (Yan et al., 1993) und der Plazentaentwicklung (Sharkey et al., 1993), der Regulation von vaskulärer Permeabilität (Senger et al., 1993), inflammatorischer Angiogenese (Sunderkotter et al., 1994) und Autotransplantation (Dissen et al., 1994) und menschlichen Erkrankungen, wie tumorfördernde Angiogenese (Folkman & Shing, 1992), rheumatoide Arthritis (Koch et al., 1994) und mit Diabetes in Verbindung stehende Retinopathie (Folkman & Shing, 1992).
  • VEGF ist daher ein wichtiges Molekül, was es zu einem potentiell wertvollen Ziel für die Erforschung von therapeutischen, prophylaktischen und diagnostischen Mitteln auf der Grundlage von VEGF oder dessen Aktivitäten macht. Es besteht auch ein Bedarf daran, Homologe oder in anderer Weise verwandte Moleküle für eine Verwendung als eine Alternative zu VEGF oder in Verbindung mit VEGF zu identifizieren.
  • Bei der Arbeit, die zu der vorliegenden Erfindung führte, suchten die Erfinder das multiple, endokrine Neoplasie-Typ 1-Suszeptibilitätsgen (MENI). Überraschenderweise entdeckten die Erfinder, daß eine genetische Sequenz, die als ein Kandidat für das MENI-Gen ausgeschlossen wurde, trotzdem ein neuer Wachstumsfaktor mit einiger Ähnlichkeit zu VEGF war. Darüber hinaus ist der Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung ein Effektormolekül für primäre und zentrale Neuronen.
  • Dementsprechend liefert ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Polypeptid, welches wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (i) eine Fähigkeit, Proliferation von vaskulären Endothelzellen zu induzieren,
    • (ii) eine Fähigkeit, mit Rezeptoren der Familie flt-1/flk-1 in Wechselwirkung zu treten, und/oder
    • (iii) eine Fähigkeit, Zellmigration, Überleben von Zellen und/oder eine Erhöhung intrazellulärer Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren, wobei das Polypeptid folgendes umfaßt:
    • (a) eine Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 3 angegeben ist, oder eine Nukleotidsequenz, welche über die volle Länge von SEQ ID NO: 3 oder dessen komplementäre Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden hybridisiert, oder
    • (b) eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder eine verkürzte Form dieses Polypeptids, welche wenigstens eine der Eigenschaften (i)–(iii) aufweist.
  • Mit "biologisch isoliert" ist gemeint, daß das Molekül wenigstens einer Stufe der Reinigung aus einer biologischen Quelle unterzogen wurde. Vorzugsweise ist das Molekül auch biologisch rein, was bedeutet, daß eine Zusammensetzung wenigstens etwa 20%, vorzugsweise wenigstens etwa 40%, besonders bevorzugt wenigstens etwa 65% und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 80– 90% oder mehr von dem Molekül, bezogen auf das Gewicht, die Aktivität oder andere geeignete Mittel im Verhältnis zu anderen Verbindungen in der Zusammensetzung aufweist. Ganz besonders bevorzugt ist das Molekül sequenzierbar rein.
  • Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt das Molekül in rekombinanter Form bereit.
  • Die vorliegende Erfindung zieht auch genomische oder teilweise genomische Klone, welche ein proteinartiges Molekül der vorliegenden Erfindung codieren, in Betracht.
  • Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, entspricht humanem VEGF (hierin als "VEGF165" bezeichnet). Dementsprechend ist das Molekül der vorliegenden Erfindung VEGF-ähnlich oder ist ein Homologes von VEGF, aber es umfaßt eine Aminosäuresequenz, welche ähnlich, aber nicht identisch zu der Aminosäuresequenz von VEGF ist. Obwohl die vorliegende Erfindung unter Verwendung eines humanen VEGF-ähnlichen Moleküls beispielhaft dargestellt wird, wird dies mit dem Verständnis getan, daß die vorliegende Erfindung das homologe Molekül und die codierende Sequenz aus anderen Säugern einbezieht, wie Nutztieren (z. B. Schafen, Schweinen, Pferden und Kühen), Gesellschaftstieren (z. B. Hunden und Katzen) und Laborversuchstieren (z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen) sowie Nicht-Säugern, wie Vögeln (z. B. Geflügel), Fisch und Reptilien. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das VEGF-ähnliche Molekül von menschlichem Ursprung und wird von einem Gen codiert, das auf Chromosom 11q13 lokalisiert ist. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auf die genomische Sequenz oder einen Teil davon, welche das voriegende VEGF-ähnliche Molekül codiert.
  • Vorzugsweise beträgt die prozentuale Ähnlichkeit wenigstens etwa 30%, besonders bevorzugt wenigstens etwa 40%, ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 50%, noch bevorzugter wenigstens etwa 60–70%, und noch bevorzugter wenigstens etwa 80–95% zu der gesamten oder einem Teil der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2 angegeben ist.
  • In einem Aspekt umfaßt das VEGF-ähnliche Molekül der vorliegenden Erfindung eine Sequenz von Aminosäuren, wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder sie ist ein Teil, ein Fragment, ein Derivat oder ein Analoges davon. Eine Bezugnahme hierin auf Derivate umfaßt auch Splice-Varianten. Dementsprechend erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf Splice-Varianten von SOM175. Beispiele von Splice-Varianten, die von der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Varianten mit einer Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in wenigstens einer von SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 10 angegeben ist, oder Mutanten oder Derivate oder weitere Splice-Varianten davon.
  • Daher zieht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Peptidfragment in Betracht, das einem Abschnitt der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder einer Splice-Variante davon, wie sie in SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 angegeben ist, oder einem chemischen Äquivalent davon entspricht. Das biologisch isolierte oder rekombinante Molekül der vorliegenden Erfindung kann auf natürliche Weise glykosyliert sein oder es kann ein verändertes Glykosylierungsmuster aufweisen, abhängig von den Zellen, von welchen es isoliert oder synthetisiert wird. Zum Beispiel wäre das Molekül unglykosyliert, wenn es durch rekombinante Mittel in prokaryontischen Organismen produziert würde. Das Molekül kann eine natürlich vorkommende Form der vollen Länge sein oder es kann eine verkürzte oder in anderer Weise derivatisierte Form sein.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Nukleinsäuremolekül gerichtet, welches das hierin beschriebene VEGF-ähnliche Molekül codiert. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, welches die in SEQ ID NO: 3 angegebene Nukleotidsequenz umfaßt oder eine Nukleotidsequenz, welche über die volle Länge der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz oder dessen komplementäre Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden hybridisiert.
  • Zu Zwecken der Definition der Stärke der Stringenz kann einfach auf Sambrook of al. (1989), S. 9.47–9.51 verwiesen werden, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden, worin die offenbarten Waschschritte als hochstringent angesehen werden. Eine niedrige Stringenz wird hierin als eine solche definiert, die in 4–6 × SSC/0,1–0,5% w/v SDS bei 37–45°C für 2–3 Stunden vorherrscht. Abhängig von der Quelle und der Konzentration der in die Hybridisierung einbezogenen Nukleinsäure, können alternative Bedingungen der Stringenz verwendet werden, wie mittelstringente Bedingungen, welche hierin als 1–4 × SSC/0,25–0,5% w/v SDS bei ≥ 45°C für 2–3 Stunden angesehen werden, oder hochstringente Bedingungen, die hierin als 0,1–1 × SSC/0,1% w/v SDS bei 60°C für 1–3 Stunden angesehen werden.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf das Homologe aus der Maus von humanem VEGF gerichtet (hierin als "SOM175" bezeichnet). Das SOM175 besitzt etwa 85% Identität und 92% Konservierung der Aminosäurereste über den gesamten codierenden Bereich im Vergleich zum humanem VEGF. Das SOM175 wird von einem Nukleinsäuremolekül codiert, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, wie sie im wesentlichen in 9 angegeben ist.
