DE69530761T2

DE69530761T2 - Methode und poröser träger zur entfernung von verunreinigungen

Info

Publication number: DE69530761T2
Application number: DE69530761T
Authority: DE
Inventors: Egisto Boschetti; Pierre Girot; Luc Philippe Guerrier
Original assignee: Biosphere Medical Inc
Current assignee: Pall Corp
Priority date: 1994-03-21
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2015-03-17
Also published as: US5609763A; AU688024B2; WO1995025574A1; EP0751810B1; JP3856396B2; CA2196971A1; AU2121795A; DE69530761D1; EP0751810A4; CA2196971C; EP0751810A1; US5486293A; ATE240140T1; JPH09512204A

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die Erfindung betrifft eine Methode und Materialien zur Entfernung kleiner exogener Moleküle, wie beispielsweise Virus-inaktivierende Mittel, aus biologischen Fluids, wie beispielsweise Blut und Blutfraktionen.
GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Es sind zahlreiche Versuchsansätze zur Inaktivierung von Viren, wie beispielsweise Hepatitis B (HB), non-A, non-B Hepatitis (NANBH), humaner T-Lymphoma Retrovirus Typ 3 (HTLV), humaner Immundefizienz-Virus (HIV) und Lymphadenopathie assoziierter Virus (LAV) unternommen worden. Heutzutage ist die Methode der Wahl zur Inaktivierung dieser Viren in Blut und Blutfraktionen die Behandlung mit einem Lösemittel wie beispielsweise Tri-n-butylphosphat und einem Detergens wie beispielsweise Polysorbat 80 (Tween 80) oder Natriumcholat. Viele frühere Arbeiten auf diesem Gebiet wurden von der Arbeitsgruppe um Bernard Horowitz und Alfred Prince am New Yorker Blond Center durchgeführt, und wie im Februar 1991 waren mehr als 1,7 Millionen Dosen Lösemittel- und Detergensbehandelte Blutgerinnungsfaktor-Konzentrate infundiert worden.
Zusätzlich zu Tri-n-butylphosphat sind weitere Phosphatester, Ether und Halogenkohlenwasserstoffe als zweckdienliche Lösemittel beschrieben worden. Zusätzlich zu Polysorbat oder Natriumcholat sind weitere nichtionische Tenside, insbesondere ethoxylierte Octylphenole und Nonylphenole wie auch Sulfobetaine, Phosphatidylcholine und Octyl-β-D-glucopyranosid als Virus-inaktivierende Mittel erwähnt worden. Zum Beispiel beschreibt U.S. Patent 4.540.573 die Anwendung mehrerer organischer Lösemittel- und Detergenspaare zur Verminderung der Infektiosität von Hepatitis und anderen Viren.
Bei allen vorangehenden Behandlungen werden exogene Mittel zu dem biologischen Fluid gegeben. In den meisten Fällen müssen diese exogenen Mittel aus dem Fluid entfernt sein, bevor dieses einem Menschen verabreicht werden kann. Die Europäische Patentanmeldung 239.859 beschreibt eine Methode, die gegenwärtig angewandt ist, um flüssige lösliche Prozesschemikalien aus biologischen Fluids zu entfernen. Sie umfasst das Inkontaktbringen des Fluids mit einem natürlich vorkommenden Öl, Rühren der resultierenden Mischung, Trennen der Phasen mittels Sedimentation oder Zentrifugation, Dekantieren der oberen Flüssigphase und Verwendung des übrig bleibenden biologischen Fluids. Neben der mechanischen Komplexität dieses Verfahrens erscheint es nur für die Entfernung von flüssigen löslichen Prozesschemikalien (wie beispielsweise Tri-n-butylphosphat) anwendbar. In der Tat lässt die Anmeldung darauf schließen, dass ein allgemein gebräuchliches nichtionisches Tensid (Polysorbat 80) schlecht extrahiert wird.
Gelfiltration ist ebenfalls zur Entfernung von Detergentien und Lösemitteln aus Blutfraktionen basierend auf ihren Molekulargewichtsunterschieden vorgeschlagen worden. Horowitz et al. [Transfusion, 25 Seiten 516–522 (1985)] haben die Entfernung von Tri-n-butylphosphat aus Antihämophilin-Faktor-Konzentraten mittels Chromatographie auf Sephadex G-25 beschrieben; allerdings ist die Gelchromatographie kein geeignetes Verfahren zur Entfernung von Lösemittel und Detergens aus Gesamtblut. Darüber hinaus war es ineffektiv bei der Entfernung von Polysorbat 80 aus einer Blutkomponente, obwohl es für die Entfernung von Natriumcholat effektiv war. Horowitz et al. [Blood, 79, Seiten 826–831 (1992)] haben ebenfalls die Entfernung von Tri-n-butylphosphat und Triton^® X-100 (polyethoxyliertes Octylphenol) aus frisch gefrorenem Plasma mittels Extraktion mit Sojabohnenöl, Zentrifugation und dann präparative Chromatographie auf C-18 Umkehrphase empfohlen.
Keines der gegenwärtig angewandten oder vorgeschlagenen Verfahren ist für Routineverarbeitungen von Blut und Blutfraktionen besonders verlockend. Es besteht folglich ein Bedarf an einem einfachen und effektiven Verfahren zur Entfernung kleiner exogener Moleküle, die sowohl hydrophob als auch polar sind, aus Blut und anderen biologischen Fluids.
Es ist deshalb ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur schnellen und effizienten Entfernung kleiner exogener Moleküle aus einem biologischen Fluid bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, ein Verfahren bereitzustellen, das exogene Moleküle entfernen kann, ohne die Funktion des biologischen Fluids zu beeinträchtigen.
