DE69611368T2

DE69611368T2 - Oligonukleotide spezifisch für humane papillomaviren

Info

Publication number: DE69611368T2
Application number: DE69611368T
Authority: DE
Inventors: Bruce L. Frank; John Goodchild; Isobel M. Greenfield; Robert E. Kilkuskie; John S. Mills; Peter C. Roberts; Veronica Sullivan; David E. Szymkowski; Jia Wolfe
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2001-08-09
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: US20020068820A1; CA2226457A1; DE69611368D1; WO1996039501A3; ATE198352T1; CA2226457C; EP0832214A2; AU6300296A; WO1996039501A2; EP0832214B1; ZA964447B; AR002758A1; US6509149B2

Description

Die Erfindung betrifft menschliches Papillomavirus. Insbesondere betrifft die Erfindung die Hemmung, Behandlung und Diagnose von mit menschlichem Papillomavirus in Verbindung stehenden Erkrankungen mit Hilfe von synthetischen, zu der Nukleinsäure von menschlichem Papillomavirus komplementären Oligonukleotiden.
Menschliche Papillomaviren (HPV) umfassen eine Gruppe von wenigstens 70 Typen, basierend auf einem Unterschied in der DNA-Sequenz, wie durch Flüssighybridisierung gemessen wurde (Pfister et al. (1994), Intervirol. 37: 143-149). Diese DNA-Viren ohne Hülle infizieren Epithelzellen, was zu einer Reihe von Erkrankungen führt, die von gutartigen Haut- und Genitalwarzen (Condyloma acuminata) und Epidermodysplasia verruciformis (EV) bis zu Papillomatose des Respirationssystems oder Kehlkopfs und Cervixkarzinom reichen. Jeder Virustyp zeigt Wirtsspezifität.
Mehrere HPV-Typen infizieren Genitalepithelien und stellen die häufigsten ätiologischen Agenzien sexuell übertragener viraler Erkrankungen dar. Die genitalen HPV-Typen können ferner in "Hoch-Risiko"-Typen, die mit der Entwicklung von Neoplasmen in Verbindung stehen, am häufigsten HPV-16 und HPV-18, und "Niedrig-Risiko"-Typen, die selten mit einer Malignizität in Verbindung stehen, am häufigsten HPV-6 und HPV-11, unterteilt werden. Die malignen Typen können sich in das Genom der Wirtszelle integrieren und vermeiden daher das Erfordernis für virale DNA-Replikations-Genprodukte. Im Gegensatz dazu benötigen die gutartigen Typen, am häufigsten HPV-6 und HPV-11, die viralen Proteine E1 und E2 für eine Replikation des episomalen Genoms.
Die gegenwärtige Behandlung von HPV-Infektionen ist extrem begrenzt. Es gibt momentan keine zugelassenen HPV-spezifischen antiviralen Therapeutika. Eine Behandlung umfasst normalerweise die physikalische Zerstörung der Warze durch operative, kryo-operative, chemische oder Laser-vermittelte Entfernung von infiziertem Gewebe. Topische Anti-Metaboliten wie 5'-Fluoruracil und Podophyllum-Zubereitungen wurden auch verwendet (Reichman in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. Auflage (Isselbacher et al., Hrsg.), McGraw-Hill, Inc., NY (1993), Seiten 801-803). Jedoch tritt eine Rückbildung nach diesem Behandlungsverfahren häufig auf und wiederholte Behandlungen zerstören nach und nach gesundes Gewebe. Eine Interferon-Behandlung war bisher die einzige Behandlung mit einem antiviralen Wirkmechanismus, seine Anwendung ist jedoch durch die begrenzte Wirksamkeit eingeschränkt (Cowsert (1994), Intervirol. 37: 226-230; Bornstein et al. (1993), Obstetrics Gynecol. Sur. 4504: 252-260; Browder et al. (1992) Ann. Pharmacother. 26: 42- 45).
Zwei HPV-Typen, HPV-6 und HPV-11, stehen gewöhnlich mit Kehlkopf-Papillomen oder gutartigen Epitheltumoren des Kehlkopfs in Verbindung. Neugeborene können mit einem genitalen Papillomavirus zum Zeitpunkt des Durchtritts durch den Geburtskanal der Mutter infiziert werden. Im Alter von zwei Jahren haben sich Papillome entwickelt und die infizierten Kinder müssen sich mehreren Operationen unterziehen, bei denen die gutartigen Papillome entfernt werden, die die Atemwege verschließen können. Im Moment gibt es keine Behandlungsmöglichkeit für Kehlkopf-Papillomatose im Kindheitsalter. Es besteht daher ein großer Bedarf für einen spezifischen antiviralen Stoff für die Behandlung einer menschlichen Papillomavirusinfektion.
Neue Chemotherapeutika, die zur Modulation der zellulären und fremden Genexpression fähig sind, wurden entwickelt (vgl. Zamecnik et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 280-284). Diese Stoffe, Antisense-Oligonukleotide genannt, binden an einzelsträngige Ziel-Nukleinsäuremofeküle gemäß einer Watson-Crick-Basenpaarung oder an doppelsträngige Nukleinsäuren durch Hoogsteen-Basenpaarung. Dabei zerstören sie die Funktion des Ziels durch einen oder mehrere Mechanismen. Sie verhindern die Bindung von Faktoren, die für eine normale Transkription, Splicing oder Translation erforderlich sind, aktivieren die enzymatische Zerstörung von mRNA durch RNase H oder zerstören das Ziel mit Hilfe reaktiver Gruppen, die direkt an das Antisense-Oligonukleotid gebunden sind.
Verbesserte Oligonukleotide wurden in jüngster Zeit entwickelt und sie besitzen eine größere Wirksamkeit bei der Hemmung derartiger Viren, Pathogene und der selektiven Genexpression. Manche dieser Oligonukleotide, die Modifikationen in ihren Internukleotid-Bindungen besitzen, zeigten sich wirksamer als ihre nicht-modifizierten Gegenstücke. Agrawal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1988) 85: 7079-7083) beschreiben z. B., dass Oligonukleotid- Phosphorothioate und bestimmte Oligonukleotid-Phosphoramidate wirksamer HIV-1 hemmen als gewöhnliche Phosphodiester-verknüpfte Oligodesoxynukleotide. Agrawal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1989) 86: 7790-7794) beschreiben den Vorteil von Oligonukleotid-Phosphorothioaten bei der Hemmung von HIV-1 in frühen und chronisch infizierten Zellen.
Zusätzlich wurden chimäre Oligonukleotide mit mehr als einem Typ von Internukleotid-Bindungen innerhalb des Oligonukleotids entwickelt. Pederson et al. (US-PS Nr. 5,149,797 und 5,220,007) beschreiben chimäre Oligonukleotide mit einer Oligonukleotid-Phosphodiester- oder Oligonukleotid-Phosphorothioat-Kernsequenz, die von Nukleotid-Methylphosphonaten oder -Phosphoramidaten flankiert wird. Agrawal et al. (WO 94/02498) beschreiben Hybrid- Oligonukleotide mit Regionen aus Desoxyribonukleotiden und 2'-O-Methylribonukleotiden.
Eine begrenzte Anzahl von Antisense-Oligonukleotiden wurde entworfen, die die Expression von HPV hemmen. Zum Beispiel wurden Oligonukleotide, die spezifisch für verschiedene Bereiche der HPV E1- und E2-mRNA sind, hergestellt (vgl. z. B. US-PS 5,364,758, WO 91/08313, WO 93/20095 und WO 95/04748).
Die Entwicklung von Oligonukleotiden, die zur Hemmung der Replikation und Expression von menschlichem Papillomavirus fähig sind und deren Verwendung mit einer erfolgreichen Behandlung und einer geringen oder keiner zellulären Toxizität einhergeht, ist nach wie vor erforderlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorstehenden und weitere erfindungsgemäße Gegenstände, verschiedene Merkmale davon und die Erfindung selbst können besser durch die nachstehende Beschreibung und die Zeichnungen verstanden werden.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des HPV-Genoms.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Antisense-Aktivität von 20mer PS-Oligonukleotiden in stabil transifizierten Zellen und der entsprechenden RNase H-Aktivität.
Fig. 3 ist ein Diagramm eines Luciferasetests mit transienter Transfektion, der dazu verwendet wird, die Antisense-Aktivität der erfindungsgemäßen Oligonukleotide zu zeigen.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Antisense-Hemmung der HPV Luciferase- Expression in transient transfizierten CHO-Zellen zeigt, die mit verschiedenen Konzentrationen von PS HPV1, HPV2 oder HPV3 behandelt wurden.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die die Antisense-Hemmung der HPV Luciferase- Expression in transient transfizierten CHO-Zellen zeigt, die mit verschiedenen Konzentrationen von PS HPV4, HPV5 und HPV6 behandelt wurden.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Antisense-Hemmung der HPV Luciferase- Expression in transient transfizierten CHO-Zellen zeigt, die mit einer Kombination verschiedener Konzentrationen von PS HPV1, HPV4 und HPV6 behandelt wurden.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung verschiedener Konzentrationen von HPV1 oder eines zufälligen Oligonukleotids auf die Expression von HPV Luciferase in Keratinozyten zeigt, wobei diese in die Zellen mit Hilfe eines Lipidträgers eingebracht wurden.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der Antisense-Aktivität von Oligonukleotiden mit Basenfehlpaarungen in einem Test mit stabil transfizierten CHO-Zellen.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung der Antisense-Aktivität von Oligonukleotiden mit Basenfehlpaarungen und Oligonukleotiden, bei denen Fehlpaarungen durch Inosine ersetzt wurden, in einem Test mit stabil transfizierten CHO-Zellen.
Fig. 10A ist eine graphische Darstellung, die die Antisense-Aktivität von HPV1, HPV32, HPV33, HPV30 und HPV34 in einem Test mit stabil transfizierten CHO-Zellen zeigt.
Fig. 10B ist eine graphische Darstellung, die die Antisense-Aktivität von HPV1, HPV31, HPV38 und HPV35 in einem Test mit stabil transfizierten CHO-Zellen zeigt.
Fig. 11 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von Längen- und chemischen Modifikationen auf die Antisense-Aktivität in stabil transfizierten Zellen, wobei HPVn = Phosphorothioat (PS); 2 OMe 3' = 3'-Ende mit 2'-O-Methyl-RNA-PS-Modifikation an 5 Nukleotiden; Methylphos 3' = 3'-Ende mit Methylphosphonat-Modifikation an 5 Nukleosiden; 2' OMe PO oder PS = nur 2'-O-Methyl-RNA-Phosphodiester oder -Phosphorothioate; 2' OMe 5', 3' PO oder PS = 2'-O-Methyl-RNA-PO/PS-Modifikation an den 5'- und 3'-Enden an 5 Nukleotiden.
Durch die jüngeren Fortschritte in der HPV-Forschung ist es nun möglich, antivirale Verbindungen gegen HPV zielgerichteter zu entwickeln. Zwei durch das Virus kodierte Proteine, E1 und E2, stellten sich als essentiell für die Replikation des viralen Genoms heraus (Ustav et al. (1991), EMBO J. 10: 449-457; Chiang et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 5799- 5803). Die meisten HPV-Typen brauchen beide Proteine für eine Initiation der viralen DNA- Replikation. Jedoch wurde vor kurzem gezeigt, dass nur E1 in bestimmten in vitro-Experimenten erforderlich ist (Gopalakrishnan et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 9597- 9601).
E1 ist eines von acht viralen Proteinen, die von dem zirkulären, doppelsträngigen, 7900 Basenpaare langen DNA-Genom aller HPV-Typen kodiert werden (vgl. Fig. 1). Das Genom kann in drei bestimmte funktionelle Domänen unterteilt werden: die stromaufwärts gelegene regulatorische Region (URR), die den Ursprung für die virale DNA-Replikation und Enhancer und Promotoren, die an der Transkription beteiligt sind, enthält; die L-Region, die die Strukturproteine L1 und L2 kodiert; und die E-Region, die Gene, die für die vegetativen Funktionen nötig sind, kodiert. Die acht viralen Proteine, die schematisch in Fig. 1 gezeigt sind, werden ausgehend von komplexen Familien alternativ-gesplicter mRNAs translatiert.
E1 ist eine ATP-hydrolysierende DNA-Helikase, die vermutlich an der Entwindung von DNA am viralen Ursprung während der Replikation des HPV-Genoms durch den DNA-Replikationskomplex des menschlichen Wirts beteiligt ist (Hughes et al. (1993), Nucleic Acids Res. 21: 5817-5823; Chow et al. (1994), Intervirol. 37: 150-158). Somit stellt E1 ein Virusspezifisches Ziel mit einer definierten biochemischen Funktion dar, die in Zellen, die dieses Gen exprimieren, gemessen werden kann.
Für die Entwicklung einer therapeutischen Antisense-Verbindung gegen menschliche Papillomaviren wurde das E1-Gen von den HPV-Typen 6 (GenBank HPV6b, Zugangsnummer M14119) und 11 (GenBank HPV11, Zugangsnummer X00203) anvisiert. Die Typen 6 und 11 stehen gemeinsam mit mehr als 90% aller Fälle von nicht-malignen Genitalwarzen in Verbindung. Eine Region von 46 Nukleotiden (-17 bis +29 des offenen Leserahmens von E1), die im Zentrum der Initiationsstelle für die Proteintranslation liegt, wurde detailliert untersucht. Diese Region ist in einer Reihe von klinischen Isolaten der HPV-Typen 6 und 11 konserviert. Der gesamte offene Leserahmen des Gens (-17 bis +1950) wurde ebenfalls als Antisense-Ziel untersucht. Diese gesamte Region zeigt eine hohe Sequenzidentität zwischen dem HPV-Typ 6 und HPV-Typ 11.
Man fand heraus, dass spezifische Oligonukleotide, die zu bestimmten Teilen der Nukleinsäure komplementär sind, die die translationelle Startstelle für das E1-Gen des menschlichen Papillomavirus kodiert, die HPV-Replikation und -Expression hemmen können. Dieses Ergebnis wurde erfindungsgemäß für die Bereitstellung synthetischer Oligonukleotide genutzt, die zu Regionen komplementär sind, die sich über die translationelle Startstelle der für das HPV E1-Protein kodierenden mRNA erstrecken oder dazu benachbart sind.
Ein "synthetisches Oligonukleotid" umfasst hier chemisch synthetisierte Polymere von etwa 5 bis zu etwa 50, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 30 Ribonukleotid- und/oder Desoxyribonukleotid-Monomeren, die miteinander durch wenigstens eine, vorzugsweise mehr als eine 5'- an 3'-Internukleotid-Bindung verbunden oder verknüpft sind.
Der Begriff "Oligonukleotidsequenz, die zu Nukleinsäure oder mRNA komplementär ist" bedeutet erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, das an die Nukleinsäuresequenz unter physiologischen Bedingungen, z. B. durch Watson-Crick-Basenpaarung (Interaktion zwischen dem Oligonukleotid und einer einzelsträngigen Nukleinsäure) oder durch Hoogsteen-Basenpaarung (Interaktion zwischen dem Oligonukleotid und einer doppelsträngigen Nukleinsäure) oder in irgendeiner anderen Weise bindet, einschließlich für den Fall, dass ein Oligonukleotid, das an RNA bindet, die Bildung eines Pseudoknotens verursacht. Die Bindung durch Watson-Crick- oder Hoogsteen-Basenpaarung unter physiologischen Bedingungen wird praktischerweise durch Messung der Interferenz mit der Funktion der Nukleinsäuresequenz bestimmt.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung synthetische Oligonukleotide bereit, die zu einer Nukleinsäure komplementär sind, die sich über die translationelle Startstelle des E1-Gens von menschlichem Papillomavirus erstreckt. Die Oligonukleotide umfassen wenigstens 15 Nukleotide. In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Oligonukleotide etwa 15 bis etwa 30 Nukleotide lang.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind modifiziert. In einer Ausführungsform umfassen die Modifikationen wenigstens eine Internukleotid-Bindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Alkylphosphonothioat, Phosphoramidat, Carbamat, Carbonat, Phosphattriester, Acetamidat oder Carboxymethylester, einschließlich Kombinationen derartiger Bindungen, z. B. in einem chimären Oligonukleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotid-Bindung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind alle Internukleotid-Bindungen in dem Oligonukleotid Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid wenigstens eine Methylphosphonat-Internukleotid-Bindung. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid wenigstens eine n-Butylphosphoramidat-Bindung. In einer Ausführungsform befindet sich wenigstens eine Methylphosphonat- oder n-Butylphosphoramidat-Bindung am 3'-Ende. Besser befinden sich etwa fünf derartige Bindungen am 3'-Ende.
In weiteren Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide auch wenigstens ein Desoxyribonukleotid, wenigstens ein Ribonukleotid oder eine Kombination davon umfassen, z. B. in einem Hybrid-Oligonukleotid. In einer besonderen Ausführungsform kann das Oligonukleotid nur aus Desoxyribonukleotiden bestehen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das Oligonukleotid wenigstens ein 2'-O-Methylribonukleotid. In besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen besitzt das Oligonukleotid fünf 2'-O-Methylribonukleotide am 3'-Ende oder an den 3'- und 5'-Enden. Weitere Ausführungsformen umfassen wenigstens einen oder wenigstens zwei Inosin-Reste an irgendeiner Position in dem Oligonukleotid.
Insbesondere besitzen in einer Ausführungsform die erfindungsgemäßen Oligonukleotide eine der in Tabelle 1A gezeigten Sequenzen oder eine im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 36, 37 und 38 dargestellte Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide eine in Tabelle 1B als SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 und 130 dargestellte Nukleotidsequenz. All diese Oligonukleotide können weiter, wie in der Beschreibung dargestellt, modifiziert sein.
In weiteren Aspekten wird erfindungsgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist ein physikalisches Gemisch von wenigstens einem und vorzugsweise zwei oder mehreren HPV-spezifischen Oligonukleotiden mit derselben oder verschiedenen Sequenzen, Modifikation(en) und/oder Längen. In manchen Ausführungsformen umfasst diese pharmazeutische Formulierung auch einen physiologisch oder pharmazeutisch verträglichen Träger. Spezifische Ausführungsformen umfassen eine therapeutische Menge eines Lipidträgers.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind für die Verwendung als therapeutisch aktive Verbindungen geeignet, insbesondere für die Verwendung bei der Kontrolle oder Prävention von menschlicher Papillomavirusinfektion.
In diesem Aspekt der Erfindung wird eine therapeutische Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die HPV-spezifische, synthetische Oligonukleotide enthält, an eine Zelle verabreicht, um die Replikation von menschlichem Papillomavirus zu hemmen. In einem ähnlichen Aspekt können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide für die Behandlung von menschlicher Papillomavirusinfektion verwendet werden, wobei unter anderem eine therapeutische Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die wenigstens ein HPV-spezifisches Oligonukleotid und in manchen Ausführungsformen wenigstens zwei HPV-spezifische Oligonukleotide enthält, an ein infiziertes Tier oder eine Zelle verabreicht wird. In manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Verabreichung wenigstens eines Oligonukleotids oder wenigstens zweier Oligonukleotide mit einer in Tabelle 1A oder im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1-11, 16, 18-28, 21-32 und 36-38 oder in Tabelle 1B als SEQ ID NO: 41-111, 116-122 und 130 dargestellten Sequenz, einschließlich Modifikationen davon.