  • Das VEGF-ähnliche Molekül der vorliegenden Erfindung wird in der Entwicklung einer Reihe von therapeutischen und/oder diagnostischen Anwendungen alleine oder in Kombination mit anderen Molekülen, wie VEGF, nützlich sein. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die das VEGF-ähnliches Molekül oder Teile, Fragmente, Derivate, Homologe oder Analoge davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägem und/oder Verdünnungsmitteln umfassen. Darüber hinaus erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Ribozyme und Antisense-Moleküle auf der Grundlage von SEQ ID NO: 3 sowie auf neutralisierende Antikörper gegen das VEGF-ähnliche Modul. Solche Moleküle können zur Verbesserung der Wirkungen von z. B. Überexpression von VEGF-ähnlichen Genen, die zu Angiogenese oder Vaskularisierung von Tumoren führen, nützlich sein.
  • Die vorliegende Erfindung erwägt auch Antikörper gegen das VEGF-ähnliche Molekül der vorliegenden Erfindung oder Nukleinsäuresonden gegen ein Gen, welches das VEGF-ähnliche Molekül der vorliegenden Erfindung codiert, welche als diagnostische Mittel nützlich sind.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isolierter neutralisierender Antikörper gegen ein Polypeptid der Erfindung bereitgestellt.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Polypeptid der Erfindung und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel umfaßt.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Wirt bereitgestellt, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.
  • In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polypeptids bereitgestellt, welches wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
    • (i) eine Fähigkeit, Proliferation von vaskulären Endothelzellen zu induzieren,
    • (ii) eine Fähigkeit, mit Rezeptoren der Familie flt-1/flk-1 in Wechselwirkung zu treten und/oder
    • (iii) eine Fähigkeit, Zellmigration, Überleben von Zellen und/oder eine Erhöhung intrazellulärer Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren, wobei das Polypeptid folgendes umfaßt:
    • (a) eine Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 angegeben ist, oder eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, mit SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 oder deren komplementärer Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden zu hybridisieren, oder
    • (b) eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10 angegeben ist, oder eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 70% Ähnlichkeit dazu oder eine verkürzte Form dieses Polypeptids

    für die Herstellung eines Medikaments zur Induzierung astroglialer Proliferation in einem Säuger.
  • Vorzugsweise umfaßt das rekombinante proteinartige Molekül die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angegeben ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Figuren und/oder Beispiele beschrieben.
  • 1 Nukleotidsequenz [SEQ ID NO: 1] und entsprechende Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 2] von VEGF165.
  • 2 Nukleotidsequenz [SEQ ID NO: 3) und entsprechende Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 4] von SOM175.
  • 3 Ergebnisse der BLAST-Recherche mit der SOM175-Proteinsequenz.
  • 4 BESTFIT-Abgleich von VEGF-cDNA und SOM175-cDNA.
  • 5 Mehrfacher Abgleich von VEGF165 mit SOM175 und dessen Splice-Varianten auf der Nukleotidebene.
  • 6 Mehrfacher Abgleich von VEGF165 mit SOM175 und dessen Splice-Varianten auf der Aminosäureebene.
  • 7 Schematische Darstellung von SOM175 und dessen Splice-Varianten.
  • 8(a) Schematische Darstellung der genomischen Struktur des humanen SOM175-Genoms, welche eine Exon/Intron-Karte zeigt.
  • 8(b) Schematische Darstellung der genomischen Struktur von humanem SOM175, welche Exon/Intron-Grenzen zeigt.
  • 9 Nukleotid- und vorhergesagte Peptidsequenz, abgeleitet aus mSOM175-cDNA-Klonen. Die Numerierung von Nukleotiden ist auf der linken Seite angegeben, beginnend von dem A des Initialisierungs-Codons. Aminosäuren sind auf der rechten Seite numeriert, beginnend von dem ersten Rest des vorhergesagten reifen Proteins, nachdem das mutmaßliche Signalpeptid entfernt wurde. Die alternativ gesplicete Region ist doppelt unterstrichen, und die von jeder mRNA resultierende Peptidsequenz ist enthalten. Ein mögliches Polyadenylierungssignal ist in Fettdruck angegeben. Start- und Stop-Codons von mSOM175167 und mSOM175186 sind unterstrichen, und eine polymorphe AC-Wiederholung in dem 3'-UTR ist durch einen punktiergestrichelten Kasten angegeben. Die Positionen von Intron/Exon-Grenzen sind durch Pfeilköpfe angegeben.
  • 10 BESTFIT-Abgleiche von Mensch- und Maus-VRF-Proteinisoformen, A: mSOM175167 und hSOM175167. B: mSOM175186 und hSOM175186 von dem Punkt, an dem die Se quenzen von den entsprechenden 167 Aminosäuren langen Isoformen abweichen. Aminosäureidentitäten sind mit vertikalen Strichen markiert und konservierte Aminosäuren mit Doppelpunkten. Ein Pfeil markiert die vorhergesagte Signalpeptidspaltungsstelle von Mensch- und Maus-SOM175.
  • 11 BESTFIT-Abgleich der Peptidsequenzen mSOM175167 und mVEGF188 (Breier et al., 1992). Ein Pfeil markiert die Signalpeptidspaltungsstelle von mVEGF. Identische Aminosäuren sind durch vertikale Striche angegeben und konservative Substitutionen durch Doppelpunkte. Die Numerierung von Aminosäuren ist so, wie es in der Legende zu 9 beschrieben ist.
  • 12 Vergleich der Genstruktur zwischen SOM175 (es ist ein generisches SOM175-Gen gezeigt, da die Intron/Exon-Organisation der Maus- und Mensch-Homologen fast identisch ist) und anderen Mitgliedern der humanen VEGF/PIGF/PDGF-Genfamilie. Exons sind durch Kästchen wiedergegeben. Proteincodierende Bereiche und nicht translatierte Bereiche sind durch gefüllte bzw. leere Abschnitte gezeigt. Der schraffierte Bereich in SOM175 zeigt die zusätzliche 3'-UTR-Sequenz, die durch alternatives Splicen der SOM175186-Isoform gebildet wird. Potentielle alternative Splice-Produkte jedes Gens sind gezeigt.
  • 13 Autoradiogramm eines Northern-Blot von Gesamt-RNA aus verschiedenen Geweben von erwachsener Maus (wie angegeben), hybridisiert mit einem mVRF-cDNA-Klon. In allen Proben wurde ein Haupttranskript von 1,3 kb detektiert.