Ein weiterer Gegenstand ist, ein Verfahren zur Entfernung exogener Moleküle bereitzustellen, das sowohl hydrophobe als auch amphiphile Moleküle entfernen kann.
Ein besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur schnellen und effektiven Entfernung von Virus-inaktivierenden Mitteln aus Blut oder Blutfraktionen in einem klinischen Standard bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, einen porösen Träger bereitzustellen, der für eine Entfernung kleiner exogener Moleküle ohne Beeinträchtigung der Funktion des biologischen Fluids geeignet ist.
Diese und weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile sind von der unten zusammengefassten Erfindung bereitgestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus einem biologischen Fluid. Das Verfahren umfasst Inkontaktbringen des Fluids mit einem vernetzten hydrophoben polymeren Netzwerk, das die Poren einer Mineraloxidmatrix ausfüllt. Das vernetzte polymere Netzwerk liegt dem porösen Mineraloxid auf und füllt das Poren-Innenvolumen aus, ist aber daran nicht kovalent gebunden. Hydrophobe und amphiphile Moleküle mit einem Molekulargewicht von unter 10.000 Dalton werden gleichzeitig aus dem biologischen Fluid entfernt, wenn dieses über das Mineraloxid getragene hydrophobe polymere Netzwerk geleitet wird.
Insbesondere kann das Verfahren zur Entfernung von Lösemitteln und Tensiden aus biologischen Fluids angewandt sein. Bevorzugte biologische Fluids umfassen Blut, Blutfraktionen und biologische Extrakte, aus denen Virus-inaktivierende Mittel zu entfernen sind.
Bevorzugte Mineraloxidmatrices besitzen eine mittlere Teilchen-Ausgangsgröße von 5 bis 2.000 Micron, Porenvolumina von 0,2 bis 4 Kubikzentimeter pro Gramm, Oberflächen von 1 bis 1.000 Quadratmeter pro Gramm und Poren-Ausgangsgrößen von 50 bis 6.000 Angström. Die bevorzugteste Mineraloxidmatrix besitzt ein Poren-Ausgangsvolumen von 1 Kubikzentimeter pro Gramm und eine Ausgangs-Oberfläche von 200 Quadratmeter pro Gramm.
Das vernetzte hydrophobe Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Acrylaten, Methacrylaten, Acrylamiden, Methacrylamiden und Gemischen davon. Bevorzugte hydrophobe Polymere sind Alkyl- und Arylalkylacrylamide und -methacrylamide mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen und Alkyl- und Arylalkylacrylate und -methacrylate mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen. Wenn das Verfahren zur Entfernung von Virus-inaktivierenden Mitteln aus Blut und Blutfraktionen angewandt ist, sind besonders bevorzugte Polymere N-tert-Octylacrylamide, N-Octadecylacrylamid, N-Methylundecylacrylamid und Octadecylmethacrylat.
Das Verfahren der Erfindung ist besonders geeignet zur Entfernung von bis zu 5 Gew.-% eines oder mehrerer Virus-inaktivierender Mittel, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Detergentien und hydrophoben Lösemitteln. Das Verfahren ist besonders zweckdienlich zur Entfernung eines Phosphatesters wie beispielsweise Tri-n-butylphosphat, eines Detergens wie beispielsweise ein ethoxyliertes Nonylphenol oder oberflächenaktives nichtionisches Octylphenol-Mittel, oder eine Kombination aus Lösemittel und Detergens.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen porösen Träger zur Entfernung kleiner exogener Moleküle aus biologischen Fluids. Der Träger umfasst eine poröse Mineraloxidmatrix, deren Poren-Innenvolumen im Wesentlichen mit einem vernetzten hydrophoben Polymer ausgefüllt ist. Das hydrophobe Polymer liegt der Mineraloxidmatrix auf, ist aber nicht an diese kovalent gebunden. Das hydrophobe Polymer hat eine Ausschlussgrenze von etwa 10 Kilodalton. Bevorzugte Matrices und hydrophobe Polymere sind, wie es oben beschrieben ist, für das Verfahren unter Verwendung des porösen Trägers.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der möglichen Architektur des dreidimensionalen polymeren Netzwerkes, das im Poreninnern gebildet wird und sich von den Innenseiten einer einzelnen Pore in einer porösen festen Matrix gemäß der vorliegenden Erfindung erstreckt.
2 ist eine schematische Darstellung der mutmaßlichen Architektur einer Octadecylsilan beschichteten Matrix als Standard der Technik.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG EINSCHLIESSLICH BEVORZUGTER ANWENDUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese eines speziellen festen Sorbens mit einer spezifischen inneren chemischen Struktur, die in der Lage ist, selektiv kleine hydrophobe Moleküle oder amphiphile Moleküle wie beispielsweise Detergentien, die eine signifikante hydrophobe Domäne und eine polare Domäne besitzen, zu adsorbieren. Die Sorbentien sind aus zwei Hauptkomponenten zusammengesetzt: (1) einem starren porösen mineralischen Material, das in der Lage sein kann, Wasserstoffbrückenbindungen mit der polaren Domäne von amphiphilen Molekülen wie beispielsweise Detergentien zu bilden und (2) einem organischen hydrophoben Netzwerk, in dem unpolare Lösemittel effektiv zurückgehalten werden können. Das organische hydrophobe Netzwerk ist hoch vernetzt, so dass Detergentien, Lösemittel und andere Verunreinigungen kleiner als 10.000 Dalton leicht innerhalb der mikroporösen Struktur eingefangen werden, während Proteine und Zellbestandteile um die Partikel gleiten und mit dem Sorbens nicht in Wechselwirkung treten.