In allen Verfahren, die eine Verabreichung von (einem) erfindungsgemäßen Oligonukleotid(en) umfassen, können wenigstens ein und vorzugsweise zwei oder mehr identische oder verschiedene Oligonukleotide zugleich oder nacheinander in einer einzigen Behandlung in Form von getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von HPV in einer Probe wie einer Lösung oder biologischen Probe bereit. Bei diesem Verfahren wird die Probe mit einem erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotid oder mit einem Oligonukleotid mit einer dazu komplementären Sequenz in Kontakt gebracht. Eine Hybridisierung des Oligonukleotids an die HPV-Nukleinsäure wird sodann nachgewiesen, falls HPV sich in der Probe befindet.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt sind Kits für den Nachweis von HPV in einer Probe. Derartige Kits umfassen wenigstens ein erfindungsgemäßes synthetisches Oligonukleotid oder ein Oligonukleotid mit einer dazu komplementären Sequenz und Mittel zum Nachweis des an die Nukleinsäure hybridisierten Oligonukleotids. In einem Kit mit mehr als einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid können diese Oligonukleotide die gleiche oder verschiedene Nukleotidsequenzen, Länge und/oder Modifikation(en) besitzen.
Erfindungsgemäße synthetische Oligonukleotide, die für die E1-Nukleinsäure, insbesondere mRNA, spezifisch sind, bestehen aus Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, 2'-O-Methylribonukleotiden oder irgendeiner Kombination davon, wobei das 5'-Ende eines Nukleotids und das 3'-Ende eines anderen Nukleotids kovalent miteinander verbunden sind. Diese Oligonukleotide sind wenigstens 15 Nukleotide lang, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotide, wobei 20 bis 30mere am häufigsten sind.
Die Oligonukleotide können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die Nukleotide kovalent miteinander durch bekannte Verfahren wie Phosphoramidit-, H-Phosphonat- oder Methylphosphoramidit-Chemien miteinander verknüpft werden (vgl. z. B. Goodchild (1990), Bioconjugate Chem. 2: 165-187; Uhlmann et al. (1990), Chem. Rev. 90: 543-584; Caruthers et al. (1987), Meth. Enzymol. 154: 287-313; US-PS 5,149,798). Diese Verfahren können durch manuelle oder automatische Synthese erfolgen und die Oligonukleotide werden sodann weiterbehandelt (eine Übersicht findet sich in Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152-158).
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können auch auf verschiedene Art und Weise modifiziert sein, ohne dass ihre Fähigkeit, an die HPV-Nukleinsäure zu hybridisieren, beeinträchtigt wird. Zum Beispiel können die Oligonukleotide andere Internukleotid-Bindungen als Phosphodiester-Internukleotid-Bindungen zwischen dem 5-Ende eines Nukleotids und dem 3'-Ende eines anderen Nukleotids enthalten, bei denen das 5'-Nukleotidphosphat durch irgendeine chemische Gruppe wie Phosphorothioat ersetzt wurde. Oligonukleotide mit Phosphorothioatbindungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wie z. B. durch Phosphoramidit-Chemie (vgl. z. B. Agrawal et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079-7083) oder H-Phosphonat-Chemie (vgl. z. B. Froehler (1986), Tetrahedron Lett. 27: 5575-5578). Die von Bergot et al. ((1992), J. Chromatog. 559: 35-42) beschriebenen Verfahren können ebenfalls eingesetzt werden. Beispiele anderer chemischer Gruppen, die eine Internukleotid-Bindung bilden können, umfassen Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Acetamidate, Carboxymethylester, Carbonate und Phosphattriester.
Beispielhaft für eine Kombination von Internukleotid-Bindungen beschreibt die US-PS 5,149,797 herkömmliche chimäre Oligonukleotide mit einer Phosphorothioat-Kernregion, die zwischen flankierenden Methylphosphonat- oder Phosphoramidat-Bereichen liegt. Andere Chimäre sind "umgekehrte" chimäre Oligonukleotide, die einen oder mehrere nicht-ionische Oligonukleotidbereiche (z. B. Alkylphosphonat- und/oder Phosphoramidat- und/oder Phosphotriester-Internukleosid-Bindung) umfassen, die von einer oder mehreren Regionen aus Oligonukleotid-Phosphorothioaten flankiert werden. Chimäre und umgekehrte Chimäre können wie in den Beispielen für Methylphosphonat-enthaltende Oligonukleotide beschrieben synthetisiert werden. Diese "chimären" und "umgekehrt chimären" Oligonukleotide sind bevorzugte Modifikationen der erfindungsgemäßen Oligonukleotide.
Verschiedene Oligonukleotide mit modifizierten Internukleotid-Bindungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden (vgl. z. B. Goodchild (1990), Bioconjugate Chem. 2: 165- 187; Agrawal et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079-7083; Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 534-583 und Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152-158).
Selbst-stabilisierte Oligonukleotide werden auch als modifizierte Oligonukleotide betrachtet und sind in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar (Tang et al. (1993), Nucleic Acids Res. 20: 2729-2735). Diese Oligonukleotide umfassen zwei Regionen: eine an das Ziel hybridisierende Region und eine selbst-komplementäre Region mit einer Oligonukleotidsequenz, die zu einer sich innerhalb des selbst-stabilisierten Oligonukleotids befindlichen Nukleinsäuresequenz komplementär ist. Diese Oligonukleotide bilden Schleifenstrukturen, die vermutlich das 3'-Ende gegenüber einem Exonuklease-Angriff stabilisieren, wobei eine Hybridisierung an das Ziel immer noch möglich ist.
Auf der anderen Seite umfassen Zucker-Modifikationen Modifikationen an der 2-Position des Riboserests, einschließlich in nicht beschränkender Weise 2'-O-Substitutionen durch eine -O-Niederalkylgruppe mit 1-6 gesättigten oder ungesättigten Kohlenstoffatomen oder durch eine -O-Aryl- oder -Allylgruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, wobei die -O-Alkyl-, -Aryl- oder -Allylgruppe nicht substituiert oder substituiert sein kann (z. B. durch Halogen-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxy-, Carbalkoxy- oder Aminogruppen) oder wobei die 2-O-Gruppe durch eine Amino- oder Halogengruppe substituiert ist. Keine dieser Substitutionen soll die native 2'-Hydroxylgruppe im Fall von Ribose oder die 2'-H-Gruppe im Fall von Desoxyribose ausschließen. Die WO 94/02498 beschreibt herkömmliche hybride Oligonukleotide mit Regionen aus 2'-O-substituierten Ribonukleotiden, die eine DNA-Kernregion flankieren. Eine weitere Form eines Hybrids ist ein "umgekehrtes" hybrides Oligonukleotid, z. B. ein Oligonukleotid, das eine 2'-O-substituierte (oder 2'-OH-nicht-substituierte) RNA-Region umfasst, die zwischen zwei Oligodesoxyribonukleotid-Regionen liegt, eine Struktur, die im Vergleich zu "herkömmlichen" hybriden Oligonukleotiden umgekehrt ist. Hybride und umgekehrte hybride Oligonukleotide können wie in den Beispielen für Oligonukleotide mit 2'-O-Methyl-RNA beschrieben synthetisiert · werden. Die erfindungsgemäßen hybriden und umgekehrten hybriden Oligonukleotide sind aufgrund ihrer erhöhten Stabilität und Aktivität in Gegenwart von Serum besonders bevorzugt. In einer weiteren Ausführungsform kann das hybride oder umgekehrt hybride Oligonukleotid wenigstens eine n-Butyl-Phosphoramidat- oder Methylphosphonat-Bindung umfassen.
Vorzugsweise ist das Ribonukleotid ein 2'-O-Methyl-Ribonukleotid. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid wenigstens ein, vorzugsweise ein bis fünf 2'-O- Methyl-Ribonukleotide am 3'-Ende des Oligonukleotids. Außerdem kann das Oligonukleotid ferner wenigstens ein, vorzugsweise ein bis fünf 2-O-Methyl-Ribonukleotide am 5'-Ende umfassen.
Weitere erfindungsgemäße Oligonukleotid-Strukturen umfassen die sogenannten Hantel- und offenen Hantel-Strukturen (Tabelle 1B). Ashly und Kushlan ((1991), Biochem. 30: 2927- 2933) beschreiben die Synthese von Oligonukleotid-Hanteln, einschließlich offenen Hanteln. Eine Hantel ist ein durch zwei Haarnadelschleifen abgeschlossener doppelhelikaler Stamm. Die Antisense-Aktivität offener Hanteln (Hantel-Moleküle mit freien Enden) wird von Yamakawa et al. ((1996), Nucleosides and Nucleotides 15: 519-529) erörtert. Man glaubt, dass diese Strukturen günstige Eigenschaften besitzen, ähnlich zu denen der selbst-stabilisierten Oligonukleotide, die vorstehend beschrieben wurden.
Weitere Modifikationen können im oder an dem (den) Ende(n) des Oligonukleotid-Moleküls liegen und umfassen Anfügungen an die Internukleosid-Phosphatbindungen des Moleküls, wie Cholesteryl-, Cholesterin- oder Diaminverbindungen mit einer verschiedenen Anzahl von Kohlenstoffresten zwischen den beiden Aminogruppen, und Modifikationen der terminalen Ribose, Desoxyribose und des Phosphats, die die gegenüberliegenden Ketten oder assoziierte Enzyme oder andere Proteine, die an das Virusgenom binden, vernetzen oder abspalten. Weitere Linker, einschließlich Nicht-Nukleosid-Linker, umfassen in nicht beschränkender Weise Polyethylenglykol mit einer unterschiedlichen Länge, wie Triethylenglykol, Monoethylenglykol, Hexaethylenglykol (Ma et al. (1993), Nucleic Acids Res. 21: 2585-2589; Benseler et al. (1993), J. Am. Chem. Soc. 115: 8483-8484), Hexylamin und Stilben (Letsinger et al. (1995), J. Am. Chem. Soc. 117: 7323-7328) oder jeden anderen käuflich erhältlichen Linker, einschließlich nicht-basische Linker oder käuflich erhältliche asymmetrische und symmetrische Linker (Clone Tech, Palo Alto, Kalifornien) (z. B. Glen, Research Produktkatalog, Sterling, VA).
Weitere Beispiele modifzierter Oligonukleotide umfassen die mit einer modifizierten Base und/oder einem modifizierten Zucker wie Arabinose anstelle von Ribose oder ein 3,5'-substituiertes Oligonukleotid mit einem Zucker, bei dem an der 3'- oder 5'-Position oder an beiden Positionen eine chemische Gruppe außer einer Hydroxyl- oder Phosphatgruppe (an der 3'- oder 5'-Position) gebunden ist.
Außerdem können Oligonukleotide mit einem Ribose-Cap am 3'-Ende einer NalO&sub4;-Oxidation/reduktiven Aminierung unterzogen werden. Beispiele für derartige Spezies finden sich in Tabelle 1B. Eine Aminierung umfasst in nicht beschränkender Weise die nachstehenden Reste: Spermin, Spermidin, Tris-(2-aminoethyl)-amin (TAEA), DOPE, langkettige Alkylamine, Kronenether, Co-Enzym A, NAD, Zucker, Peptide, Dendrimere.
In einer weiteren Ausführungsform kann wenigstens eine Cytosinbase durch eine bekannte Methylierung modifiziert sein, z. B. 5'-methyliertes Desoxycytosin (5-Me-dC) (vgl. Tabelle 1B). Eine derartige Methylierung kann z. B. für die Reduzierung einer Stimulation des Immunsystems durch das Oligonukleotid, falls notwendig, gewünscht sein.
Weitere modifizierte Oligonukleotide tragen ein Cap mit einem raumgreifenden Substituenten an den 3'- und/oder 5'-Enden, der Resistenz gegenüber Nuklease verleiht, oder tragen eine Substitution an einem oder beiden Nicht-Brücken-Sauerstoffen pro Nukleotid. Derartige Modifikationen können an manchen oder allen Internukleosid-Bindungen vorliegen, sowie an einem oder beiden Enden des Oligonukleotids und/oder im inneren des Moleküls (vgl. Übersicht in Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152-158). Nicht-beschränkende Beispiele der Spezies mit einem Cap umfassen 3'-O-Methyl, 5'-O-Methyl, 2'-O-Methyl und Kombinationen davon, wie in Tabelle 1 B gezeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Oligonukleotid eine komplementäre Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 1 (HPV1), 11 (HPV19), 18 (HPV30), 19 (HPV31), 20 (HPV32), 21 (HPV33) und 26 (HPV38), wie in Tabelle 1A gezeigt, einschließlich Modifikationen davon.
In einer weiteren Ausführungsform besitzt das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 54 (HPV56), 118 (HPV53), 119 (HPV52) und 121 (HPV50), wie in Tabelle 1B gezeigt, einschließlich Modifikationen davon.
In einer besonderen Ausführungsform bestehen die Oligonukleotide der zuvor genannten zwei Ausführungsformen aus Desoxyribonukleotiden und besitzen Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen mit SEQ ID NOS: 1, 41-111, 116-122 und 130, wie in Tabelle 1B dargestellt, wobei das Oligonukleotid die Internukleotid-Bindungszusammensetzung und weitere Modifikationen, wie in Tabelle 1B dargestellt, besitzt.
Am besten besitzt das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz und weitere Modifikationen, wie für ein Oligonukleotid angegeben, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NOS: 88 (HPV1 8-4-8 IH 2'-Ome PO), 88 (HPV1 8-4-8 IH 2'-OMe PS), 89 (7-6-7 IH 2'- OMe PO), 89 (7-6-7 IH 2'-OMe PS), 90 (HPV1 9-6-5 IH 2'-OMe PO), 90 (HPV1 9-6-5 IH 2'- OMe PS), 91 (5-6-9 IH 2'-OMe PO), 91 (5-6-9 IH 2'-OMe PS), 92 (10-6-4 IH 2'-OMe PO), 92 (10-6-4 IH 2'-OMe PS), 93 (HPV1 6-8-6 IH 2'-OMe PO), 93 (HPV1 6-8-6 IH 2'-OMe PS) und 96 (HPV1 0 · 5 Hybrid), aus SEQ ID NOS: 41 (SS1), 42 (SS2), 43 (SS3), 44 (SS4), 49 (SS9) und 51 (SS11), aus SEQ ID NOS: 54 (HPV56 CAP), 57 (SS16), 59 (SS18), 65 (SS26), 67 (SS28) und aus 104 (HPV56 0 · 5 Hybrid), und aus SEQ ID NOS: 1 (HPV1 5-Me-dC), 24 (HPV36 5-Me-dC) und 112 (HPV43 5-Me-dC).
20mer-Phosphorothioat-Oligonukleotide, die komplementär zum E1-Gen der HPV-Stämme 6a und 6b (in vitro-transkribierte RNA = 2328 Basen) sind, wurden mit einem Ribonuklease H (RNase H)-Test mit 100 nM synthetischem Oligonukleotid und in vifro-transkribierter RNA getestet. Der RNase H-Test identifizierte Regionen der Ziel-RNA, die für das Antisense-Oligonukleotid zugänglich waren. Eine Spaltung zeigte, dass das Oligonukleotid an die Ziel- RNA so hybridisiert hatte, dass das Ziel durch RNase H gespalten wurde. Die Ergebnisse der RNase H-vermittelten Spaltung sind in Tabelle 1A gezeigt. Position +1 der E1-Zielstelle ist die erste Base der Startstelle für die Translation. TABELLE 1A
a mögliches Triplex-bildendes Oligonukleotid
b die Kleinbuchstaben stellen eine Base mit einer Fehlpaarung dar, kursive Buchstaben stellen Triplex-bildende Basen dar. Die Internukleotid-Bindung ist PS, es sei denn, es ist anders beschrieben.
Diese Ergebnisse deuten an, dass die nahe zur Translationsstartstelle (AUG) gelegene Region zugänglich für Antisense-Oligonukleotide ist und durch RNase H gespalten werden kann. Die Daten definieren ferner eine sehr aktive Region für eine Hybridisierung und Spaltung im Bereich von -13 bis +20. Die besten dieser Oligonukleotide waren HPV1 (+1 bis +20) (SEQ ID NO: 1), HPV3 (-9 bis +11) (SEQ ID NO: 3), HPV4 (-13 bis +7) (SEQ ID NO: 4) und HPV5 (-5 bis +15) (SEQ ID NO: 5).
Weiterhin wurden vier Regionen in der stromabwärts gelegenen kodierenden Region, die für eine Hybridisierung mit Antisense-Oligonukleotiden zugänglich erscheinen, mit dem Randomer-RNase H-Test identifiziert. Die an diese Regionen bindenden hergestellten Oligonukleotide sind HPV20 (+203 bis +222) (SEQ ID NO: 12), HPV21 (+231 bis +250) (SEQ ID NO: 13), HPV22 (+282 bis +301) (SEQ ID NO: 14) und HPV23 (+373 bis +392) (SEQ ID NO: 15). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1A gezeigt. Die Daten lassen vermuten, dass die Region bei +373 die Stelle ist, die am stärksten durch RNase H in Gegenwart der komplementären DNA-Phosphorothioat-Sequenz gespalten wird.
Die Oligonukleotide, die außerhalb der E1-Luciferase-Fusionszielsequenzen identifiziert wurden, können durch Untersuchung der Expression des vollständigen E1-Genprodukts getestet werden (vgl. nachstehendes Beispiel 6).
Diese und andere Antisense-Oligonukleotide, die gegen die Translationsstartstelle gerichtet sind, wurden in Säugerzellen mit Hilfe von Reportergentests unter Verwendung von Luciferase aus Glühwürmchen getestet. Die 46 Nukleotide lange Region des HPV E1-Gens von den Nukleotiden -17 bis +29 relativ zur Translationsstartstelle wurde 5' zu und im Raster mit dem gesamten offenen Leserahmen des Glühwürmchen-Luciferase-Gens in dem Plasmid pGLori kloniert, um das Plasmid pE1Luc6 herzustellen. Die Transkription dieser E1-Luciferase-Genfusion wurde unter die Kontrolle des Promotors für das frühe Gen aus Cytomegalovirus gestellt. Die Expression der E1-Luciferase-Fusion in Säugerzellen wurde in einem Luminometer durch Zugabe von Luciferinsubstrat und ATP-Co-Faktor zu Zelllysaten quantifiziert. Die Verminderung der Luciferasemengen in mit Antisense-Oligonukleotiden behandelten Zellen im Vergleich zu den Luciferasemengen in mit einer negativen Kontrolle (zufälliges Oligonukleotid; Randomer) behandelten Zellen dient als Maß der sequenzspezifischen Aktivität der Antisense-Oligonukleotide.
In allen zellulären Antisense-Tests wurde ein 20mer Phosphorothioat-Oligonukleotid mit einer zufälligen Sequenz als Negativkontrolle verwendet. Ferner wurde ein 20mer Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid, das gegen die ersten 20 Nukleotide der kodierenden Region des Glühwürmchen-Luciferase-Gens gerichtet war, als Positivkontrolle verwendet (Luc +1 - +20) (SEQ ID NO: 39). Dieses Ziel ist in den E1-Fusions- und Kontroll-Luciferase- Konstrukten vorhanden.
Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-K1) wurden stabil mit dem pE1Luc6-Konstrukt transfiziert. Der Prozentsatz an Luciferase-Expression, gemessen relativ zu der wirksamen Konzentration der Kontrolle (EC&sub5;&sub0;), wurde sodann für das Oligonukleotid gemessen, die eine Hemmung von 50% der Kontrolle (d. h. Zellen, die nur mit Lipid behandelt wurden) ergibt. Die Phosphorothioat (PS)-20mer-Oligonukieotide 1, 3, 4, 5, und 17 zeigten alle eine sequenzspezifische Antisense-Aktivität gegen das E1 Luc6-Ziel, genauso wie das Luc +1 - +20 PS-Antisense-Oligonukleotid der Positivkontrolle, das gegen die ersten 20 Nukleotide der kodierenden Region des Luciferase-Gens gerichtet war. Zwei E1-spezifische 20mer-Oligonukleotide, 2 und 6, und das zufällige PS-20mer-Oligonukleotid der Negativkontrolle zeigten nur geringe oder keine Aktivität (Fig. 2). Es gab einen deutlichen Zusammenhang zwischen der in vitro-RNase H-Spaltung der Ziel-RNA und der sequenzspezifischen Antisense-Aktivität in stabil transfizierten Zellen (Fig. 2). Keines der Oligonukleotide mit Ausnahme des Luc +1 - +20-Oligonukleotids der Positivkontrolle zeigte eine sequenzspezifische Antisense-Aktivität in CHO-K1-Zellen, die stabil mit dem parentalen pGLori-Konstrukt transfiziert worden waren, das nur das Luciferase-Gen trägt.
Die in der nachstehenden Tabelle 1B aufgeführten weiteren Oligonukleotide zeigten ebenfalls Aktivität.