  • 14 Filmautoradiogramme (A–C) und Dunkelfeldmikrofotografien (D–E), welche das Expressionsmuster von mVRF und mRNA in der Maus zeigen. In dem E14-Mausembryo (A) sind positive Signale in dem sich entwickelnden Herzen (Ha) und dem zerebralen Kortex (Cx) vorhanden. Ein niedriges Hintergrundsignal ist auch in anderen Geweben in dem Schnitt vorhanden. In dem E17-Embryo (B) ist das Herz (Ha) aufgrund eines starken Hybridisierungssignals deutlich sichtbar. Ein gleichermaßen starkes Signal ist in braunem Fettgewebe (Fa) in dem Rücken und um den Brustkäfig herum vorhanden. Ein mäßiges Hybridisierungssignal ist in dem Rückenmark (SC) und in der Zunge (T) vorhanden. Das Hintergrundsignal ist im Vergleich mit dem E14-Embryo vermindert. In der jungen erwachsenen Maus (C–D) sind positive Signale in dem Herzen (Ha) und dem Fettgewebe (Fa) um den Brustkäfig herum vorhanden, wogegen z. B. die Lungen (Lu) unmarkiert sind. Das Hybridisierungssignal in dem Herzen ist gleichmäßig über das gesamte linke Ventrikel, einschließlich dem Papillarmuskel (D), verteilt. In dem E17-Herz, das mit einem Überschuß an kal ter Sonde hybridisiert wurde, ist kein positives Signal vorhanden (E). Maßstabsbalken = 0,5 mm (A), 1,2 mm (B), 1 mm (C), 0,3 mm (D), 0,1 mm (E).
  • 15 Dunkel- (A und C) und Hellfeld- (B und D) Mikrofotografien, welche mSOM175-mRNA-Expression in Maus-Fettgewebe (A–B) und -Rückenmark (C–D) zeigen. Ein starkes Hybridisierungssignal ist im Fett vorhanden (A), wie es durch die starke Markierung in mit Sudan-Schwarz gefärbten Schnitten (B) gezeigt ist. Ein schwaches Signal ist auch in Skelettmuskel (M in A–B) vorhanden. In dem erwachsenen Rückenmark (C) lieferten die mSOM175-Sonden ein neuronales Färbungsmuster in der grauen Substanz. Toloudin-Gegenfärbung zeigt, daß motorische Neuronen in dem Vorderhorn (D), zwischen Neuronen in dem tiefen Teil des Hinterhorns und um den zentralen Kanal (nicht gezeigt) weitestgehend positiv hinsichtlich mSOM175-mRNA waren. Maßstabsbalken = 0,1 mm (A), 0,1 mm (B), 0,25 mm (C), 0,015 mm (D).
  • 16 Wirkung von VEGF auf sensorische Neuronen von Küken am Embryonaltag 8 (E8), bestimmt durch % Überleben, % Neuritenauswuchs und durchschnittliche Neuritenlänge (μm).
  • 17 Wirkungen von VEGF und SOM175 auf Kükenglia. Getestet wurden zur Glia gehörige, periphere CNS-Glia und CNS-Oligodendrozyten.
  • 18 Wirkung von verschiedenen SOM175-Proteinen auf astrogliale Zellen der Maus. ∎ 3H (cpm)
    • 1. FGF-1 (10 ng/ml) Positivkontrolle
    • 2. SOMΔX6 1 ng/ml
    • 3. SOMΔX6 10 ng/ml
    • 4. SOMΔX6 100 ng/ml
    • 5. SOMΔX6 1000 ng/ml
    • 6. SOMΔX6 1000 ng/ml, kein Heparin
    • 7. SOMX6 1 ng/ml
    • 8. SOMX6 10 ng/ml
    • 9. SOMX6 100 ng/ml
    • 10. SOMX6 1000 ng/ml
    • 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
  • 19 Wirkung von verschiedenen SOM175-Proteinen auf oligodendrogliale Zellen der Maus. ∎ 3H (cpm)
    • 1. FGF-2 (10 ng/ml) Positivkontrolle
    • 2. SOMΔX6 1 ng/ml
    • 3. SOMΔX6 10 ng/ml
    • 4. SOMΔX6 100 ng/ml
    • 5. SOMΔX6 1000 ng/ml
    • 6. SOMΔX6 1000 ng/ml, kein Heparin
    • 7. SOMX6 1 ng/ml
    • 8. SOMX6 10 ng/ml
    • 9. SOMX6 100 ng/ml
    • 10. SOMX6 1000 ng/ml
    • 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
  • 20 Wirkung von verschiedenen SOM175-Proteinen auf Vorderhirnneuronen der Maus. ∎ Überleben.
    • 1. FGF-2 (10 ng/ml) Positivkontrolle
    • 2. SOMΔX6 1 ng/ml
    • 3. SOMΔX6 10 ng/ml
    • 4. SOMΔX6 100 ng/ml
    • 5. SOMΔX6 1000 ng/ml
    • 6. SOMΔX6 1000 ng/ml, kein Heparin
    • 7. SOMX6 1 ng/ml
    • 8. SOMX6 10 ng/ml
    • 9. SOMX6 100 ng/ml
    • 10. SOMX6 1000 ng/ml
    • 11. SOMX6 1000 ng/ml, kein Heparin
  • TABELLE 1 ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZIDENTITÄTSNUMMERN
    Figure 00100001
  • BEISPIEL 1
  • Humane cDNA-Klone
  • Die ursprüngliche SOM175-cDNA wurde isoliert, indem man eine humane fötale Himbibliothek (λzapII, Stratagene) mit dem Cosmid D11S750 (Larsson et al., 1992) durchmusterte. Das Plasmid wurde "in vivo" ausgeschnitten, und man erhielt eine einzelne 1,1 kb lange cDNA. Drei unabhängige SOM175-cDNA-Klone wurden auch aus einer humanen fötalen Milzbibliothek (Stratagene, Uni-zap) unter Verwendung des oben genannten SOM175-Inserts als eine Sonde isoliert. Man erhielt drei Klone: SOM175-4A, -5A und -6A. SOM175-5A ist ein alternativ gespliceter Klon, dem Exon 4 fehlt (SOM175-E4). Diese Bibliotheksdurchmusterungen wurden unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, die von dem Hersteller der Bibliothek (Stratagene) empfohlen wurden, und einem zufällig initiierten (random primed) Insert von SOM175 durchgeführt.
  • Zwei partielle humane SOM175-cDNAs wurden auch aus einer Bibliothek einer λGT11 humanen Melanomzellinie A2058 (Clontech) isoliert. cDNA-Bibliothekdurchmustenangen wurden unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, wie sie von Church und Gilbert, 1984, beschrieben wurden, durchgeführt. In jedem Fall wurde die Sonde durch zufällige Initiierung (random priming) eines PCR-Produkts, das aus SOM175 (18f-700r) erhalten wurde, erzeugt.
  • Maus-cDNA-Klone
  • Humanes SOM175 wurde auch dazu verwendet, eine neonatale Gesamthirn-cDNA-Bibliothek der Maus (Unizap, Stratagene) zu durchmustern. Es wurden vier nicht-chimäre Klone isoliert: M175-A, B, C, D. Alle Klone waren partielle cDNAs, und M175-C enthielt mehrere Introns. Dreien dieser cDNAs fehlte das Exon 6.
  • Ein weiterer Klon, der als M1 bezeichnet wird, wurde vollständig sequenziert, und man fand, daß er das vollständige offene Leseraster und einen Teil des 5'-UTR und den gesamten 3'-UTR enthielt.
  • BEISPIEL 2
  • DNA-SEQUENZANALYSE
  • Die gesamte Sequenz des cDNA-Klons (SOM175) wurde zusammengestellt und ist in 2 mit ihrer entsprechenden Aminosäuresequenz gezeigt. Diese Sequenz wurde hinsichtlich offener Leseraster unter Verwendung des MAP-Programms (GCG, University of Wisconsin) durchmustert. Ein einzelnes offenes Leseraster von 672 bp Länge wurde beobachtet (siehe 2). Es scheinen wenig 5'-untranslatierte Sequenzen (2 bp) vorhanden zu sein. Der 3'-untranslatierte Bereich scheint vollständig zu sein, da er ein Polyadenylierungssignal und einen Poly-A-Schwanz umfaßt.
