DE69622575T2

DE69622575T2 - Photovernetztes hyaluronsäuregel und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE69622575T2
Application number: DE69622575T
Authority: DE
Inventors: Kenji Miyamoto; Michinori Waki
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1995-11-15
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2016-11-15
Also published as: NO982212L; HK1015799A1; WO1997018244A1; AU722250B2; ES2179215T3; EP0861270B1; EP0861270A1; CN1098863C; CN1207744A; NO982212D0; CA2237192C; KR19990067621A; JP3439481B2; DE69622575D1; RU2197501C2; HUP0000390A3; ATE221086T1; JPH11512778A; CA2237192A1; HUP0000390A2

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft ein biokompatibles, lichtgehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das ein Hydrogel mit spezifischen physikalischen Eigenschaften ist, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendungen als biomedizinische Materialien.

Stand der Technik

Hyaluronsäure existiert in tierischen Geweben und weist eine Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit auf. Im Hinblick auf die physikalischen Eigenschaften weist es ausgezeichnete Eigenschaften wie stark wasserabsorbierende Eigenschaft auf, und die wäßrige Lösung davon hat eine hohe Viskosität.
Ein Hydrogel wird durch chemisches Modifizieren von Hyaluronsäure, Vernetzen der modifizierten Hyaluronsäure durch einige Verfahren, unter Bildung einer Netzwerkstruktur, und Einfügen eines wäßrigen Mediums wie Wasser in die Netzwerkstruktur erhalten. Das Hydrogel zeigt Viskoelastizität ebenso wie eine Viskosität.
Die vernetzte Hyaluronsäure bildet offensichtlich Makromoleküle unabhängig von der Bindeart. Die Bioabbaubarkeit der vernetzten Hyaluronsäure kann durch Einstellen des Vernetzungsgrades gesteuert werden. Es gibt verschiedene Vernetzungsarten. Z.B. sind als Vernetzungsart unter Verwendung einer hydrophoben Bindung oder einer ionischen Bindung eine Vernetzung von Hyaluronsäure durch Einführen eines nukleophilen Reagens darin (JP-W-3-502704 (entspricht US-Patent 4 937 270), der Ausdruck "JP-W", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine nicht geprüfte veröffentlichte internationale Patentanmeldung), eine Vernetzung über eine hydrophobe Bindung durch Veresterung von Hyaluronsäure (US-Patent 4 851 521) und eine Vernetzung über eine ionische Bindung durch polyvalente Ionen (EP 0507604 A2) bekannt. Da sie durch eine schwache Bindungskraft im Vergleich zu einer kovalenten Bindung vernetzt werden, sind sie für Einflüsse durch externe Veränderungen wie pH, ionische Stärke, Temperatur und dgl. anfällig. Wenn sie als biomedizinische Materialien verwendet werden, ist zusätzlich die Verweilzeit im lebenden Körper kurz, und es ist schwierig, die Verweilzeit im Körper angemessen zu steuern, um so die physiologischen Wirkungen von Hyaluronsäure für den Körper aufrecht zu erhalten.
Als Vernetzungsart zum Binden von Hyaluronsäure-Molekülen durch eine kovalente Bindung sind eine Vernetzung über Divinylsulfon (JP-B-4-30691 (entspricht US-Patent 4 582 865), der Ausdruck "JP-B", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine geprüfte japanisches Patentveröffentlichung) und eine Vernetzung über ein Epoxid (JP-W-61-502729 (entspricht US-Patent 4 886 787), JP-A-5-140201, der Ausdruck "JP-A", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung) bekannt. Jedoch sind die Vernetzungsmittel oder die Vernetzungsverbindungen, die für diese Vernetzungen verwendet werden, toxisch. Darüber hinaus setzt sich eine dreidimensionale Netzwerkstruktur durch gleichzeitiges Vernetzung zusammen, wenn Divinylsulfon, Epoxid oder dgl. in Hyaluronsäure eingeführt werden, und das gebildete, vernetzte Hyaluronsäuregel wird in einem Lösungsmittel wie Wasser oder dgl. unlöslich gemacht. Nichtreagierte niedermolekulare Verbindungen, die somit in die Netzwerkstruktur eingeführt sind, sind schwierig zu trennen und zu entfernen.
Auf der anderen Seite ist ebenfalls eine Vernetzung von Hyaluronsäure durch eine photohärtende Vernetzungsreaktion durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen (JP-A-6-73102 (entspricht US-Patent 5 462 976), ASAIO Journal, 38, M154-M157 (1992) bekannt. Diese Vernetzungsart hat die Vorteile, daß ein photoreaktives Hyaluronsäure-Derivat, in das eine photoreaktive Vernetzungsgruppe eingeführt wird, vor der photohärtenden Vernetzung wasserlöslich ist, und eine dreidimensionale Netzwerkstruktur wird nicht zu dieser Zeit gebildet, so daß nicht reagierte, niedermolekulare Verbindungen leicht entfernt werden können; die Photoreaktion selbst ist eine saubere Reaktion, die ein photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäure-Derivat ergibt, das frei von nicht-reagierten niedermolekularen Verbindungen ist; und die resultierende vernetzte Struktur wird durch eine kovalente Bindung gebildet, so daß die Steuerung der Verweilzeit des photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäure-Derivates leicht durch Steuern des Vernetzungsgrades durchgeführt werden kann.
Zur Verwendung des oben beschriebenen photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäure-Derivates für biomedizinische Materialien, z.B. antiadhäsive Materialien, wurden solche mit einer filmartigen Form untersucht (ASAIO Journal, 38, MI154-M157 (1992)), aber es war schwierig, Adhäsionen in feinen Teilen von Geweben oder Organen verhindern. Somit ist ein injizierbares photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das in eine solche feine Stelle injiziert werden kann, gewünscht.
Jedoch sind ein Hydrogel aus einer photogehärteten vernetzten Hyaluronsäure und Verfahren zu dessen Herstellung, wie es in der Erfindung offenbart wird unbekannt.
Bei einem konventionellen, vernetzten Hyaluronsäurehydrogel kann eine Verunreinigung wie nicht-reagierte niedermolekulare Verbindungen und dgl. schlecht entfernt werden und die physikalischen Eigenschaften des Hydrogels können schwierig gesteuert werden. Weiterhin war es schwierig, Bedingungen zur Herstellung eines Hydrogels mit den gewünschten physikalischen Eigenschaften anzugeben.

Offenbarung der Erfindung

Ein erstes Ziel dieser Erfindung liegt darin, ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel mit einem wäßrigen Medium, das durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen von einem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivat, in das die photoreaktive Vernetzungsgruppe eingeführt wird, und durch Dimerisierung der wechselseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen unter Bildung eines Cyclobutan-Ringes und somit unter Bildung einer Netzwerkstruktur erhalten wird, und Verfahren zur leichten Herstellung des beschriebenen Gels anzugeben.
Ein zweites Ziel dieser Erfindung liegt darin, ein injizierbares biomedizinisches Material anzugeben, umfassend ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das eine ausgezeichnete Sicherheit, Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit aufweist.
Als Ergebnis von intensiven Studien haben diese Erfinder die obigen Ziele durch folgende Erfindung vollendet:
1) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel mit einem Lagerungsmodul (G') von 50 bis 1500 Pa, einem Verlustmodul (G") von 10 bis 300 Pa und einem Tangens delta (G"/G') von 0,1 bis 0,8 bezüglich der dynamischen Viskoelastizität, gemessen durch ein Rheometer unter folgenden Bedingungen:

Meßverfahren:

Oszillations-Testverfahren, Beanspruchungskontrolle, Meßtemperatur: 37ºC, Meßgeometrie: 4 cm, Zwischenraum: 800 um, Frequenz: 10 Hz und
das ein Hydrogel ist, erhalten durch Bestrahlung eines photohärtenden Hyaluronsäure-Derivates, worin ein Zimtsäure-Derivat mit einem Abstandshalter chemisch an eine funktionelle Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen, um das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat zu dimerisieren, unter Bildung von Cyclobutan-Ringen und unter Bildung einer Netzwerkstruktur und wobei das Gel ein injizierbares Hydrogel mit einem wäßrigen Medium in der Netzwerkstruktur ist.
2) Photohärtendes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das oben erwähnt ist, mit einem Vernetzungsausmaß von 0,01 bis 0,5% pro Mal einer Disaccharid-Komponenteneinheit aus der Hyaluronsäure
und das ein Hydrogel ist, erhalten durch Bestrahlen eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates, worin eine photoreaktive Vernetzungsgruppe chemisch mit einer funktionellen Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen und Vernetzen von gegenseitig photoreaktiven Vernetzungsgruppen.
3) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das oben erwähnt ist, mit einer Wasserabsorption von 2 000 bis 15 000%, die wie folgt definiert wird:
Wasserabsorption (%) = Gewicht des absorbierten Wassers/Gewicht des trockenen Gels · 100, und
das ein Hydrogel ist, erhalten durch Bestrahlen eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates, worin eine photoreaktive Vernetzungsgruppe chemisch an eine funktionelle Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen, und Vernetzen der gegenseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen.
4) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der obigen Punkte 1) bis 3), worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe ein Zimtsäure-Derivat mit einem Abstandshalter ist und chemisch an eine funktionelle Gruppe von Hyaluronsäure bindet, unter Erhalt des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates;
wobei die gegenseitig photoreaktiven vernetzenden Gruppen des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen dimerisiert werden, unter Bildung eines Cyclobutan-Ringes und unter Bildung einer Netzwerkstruktur; und
wobei das Gel ein Hydrogel ist, das ein wäßriges Medium in der Netzwerkstruktur umfaßt.
5) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach obigem Punkt 4), worin der Abstandshalter eine Gruppe ist, die von einem Aminoalkohol, einer Aminosäure oder einem Peptid abstammt.
6) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach dem obigen Punkt 4) oder 5), worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe durch die folgende Formel (1) oder (2) dargestellt wird:
-NH(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (1)
worin R¹ und R² jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind; Ph eine Phenyl-Gruppe ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 18 ist;
-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2)
worin R³ eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe ist, A -(NHCR&sup4;R&sup5;CO)m- oder -NH(CR&sup4;R&sup5;)hCO- ist, R&sup4; und R&sup5; jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten; -Ph- eine para-Phenylen-Gruppe ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und h eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist.
7) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 6), worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe in einem Anteil von 0,05 bis 10% pro Mol Disaccharid-Bestandteilseinheit eingeführt ist.
8) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 7), worin sich an die Bestrahlung eine weitere Wärmebehandlung anschließt.
9) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, nach einem der obigen Punkte 1) bis 8), das ein Hydrogel ist, erhalten durch Wärmebehandlung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates und anschließende Bestrahlung des erwärmten photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates mit Ultraviolettstrahlen und Vernetzen von gegenseitig photoreaktiven Vernetzungsgruppen.
10) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 9), das ein Hydrogel ist, erhalten durch Wärmebehandlung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates und anschließende Bestrahlung des erwärmten photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates mit Ultraviolettstrahlen und Vernetzung von wechselseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen und dann durch eine erneute Wärmebehandlung des vernetzten Produktes.
11) Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 10), worin der Endotoxin-Gehalt des Gels 0,25 Entotoxin- Einheiten (EU)/g oder weniger ist.
12) Verfahren zur Erzeugung des photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels nach einem der obigen Punkte 1) bis 11) umfassend:
Bestrahlen einer wäßrigen Mediumlösung mit 0,5 bis 10 Gew.-% eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates, worin eine photoreaktive Vernetzungsgruppe chemisch an eine funktionelle Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen, und
Bildung einer intermolekularen und/oder intramolekularen Vernetzung durch Dimerisierung der wechselseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen, unter Erhalt einer Netzwerkstruktur.
13) Verfahren zur Herstellung eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels nach Punkt 12), worin eine Wärmebehandlung vor und/oder nach der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen der wäßrigen Mediumlösung aus dem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivats durchgeführt wird.
14) Verfahren zur Herstellung eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels nach Punkt 13), worin die Wärmebehandlung bei 100 bis 125ºC für 5 bis 30 Minuten unter Hochdruckdampf durchgeführt wird.
15) Biomedizinisches Material, umfassend das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 11).
16) Biomedizinisches Material nach Punkt 15), mit einer antiadhäsiven Wirkung.
17) Biomedizinischer Material-Kit, umfassend ein vernetztes Hyaluronsäuregel und einen Behälter, der dieses Gel in einem solchen Zustand enthält, daß es herausgenommen werden kann, worin der Behälter ein Behälter ist, der das Gel für die Injektion herausstoßen kann.
18) Biomedizinischer Material-Kit, umfassend das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel nach einem der Punkte 1) bis 11) und einen Behälter, der das Gel in einem solchen Zustand enthält, daß es herausgenommen werden kann.
19) Biomedizinischer Material-Kit nach Punkt 18), worin der Behälter ein Behälter ist, der das Gel für die Injektion herausstoßen kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Zeichnung, die ein Konzept der photohärtenden Vernetzung in einer photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivatlösung zeigt.
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen DS (Substitutionsgrad) und Wasserabsorptionsverhältnis eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels zeigt.