GROßBUCHSTABEN STELLEN DIE ANTISENSE-SEQUENZ DAR

Kleinbuchstaben stellen die Nicbt-Antisense-Sequenz dar
Umrissene Reste sind basengepaart
Die unterstrichene Sequenz ist 2'-OMe-RNA
Die fettgedruckte Sequenz ist Methylphosphonat
L= nicht-nukleosidischer Polyethylenglykol (PEG) -Linker
Die Internukleotid-Bindung ist PS, es sei denn, es ist anders erwähnt
Antisense-Tests mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden wurden ebenfalls in transient transfizierten CHO-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden mit Hilfe des Lipidträgers Lipofectamin entweder mit dem Plasmid pE1 Luc6 oder dem Kontrollplasmid pGLori in Gegenwart von PS-Oligonukleotiden transfiziert (Fig. 3). Zwei unabhängige Verfahren zur Analyse der Antisense-Aktivität wurden durchgeführt. Bei dem ersten Verfahren wurde die Menge des Reporterplasmids über einen 1000-10000-fachen Bereich titriert, um den linearen Bereich der Luciferase-Expression unter diesen Testbedingungen zu bestimmen. Antisense- Oligonukleotide wurden in festen Konzentrationen zu jeder dieser Plasmid-Verdünnungsreihen hinzugegeben und die Luciferase-Aktivität gemessen. Eine Abnahme des Luciferase- Signals in einer Plasmid-Titrationskurve, verursacht durch die Zugabe von Oligonukleotid, zeigt einen Antisense-Effekt. Dieses Verfahren wurde später durch Fixierung der Konzentration des Reporter-Plasmids bei einem Optimum verbessert, um die für einen spezifischen Antisense-Effekt erforderliche Menge eines Oligonukleotids genau zu titrieren. Dieses Verfahren wurde für die Bestimmung der relativen Luciferase-Expression, gemessen in relativen Luciferase-Einheiten (vgl. Fig. 4 und 5) für bestimmte Verbindungen, und für die Bestimmung kleiner Unterschiede in ihrer Aktivität eingesetzt.
Die Fig. 4 und 5 zeigen, dass Phosphorothioat-Oligonukleotide, die in dieser Region getestet wurden, einschließlich HPV1 (SEQ ID NO: 1), HPV2 (SEQ ID NO: 2), HPV3 (SEQ ID NO: 3), HPV4 (SEQ ID NO: 4), HPV5 (SEQ ID NO: 5) und HPV6 (SEQ ID NO: 6), aktive Antisense-Verbindungen sind. HPV17 (SEQ ID NO: 9) war ebenfalls in diesem Test aktiv. Die Randomer-Negativkontrolle verursachte geringe Wirkungen bei beiden Plasmiden bis zu 300 nM. Die Luc +1 - +20-Positivkontrolle, die gegen beide Konstrukte gerichtet ist, zeigt eine spezifische Antisense-Aktivität gegen beide Konstrukte. HPV-spezifische Antisense-Aktivität tritt bei Konzentrationen von weniger als 1 nM bis mehr als 300 nM auf. HPV1 bis 6 zeigen ähnliche spezifische Aktivitäten gegen pE1Luc6 (Fig. 4 und 5). Bei 100 nM vermindern alle Verbindungen spezifisch die Expression von E1-Luciferase um mehr als 90% im Vergleich zu der Randomer-Kontrolle. Bei Konzentrationen von mehr als 100 nM besitzen die Randomer-Oligonukleotide nicht-sequenzspezifische Hemmwirkungen in dem transient transfizierten Zellsystem. Entsprechend sind die Daten nicht für Oligonukleotidkonzentrationen über 100 nM gezeigt. Gegenüber der Genexpression von dem Kontrollplasmid pGLori zeigen diese Verbindungen die gleiche Wirkung wie das Randomer, was zeigt, dass sie nur spezifisch gegen die HPV E1-Sequenz gerichtet sind.
HPV24 (SEQ ID NO: 29) ist eine 28mer-Variante von HPV17 (SEQ ID NO: 9) mit einem 3'- Anhängsel, das so geschaffen war, das es sich rückfaltete, um eine stabilisierende Triplex- Struktur zu bilden. In dem Test mit transient transfizierten CHO-Zellen behielt dieses Oligonukleotid die Antisense-Aktivität. Andere ähnliche Oligonukleotide zeigten auch Antisense- Aktivität (vgl. Tabelle 1B).
Die Verwendung eines Gemisches verschiedener Oligonukleotide, die gegen verschiedene konservierte Stellen innerhalb eines bestimmten viralen Gens gerichtet sind, kann erwünscht sein. Ein derartiges Oligonukleotid-Gemisch kann in Form einer therapeutischen Zusammensetzung vorliegen, die wenigstens ein, zwei oder mehr Oligonukleotide in einer einzigen therapeutischen Zusammensetzung umfasst (d. h. eine Zusammensetzung, die ein physikalisches Gemisch von wenigstens zwei Oligonukleotiden umfasst). Alternativ können diese Oligonukleotide zwei verschiedene Sequenzen besitzen. Zum Beispiel wurden verschiedene Verbindungen gemischt, die gegen verschiedene, getrennte oder überlappende Regionen innerhalb des E1-Luciferase-Transkripts gerichtet sind, wobei die absolute Oligonukleotid- Konzentration bei 100 nM gehalten wurde. Fig. 6 zeigt, dass E1-spezifische Oligonukleotide im Gemisch mit anderen E1-spezifischen Oligonukleotiden, Randomer oder Luc +1 - +20, aktiv waren. Dies zeigt, dass niedrigere Konzentrationen einzelner Oligonukleotide miteinander kombiniert werden können, um eine starke spezifische Antisense-Aktivität beizubehalten.
Eine relevante Zelllinie für die Messung der Antisense-Aktivität gegen HPV ist die Zielzelle des Virus, menschliche Keratinozyten. Erfindungsgemäße HPV-spezifische Oligonukleotide wurden in Tests mit einer transienten Transfektion untersucht, die den vorstehenden für CHO-Zellen ähnlich sind. Die menschlichen, epidermalen Vorhaut-Keratinozyten von Neugeborenen (NHEK) wurden transient mit pE1Luc6 oder pGLori mit Hilfe des Lipidträgers Lipofectamin transfiziert. PS-Oligonukleotide wurden zu den Zellen in Gegenwart eines Lipidträgers hinzugegeben. Die in Fig. 7 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Luciferase- Expression in Gegenwart eines zufälligen Oligonukleotids oder bei Fehlen eines Oligonukleotids in den Keratinozyten stark ist (zwischen 10&sup6; und 10&sup7; relative Strahlungseinheiten (RLU) in jedem Loch). Das Randomer verursacht keine messbaren nicht-spezifischen Wirkungen in Zellen, die mit einem der beiden Reporterplasmide pE1 Luc6 oder pGLori transfiziert worden waren. Das HPV1-Oligonukleotid, das in Gegenwart von Lipofectamin zu Zellen hinzugegeben wurde, die mit pE1 Luc6 transfiziert worden waren, verringerte die Luciferase-Expression auf 2 · 10&sup4; RLU bei einer Konzentration von 100 nM, was eine sequenzspezifische Wirkung zeigt. Eine ähnliche Wirkung wurde beobachtet, falls die Oligonukleotide bei Fehlen eines Lipidträgers hinzugegeben wurden.
Somit konnte in diesen Versuchen eine Oligonukleotid-spezifische Verringerung der Reporterplasmid-Expression bei normalen menschlichen Keratinozyten gezeigt werden, falls die Oligonukleotide mit einem Lipidträger an die Zellen verabreicht wurden.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Oligonukleotide kann bei in vitro-kultivierten dreidimensionalen Epithelien bestätigt werden. Dies umfasst das Aufbringen von HPV-positiven Keratinozyten auf eine Kollagenmembran (Kollagen-Floß) und die Kultivierung der Zellen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Die in diesen Versuchen verwendeten Keratinozyten können aus normaler Vorhaut von Neugeborenen stammen oder können aus Condylomata acuminata-Biopsiematerial erhalten werden. Diese Kollagen-Floß-Kulturen (organotypisch) lassen die Keratinozyten differenzieren und eine dreidimensionale Struktur bilden die ähnlich zu der in vivo vorkommenden ist. Dieser gerichtete Vorgang der normalen zellulären Differenzierung kann eine vegetative Replikation von Papillomavirus erlauben, ein Vorgang, der die Replikation des viralen Genoms in der Zelle erfordert. Antisense-Oligonukleotide werden zu dem Kulturmedium unter dem Floß hinzugegeben. Wie in vivo müssen die Oligonukleotide von den Keratinozyten aufgenommen werden und müssen die Zellen erreichen, wo eine aktive virale DNA-Replikation stattfindet, um diesen Vorgang zu verhindern. Die Wirkung von Antisense-Oligonukieotiden auf den Lebenszyklus von HPV kann durch Sichtbarmachung der Menge des Virus in jeder Floß-Kultur überwacht werden, wobei in situ-Hybridisierung mit Sonden für HPV-DNA eingesetzt wird. Eine Quantifizierung kann durch Bildanalyse erfolgen. Zusätzlich kann die Expression einzelner viraler Gene gezeigt und der mögliche Wirkmechanismus des Antisense-Oligonukleotids bestimmt werden, falls für einzelne virale offene Leserahmen spezifische Ribo-Sonden verwendet werden. Eine gewöhnliche immunohistochemische Analyse der Kollagen-Floßkulturen wird ebenfalls eingesetzt, um die Expression (oder das Fehlen) viraler Proteine zu zeigen. Zusätzlich wird klassische Histologie, verbunden mit Immunohistochemie ebenfalls eingesetzt, um einen Zusammenhang zwischen einer aktiven Papillomavirusinfektion, atypischer Zellhistologie und fehlerhafter zellulärer Differenzierung zu zeigen.
Für die Bestimmung, ob erfindungsgemäße Oligonukleotide eine sequenzspezifische Antisense-Aktivität besaßen, wurde eine steigende Anzahl an Fehlpaarungen in die HPV1- Sequenz eingebracht: die G-Reste wurden nacheinander zu A mutiert (vgl. Tabelle 1A, in der die Kleinbuchstaben in HPV7-10, 12-14 und 29 die Position von Fehlpaarungen relativ zu der Zielsequenz darstellen). Mit CHO-K1-Zellen, die stabil mit dem E1Luc6-Konstrukt transfiziert worden waren, wurde gezeigt, dass eine Fehlpaarung nicht merklich die sequenzspezifische Antisense-Aktivität beeinflusste, dass jedoch zwei oder mehr Fehlpaarungen die Aktivität von HPV1 (SEQ ID NO: 1) beseitigten (Fig. 8). Dies stimmte mit der Wirksamkeit der RNase H-Spaltung der in Tabelle 1A gezeigten Oligonukleotide überein. HPV7 (SEQ ID NO: 31) mit einer Basen-Fehlpaarung zeigte keine Wirkung auf die RNase H- Spaltung. Zwei Fehlpaarungen (HPV8, SEQ ID NO: 32) verminderten jedoch die RNase H- Spaltung um 50% und drei Fehlpaarungen (HPV9, SEQ ID NO: 33) beseitigten im wesentlichen die RNase H-Aktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden in dem System mit transient transfizierten CHO-Zellen erhalten.
Für die Entwicklung einer Verbindung, die gegen viele klinische Isolate von HPV wirksam ist, ist die Auswahl einer stark-konservierten Region von E1 notwendig. Jedoch können Basen- Fehlpaarungen in den Antisense-Oligonukleotiden vorkommen, die gegen mehr als einen HPV-Typ gerichtet sind, und zwei Basen-Fehlpaarungen können die Antisense-Aktivität von HPV1 beseitigen (vgl. Fig. 8). Eine Lösung für das Problem der Sequenzvariation ist die Schaffung von Oligonukleotiden, die an viele Sequenzen binden können. Ein Oligonukleotid wurde entworfen, bei dem Fehlpaarungen durch Inosin-Nukleoside ersetzt sind (HPV12-14, Tabelle 1A, Fig. 9, wo das "i"-Ende in den Oligonukleotiden HPV12-14 die Positionen zeigt, wo die fehlgepaarten Basen durch Inosinreste ersetzt wurden). Inosin bildet Wasserstoffbrücken mit allen normalen Basen in einem unterschiedlichen Ausmaß. In dem Testsystem mit stabiler Transfektion stellte ein Austausch der einen oder anderen Fehlpaarung in HPV8 (SEQ ID NO: 32) durch Inosin teilweise die Antisense-Aktivität wieder her (Fig. 9). Ein Austausch beider Fehlpaarungen durch Inosin stellte jedoch die Antisense-Aktivität nahezu von HPV1 her. Dieses stimmt wiederum mit den Daten der RNase H-Spaltung, die in Tabelle 1A gezeigt sind, überein. In Gegenwart von zwei Fehlpaarungen (HPV8, SEQ ID NO: 32) verringerte sich die Spaltungseffizienz auf 52% gegenüber der von HPV1. Ein Austausch der am weitesten 5' gelegenen Fehlpaarung (in dem Oligonukleotid) durch Inosin (HPV12, SEQ ID NO: 36) erhöhte die Spaltung auf 61% gegenüber HPV1. Ein Austausch von nur der am weitesten 3' gelegenen Fehlpaarung durch Inosin (HPV13, SEQ ID NO: 37) verringerte die Wirkung der Fehlpaarung wirksamer und erhöhte die Spaltung auf 76% gegenüber HPV1. Ein Austausch beider Fehlpaarungen durch Inosin (HPV14, SEQ ID NO: 38) erhöhte die Spaltung noch weiter auf 81% gegenüber HPV1. Dies zeigt, dass die Positionierung von Inosin an den Stellen, wo sich Unterschiede zwischen den Stämmen befinden, eine Aktivität der Oligonukleotide gegen mehrere HPV-Stämme ermöglicht. Ähnliche Ergebnisse wurden bei einem Vergleich von HPV8 gegenüber HPV14 in transient transfizierten CHO-Zellen erhalten.
Das Verhältnis zwischen Oligonukleotidlänge und -aktivität wurde ebenfalls untersucht. Eine Verlängerung des 20mer-HPV1 am 3'-Ende auf ein 24mer (HPV15, SEQ ID NO: 8) oder 28mer (HPV11, SEQ ID NO: 7) zeigte keine Wirkung auf die Antisense-Aktivität des Oligonukleotids, wie gemessen in den Luciferase-Tests mit stabil oder transient transfizierten CHO-K1-Zellen. Weiterhin zeigte in dem System mit stabil transfizierten CHO-Zellen eine allmähliche Verkürzung von Basen am 5'- oder 3'-Ende von HPV1 (HPV30-39, Tabelle 1A), dass die Antisense-Aktivität beibehalten wurde, selbst wenn vier Basen vom 5'-Ende (Fig. 10A) und fünf Basen vom 3-Ende (Fig. 10B) entfernt worden waren.
Die Wirkung von chemischen Modifikationen auf die Antisense-Aktivität wurde ebenfalls untersucht. Mehrere verschiedene chemische Modifikationen wurden getestet: 5 Nukleotide am 3'-Ende mit Methylphosphonat- oder 2'-O-Methyl-RNA-chemischen Modifikationen; 5 Nukleotide am 5'- und 3'-Ende mit 2'-O-Methyl-RNA-chemischen Modifikationen und vollständige 2'-O-Methyl-PO- und -PS-Oligonukleotide.
Fig. 12 zeigt die Daten für die verschiedenen chemischen Modifikationen, gestestet in stabil transfizierten CHO-K1-Zellen. Das Einbringen von fünf 2'-O-Methyl-RNA-chemischen Modifikationen am 3'-Ende oder an den 3'- und 5'-Enden der Sequenz scheint die Aktivität des 20mer-PS-HPV1 zu erhöhen, während ähnliche Methylphosphonat-Modifikationen die Aktivität des 20mer-PS-HPV1 verminderten. Längere Oligonukleotide verbesserten die Aktivität von Methylphosphonat-Modifikationen am 3'-Ende. Oligonukleotide mit einem ausschließlichen 2'-O-Methyl-RNA-Rückgrat mit PO- oder PS-Bindungen waren inaktiv, was für eine Rolle der RNase H bei der Antisense-Aktivität spricht. Verbindungen mit einem n-Butyl- Phosphoramidat-Rückgrat, 5 n-Butyl-Phosphoramidaten am 3'-Ende oder einer gemischten n-Butyl-Phosphoramidat- und 2'-O-Methyl-RNA-Struktur sollten aktiv sein und eine Aktivität besitzen, die zwischen der von den Phosphorothioat- und Methylphosphonat-Verbindungen liegt.
Die 2'-O-Methyl-RNA-Phosphorothioat-Hybrid-Oligonukleotide besaßen eine noch größere Aktivität als Desoxyribose-Phosphorothioate und ungeachtet der Oligonukleotidlänge war jedes Hybrid-Oligonukleotid aktiver als sein entsprechendes homogenes Phosphorothioat- Oligonukleotid. Die 2'-O-Methyl-RNA-Phosphorothioat-gemischtes Rückgrat-Version von HPV1 war aktiver als die Phosphorothioat-Verbindung in ähnlichen Tests mit transient transfizierten CHO-Zellen und Methylphosphonat-HPV1 behielt Antisense-Aktivität.