  • Datenbankhomologierecherchen wurden unter Verwendung des BLAST-Algorithmus (durchgeführt beim NCBI, USA) durchgeführt. Diese Analyse offenbarte Homologie zu mehreren Säugerformen von VEGF (siehe 3). Das Ausmaß an Homologie zwischen SOM175 und humanem VEGF165 wurde unter Verwendung des BESTFIT-Programms (GCG, University of Wisconsin; siehe 4 und 5) bestimmt. Die Nukleotidhomologie wurde auf 69,7% eingeschätzt, und die Proteinhomologie wurde auf wenigstens 33,3% Identität und 52,5% Konservierung unter Anwendung von BESTFiT-Analyse eingeschätzt. BLAST-Analyse von Nukleotidsequenzen offenbarte die fast vollständige Übereinstimmung mit einer humanen exprimierten Sequenzmarkierung EST06302 (Adams of al., 1993).
  • Diese Daten zeigen, daß SOM175 einen Wachstumsfaktor codiert, der strukturelle Ähnlichkeiten zu VEGF besitzt. Beide Gene zeigen Start- und Stop-Codons an ähnlichen Positionen und teilen diskrete Homologieblöcke. Alle acht Cysteine sowie eine Anzahl anderer VEGF-Reste, von denen man annimmt, daß sie in Dimerisierung involviert sind, sind konserviert. Diese Reste sind Cystein-47, Prolin-70, Cystein-72, Valin-74, Arginin-77, Cystein-78, Glycin-80, Cystein-81, Cystein-82, Cystein-89, Prolin-91, Cystein-122 und Cystein-124 und sind in 6 gezeigt. Unter der gegebenen strukturellen Konservierung zwischen VEGF und dem SOM175-Genprodukt ist es auch möglich, daß sie funktionale Ähnlichkeiten gemeinsam haben. Es wird vorgeschlagen, daß SOM175 ein VEGF-ähnliches Molekül codiert, das einige Eigenschaften mit VEGF gemeinsam hat, aber auch selbst einzigartige Eigenschaften besitzt. Die Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von VEGF165 sind in 1 gezeigt.
  • BEISPIEL 3
  • Die prozentuale Ähnlichkeit und Abweichung zwischen der VEGF165-Familie und der SOM175-Familie (Protein) wurde unter Verwendung der Clustal-Methode, MegAlign-Software, DNASTAR, Wisconsin, analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2.1 und 2.2 gezeigt. Die alternativ gespliceten Formen von SOM175 sind auf SOM175-e6 verkürzt, wo das gesamte Exon 6 entfernt ist, auf SOM175-e6 und 7, wo die gesamten Exons 6 und 7 entfernt sind, und SOM175-e4, wo das gesamte Exon 4 entfernt ist. Die gesplicete Form von SOM175 ist in 7 gezeigt. Genomkarten von SOM175, welche Intron/Exon-Grenzen zeigen, sind in 8a und 8b dargestellt.
  • Tabelle 2.1 A Prozent Nukleotidähnlichkeit zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF165
    Figure 00120001
  • B Prozent Nukleotidabweichung zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF165
    Figure 00120002
  • Tabelle 2.2 A Prozent Aminosäureidentität zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF165
    Figure 00130001
  • B Prozent Aminosäureabweichung zwischen Splice-Varianten von SOM175 und humanem VEGF165
    Figure 00130002
  • BEISPIEL 4
  • BIOLOGISCHE TESTS ZUR BESTIMMUNG DER FUNKTION VON SOM175
  • Es werden Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob SOM175 ähnliche Aktivitäten wie VEGF in Bezug auf Endothelzellfunktion, Angiogenese und Wundheilung besitzt. Andere Tests werden auf der Grundlage der Ergebnisse von Rezeptorbindungsverteilungsstudien durchgeführt.
  • Tests der Endothelzellfunktion
  • Endothelzellproliferation. Endothelzellwachstumstests werden bei Ferrara & Henzel (1989) und bei Gospodarowicz et al. (1989) beschrieben.
  • Gefäßpermeabilitätstest. Dieser Test, welcher den Miles-Test in Meerschweinchen verwendet, wird durchgeführt, wie er bei Miles & Miles (1952) beschrieben wird.
  • Zelladhäsionstest. Der Einfluß von SOM175 auf die Adhäsion von polymorphkernigen Leukozyten an Endothelzellen wird analysiert.
  • Chemotaxis. Diese wird unter Verwendung des Standard-Boyden-Kammer-Chemotaxistests durchgeführt.
  • Plasminogenaktivatortest. Endothelzellen werden hinsichtlich Plasminogenaktivator- und Plasminogenaktivatorinhibitorproduktion nach Gabe von SOM175 getestet (Pepper et al. (1991)).
  • Endofhelzellmigrafionstesf. Die Fähigkeit von SOM175 zur Stimulation von Endothelzellen zu migrieren und Röhrchen auszubilden, wird getestet, wie es bei Montesano of al. (1986) beschrieben wird.
  • Angiogenesetest
  • SOM175-Induktion einer angiogenen Reaktion in Hühnchen-Chorioaliantoinmembran wird bestimmt, wie es bei Leung et al. (1989) beschrieben wird.
  • Mögliche neurotrophe Aktionen von SOM175 werden unter Verwendung der folgenden Tests untersucht:
  • Neuritenauswuchstest und Geninduktion (PC12-Zellen)
  • PC12-Zellen (einer Phaeochromocytoma-Zellinie) reagieren auf NGF und andere neurotrophe Faktoren durch Ausbildung der Charakteristika von sympathetischen Neuronen, einschließlich der Induktion von frühen und späten Genen und der Verlängerung von Neuriten. Diese Zellen werden SOM175 ausgesetzt und ihre Reaktion aufgezeichnet (Drinkwater of al. (1991), und Drinkwater et al. (1993)).
  • Kultivierte Neuronen aus dem peripheren Nervensystem (PNS)
  • Primäre Kulturen der folgenden PNS-Neuronen werden SOM175 ausgesetzt und hinsichtlich irgendeiner Reaktion beobachtet:
    • – Sensorische Neuronen von der Neuralleiste und Rückenwurzelganglien
    • – sympathetische Neuronen von sympathetischen Kettenganglien
    • – von Plakode abgeleitete sensorische Neuronen von nodösen Ganglien
    • – motorische Neuronen vom Rückenmark.
  • Die Tests sind bei Suter et al. (1992) und bei Marinou of al. (1992) beschrieben.
  • Wo eine in vitro Reaktion beobachtet wird, werden in vivo Tests hinsichtlich von Eigenschaften, wie Aufnahme und Rücktransport, durchgeführt, wie es bei Hendry et al. (1992) beschrieben ist.
  • Nervenregeneration (PNS)
  • Wo neurotrophe Effekte von SOM175 beobachtet werden, wird dessen mögliche Rolle bei der Regeneration von axotomisierten sensorischen Neuronen, sympathetischen Neuronen und motori schen Neuronen nach den Verfahren von Otto et al. (1989), Yip et al. (1984) und Hendry et al. (1976) analysiert.
  • Aktionen von SOM175 auf CNS-Neuronen
  • Die Fähigkeit von SOM175, das Überleben von Neuronen des zentralen Nervensystems zu fördern, wird analysiert, wie es bei Hagg et al. (1992), Williams et al. (1986), Hefti (1986) und Kromer (1987) beschrieben ist.
  • Wundheilung
  • Die Fähigkeit von SOM175, die Wundheilung zu unterstützen, wird in dem klinisch besonders relevanten verfügbaren Modell getestet, wie es bei Shilling et al. (1959) beschrieben und von Hunt et al. (1967) verwendet wird.