Beste Art zur Durchführung der Erfindung

Diese Erfindung wird detailliert erläutert.
Der Ausdruck "photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäure-Derivat", wie er erfindungsgemäß verwendet wird, soll ein Derivat als Konzept umfassen, erhalten durch Bestrahlen eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates, worin eine photoreaktive Vernetzungsgruppe chemisch gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen und Dimerisierung der gegenseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen, zum Vernetzen des Hyaluronsäure-Derivates zur Bildung einer Netzwerkstruktur. Der Ausdruck "photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel", wie er erfindungsgemäß verwendet wird, bedeutet Hydrogele als Konzept, umfassend ein wäßriges Medium, wie Wasser, einen Puffer, physiologische Saline, gepufferte physiologische Saline, eine wäßrige Lösung mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel und dgl. als Dispersionsmedium in der Netzwerkstruktur (dreidimensionale Netzwerkstruktur) der photogehärteten vernetzten Hyaluronsäure (nachfolgend einfach mit "Gel dieser Erfindung" bezeichnet). Der Ausdruck funktionelle Gruppe von Hyaluronsäure, wie er hierin verwendet wird, soll funktionelle Gruppen umfassen, die in Hyaluronsäure existieren und chemisch an die photoreaktiven Vernetzungsgruppen binden können. Repräsentative Beispiele der funktionellen Gruppen sind eine Carboxyl-Gruppe und eine Hydroxyl-Gruppe. Der Ausdruck "Niedrigalkyl" oder "Niederalkoxyl", wie er erfindungsgemäß verwendet wird, soll eine Alkyl-Gruppe oder eine Alkoxyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten.
In dem erfindungsgemäßen Gel werden zunächst die physikalischen Eigenschaften davon angesichts der Viskoelastizität und dann die Vernetzungsstruktur angesichts des Vernetzungsausmaßes angegeben.
Die photoreaktive Vernetzungsgruppe in dem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivat dieser Erfindung ist nicht besonders beschränkt, so lange diese Gruppe eine Vinylen-Gruppe aufweist, die durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen unter Bildung eines Cyclobutan-Ringes dimerisiert werden kann, wobei die Gruppe von Zimtsäure oder substituierten Derivaten davon abstammt (z.B. Zimtsäure-Derivate, worin ein oder zwei Wasserstoffatome an irgendeiner Position des Benzol-Ringes von Zimtsäure durch eine Niedrigalkyl-Gruppe (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl und t-Butyl), eine Niedrigalkoxyl-Gruppe (z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy und Butoxy), eine Amino-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe, Carboxyniedrigalkylthymin (z.B. 1-(2-Carboxyethyl)thymin), Carboxy-niedrigalkylsubstituiertes Coumarin (z.B. 7-Coumaryloxyessigsäure) abstammt. Unter diesen ist eine photoreaktive, vernetzende Gruppe insbesondere bevorzugt, in die eine Gruppe, die von Zimtsäure oder einem Derivat davon abstammt, eingeführt wird. Als photoreaktive Vernetzungsgruppe ist eine Gruppe, die von einer Verbindung abstammt, worin ein Abstandshalter an eine photoreaktive Verbindung wie Zimtsäure und dgl. gebunden ist, ebenfalls bevorzugt. Bevorzugte Abstandshalter umfassen solche mit zwei oder mehr funktionellen Gruppen, die an die funktionelle Gruppen einer photoreaktiven Verbindung wie Zimtsäure und von Hyaluronsäure binden können. Konkret sind Aminosäuren oder Derivate davon, Peptide und Aminoalkohole bevorzugt, und insbesondere sind Aminoalkohole am meisten bevorzugt. Die photoreaktive Vernetzungsgruppe kann in irgendeine funktionelle Gruppe der Saccharid- Anteile von Hyaluronsäure eingeführt werden, d.h. N-Acetyl-D-glucosamin und D-Glucuronsäure, aber es ist insbesondere bevorzugt, diese Vernetzungsgruppe in die Carboxyl-Gruppe von D-Glucuronsäure einzuführen.
Bei der Verwendung von Zimtsäure als photoreaktive Vernetzungsgruppe und Aminoalkohol als Abstandshalter ist das photoreaktive Hyaluronsäure- Derivat mit einer solchen Struktur bevorzugt, bei dem die Carboxyl-Gruppe von Zimtsäure chemisch an die Hydroxyl-Gruppe des Aminoalkohols durch eine Ester-Bindung und die Amino-Gruppe des Aminoalkohols chemisch an die Carboxyl-Gruppe von Hyaluronsäure durch eine Amid-Bindung; gebunden ist. Bei der Verwendung von Aminozimtsäure als photoreaktive Vernetzungsgruppe und einer Aminosäure oder Peptid als Abstandshalter ist die photoreaktive Hyaluronsäure mit einer solchen Struktur bevorzugt, daß die Carboxyl-Gruppe des Abstandshalters chemisch an die Amino-Gruppe der Aminozimtsäure durch eine Amid-Bindung und die Amino-Gruppe der Aminosäure oder des Peptides chemisch an die Carboxyl-Gruppe von Hyaluronsäure durch eine Amid-Bindung gebunden ist.
Konkret sind von den photoreaktiven Vernetzungsgruppen, an die ein Abstandhalter gebunden ist, solche mit der Formel (1) oder (2), die unten gezeigt sind, insbesondere bevorzugt.
-NH(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (1)
In der Formel (1) bedeuten R¹ und R² jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl-Gruppe (bevorzugt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen); Ph eine Phenyl-Gruppe, die nicht nur eine Gruppe sein kann, die mit C&sub6;H&sub5;- ausgedrückt wird, sondern ebenfalls eine Gruppe sein kann, die einen substituierten Benzol-Ring enthalten kann, wobei ein oder zwei Wasserstoffatome an irgendwelchen Positionen durch einen oder zwei Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Niedrigalkyl- oder Alkoxyl-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Amino-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe oder dgl.; und n eine ganze Zahl von 2 bis 18, bevorzugt 2 bis 12 ist.
Die photoreaktive Vernetzungsgruppe mit der Formel (1) ist chemisch z.B. an die Carboxyl-Gruppe von Hyaluronsäure durch eine Amid-Bindung gebunden, unter Bildung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates.
-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2)
In der Formel (2) bedeutet R³ eine Niedrigalkyl-Gruppe, bevorzugt eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl, Ethyl oder dgl.) oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Benzyl oder Phenethyl; A bedeutet -(NHCR&sup4;R&sup5;CO)m- oder -NH(CR&sup4;R&sup5;)hCO-, R&sup4; und R&sup5; bedeuten jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl-Gruppe (bevorzugt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen); -Ph- bedeutet eine para-Phenylen-Gruppe, die nicht nur eine Gruppe sein muß, die durch -C&sub6;H&sub4;- dargestellt ist, sondern ebenfalls eine Gruppe, die einen substituierten Benzol-Ring einschließt, wobei ein Wasserstoffatom an der ortho- oder meta-Position des Benzol-Rings durch eine Niedrigalkyl- oder -alkoxyl-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Amino-Gruppe, Hydroxyl- Gruppe oder dgl. substituiert ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 3 ist, und h eine ganze Zahl von 1 bis 18, bevorzugt 1 bis 12 ist.
Die Hyaluronsäure zur Verwendung in dieser Erfindung ist nicht besonders beschränkt; jedoch wird üblicherweise eine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Gewichtsmittel von 10 000 bis 5 000 000 als Ausgangsmaterial verwendet. Verschiedene Molekulargewichte können entsprechend dem Verwendungszweck ausgewählt werden. Das Molekulargewicht im Gewichtsmittel ist bevorzugt von 500 000 bis 3 000 000 und mehr bevorzugt von 800 000 bis 2 500 000. Ein wasserlösliches Salz einer Hyaluronsäure wie ein Alkalimetallsalz (z.B. Natriumsalz, Kaliumsalz), ein Erdalkalimetallsalz (z.B. Calciumsalz) wird bevorzugt bei dem folgenden Syntheseverfahren verwendet, aber andere Salze oder eine freie Säure können ebenfalls verwendet werden, so lange sie in dem verwendeten Reaktionslösungsmittel löslich sind und nicht die Reaktion beeinträchtigen. Der Ausdruck "Hyaluronsäure", wie er hierin verwendet wird, bedeutet manchmal Salze davon.
Das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat zur Verwendung in dieser Erfindung kann durch Auflösen von Hyaluronsäure z.B. in Wasser alleine oder in einer wäßrigen Lösung, umfassend ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel (z.B. Dioxan, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Acetamid, Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol), Pyridin und durch Einführen einer photoreaktiven vernetzenden Gruppe durch z.B. ein Carbodiimid-Verfahren in der Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimides (z.B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (nachfolgend als "EDC·HCl" bezeichnet), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidmethiodid, 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholinoethyl)carbodiimidhydrochlorid) und ein Kondensationshilfsmittel (z.B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol) hergestellt werden.
Die Reinigung des nach der Reaktion erhaltenen Produktes kann auf übliche Weise z.B. durch Ausfällen mit Methanol oder Dialyse durchgeführt werden. Nach der Reinigung und dem Trocknen kann der Substitutionsgrad (nachfolgend mit "DS" abgekürzt, was das Verhältnis der Einführung der photoreaktiven, vernetzenden Gruppe pro Bestandteilseinheit von Disaccharid der Hyaluronsäure darstellt) des resultierenden photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates durch Messen der Absorbans bei etwa 269 nm des Produktes mit einem Spektrophotometer erhalten werden.
Die sterilen und im wesentlichen Endotoxin-freien (z.B. Endotoxin- Gehalt von 0,25 EU/g oder weniger) photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivate und photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregele können durch Verwendung von sterilen oder im wesentlichen Endotoxin-freien Reagenzien, Wasser, Behälter und dgl. und durch Einhalten von Vorsichtsmaßnahmen bei Sterilisierung der Arbeitsumgebung bei der Herstellung erhalten werden.
Spezifische Verbindungen, die zur Einführung einer photoreaktiven vernetzenden Gruppe in Hyaluronsäure verwendet werden, umfassen solche mit der allgemeinen Formel (1-1) oder (2-1):
H&sub2;N(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (1-1)
worin R¹, R², Ph und n wie oben definiert sind.
H-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2-1)
worin A, -Ph- und R³ wie oben definiert sind.
Die Verbindungen (1-1) und (2-1) werden bevorzugt in der Form eines Salzes, z.B. eine Säureadditionssalzes, wie Hydrochlorides, Hydrobromides, Hydrofluorides oder dgl. verwendet, wobei ein Hydrochlorid insbesondere bevorzugt ist.
Konkret kann das Hydrochlorid (1-2) der Verbindung (1-1) durch folgendes Reaktionsschema hergestellt werden:

Erste Reaktion

R&sup6;HN(CR¹R²)nOH (3) + XCOCH=CH-Ph (4) -> R&sup6;HN(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (5)

Zweite Reaktion

(5) + HCl -> HCl·H&sub2;N(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (1-2)
worin R&sup6; eine Amino-Schutzgruppe ist, die mit Säure gespalten werden kann, z.B. eine t-Butoxycarbonyl-Gruppe und dgl. und X ein Halogenatom, z.B. Chloratom und dgl. ist.
Spezifisch wird die Verbindung (1-2) wie folgt synthetisiert.
Ein organisches Lösungsmittel (z.B. Chloroform) wird zu der Verbindung (3) gegeben, und eine organische Base (z.B. Triethylamin und dgl.) wird unter Eiskühlen hinzugegeben. Die Verbindung (4) und ein basischer Katalysator (z.B. 4-Dimethylaminopyridin) werden nacheinander zugegeben. Nach Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wird ein organisches Lösungsmittel (z.B. Ethylacetat) zu der Reaktionsmischung gegeben und die Mischung aufeinanderfolgend mit mehreren Portionen einer schwach sauren wäßrigen Lösung, Wasser, mehreren Portionen einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung, Wasser, einer gesättigten, wäßrigen Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Lösungsmittelschicht wird abgetrennt und über wasserfreiem Natriumsulfat oder dgl. getrocknet. Das Trocknungsmittel und dgl. werden durch Filtration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck getrocknet, unter Erhalt der Verbindung (5).
Eine 1 bis 5 M-Lösung Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Dioxan) wird zu der Verbindung (5) unter Eiskühlen gegeben, mit anschließendem Rühren. Ein organisches Lösungsmittel (z.B. Diethylether) wird zugegeben und die ausgefällten Kristalle durch Filtration gesammelt. Die Kristalle werden mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, unter Erhalt der Verbindung (1-2).
Konkret kann das Hydrochlorid (2-2) der Verbindung (2-1) entsprechend dem folgenden Reaktionsschema synthetisiert werden:

Erste Reaktion

R&sup6;-A-OH (6) + H&sub2;N-Ph-CH=CHCOOR³(7) -> R&sup6;-A-HN-Ph-CH=CHCOOR³ (8)