Experimente mit einer gemischten Gestaltung des Rückgrats wurden mit Oligonukleotiden verschiedener Längen wiederholt, um zu bestimmen, ob eine Erhöhung der Länge die Aktivität der Verbindung verändern könnte. Daher wurden zwei längere Versionen von HPV1 (ein 20mer) in drei Rückgrat-Gestaltungen (PS, M und OMe) in transient transfizierten CHO- Zellen untersucht. Im Fall des 20mers (HPV15) zeigte die PS-Verbindung eine gute Antisense-Aktivität. Die 2'-O-Methyl-RNA-Verbindung war ähnlich aktiv. Die Verbindung mit dem Methylphosphonat-Rückgrat war etwas weniger aktiv. Beim Einbau dieser Modifikationen in ein 28mer-Oligonukleotid (HPV11) wurden ähnliche Resultate beobachtet.
Da die Ergebnisse eine ähnliche oder bessere Aktivität von chimären und hybriden Oligonukleotiden nach 24 Stunden zellulärer Inkubationszeit zeigten, wurden die Antisense-Wirkungen dieser Oligonukleotide über längere Zeiträume untersucht. Die modifizierten Oligonukleotide weisen eine stärkere Resistenz gegenüber Abbau im Serum auf, woraus sich eine höhere Aktivität in den Zellen ergeben könnte. In dem Test mit transient transfizierten CHO-Zellen zeigte die Phosphorothioat-Verbindung einen Verlust an Aktivität von Tag 1 bis Tag 7. Im Gegensatz dazu behielt das 2'-O-Methyl-RNA-Phosphorothioat-Hybrid eine hohe Aktivität bis zum Tag 7. Ähnliche Resultate ergaben sich mit 24meren und 28meren.
Zusammenfassend ergab eine Kombination eines chimären Rückgrats und Phosphorothioat- Bindungen (die die zelluläre RNase H-Aktivität vermitteln) und Modifikationen am 3'- und/oder 5'-Ende, dass der Antisense-Effekt gegen E1-Expression eine Woche nach Verabreichung an die Zellen beibehalten wurde.
Für das Testen der Toxizität der erfindungsgemäßen Oligonukleotide wurde ein käuflich erhältlicher Cytotoxizitätstest (CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation/Cytotoxicity Assay, Promega, Madison, WI) eingesetzt. Die Toxizität der Verbindungen wurde parallel zur Antisense-Aktivität mit Hilfe des Standardtestsystems mit transienter Transfektion von Zellen gemessen. Ungeachtet des Rückgrats waren die erfindungsgemäßen Oligonukleotide für Zellen bei Konzentrationen, bei denen eine spezifische Antisense-Aktivität beobachtet wird, nicht toxisch.
Bei einem weiteren Test, durch den die Antisense-Wirkung gegen die native biochemische Funktion des viralen E1-Gens gezeigt werden soll, wird die Fähigkeit dieses Proteins zur Stimulation von am HPV-Replikationsursprung initiierter DNA-Replikation gemessen. Die DNA-Replikation von Papillomavirus erfordert in Säugerzellen nur drei virale Komponenten, die E1- und E2-Genprodukte, und eine den HPV-Replikationsursprung enthaltende DNA- Sequenz. Für die Messung der Antisense-Aktivität gegen E1-Genexpression wurden zwei Plasmide konstruiert, die E1 oder E2 durch einen CMV-Promotor exprimieren. Diese zwei Plasmide können durch Oligonukleotide, die irgendwo in den E1- oder E2-Transkripten binden, angesteuert werden. Als Reporter für die E1-Aktivität wurde ein Plasmid konstruiert, das Luciferase exprimiert und zusätzlich den HPV-Typ 6-Replikationsursprung enthält. Bei Transfektion in eine Säugerzelle erhöht sich die Kopienzahl dieses Plasmids, falls die E1- und E2-Proteine vorhanden sind. Schließlich erhöht sich die zelluläre Luciferase-Expression. Diese Erhöhung der Enzymaktivität kann mit einem Luminometer quantifiziert werden und die Gesamtwirkung auf die virale DNA-Replikation bestimmt werden. Ein ähnliches Luciferase-Expressionsplasmid ohne den HPV-Ursprung kann hergestellt werden, das als Negativkontrolle für diese Experimente dient. Dieses Plasmid wird nicht durch die Expression der viralen E1- und E2-Gene beeinflusst und die Luciferase-Expression bleibt konstant.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Antisense-Oligonukleotide können in Form einer therapeutischen Zusammensetzung oder Formulierung vorliegen, die für die Hemmung der DNA-Replikation in einer Zelle und bei der Behandlung menschlicher Papillomavirusinfektionen und begleitender Erkrankungen in einem Tier, wie Haut- und Genitalwarzen, Epidermodysplasia verruciformis, Papillomatose des Respirationssystems oder Kehlkopfs oder Cervixkarzinom verwendet werden können. Sie können als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei einer Kombination mit einem physiologisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Träger eingesetzt werden. Die Eigenschaften des Trägers werden von dem Verabreichungsweg abhängen. Eine derartige Zusammensetzung kann zusätzlich zu dem synthetischen Oligonukleotid und Träger Verdünnungsstoffe, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisationsmittel, Lösungsmittel und andere bekannte Materialien enthalten. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch andere aktive Faktoren und/oder Stoffe enthalten, die eine Hemmung der HPV-Expression verstärken. Zum Beispiel können Kombinationen von synthetischen Oligonukleotiden, die jeweils gegen eine andere Region der HPV-Nukleinsäure gerichtet sind, in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen kann ferner andere Chemotherapeutika für die Behandlung von Cervixkarzinomen enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Stoffe können in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebaut werden, um einen synergistischen Effekt mit den erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotiden zu erzeugen oder um Nebenwirkungen der erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotide zu verringern. Auf der anderen Seite können die erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotide in Formulierungen eines bestimmten anti-HPV- oder anti-Krebs-Faktors und/oder -Stoffs für die Verringerung der Nebenwirkungen des anti-HPV-Faktors und/oder -Stoffs eingebaut werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Liposoms vorliegen, in dem die erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotide zusätzlich zu anderen pharmazeutisch verträglichen Trägern mit amphipathischen Stoffen wie Lipiden, die in einer Aggregationsform als Micellen vorliegen, unlöslichen Monolayern, Flüssigkristallen oder Lamellenschichten, die in einer wässrigen Lösung vorliegen, kombiniert werden. Geeignete Lipide für eine liposomale Formulierung umfassen in nicht begrenzender Weise Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und ähnliches. Eine Herstellung derartiger liposomaler Formulierungen erfolgt in an sich bekannter Weise und ist z. B. in den US-PSen 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 und 4,737,323 beschrieben. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner andere Lipidträger wie Lipofektamin oder Cyclodextrine und ähnliches enthalten, wodurch die Bereitstellung der Oligonukleotide an die Zellen verstärkt wird, oder sie kann Polymere mit einer verzögerten Freisetzung enthalten.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet hier die Gesamtmenge eines jeden aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Verfahrens, die ausreichend ist, um eine deutliche Besserung bei dem Patienten zu bewirken, d. h. eine Verringerung der Anzahl oder Größe von Haut- und Genitalwarzen, eine Verringerung von Epidermodysplasia verruciformis, Papillomatose des Respirationssystems oder Kehlkopfs oder Rückbildung eines Cervixkarzinoms. Bei Verwendung im Zusammenhang mit einem einzelnen aktiven Bestandteil, der alleine verabreicht wird, betrifft der Begriff diesen Bestandteil alleine. Falls er in Bezug auf eine Kombination verwendet wird, betrifft der Begriff die kombinierten Mengen der aktiven Bestandteile, die zu der therapeutischen Wirkung führen, egal, ob sie in einer Kombination, Serie oder gleichzeitig verabreicht werden.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens oder der erfindungsgemäßen Verwendung wird eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer synthetischer Oligonukleotide an ein Lebewesen verabreicht, das an einer mit HPV in Verbindung stehenden Erkrankung leidet. Das erfindungsgemäße synthetische Oligonukleotid kann in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien für die mit HPV in Verbindung stehende Erkrankung verabreicht werden. Bei einer gemeinsamen Verabreichung mit einer oder mehreren anderen Therapien kann das erfindungsgemäße synthetische Oligonukleotid entweder gleichzeitig oder in einer Sequenz mit der (den) anderen Behandlung(en) verabreicht werden. Bei einer sequenziellen Verabreichung wird der behandelnde Arzt eine geeignete Verabreichungssequenz des erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotids in Kombination mit der anderen Therapie festlegen.
Die Verwendung eines Gemisches verschiedener Oligonukleotide, die gegen verschiedene konservierte Stellen in einem bestimmten viralen Gen gerichtet sind, kann gewünscht sein. Ein derartiges Gemisch von Oligonukleotiden kann in Form einer therapeutischen Zusammensetzung vorliegen, die wenigstens ein, zwei oder mehr Oligonukleotide in einer einzigen therapeutischen Zusammensetzung umfasst (d. h. eine Zusammensetzung, die ein physikalisches Gemisch von wenigstens zwei Oligonukleotiden umfasst). Alternativ dazu können diese Oligonukleotide zwei verschiedene Sequenzen besitzen. Wenigstens ein, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotide können zugleich oder in einer Sequenz in einer einzigen Behandlung in Form getrennter pharmazeutischer Zusammensetzungen verabreicht werden.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotids, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung oder für das Behandlungsverfahren eines Tiers verwendet wird, kann auf verschiedenen herkömmlichen Wegen erfolgen, wie intraokular, oral, durch Inhalation oder durch kutane, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion.
Falls eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotids oral verabreicht wird, wird, das synthetische Oligonukleotid in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vorliegen. Bei einer Verabreichung in Tablettenform kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen festen Träger wie Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten etwa 5 bis 95% synthetisches Oligonukleotid und vorzugsweise etwa 25 bis 90% synthetisches Oligonukleotid. Bei einer Verabreichung in einer flüssigen Form kann ein flüssiger Träger wie Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl, Sesamöl oder synthetische Öle hinzugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann ferner eine physiologische Salzlösung, eine Lösung mit Dextrose oder einem anderen Saccharid oder Glykole wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Bei der Verabreichung in einer flüssigen Form enthält die pharmazeutische Zusammensetzung etwa 0,5 bis 90 Gew.-% des synthetischen Oligonukleotids und vorzugsweise etwa 1 bis 50% synthetisches Oligonukleotid.
Falls eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleotids intravenös, kutan oder subkutan durch Injektion verabreicht wird, wird das synthetische Oligonukleotid in Form einer Pyrogen-freien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung derartiger parenteral verträglicher Lösungen mit einem geeigneten pH, Isotonizität, Stabilität und ähnlichem ist bekannt. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für eine intravenöse, kutane oder subkutane Injektion sollte vorzugsweise zusätzlich zu dem synthetischen Oligonukleotid einen isotonischen Träger wie Natriumchlorid-Lösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung, Dextrose- und Natriumchlorid- Lösung, Ringer-Lösung mit Lactat oder einen anderen bekannten Träger enthalten. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisationsmittel, Konservierungsstoffe, Puffer, Antioxidanzien oder andere bekannte Zusätze enthalten.
Die Menge des in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen synthetischen Oligonukleotids wird von der Art und Stärke der behandelten Krankheit und von der Art früherer Behandlungen, denen sich der Patient unterzogen hatte, abhängen. Letztendlich wird der behandelnde Arzt die Menge des synthetischen Oligonukleotids bestimmen, mit der der einzelne Patient behandelt wird. Anfänglich wird der behandelnde Arzt niedrige Mengen des synthetischen Oligonukleotids verabreichen und die Reaktionen des Patienten überprüfen. Größere Mengen des synthetischen Oligonukleotids können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erhalten wird. An diesem Punkt wird die Dosis nicht weiter erhöht. Es ist vorgesehen, dass die verschiedenen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 1,0 ng bis etwa 2,5 mg synthetisches Oligonukleotid pro kg Körpergewicht enthalten sollen.
Die Dauer einer intravenösen Therapie mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird verschieden sein, abhängig von der Stärke der behandelten Krankheit und dem Zustand und der möglichen idiosynkratischen Reaktion jedes einzelnen Patienten. Es ist vorgesehen, dass jede Verabreichung des synthetischen Oligonukleotids 12 bis 24 Stunden durch eine kontinuierliche intravenöse Verabreichung erfolgt. Letztendlich wird der behandelnde Arzt die geeignete Dauer der intravenösen Therapie mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung festlegen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können auch Teil von Kits für die Hemmung der Replikation von menschlichem Papillomavirus und Infektion in einer Zelle sein. Ein derartiger Kit umfasst ein synthetisches Oligonukleotid, das spezifisch für eine HPV-Nukleinsäure ist, wie die hier beschriebenen. Zum Beispiel kann der Kit wenigstens ein erfindungsgemäßes synthetisches, kontinuierliches Oligonukleotid enthalten, z. B. die mit SEQ ID NOS: 1-39. Diese Oligonukleotide können ein modifiziertes Rückgrat besitzen, wie die vorstehend beschriebenen, und können RNA/DNA-Hybride sein, die z. B. wenigstens ein 2'-O-Methyl enthalten. Der erfindungsgemäße Kit kann gegebenenfalls Puffer, Zell- oder Gewebe- Behandlungsreagenzien, Zell- oder Gewebe-Behandlungsmittel, Gefäße und ähnliches enthalten.
Weitere erfindungsgemäße Kits dienen dem Nachweis von HPV in einer Probe wie einer Lösung oder einer biologischen Probe wie Flüssigkeit, Gewebe, Gewebehomogenat und ähnliches. Diese Kits enthalten wenigstens ein synthetisches Oligonukleotid, das zu einer Nukleinsäure komplementär ist, die sich über die translationelle Startstelle des E1-Gens von menschlichem Papillomavirus erstreckt, und Mittel für den Nachweis des im Fall des Auftretens von HPV in der Probe an die Nukleinsäure hybridisierten Oligonukleotids.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sind nicht begrenzend zu verstehen.