Die Sorbentien der Erfindung erlauben eine Verarbeitungskette zur Entfernung von hydrophoben Molekülen mit einem höheren Durchsatz als dies mit der Öl-Extraktionstechnik möglich wäre. Das Verfahren besitzt den weiteren Vorteil, dass keine Lösemittelabfälle anfallen, wohingegen bei der Öl-Extraktion mit Lösemittel angereichertes Öl anfällt, das entweder aufzureinigen oder zu verwerfen ist. Zusätzlich wird eine Verunreinigung des biologischen Fluids durch das Reinigungs medium vermieden, während im Falle der Öl-Extraktion das Öl wahrscheinlich in Spurenmengen von den hydrophoben Proteinen in dem biologischen Fluid adsorbiert wird.
Die Sorbentien der Erfindung zeigen außerdem mehrere Vorteile auch gegenüber der Gelfiltration. Bei der Gelfiltration ist die Probenladung der limitierende Faktor. Normalerweise kann das Volumen der Ladung nicht höher als 25% des Säulenvolumens betragen, so dass eine 101 Säule für die Behandlung von etwa 2,51 biologischem Fluid benötigt wird. Im Gegensatz dazu könnte eine 101 Säule des Sorbens der Erfindung zur Behandlung von 1001 biologischem Fluid verwendet sein. Die lineare Flussrate einer derartigen Gelfiltrationssäule ist auf weniger als 50 Zentimeter pro Stunde auf Grund der mechanische Instabilität des Gels und der Bandenverbreiterung begrenzt, die bei höheren Geschwindigkeiten erfolgt; im Gegensatz hierzu erlauben die Teilchen der Erfindung hohe Flussraten.
Die mit Polymer gefüllten Mineraloxid-Sorbentien der Erfindung zeigen eine sehr hohe chemische und physikalische Stabilität und werden von Lösemitteln, stark sauren wässrigen Medien, stark alkalischen Medien und Oxidationsmitteln nicht angegriffen.
Chemische und physikalische Stabilität sind sehr wichtige Charakteristika eines Materials, das mehrmals verwendet werden soll, und das deshalb gereinigt und regeneriert werden muss. Insbesondere ist es wichtig, dass die Regenerationsbedingungen zu keinen Abbauprodukte führen, die entweder die ursprünglichen Eigenschaften des Sorbens beeinträchtigen oder das biologische Fluid verunreinigen.
Hinsichtlich der Stabilität besitzt das Sorbens der Erfindung mehrere Vorteile im Vergleich zu bereits vorhandenen Methoden zur Entfernung von Lösemitteln und Detergentien aus biologischen Fluids.
Chemische Stabilität und Sorptionskapazität sind die Hauptgründe für eine Umkehrphasen-Chromatographie auf C-18 Kieselgel zur Entfernung flüssiger Lösemittel. Die C-18 Festphase kann auf Grund des chemischen Abbaus des Substrats nicht bei einem pH über 8 eingesetzt sein. Darüber hinaus sind C-18 Umkehrphasen-Sorbentien für ihre nicht spezifische Adsorption von lipophilen Proteinen aus biologischen Fluids bekannt.
Die Poren der Mineraloxid-Sorbentien der vorliegenden Erfindung sind mit einem stabilen vernetzten Polymer gefüllt, das einem chemischen Abbau widersteht. Zusätzlich ist die reversible Sorptionskapazität auf Grund der Dichte der Lipidketten im polymeren Netzwerk höher. Während die Anzahl der Octadecyl-Kohlenwasserstoffhetten auf C-18 Umkehrphasen-Substraten von der Anzahl zugänglicher Hydroxyle auf der Kieselgel-Oberfläche begrenzt ist, besteht in der vorliegenden Erfindung eine derartige Begrenzung nicht. Weil das Polymer-Volumen eher eine Funktion des Porenvolumens als der Porenoberfläche ist und weil das Polymer nicht an Kieselgel gebunden ist, kann ein dichtes Netzwerk unter Verwendung eines konzentrierteren Monomers für die Polymerisation angelagert werden.
Die Mineral-Komponente des Sorbens der Erfindung ist durch eine große Oberfläche pro Gramm gekennzeichnet, um die Adsorptionskapazität für Detergentien und ähnliche Moleküle mit polaren Domänen zu maximieren. Aus dem gleichen Grund ist die Menge an organischem hydrophoben polymeren Netzwerk hoch genug, um eine maximale Sorption von unpolaren Lösemitteln zu erlauben. Die hohe Vernetzung, die zu einer Ausschlussgrenze von unter 10 Kilodalton führt, beschränkt die Diffusion auf relativ kleine Moleküle und verhindert das Eindringen und folglich unspezifisches Binden von Proteinen.
Die Herstellung der Sorbentien der Erfindung ähnelt in mancher Hinsicht der im U.S. Patent 5.268.097 beschriebenen Herstellung von Sorbentien. Ein festes poröses Mineral in Form von Kügelchen oder in Form von unregelmäßigen Teilchen wird mit einer Lösung aus geeigneten hydrophoben polymerisierbaren Monomeren und bifunktionellen Vernetzern getränkt. Nach Füllen der Poren des Minerals mit Monomer-Lösung, erfolgt die Polymerisation durch Wirkung eines Katalysators. Das vernetzte Polymer wird innerhalb des Porenvolumens des Mineralsubstrats durch physikalisches Einfangen immobilisiert und kann selbst durch Lösemitteleinwirkung nicht frei werden.