Zweite Reaktion

(8) + HCl -> HCl·H-A-HN-Ph-CH=CHCOOR³ (2-2)
worin R³ und R&sup6; wie oben definiert sind.
Weiterhin wird die Verbindung (2-2) spezifisch wie folgt synthetisiert.
Ein organisches Lösungsmittel (z.B. Chloroform und dgl.) wird zu der Verbindung (6) gegeben und ein Aktivator (z.B. Dimethylphosphinothionylchlorid) wird in der Gegenwart einer organischen Base (z.B. Triethylamin) unter Eiskühlung zugegeben, um die Carboxyl-Gruppe der Verbindung (6) zu aktivieren. Nach der Aktivierung der Verbindung (6) wird die Verbindung (7) in der Gegenwart einer organischen Base (z.B. Triethylamin und dgl.) unter Eiskühlung zugegeben, mit anschließendem Rühren bei Raumtemperatur. Ein organisches Lösungsmittel (z.B. Ethylacetat und dgl.) wird zur Reaktionsmischung gegeben und die Mischung aufeinanderfolgend mit mehreren Portionen einer schwach sauren wäßrigen Lösung, Wasser, mehreren Portionen einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung, Wasser, einer gesättigten wäßrigen Natriumchlorid-Lösung und dgl. gewaschen. Die organische Lösungsmittelschicht wird abgetrennt und über wasserfreiem Natriumsulfat oder dgl. getrocknet. Das Trocknungsmittel und dgl. werden durch Filtration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck getrocknet, unter Erhalt der Verbindung (8).
Eine 1 bis 5 M Lösungsmittel Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Dioxan und dgl.) wird zur Verbindung (8) unter Eiskühlung gegeben, mit anschließendem Rühren. Ein organisches Lösungsmittel (z.B. Diethylether und dgl.) wird zugegeben und die ausgefällten Kristalle durch Filtration gesammelt, mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, unter Erhalt der Verbindung (2-2).
Die Existenz eines Abstandshalters, der in die photoreaktive Vernetzungsgruppe eingeführt ist, trägt stark zur Verbesserung der Photoreaktivität des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates bei, wobei die Verbesserung vom Freiheitsgrad und den hydrophoben Bindeeigenschaften des Abstandshalters abhängt. Die verbesserte Empfindlichkeit der Photoreaktivität, die durch den Abstandshalter verursacht wird, ermöglicht es, eine durch Photohärtung verursachte Vernetzung bei einem geringen Einführungsverhältnis der photoreaktiven vernetzenden Gruppe zu erzielen, wobei die photogehärtete Vernetzung unter solchen Bedingungen bisher schwierig war.
Gemäß einer konventionellen Technik wird, wenn das oben beschriebene photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat durch Lichtbestrahlung vernetzt wird, eine wäßrige Lösung aus dem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivat zunächst über einen Behälter und dgl. zu einem Film oder dgl. getrocknet und dann mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt, unter Erhalt eines photogehärteten und vernetzten Hyaluronsäure-Filmes. Ein Film läßt nicht nur Ultraviolettstrahlen leicht durch, sondern die photoreaktiven Vernetzungsgruppen werden ebenfalls orientiert, so daß sie wegen ihrer hydrophoben Natur näher aneinander geraten, wobei der Film dehydratisiert wird oder Wasser während der Filmbildung verdampft wird. Es ist akzeptiert, daß die somit gebildete Situation sich vorteilhaft für die Photoreaktion erweist. Wenn eine photoreaktive Vernetzungsgruppe ein Zimtsäurerest ist, können z.B. wenn der Abstand zwischen den wechselseitigen Zimtsäureresten 4 Å ist, die Moleküle durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen mit einer spezifischen Wellenlänge dimerisiert, d.h. vernetzt werden, aber nicht wenn ein anderer intermolekularer Abstand vorliegt. Daher wird die Filmbildung, die dazu führt, daß die photoreaktiven Vernetzungsgruppe näher beieinanderliegen, als wichtiger Schritt für das Erzielen einer Photoreaktion angesehen. Weiterhin kann trans-Zimtsäure durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen unter den beschriebenen Bedingungen dimerisiert werden, während das geometrische Isomer (d.h. cis-Zimtsäure) für die Dimerisierung inaktiv ist. Wenn eine wäßrige Lösung aus einem konventionellen photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivat mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird, kann die Vernetzung schwierig sein, weil Wassermoleküle vermutlich verhindern, daß die photoreaktiven Vernetzungsgruppen einander näher kommen und die trans-bis-cis- Isomerisierung hauptsächlich gegenüber der Dimerisierung stattfindet.
Die Erfinder dieser Erfindung haben festgestellt, daß ein photogehärtetes vernetztes Hyaluronsäuregel durch Herstellung einer wäßrigen Lösung aus einem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivat mit hoher Konzentration gebildet werden kann, wodurch der enge Kontakt der photoreaktiven Vernetzungsgruppen häufiger auftritt, wodurch die Lösungsschicht eine Form einnimmt, die den leichten Durchgang von Ultraviolettstrahlen ermöglicht, mit anschließender Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen.
Erfindungsgemäß kann, wenn die photoreaktive Hyaluronsäure mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird, ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel mit gewünschten physikalischen Eigenschaften wie Viskoelastizität und dgl. erhalten werden, indem die Photoreaktionsbedingungen wie die Konzentration der Photoreaktionslösung, die Bestrahlungszeit der Ultraviolettstrahlen und dgl. oder DS ausgewählt werden.
Eine bevorzugte Konzentration der photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivatlösung in einem wäßrigen Medium, die mit Licht bestrahlt wurde (manchmal mit "Photoreaktionskonzentration" bezeichnet) ist etwa von 0,5 bis 10 Gew.-%. Bei Verwendung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates mit einem Molekulargewicht von etwa 1 000 000 ist eine Konzentration von 1 bis 4 Gew.-% mehr bevorzugt. Bei niedrigeren Konzentrationen tritt die Isomerisierung bevorzugt gegenüber der Dimerisierung, wie später erwähnt auf. Im Gegensatz dazu ist es bei höheren Konzentrationen schwierig, ein gleichmäßiges Gel zu erhalten.
Wenn eine verdünntere wäßrige Lösung bezüglich der Konzentration als diese angegebene Konzentration mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird, können Isomere bevorzugt wie oben beschrieben erzeugt werden. Bei der Fortsetzung der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen wird die Saccharid-Kette der Hyaluronsäure selbst durch den Einfluß von Ultraviolettstrahlen gespalten, was zur Verminderung des Molekulargewichtees führt. Von diesem Standpunkt her ist es wichtig, eine Reaktionssituation zu kreieren, bei der die photohärtende Vernetzungsreaktion effizient abläuft ohne nachteilige Einflüsse auf die Saccharid-Kette von Hyaluronsäure. Es ist daher essentiell, eine wäßrige Lösung bei den angegebenen Konzentrationen herzustellen. Fig. 1 zeigt das Konzept zur vernetzenden Photohärtung in einem wäßrigen Medium, worin (a) die Änderung des photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates in einer verdünnten Lösung bei der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen zeigt. Wassermoleküle verhindern, daß die photoreaktiven Vernetzungsgruppen eine molekulare Anordnung einnehmen, die für die Vernetzung ausreicht, und als Ergebnis tritt die Isomerisierung hauptsächlich auf. Bei (b) ist die Änderung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates in einer Lösung bei einer spezifischen Konzentration bei der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen gezeigt. Die photoreaktiven vernetzenden hydrophoben Gruppen, die für die Interferenz von Wassermolekülen weniger empfänglich sind als in einer verdünnten Lösung, scheinen sich einander durch die hydrophobe Bindekraft anzuziehen, wodurch eine molekulare Anordnung erfolgt, die für die Vernetzung fertig ist. Somit werden die photoreaktiven Vernetzungsgruppen durch die Bestrahlung dimerisiert, während das wäßrige Medium enthalten ist, wodurch die Vernetzung vollendet wird. Zur Sicherstellung der verbesserten Photoreaktivität bei der Vernetzung in der Lösung bei der angegebenen Konzentration ist es insbesondere bevorzugt, ein photoreaktives Hyaluronsäure-Derivat zu verwenden, das eine photoreaktive Vernetzungsgruppe mit dem beschriebenen Abstandshalter und mit einer hohen Flexibilität aufweist.
Die genannte Photoreaktionskonzentration hängt vom Substitutionsgrad (DS) der photoreaktiven Vernetzungsgruppe, die bei der Hyaluronsäure vorhanden ist, ab. DS kann auf der Basis des Verhältnisses (%) der Einführung der photoreaktiven Vernetzungsgruppe pro Disaccharid-Bestandteilseinheit von Hyaluronsäure berechnet werden. Z.B. ist der DS eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates mit einer photoreaktiven Vernetzungsgruppe pro Disaccharid-Bestandteilseinheit oder pro 200 Saccharid-Bestandteilseinheiten 100% bzw. 1%. Unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen mit Licht ist das Vernetzungsverhältnis um so niedriger je niedriger der DS-Wert ist.
Erfindungsgemäß kann der DS-Wert des photoreaktiven. Hyaluronsäure- Derivates für das Erzielen einer Vernetzung bei der spezifischen Photoreaktions-Konzentration, die oben erwähnt ist, etwa von 0,05 bis 10%, bevorzugt etwa 0,3 bis 5% und mehr bevorzugt etwa 0,5 bis 3% bei einer Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 500 000 oder mehr sein, wobei dies entsprechend dem Molekulargewicht der Ausgangs-Hyaluronsäure variiert.
Das wäßrige Medium als Lösungsmittel der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivatlösung, die mit Licht bestrahlt werden soll, umfaßt Wasser, einen Puffer, physiologische Saline, gepufferte physiologische Saline und dgl. Für die Verwendung als biomedizinisches Material sind ein Puffer, physiologische Saline und gepufferte physiologische Saline (z.B. Phosphatgepufferte physiologische Saline (PBS) und dgl.) insbesondere bevorzugt. Wenn ein anderes wäßriges Medium als Wasser verwendet wird, kann die Art des Mediums und die Konzentration des Lösungsmittels zum Steuern der physikalischen Eigenschaften des resultierenden Gels dieser Erfindung verwendet werden, und diese werden in Abhängigkeit von dem Verwendungszweck angemessen ausgewählt.
Die photoreaktive Hyaluronsäure-Derivatlösung wird üblicherweise durch Auflösen eines photoreaktiven Hyaluronsäuree-Derivates, das getrennt ist und von dem synthetischen Reaktionssystem in einem wäßrigen Medium gereinigt ist, hergestellt. Bezüglich der photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivatlösung ist es in einigen Fällen möglich, ein photoreaktives Hyaluronsäure-Derivat bei dem synthetischen Reaktionssystem so wie es ist oder im konzentrierten Zustand zu verwenden.
Wenn der. DS-Wert des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivats fixiert ist, kann der Anteil an Cyclobutan-Ringbildung, d.h. das Vernetzungsverhältnis sich mit der Variation der Bereiche bei der Photoreaktionskonzentration, die oben erwähnt ist, ändern, und die physikalischen Eigenschaften des resultierenden Gels ändern sich entsprechend. Mit einer Erhöhung der Photoreaktions-Konzentration kann sich das Vernetzungsverhältnis erhöhen, und die Elastizitätsnatur des Gels erhöht sich, wie dies durch Messung der Viskoelastizität des photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels verifiziert wird. Mit einer Erhöhung des Vernetzungsverhältnisses wird die Netzwerkstruktur dichter. Der Anteil des Cyclobutan- Ringes in dem photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregel kann als Vernetzungsausmaß definiert werden, das ein Produkt von DS und einem Vernetzungsverhältnis ist, und wird als molares Verhältnis (%) von Dimeren pro Disaccharid-Einheit von Hyaluronsäure ausgedrückt. Ein bevorzugtes Vernetzungsausmaß liegt im Bereich von 0,01 bis 0,5% pro mol einer Disaccharid- Bestandteilseinheit von Hyaluronsäure.
Die Wasserabsorption eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels (nachfolgend einfach mit "getrocknetem Gel" bezeichnet), wird durch den Vernetzungsgrad beeinflußt, und wird somit ein Maß für den Vernetzungsgrad. Die Wasserabsoroption wird wie folgt ausgedrückt:
Wasserabsorption (%) = Gewicht des absorbierten Wassers/Gewicht des getrockneten Gels · 100
Wenn sich der Vernetzungsgrad, d.h. das Vernetzungsverhältnis erhöht, wird die Netzwerkstruktur dichter, und die Aufnahme von Wasser vermindert sich, was zu einer verminderten Wasserabsorption des getrockneten Gels führt. Die Wasserabsorption des getrockneten Gels dieser Erfindung ist üblicherweise von 20 (x100%) bis 150 (x100%), bevorzugt von 30 (x100%) bis 120 (x100%), mehr bevorzugt von 40 (x100%) bis 100 (x100%) wenn die des getrockneten Gels nach 24-stündiger Eintauchung in physiologischer Saline (0,9%ige wäßrige Natriumchlorid-Lösung) als wäßriges Medium gemessen wird.
Das Gel dieser Erfindung kann ein Gel mit 0,5 bis 10 Gew.-%, ausgedrückt als Hyaluronsäure-Gehalt des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäure-Derivates sein. Insbesondere hat ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäure-Gel, hergestellt aus einem photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivat mit einem Molekulargewicht im Gewichtsmittel von etwa 1 000 000 bevorzugt einen Hyaluronsäure-Gehalt von 1 bis 4 Gew.-% im Gel.
Die physikalischen Eigenschaften des Gels durch Viskoelastizität kann durch die dynamischen viskoelastischen Eigenschaften wie Lagerungsmodul (G'), Verlustmodul (G"), Tangens delta (tanδ; G"/G) und dgl. ausgedrückt werden. Ein hoher Lagermodul und ein geringer Verlustmodul zeigen eine hohe Elastizität an, und bedeuten ein hartes Gel. Umgekehrt bedeuten ein hoher Verlustmodul und ein niedriger Lagermodul ein Gel mit hoher Viskosität.
Das Gel dieser Erfindung hat physikalische Eigenschaften mit Bereichen des Lagermoduls (G') von 50 bis 1500 Pa, bevorzugt 100 bis 500 Pa, des Verlustmoduls (G") von 10 bis 300 Pa, bevorzugt 50 bis 150 Pa und des Tangens delta (tanδ; G"/G') von 0,1 bis 0,8, bevorzugt von 0,2 bis 0,5 bezüglich der dynamischen Viskoelastizität bei einer Frequenz von 10 Hz.
Bei der Bestrahlung mit Licht, d.h. Ultraviolettstrahlen ist die Art der Ultraviolettstrahlen nicht besonders beschränkt. Die Bestrahlung mit Licht oder Ultraviolettstrahlen wird üblicherweise von mehreren Sekunden bis mehreren Minuten unter Verwendung einer Lichtquelle durchgeführt, die Licht mit Wellenlängen, die für die Photoreaktion notwendig sind, d.h. von 200 bis 450 nm (z.B. eine Hochdruck-Quecksilberlampe, Metallhalogenid-Lampe oder dgl.) durchgeführt, wobei Kurzwellenlängen, die für die Dimerisierung unerwünscht sind, mit einem Ultraviolettstrahl-Schneidfilter oder dgl. (z.B. Pyrexglas (Warenname) oder dgl.) abgeschritten werden. Die Bestrahlungsart ist nicht besonders beschränkt und verschiedene werden entsprechend der Verwendung angemessen ausgewählt. Z.B. wird die photoreaktive Hyaluronsäure-Derivatlösung in einen Behälter gegeben, der als kommerzielles Endprodukt des Gels dieser Erfindung zugeführt wird, und wie nachfolgend beschrieben bestrahlt; diese Lösung wird zwischen einem Paar von Bandförderern aus Blättern aus einem für Ultraviolettstrahlen durchlässigen Material gehalten und während sie in Bewegung ist, bestrahlt; oder die photoreaktive Hyaluronsäure-Lösung wird durch das Innere eines Rohrs aus einem für Ultraviolettstrahlen durchlässigen Material geführt und während der Zufuhr mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt.
Bei dem Verfahren zur Herstellung des Gels dieser Erfindung kann das Gel, das die beschriebenen Viskoelastizitätserfordernisse erfüllt, erhalten werden, selbst wenn die photoreaktive Hyaluronsäure-Derivatlösung einer Wärmebehandlung vor und/oder nach der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen mit Hochdruckdampf bei 100 bis 125ºC für 5 bis 30 Minuten (Autoklav) unterworfen wird. Diese Wärmebehandlungen können einem Sterilisationsverfahren entsprechen, das für medizinische Vorrichtungen oder die Medizin erforderlich ist.
Die Zustände der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivatlösung, die mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird, und das Material und die Form des Behälters zur Aufnahme dieser für eine Photoreaktion und des Ultraviolettstrahlen-empfangenden Teils sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, daß die Ultraviolettstrahlen durchgehen können. Z.B. können sie schichtartig, rohrartig, spritzenartig, ampullenartig oder dgl. sein. Angesichts der Gleichmäßigkeit der Vernetzungsreaktion sollte die Form so sein, daß Ultraviolettstrahlen gleichmäßig und ausreichend durchgehen. Die Bestrahlung einer Lösungsschicht, die zu einer dünnen Schicht geformt ist, mit Ultraviolettstrahlen ist insbesondere geeignet für den Erhalt eines gleichmäßig vernetzten Gels. Der Behälter für die Photoreaktion kann eine Form aufweisen, so daß die Lösung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates und das resultierende Gel dieser Erfindung in einem Photoreaktionssystem gehalten werden kann, und dies muß nicht unbedingt ein geschlossener Behälter sein. Z.B. kann der Behälter eine einfache flache Form aufweisen.
Wenn das Gel dieser Erfindung als biomedizinisches Material wie Antiadhäsivmaterial verwendet wird, kann der Behälter zum Konservieren des Gels dieser Erfindung bevorzugt eine Form aufweisen, mit der das resultierende Gel dieser Erfindung steril bis zu dessen Verwendung gehalten und aus dem das Gel bei der Verwendung angemessen herausgenommen werden kann. Ein solcher Konservierungsbehälter kann ebenfalls als Behälter für die Photoreaktion verwendet werden. Beispiele eines solchen Behälters, worin das Gel steril bis zur Verwendung aufbewahrt und aus dem das Gel leicht einem Verabreichungsobjekt oder -stelle verabreicht werden kann (wenn das Gel als Antiadhäsivmaterial verwendet wird, ist das Objekt oder die Stelle ein beeinträchtigtes Teil, das vor Adhäsionen geschützt werden soll), umfassen Behälter wie eine Spritze, Rohr und dgl. Weiterhin umfassen Beispiele eines solchen Behälters, worin das Gel leicht herausgenommen und verwendet werden kann, Behälter wie eine Ampulle und dgl.
Wenn das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat in den Behälter gegeben wird und das zugegebene photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird, um die Photoreaktion wie oben erwähnt einzugehen, muß das Behältermaterial aus einem solchen Material ausgewählt werden, das Ultraviolettstrahlen durchläßt und keinen Abbau durch Ultraviolettstrahlen eingeht. Wenn das Gel dieser Erfindung bei dem menschlichen Körper als biomedizinisches Material verwendet werden soll, kann das Gel nach der Photoreaktion bevorzugt z.B. durch Hochdruckdampf (Autoklav) sterilisiert werden. Wenn das photogehärtete vernetzte Gel, das in den Behälter gegeben ist, durch Autoklavensterilisierung sterilisiert ist, kann das Behältermaterial bevorzugt aus Glas, Kunststoff oder dgl. mit einer gewissen Wärmeresistenz sein. Die Menge des Gels, das in den Behälter gegeben wird, ist nicht besonders beschränkt; jedoch ist es z.B. von 0,5 bis 500 ml, basierend auf den ökonomischen und Arbeitsaspekten und dgl.
Es ist möglich, daß das Hydrogel, das durch Lichtbestrahlung wie oben beschrieben erhalten wird, z.B. durch Trocknen oder dgl. dehydratisiert und dann durch Zugabe einer gewünschten Menge eines wäßrigen Mediums gequollen wird, unter Erhalt des Gels mit den beschriebenen physikalischen Eigenschaften gemäß der Erfindung. In diesem Fall wird das Trocknen bevorzugt durch ein Verfahren durchgeführt, das keinen nachteiligen Einfluß auf die Hyaluronsäure-Saccharid-Kette und die vernetzte Struktur ausübt.
Es ist ebenfalls möglich, das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel in der Form eines solchen getrockneten festen Gels wie oben erwähnt zu lagern oder zu transportieren und dies in Form eines erneut gequollenen Zustandes mit einem angemessenen wäßrigen Medium unmittelbar bevor der Verwendung zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Gel ist als biomedizinisches Material sehr nützlich. Die hohe inhärente Biokompatibilität der Hyaluronsäure, kombiniert mit den neu verliehenen Eigenschaften durch Vernetzung wie verlängerte Dauer im lebenden Körper (Verbesserung bei der Verweilzeit) und verbesserten physikochemischen Eigenschaften wie Viskoelastizität und dgl., was zur Verwendung als biomedizinisches Material nützlich ist, macht das Gel dieser Erfindung zur Verwendung auf dem medizinischen. Gebiet sehr geeignet.
Weil das Gel dieser Erfindung ein harmloses und nicht-toxisches wäßriges Medium für die meisten Teile umfaßt, entfaltet es keine Toxizität für den lebenden Körper und hat für diese eine hohe Sicherheit.
Mehr spezifisch verursachte eine Verabreichung in einer Einzeldosis von 100 ml/kg intraperitoneal (entsprechend 2000 mg Hyaluronsäure pro kg) des erfindungsgemäßen Gels an Ratten keinen Tod und keine ernsthafte Störung, die dem Gel zuzuschreiben waren.
Ein Antigenizitätstest wurden durchgeführt, um die aktive Anaphylaxe zu überprüfen, worin Meerschweinchen intraperitoneal mit 20 mg oder 2 mg des. Gels dieser Erfindung sensibilisiert wurden, und dann wurden 40 mg des Gels erneut intraperitoneal verabreicht. Als Ergebnis wurde keine anaphylaktische Reaktion induziert.
Wenn das erfindungsgemäße Gel als biomedizinisches Material, d.h. Antiadhäsivmaterial verwendet wird, wird überlegt, daß die erhöhte Elastizität des Gels eine Verbesserung der Sperrwirkung zwischen Geweben und Verweilzeit im Körper verursacht, wobei die erhöhte Viskosität eine Verbesserung der Klebrigkeit an dem Gewebe und Injektionsfähigkeit in ein beeinflußtes Teil erzielt. Daher ist es bevorzugt wünschenswert, daß das Gel für eine solche Verwendung eine gut ausgewogenen Elastizität und Viskosität aufweist. Wenn G' 1500 übersteigt oder Tangens delta weniger als 0,1 ist, wird das Gel hochelastisch, sogenannt hart und spröde und es wird schwierig, das Gel in ein beeinträchtigtes Teil zu injizieren. Wenn auf der anderen Seit G' weniger als 50 ist oder Tangens delta 0,8 übersteigt, wird das Gel hochviskos und verhält sich wie eine Lösung, wodurch die gewünschte Härte nicht entfaltet wird und eine Sperrwirkung, die für eine Antiadhäsivwirkung erforderlich ist, verlorengeht. D.h., das erfindungsgemäße Gel hat sehr geeignete physikochemische Eigenschaften als Antiadhäsivmaterial.
Eine Adhäsion von Organen z.B., die nach der Operation häufig auftritt, ist vom klinischen Standpunkt her unerwünscht, und die Entwicklung eines wirksamen antiadhäsiven Materials ist aufgrund dessen gewünscht. Wünschenswerte Eigenschaften für ein Antiadhäsivmaterial sind wie folgt: das Material soll (1) eine Sperrwirkung zwischen Organen aufweisen, die eine Adhäsion eingehen können, (2) Abdeckeigenschaften über einem Wundteil aufweisen, (3) das Abheilen einer Wunde nicht verzögern, (4) im Körper während einer Heilperiode verbleiben und bevorzugt innerhalb des Körpers nach der Heilung abgebaut und absorbiert werden, (5) harmlos, nicht toxisch, biokompatibel und dgl. sein.
Das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel dieser Erfindung, das durch photohärtende Vernetzung erhalten wird und eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Sicherheit aufweist, erfüllt all die genannten Bedingungen. Die Sperrwirkung, die von besonderem Interesse ist, wird durch die physikochemischen Eigenschaften des vernetzten Gels sichergestellt, und das Verbleiben im Körper wird durch die Bildung einer photogehärteten vernetzten Netzwerkstruktur erzielt.
Der amorphe Zustand des Gels ermöglicht z.B., daß das Gel durch eine Injektionsdüse oder -nadel injiziert wird, d.h. daß es in eine Spritze gegeben und in ein feines beeinträchtigtes Teil (z.B. den Wundteil und dgl.) injiziert wird. In diesem Zusammenhang ist das Gel dieser Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß es eine weit höhere Elastizität aufweist als eine Hyaluronsäure-Lösung, aber eine Härte zeigt, die eine solche Weichheit aufweist, daß es durch die Nadel einer Spritze geht. Das Gel kann ebenfalls einem beeinträchtigten Teil durch ein Rohr mit kleinem Durchmesser (Injektionsdüse) injiziert werden, und es wird erwarte t, daß es bei der laparoskopischen Mikrochirurgie und dgl. angewandt wird.
Kurz gesagt, hat das Antiadhäsivmaterial, das das Gel dieser Erfindung umfaßt, die folgenden Eigenschaften:
(1) ausgezeichnete Antiadhäsivwirkung;
(2) es ist ein Hydrogel mit physikalischen Eigenschaften, die die Injektion in ein beeinflußtes Teil ermöglicht;
(3) es entfaltet eine hohe Klebrigkeit für Gewebe und ebenfalls ausgezeichnete Klebrigkeit für Gewebe bei der Injektion oder Auftragung, wodurch es bei dem beeinträchtigten Teil für eine Zeitspanne verbleibt, die für die Antiadhäsion notwendig ist;
(4) es muß nicht entfernt werden und ist ebenfalls von der entsprechenden Stelle der Auftragung wie Abdominalkavität und dgl. absorbierbar, kann metabolisiert und ausgeschieden werden; und
(5) es weist eine hohe Sicherheit auf: es wurde kein Problem bezüglich der Sicherheit bei irgendwelchen Testtieren mit einem Toxizitätstest mit einzelner Dosis, wiederholter Dosis und bei einem Antigenizitätstest beobachtet.
Anwendbare Gebiete, wenn das erfindungsgemäße Gel als antiadhäsives Material verwendet wird, werden wie folgt veranschaulicht:

(1) Gebiet der Geburtshilfe und Gynäkologie:

Antiadhäsionen für Adhäsionen, die eine intrapelvine Operation für die Behandlung für Unfruchtbarkeit, Uterusoperation, Tubusoperation, Ovarialoperation, Endometriose-Behandlungsoperation, Kaiserschnitt, Intrapelvin-Adhäsiotomie oder dgl. begleiten.

(2) Gebiet der Gastroitestinaloperation:

Antiadhäsionen für Adhäsionen, die die intestinale Adhäsion nach der Abdominaloperation begleiten, oder dgl.

(3) Orthopädiegebiet:

Antiadhäsionen für Adhäsionen, die die Operation der Achillessehne, Operation bei der Beugemuskulatur und Sehnen, Arthroplastie, Laminektomoie oder dgl.
Anwendungen des Gels dieser Erfindung bei dem medizinischen Gebiet als anderes biomedizinisches Material als das oben beschriebene Antiadhäsivmaterial werden unten gezeigt.
(1) Hilfsmittel für ophthalmologische Operation. Z.B. wird das Gel in die Vorderkammer bei Operationen wie dem Einsatz von Intraokularlinsen, gesamte Korneal-Transplantation oder dgl. injiziert, oder das Gel wird zur Aufrechterhaltung des Intraokulardrucks bei der Retinalablösung und dgl. oder zum Auffüllen des Glaskörpers verwendet.
(2) Mittel zur Verbesserung der Gelenkfunktion. Z.B. wird das Gel in den Gelenkhohlraum zur Linderung von Schmerzen, Verbesserung des Gelekbewegungsbereiches, Normalisierung des morbiden Synovialfluids und dgl. bei der Behandlung von Arthritis wie Arthritisdeformation in einem Kniegelenk, Periarthritis in einem Schultergelenk oder dgl. injiziert.
(4) Mangelhafte Prothesen bei dem Gebiet der plastischen Chirurgie.
(5) Wundauflagen für durchgelegene Stellen oder Brand.
(6) Materialien oder Präparate für die verzögerte Freisetzung eines Arzneimittels.
Für die Verwendung als Antiadhäsivmaterial des Gels der Erfindung kann die Menge des auf das beeinträchtigte Teil aufzutragenden Gels nicht spezifiziert werden, weil es in Abhängigkeit von der Art (z.B. der Art des Organs und dgl.), Größe oder Zustand der Auftragungsstelle und dem Anwendungszweck variiert. Üblicherweise liegt die Menge bei etwa 0,5 bis 500 ml/Stelle, bevorzugt etwa 1 bis 100 ml/Stelle, mehr bevorzugt etwa 2 bis 50 ml/Stelle.
Das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel dieser Erfindung hat eine dreidimensionale Netzwerkstruktur. Die Einfügung eines Arzneimittels in das Netzwerk ergibt ein nützliches Präparat mit verzögerter Freisetzung des Arzneimittels. Die Einfügung des Arzneimittels in das Gel kann durch Eintauchen eines trockenen Gels in eine Lösung mit einem Arzneimittel bewirkt werden. Weil das photogehärtete, vernetzte Gel keine Reinigung nach der Vernetzung erfordert, kann ein Arzneimittel zuvor zu einer Lösung aus dem photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivat, das bestrahlt werden soll, gegeben werden. Eines der oben beschriebenen Verfahren kann angewandt werden.
Weiterhin kann ein Arzneimittel chemisch an das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat durch eine chemische Bindung (kovalente Bindung, ionische Bindung und dgl.) gebunden werden und dann der Vernetzung einer Photoreaktion unterworfen werden. Wenn z.B. ein Arzneimittel durch eine kovalente Bindung eingeführt wird, können das Arzneimittel und die Carboxyl- und die Hydroxyl-Gruppe eines photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivats über eine Amid- oder Ester-Bindung kombiniert und dann einer Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen unterworfen werden. Wenn ein Arzneimittel durch eine ionische Bindung eingeführt wird, kann ein kationisches Arzneimittel, das an eine Carboxyl-Gruppe von Hyaluronsäure über eine ionische Bindung binden kann, mit der photoreaktiven Hyaluronsäure vermischt und dann der Bestrahldung mit Ultraviolettstrahlen unterworfen werden. Darüber hinaus kann ein photoreaktives Hyaluronsäure- Derivat, das eine photoreaktive Vernetzungsgruppe enthält, an die an Arzneimittel gebunden ist, einer Photoreaktion für die Vernetzung unterworfen werden.