  • Das hämopoietische System
  • Eine Vielzahl von in vitro und in vivo Tests auf spezifische Zellpopulationen des hämopoietischen Systems ist verfügbar und nachfolgend angegeben:
    Stammzellen
    Maus
  • Eine Vielzahl neuer in vitro Maus-Stammzelltests wurde unter Verwendung von FACS-gereinigten Zellen entwickelt:
  • (a) Wiederbesiedelnde Stammzellen
  • Dies sind Zellen, die in der Lage sind, das Knochenmark von tödlich bestrahlten Mäusen wiederzubesiedeln, und sie besitzen den Phänotyp Lin, Rhhi, Ly-6A/E+, c-kit+. Die Testsubstanz wird auf diese Zellen entweder alleine oder durch gemeinsame Inkubation mit mehreren Faktoren, gefolgt von Messung der zellulären Proliferation durch 3N-Thymidin-Aufnahme, getestet.
  • (b) Spätstufenstammzellen
  • Dies sind Zellen, die eine vergleichsweise geringe Knochenmarkswiederbesiedelungsfähigkeit besitzen, die aber D13 CFU-S erzeugen können. Diese Zellen besitzen den Phänotyp Lin, Rhhi, Ly-6A/E+, c-kit+. Die Testsubstanz wird mit diesen Zellen für einen Zeitraum inkubiert, in tödlich bestrahlte Empfänger injiziert und die Anzahl an D13-Milzkolonien gezählt.
  • (c) Vorläuferangereicherte Zellen
  • Dies sind Zellen, die in vitro auf einzelne Wachstumsfaktoren reagieren und den Phänotyp Lin, Rhhi, Ly-6A/E+, c-kit+ besitzen. Dieser Test wird zeigen, ob SOM175 direkt auf hämopoietische Vorläuferzellen wirken kann. Die Testsubstanz wird mit diesen Zellen in Agar-Kulturen inkubiert und die Anzahl an Kolonien nach 7–14 Tagen gezählt.
  • Arteriosklerose
  • Glatte Muskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Initiation von Arteriosklerose, was eine Veränderung ihres Phänotyps von einem kontraktilen zu einem synthetischen Zustand erfordert. Makrophagen, Endothelzellen, T-Lymphozyten und Blutplättchen spielen alle eine Rolle bei der Entwicklung von arteriosklerotischen Plaques, indem sie das Wachstum und phänotypische Veränderungen von glatten Muskelzellen beeinflussen. Ein in vitro Test, der die proliferative Rate und phänotypische Veränderungen von glatten Muskelzellen in einer multizellulären Umgebung mißt, wird zur Untersuchung der Wirkung von SOM175 auf glatte Muskelzellen verwendet. Das System verwendet eine modifizierte Rose-Kammer, in welcher verschiedene Zelltypen auf gegenüberliegende Deckgläschen ausgesät werden.
  • Wirkungen von SOM175 auf Knochen
  • Die Fähigkeit von SOM175, die Proliferation von Osteoblasten zu regulieren, wird untersucht, wie es bei Lowe of al. (1991) beschrieben ist. Alle Wirkungen auf die Knochenresorption werden untersucht, wie es bei Lowe et al. (1991) beschrieben ist. Wirkungen auf Osteoblastenmigration und Veränderungen in intrazellulären Molekülen (z. B. cAMP-Ansammlung, Mengen an alkalischer Phosphatase) werden analysiert, wie es bei Midy et al. (1994) beschrieben ist.
  • Wirkungen auf Skelettmuskelzellen
  • Wirkungen von SOM175 auf die Proliferation von Myoblasten und die Entwicklung von Myotuben kann bestimmt werden, wie es von Ewton et al. (1980) und von Gospodarowicz et al. (1976) beschrieben wird.
  • BEISPIEL 5
  • KLONIERUNG VON MAUS-SOM175-DNA
  • Isolierung von cDNAs
  • Maus-SOM175- (mSOM175-) Klone wurden aus einer Lambda Zap-neugeborenen Gesamthirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene) selektiert. Primärer Phage von hochgradig dichten Filtern (5 × 104 pfu/Platte) wurden durch Hybridisierung mit einer 682 bp langen, mit 32P markierten Sonde identifiziert, die mittels PCR aus einer hVRF-cDNA (pSOM175) erzeugt wurde, wie es oben beschrieben ist. Hybridisierung und stringentes Waschen von Nylonmembranen (Hybond-N) wurden bei 65°C unter Bedingungen, die von Church und Gilbert (1984) beschrieben werden, durchgeführt. Positive Plaques wurden abgenommen, gereinigt und in vivo ausgeschnitten, um bakterielle Kolonien zu erzeugen, die cDNA-Klone in pBluescript SK- enthielten.
  • Isolierung von genomischen Klonen
  • Genomische Klone wurden aus einer Bibliothek des Mausstamms SV/129, kloniert in den Lambda Fix II-Vektor (Stratagene), isoliert. Hochgradig dichte Filter (5 × 104 pfu/Filter) wurden mit einer 563 bp langen, mit 32P markierten Sonde durchmustert, die mittels PCR-Vervielfältigung des Bereichs der Nukleotide 233–798 der mSOM175-cDNA erzeugt worden war (siehe 9). Positive Klone wurden gepfropft und erneut mit Filtern, die 400–800 pfu enthielten, durchmustert. Phagenpräparationen in großem Maßstab wurden unter Verwendung des QIAGEN Lambda-Kit oder durch ZnCl2-Reinigung (Santos, 1991) hergestellt.
  • Nukleotidsequenzierung und -analyse
  • cDNAs wurden auf beiden Strängen unter Verwendung einer Vielzahl von vektorbasierten und internen Primern mit Applied Biosystems Incorporated (ABI) Farbstoffterminator-Sequenzierungskits gemäß den Beschreibungen des Herstellers sequenziert. Sequenzen wurden auf einem automatisierten DNA-Sequenzierer ABI Modell 373A analysiert. Peptidhomologieabgleiche wurden unter Verwendung des Programms BESTFIT (GCG, Wisconsin) durchgeführt.
  • Identifizierung von Intron/Exon-Grenzen
  • Identifizierung von Exon-Grenzen und flankierenden Bereichen wurde unter Verwendung von PCR mit genomischer Maus-DNA oder genomischen Lambda-Klonen mSOM175 als Matrizen durchgeführt. Die in der PCR zur Identifizierung von Introns verwendeten Primer waren von der hSOM175-Sequenz abgeleitet, und um mögliche Mensch-Maus-Sequenzfehlpaarungen zuzulassen, wurden Annealingtemperaturen von 5–10°C unterhalb der bestimmten Tm eingesetzt. Alle PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektroforese hinsichtlich der Größe untersucht und unter Verwendung von QIAquick spin-Säulen (Qiagen) gelgereinigt, und die Intron/Exon-Grenzen wurden direkt von diesen Produkten sequenziert. Darüber hinaus wurden einige Splice-Verbindungen von subklonierten genomischen Fragmenten von mSOM175 sequenziert. Intron/Exon-Grenzen wurden durch Vergleichen von cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen identifiziert.
  • Northern-Analyse
  • Zelluläre Gesamt-RNA wurde von einer Gruppe von frischen, normalen Geweben von erwachsener Maus (Gehirn, Niere, Leber, Muskel) unter Verwendung des Verfahrens von Chomczynski und Sacchi (1987) hergestellt. 20 μg Gesamt-RNA wurden Elektroforese unterzogen, auf eine Nylonmembran (Hybond N, Amersham) überführt und unter Standardbedingungen hybridisiert (Church & Gilbert, 1984). Die Filter wurden bei 65°C in 0,1 × SSC (20 × SSC in 3 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat), 0,1% SDS gewaschen und Röntgenfilm mit Intensivierungsschirmen bei –70°C für 1–3 Tage exponiert.