Das Mineralsubstrat kann ein beliebiges Metalloxid sein, das eine poröse Struktur bereitzustellen vermag, und das als unregelmäßige oder als Kügelchen geformte Teilchen gewonnen werden kann. Das Metalloxid kann außerdem die Fähigkeit besitzen, mit Detergentien, die polare Seitenketten besitzen, Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen. Kieselgel, Aluminiumoxid, Zirkoniumoxid, Titandioxid und Gemenge dieser sind Beispiele für zweckdienliche Mineralmaterialien.
Zweckdieriliche Monomere zur Herstellung des immobilisierten vernetzten hydrophoben Polymers umfassen Vinyl-, Acryl- und Alkyl-Monomere. Sie sind durch das Vorhandensein einer hydrophoben Seitenkette gekennzeichnet, die aromatisch, heterocyclisch oder aliphatisch sein kann. Aliphatische Seitenketten können linear, verzweigt oder cyclisch sein. Beispiele für Monomere umfassen Octadecylmethacrylat, Hexadecylmethacrylat, Dodecylmethacrylat, Octylmethacrylat, Octadecylacrylamid, Hexadecylacrylamid, Methylundecylacrylamid, Isooctylacrylamid, Hexylacrylamid, Phenylpropylacrylamid und Tritylacrylamid. Beispielhafte Vinyl-, Alkyl- und Acryl-Monomere entsprechen der allgemeinen Formel I:
worin R¹ Wasserstoff oder Methyl ist und R² ist Wasserstoff, niederes Alkyl,
oder
n gleich null oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 18 ist;
R³ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist;
R⁴ Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist; und
R⁵ Wasserstoff oder Alkyl ist;
Zur Herstellung der Sorbentien der Erfindung wird ein bifunktionelles Vernetzungsmittel zu dem Monomer gegeben. Das Vernetzungsmittel erlaubt dem dreidimensionalen unlöslichen polymeren Netzwerk sich im Poreninnern zu bilden und im Wesentlichen das Porenvolumen der porösen Matrix zu füllen. Ohne den Vernetzer wäre das gebildete Polymer linear und könnte auf Grund seiner Löslichkeit aus den Poren durch allgemein verbreitete Lösemittel extrahiert werden. Die Menge an Vernetzungsmittel sollte 0,1 bis 10 Gew. % des Monomergesamtgewichtes betragen. In der vorliegenden Erfindung eingesetzte Vernetzungsmittel sind Acryl-, Vinyl- oder Allyl-Monomere, die wenigstens zwei polymerisierbare funktionelle Gruppen besitzen. Bevorzugte Vernetzungsmittel besitzen wenigstens zwei Doppelbindungen und sind diejenigen, die bei Herstellung von Acryl-, Vinyl- und Allyl-Polymeren klassischerweise eingesetzt werden. Beispiele zweckdienlicher Vernetzungsmittel umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, N,N'-Methylen-bis-acrylamid, N,N'-Methylen-bis-methacrylamid, Diallyltartratdiamid, Allylmethacrylat, Diallylamin, Diallylether, Diallylcarbonat, Divinylcarbonat, Divinylether, 1,4-Butandioldivinylether und 1,3-Diallyloxy-2-propanol.
Nach Mischen des Monomers und des Vernetzungsmittels wird die Mischung der porösen festen Matrix beigemischt, wobei dadurch die Poren der Matrix gefüllt werden. In einem möglichen Herstellungsverfahren des Sorbents werden die Poren mit einer wässrigen Lösung des Monomers und Vernetzungsmittels gefüllt und die Mischung wird in ein nicht-wässriges dispergierendes Medium verbracht. Geeignete nicht-wässrige Medien umfassen dem Fachmann bekannte unpolare organische Lösemittel, zum Beispiel Pflanzenöle, aromatische Lösemittel und chlorierte Lösemittel. Bevorzugte nicht-wässrige Medien umfassen Toluol, Methylenchlorid und Hexan.
Danach wird ein Polymerisationsstarter zu der Mischung gegeben. Beispiele umfassen Amine wie beispielsweise N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TMEDA) oder Dimethylaminopropionitril, die normalerweise mit oxidierenden Startern (siehe unten) wie beispielsweise Ammoniumpersulfat verwendet werden. Diese können ebenfalls photoaktivierbare Verbindungen wie beispielsweise Riboflavin oder thermisch aktivierbare Chemikalien wie beispielsweise Azo-bis-isobutyronitril, Ammoniumpersulfat oder Azo-bis-amidinopropan umfassen. Die Starterkonzentration liegt bei 0,1 % bis 2%. Es ist dem Fachmann klar, dass bestimmte Starter gut in wässrigen Medien löslich sind, während andere gut in organischen Medien löslich sind. Deshalb kann der Polymersiationsstarter in Abhängigkeit der Löslichkeitscharakteristika eines bestimmten Starters oder Kombination an Startern zu der Ausgangslösung aus Monomer und Vernetzungsmittel vor Zugabe dieser Mischung zu der porösen festen Matrix gegeben werden. In der Tat kann eine Starterkombination aus Ammoniumpersulfat und Tetramethylendiamin (TMEDA) separat zugegeben werden. Das wasserlösliche Persulfat-Salz wird mit der wässrigen Mischung aus Monomer und Vernetzungsmittel vereint, während das TMEDA mit dem nicht-wässrigen dispergierenden Medium vereint wird. Es sollte angemerkt werden, dass die Persulfat/TMEDA Kombination besonders zweckdienlich ist, da TMEDA eine bemerkenswerte Löslichkeit in Wasser zeigt und dadurch in die Poren des behandelten Trägers einzudringen vermag, um die Polymerisation effektiv zu starten. Wenn die Kombination aus Persulfat und tertiärem Amin verwendet wird, wird das Persulfat vorzugsweise vor der Zugabe des nicht-wässrigen Mediums zugegeben, da Persulfat viel löslicher in Wasser als in nicht-wässrigem dispergierendem Medium ist.