Beispiele

Diese Erfindung wird nachfolgend detaillierter unter Bezugnahme auf Herstellungsbeispiele, Beispiele und Testbeispiele erläutert, aber es sollte verstanden werden, daß diese Erfindung nicht hierauf beschränkt werden soll.

Herstellungsbeispiel 1:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 0,53%)

In 1,5 l Wasser wurden 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten), Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Molekulargewicht im Gewichtsmittel (MW): 950 000) aufgelöst und 750 ml 1,4-Dioxan zu der Lösung gegeben. Zu der Lösung wurden aufeinanderfolgend 50 ml einer Dioxan-Lösung mit 288 mg (2,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid, 50 ml einer wäßrigen Lösung mit 1240 mg (1,25 mmol) EDC·HCl und 50 ml einer wäßrigen Lösung mit 355 mg (1,25 mmol) HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh bei 5-Minuten-Intervallen unter Kühlung mit Eis gegeben. Nach 8-stündigem Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wurde eine wäßrige Lösung aus 10 g Natriumchlorid zugegeben, mit anschließendem einstündigem Rühren. Die resultierende Lösung wurde in 5 l Ethanol gegossen. Das somit gebildete gewünschte Präzipitat wurde durch Zentrifugation (4000 Upm · 15 min) gesammelt, aufeinanderfolgend mit 3 Portionen 80%igem Ethanol und einer Einzelportion Ethanol gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 9,73 g eines photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates als weißen Feststoff (DS: 0,53%), Endotoxin: 0,8 pg/mg).
Das Endotoxin in diesem Herstellungsbeispiel und den folgenden Herstellungsbeispielen und Beispielen wurde unter Verwendung des Toxicolor- System LS-20-Set, DIA-Set und Et-1-Set, alle von Seikagaku Corporation erhältlich (Warenname, nachfolgend gilt gleiches) bestimmt.
Der Endotoxin-Gehalt des photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels wurde durch das beschriebene Verfahren bestimmt, nachdem das photogehärtete vernetzte Hyaluronsäuregel, das in den Beispielen beschrieben ist, durch Enzymverdauung (z.B. Chondroitinase ABC, ein Produkt von Seikagaku Corporation und dgl.) löslich gemacht war.
Bei dem Endotoxin-Gehalt entspricht eine Endotoxin-Einheit (EU) 345 pg Endotoxin.

Herstellungsbeispiel 2:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 0,75%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 65 ml einer 0,05 M Lösung N-Hydroxysuccinimid (3,25 mmol) in Dioxan, 65 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung EDC·HCl (1,625 mmol) und 65 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh (1,625 mmol) verwendet wurden. 9,74 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 0,75%, Endotoxin: 2,5 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 3:

Herstellung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 0,90%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 2,0 g (5,0 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; MW; 950 000), 3 ml einer wäßrigen Lösung mit 69 mg (0,6 mmol) N-Hydroxysuccinimid, 3 ml einer wäßrigen Lösung mit 58 mg (0,3 mmol) EDC·HCl und 3 ml einer wäßrigen Lösung mit 85 mg (0,3 mmol) HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh verwendet wurden. 2,1 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 0,90%; Endotoxin: 2,4 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 4:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 1,06%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 unter Verwendung von 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 100 ml einer 0,05 M Lösung N-Hydroxysuccinimid (5,0 mmol) in Dioxan, 100 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung EDC·HCl (2,5 mmol) und 100 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh (2,5 mmol) verwendet wurden. 9,64 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 1,06%, Endotoxin: 3,2 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 5:

Herstellung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 1,26%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 5 g (12,5 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 50 ml einer Lösung aus 288 mg (2,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid in Dioxan, 50 ml einer wäßrigen Lösung aus 240 mg (1,25 mmol) EDC·HCl und 50 ml einer wäßrigen Lösung aus 355 mg (1,25 mmol) HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh verwendet wurden. 4,9 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 1,26%; Endotoxin: 1,0 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 6:

Herstellung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 1,29%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 50 ml einer 0,1 M Lösung in N-Hydroxysuccinimid (5,0 mmol) in Dioxan, 50 ml einer 0,05 M wäßrigen Lösung aus EDC·HCl (2,5 mmol) und 50 ml einer 0,05 M wäßrigen Lösung aus HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh (2,5 mmol) verwendet wurden. 10,0 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 1,29%; Endotoxin: 2,5 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 7:

Herstellung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 1,55%)
Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 150 ml einer 0,05 M Lösung in N-Hydroxysuccinimid (7,5 mmol) in Dioxan, 150 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung aus EDC·HCl (3,75 mmol) und 150 ml einer 0,025 M wäßrigen Lösung aus HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)6OCOCH=CHPh (3,75 mmol) verwendet wurden. 9,92 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 1,55%; Endotoxin: 1,2 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 8:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 1,93%)

In 600 ml Wasser wurden 4,0 g (10,0 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000) aufgelöst und 300 ml 1,4-Dioxan zu der Lösung gegeben. Zu der Lösung wurden aufeinanderfolgend 10 ml einer wäßrigen Lösung mit 230 mg (2,0 mmol) N-Hydroxysuccinimid, 10 ml einer wäßrigen Lösung mit 192 mg (1,0 mmol) EDC·HCl und 10 ml einer wäßrigen Lösung mit 284 mg (1,0 mmol) HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh bei 5-Minuten-Intervallen unter Eiskühlen gegeben. Nach 24-stündigem Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wurde eine wäßrige Lösung aus 2,0 g Natriumchlorid zugegeben, mit anschließendem Rühren. Die resultierende Lösung wurde in 3,0 l Ethanol gegossen. Das somit gebildete, gewünschte Präzipitat wurde durch Zentrifugation (4000 Upm · 15 min) gesammelt, aufeinanderfolgend dreimal mit 80% Ethanol und einmal mit Ethanol gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 4,1 g eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates als weißen Feststoff (DS: 1,93%; Endotoxin: 2,1 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 9:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 2,87%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 10 g (25 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 50 ml einer Lösung aus 864 mg (7,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid in Dioxan, 50 ml einer wäßrigen Lösung aus 718 mg (3,75 mmol) EDC·HCl und 50 ml einer wäßrigen Lösung aus 1,06 g (3,75 mmol) HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh verwendet wurden. 10 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 2,87%; Endotoxin: 2,8 pg/mg).

Herstellungsbeispiel 10:

Herstellung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates (DS 2,28%)

Dieses wurde auf gleiche Weise wie bei Herstellungsbeispiel 1 hergestellt, wobei 50 g (125 mmol Disaccharid-Einheiten) Natriumhyaluronat (ein Produkt von Seikagaku Corporation; Mw: 950 000), 250 ml einer Lösung aus 3,45 g (30 mmol) N-Hydroxysuccinimid, 250 ml einer wäßrigen Lösung aus 2,88 g (15 mmol) EDC·HCl und 250 ml einer wäßrigen Lösung aus 15 mmol HCl·H&sub2;N(CH&sub2;)&sub6;OCOCH=CHPh verwendet wurden. 49 g des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates wurden als weißer Feststoff erhalten (DS: 2,28%; Endotoxin: 3,2 pg/mg).

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, das durch photohärtende Vernetzung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates gemäß Herstellungsbeispiel 6 in einer wäßrigen Lösung mit anschließendem Ersatz des Mediums mit 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) erhalten wurde.
Eine 1,4 Gew.-%ige wäßrige Lösung des photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates (DS: 1,29%), erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 6, wurde zwischen ein Paar Pyrex-Glasplatten mit jeweils einer Dicke von 2,5 mm, die mit 1,0 mm beabstandet waren, gehalten, mit Ultraviolettstrahlen (3 KW Metallhalogenid-Lampe) 4 Minuten von jeder Seite, (8 Minuten insgesamt) bestrahlt und bei 45ºC getrocknet. Zu dem resultierenden getrockneten Gel wurden 1,5 mM Phosphat-gepufferte physiologische Saline (pH 7,4) gegeben, wobei die Konzentration auf 2 Gew.-% eingestellt wurde. Dann wurde das getrocknete Gel 1 Tag lang gequollen, unter Erhalt eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels (Endotoxin: 0,11 EU/g).

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft photogehärtete vernetzte Hyaluronsäuregele, die durch photohärtendes Vernetzen der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivate gemäß den Herstellungsbeispielen 1, 4 und 7 in einer 1,4 Gew.-%igen Lösung in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) erhalten wurde.
Eine 1,4 Gew.-%ige Lösung eines jeden photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates gemäß den Herstellungsbeispielen 1, 4 und 7 (DS: 0,53%, 1,06% bzw. 1,55%) in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) wurde zwischen einem Paar Pyrex-Glasplatten mit einer Dicke von jeweils 2,5 mm, die bei 1,0 mm beabstandet waren, gehalten, mit Ultraviolettstrahlen (3 kW Metallhalogenidlampe) 4 Minuten lang von jeder Seite (8 Minuten insgesamt) bestrahlt, unter Erhalt eines photogehärteten vernetzten Hyaluronsäuregels.
Der Endotoxin-Gehalt war 0,03, 0,12 bzw. 0,05 EU/g in den Gelen mit einem DS-Wert von 0,53%, 1,06% bzw. 1,55%.

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregele, die durch photohärtendes Vernetzen der photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivate gemäß den Herstellungsbeispielen 1 bis 9 in einer 2,0 Gew.-%igen Lösung in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) erhalten wurden.
Eine 2,0 Gew.-%ige Lösung eines jeden photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates gemäß den Herstellungsbeispielen 1 bis 9 (DS: 0,53%, 0,75%, 0,90%, 1,06%, 1,26%, 1,29%, 1,55%, 1,93% bzw. 2,87%) in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) wurde zwischen einem Paar Pyrex-Glasplatten mit jeweils einer Dicke von 2,5 mm, die mit 1,0 mm beabstandet waren, gehalten, mit Ultraviolettstrahlen (3 KW Metallhalogenidlampe) 4 Minuten von jeder Seite (8 Minuten insgesamt) bestrahlt, unter Erhalt eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels.

Beispiel 4

Dieses Beispiel betrifft photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregele, die durch photohärtendes Vernetzen der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivate gemäß den Herstellungsbeispielen 1, 4 und 7 in einer 3,2 Gew.-%igen Lösung in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) erhalten wurden.
Eine 3,2 Gew.-%ige Lösung eines jeden photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivates gemäß den Herstellungsbeispielen 1, 4 und 7 (DS: 0,53%, 1,06% und 1,55%) in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) wurde zwischen einem Paar Pyrex-Glasplatten mit jeweils einer Dicke von 2,5 mm, die mit 1,0 mm beabstandet waren, gehalten, mit Ultraviolettstrahlen (3 KW Metallhalogenidlampe) 4 Minuten von jeder Seite (8 Minuten insgesamt) bestrahlt, unter Erhalt eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels.