  • Charakterisierung von mSOM175-cDNAs
  • Maus-SOM175-Homologe wurden durch Durchmusterung einer Maus-cDNA-Bibliothek mit einem hSOM175-cDNA-Klon isoliert. Fünf Klone mit Größen, die von 0,8–1,5 kb variierten, wurden gewonnen und sequenziert. Die cDNA-Sequenzen wurden unter Erhalt einer 1041 bp langen cDNA-Sequenz der vollen Länge zusammengestellt, welche das gesamte offene Leseraster (621 bp oder 564 bp, abhängig von der Splice-Form, siehe unten) und den 3'-UTR (379 bp) sowie 163 bp des 5'-UTR abdeckte (9).
  • Das vorhergesagte Initiations-Codon paßte zu der Position des Start-Codons in hSOM175. Ein anderes, außerhalb des Rasters liegendes ATG wurde bei Position -47 lokalisiert, und zwei Terminierungs-Codons wurden aufstromig (Positionen -9 bzw. -33) und im Raster mit dem mutmaßlichen Initiations-Codon beobachtet.
  • Das vorhergesagte N-terminale Signalpeptid von hSOM175 scheint in mSOM175 mit 81% Identität (17/21 Aminosäuren) vorhanden zu sein. Man erwartet, daß eine Peptidspaltung in mSOM175 nach Rest 21 stattfindet (10). Diese Daten legen nahe, daß reifes mSOM175 ausgeschieden wird und daher vorstellbar als ein Wachstumsfaktor funktionieren könnte.
  • Wie bei hSOM175 wurden zwei offene Leseraster (ORFs) in cDNAs, die durch Bibliothekdurchmusterung isoliert wurden, festgestellt. Für vier von fünf Klonen wurde gefunden, daß sie alternativ gesplicet werden und ihnen ein zu Exon 6 von hSOM175 homologes, 101 bp langes Fragment fehlt. Die vorhergesagte Peptidsequenz der zwei Isoformen von mSOM175 wurde bestimmt und mit den entsprechenden humanen Isoformen abgeglichen (10).
  • Die Botschaft, die mSOM175186 codiert, enthält einen 621 bp langen ORF mit codierenden Sequenzen, die bei Position +622 in Richtung des Endes von Exon 7 enden (9). Die kleinere Botschaft, die mSOM175167 codiert, endet abstromig zu der +622 TAG-Stelle aufgrund einer Rasterverschiebung, die aus dem Heraussplicen des 101 bp langen Exon 6 und die Einfügung eines Stop-Codons (TGA) an Position +666 in der Nähe des Anfangs von Exon 8 resultiert (9).
  • Das mSOM175186-Protein besitzt starke Homologie zu den aminoterminalen und zentralen Abschnitten von VEGF, wogegen das Carboxylende vollständig abweicht und reich an Alanin ist. mSOM175167 zeigt diese Ähnlichkeiten und behält auch Homologie zu mVEGF bis über den C-Terminus bei (11). Die Gesamthomologie von mSOM175167 zu hSOM175167 betrug 85% Identität bzw. 92% Ähnlichkeit (10). In gleicher Weise betrug die Homologie zwischen mSOM175167 und mVEGF (Breier et al., 1992) 49% Identität bzw. 71% konservativer Aminosäureaustausch (11).
  • Ein kanonisches Vertebratenpolyadenylierungssignal (AATAAA) (Birnstiel et al., 1986) war in der mSOM175-cDNA nicht vorhanden, jedoch ist die eng übereinstimmende Sequenz GATAAA an gleichen Positionen sowohl in Maus- als auch Mensch-SOM176-cDNAs vorhanden (9). Im Gegensatz zu hSOM175 hat man gefunden, daß mSOM175 eine AC-Dinukleotidwiederholung an dem äußersten 3'-Ende des 3'-UTR (Nukleotidpositionen 998–1011, 9) enthält. Ein Polymorphismus dieser Wiederholungsregion wurde zwischen einigen der mSOM175-cDNAs beobachtet, wobei die Anzahl an Dinukleotiden von 7–11 variierte.
  • Genomische Charakterisierung von mSOM175
  • Intron/Exon-Grenzen (Tabelle 3) wurden unter Verwendung von Primern, welche Sequenzen flankierten, die zu den entsprechenden hSOM175-Grenzen homolog waren, kartiert. Introns I, III, IV und VI von mSOM175 (Tabelle 3, 12) waren kleiner als die hSOM175-Zwischensequenzen. Die vollständige genomische Sequenz wurde von dem 5'-UTR von mSOM175 über das Intron VI, den größten dazwischen liegenden Bereich (2,2 kb), durch Sequenzierung von vervielfältigten Introns und klonierten genomischen Bereichen von mSOM175 zusammengestellt. Es gab nur einen Hauptunterschied in der genomischen Struktur zwischen mSOM175 und hSOM175, und das war, daß die Exon 7/Intron VI-Grenze von mSOM175 10 bp weiter abstromig in Bezug auf die cDNA-Sequenz lokalisiert war, da Exon 7 in mSOM175 10 bp länger ist als das entsprechende Exon in hSOM175.
  • Exons 6 und 7 sind in mSOM175 benachbart, und es wurde gefunden, daß sie in dem humanen Homologen vorkommen. Die starke Sequenzhomologie zwischen Exon 6 von mSOM175 und hSOM175 (10) legt nahe, daß diese Sequenz keine zurückbehaltene Intron-Sequenz ist, sondern eher einen funktionalen Teil der SOM175186-Isoform codiert.
  • Eine allgemeine Intron/Exon-Struktur ist zwischen den verschiedenen Mitgliedern der VEGF-Genfamilie (VEGF, PIGF, hSOM175) konserviert, und daher ist es nicht überraschend, daß die gesamte genomische Organisation des mSOM175-Gens zu diesen Genen sehr ähnlich ist (12).
  • Frühere vergleichende Kartierungsstudien haben gezeigt, daß der Bereich, welcher den Lokus für humane multiple Endokrinneoplasie-Typ I-Erkrankung auf Chromosom 11q13 umgibt, mit dem proximalen Abschnitt des Maus-Chromosoms 19 vergleichbar ist (Rochelle et al., 1992). Da die Erfinder das hSOM175-Gen innerhalb von 1 kb des humanen MEN1-Lokus (siehe oben) kartiert haben, ist es sehr wahrscheinlich, daß das Maus-SOM175-Gen in der Nähe des Zentromers von Chromosom 19 kartiert.
  • Expressionsstudien von mSOM175
  • Northern-Analyse von RNA von Geweben von erwachsener Maus (Muskel, Herz, Lunge und Leber) zeigte, daß Expression ubiquitär zu sein scheint und in erster Linie als eine Hauptbande mit einer Größe von etwa 1,3 kb auftritt (14). Dies ist etwas unterschiedlich zu dem Muster, das man für hSOM175 beobachtet, in welchem zwei Hauptbanden von 2,0 und 5,5 kb in allen untersuchten Geweben identifiziert wurden. Die 1,3 kb Botschaft der Maus entspricht voraussichtlich dem kürzeren der humanen Transkripte, und die Größenvariation davon ist mit höchster Wahrscheinlichkeit auf einen Unterschied in der Länge der entsprechenden 5'-UTRs zurückzuführen.