Der Polymerisation bildet ein dreidimensionales Gitter oder vernetztes polymeres Netzwerk 1, das sich von der Porenwandfläche 2 der porösen festen Matrix erstreckt, wie in 1 veranschaulicht. Die dreidimensionale Gitterstruktur füllt im Wesentlichen das Porenvolumen aus und besitzt im Wesentlichen die selbe Form wie die Pore, die sie ausfüllt. Dies ist der Unterschied zu der Struktur eines typischen beschichteten Kieselgels (siehe 2), wo die aliphatischen Reste 3 in einer monomolekularen Schicht über der Kieselgeloberfläche 2 verstreut sind.
Es ist entdeckt worden, dass die porösen Träger der vorliegenden Erfindung eine ungewöhnlich hohe dynamische Sorptionskapazität als eine Funktion der Flussrate bei der Entfernung von hydrophoben Molekülen zeigen. Während die große Mehrheit der porösen Materialien eine merkliche Abnahme der Sorptionskapazität bei anwachsenden Flussraten erfahren, zeigen insbesondere die Träger der vorliegenden Erfindung eine geringe Abnahme der zweckdienlichen Sorptionskapazität für hydrophobe Moleküle bei statischen Bedingungen bis zu Flussraten von mehreren Hundert cm/hr. Dies steht in bemerkenswertem Gegensatz zu dem Verhalten von Materialien vom Typus Polysaccharidgel wie beispielsweise Sepharose. Darüber hinaus sind die absoluten Kapazitäten der Träger der vorliegenden Endung beträchtlich größer als diejenigen anderer fester Trägertypen, die eine ähnliche Unempfindlichkeit für hohe Flussraten zeigen. Interessanterweise scheinen die Sorbentien mehr wie typische poröse Träger hinsichtlich ihres Verhaltens gegen Detergentien zu sein.
Die Sorbentien und Verfahren der Erfindung können zur Entfernung verschiedener kleiner exogener Moleküle aus biologischen Fluids verwendet sein. Biologische Fluids von Interesse umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Blut und Blutfraktionen, Sperma, Milch, Ascitesflüssigkeit, Speichelflüssigkeit, Plazenta-Extrakte, Gewebekultur-Zelllinien und ihre Extrakte einschließlich transformierter Zellen und Fermentationsprodukte.
Von primärem Interesse sind unter den zu entfernenden Lösemitteln die Dialkylphosphat- und Trialkylphosphat-Lösemittel mit linearen oder verzweigten Gruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele dieser Gruppen sind Tri-(n-butyl)phosphat, Tri-(t-butyl)phosphat, Tri-(n-hexyl)phosphat und Tri-(2-ethylhexyl)phosphat. Lipophile Lösemittel umfassen zusätzlich zu den oben erwähnten Phosphatestern, Halogenkohlenwasserstoffe und Ether, die ebenfalls zur Virusinaktivierung eingesetzt worden sind.
Die Medien sind ebenfalls bei Entfernung von Detergentien oder Tensiden aller Art zweckdienlich. Die hydrophile Domäne des Detergens kann nichtionisch (z. B. Polyoxyethylenketten, mono- oder polyhydroxylierte Ketten, Zucker und ähnliche), anionisch (z. B. Carboxylate, Sulfonsäuren, Sulfate, Phosphate oder Phosphonate) oder kationisch sein (z. B. Ammoniumsalze und Pyridiniumsalze). Die hydrophobe Domäne des Detergens kann Alkyl-, Aryl- oder Heteroaryl-Reste umfassen. Beispiele für nichtionische Detergentien umfassen: (a) die Polyethylenoxid-Kondensate von Alkyl- und Dialkyl-Phenolen, mit einem geraden oder verzweigten Alkyl mit etwa 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen, mit Ethylenoxid und (b) die Kondensationsprodukte von aliphatischen Alkoholen mit Ethylenoxid mit der Formel RO(C₂H₄O)_nH, worin R ein gerades oder verzweigtes Alkyl mit etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen ist und n 3 bis 40 ist. Nichtionische Tenside vom Typ (a) werden von GAF Corporation unter der Handelsmarke IGEPAL^TM und von Union Carbide unter der Handelsmarke Triton^TM vermarktet. Von besonderem Interesse sind Triton X100 und Triton X45, die zur Inaktivierung von Viren in Blut und Blutprodukten eingesetzt worden sind. Nichtionische Tenside vom Typ (b) oben sind von Shell Chemical Company unter der Handelsmarke Neodol^TM und von Union Carbide unter der Handelsmarke Tergitol^TM vermarktet. Weitere nichtionische Tenside umfassen polyoxyethylenierte Derivate von Sorbatmonolaurat, bekannt als Polysorbate; von besonderem Interesse ist Polysorbat 80, das zur Virusinaktivierung in Blut und Blutprodukten eingesetzt worden ist.