BEISPIELE

1. RNase H-Test

A. Linearisierung der DNA-Matrize

Das E1-Gen aus dem Plasmid pE16B1 wurde durch Polymerase-Kettenreaktion in den Vektor PCR-Script (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert. Das Plasmid PCR-pE16B1 (20 ug) wurde mit dem Restriktionsenzym Notl (New England Biolabs, Beverly, MA, 60 E) 4 Stunden bei 37ºC linearisiert, 1 Stunde bei 37ºC mit Proteinase K (Stratagene, La Jolla, CA) (0,1 ug/ul) behandelt und zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert. Das linearisierte Plasmid wurde mit Ethanol gefällt und aus dem Überstand durch Zentrifugation isoliert. Der getrocknete Niederschlag wurde in Diethylpyrocarbonat (Aldrich, Milwaukee, WI)-behandeltem Wasser in einer Konzentration von 0,5 ug/ul gelöst.

B. In vitro-Transkription und ³²P-Markierung von HPV-RNA

HPV-E1-mRNA wurde in vitro mit Hilfe des Stratagene-mRNA-Transkriptionskits (La Jolla, CA) und der mit dem Kit gelieferten T7-RNA-Polymerase transkribiert. Die Transkription erfolgte in Gegenwart von 7,5 mM CTP, 7,5 mM ATP, 7,5 mM UTP, 6 mM GTP und 6 mM Guanosinhydrat. Die geringere GTP-Konzentration ermöglichte eine Initiation eines großen Teils der Transkripte mit Guanosin, um eine Endmarkierung der RNA ohne eine Vorbehandlung mit alkalischer Phosphatase zu ermöglichen. Nach 3-stündiger Transkription bei 37ºC wurde die Reaktion mit RNase-freier DNase (Stratagene, La Jolla, CA, oder Ambion, Austin, TX) behandelt, zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und auf einer G-50 Sephadex-Spinsäule (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN oder Pharmacia, Uppsala, Schweden) zur Beseitigung nicht-umgesetzter Nukleotide und Nukleoside chromatographiert. Die gewonnene RNA wurde durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm quantifiziert, wobei ein Extinktionskoeffizient von 10 000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ Base&supmin;¹ der RNA verwendet wurde.
Die RNA (5 ug) wurde mit 20-25 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und 50 uCl γ-³²P-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL, 6000 Ci/mmol) endmarkiert. Die markierte RNA wurde durch Chromatographie auf einer G-50 Sephadex-Spinsäule (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN oder Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt.