Beispiel 5

Dieses Beispiel betrifft photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregele, die durch Wärmebehandlung der photogehärteten, vernetztes Hyaluronsäuregele mit einem DS-Wert von 1,55% und 2,87% gemäß Beispiel 3 erhalten wurden.
Die photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregele, erhalten gemäß Beispiel 3 von den photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivaten mit einem DS von 1,55% und 2,87% wurden jeweils in eine 10 ml Ampulle gegeben und in einem Autoklaven bei 121ºC 8 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterzogen.

Messung der physikalischen Eigenschaften

Die dynamische Viskoelastizität (Lagermodul G', Verlustmodul G", Tangens delta tanδ (G"/G')), die dynamische Viskosität (η) und die Wasserabsorption der Lösungen der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivate gemäß den Herstellungsbeispielen 1, 4, 5 und 7 mit einer Herstellungskonzentration (Lösungskonzentration: als Hyaluronsäure-Konzentration) von 1,4 Gew.-%, 2,0 Gew.-% bzw. 3,2 Gew.-%, der photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregele gemäß den Beispielen 2 bis 4 mit einer Herstellungskonzentration von 1,4 Gew.-%, 2,0 Gew.-% oder 3,2 Gew.-% und der wärmebehandelten photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregele gemäß Beispiel 5 wurden gemessen. Die physikalischen Eigenschaften der hergestellten Hyaluronsäure-Lösung, bei der die Herstellungskonzentration gleich war wie die des oben erwähnten photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels, wurden wie oben beschrieben gemessen. Die Messung der dynamischen Viskoelastizität und dynamischen Viskosität erfolgte mit einem Rheometer Modell CSL-50, hergestellt von Carri-Med unter folgenden Bedingungen.
Meßverfahren: Oszillations-Testverfahren, Beanspruchungskontrolle
Meßtemperatur: 37ºC
Meßgeometrie: 4 cm
Zwischenraum: 800 um
Frequenz: 10 Hz
Die Wasserabsorption wurde durch ein Ultraviolett-Absorbansverfahren unter Verwendung von Blue Dextran (nachfolgend mit "B.D." abgekürzt), das in EP-0205674 A1 offenbart ist, wie folgt berechnet. Physiologische Saline (0,9%ige wäßrige Natriumchlorid-Lösung) wurde als wäßriges Medium verwendet.
Wenn ein getrocknetes Gel in eine D.B.-Lösung gegeben wird, absorbiert das Gel nur Wasser, weil B.D. mit einem hohen Molekulargewicht nicht in das Gel eindringen kann. Entsprechend erhöht sich die Konzentration der B.D.-Lösung, die nicht absorbiert wird, im Vergleich zur ursprünglichen in Abhängigkeit vom absorbierten Wasser. Dieser Unterschied der Konzentration wird von den Absorbanzen (610 nm) erhalten, und die Wasserabsorption kann dann wie folgt berechnet werden:
Wasserabsorption (x100%) = (1 - y1/y2)/A · 1000
worin y1 die Absorbans bei der Anfangskonzentration von A mg eines getrockneten Pulvers pro Gramm einer 0,1 Gew.-%igen B.D.-Lösung ist; und y2 die Absorbans nach 24-stündigem Quellen in der B.D.-Lösung ist.
Weiterhin wurde die Wasserabsorption bei den getrockneten Proben der vorgehärteten vernetzten Hyaluronsäuregele gemäß Beispiel 3 von den photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivaten mit einem DS von 0,53%, 0,75%, 0,90%, 1,26%, 1,55% und 1,93% untersucht.
Einige Ergebnisse der Messung der dynamischen Viskoelastizität und dgl. sind in Tabelle 1 gezeigt, und die Beziehung zwischen DS und der Wasserabsorption ist in Fig. 2 gezeigt. In Tabelle 1 wurden die gefundenen Konzentrationen der untersuchten Proben durch Bestimmung des Gehaltes der Hyaluronsäure-Komponente des Gels entsprechend einem Carbazol-Schwefelsäure-Reaktionsverfahren erhalten. Tabelle 1

Beispiel 6

Dieses Beispiel betrifft die photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregele, die durch Bestrahlen unter verschiedenen Bedingungen mit Ultraviolettstrahlen und Wärmebehandlung einer 2,0 Gew.-%igen Lösung eines jeden photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates gemäß Herstellungsbeispiel 10 in 1,5 mM Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) erhalten wurden.
Das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat mit einem DS von 2,28%, das in Herstellungsbeispiel 10 hergestellt wurde, wurde in 1,5 mM Phosphatgepufferter physiologischer Saline (pH 7,4) in einer 2,0 Gew.-%igen Lösung aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde mit Ultraviolettstrahlen entsprechend den folgenden drei Verfahren bestrahlt. Vor und/oder nach der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen wurde mit der Lösung (oder dem Gel) eine Wärmebehandlung unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Das Vernetzungsverhältnis, Vernetzungsausmaß und die viskoelastischen Eigenschaften der resultierenden Gele wurden gemessen.
Bedingungen für die Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen (UV-Bestrahlung):
(1) Gleiches Verfahren wie bei den Beispielen 2 bis 4. Die wäßrige Lösung der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivate wurde zwischen einem Paar Pyrexglasplatten mit jeweils einer Dicke von 2,5 mm, die bei 1,0 mm beabstandet waren, gehalten und mit Ultraviolettstrahlen einer 3 KW Metallhaologenidlampe für 4 Minuten bei jeder Seite (8 Minuten insgesamt) bestrahlt.
(2) Die Lösung wurde zwischen einem Paar Polyethylenfilme gehalten und mit Ultraviolettstrahlen einer 400 W-Hochdruck-Quecksilberlampe 3 Sekunden von einer Seite bestrahlt.
(3) Die Lösung wurde unter Verwendung einer 400 W Hochdruck-Quecksilberlampe bestrahlt, während sie durch ein Quarzrohr mit einem Durchmesser von 5 mm geleitet wurde.
Bedingungen für die Wärmebehandlung (Autoklaven-Verfahren):
A: Nach der UV-Bestrahlung; 121%, 8 min
B: Vor der UV-Bestrahlung, 121ºC, 8 min
C: Vor der UV-Bestrahlung, 121ºC, 8 mm, dann nach der UV-Bestrahlung, 100ºC, 10 min
D: Nach der UV-Bestrahlung, 121ºC, 15 min
Die Meßergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Das Vernetzungsverhältnis wurde aus der folgenden Gleichung berechnet:
Vernetzungsverhältnis (%) = Molzahl der dimerisierten Zimtsäure · 2/Molzahl der eingeführten Zimtsäure · 100
Mehr spezifisch wurde Zimtsäure oder deren Dimer chemisch gespalten und von einem photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregel extrahiert. Wenn der Unterschied des Molekulargewichtes zwischen Zimtsäure und ihrem Dimer berücksichtigt wird, wurde der Extrakt in Zimtsäure und deren Dimer durch Gel-Permeationschromatographie (GPC) getrennt, und jede Komponente wurde quantitativ bestimmt, unter Erhalt der jeweiligen Molzahl. Dann wurde das Vernetzungsverhältnis auf der Grundlage der obigen Gleichung berechnet.
Das Vernetzungsausmaß wurde von der folgenden Gleichung berechnet.
Vernetzungsausmaß (%) = DS · Vernetzungsverhältnis/100
Wie aus den obigen Gleichungen ersichtlich ist, kann das Vernetzungsausmaß (Produkt des Vernetzungsverhältnisses und. DS) als molares Verhältnis (%) von Dimeren pro Disaccharid-Bestandteilseinheiten von Hyaluronsäure ausgedrückt werden, weil das Vernetzungsverhältnis ein Wert ist, der auf der eingeführten Zimtsäure basiert. Tabelle 2

Testbeispiel 1

Antiadhäsionswirkung in einem Uterushorn-Modell bei Ratten

Dieses Testbeispiel betrifft die Antiadhäsionswirkung der Gele gemäß den Beispielen 1, 3, 5 und 6 und zum Vergleich der photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivatlösungen vor der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen, hergestellt in den Beispielen 1 und 3 (nachfolgend als "nicht-vernetztes Hyaluronsäuregel" bezeichnet), eines kommerziell erhältlichen Antiadhäsivmaterials TC7 (Interceed (Warenname), hergestellt von Johnson & Johnson) und einer 3,2 Gew.-%igen Lösung von Hyaluronsäure in 1,5 mM Phosphatgepufferter physiologischer Saline in einem Uterushorn-Adhäsionsmodell bei Ratten.

1. Testtier

7 Wochen alte Crj : SD (SPF.) weibliche Ratten wurden gekauft und eine Woche vor dem Test ernährt. Jede Gruppe bestand aus 5 Ratten.

2. Testverfahren

2-1. Herstellung des Uterushorn-Adhäsionsmodells bei Ratten

Das Abdomen der Ratte wurde unter Anästhesie mit Nembutal rasiert. Ein Mittellinienschnitt mit ungefähr 4 cm Länge wurde durchgeführt.
(a) Die rechte Abdominalwand wurde aus der Muskelschicht mit einem Fräser für die ophthalmologische Operation herausgeschnitten und die Muskelschicht wurde mit Klemmen freigelegt.
(b) Das Uterushorn wurde freigelegt und 4 transversale Schnitte wurden von etwa 1 cm unterhalb vom Eierstock in. Richtung zur Cervix bei 2 bis 3 mm Intervallen geschnitten. Eine Hämostase wurden jedes Mal für jeden Schnitt durch elektrische Kauterisation durchgeführt.
(c) Die Stelle bei etwa 3 bis 4 mm vom Ende der transversalen Schnitte am Uterushorn und die Stelle bei 3 bis 4 mm vom Ende des Defekts in der Abdominalwand wurden mit einer einzigen 8/0-Naht zusammengegeben, um die Verletzungen, die oben bei (a) und (b) durchgeführt wurden, zu schließen.

2-2. Verabreichung

Testgruppe:

Jeweils 1 ml der photogehärteten vernetzten Hyaluronsäuregele, nicht- vernetzten Hyaluronsäuregele und der Hyaluronsäure-Lösung, die oben beschrieben ist, und des kommerziell erhältlichen TC7 wurde mit einer Fläche von 1,5 · 1,5 cm² zwischen dem kaputten Teil in der Abdominalwand und dem Schnitteil des Uterushorns injiziert bzw. eingefügt. Mehr spezifisch wurden die obigen Gele wie folgt verabreicht. Jeweils 1 ml Geh, das oben beschrieben und genau gewogen wurde, wurde in eine 1 ml-Spritze (Terumo-Spritze (Warenname) für Tuberculin; γ-Strahlen-sterilisiert, Innendurchmesser des Spritzenrohrs: etwa 4 mm; Innendurchmesser der Spitze: etwa 1 mm) aufgenommen und durch die Spitze der Spritze zwischen das defekte Teil in der Abdominlwand und dem Schnitteil im Uterushorn injiziert.

Kontrollgruppe;

Der gleiche Vorgang wurde bei der Abdominalwand und dem Uterushorn an der linken Seite des gleichen Tiers, das für die Testgruppe verwendet wurde, ohne Einfügung von Materialien durchgeführt.