Anionische Tenside von Interesse umfassen Natriumcholat und Natriumtaurodesoxycholat. Kationische Tenside umfassen Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetylpyridiniumchlorid und Dodecylpyridiniumchlorid. Zwitterionische Tenside umfassen Phosphatidylcholin und Sulfobetaine wie beispielsweise N-Dodecyl-N,N-dimethyl-2-amino-1-ethansulfonat. Weitere nichtionische Tenside umfassen Amide von Tris-hydroxymethylaminomethan enthaltende Alkylketten, Alkylglycoside und andere Lipopolysaccharide. Weitere Arten von Interesse umfassen Fettsäuren wie beispielsweise Caprylsäure und Triterpenoide wie beispielsweise Carbenoxolon, die ebenfalls zur Virusinaktivierung in Blut und Blutprodukten eingesetzt worden sind.
Die Elimination von unerwünschten exogenen chemischen Mitteln ist für andere Verfahren außer der Entfernung von Virus-inaktivierenden Mitteln wertvoll. Zum Beispiel wurden Phorbolester, die als Carcinogene bekannt sind, zur Stimulierung der Lymphokinproduktion eingesetzt und müssen aus dem Produkt vor Verabreichung entfernt werden. Aus dem selben Grund ist der Detergenseinsatz nicht auf die Virusinaktivierung begrenzt; Detergentien, die zur Reinigung von Impfstoff Antigenen eingesetzt sind, müssen ebenfalls am Ende des Reinigungsprozesses entfernt werden [siehe Biochem. Biophys, Acta 415, 29 (1975)].
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Herstellung eines Kieselgel-Polymer-Verbunds mit einer aliphatischen hydrophoben Kette mittlerer Länge.
Vier Gramm Methylundecylacrylamid (MUA) wurden in 3 ml reinem Ethanol bei 40–50°C gelöst. 0,4 mg N,N'-Methylen-bis-acrylamid (MBA) wurden separat in 1,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Die zwei Lösungen wurden zusammengemischt und 0,5 ml demineralisiertes Wasser, das 0,05 mg Azobisamidinopropan enthielt, wurde zu der Lösung gegeben. Das Gesamtvolumen der Mischung wurde mit reinem Ethanol auf 10 ml eingestellt.
Die Monomerlösung wurde unter Rühren tropfenweise zu 10 g trockenem porösem Kieselgel gegeben, dessen Oberfläche 200 m²/g und Porenvolumen etwa 1 cm³/g betrug. Das durchtränkte Kieselgel wurde unter Stickstoff in einem geschlossenen Gefäß mindestens zwei Stunden auf 80–90°C erhitzt, um die Polymerisation zu starten. Der erhaltene Polymer-Kieselgel-Verbund wurde über Nacht abgekühlt und dann ausgiebig mit Ethanol, 0,5 M Natriumhydroxid, 0,1 M Salzsäure und zuletzt mit Wasser gewaschen.
Das Verbund-Sorbens wurde in eine 0,3 × 10 cm Säule verbracht und 6 ml Rinderserum, behandelt mit 5 mg/ml TNBP und 10 mg/ml Triton X-100 gemäß dem Verfahren von Horowitz et al. [Transfusion 25, 516–522 (1985) und Blond 79, 826-831 (1992)], wurden durch die Säule laufen gelassen. Sowohl Triton X-100 als auch Tri-n-butylphosphat (TNBP) wurden aus dem Lösemittel/Detergens Virusinaktivierten Rinderserum entfernt. Die Sorptionskapazität für Triton X-100 betrug etwa 60 mg/ml Sorbens. Die Sorptionskapazität für TNBP war größer als 43 mg/ml Sorbens.
Beispiel 2
Herstellung eines Kieselgel Polymer-Verbunds mit langen aliphatischen hydrophoben Ketten.
Zwei Gramm Octadecylacrylamid (ODA) wurden in 15 ml Dichlorethan unter Rühren gelöst. Separat wurden 0,8 mg N,N'-Methylen-bis-methacrylamid (MBMA) in 3 ml Methanol gelöst und mit der ODA-Lösung gemischt. Zu der resultierenden Mischung wurden 2 ml 0,1 mg Azobis-isobutyronitril haltiges Methanol gegeben und gründlich gemischt. Zehn Milliliter der Monomerlösung wurden tropfenweise und unter Rühren zu 10 g trockenem porösem Kieselgel gegeben, dessen Oberfläche etwa 200 m²/g und Porenvolumen 1 cm³/g betrug.
Die Lösemittel (Dichlorethan und Methanol) wurden im Stickstoffstrom auf Konstantgewicht eingedampft. Auf das resultierende trockene Material wurde dann die zweite Hälfte der Monomerlösung (10 ml) tropfenweise, wie oben beschrieben, zugegeben.
Das mit Monomer durchtränkte Kieselgel wurde unter Stickstoff in einem geschlossenen Gefäß mindestens zwei Stunden auf 80–90°C erhitzt, um die Polymerisation zu starten. Das erhaltene Polymer-gefüllte Kieselgel wurde über Nacht abgekühlt und dann ausgiebig mit Dichlorethan, Methanol, 0,5 M Natriumhydroxid, 0,1 M Salzsäure und zuletzt mit Wasser gewaschen. Es wurde dann als Ethanol-Suspension oder getrocknet aufbewahrt. Rinderplasma wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Die Sorptionskapazität für Triton X-100 betrug 78 mg pro ml Sorbens; die Sorptionskapazität für TNBP war größer als 45 mg/ml Sorbens. Beide Ergebnisse wurden in Gegenwart von Rinderplasma erhalten.
Beispiel 3
Herstellung von Polymer-gefülltem Kieselgel mit verzweigten aliphatischen hydrophoben Ketten.