C. RNase H-Spaltung mit einer zufälligen 20mer-Bibliothek

Endmarkierte RNA (20-100 nM) wurde mit einer zufälligen DNA-Bibliothek aus 20 Basen (50-100 uM) (synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler, wie nachstehend beschrieben) inkubiert, die zuvor zur Dissoziation von Aggregaten 90 Minuten bei 37ºC in 9 ul 1· Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 4 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) aufgekocht worden war. RNase H (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) (1 ul, 1 Einheit/ul) wurde sodann hinzugegeben. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, durch Zugabe von 10 ul 90% Formamid mit 0,1% Phenolrot/0,1% Xylencyanol gestoppt und auf Trockeneis eingefroren. Die gestoppten Reaktionen wurden 2,5 bis 3 Minuten aufgekocht, auf Eis abgekühlt und 5 bis 7 ul auf ein 4%-iges denaturierendes Polyacrylamidgel geladen, das in einem Vorlauf auf 50 bis 55ºC erwärmt worden war. Typischerweise lief das Phenolrot bis an das untere Ende des Gels, das sodann bei 80ºC unter vermindertem Druck getrocknet wurde. Das Gel wurde unter Verwendung eines XOMAT-Films (Kodak, Rochester, NY) einer Autoradiographie unterzogen oder wurde mit einem Phosphorimager von Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) oder Bio Rad (Hercules, CA) analysiert.

D. Spaltung von HPV-RNA mit spezifischen Antisense-Oligonukleotiden

20-100 nM [5'-³²P]-markierte RNA und 100 nM Oligonukleotide (ODN) wurden in 9 ul 1· RNase H-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 4 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) 15 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. 1 ul RNase H (1 E/ul) wurde hinzugegeben und die Reaktion 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden abgestoppt und wie vorstehend beschrieben analysiert. Eine Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgte mit Hilfe der mit dem Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA oder Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) gelieferten Software. "Zählwerte" wurden dadurch bestimmt, dass ein Kästchen um die interessierende Bande gezeichnet wurde und davon der Hintergrund, der durch ein nahe dazu gezeichnetes Kästchen bestimmt wurde, subtrahiert wurde. Zählwerte in einer Produktbande wurden zu den Gesamt-Zählwerten in der Spur darüber verglichen, um den Prozentsatz der Spaltung zu bestimmen.

E. Spaltung von HPV-mRNA durch halb-zufällige Oligonukleotide

Halb-zufällige Oligonukleotide (100 uM in Wasser) werden 1 Minute für die Dissoziation von Aggregaten, die sich zwischen komplementären Sequenzen in dem Gemisch bilden, aufgekocht und 1 ul (Endkonzentration 10 uM) zu 8 ul 1· RNase H-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 4 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) mit markierter mRNA (20-100 nM) hinzugegeben. Nach einer 15-minütigen Vorinkubation bei 37ºC wird RNase H (1 E) hinzugegeben und 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen werden abgestoppt und wie vorstehend beschrieben analysiert. Spaltstellen werden mit DNA- und/oder RNA-Größenmarkern bestimmt.

2. Synthese von Oligonukleotiden

Oligonukleotide wurden durch Standard-Phosphoramidit-Chemie (Beaucage (1993), Meth. Mol. Biol. 20: 33-61) auf einem ABI 394-DNA/RNA-Synthesegerät (Perkin-Elmer, Foster City, CA), einem Pharmacia Gene Assembler Plus (Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder einem Gene Assembler Special (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemäß den Standardverfahren des Herstellers und eigenen Verfahren synthetisiert. Die eigenen Verfahren dienten der Erhöhung der Kopplungszeit von 1,5 Minuten auf 12 Minuten für die 2'-O-Methyl-RNA-Amidite. Die Synthesegeräte von Pharmacia erforderten die zusätzliche Trocknung der Amidite, Aktivierungsreagenz und Acetonitril. Dies erfolgte durch Zugabe von 3 A Molekularsieben (EM Science, Gibbstown, NJ) vor dem Einsetzen in der Maschine.
DNA-β-cyanoethylphosphoramidite wurden von Cruachem (Glasgow, Schottland) erworben. Der DNA-Träger war kontrolliertes Porenglas (CPG) mit 500 A Porengröße (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA), das bei einer Beladung zwischen 30 und 40 mmol pro Gramm mit der geeigneten 3'-Base derivatisiert wurde. 2'-O-Methyl-RNA-β-cyanoethylphosphoramidite und CPG-Träger (500 Å) wurden von Glen Research (Sterling, VA) erworben. Für die Synthese von zufälligen Sequenzen wurden die DNA-Phosphoramidite von dem Synthesegerät gemäß den Anleitungen des Herstellers gemischt (Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Alle 2'-O-Methyl-RNA-enthaltenden Oligonukleotide wurden mit Ethylthiotetrazol (American International Chemical (AIC), Natick, MA) als Aktivator synthetisiert, das bei 0,25 M in Acetonitril mit geringem Wassergehalt (Aldrich, Milwaukee, WI) gelöst wurde. Manche DNA- Synthesen erfolgten mit 0,25 M Ethylthiotetrazol, die meisten jedoch mit 0,5 M 1-H-Tetrazol (AIC). Das thiosulfurierende Reagenz, das für alle PS-Oligonukleotide verwendet wurde, war 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage Reagent, R. I. Chemical, Orange, CA oder AIC, Natick, MA) als 2%ige Lösung in Acetonitril mit geringem Wassergehalt (w/v).
Cholesteryl-CPG (chol) und Polyethylenglykol (PEG), 5'-Amino-Modifier [C&sub6;NH&sub2;], und Cholesteryl (chol)-Phosphoramidite für die Synthese von Oligonukleotiden mit wie in Tabelle 1B beschriebenen Linkem wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendet (Glen Research, Sterling, VA).
Das 3'-NH&sub2;-Cap ist ein 3'-(3-Amino-2-propanol)-Konjugat (Tabelle 1B), das mit 3'-Amino- Modifier C3 CPG gemäß den Anleitungen des Herstellers hergestellt worden war (Glen Research, Sterling, VA).
Für eine Oxidation, Redox-Reaktion oder Aminierung von Oligonukleotid-Phosphorothioaten mit einem Ribonukleotid am 3'-Terminus (Tabelle 1B) erfolgte die Synthese wie folgt. Ein Oligonukleotid-Phosphorothioat (1 mM) mit einem Ribonukleotid am 3'-Terminus wurde mit NalO&sub4; (1,2 mM) 30 Minuten auf Eis in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,75, oxidiert, um das 3'- Dialdehyd-Produkt (Ox.) zu erhalten. Für das Anfügen von Aminen wurden 6 Äquivalente Amin in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer (pH 8) zu dem oxidierten Oligonukleotid bei Raumtemperatur 30 Minuten hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von 30 Äquivalenten NaCNBH&sub3;. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Produkt wurde durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 20%igen denaturierenden Gel gereinigt. Das gleiche Verfahren wurde bei Fehlen des Amins durchgeführt, um das 3'-Diol-Produkt (Ox./Red.) zu erhalten.
Nach der vollständigen Synthese wurde das CPG luftgetrocknet und in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Schraubdeckel überführt. Das Oligonukleotid wurde entschützt und von dem CPG mit 2 ml Ammoniumhydroxid (25-30%) abgespalten. Das Röhrchen wurde verschlossen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und sodann 7 Stunden bei 55ºC inkubiert. Nach Vervollständigung der Entschützung wurden die Röhrchen aus dem Heizblock entnommen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Deckel wurden entfernt und die Röhrchen bei 10 000 Upm 30 Minuten zentrifugiert, um das meiste Ammoniumhydroxid zu entfernen. Die Flüssigkeit wurde sodann in ein neues 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Schraubdeckel überführt und in einen Speed Vac-Konzentrator (Savant, Farmingdale, NY) lyophilisiert. Nach dem Trocknen wurde der Rest in 400 ul 0,3 M NaCl gelöst und die DNA mit 1,6 ml absolutem EtOH präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation bei 14 000 Upm für 15 Minuten gefällt, der Überstand abgegossen und der Niederschlag getrocknet. Die DNA wurde erneut aus 0,1 M NaCl, wie vorstehend beschrieben, gefällt. Der Niederschlag wurde in 500 ul H&sub2;O gelöst und 10 Minuten bei 14 000 Upm zentrifugiert, um das gesamte Festmaterial zu entfernen. Der Überstand wurde in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die DNA-Menge spektrophotometrisch bestimmt. Die Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt. Die E&sub2;&sub6;&sub0; für den DNA-Anteil des Oligonukleotids wurde mit Hilfe von OLIGSOL (Lautenberger (1991), Biotechniques 10: 778-780) berechnet. Die E&sub2;&sub6;&sub0; des 2'-O-Methyl-Anteils wurde mit Hilfe der OLIGO 4.0 Primer Extension Software (NBI, Plymouth, MN) berechnet.
Die Reinheit der Oligonukleotide wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und UV-Abschattung überprüft. 0,2 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten wurden mit 95% Formamid/H&sub2;O und Orange G-Farbstoff auf ein 20%iges denaturierendes Polyacrylamidgel (20 · 20 cm) geladen. Das Gel lief, bis der Orange G-Farbstoff sich innerhalb eines Inch vom unteren Ende des Gels befand. Die Bande wurde durch Abschattung mit kurzwelligem UV-Licht auf einer Dünnschicht-Chromatographieplatte (Kieselgel 60 F254, EM Separations, Gibbstown, NJ) dargestellt.
Manche Oligonukleotide wurden ohne Entfernung der 5'-Tritylgruppe (mit Trityl) synthetisiert, um eine Reinigung durch Reverse-Phase-HPLC zu erleichtern. Oligonukleotide mit Trityl wurden in 3 ml Wasser gelöst und bei 6000 Upm 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen 0,45 Mikron Spritzenfilter (Gelman Scientific, Ann Arbor, MI) filtriert und mit Hilfe einer 600E HPLC (Waters, Franklin, MA) auf einer 1,5 · 30 cm Flüssigchromatographiesäule aus Glas (Spectrum, Houston, TX) gereinigt, die mit C-18 uBondapak Chromatographiematrix (Waters, Franklin, MA) gepackt worden war. Das Oligonukleotid wurde bei 5 ml/min durch einen 40-minütigen Gradienten von 14-32% Acetonitril (Baxter, Burdick und Jackson Division, Muskegon, MI) in 0,1 M Ammoniumacetat (J. T. Baker, Phillisburg, MJ), gefolgt von 32% Acetonitril für 12 Minuten eluiert. Ein Nachweis der Peaks erfolgte bei 260 nm mit einem Dynamax UV-C Absorptionsdetektor (Rainin, Emeryville, CA).
Das HPLC-gereinigte Oligonukleotid mit Trityl wurde durch Verdampfen getrocknet und die Tritylgruppe durch Inkubation in 5 ml 80% Essigsäure (EM Science, Gibbstown, NJ) für 15 Minuten entfernt. Nach Verdampfen der Essigsäure wurde das Oligonukleotid in 3 ml 0,3 M NaCl gelöst und durch Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und erneut mit Ethanol aus 3 ml 0,1 M NaCl gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und auf einer Savant Speed Vac (Savant, Farmingdale, NY) getrocknet. Eine Quantifizierung und PAGE-Analyse erfolgten wie vorstehend für Ethanol-gefällte Oligonukleotide beschrieben.
Standard-Phosphoramidit-Chemie wurde für die Synthese von Oligonukleotiden mit Methylphosphonat-Bindungen eingesetzt, wobei zwei Pharmacia Gene Assembler Special DNA- Synthesegeräte verwendet wurden. Ein Synthesegerät wurde für die Synthese der Phoshporothioat-Anteile der Oligonukleotide mit Hilfe des vorstehend beschriebenen β-Cyanoethyl- Phosphoramidit-Verfahrens eingesetzt. Das andere Synthesegerät wurde für das Einbringen von Methylphosphonat-Anteilen eingesetzt. Reagenzien und Synthesezyklen, die sich als vorteilhaft für die Methylphosphonat-Synthese erwiesen hatten, wurden verwendet (Hogrefe et al., Methods in Molecular Biology, Bd. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs (Agrawal, Hrsg.) (1993), Humana Press Inc., Totowa, NJ). Zum Beispiel wurden 0,1 M Methyl-Phosphonamidite (Glen Research, Sterling, VA) mit 0,25 M Ethylthiotetrazol aktiviert. Eine Kopplungszeit von 12 Minuten wurde eingesetzt und sofort nach dem Kopplungsschritt mit Iod (0,1 M) in Tetrahydrofuran/2, 6-Lutidin/Wasser (74, 75/25/0,25) oxidiert. Dimethylaminopyridin (DMAP) wurde für das Capping verwendet, um Standard-N-Methylimidazol (NMI) zu ersetzen. Die Chemikalien stammten von Aldrich (Milwaukee, WI).
Das Aufbereitungsverfahren beruhte auf dem von Hogrefe et al., ((1993), Nucleic Acids Research, 21: 2031-2038) beschriebenen Verfahren. Das Produkt wurde von dem Harz durch Inkubation mit 1 ml Ethanol/Acetonitril/Ammoniumhydroxid (45/45/10) 30 Minuten bei Raumtemperatur abgespalten. Ethylendiamin (1,0 ml) wurde sodann zu dem Gemisch hinzugefügt, um 4,5 Stunden bei Raumtemperatur zu entschützen. Die resultierende Lösung und zwei Waschungen des Harzes mit 1 ml 50/50 Acetonitril/0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB), pH 8, wurden gepoolt und gut gemischt. Das resultierende Gemisch wurde auf Eis abgekühlt und mit 6 N HCl in 20/80 Acetonitril/Wasser (4-5 ml) neutralisiert (pH 7). Sodann wurde das Gemisch mit einem Speed Vac-Konzentrator bis zur Trockne einkonzentriert. Der resultierende feste Rest wurde in 20 ml Wasser gelöst und die Probe mit Hilfe einer Sep-Pak-Kartusche entsalzt. Nach zweifacher Passagierung der wässrigen Lösung durch die Kartusche bei 2 ml pro Minute wurde die Kartusche mit 20 ml 0,1 M TEAB gewaschen und das Produkt mit 4 ml 50% Acetonitril in 0,1 M TEAB bei 2 ml pro Minute eluiert. Das Eluat wurde in einer Speed Vac bis zur Trockne eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gereinigt und mit einer Sep-Pak-Kartusche entsalzt. Das Oligonukleotid wurde mit Ethanol aus 0,3 M NaCl gefällt und sodann aus 0,1 M NaCl. Das Produkt wurde in 400 ul Wasser gelöst und mittels UV-Absorption bei 260 nm quantifiziert.