  • BEISPIEL 6
  • EXPRESSION VON MAUS-SOM175 IN PRÄ- UND POSTNATALER MAUS
  • Tiere
  • Zeitlich angepaßte (n = 4) und junge erwachsene (n = 2) Mäuse (C57 Zuchtstamm, ALAB, Schweden) wurden mit Kohlendioxid getötet, und die relevanten Gewebe wurden entnommen und an einem Wurf eingefroren. Die Gewebe wurden bei –70°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Zwei Schwangerschaftsalter wurden in dieser Untersuchung verwendet; Embryonaltag 8 (E8), 14 und E17.
  • In situ Hybridisierungshistochemie
  • In situ Hybridisierung wurde durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde (Dagerlind et al., 1992). Kurzgefaßt wurden Querschnitte (14 μm) in einem Cryostaten (Microm, Deutschland) geschnitten, auf Probe-On-Trägern (Fisher Scientific, USA) aufgetaut und in schwarzen abgedichteten Behältern bei –70°C gelagert, bis sie verwendet wurden. Die Sequenzen der synthetischen 42-meren Oligonukleotide, die zu mSOM175 codierender mRNA komplementär waren, waren ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG [SEQ ID NO: 11] (komplementär zu nt 120–161) und AGTTGTTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC [SEQ ID NO: 12] (komplementär zu nt 162–203). Zur Detektion der zwei alternativen Splice-Formen wurden die Oligonukleotide GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG [SEQ ID NO: 13] (komplementär zu nt xxx-xxx) und GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT [SEQ ID NO: 14] verwendet. Die Sonden wurden an dem 3'-Ende mit Desoxyadenosin-alpha-[thiojtriposphat-[35S] (NEN, USA) unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase (IBI, USA) bis zu einer spezifischen Aktivität von 7–10 × 108 cpm/μg markiert und an die Abschnitte ohne Vorbehandlung für 16–18 Stunden bei 42°C hybridisiert. Das Hybridisierungsgemisch enthielt folgendes: 50% v/v Formamid, 4 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), 1 × Denhardts-Lösung Qeweils 0,02% Polyvinylpyrrolidon, BSA und Ficoll), 1% v/v Sarcosyl (N-lauroylsarcosin; Sigma), 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), 10% w/v Dextransulfat (Pharmacia, Schweden), 250 μg/ml Hefe-tRNA (Sigma), 500 μg/ml gescherte und hitzedenaturierte Lachssperma-DNA (Sigma) und 200 mM Dithiothreitol (DTT; LKB, Schweden). In Kontrollabschnitten wurde die Spezifität beider Sonden durch Zugabe eines 20-fachen Überschusses an unmarkierter Sonde zu dem Hybridisierungsgemisch überprüft. Zusätzlich wurden benachbarte Abschnitte mit einer zu dieser Untersuchung nicht in Zusammenhang stehenden Sonde hybridisiert, welche ein unterschiedliches Expressionsmuster lieferte. Nach der Hybridisierung wurden die Abschnitte mehrere Male in 1 × SSC bei 55°C gewaschen, in Ethanol dehydratisiert und in NTB2 Nuclear Track-Emulsion (Kodak, USA) eingetaucht. Nach 3–5 Wochen wurden die Abschnitte in D-19-Entwickler (Kodak, USA) entwickelt und mit Deckgläsern versehen. In einigen Fällen wurden die Abschnitte vor dem Eintauchen in Emulsion einem autoradiographischen Film (Beta-max Autoradiographiefilm, Amersham Ltd., UK) ausgesetzt.
  • Die vier verschiedenen Sonden lieferten in allen untersuchten Geweben identische Hybridisierungsmuster. Maus-SOM175-Expression wurde bereits in dem E8-Embryo detektiert, in welchem ein positives Signal in Strukturen aufgezeichnet wurde, die höchstwahrscheinlich der neuronalen Röhre entsprechen. In sagittalen Abschnitten von E14-Mausembryo war das stärkste Hybridisierungssignal im Herzen und in dem Nervensystem, insbesondere der cerebralen Hirnrinde vorhanden (14A). Ein niedriges Expressionsniveau war in allen anderen Geweben vorhanden. Bei einem späteren Schwangerschaftsalter, E17, war ein hohes mSOM175-mRNA-Signal auf das Herz und braunes Fettgewebe im Rücken und um den Nacken herum begrenzt (14B). Deutlich positive Hybridisierungssignale waren in dem Grauen des Rückenmarks und in der Zunge vorhanden (14B). Expression in der cerebralen Hirnrinde war deutlich reduziert gegenüber Tag 14. Die schwache Hintergrundexpression, die man in dem E14-Embryo z. B. im Muskel sah, hatte zu diesem Schwangerschaftsalter abgenommen. Ein starkes mSOM175-mRNA-Hybridisierungssignal war alleine im Herzen und in dem braunen Fett in den jungen erwachsenen Mäusen vorhanden (14C). Das Signal in dem Herzen war gleichmäßig über die gesamte Ventrikelwand, einschließlich den Papillarmuskeln verteilt (14D). In Schnitten von Herzgewebe, das mit einem Überschuß an kalter Sonde hybridisierte, wurde keine spezifische Markierung über dem Hintergrundsignal aufgezeichnet (14E).
  • Neben dem Herzen war das mSOM175-mRNA-Signal in verschiedenen Geweben an der Außenseite des Brustkorbs, welches braunem Fett morphologisch ähnlich war, vorhanden. Dies wurde durch Sudan-Schwarz-Gegenfärbung verifiziert, welche eine starke Färbung in den gleichen Bereichen zeigte (15A und 15B). In Querschnitten von Rückenmark von erwachsener Maus lieferten die mVRF-Sonden ein neuronales Färbungsmuster in der grauen Substanz (15C). Gegenfärbung mit Toluidin (15D) zeigte, daß motorische Neuronen in dem Vorderhorn (15C und 15D), zwischen Neuronen (15C) in dem tiefen Teil des Hinterhorns und um den zentralen Kanal herum in einem großen Ausmaß positiv hinsichtlich mSOM175-mRNA waren.
  • BEISPIEL 7
  • WIRKUNGEN VON VEGF UND SOM175-PROTEINEN AUF SENSORISCHE NEURONEN VON HÜHNCHEN
  • Die Wirkungen von VEGF und SOM175-Proteinen auf embryonische sensorische Neuronen von Hühnchen am Tag 8 wurden unter Verwendung der Methode von Nurcombe et al. (1992) bestimmt. Der neuronale Test wurde nach 48 Stunden unter Verwendung von 2000 Zellen pro Testgefäß ausgewertet. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von 3H-Thymidinzählern erhalten. Der Prozentsatz des Überlebens von Neuronen, Neuritenauswuchs und durchschnittlicher Neuritenlänge in μm wurde unter Verwendung von NGF als Positivkontrolle und verschiedenen Konzentrationen an VEGF, VEGF in der Gegenwart von Heparin und VEGF in der Gegenwart von Heparin und 5 μM 5'-Fluorouracil (5FU) bestimmt. 5FU tötet Gliazellen.
  • Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß VEGF für die Förderung von neuronalem Überleben wirksam ist, daß dies aber die Gegenwart von Gliazellen erfordert. 17 zeigt die Ergebnisse der Wirkung von VEGF und SOM175 auf drei Typen von Hühnchenglia. Die getesteten Glia waren CNS-Glia, periphere Glia und CNS-Oligodendrozyten. Heparin wurde mit 10 μg/ml in sämtlichen Kulturen eingesetzt, und der Test wurde nach 24 Stunden ausgewertet. Ergebnisse wurden in 3H-Thymidinzählern unter Verwendung von 2000 Zellen pro Gefäß gemessen.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß für zentrale und periphere Neuronen von Hühnchen Astroglia durch SOM175 in der Gegenwart von Heparin deutlich zur Proliferation stimuliert wurden, aber daß Hühnchenoligodendrozyten eine vernachlässigbare Zunahme in der Teilungsrate zeigten.