Die Herstellung dieses Materials erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, außer dass das Hauptmonomer tert-Octylacrylamid anstatt MUA war und dass der bifunktionelle Vernetzer MBMA anstatt MBA war.
Wenn das Material wie in Beispiel 1 getestet wurde, waren die Eigenschaften folgendermaßen:

Kapazität für Triton X-100 : 65 mg/ml Sorbens

Kapazität für TNBP: >43 mg/ml Sorbens
Beispiel 4
Herstellung eines Kieselgel-Polyacrylat-Verbundmaterials mit langen aliphatischen Ketten.
Die Herstellung dieses Materials erfolgte, wie in Beispiel 2 beschrieben, außer dass das Hauptmonomer ein Octadecylmethacrylat anstatt Octadecylacrylamid war. Wenn das Material wie in Beispiel 1 getestet wurde, waren die Eigenschaften folgendermaßen:

Kapazität für Triton X-100 : 72 mg/ml Sorbens

Kapazität für TNBP: >43 mg/ml Sorbens
Beispiel 5
Einfluss der Kieselgel-Oberfläche auf die Sorptionskapazität für Triton X-100.
Drei MUA-Kieselgel Sorbentien wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methodik hergestellt. Der einzige variable Parameter war die Oberfläche der Kieselgel-Poren. Die Konzentration des Monomers war in allen Fällen 40 % w/v. Auf diesen drei Sorbentien wurde die Sorptionskapazität unter den gleichen Bedingungen für ein nichtionisches Detergens, Triton X-100 gemessen. Dies wurde unter Verwendung von Rinderserum, das 1% Triton X-100 enthielt, durchgeführt. Die wesentlichen Sorptionskapazitäten der Sorbentien sind wie folgt:
Beispiel 6 Einfluss der Polymerkonzentration auf die Einfangeffizienz für TNBP.
Drei Kieselgel-MUA Sorbentien wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methodik hergestellt. Der einzige variable Parameter war die Konzentration des Monomers MUA vor der Polymerisation. Die spezifische Oberfläche und das Porenvolumen des Kieselgels waren in allen Fällen 200 m²/g beziehungsweise 1 cm³/g.
Auf diesen drei Sorbentien wurde unter den gleichen Bedingungen die Sorptionskapazität für TNBP gemessen. Dies wurde unter Verwendung von Rinderserum, das 0,5 % TNBP enthielt, durchgeführt. Durch Messen des TNBP in dem Säulenauslauf war es möglich, ein Maß für die Einfangeffizienz der Sorbentien zu erhalten. Die Ergebnisse sind folgendermaßen:
Die Sorptionsgesamtkapazität für TNBP betrug in allen Fällen zwischen 40 bis 45 mg/ml.
Beispiel 7
Wiederholte Verarmung von Lösemittel/Detergens aus einem Virusinaktivierten Plasma.
Ein der Beschreibung von Beispiel 1 entsprechendes MUA-Kieselgel Sorbens wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,3 cm und 10 cm Länge gepackt. Die Säule wurde durch wiederholtes Waschen mit einer Phosphat gepufferten physiologischen Saline-Lösung (PBS) mit einer Durchflussrate von 0,15 ml pro Minute äquilibriert. Eine Probe mit 2,5 ml Lösemittel/Detergens behandeltem Rinderserum (der Gehalt an Triton X-100 beträgt 1%; der Gehalt an TNBP beträgt 0,5%) wurde auf die Säule injiziert, und am Säulenausgang gesammelt. Die Säule wurde dann mit jeweils 10 Volumina der folgenden Lösung gewaschen: PBS/Ethanol 50%; Ethanol; Ethanol/Isopropanol 50%; Isopropanol; Ethanol; PBS/Ethanol 50%. Zuletzt wurde die Säule mit PBS reäqilibriert. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite Injektion unter den gleichen oben beschriebenen Bedingungen mit Lösemittel/Detergens behandeltem Rinderserum durchgeführt und dann die Säule regeneriert und reäquilibriert. Dieser Ablauf wurde fünfmal wiederholt. Die fünf Säulen-Ausläufe werden analysiert und der Gehahlt an Triton X-100 und an TNBP bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:
Beispiel 8
Entfernung von Lösemittel/Detergens aus einer Immunglobulin G Lösung
Zu 10 ml einer 0,15 M Phosphat gepufferten Saline mit physiologischen pH mit 10 mg/ml menschlichem Immunglobulin G (IgG) wurden 0,05 ml TNBP und 0,1 ml Triton X-100 gegeben. Die Mischung wurde unter langsamen Rühren bei 27°C 4 Stunden klassisch behandelt. Zweieinhalb Milliliter dieser Lösung wurden über eine 0,7 × 10 cm Säule mit MUA-Kieselgel Sorbens gegeben; die Durchflussrate betrug 0,15 ml/Minute. Der IgG-Auslauf wurde aufgefangen und analysiert, um die verbliebene Menge an Lösemittel und Detergens zu bestimmen. Die Ergebnisse sind folgendermaßen:
Beispiel 9
Entfernung von Lösemittel/Detergens aus inaktiviertem menschlichem Gesamtplasma.
Zu 10 ml menschlichem Plasma wurden 0,05 ml TNBP und 0,1 ml Triton X-100 gegeben. Dieses biologische Fluid wurde dann wie in Beispiel 8 behandelt. Die Ergebnisse der Behandlung sind in der Tabelle unten gezeigt.
Beispiel 10
Einfluss der Durchflussrate auf die Lösmittel/Detergens Verarmung in einem biologischen Fluid.