3. E1-Luciferase-Genfusionstest

A. Verwendung stabil transfizierter Zellen

Das E1-Luciferase-Fusionskonstrukt pE1Luc6 (Roche, Welwyn Garden City, England) enthält 46 Nukleotide, die sich über die Translationsstartstelle des HPV-6b E1-Gens erstrecken und zwischen dem unmittelbar frühen Gen-Promotor von Cytomegalovirus und dem Luciferase-Reportergen in dem Plasmid pGLori (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ) inseriert sind. Das E1-Ziel und das Luciferase-Gen wurden durch Polymerase-Kettenreaktion aus diesem Plasmid und dem parentalen Plasmid pGLori in den Vektor pCR-Script (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und weiter in den Vektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert. Diese Konstrukte (pcDNA3GLori und pcDNA3E1 Luc6) wurden mit Lipofektamin (GIBCO- BRL, Gaithersburg, MD) stabil in CHO-K1-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC CCL60), Rockville, MD) transfiziert. Mehrere Geniticin-resistente, Luciferase-exprimierende Klone wurden zufällig für jedes Konstrukt selektiert.
Stabil transfizierte CHO-Zellen wurden auf 96 Loch-Platten ausgebracht. Cellfectin (GIBCO- BRL, Gaithersburg, MD) wurde auf eine Konzentration von 4 ug/ml in Optimem Serumfreien Medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) verdünnt und 100 ul in jedes Loch der 96 Loch- Platte verteilt. Oligonukleotide wurden auf 5 uM oder 25 uM in 4 ug/ml Cellfectin in Optimem verdünnt und 25 ul auf 3 Löcher der 96 Loch-Platte verteilt. Das Oligonukleotid wurde bei einer fünffachen Steigerung entlang der Platte seriell verdünnt. Vier Stunden nach Zugabe des Oligonukleotids wurden die Löcher abgesaugt und 100 ul CCM5-Medium (Hyclone, Logan, Utah) in jedes Loch verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in 50 ul Zelllyse-Puffer (Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, CA) lysiert. Die Luciferase-Aktivität wurde in 20 ul Lysat mit Analytical Luminescence Laboratory-Substraten in einem MicroLumat LB 96 P-Luminometer (EG & G Berthold, Nashua, NH) gemessen.

B. Verwendung transient transfizierter CHO-Zellen

CHO-Zellen wurden in DMEM-Vollmedium (PMEM + 10% fötales Kälberserum + nicht- essentielle Aminosäuren + Natriumpyruvat + L-Glutamin + Penicillin/Streptomycin) vermehrt. 10&sup4; CHO-Zellen pro Loch wurden auf weißen 96 Loch-Luminometer-Platten etwa 15 Stunden vor der Transfektion ausgebracht. Das Medium wurde entfernt und die Zellen zweimal mit DMEM-Halbvollmedium (kein fötales Kälberserum oder Penicillin/Streptomycinsulfat) gewaschen.
100 ul eines Transfektionsgemisches mit E1-Luciferase-Fusions- oder Luciferase-Reporterplasmiden (pE1Luc6 oder pGLori, 0,01 bis 20 ng/100 ul), Oligonukleotid (0,1 nM bis 1000 nM) und 8 bis 12 ug/ml Lipofektamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) in DMEM-Halbvollmedium wurden hinzugegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. 100 ul DMEM + 20% fötales Kälberserum + 2 · Penicillin/Streptomycinsulfat wurden sodann hinzugegeben und die Zellen 1 bis 7 Tage inkubiert.
Die Zellen wurden zweimal mit 100 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden durch einen Gefrier (-80ºC)-/Auftauzyklus in 20 ul Reporterlyse-Puffer (Promega, Madison, WI) lysiert. Die Mengen des Luciferase-Enzyms wurden durch Zugabe von 100 ul Luciferin-Testreagenz (Promega, Madison, WI) und mit Hilfe eines Luminometers (EG & G Berthold Microlumat LB96P, St. Albans, Herts, UK) gemessen. Jedes Loch wurde 40 s ausgezählt.
Die Aktivitätsdaten des Luciferase-Enzyms können gegen die Plasmidkonzentration oder Oligonukleotidkonzentration aufgetragen werden. Die spezifische Aktivität der Antisense- Oligonukleotide ist als die prozentuale Aktivität des Oligonukleotids im Vergleich zu einem Randomer gegen das E1-Luciferase-Ziel definiert.

C. Verwendung transient transfizierter menschlicher Keratinozyten

Menschliche Vorhaut-Keratinozyten von Neugeborenen (NHEK-Zellen) wurden transient mit dem E1-Luciferase-Fusionsplasmid pE1Luc6 oder dem Kontrollplasmid pGLori (vorstehend beschrieben) mit Hilfe von Lipofektamin transfiziert. Antisense-Oligonukleotide wurden zu den Zellen mit dem Plasmid oder nach Transfektion ohne Lipidträger oder vor und nach Transfektion ohne einen Lipidträger hinzugegeben.
Falls erfindungsgemäße Oligonukleotide mit dem Plasmid hinzugegeben wurden, wurde das nachstehende Verfahren eingesetzt. NHEK-Zellen bei der zweiten Passage (Stamm 2718, Clonetics Corp., San Diego, CA) wurden in jedes Loch einer 96 Loch-Luminometerplatte (Dynatech, Billingshurst, West Sussex, UK) bei einer Konzentration von 10&sup4; Zellen/Loch in 100 ul Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) (Clonetics Corp., San Diego, CA) ausgebracht. Die Zellen wurden über Nacht bei 37ºC in einer befeuchteten CO&sub2;-Atmosphäre kultiviert. Die nachstehenden Transfektionsgemische wurden für jedes Loch in 100 ul Keratinozyten-Basismedium (KBM, Clonetics Corp., San Diego, CA) erstellt: 1% Lipofektamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), 50 ng Plasmid-DNA und 0, 0,1, 1, 10 oder 100 nM Antisense-Oligonukleotid. Unmittelbar vor der Transfektion wurden die Zellen mit KBM gewaschen. Das Transfektionsgemisch wurde 6 Stunden bei 37ºC auf die Zellen gegeben. Dieses Gemisch wurde sodann von den Zellen entfernt. Voll-KGM wurde hinzugegeben und die Kultur weitere 48 Stunden vermehrt. Für das Auszählen in einem Luminometer wurden die Zellen durch Entfernen des Mediums geerntet, einmal mit PBS gewaschen und sodann 50 ul Zelllyse-Puffer (Promega, Madison, WI) zu jedem Loch der Platte hinzugegeben und bei -80ºC eingefroren. Vor dem Einlesen der Platte in dem Luminometer (Berthold Microlumat L96P, St. Albans, Herts, UK) wurde sie 30 Minuten bei Raumtemperatur aufgetaut und sodann 100 ul Luciferase-Substratpuffer (Promega, Madison, WI) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 3 Sekunden wurde die Luciferase-Aktivität in jedem Loch 40 Sekunden gemessen.
Falls erfindungsgemäße Oligonukleotide nach Transfektion hinzugegeben wurden, wurde das nachstehende Verfahren eingesetzt. NHEK-Kulturen wurden wie vorstehend beschrieben in 96 Loch-Platten angesetzt. Für diese Experimente enthielt das Transfektionsgemisch 50 ng Plasmid und 1% Lipofektamin in KBM. Die Transfektionen erfolgten wie vorstehend beschrieben. Nach 6-stündiger Inkubation wurde das Transfektionsgemisch entfernt, durch KBM ersetzt und sodann über Nacht in KGM inkubiert. Am folgenden Tag wurde das KGM durch KGM mit 0, 0,2, 1,0, 5,0 oder 10,0 uM Antisense-Oligonukleotid ersetzt. Die Kulturen wurden in diesem Medium 48 Stunden vor einer Weiterbehandlung für die Luminometerauszählung, die wie vorstehend beschrieben erfolgte, gehalten. In manchen Fällen wurden die Zellen vor der transienten Transfektion mit in KGM verdünnten Antisense-Oligonukleotiden (0-10 uM) behandelt. Sodann wurden sie transient transfiziert und mit Oligonukleotid wie vorstehend beschrieben nachbehandelt.

4. Cytotoxizitätstest

Das Transfektionsgemisch mit Reporterplasmid, Oligonukleotid und Lipofektamin in DMEM- Halbvollmedium wurde wie in 3B, supra, angesetzt. Teile davon wurden zweifach auf zwei Mikrotiterplatten ausgebracht: einer, um die Luciferase-Expression zu bestimmen und einer, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Celltiter 96 nicht-radioaktiven Zellproliferations-/Cytotoxizitätstest (Promega, Madison, WI) gemessen. Die Luciferase-Aktivität in der Platte 1 wurde wie in B, supra, beschrieben gemessen. Bei der Platte 2 wurden 15 ul MTT-Farblösung zu den CHO-Zellen in 100 ul DMEM-Medium hinzugegeben. Die Platten wurden bei 37ºC in befeuchteter 5% CO&sub2;-Atmosphäre 4 Stunden inkubiert. 100 ul Solubilisierungs-/Stopplösung (alle Reagenzien sind in dem Promega-Kit enthalten) wurden hinzugegeben und das Gemisch 1 Stunde inkubiert. Die optische Dichte von jedem Loch wurde bei 570 nm (gegenüber Kontrollen) gemessen.

5. In vivo-Test HPV-spezifischer Oligonukleotide

Das in vivo-Verfahren von Kreider et al. (US-PS 4,814,268) wird für die Bestimmung eingesetzt, ob die erfindungsgemäßen Oligonukleotide zur Hemmung der Expression HPV-spezifischer Gene fähig sind. Insbesondere wurden Mäuse in dem Kreider-nackte Maus-Fremdtransplantat-Modell einer HPV Typ 11-Infektion in menschlichen Vorhäuten behandelt [M. K. Howett, J. W. Kreider und K. D. Cockley (1990), Human xenografts. A model system for human papillomavirus infection. Intervirology 31: 109-115]. Menschliche Vorhaut-Transplantate wurden mit Minimum Essential Medium mit 800 ug/ml Gentamycin (GlBCO-BRL, Gaithersburg, MD) gespült und sodann 1 Stunde bei 37ºC in 1 ml Condyloma acuminatum (HPV-enthaltend)-Extrakt inkubiert. Der Extrakt wird aus einem Vulva-Kondylom hergestellt, das kleingeschnitten und in 50 ml PBS bei 4ºC mit einem Gewebehomogenisator bei 25 000 Upm 30 Minuten zerstört wird. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt. Athymische Mäuse (nu/nu in einem BALB/c-Hintergrund) (Harlan Sprague Dawley, Inc., Madison, Wi) werden mit Nembutal amnestisiert und die Nieren getrennt durch dorsale, bilaterale, paravertebrale, subkostale Einschnitte beliefert. Die Nierenkapsel wird eingeschnitten und das Vorhaut-Transplantat in jede Niere mit zahnlosen Pinzetten gebracht. Die Hauteinschnitte werden mit Wundklammern geschlossen und den Mäusen Trinkwasser mit Trimethoprin (0,01 mg/ml) und Sulfamethoxazol (0,05 mg/ml) für die Dauer des Experiments angeboten.
In dem Experiment wurden 10 Mäusen, von denen jede zwei Transplantate (eines pro Niere) enthielt, 25 mg kg&supmin;¹ Tag&supmin;¹ des Antisense-Oligonukleotids HPV1 0 · 5 Hybrid (SEQ ID NO: 96, Tabelle 1 B), das fünf 2'-OMe-Ribonukleotide am 3'-Ende besitzt, subkutan 34 Tage lang verabreicht und sodann 5 mg kg&supmin;¹ Tag&supmin;¹ für die verbleibenden 56 Tage des Experiments einer Gesamt-Exposition von 90 Tagen. Als Kontrollen wurden 10 Mäuse mit jeweils zwei Transplantaten mit Salzlösung behandelt. Die Mäuse wurden durch Cervixdislokation getötet, die Nieren mit den Zysten entfernt und deren Größe gemessen. Die von Kreider verwendete Standard-Messgröße für die Zystengröße ist der "Große Mittiere Durchmesser" (GMD) oder die durchschnittliche Dimension [d. h. (I + w + h)/3]. Der berechnete GMD betrug 2,89±0,23 mm (Tabelle 2) für 10 Kontrolltiere, denen subkutan Salzlösung verabreicht worden war, und 1,62±0,14 mm für 9 Tiere, denen HPV1 0 · 5 OMe verabreicht worden war (Tabelle 3). Die statistische Messgenauigkeit für die Arzneistoffwirkung wurde auf p < 0,001 gemäß dem Student t-Test (T = 4,59, n = 18) berechnet. Obwohl der GMD für die Messung der Größe verwendet wurde, ist ein repräsentativerer Vergleich der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen das Verhältnis der Zystenvolumina, d. h. die dritte Potenz der zwei GMDs oder 1,62³/2,89³ = das Tumorvolumen in mit der HPV1 0 · 5 OMe-Verbindung behandelten Mäusen ist 82% niedriger als bei den Kontrollmäusen. Dies ist eine konservative Abschätzung, da vermutet wird, dass der ursprüngliche eingesetzte Vorhaut-Chip bei der Implantation kein Volumen besitzt und bei Fehlen einer viralen Infektion nicht wächst. Keine dieser Vermutungen ist richtig. Vorhaut-Chips sind bei der Implantation ~ 1 · 1 mm · Hautdicke groß und wachsen selbst im nicht-infizierten Zustand leicht, wie in einem vorhergehenden Experiment bestimmt wurde (GMD = 1,20 ± 0,363 mm). Daher berechnet sich die Wirkung bei Subtraktion dieser Basislinie nicht-infizierter Implantate zu (1,62- 1,20)³/(2,89-1,20)³ = eine 65-fache (> 98%) Abnahme der Zystengröße für das Antisense- Oligonukleotid im Vergleich zur Salz-Kontrolle. Tabelle 2 Kontrolle (Salzlösung) Tabelle 3 HPV1 0 · 5 OMe (wie vorstehend beschrieben verabreicht)
Außerdem werden die Nieren nach Bestimmung der Zystengröße in neutral-gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, bei 6 Mikron geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Kohorten-Schnitte werden von Paraffin befreit und mit Antikörper gegen zerstörtes Rinder-Papillomavirus (Dakopatts, Accurate Chemica. & Scientific Corp., Westbury, NY) inkubiert, um das Gruppen-spezifische Antigen (GSA) durch das Immunoperoxidaseverfahren zu zeigen (vgl. Jensen et al. (1980), J. Natl. Cancer Inst. 64: 495-500 und Kurman et al. (1983), Am. J. Surg. Path 7: 39-52)). GSA ist ein Kapsid-Antigen, das den meisten Papillomaviren gemeinsam ist. Positivkontrollen bestehen aus Kaninchen-Papillomen oder menschlichen Vulva-Kondylomen. Negativkontrollen sind normale menschliche Haut.

6. Untersuchungen von CHO-K1-Zellen, stabil transfiziert mit dem vollständigen HPV E1-Gen

Das vollständige E1-Gen wird von dem Plasmid pE16B1 (Roche Welwyn, Garden City, UK) (SEQ ID NO: 40) durch Polymerase-Kettenreaktion in den Vektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert. Dieser wird in CHO-K1-Zellen transfiziert und Geneticin-resistente (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) Klone isoliert. Diese Klone werden durch Western Blot auf Expression von E1-Protein getestet. Positive Klone werden für Antisense-Oligonukleotid- Tests verwendet, wobei die Wirksamkeit durch Western Blots für eine Translationshemmung und durch Northern Blots und Ribonuklease-Protection-Tests für RNA-Verlust und RNase H- Spaltprodukte gemessen wird. Zusätzlich werden E1-exprimierende Zellen transient mit pHPVE2 und pGLori transfiziert, um die Hemmung der HPV-DNA-Replikation zu messen.