  • BEISPIEL 8
  • WIRKUNGEN VON SOM175-PROTEINEN AUF PRIMÄRE UND ZENTRALE NEURONEN DER MAUS
  • Die Ergebnisse in Beispiel 7 zeigen, daß die VEGF-Isoform eine Wirkung auf primäre und zentrale Neuronen des Hühnchens durch die Wirkung der astroglialen Zellen hatte. Ähnliche Experimente wurden in Mauszellen wiederholt.
  • Kulturbedingungen
  • Neuronale und Gliazellen wurden für alle in vitro Experimente präpariert und kultiviert gemäß den Techniken, die in "Methods in Neurosciences (Band 2): Cell Culture" Ed. P. M. Conn, Academic Press, San Diego, 1990, S. 33–46 für Astrogliazellen, S. 56–74 für Oligodendrogliazellen und S. 87– 102 für zentrale Neuronen beschrieben sind.
  • Zellen wurden auf 24-Well Kulturbereiche (Nunc) plattiert, die mit Poly-L-omithin (0,1 mg/ml, 1 h) beschichtet waren, mit einer Dichte von 2000 Zellen/Well. Nach 48 Stunden in Kultur wurden die Neuronen in den Wells unter Inversionsphasenlicht gezählt, wobei gut etablierte Techniken verwendet wurden (Maruta et al., 1993), und Gliazellen mit [3H]-Thymidinaufnahme zur Aufzeichnung von Zellteilungsraten untersucht, wie nachfolgend beschrieben. Heparin (10 μg/ml, Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht, Sigma Chemical Corp.) war zu jeder Zeit in den Kulturmedien vorhanden, wenn es nicht anders angegeben ist. Die neuronalen Kulturen waren mit 5 mM 5-Fluoro-2-desoxyuridin (Sigma) zur Unterdrückung von glialem Hintergrundwachstum versetzt.
  • 3H-Thymidin-Einbautest für Gliazellproliferation
  • Die Zellen wurden für 14 Stunden mit 3H-Thymidin (spezifische Aktivität: 103 μCi/μg) aus einer Stammkonzentration von 0,1 mCi/ml in Standardmedium unter Erhalt eines Inkubationsendvolumens von 20 μl/Well gepulst. Die Inhalte der Wells wurden geerntet und auf Nitrozellulosepapier (Titertek, Flow) absorbiert. Restliche anhaftende Zellen wurden durch Inkubation mit Trypsin/Versen (CSL Limited, Victoria, Australien) für 5 Minuten entfernt. Dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt. Die Nitrozellulosescheiben wurden in einem Standard-Titertek-Ernter (Flow) unter Verwendung von zuerst destilliertem Wasser und dann Methanol gewaschen. Die Nitrozellulosescheiben wurden getrocknet, Szintillationsflüssigkeit (enthaltend 5% v/v Triton-X) wurde hinzugegeben, und die Scheiben wurden auf einem Szintillationszähler ausgezählt.
  • Die größte Aktivität fand man bei Präparationen von SOM175, dem Exon 6 fehlte (SOMΔX6), auf Maus-Astrogliazellkulturen, wo es eine signifikante Stimulation ihrer Proliferation gab, wenn es in Verbindung mit Heparin verabreicht wurde (16). Wenig Stimulation wurde der Proliferation von Oligodendrogliazellen verliehen (17), und eine sehr gering wahrnehmbare Potenzierung der Überlebensreaktion von isolierten Vorderhirnneuronen (18). Die Standardabweichung in allen drei Diagrammen für jeden Punkt betrug weniger als 8%.
  • Die Überlebensfähigkeit von Neuronen kann aufrechterhalten werden, indem man Gliazellproliferation fördert. Darüber hinaus ist SOMΔX6 ein guter Induktor für Astrogliaproliferation und kann in Verbindung mit der Ausbildung von Astrogliaendknöpfen an Endothelzellen des zentralen Nervensystems exprimiert werden.
  • TABELLE 3 Splice-Verbindungen des Maus-SOM175-Gens
    Figure 00230001
  • Groß- und Kleinbuchstaben bezeichnen Exon- bzw. Intron-Sequenzen.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (19)

  1. Isoliertes Polypeptid, welches wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (i) eine Fähigkeit, Proliferation von vaskulären Endothelzellen zu induzieren, (ii) eine Fähigkeit, mit Rezeptoren der Familie flt-1/flk-1 in Wechselwirkung zu treten, und/oder (iii) eine Fähigkeit, Zellmigration, Überleben von Zellen und/oder eine Erhöhung intrazellulärer Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren, wobei das Polypeptid folgendes umfaßt: (a) eine Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 3 angegeben ist, oder eine Nukleotidsequenz, welche über die volle Länge von SEQ ID NO: 3 oder dessen komplementäre Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden hybridisiert, oder (b) eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, oder eine verkürzte Form dieses Polypeptids, welche wenigstens eine der Eigenschaften (i)–(iii) aufweist.
  2. Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 angegeben ist.
  3. Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 angegeben ist.
  4. Isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid menschlichen Ursprungs ist.
  5. Isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, astrogliale Proliferation zu induzieren.
  6. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche codiert.
  7. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, welches die Nukleotidsequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 angegeben ist.
  8. Isolierter neutralisierender Antikörper gegen das Polypeptid, welches von dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 oder 7 codiert wird.
  9. Isolierter neutralisierender Antikörper gegen das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren das Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert, in einem geeigneten Wirt, der unter für die Synthese des Polypeptids wirksamen Bedingungen gezüchtet wird, umfaßt.
  11. Antisense-Molekül, welches über die volle Länge eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 6 oder 7 oder dessen Komplementäres hybridisiert.
  12. Zusammensetzung mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
  13. Verwendung eines Polypeptids, welches wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (i) eine Fähigkeit, Proliferation von vaskulären Endothelzellen zu induzieren, (ii) eine Fähigkeit, mit Rezeptoren der Familie flt-1 /flk-1 in Wechselwirkung zu treten, und/oder (iii) eine Fähigkeit, Zellmigration, Überleben von Zellen und/oder eine Erhöhung intrazellulärer Mengen an alkalischer Phosphatase zu induzieren, wobei das Polypeptid folgendes umfaßt: (a) eine Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 angegeben ist, oder einer Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, mit SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 oder deren komplementärer Form unter hochstringenten Bedingungen von 0,1–1 × SSC/0,1% w/w SDS bei 60°C für 1–3 Stunden zu hybridisieren, oder (b) eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10 angegeben ist, oder eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 70% Ähnlichkeit dazu oder eine verkürzte Form dieses Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Induzierung astroglialer Proliferation in einem Säuger.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Nukleotidsequenz codiert wird, wie sie in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 angegeben ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 angegeben ist.
  16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Polypeptid oder die Nukleotidsequenz, welche dieses codiert, menschlichen Ursprungs ist.
  17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Polypeptid codiert, wie es in einem der Ansprüche 13 bis 16 definiert ist, für die Herstellung eines Medikamentes zur Induzierung astroglialer Proliferation in einem Säuger.
  18. Wirtszelle, welche ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7 umfaßt.
  19. Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7 umfaßt.
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