Dieses Experiment wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 durchgeführt. Vier Experimente wurden parallel durchgeführt, um den Einfluss der Durchflussrate auf die Lösemittel/Detergens Verarmungseffizienz zu bestimmen. Die Ergebnisse sind wie folgt:

Claims

Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus einem biologischen Fluid, umfassend das Inkontaktbringen des biologischen Fluids mit einem vernetzten hydrophoben polymeren Netzwerk, das auf einer porösen Mineraloxidmatrix aufliegt, jedoch nicht kovalent an sie gebunden ist, wobei die Mineraloxidmatrix ein Poren-Innenvolumen aufweist, das im wesentlichen mit dem hydrophoben polymeren Netzwerk gefüllt ist, wobei gleichzeitig hydrophobe und amphiphile Moleküle eines Molekulargewichts von unter 10000 Dalton aus dem biologischen Fluid entfernt werden, wobei das Poren-Innenvolumen durch das Mineraloxid, das nicht passiviert ist und mit der polaren Domäne der zu entfernenden Moleküle Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden vermag, begrenzt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Entfernung von Lösungsmitteln und oberflächenaktiven Mitteln aus einem biologischen Fluid, wie aus Blut, einer Blutfraktion oder einem biologischen Extrakt, umfassend das Inkontaktbringen des biologischen Fluids mit einem vernetzten hydrophoben polymeren Netzwerk, das auf einer porösen Mineraloxidmatrix aufliegt, jedoch nicht kovalent an sie gebunden ist, wodurch die Lösungsmittel und oberflächenaktiven Mittel aus dem Fluid entfernt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mineraloxidmatrix eine mittlere Teilchen-Ausgangsgröße von 1 bis 2000 Micron, ein Poren-Ausgangsvolumen von 0,2 bis 4 cm³/g, z. B. 1 cm³/g, eine spezifische Ausgangoberfläche von 1 bis 1000 cm²/g, z. B. 200 cm²/g, und eine Poren-Ausgangsgröße von 5 bis 600 nm (50 bis 6000 Å) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus Acrylaten, Methacrylaten, Acrylamiden, Metharylamiden und Gemischen hiervon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus N-Alkyl- und N-Arylalkylacrylamiden und -methylacrylamiden von 4 bis 20 Kohlenstoffen oder aus der Gruppe von Alkyl- und Arylalkylacrylaten und -methylacrylaten von 4 bis 20 Kohlenstoffen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Entfernung von Virusinaktivierenden Mitteln aus Blut oder aus einer Blutfraktion, umfassend das Inkontaktbringen des Bluts mit einem vernetzten hydrophoben Polymer, das aus der Gruppe bestehend aus Acrylaten, Methacrylaten, Acrylamiden, Metharylamiden und Gemischen hiervon ausgewählt ist und wobei das hydrophobe Polymer beispielsweise aus der Gruppe von N-Alkyl- und N-Arylalkylacrylamiden und -methylacrylamiden von 4 bis 20 Kohlenstoffen oder aus der Gruppe bestehend aus N-tert.-Octylacrylamid, N-Octadecylacrylamid und N-Methylundecylacrylamid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- und Arylalkylacrylaten und -methylacrylaten von 4 bis 20 Kohlenstoffen, wie Octadecylmethacrylat, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Blut bis zu 5 von einem oder mehreren Virus-inaktiviernden Mitteln enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Detergentien und hydrophoben Lösungsmitteln; einem Phosphatester, einem Detergens oder einer Kombination der beiden; oder einer Kombination von Tri-n-butylphosphat und einem ethoxylierten nichtionischen oberflächenaktiven Alkylphenol-Mittel ausgewählt sind.
Poröses Sorbens zur Entfernung von Verunreinigungen aus biologischen Fluiden, umfassend eine poröse Mineraloxidmatrix (M) mit einem porösen Innenvolumen (V), das im wesentlichen mit einem vernetzten, hydrophoben, polymeren Netzwerk (I) gefüllt ist, wobei das hydrophobe polymere Netzwerk (I) auf der Mineraloxidmatrix (M) aufliegt, jedoch nicht kovalent an sie gebunden ist, und das hydrophobe Polymer eine Ausschlussgrenze von 10 kD aufweist, wobei das Poren-Innenvolumen durch das Mineraloxid, das nicht passiviert ist und mit der polaren. Domäne der zu entfernenden Moleküle Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden vermag, begrenzt ist.
Poröses Sorbens nach Anspruch 9, wobei die Mineraloxidmatrix eine mittlere Teilchen-Ausgangsgröße von 1 bis 2000 Mikron, ein Poren-Ausgangsvolumen von 0,2 bis 4 cm³/g, z. B. 1 cm³/g, eine spezifische Ausgangoberfläche von 1 bis 1000 cm²/g, z. B. 200 cm²/g, und eine Poren-Ausgangsgröße von 5 bis 600 nm (50 bis 6000 A) aufweist.
Poröses Sorbens nach Anspruch 9, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus Acrylaten, Methylacrylaten, Acrylamiden, Methacrylamiden und Gemischen hiervon ausgewählt ist, und wobei beispielsweise das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus N-Alkyl- und N-Arylalkylacrylamiden und -methylacrylamiden von 4 bis 20 Kohlenstoffen, oder aus der Gruppe bestehend aus N-tert.-Octylacrylamid, N-Octadecylacrylamid und N-Methylundecylacrylamid ausgewählt ist.
Poröses Sorbens nach Anspruch 11, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- und Arylalkylacrylaten und -methylacrylaten von 4 bis 20 Kohlenstoffen, wie Octadecylmethacrylat, ausgewählt ist.