7. E1-RNA-Dot Blot-Test

Um die Richtigkeit des E1-Luciferase-Enzymtests zu bestätigen, bei dem die E1-Luciferase- Expression als Surrogat-Marker für die Expression des eigentlichen viralen E1-Ziels gemessen wurde, wurden E1-mRNA-Mengen in CHO-Zellen mit einem zu dem von Plumpton et al. ((1995), Biotechnol. 31: 1210-1214) ähnlichen Testsystem gemessen.
CHO-Zellen wurden mit pE1681 (SEQ ID NO: 40), einem Plasmid, das den gesamten offenen Leserahmen von E1 zusammen mit 103 nt 5' nicht-translatierter Region exprimiert, transfiziert. Die Zellen wurden sodann mit einem Placebo oder 100 nM HPV1, HPV9 (mit drei Fehlpaarungen) oder Randomer-Phosphorothioat-Verbindungen behandelt. Ein anderer Satz von CHO-Zellen wurde mit den gleichen Antisense-Verbindungen behandelt, jedoch nicht mit dem Expressionsplasmid transfiziert. Schließlich wurde RNA aus allen acht CHO- Proben isoliert. Gesamt-RNA wurde mit markierten Oligonukleotid-Sonden für den E1-Boten oder eine Actin-Kontrolle hybridisiert und die Mengen eines jeden Transkripts durch Quantifizierung der Markerintensität auf einem Phosphorimager gemessen.
Zellen, die mit dem E1-Konstrukt transfiziert, jedoch nur mit Placebo behandelt wurden, exprimierten große Mengen des E1-Boten. Zellen, die mit dem Kontroll-Randomer-Oligonukleotid behandelt wurden, exprimierten die gleichen großen Mengen E1. Jedoch zeigten Zellen, die mit dem fehlgepaarten HPV29 behandelt wurden, 40% weniger E1-Expression. Zellen, die mit HPV1 behandelt wurden, das genau zu dem viralen Zielgen passt, zeigten um 80% geringere Mengen der E1-mRNA. Im Gegensatz dazu zeigten Kontroll-CHO-Zellen, die nicht mit dem E1-Konstrukt transfiziert worden waren, keine Wirkungen aufgrund der Behandlung mit den Antisense-Oligonukleotiden. Weiterhin zeigten alle acht CHO-RNA-Proben ähnliche Mengen an Actin-RNA. Dies zeigt, dass die Antisense-Wirkungen spezifisch für die E1-Genexpression war. Diese Arbeit lässt vermuten, dass gegen das E1-Gen von menschlichem Papillomavirus gerichtete Oligonukleotide direkt die mRNA-Menge in der Zelle verringern und bestätigt, dass die Antisense-Aktivität in dem E1-Luciferase-Surrogattest, der für ein Routine-Screening verwendet wird, mit den direkten Messungen der E1-RNA-Mengen übereinstimmt.

Äguivalente

Der Fachmann kennt zahlreiche Äquivalente für die hier beschriebenen spezifischen Substanzen und Verfahren oder kann diese durch Routineexperimente auffinden. Solche Äquivalente liegen im Umfang der Erfindung und sind durch die nachstehenden Ansprüche abgedeckt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
(B) STRASSE: Grenzacherstrasse 124
(C) ORT: Basel
(D) BUNDESLAND: BS
(E) LAND: Schweiz
(F) POSTLEITZAHL: CH-4070
(G) TELEFON: 061-688 39 43
(H) TELEFAX: 061-688 13 95
(I) TELEX: 962292/965542 hIr ch
(A) NAME: Hybridon, Inc
(B) STRASSE: One Innovation Drive
(C) ORT: Worcester
(D) BUNDESLAND: MA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 01605
(G) TELEFON: 508/752-7000
(H) TELEFAX: 508/752-7001
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Oligonukleotide, spezifisch für humane Papillomaviren
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 40
(iv) KORRESPONDENZADDRESSE:
(A) ADDRESSAT: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
(B) STRASSE: Grenzacherstrasse 124
(C) ORT: Basel
(D) BUNDESLAND: BS
(E) LAND: Schweiz
(F) POSTLEITZAHL: CH-4070
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: Apple Macintosh
(C) BETRIEBSSYSTEM: System 7.1 (Macintosh)
(D) SOFTWARE: Word 5.1
(vi) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/471,974
(B) ANMELDEDATUM: 06.06.1995
(C) KLASSIFIKATION:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

GTACCTGAAT CGTCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

CATCGTTGTT AGGTCTTCGG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

TCGTCCGCCA TCGTTGTTAG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

CCGCCATCGT TGTTAGGTCT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

TGAATCGTCC GCCATCGTTG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

CATTTTCTGT ACCTGAATCG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

GTACCTGAAT CGTCCGCCAT CGTTGTTA 28

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

GTACCTGAAT CGTCCGCCAT CGTTG 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

TTTTCTGTAC CTGAATCGTC 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

CCCCTCATTT TCTGTACCTG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

ACCCAGACCC CTCATTTTCT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

GGGTGTCCGC CTCCTGCCTG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

CGTTTTAGGT CCTGCACAGT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20. Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

GCCTCGGCTA TAGTGTTTAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

CGTCGCTTTA CCTTTTTTGG 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

CCAGACCCCT CATTTTCTGT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

ATAAACCATC CTGTACACCC 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

CCTGAATCGT CCGCCAT 17

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

GTACCTGAAT CGTCCGCCA 19

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

TACCTGAATC GTCCGCCAT 19

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

ACCTGAATCG TCCGCCAT 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

CTGAATCGTC CGCCAT 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

GTACCTGAAT CGTCC 15

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: lineat
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

GTACCTGAAT CGTCCG 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

GTACCTGAAT CGTCCGC 17

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

GTACCTGAAT CGTCCGCC 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

TGAATCGTCC GCCAT 15

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(iv) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

GTACCTGAAT CGTCCGCCAT CGTTGTTAGG 30

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

TCTTTTTTTT TTTTCTGTAC CTGAATCGTC 30

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

ACCCAGACCC CTCATTTTCT TTTTTCTTTT 30

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

GTACCTAAAT CGTCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

GTACCTAAAT CATCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART; Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

GTACCTAAAT CATCCACCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

ATACCTAAAT CATCCACCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

GTGCCAGAGT CGTCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

GTACCTNAAT CATCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

GTACCTAAAT CNTCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

GTACCTNAAT CNTCCGCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

ATGTTTTTGG CGTCTTCCAT 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 107 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

TCGAAGCTCA GATCCGAAGA CCTAACAACG ATGGCGGACG ATTCAGGTAC AGAAAATGAG 60
GGGTCTGGGT GTACAGGATG GTTTATGGTA GAAGCTATAG TGCAACA 107

Claims

1. Synthetisches Oligonukleotid, das zu einer Nukleinsäuresequenz des offenen Leserahmens aus dem E1-Gen von menschlichem Papilloma-Virus, der sich innerhalb der Nukleotide -17 bis +29 befindet, komplementär ist, wobei das Oligonukleotid modifiziert ist und wenigstens 15 Nukleotide und ebenfalls wenigstens eine Modifikation umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus modifizierten Internukleosid-Bindungen, Basen-modifizierten Oligonukleosiden, Zuckermodifizierten Oligonukleotiden, Mismatch-Nukleotiden, nicht-nukleosidischen Verbindungsgruppen und Caps, selbst-komplementären Bereichen und Bereichen einer hybriden Oligodesoxyribonukleotid-Oligoribonukleotid-Sequenz.

2. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, das 15 bis etwa 30 Nukleotide lang ist.

3. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das komplementäre Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz besitzt, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen mit den SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 und 28, wie in Tabelle 1A gezeigt.

4. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das komplementäre Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz besitzt, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen mit den SEQ ID NOs: 54, 74, 76, 116, 117, 118, 119, 120, 121 und 122, wie in Tabelle 1B gezeigt.

5. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend wenigstens ein Desoxyribonukleotid.

6. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend wenigstens ein Ribonukleotid.

7. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation ein Bereich einer hybriden Oligodesoxyribonukleotid-Oligoribonukleotid-Sequenz ist.

8. Oligonukleotid gemäß Anspruch 7, wobei ein Oligodesoxyribonukleotid-Bereich zwischen zwei Oligoribonukleotid-Bereichen liegt oder die umgekehrte Konfiguration davon.

9. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation ein Zuckermodifiziertes Ribonukleotid ist, bestehend aus 2'-O-Methylribonukleotid.

10. Oligonukleotid gemäß Anspruch 9, umfassend wenigstens ein 2'-O-Methylribonukleotid am 3'-Ende des Oligonukleotids.

11. Oligonukleotid gemäß Anspruch 10, umfassend ferner wenigstens ein 2'-O-Methylribonukleotid am 5'-Ende des Oligonukleotids.

12. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation wenigstens eine modifizierte Internukleosid-Bindung umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Alkylphosphonothioat, Phosphoramidat, Carbamat, Carbonat, Phosphat-Triester, Acetamidat und Carboxymethylester, einschließlich Kombinationen davon.

13. Oligonukleotid gemäß Anspruch 12, wobei das Alkylphosphonat ein Methylphosphonat ist.

14. Oligonukleotid gemäß Anspruch 12, wobei das Phosphoramidat ein n-Butylphosphoramidat ist.

15. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, umfassend wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleosid-Bindung.

16. Oligonukleotid gemäß Anspruch 12, wobei alle Internukleosid-Bindungen in dem Oligonukleotid Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen sind.

17. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, das ein Rückgrat besitzt, umfassend einen Phosphorothioat-Bereich, der zwischen flankierenden Bereichen mit nicht- ionischen Internukleosid-Bindungen liegt, oder die umgekehrte Konfiguration davon.

18. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, das ein Rückgrat besitzt, umfassend einen Oligodesoxyribonukleotid-Bereich, der zwischen flankierenden Bereichen mit 2'-O-substituierten oder nicht-substituierten Ribonukleotiden liegt, wobei das Rückgrat ferner wenigstens eine n-Butylphosphoramidat- oder wenigstens eine Methylphosphonat- Internukleosid-Bindung umfasst.

19. Oligonukleotid gemäß Anspruch 3 mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1 (HPV1), 11 (HPV19), 18 (HPV30), 19 (HPV31), 20 (HPV32), 21 (HPV33) und 26 (H PV38).

20. Oligonukleotid gemäß Anspruch 4 mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NOs: 118 (HPV53), 119 (HPV52), 54 (HPV56) und 121 (HPV50).

21. Oligonukleotid gemäß Anspruch 19 oder 20, das aus Desoxyribonukleotiden besteht und Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen besitzt.

22. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, das modifiziert ist, so dass es durch eine Schleife selbst-stabilisiert ist, eine offene oder geschlossene Hantelstruktur besitzt, ein Cap am 2'-, 3'- und/oder 5'-Ende besitzt, Hinzufügungen an das Molekül an den Internukleosid-Phosphatbindungen enthält oder ferner durch Oxidation, Oxidation/Reduktion oder Oxidation/reduktive Aminierung modifiziert ist, einschließlich Kombinationen davon.

23. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen mit SEQ ID NOs: 1-11, 16, 18-28, 31, 32, 36, 37 und 38, wie in Tabelle 1A gezeigt oder aus SEQ ID NOs: 1, 41-111, 116-122 und 130, wie in Tabelle 1B gezeigt, wobei das Oligonukleotid die Internukleosid-Bindungszusammensetzung und weitere Modifikationen, wie in Tabelle 1A und 1B gezeigt, besitzt.

24. Oligonukleotid gemäß Anspruch 23, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NOs: 88 (HPV18-4-8 IH 2'-Ome PO), 88 (HPV18-4-8 IH 2'-OMe PS), 89 (HPV17-6-7 IH 2'-OMe PO), 89 (HPV17-6-7 IH 2'-OMe PS), 90 (HPV19-6-5 IH 2'-OMe PO), 90 (HPV19-6-5 IH 2'- OMe PS), 91 (HPV15-6-9 IH 2'-OMe PO), 91 (HPV15-6-9 IH 2'-OMe PS), 92 (HPV110-6-4 IH 2'-OMe PO), 92 (HPV1 10-6-4 IH 2'-OMe PS), 93 (HPV16-8-6 IH 2'-OMe PO), 93 (HPV1 6-8-6 IH 2'-OMe PS) und 96 (HPV1 0 · 5 Hybrid).

25. Oligonukleotid gemäß Anspruch 23, ausgewählt aus der Gruppe von Oligonukleotiden mit SEQ ID NOs: 41 (SS1), 42 (SS2), 43 (SS3), 44 (SS4), 49 (SS9) und 51 (SS11).

26. Oligonukleotid gemäß Anspruch 23, ausgewählt aus der Gruppe von Oligonukleotiden mit SEQ ID NOs: 54 (HPV56 CAP), 57 (SS16), 59 (SS18), 65 (SS26), 67 (SS28) und 104 (HPV56 0 · 5 Hybrid).

27. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei wenigstens ein Nukleosid durch Inosin oder wenigstens ein Desoxycytosin durch 5-Methyldesoxycytosin ersetzt ist.

28. Oligonukleotid gemäß Anspruch 27, umfassend zwei Inosin- oder zwei 5-Methyldesoxycytosin-Nukleoside.

29. Oligonukleotid gemäß Anspruch 28, das eine Sequenz besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1 (HPV15-Me-dC) und 24 (HPV365-Me-dC), wie in Tabelle 1B gezeigt.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein synthetisches Oligonukleotid, das zu einem Teil des offenen Leserahmens aus E1 des menschlichen Papilloma-Virus komplementär ist, der sich innerhalb der Nukleotide -17 bis +29 befindet, wobei das Oligonukleotid wenigstens 15 Nukleotide umfasst.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 30, weiter umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

32. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 31, wobei der Träger ein Lipid-Träger ist.

33. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29 für die Verwendung als therapeutisch aktive Verbindung, insbesondere für die Verwendung zur Kontrolle oder Prävention einer Infektion durch menschliches Papilloma-Virus.

34. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung von Replikation, der Expression von RNA des menschlichen Papilloma-Virus oder zur Behandlung einer Infektion durch menschliches Papilloma-Virus.

35. Verfahren zum Nachweis von HPV in einer Probe, umfassend die Schritte:

(a) Kontaktieren der Probe mit wenigstens einem synthetischen Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Komplementen davon, und

(b) Nachweis der Hybridisierung des Oligonukleotids an die Nukleinsäure.

36. Kit für den Nachweis von HPV in einer Probe, umfassend:

(a) wenigstens ein synthetisches Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder die Komplemente davon, und

(b) Mittel für den Nachweis des an die Nukleinsäure hybridisierten Oligonukleotids.