3. Auswertung

Sieben Tage nach der Implantation wurden die Ratten durch Ausblutung durch die Karotidarterie unter Anästhesie mit Ethylether getötet. Nach der Dissektion wurde die Stelle, die eine Adhäsion aufwies, bezüglich des Adhäsionsausmaßes entsprechend dem folgenden Einstufungssystem ausgewertet.
0: Keine Adhäsion
1: Leichte und leicht entfernbare Adhäsion
2: Mittlere und entfernbare Adhäsion
3: Starke und nicht-entfernbare Adhäsion

4. Resultate

Die Ergebnisse des Tests sind unten in Tabelle 3 gezeigt. In Tabelle 3 sind die Bedingungen der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen und die Bedingungen der Wärmebehandlung gleich wie bei Beispiel 6. Tabelle 3
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 3 ersichtlich ist, erwies sich das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel dieser Erfindung als ausreichend wirksam bezüglich der Antiadhäsionen bei diesem Modell, während der kommerziell erhältliche Antiadhäsionsfilm TC7 bei diesem Adhäsionsmodell nicht vollständig wirksam war.
Aufgrund der Tatsache, daß eine Wirkung bei den nicht-vernetzten Gelen oder der 3,2%igen Hyaluronsäure-Lösung, die eine ähnliche Viskoelastizität und Viskosität wie die von photovernetzten Gelen aufwiesen, ersichtlich ist, kann gefolgert werden, daß die antiadhäsive Wirkung des photogehärteten vernetzten Hyaluronsäure-Gels dieser Erfindung bei der photohärtenden Vernetzung manifestiert wird.

Testbeispiel 2

Dieses Testbeispiel betrifft die Andiadhäsionswirkung des Gels dieser Erfindung beim gleichen Uterushorn-Adhäsionsmodell bei Ratten wie bei Testbeispiel 1 ohne die Hämostase für den verletzten Teil der Abdominalwand und dem Schnitteil des Uterushorns.
Die Antiadhäsionswirkung des Gels dieser Erfindung wurde auf gleiche Weise wie bei Testbeispiel 1 untersucht und ausgewertet, mit der Ausnahme, daß keine Hämostase für die Schnitte der Abdominalwand und des Uterushorns durchgeführt wurden und daß 0,5 ml eines photogehärteten vernetzten Hyaluronsäuregels mit einer Konzentration von 2% und einem DS von 2,5% verwendet und eine Wärmebehandlung bei 105ºC für 10 Minuten vor der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen und bei 121ºC für 8 Minuten nach der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen (n = 10) durchgeführt wurde. Als Kontrolle wurde das gleiche Tier wie es für die Testgruppe verwendet wurde, ohne Einfügung von Materialien auf gleiche Weise wie bei Testbeispiel 1 untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel bei einer Dosis von 0,5 ml zeigte eine signifikante Wirkung der Antiadähsion beim Modell, das keine Hämostase erhielt. Mit anderen Worten beweisen die Ergebnisse gemäß Tabelle 4, daß das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel gegenüber dem kommerziell erhältlichen TC7 ausgezeichnet ist, da es bei dem verletzten Teil ohne Durchführung einer Hämostase nicht verwendet werden kann.

Testbeispiel 3

Antiadhäsionswirkung des photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels beim Intestinal-Adhäsionsmodell bei Ratten

1. Testsubstanz

Ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel mit einer Konzentration von 2% und einem DS von 2,5%, das bei 105ºC 10 Minuten vor der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen und bei 121ºC 8 Minuten nach der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen damit behandelt war.

2. Testtier

Sieben Wochen alte weibliche SD-Ratten wurden gekauft und eine Woche vor dem Testen gefüttert.

3. Herstellung des Adhäsionsmodells

Die seröse Membran vom Ileum bis zum Kolon wurden linear in einer Länge von 20 cm und einer Breite von 3 bis 4 nun abgeschält. Eine Hämostase wurde nicht durchgeführt.

4. Verabreichung und Gruppierung

Eine vorgeschriebene Menge (0,5 ml, 1,0 ml oder 2,0 ml) des Gels wurde von einer 1 ml-Spritze injiziert und auf die verletzte Stelle aufgetragen. Nach der Auftragung wurde der Intestinalkanal in die Bauchhöhle zurückgegeben und das Abdomen geschlossen. Das Adhäsionsmodell ohne Auftragung des Gels wurde als Kontrollgruppe verwendet. Die mit 0,5 ml, 1,0 ml und 2,0 ml Gel versetzten Modelle wurden als 0,5 ml, 1,0 ml bzw. 2,0 ml Gruppen verwendet. Jede Gruppe bestand aus 10 Ratten.

5. Auswertung und Ergebnisse

Sieben Tage nach der Implantation wurden die Ratten durch Ausbluten durch die Karotidarterie unter Anästhesie mit Ethylether getötet. Nach der Dissektion wurde das Adhäsionsausmaß entsprechend dem gleichen Auswertungssystem wie bei Testbeispiel 1 ausgewertet. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Alle drei Testgruppen zeigten signifikante Antiadhäsionswirkungen im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse gemäß Tabelle 5 zeigen nicht nur die Wirksamkeit des Gels dieser Erfindung bezüglich der Antiadhäsion, sondern ebenfalls ihre Ausgezeichnetheit beim Verkleben von Gewebe und der Biokompatibilität mit den Geweben angesichts der heftigen persitaltischen Bewegung des Darms.
Bei einer Dissektion 7 Tage nach der Implantation bei den Tierversuchen bei den Testbeispielen 1 und 2 war der Hauptteil des verabreichten photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels entsprechend der Beobachtung mit dem bloßen Auge verschwunden. Somit war die Bioabbaubarkeit des erfindungsgemäßen Gels gezeigt.
Wie oben beschrieben und bewiesen, kann ein photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel leicht durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen einer wäßrigen Lösung eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates mit hoher Konzentration hergestellt werden. Das erfindungsgemäße photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel weist physikalische Eigenschaften wie eine geeignete Viskoelastizität, Gewebeaffinität, Bioabbaubarkeit und dgl. auf, wobei die inhärenten Eigenschaften von Hyaluronsäure wie Nicht-Toxizität, Nicht-Antigenizität, Biokompatibilität, Bioabbaubarkeit und dgl. aufrecherhalten bleiben. Daher wird erwartet, daß es auf verschiedenen Gebieten als medizinisches Material mit hoher Sicherheit, z.B. als Antiadhäsivmaterial, Träger für die verzögerte Freisetzung eines Arzneimittels oder dgl. eingesetzt werden kann. Weiterhin kann das Gel in feinen Stelle von verletzten Stellen des Körpers durch eine Spritze, ein Rohr oder dgl. injiziert werden und kann daher in der Mikrochirurgie und dgl. eingesetzt werden.

Claims

1. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel mit einem Lagerungsmodul (G) von 50 bis 1500 Pa, einem Verlustmodul (G") von 10 bis 300 Pa und einem Tangens delta (G"/G') von 0,1 bis 0,8 bezüglich der dynamischen Viskoelastizität, gemessen durch ein Rheometer unter folgenden Bedingungen:

Meßverfahren:

Oszillations-Testverfahren, Beanspruchungskontrolle,

Meßtemperatur: 37ºC,

Meßgeometrie: 4 cm,

Zwischenraum: 800 um,

Frequenz: 10 Hz,

wobei das Gel durch Bestrahlung eines photohärtenden Hyaluronsäure- Derivates, worin ein Zimtsäure-Derivat mit einem Abstandshalter chemisch an eine funktionelle Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen, erhalten ist, um das photoreaktive Hyaluronsäure-Derivat zu dimerisieren, unter Bildung von Cyclobutan-Ringen und unter Bildung einer Netzwerkstruktur und wobei das Gel ein injizierbares Hydrogel mit einem wäßrigen Medium in der Netzwerkstruktur ist.

2. Photohärtendes, vernetztes Hyaluronsäuregel, gemäß Anspruch 1, mit einem Vernetzungsausmaß von 0,01 bis 0,5% pro Mol einer Disaccharid- Bestandteilseinheit der Hyaluronsäure.

3. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel, gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, mit einer Wasserabsorption von 2000 bis 15000%, die wie folgt definiert wird:

Wasserabsorption (%) = Gewicht des absorbierten Wassers/Gewicht des trockenen Gels · 100.

4. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Abstandshalter eine Gruppe ist, die von einem Aminoalkohol, einer Aminosäure oder einem Peptid abstammt.

5. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe durch die folgende Formel (1) oder (2) dargestellt wird:

-NH(CR¹R²)nOCOCH=CH-Ph (1)

worin R¹ und R² jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen sind; Ph eine Phenyl-Gruppe ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 18 ist;

-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2)

worin R³ eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe ist, A -(NHCR&sup4;R&sup5;CO)m- oder -NH(CR&sup4;R&sup5;)hCO- ist, R&sup4; und R&sup5; jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten; -Ph- eine para-Phenylen-Gruppe ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und h eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist.

6. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die photoreaktive Vernetzungsgruppe in einem Anteil von 0,05 bis 10% pro Mol Disaccharid-Bestandteilseinheit eingeführt ist.

7. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Hydrogel durch Bestrahlen eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates in einem wäßrigen Medium und anschließende Wärmebehandlung des vernetzten Produktes erhalten ist.

8. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Hydrogel durch Wärmebehandlung des photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates und anschließende Bestrahlung mit Ultraviolettlicht in einem wäßrigen Medium erhalten ist.

9. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach Anspruch 8, worin sich an die Bestrahlung eine weitere Wärmebehandlung anschließt.

10. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Endotoxin-Gehalt des Gels 0,25 Entotoxin- Einheiten (EU)/g oder weniger ist.

11. Photogehärtetes, vernetztes Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das aus einem Behälter herausgestoßen werden kann.

12. Verfahren zur Herstellung eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, worin das Verfahren umfaßt:

Bestrahlen einer wäßrigen Lösung, umfassend von 0,5 bis 10 Gew.-% eines photoreaktiven Hyaluronsäure-Derivates, worin eine photoreaktive Vernetzungsgruppe chemisch an eine funktionelle Gruppe der Hyaluronsäure gebunden ist, mit Ultraviolettstrahlen; und

Bildung einer intermolekularen und/oder intramolekularen Vernetzung durch Dimerisierung der wechselseitigen photoreaktiven Vernetzungsgruppen, unter Erhalt einer Netzwerkstruktur.

13. Verfahren zur Herstellung eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels nach Anspruch 12, worin eine Wärmebehandlung vor und/oder nach Bestrahlung der wäßrigen Lösung aus dem photoreaktiven Hyaluronsäure- Derivat mit Ultraviolettstrahlen durchgeführt wird.

14. Verfahren zur Herstellung eines photogehärteten, vernetzten Hyaluronsäuregels nach Anspruch 13, worin die Wärmebehandlung bei 100 bis 125ºC für 5 bis 30 Minuten mit Hochdruckdampf durchgeführt wird.

15. Biomedizinisches Material, umfassend das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

16. Biomedizinisches Material nach Anspruch 15 mit einer antiadhäsiven Wirkung.

17. Biomedizinischer Material-Kit, umfassend ein vernetztes Hyaluronsäuregel und einen Behälter, der das Gel in einem solchen Zustand enthält, daß es herausgenommen werden kann, worin der Behälter ein Behälter ist, der das Gel für die Injektion herausstoßen kann.

18. Biomedizinischer Material-Kit, umfassend das photogehärtete, vernetzte Hyaluronsäuregel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen Behälter, der das Gel in einem solchen Zustand enthält, daß es herausgenommen werden kann.

19. Biomedizinischer Material-Kit nach Anspruch 18, worin der Behälter ein Behälter ist, der das Gel für die Injektion herausstoßen kann.